CN109476648B - 司维司群抗体-药物缀合物和使用方法 - Google Patents

司维司群抗体-药物缀合物和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明一般性涉及用离去基团活化的司维司群分子。本发明进一步一般性涉及包含通过接头与一个或多个司维司群药物模块缀合的抗体的抗体‑药物缀合物和治疗方法。

Description

司维司群抗体-药物缀合物和使用方法
对相关申请的交叉援引
依照37CFR§1.53(b)提交的此非临时申请要求2016年6月6日提交的流水号62/346,024的美国临时申请的依照35 USC§119(e)的权益,通过援引将其完整收录。
发明领域
本发明的领域一般性涉及包含直接与一个或多个司维司群(silvestrol)分子缀合的抗体的抗体-药物缀合物。
发明背景
司维司群和司维司群衍生物指抗细菌和抗肿瘤剂的一个家族(Lucas,D.M.et al.(2009)Blood,113:4656-4666；Alinari,L.et al.(2012)Clin.Cancer Res.,18:4600-4611；Cencic,R.et al.(2009)PLoS One,4:e5223；Hwang,B.Y.et al.(2004)J.Org.Chem.,69:3350-3358；US 6,710,075)。司维司群和类似物是有力且选择性的蛋白质合成抑制剂且已经研究了它们的抗过度增殖性特性(Liu,T.et al.(2012)Journal of MedicinalChemistry,55(20):8859-8878；WO 2015/085221；WO 2013/016658；WO 2004/041812；US 8,137,509；US 8,404,088；WO 2006/007634；US 7,816,544)。
司维司群(CAS:697235-38-4)的名称是(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-l,4-二氧杂环己-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯,且具有结构:
Figure BDA0001945712510000021
抗体-药物缀合物,也称作ADC或免疫缀合物,是靶向性化疗分子,其组合抗体和细胞毒性药物二者的特性,通过将有力的细胞毒性药物靶向抗原表达性肿瘤细胞,由此增强它们的抗肿瘤活性。成功的针对给定靶抗原的抗体-药物缀合物开发依赖于抗体选择性,接头稳定性,细胞毒性药物效力和接头-药物缀合至抗体的模式的优化。更加特别地,选择性抗体-药物缀合物特征在于下述至少一项或多项:(i)抗体-药物缀合物形成方法,其中抗体保留足够的对靶抗原的特异性且其中药物功效得到维持；(ii)抗体-药物缀合物稳定性,其足以限制血液中的药物释放和伴随的对非靶定细胞的损害；(iii)足够的细胞膜转运效率(胞吞)以实现治疗性细胞内抗体-药物缀合物浓度；(iv)足以实现治疗性药物浓度的足够的来自抗体-药物缀合物的细胞内药物释放；和(v)纳摩尔或亚纳摩尔量的药物细胞毒性。
抗体-药物缀合物容许药物模块靶向投递至肿瘤,和,在一些实施方案中其中的细胞内积累,其中未缀合药物的系统性施用可对正常细胞导致不可接受水平的毒性(Polakis,P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382-387)。
抗体-药物缀合物是靶向性化疗分子,其通过将有力的细胞毒性药物靶向抗原表达性肿瘤细胞而组合抗体和细胞毒性药物二者的特性(Teicher,B.A.(2009)CurrentCancer Drug Targets 9:982-1004),由此通过最大化功效和最小化脱靶毒性而增强治疗指数(Carter,P.J.and Senter,P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41:98-107)。
经由如下位点处的半胱氨酸替代,已经开发了提供药物对抗体的位点特异性缀合的抗体,其中工程化改造的半胱氨酸对于缀合是可用的但不扰乱免疫球蛋白折叠和装配或改变抗原结合和效应器功能(Junutula et al.,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Doman et al.(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7,521,541；US 7,723,485；WO 2009/052249)。这些THIOMABTM抗体然后可经由工程化改造的半胱氨酸硫醇基团缀合至细胞毒性药物以获得具有统一的化学计量的THIOMABTM药物缀合物(TDC)(例如在具有一个工程化改造的半胱氨酸位点的抗体中高至2个药物每个抗体)。针对不同抗原的多种抗体的研究已经显示TDC在异种移植物模型中像常规的抗体-药物缀合物一样有效且在有关的临床前模型中在更高剂量得到耐受。已经为了抗体的不同位置处的药物附着(例如轻链-Fab,重链-Fab和重链-Fc内的特定氨基酸位置(即位点))工程化改造THIOMABTM抗体。由于它们的均质性和对细胞毒性药物的位点特异性缀合,THIOMABTM抗体的体外和体内稳定性,功效和PK特性提供胜过常规抗体-药物缀合物的独特优势。
抗体-药物缀合物的设计,制备和使用仍然有其它限制或挑战。例如,一些接头可能在血流中不安定,由此在靶细胞中内在化之前释放不可接受量的药物(Khot,A.et al.(2015)Bioanalysis 7(13):1633-1648)。其它接头可提供血流中的稳定性,但是细胞内释放有效性可受到负面影响。提供想要的细胞内释放的接头典型地具有较差的血流中的稳定性。换言之,血流稳定性和细胞内释放典型地逆相关。其次,在标准缀合过程中,抗体载体蛋白上加载的药物模块的量(药物载荷),缀合反应中形成的聚集物的量,和能获得的最终的经过纯化的缀合物的产率是相互关联的。例如,聚集物形成一般与缀合至载体-抗体的药物模块和其衍生物的当量数目正相关。在高药物载荷下,为了治疗性应用必须去除形成的聚集物。结果是,药物载荷介导的聚集物形成降低抗体-药物缀合物产率且能使得工艺难以扩大。因而,继续需要提供优化的安全性和功效的改良的有效的抗体-药物缀合物。
发明概述
本公开文本一般性涉及包含通过缀合与一个或多个司维司群衍生物连接的抗体的抗体-药物缀合物。本公开文本进一步涉及包含离去基团的司维司群衍生物中间体组合物。此类中间体组合物对于抗体-药物缀合物的形成是合适的底物,其中抗体可经由接头或连接模块共价结合至司维司群衍生物。本公开文本进一步涉及此类抗体-司维司群缀合物在治疗病,特别是癌症中的用途。如本文中使用的,除非另有规定,司维司群指本公开文本涵盖的司维司群衍生物化合物。
本发明包括一种包含经由接头共价附着至司维司群药物模块的抗体的抗体-药物缀合物化合物,其选自式Ia和Ib:
Figure BDA0001945712510000041
或其药学可接受盐,
其中
Ra是选自CH3O,CN,NO2,和Cl的基团；
L是接头；
p是1至8的整数；且
Ab是结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体。
本发明包括一种药用组合物,其包含选自式Ia和Ib的抗体-药物缀合物化合物,和药学可接受稀释剂,载剂或赋形剂。
本发明包括选自式Ia和Ib的抗体-药物缀合物化合物在制造用于在哺乳动物中治疗癌症的药物中的用途。
本发明包括一种治疗癌症的方法,其包含对患者施用包含选自式Ia和Ib的抗体-药物缀合物化合物的药用组合物。
本发明包括选自式Ia和Ib的抗体-药物缀合物化合物,其供治疗癌症的方法中使用。
本发明包括一种制品,其包含包含选自式Ia和Ib的抗体-药物缀合物化合物的药用组合物,容器,和指示该药用组合物可用于治疗癌症的包装插页或标签。
本发明包括式II的司维司群-接头中间体化合物:
Figure BDA0001945712510000051
其中
Ra是选自CH3O,CN,NO2,和Cl的基团；
R1选自-OCH3和L-X；且
R2选自-CH(OH)CH2OH和L-X,
L是接头；且
X包含选自马来酰亚胺,硫醇,氨基,溴化物,溴乙酰胺基,碘乙酰胺基,p-甲苯磺酸酯,碘化物,羟基,羧基,吡啶基二硫化物,和N-羟基琥珀酰亚胺的反应性官能团。
本发明包括一种生成选自式Ia和Ib的抗体-药物缀合物化合物的方法,该方法包含使抗体与式II的司维司群-接头中间体化合物反应。
附图简述
图1A显示用Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,ThioHu抗CD22 10F4v3HC:A140C氨基司维司群类似物,ADC-105,非靶对照,和Thio Hu抗Her27C2HC:A140C氨基司维司群类似物,ADC-106处理的SK-BR-3细胞的体外细胞存活力的图。
图1B显示用Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,ThioHu抗CD22 10F4v3HC:A140C氨基司维司群类似物,ADC-105,非靶对照,和Thio Hu抗Her27C2HC:A140C氨基司维司群类似物,ADC-106处理的KPL-4细胞的体外细胞存活力的图。
图1C显示用Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,和Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,6mg/kg IV一次,ADC-104处理的Bjab-luc细胞的体外细胞存活力的图。
图1D显示用Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,和Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,6mg/kg IV一次处理的WSU-DLCL2细胞的体外细胞存活力的图。
图2以CB-17Fox Chase SCID小鼠中的Bjab-luc人异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效。
1)媒介(HisAc 20mM,蔗糖240mM,TW-20 0.02％,pH 5.5),100μL,IV一次
2)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,1mg/kg IV一次
3)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,3mg/kg IV一次
4)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,6mg/kg IV一次
5)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,10mg/kg IV一次
6)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,3mg/kg IV一次
图3以scid米色小鼠中的KPL4人乳房异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效。
1)媒介(HisAc 20mM,蔗糖240mM,TW-20 0.02％,pH 5.5),100μL,IV一次
2)司维司群,0.09mg/kg,IV一次
3)司维司群,1mg/kg,IP qdX5达2周
4)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,1mg/kg IV一次
5)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,3mg/kg IV一次
6)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,6mg/kg IV一次
7)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,10mg/kg IV一次
8)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,3mg/kg IV一次
图4以CB-17Fox Chase SCID小鼠中的Bjab-luc人异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效。
1)媒介(组氨酸缓冲液#8),100μL,IV一次
2)Thio CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,10mg/kg IV一次
3)Thio Her2(7C2)LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,10mg/kg IV一次
4)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,1mg/kg IV一次
5)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,3mg/kg IV一次
6)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,6mg/kg IV一次
7)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,10mg/kg IV一次
8)Thio Her2(7C2)HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-106,3mg/kg IV一次
9)Thio Her2(7C2)HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-106,10mg/kg IV一次
图5以CB-17Fox Chase SCID小鼠中的Bjab-luc人异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效。
1)媒介(组氨酸缓冲液#8),100μL,IV一次
2)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-110,3mg/kg IV一次
3)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-110,6mg/kg IV一次
4)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-110,10mg/kg IV一次
5)Thio Hu抗LY6E 9B12v12LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-109,10mg/kg IV一次
6)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,0.3mg/kg IV一次
7)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,1mg/kg IV一次
8)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,3mg/kg IV一次
9)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,6mg/kg IV一次
10)Thio Hu抗LY6E 9B12v12LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-107,6mg/kg IV一次
发明详述
现在要详细提到本发明的某些实施方案,其实施例以所附结构和通式例示。尽管会联合列举的实施方案描述本发明,但是会理解的是它们并非旨在将本发明限于那些实施方案。相反,本发明旨在涵盖所有备选方案,变更,和等同方案,它们可以包括在如由权利要求书限定的本发明的范围内。
本领域技术人员会认识到可以用于实施本发明的与本文中所描述的那些相似或等同的许多方法和材料。本发明绝不限于所描述的方法和材料。
定义
除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义,而且与下述一致:Singleton et al.(1994)Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,2nd Ed.,J.Wiley&Sons,New York,NY；和Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immunobiology,5th Ed.,GarlandPublishing,New York。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和它的结合配偶(例如抗原)之间的全部非共价相互作用总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来代表。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中描述的那些。下面描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性实施方案。
术语“抗体”在本文中以最广义使用,而且具体涵盖单克隆抗体,多克隆抗体,二聚体,多聚体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的生物学活性(Miller et al.(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠的,人的,人源化的,嵌合的,或衍生自其它物种的。抗体是由免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York)。靶抗原一般具有众多结合位点,也称作表位,受到多种抗体上的CDR识别。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同结构。因此,一种抗原可以具有超过一种相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫学活性部分,即含有免疫特异性结合感兴趣靶物的抗原或其部分的抗原结合位点的分子,此类靶物包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫性抗体的细胞。本文中公开的免疫球蛋白可以是任何型(例如IgG,IgE,IgM,IgD,和IgA),类(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以衍生自任何物种。然而,在一个方面,免疫球蛋白是人,鼠,或家兔起源的。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分,一般是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab,Fab',F(ab')2,和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody)(Olafsen etal.(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)；通过Fab表达文库生成的片段；抗独特型(抗Id)抗体；CDR(互补决定区)；和免疫特异性结合癌细胞抗原,病毒抗原或微生物抗原的任何本文所述的表位结合片段；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”指从实质性同质的抗体群体获得的抗体,即除了可能少量存在的可能的天然发生突变,构成该群体的抗体个体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的,针对单个抗原位点。而且,与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外,单克隆抗体的优点还在于它们可以在不受其它抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”指示抗体自实质性同质的抗体群体获得的特征,而且不要解读为需要通过任何特定方法来生成抗体。例如,要依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler et al.(1975)Nature,256:495描述的杂交瘤方法来生成,或者可以通过重组DNA方法来生成(参见例如US4,816,567；US 5,807,715)。还可以使用例如Clackson et al.(1991)Nature,352:624-628；Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术自噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体,其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现期望的生物学活性(US 4,816,567；及Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长化”抗体,其包含衍生自非人灵长动物(例如旧世界猴,猿,等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
“完整抗体”在本文中是包含VL和VH域,以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域(CH1,CH2和CH3)的。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应器功能”,指那些可归于抗体Fc恒定区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；和细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)的下调。
取决于它们的重链恒定域的氨基酸序列,可以将完整抗体指派至不同的“类”。存在五大类完整免疫球蛋白抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且其中数项可以进一步分成“亚类”(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的。Ig形式包括铰链修饰或无铰链形式(Roux et al.(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund etal.(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。
“半胱氨酸工程化改造抗体”或“半胱氨酸工程化改造抗体变体”是如下的抗体,其中抗体的一个或多个残基是用半胱氨酸残基替代的。依照本公开文本,半胱氨酸工程化改造抗体的硫醇基团可以缀合至司维司群以形成THIOMABTM抗体(即THIOMABTM药物缀合物(TDC),其中依照本公开文本,该药物是司维司群衍生物)。在特定的实施方案中,替代残基存在于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,反应性硫醇基团由此位于抗体的可及位点且可用于将抗体缀合至药物模块以创建免疫缀合物,如本文中进一步描述的。例如,THIOMABTM抗体可以是具有轻链中(例如依照Kabat编号方式的G64C,K149C或R142C)或重链中(例如依照Kabat编号方式的D101C,V184C,或T205C)非半胱氨酸天然残基变成半胱氨酸的单一突变的抗体。在具体的例子中,THIOMABTM抗体具有重或轻链任一中的单一半胱氨酸突变,使得每个全长抗体(即具有两条重链和两条轻链的抗体)具有两个工程化改造半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化改造抗体和制备方法披露于US 2012/0121615 A1(通过援引完整收入本文)。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤,淋巴瘤(例如霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤),母细胞瘤,肉瘤,和白血病。此类癌症的更具体例子包括急性髓样白血病(AML),骨髓增生异常综合征(MDS),慢性髓细胞性白血病(CML),慢性骨髓单核细胞性白血病,急性早幼粒细胞性白血病(APL),慢性骨髓增生性病症,血小板性白血病,前体B细胞急性成淋巴细胞性白血病(pre-B-ALL),前体T细胞急性成淋巴细胞性白血病(preT-ALL),多发性骨髓瘤(MM),肥大细胞病,肥大细胞白血病,肥大细胞肉瘤,髓样肉瘤,淋巴样白血病,和未分化的白血病。在一些实施方案中,癌症是髓样白血病。在一些实施方案中,癌症是急性髓样白血病(AML)。
术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。
抗体的“类”指它的重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且这些中的数种可以进一步分成亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。
“效应器功能”指那些可归于抗体的Fc区,随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。
药剂(例如药用配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
术语“表位”指抗原分子上抗体结合的特定位点。在一些实施方案中,抗原分子上抗体结合的特定位点是通过羟基自由基足迹法确定的。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统,也称作EU索引,如记载于Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基以外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以下面的顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指与天然抗体结构具有实质性类似的结构或者具有含有如本文中限定的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞/经转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不是完全相同,而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的。人抗体的此定义具体排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选集中最常发生的氨基酸残基的框架。通常,人免疫球蛋白VL或VH序列的选集来自可变域序列的亚组。通常,序列的亚组是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,亚组是如Kabat等人,见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中,对于VH,亚组是如Kabat等人,见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中所有或实质性所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,且所有或实质性所有FR对应于人抗体的那些。任选地,人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。“人源化形式”的抗体(例如非人抗体)指已经经历人源化的抗体。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有相似的结构,其中每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007))。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外,可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson etal.,Nature 352:624-628(1991)。
如本文中使用的,术语“载体”指能够增殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制型核酸结构的载体以及并入接受它导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区。一般地,天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1,H2,H3)且三个在VL中(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高序列可变性和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothiaand Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3,CDR-H1,CDR-H2,和CDR-H3)存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35B(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中的CDR1以外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”,它们是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的CDR或a-CDR的CDR区内。例示性a-CDR(a-CDR-L1,a-CDR-L2,a-CDR-L3,a-CDR-H1,a-CDR-H2,和a-CDR-H3)存在于氨基酸残基31-34(L1),50-55(L2),89-96(L3),31-35B(H1),50-58(H2),和95-102(H3)(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示,HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长动物(例如人和非人灵长动物,诸如猴),家兔,和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中,个体或受试者是人。
“分离的抗体”是已经与它的天然环境的成分分开的。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％的纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,参见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“天然抗体”指具有不同结构的天然发生免疫球蛋白分子。例如,天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白,由成二硫键的两条相同轻链和两条相同重链构成。自N至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3)。类似地,自N至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个恒定轻(CL)域。基于它的恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可归入两种型中的一种,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗用产品的使用的适应征,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:100乘分数X/Y,其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药用配制剂”指如下的制剂,其处于使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的形式且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药学可接受载剂”指药用配制剂中除了活性组分以外的,对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂,或防腐剂。
术语“治疗”和“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者,其中目标是预防或减缓(减轻)不想要的生理学变化或病症,诸如癌症的发生或传播。出于此发明的目的,有益或期望的临床结果包括但不限于:缓解症状,削弱疾病的程度,疾病状态稳定(即不恶化),延迟或减缓疾病进展,改善或减轻疾病状态,及康复(无论是部分的还是完全的),无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”或“处理”还可以指与不接受治疗的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括早就具有状况或病症的那些以及倾向于具有状况或病症的那些或者要预防状况或病症的受试者。
术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中,药物的治疗有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即在一定程度上减缓和优选阻止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与癌症有关的症状。在药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上,它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法,可通过例如评估疾病进展前时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测量功效。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长不受调节的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞。癌症的例子包括但不限于癌瘤,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌),肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌(“NSCLC”),肺的腺癌和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括胃肠癌),胰腺癌,成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,乳腺癌,结肠癌,直肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌,肛门癌,阴茎癌,以及头和颈癌。
如本文中使用的,术语“离去基因”指在牵涉如本文中描述的基团的化学反应的过程中离去的硫氢基模块。
如本文中使用的,术语“烷基”指1至12个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链的单价的烃根,其中烷基根可以是任选用一个或多个下文所述取代基独立取代的。在另一个实施方案中,烷基根是1至8个碳原子(C1-C8),或1至6个碳原子(C1-C6)。烷基基团的例子包括但不限于甲基(Me,-CH3),乙基(Et,-CH2CH3),1-丙基(n-Pr,正丙基,-CH2CH2CH3),2-丙基(i-Pr,异丙基,-CH(CH3)2),1-丁基(n-Bu,正丁基,-CH2CH2CH2CH3),2-甲基-1-丙基(i-Bu,异丁基,-CH2CH(CH3)2),2-丁基(s-Bu,仲丁基,-CH(CH3)CH2CH3),2-甲基-2-丙基(t-Bu,叔丁基,-C(CH3)3),1-戊基(正戊基,-CH2CH2CH2CH2CH3),2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3),3-戊基(-CH(CH2CH3)2),2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3),3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2),3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2),2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3),1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3),2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3),3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)),2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3),3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3),4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2),3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2),2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2),2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2),3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3),1-庚基,1-辛基,等等。
如本文中使用的术语“亚烷基”指1至12个碳原子(C1-C12)的饱和的直链或支链的二价的烃根,其中亚烷基根可以是任选用一个或多个下文所述取代基独立取代的。在另一个实施方案中,亚烷基根是1至8个碳原子(C1-C8),或1至6个碳原子(C1-C6)。亚烷基基团的例子包括但不限于亚甲基(-CH2-),亚乙基(-CH2CH2-),亚丙基(-CH2CH2CH2-),等等。
术语“烯基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp2双键)的,直链或支链的单价的烃根,其中烯基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的,而且包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的根。例子包括但不限于乙烯基(-CH＝CH2),烯丙基(-CH2CH＝CH2),等等。
术语“亚烯基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp2双键)的,直链或支链的二价的烃根,其中亚烯基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的,而且包括具有“顺式”和“反式”取向或者“E”和“Z”取向的根。例子包括但不限于亚乙烯基(-CH＝CH-),亚烯丙基(-CH2CH＝CH-),等等。
术语“炔基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp三键)的,线性或分支的单价的烃根,其中炔基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的。例子包括但不限于乙炔基(-C≡CH),丙炔基(炔丙基,-CH2C≡CH),等等。
术语“亚炔基”指2至8个碳原子(C2-C8)的,有至少一个不饱和位点(即碳-碳,sp三键)的,线性或分支的二价的烃根,其中亚炔基根可以是任选用一个或多个本文所述取代基独立取代的。例子包括但不限于亚乙炔基(-C≡C-),亚丙炔基(亚炔丙基,-CH2C≡C-),等等。
术语“碳环”,“碳环基”,“碳环环”和“环烃基”指具有作为单环环的3至12个碳原子(C3-C12)或作为双环环的7至12个碳原子的,单价的,非芳香族的,饱和或部分未饱和的环。具有7至12个原子的双环碳环可以排列成例如双环[4,5],[5,5],[5,6]或[6,6]体系,而具有9或10个环原子的双环碳环可以排列成双环[5,6]或[6,6]体系,或桥连体系诸如双环[2.2.1]庚烷,双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。螺碳环模块也包括在此定义的范围内。单环碳环的例子包括但不限于环丙基,环丁基,环戊基,1-环戊-1-烯基,1-环戊-2-烯基,1-环戊-3-烯基,环己基,1-环己-1-烯基,1-环己-2-烯基,1-环己-3-烯基,环己二烯基,环庚基,环辛基,环壬基,环癸基,环十一烷基,环十二烷基,等等。碳环基基团任选是用一个或多个本文所述取代基独立取代的。
如本文中单独或作为另一基团的部分使用的术语“芳基”表示在环部分中含有5至20个碳,5至10个碳,或5至6个碳的任选取代的同素环芳香族基团,优选单环或双环基团,包括但不限于苯基,联苯基,萘基,取代的苯基,取代的联苯基或取代的萘基。芳基模块可任选包含一个或多个选自O,S和N的杂原子。此类杂芳香族基团可在环中包含1或2个氮原子,1或2个硫原子,1或2个氧原子,和其组合,其中每一个杂原子经由碳与分子的剩余部分成键。非限制性例示性基团包括吡啶,吡嗪,嘧啶,吡唑,吡咯,咪唑,噻吩,硫代吡喃嗡(thiopyrrilium),对噻嗪,吲哚,嘌呤,苯并咪唑,喹诺酮,和吩噻嗪。非限制性例示性取代基包括一种或多种下述基团:烷基,烷氧基,酰基,酰基氧基,烯基,烯氧基,芳基,芳基氧基,氨基,酰胺基,(乙)缩醛,氨甲酰基,碳环,氰基,酯,醚,卤素,杂环,羟基,酮基,缩酮,磷酸基,硝基,和硫代。
本文中描述的“取代的”模块是用至少一个除了碳以外的原子取代的模块,诸如烷基和芳基,包括其中碳链原子用杂原子,诸如氮,氧,硅,磷,硼,硫,或卤素原子取代的模块。这些取代基包括但不限于卤素,杂环,烷氧基,烯氧基,炔氧基,芳基氧基,羟基,酮基,酰基,酰基氧基,硝基,叔氨基,酰胺基,硝基,氰基,硫代,亚磺酸基,亚磺酰胺,缩酮,(乙)缩醛,酯和醚。
如本文中单独或作为另一基团的部分使用的术语“卤素”指氯,溴,氟,和碘。
抗体
在本公开文本的任何实施方案中,抗体是人源化的。在一个实施方案中,抗体包含本公开文本的任何实施方案中的HVR,且进一步包含人受体框架,例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中,人受体框架是人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。在某些实施方案中,人受体框架是包含任一下述突变的人VL卡帕I共有(VLKI)框架和/或VH框架VH1。
在另一个方面,该抗体包含本文中提供的任何实施方案中的VH和本文中提供的任何实施方案中的VL。
在本发明的又一个方面,依照本文中的任何实施方案的抗体是单克隆抗体,包括人抗体。在一个实施方案中,抗体是抗体片段,例如Fv,Fab,Fab’,scFv,双抗体,或F(ab’)2片段。在另一个实施方案中,抗体是实质性全长抗体,例如IgG1抗体,IgG2a抗体或如本文中定义的其它抗体类或同种型。
在又一个方面,依照本文中的任何实施方案的抗体可以单一地或组合地并入如本文中描述的任何特征。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中,本文中提供的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤50nM,≤10nM,≤5nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM且任选≥10-13M(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中,Kd是通过用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的,如通过下面的测定法描述的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab,然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(参见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件,将
Figure BDA0001945712510000191
多孔板(ThermoScientific)用50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜,随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(大约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体,Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而,温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后,将混合物转移至捕捉板,于室温温育(例如1小时)。然后去除溶液,并用PBS中的0.1％聚山梨酯20
Figure BDA0001945712510000192
清洗板8次。将板干燥之后,添加150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard),然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案,Kd是于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)使用
Figure BDA0001945712510000193
或
Figure BDA0001945712510000194
(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)使用表面等离振子共振测定法测量的。简言之,依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用HBS-P(0.01M HepespH 7.4,0.15M NaCl,0.005％表面活性剂P20)和/或10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM),之后以5μl/分钟和/或30μl/分钟的流速注射以实现大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射抗原之后,注射1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量,于25℃以大约25μl/分钟的流速注射在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0001945712510000201
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)以比率koff/kon计算(Chen et al.(1999)J.Mol.Biol.293:865-881)。如果根据本文所述表面等离振子共振测定法,结合速率超过106M-1s-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的情况中,测量PBSpH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通)的升高或降低。
2.抗体片段
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,Fv,和scFv片段,及本文中描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Pluckthün,于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 1993/16185；及US5,571,894和US 5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,参见US 5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如US 6,248,516)。
可以通过多种技术来生成抗体片段,包括但不限于如本文所述对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如US4,816,567；及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中,嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠,大鼠,仓鼠,家兔,或非人灵长动物,诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中,嵌合抗体是“类转换的”抗体,其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中,嵌合抗体是人源化抗体。通常,将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地,人源化抗体包含一个或多个可变域,其中HVR,例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生,而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地,人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中,将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),并且进一步记载于例如Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；US 5,821,337,US 7,527,791,US 6,982,321,和US 7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“重修表面”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)；及Klimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“引导选择”办法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(参见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见例如Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；及Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro andFransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(参见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)及Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地,人抗体记载于van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体,所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替换内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述,参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584,其描述XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429,其描述
Figure BDA0001945712510000221
技术；US 7,041,870,其描述K-M
Figure BDA0001945712510000222
技术,和US 2007/0061900,其描述
Figure BDA0001945712510000223
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于US 7,189,826(其描述自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmersand Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers andBrandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后,可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。本文中描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如,用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等,于Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001),并且进一步记载于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,于Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的全集通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体,如记载于Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源,如由Griffiths etal.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后,也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库,如由Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如:美国专利No.5,750,373,和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936,和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体是多特异性抗体,例如双特异性抗体。术语“多特异性抗体”以最广义使用且具体涵盖包含具有多表位特异性(即能够特异性结合一种生物学分子上的两种或更多种不同表位或能够特异性结合两种或更多种不同生物学分子上的表位)的抗原结合域的抗体。在一些实施方案中,多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在一些实施方案中,多特异性抗体(诸如双特异性抗体)的抗原结合域包含两个VH/VL单元,其中第一VH/VL单元特异性结合第一表位而第二VH/VL单元特异性结合第二表位,其中每个VH/VL单元包含重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体,具有两个或更多个VL和VH域的抗体,抗体片段诸如Fab,Fv,dsFv,scFv,双抗体,双特异性双抗体和三抗体,已经共价或非共价连接的抗体片段。进一步包含至少部分重链可变区和/或至少部分轻链可变区的VH/VL单元也可称作“臂”或“半体”或“半抗体”。在一些实施方案中,半体包含的部分重链可变区足以容许与第二半体形成分子内二硫键。在一些实施方案中,半体包含节突变或穴突变,例如为了容许与包含互补穴突变或节突变的第二半体或半抗体异二聚化。本文中进一步讨论节突变和穴突变。
在某些实施方案中,本文中提供的多特异性抗体可以是双特异性抗体。术语“双特异性抗体”以最广义使用且涵盖包含能够特异性结合一种生物学分子上的两种不同表位或能够特异性结合两种不同生物学分子上的表位的抗原结合域的多特异性抗体。双特异性抗体在本文中也可称作具有“双重特异性”或是“双重特异性的”。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。如本文中使用的,术语“双互补位抗体”指如下的双特异性抗体,其中第一抗原结合域和第二抗原结合域结合相同抗原分子上的两种不同表位,或者它可结合两种不同抗原分子上的表位。
在一些实施方案中,双互补位抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合一种和相同抗原分子内的两个表位(分子内结合)。例如,双互补位抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合相同抗原分子上的两个不同表位。在某些实施方案中,双互补位抗体结合的两个不同表位是正常情况下不受一个单特异性抗体,诸如例如常规抗体或一个免疫球蛋白单一可变域在同一时间结合的表位。
在一些实施方案中,双互补位抗体的第一抗原结合域和第二抗原结合域可结合位于两种截然不同抗原分子内的表位。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829,和Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)),和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168,WO 2009/089004,US 2009/0182127,US 2011/0287009,Marvin andZhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658,和Kontermann(2005)ActaPharmacol.Sin.,26:1-9)。如本文中使用的术语“节-入-穴”或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面处将隆起(节)引入一条多肽并将空腔(穴)引入另一条多肽中,在体外或在体内将两条多肽配对在一起的技术。例如,已经在抗体的Fc:Fc结合界面,CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH(参见例如US 2011/0287009,US 2007/0178552,WO 96/027011,WO98/050431,和Zhu et al.,1997,Protein Science 6:781-788)。在一些实施方案中,KnH在制造多特异性抗体期间驱动两条不同重链配对在一起。例如,在它们的Fc区中具有KnH的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单一可变域,或进一步包含与相似或不同轻链可变域配对的不同重链可变域。KnH技术还可用于将两个不同受体胞外域或包含不同靶物识别序列的任何其它多肽序列(例如包括亲和体(affibody),肽体(peptibody)和其它Fc融合物)配对在一起。
如本文中使用的术语“节突变”指在多肽与另一多肽相互作用的界面处向该多肽中引入隆起(节)的突变。在一些实施方案中,另一多肽具有穴突变。
“隆起”指至少一个氨基酸侧链自第一多肽的界面凸出并因此可放置在邻近界面(即第二多肽的界面)的补偿空腔中,从而稳定异多聚体,并由此例如有利于异多聚体形成,超过同多聚体形成。隆起可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中,改变编码第一多肽的界面的核酸以编码隆起。为了实现这一点,将编码第一多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要大的“输入”氨基酸残基的核酸替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。各种氨基酸残基的侧链体积显示于例如US 2011/0287009的表1。引入“隆起”的突变可称作“节突变”。
在一些实施方案中,用于形成隆起的输入残基是选自精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的天然发生氨基酸残基。在一些实施方案中,输入残基是色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中,用于形成隆起的初始残基具有较小侧链体积,诸如丙氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸或缬氨酸。
“空腔”指至少一个氨基酸侧链自第二多肽的界面凹进并因此容纳第一多肽的邻近界面上的对应隆起。空腔可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中,改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空腔。为了实现这一点,将编码第二多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要小的“输入”氨基酸残基的DNA替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。在一些实施方案中,用于形成空腔的输入残基是选自丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的天然发生氨基酸残基。在一些实施方案中,输入残基是丝氨酸,丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中,用于形成空腔的初始残基具有较大的侧链体积,诸如酪氨酸,精氨酸,苯丙氨酸或色氨酸。引入“空腔”的突变可称作“穴突变”。
隆起“可放置”在空腔中,这意味着隆起和空腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置及隆起和空腔的大小使得隆起能定位在空腔中,而对第一和第二多肽在界面处的正常联合没有显著扰乱。因为隆起诸如Tyr,Phe和Trp通常不与界面的轴垂直延伸且具有优选构象,所以隆起与对应空腔的排列在一些情况中可能依赖于隆起/空腔对基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的)的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。
在一些实施方案中,IgG1恒定区中的节突变是T366W。在一些实施方案中,IgG1恒定区中的穴突变包含一处或多处选自T366S,L368A和Y407V的突变。在一些实施方案中,IgG1恒定区中的穴突变包含T366S,L368A和Y407V。
在一些实施方案中,IgG4恒定区中的节突变是T366W。在一些实施方案中,IgG4恒定区中的穴突变包含一处或多处选自T366S,L368A,和Y407V的突变。在一些实施方案中,IgG4恒定区中的穴突变包含T366S,L368A,和Y407V。
也可以通过用于生成抗体Fc异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004 A1)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如US 4,676,980,及Brennan et al.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny etal.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)中描述的)来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体,包括“章鱼抗体”或“双重可变域免疫球蛋白”(DVD)(US 2006/0025576 A1,和Wu et al.(2007)Nature Biotechnology)。
在某些实施方案中,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中,由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中,本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体,所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物,其中抗体的体内半衰期是重要的,而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI,FcγRII和FcγRIII。在Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于US 5,500,362(参见例如Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I.et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；US 5,821,337；Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox
Figure BDA0001945712510000271
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如披露于Clynes et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(Petkova,S.B.etal.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(US 7,332,581)。
在某些实施方案中,野生型人Fc区的Pro329是用甘氨酸或精氨酸或大得足以破坏Fc/Fcγ受体界面内Fc的脯氨酸329和FcgRIII的色氨酸残基Trp87和Trp110之间形成的脯氨酸三明治的氨基酸残基(Sondermann et al.,Nature 406:267-273(20July 2000))替代的。在又一个实施方案中,Fc变体中的至少一处别的氨基酸替代是S228P,E233P,L234A,L235A,L235E,N297A,N297D,或P331S,而且在仍有另一个实施方案中,所述至少一处别的氨基酸替代是人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E(US 8,969,526,通过援引将其完整收录)。
在某些实施方案中,多肽包含野生型人IgG Fc区的Fc变体,其中该多肽所具有的人IgG Fc区的Pro329是用甘氨酸替代的,且其中该Fc变体包含至少两处别的氨基酸替代,人IgG1Fc区的L234A和L235A或人IgG4Fc区的S228P和L235E,且其中残基是依照Kabat的EU索引编号的(US 8,969,526,通过援引将其完整收录)。在某些实施方案中,包含P329G,L234A和L235A替代的多肽展现降低的对人FcγRIIIA和FcγRIIA的亲和力,用于将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％,和/或用于下调ADCP(US 8,969,526,通过援引将其完整收录)。
在一个具体的实施方案中,包含野生型人Fc多肽的Fc变体的多肽包含三重突变:位置Pro329处的氨基酸替代,L234A和L235A突变(P329/LALA)(美国专利No.8,969,526,通过援引将其完整收录)。在具体的实施方案中,该多肽包含下述氨基酸替代:P329G,L234A,和L235A。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如US 6,737,056；WO 2004/056312；及Shields et al.(2001)J.Biol.Chem.9(2):6591-6604)。
在某些实施方案中,抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代,例如Fc区的位置298,333,和/或334(残基的EU编号方式)处的替代的Fc区。
在一些实施方案中,对Fc区做出改变,其导致改变的(即改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC),例如如记载于US 6,194,551,WO 1999/51642,及Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934 A1(Hinton等人),新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyeret al.,J.Immunol.117:587(1976)及Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代,例如Fc区残基434的替代的(US 7,371,826)。
还参见Duncan and Winter,Nature 322:738-40(1988)；US 5,648,260；US 5,624,821；及WO 1994/29351,其关注Fc区变体的其它例子。
7.经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中,可能想要创建经半胱氨酸工程化改造的抗体,例如“THIOMABTM抗体”,其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定的实施方案中,替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点,并且可以用于将抗体与药物模块缀合以创建免疫缀合物,如本文中进一步描述的。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个:轻链的V205(Kabat编号方式)；轻链的K149(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如US 7,521,541；Shen,B.et al.(2012)Nat.Biotechnol.30(2):184-189；Sukumaran et al.(2015)Pharm Res 32:1884-1893所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
抗体-药物缀合物(ADC,免疫缀合物)可通过缀合一个或多个抗体半胱氨酸硫醇基团与一个或多个结合至药物的接头模块由此形成抗体-接头-药物复合物来形成。半胱氨酸硫醇在中性pH时是反应性亲核试剂,不像在接近pH7时质子化且亲核性降低的大部分胺。由于游离硫醇(RSH,硫氢基)基团相对具有反应性,所以带有半胱氨酸残基的蛋白质常常以其作为二硫化物连接的寡聚体的氧化形式存在或具有内部桥连的二硫化物基团。抗体半胱氨酸硫醇基团一般对亲电子缀合试剂比对抗体胺或羟基基团更具反应性,即更具亲核性。通过使蛋白质的各种氨基酸残基突变成半胱氨酸氨基酸的在半胱氨酸硫醇基团上的工程化改造可能存在问题,特别是在未配对的(游离Cys)残基或那些相对易于进行反应或氧化的残基的情况中。在蛋白质的浓缩溶液中,无论是在大肠杆菌(E.coli)的周质中,还是在培养物上清液或部分或完全纯化的蛋白质中,蛋白质表面上的未配对Cys残基能配对并氧化以形成分子内二硫化物和由此的蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体形成使得新的Cys对于与药物,配体,或其它标记物的缀合不具反应性。此外,如果蛋白质以氧化方式在新改造的Cys和已存在的Cys残基之间形成分子内二硫键,那么这两个Cys基团对活性位点参与和相互作用而言均是不可用的。此外,可以通过错误折叠或丧失三级结构使蛋白质成为无活性的或非特异性的(Zhang et al.(2002)Anal.Biochem.311:1-9)。
在一些方面,THIOMABTM抗体包含下文表1中列出的重或轻链半胱氨酸替代之一。
表1:THIOMABTM抗体中的轻链半胱氨酸突变位点
Figure BDA0001945712510000301
Figure BDA0001945712510000311
在其它方面,THIOMABTM抗体包含表2中列出的重链半胱氨酸替代之一。
表2:THIOMABTM抗体中的重链半胱氨酸突变位点
链(HC/LC) 残基 筛选突变位点# GNE突变位点# Kabat突变位点#
HC T 117 114 110
HC A 143 140 136
HC L 177 174 170
HC L 182 179 175
HC T 190 187 183
HC T 212 209 205
HC V 265 262 258
HC G 374 371 367
HC Y 376 373 369
HC E 385 382 378
HC S 427 424 420
HC N 437 434 430
HC Q 441 438 434
在一些其它方面,THIOMABTM抗体包含表3中列出的轻链半胱氨酸替代之一。
表3:THIOMABTM抗体中的轻链半胱氨酸突变位点
Figure BDA0001945712510000312
Figure BDA0001945712510000321
在一些其它方面,THIOMABTM抗体包含表4中列出的重或轻链半胱氨酸替代之一。
表4:THIOMABTM抗体中的重链半胱氨酸突变位点
链(HC/LC) 残基 筛选突变位点# GNE突变位点# Kabat突变位点#
LC K 149 149 149
HC A 143 140 136
HC A 121 118 114
在癌症的治疗中在本发明的抗体-药物缀合物中可能有用的半胱氨酸改造的抗体包括但不限于针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。肿瘤相关抗原是本领域已知的,而且可以制备它们以用于使用本领域公知的方法和信息生成抗体。在发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶物的尝试中,研究人员寻求鉴定与一种或多种正常非癌性细胞相比在一种或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性表达的跨膜或其它方面肿瘤相关多肽。通常,与非癌性细胞的表面上相比,此类肿瘤相关多肽在癌细胞的表面上更加丰富地表达。对此类肿瘤相关细胞表面抗原多肽的鉴定引起经由基于抗体的疗法特异性靶向癌细胞进行破坏的能力。
肿瘤相关抗原TAA的例子包括但不限于本文中所列TAA(1)-(53)。为方便起见,有关均为本领域已知的这些抗原的信息在此列出,并且遵循National Center forBiotechnology Information(NCBI)的核酸和蛋白质序列鉴定规则,包括名称,备选名称,Genbank登记号和主要参考文献。与TAA(1)-(53)对应的核酸和蛋白质序列是在公共数据库,诸如GenBank中可得的。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括所有氨基酸序列变体和同等型,它们相对于引用的参考文献中鉴定的序列拥有至少约70％,80％,85％,90％,或95％序列同一性,或展现与具有引用的参考文献中发现的序列的TAA实质性相同的生物学特性或特征。例如,具有变体序列的TAA一般能够特异性结合特异性结合具有所列相应序列的TAA的抗体。通过援引明确收录本文中具体叙述的参考文献中的序列和公开内容。
肿瘤相关抗原
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型,Genbank登录号NM_001203)；ten Dijke,P.,et al.Science 264(5155):101-104(1994),Oncogene 14(11):1377-1382(1997)；WO2004063362(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003134790-A1(第38-39页)；WO2002102235(权利要求13；第296页)；WO2003055443(第91-92页)；WO200299122(实施例2；第528-530页)；WO2003029421(权利要求6)；WO2003024392(权利要求2；图112)；WO200298358(权利要求1；第183页)；WO200254940(第100-101页)；WO200259377(第349-350页)；WO200230268(权利要求27；第376页)；WO200148204(实施例；图4)；NP_001194骨形态发生蛋白受体,IB型/pid＝NP_001194.1；交叉援引:MIM:603248；NP_001194.1；AY065994；
(2)E16(LAT1,SLC7A5,Genbank登录号NM_003486)；Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999),Nature 395(6699):288-291(1998),Gaugitsch,H.W.,et al.(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273；WO2004048938(实施例2)；WO2004032842(实施例IV)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003016475(权利要求1)；WO200278524(实施例2)；WO200299074(权利要求19；第127-129页)；WO200286443(权利要求27；第222,393页)；WO2003003906(权利要求10；第293页)；WO200264798(权利要求33；第93-95页)；WO200014228(权利要求5；第133-136页)；US2003224454(图3)；WO2003025138(权利要求12；第150页)；NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运蛋白,y+系统),成员5/pid＝NP_003477.3-Homo sapiens；交叉援引:MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1；
(3)STEAP1(前列腺的六次跨膜上皮抗原,Genbank登录号NM_012449)；CancerRes.61(15),5857-5860(2001),Hubert,R.S.,et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528；WO2004065577(权利要求6)；WO2004027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004016225(权利要求2)；WO2003042661(权利要求12)；US2003157089(实施例5)；US2003185830(实施例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实施例5；第618-619页)；WO2003022995(实施例9；图13A,实施例53；第173页,实施例2；图2A)；NP_036581前列腺的六次跨膜上皮抗原；交叉援引:MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1；
(4)0772P(CA125,MUC16,Genbank登录号AF361486)；J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001)；WO2004045553(权利要求14)；WO200292836(权利要求6；图12)；WO200283866(权利要求15；第116-121页)；US2003124140(实施例16)；US798959；交叉援引:GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1；
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核细胞强化因子,间皮素,Genbank登录号NM_005823)；Yamaguchi,N.,et al.Biol.Chem.269(2),805-808(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996),J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995)；WO2003101283(权利要求14)；WO2002102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002101075(权利要求4；第308-309页)；WO200271928(第320-321页)；WO9410312(第52-57页)；交叉援引:MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1；
(6)Napi3b(NAPI-3B,NPTIIb,SLC34A2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b,Genbank登录号NM_006424)；J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002),Genomics 62(2):281-284(1999),Feild,J.A.,et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实施例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉援引:MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1；
(7)Sema 5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白5b Hlog,sema域,七次血小板反应蛋白重复(1型和1型样),跨膜域(TM)和短胞质域,(脑信号蛋白)5B,Genbank登录号AB040878)；Nagase T.,et al.(2000)DNA Res.7(2):143-150；WO2004000997(权利要求1)；WO2003003984(权利要求1)；WO200206339(权利要求1；第50页)；WO200188133(权利要求1；第41-43,48-58页)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003101400(权利要求11)；登录号:Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC:10737；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因,Genbank登录号AY358628)；Ross et al.(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003129192(权利要求2)；US2004044180(权利要求12)；US2004044179(权利要求11)；US2003096961(权利要求11)；US2003232056(实施例5)；WO2003105758(权利要求12)；US2003206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003025148(权利要求20)；交叉援引:GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1；
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体,Genbank登录号AY275463)；Nakamuta M.,et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.,et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.,et al.Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；AraiH.,et al.J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.,et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.,etal.J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.,etal.J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.,et al.Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.,et al.J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.,etal.Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.,et al.Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.,et al.Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；PuffenbergerE.G.,et al.Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.,et al,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.,et al.Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.,etal.Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.,et al.Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.,et al.Hum.Genet.103,145-148,1998；Fuchs S.,et al.Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.,et al.(2002)Hum.Genet.111,198-206；WO2004045516(权利要求1)；WO2004048938(实施例2)；WO2004040000(权利要求151)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200261087(图1)；WO2003016494(图6)；WO2003025138(权利要求12；第144页)；WO200198351(权利要求1；第124-125页)；EP522868(权利要求8；图2)；WO200177172(权利要求1；第297-299页)；US2003109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；第31-34栏)；WO2004001004；
(10)MSG783(RNF124,假设的蛋白质FLJ20315,Genbank登录号NM_017763)；WO2003104275(权利要求1)；WO2004046342(实施例2)；WO2003042661(权利要求12)；WO2003083074(权利要求14；第61页)；WO2003018621(权利要求1)；WO2003024392(权利要求2；图93)；WO200166689(实施例6)；交叉援引:LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1；
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白,Genbank登录号AF455138)；Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002)；WO2003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；WO2003104270(权利要求11)；WO2003104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；WO2003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；交叉援引:GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1；
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体潜在阳离子通道,亚家族M,成员4,Genbank登录号NM_017636)；Xu,X.Z.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001),Cell 109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003)；US2003143557(权利要求4)；WO200040614(权利要求14；第100-103页)；WO200210382(权利要求1；图9A)；WO2003042661(权利要求12)；WO200230268(权利要求27；第391页)；US2003219806(权利要求4)；WO200162794(权利要求14；图1A-D)；交叉援引:MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1；
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生的生长因子,Genbank登录号NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola,A.,et al.EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991)；US2003224411(权利要求1)；WO2003083041(实施例1)；WO2003034984(权利要求12)；WO200288170(权利要求2；第52-53页)；WO2003024392(权利要求2；图58)；WO200216413(权利要求1；第94-95,105页)；WO200222808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；第17-18栏)；US5792616(图2)；交叉援引:MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃巴二氏病毒受体)或Hs.73792,Genbank登录号M26004)；Fujisaku et al.(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125；Weis J.J.,etal.J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.,et al.Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.,et al.(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(实施例4)；US2004005538(实施例1)；WO2003062401(权利要求9)；WO2004045520(实施例4)；WO9102536(图9.1-9.9)；WO2004020595(权利要求1)；登录号:P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1；
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29,Genbank登录号NM_000626或11038674)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131,Blood(2002)100(9):3068-3076,Muller et al.(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625；WO2004016225(权利要求2,图140)；WO2003087768,US2004101874(权利要求1,第102页)；WO2003062401(权利要求9)；WO200278524(实施例2)；US2002150573(权利要求5,第15页)；US5644033；WO2003048202(权利要求1,第306和309页)；WO 99/558658,US6534482(权利要求13,图17A/B)；WO200055351(权利要求11,第1145-1146页)；交叉援引:MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1；
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含SH2域的磷酸酶锚定蛋白1a),SPAP1B,SPAP1C,Genbank登录号NM_030764,AY358130)；Genome Res.13(10):2265-2270(2003),Immunogenetics 54(2):87-95(2002),Blood 99(8):2662-2669(2002),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001),Xu,M.J.,et al.(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(权利要求2)；WO2003077836；WO200138490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003097803(权利要求12)；WO2003089624(权利要求25)；交叉援引:MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1；
(17)HER2(ErbB2,Genbank登录号M11730)；Coussens L.,et al.Science(1985)230(4730):1132-1139；Yamamoto T.,et al.Nature 319,230-234,1986；Semba K.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.,et al.J.CellBiol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.,et al.J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；ChoH.-S.,et al.Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.,et al.(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(实施例2)；WO2004027049(图1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(权利要求9)；WO2003016475(权利要求1)；US2003118592；WO2003008537(权利要求1)；WO2003055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003025228(权利要求37；图5C)；WO200222636(实施例13；第95-107页)；WO200212341(权利要求68；图7)；WO200213847(第71-74页)；WO200214503(第114-117页)；WO200153463(权利要求2；第41-46页)；WO200141787(第15页)；WO200044899(权利要求52；图7)；WO200020579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；第31-38栏)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004043361(权利要求7)；WO2004022709；WO200100244(实施例3；图4)；登录号:P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1；EMBL；M11761；AAA35808.1；
(18)NCA(CEACAM6,Genbank登录号M18728)；Barnett T.,et al.Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.,et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004044178(实施例4)；WO2004031238；WO2003042661(权利要求12)；WO200278524(实施例2)；WO200286443(权利要求27；第427页)；WO200260317(权利要求2)；登录号:P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1；EMBL；M18728；
(19)MDP(DPEP1,Genbank登录号BC017023)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002)；WO2003016475(权利要求1)；WO200264798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO9946284(图9)；交叉援引:MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1；
(20)IL20Rα(IL20Ra,ZCYTOR7,Genbank登录号AF184971)；Clark H.F.,etal.Genome Res.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.,et al.Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.,et al.Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.,et al.J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.,et al.J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.,et al.(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.,et al.(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004005320(实施例5)；WO2003029262(第74-75页)；WO2003002717(权利要求2；第63页)；WO200222153(第45-47页)；US2002042366(第20-21页)；WO200146261(第57-59页)；WO200146232(第63-65页)；WO9837193(权利要求1；第55-59页)；登录号:Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1；
(21)短小蛋白聚糖(BCAN,BEHAB,Genbank登录号AF229053)；Gary S.C.,etal.Gene 256,139-147,2000；Clark H.F.,et al.Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(权利要求11)；US2003186373(权利要求11)；US2003119131(权利要求1；图52)；US2003119122(权利要求1；图52)；US2003119126(权利要求1)；US2003119121(权利要求1；图52)；US2003119129(权利要求1)；US2003119130(权利要求1)；US2003119128(权利要求1；图52)；US2003119125(权利要求1)；WO2003016475(权利要求1)；WO200202634(权利要求1)；
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5,Genbank登录号NM_004442)；Chan,J.and Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)Oncogene 10(5):897-905(1995),Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998),Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000)；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；交叉援引:MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1；
(23)ASLG659(B7h,Genbank登录号AX092328)；US20040101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003165504(权利要求1)；US2003124140(实施例2)；US2003065143(图60)；WO2002102235(权利要求13；第299页)；US2003091580(实施例2)；WO200210187(权利要求6；图10)；WO200194641(权利要求12；图7b)；WO200202624(权利要求13；图1A-1B)；US2002034749(权利要求54；第45-46页)；WO200206317(实施例2；第320-321页,权利要求34；第321-322页)；WO200271928(第468-469页)；WO200202587(实施例1；图1)；WO200140269(实施例3；第190-192页)；WO200036107(实施例2；第205-207页)；WO2004053079(权利要求12)；WO2003004989(权利要求1)；WO200271928(第233-234,452-453页)；WO0116318；
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体,Genbank登录号AJ297436)；Reiter R.E.,etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.,et al.Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(实施例11)；US2004018553(权利要求17)；WO2003008537(权利要求1)；WO200281646(权利要求1；第164页)；WO2003003906(权利要求10；第288页)；WO200140309(实施例1；图17)；US2001055751(实施例1；图1b)；WO200032752(权利要求18；图1)；WO1998/51805(权利要求17；第97页)；WO1998/51824(权利要求10；第94页)；WO1998/40403(权利要求2；图1B)；登录号:O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1；
(25)GEDA(Genbank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC融合配偶样蛋白/pid＝AAP14954.1-Homo sapiens物种:Homo sapiens(人)；WO2003054152(权利要求20)；WO2003000842(权利要求1)；WO2003023013(实施例3,权利要求20)；US2003194704(权利要求45)；交叉援引:GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1；
(26)BAFF-R(B细胞活化性因子受体,BLyS受体3,BR3,Genbank登录号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-Homo sapiens；Thompson,J.S.,et al.Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(实施例；第32-33页)；WO2003014294(权利要求35；图6B)；WO2003035846(权利要求70；第615-616页)；WO200294852(第136-137栏)；WO200238766(权利要求3；第133页)；WO200224909(实施例3；图3)；交叉援引:MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同等型,BL-CAM,Lyb-8,Lyb8,SIGLEC-2,FLJ22814,Genbank登录号AK026467)；Wilson et al.(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；交叉援引:MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1；
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α,与Igβ(CD79B)共价相互作用并与IgM分子在表面上形成复合物,转导牵涉B细胞分化的信号的B细胞特异性蛋白)；pI:4.84；MW:25028；TM:2[P]基因染色体:19q13.2,Genbank登录号NP_001774.10)；WO2003088808,US20030228319；WO2003062401(权利要求9)；US2002150573(权利要求4,第13-14页)；WO9958658(权利要求13,图16)；WO9207574(图1)；US5644033；Ha et al.(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller et al.(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto et al.(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme et al.(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu et al.(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi et al.(1988)EMBO J.7(11):3457-3464；
(29)CXCR5(伯基特氏淋巴瘤受体1,由CXCL13趋化因子活化,在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能,在HIV-2感染和可能AIDS,淋巴瘤,骨髓瘤,和白血病发生中发挥作用的G蛋白偶联受体)；372aa；pI:8.54；MW:41959；TM:7[P]基因染色体:11q23.3,Genbank登录号NP_001707.1)；WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO200261087(图1)；WO200157188(权利要求20,第269页)；WO200172830(第12-13页)；WO200022129(实施例1,第152-153页,实施例2,第254-256页)；WO199928468(权利要求1,第38页)；US5440021(实施例2,第49-52栏)；WO9428931(第56-58页)；WO199217497(权利要求7,图5)；Dobner et al.(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella et al.(1995)Biochem.J.309:773-779；
(30)HLA-DOB(结合肽并将它们呈递给CD4+T淋巴细胞的MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；273aa；pI:6.56；MW:30820；TM:1[P]基因染色体:6p21.3,Genbank登录号NP_002111.1)；Tonnelle et al.(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson et al.(1989)Immunogenetics 29(6):411-413；Beck et al.(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius et al.(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck et al.(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruseet al.(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO9958658(权利要求13,图15)；US6153408(第35-38栏)；US5976551(第168-170栏)；US6011146(第145-146栏)；Kasahara et al.(1989)Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar et al.(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119；
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5,由细胞外ATP门控的离子通道,可能牵涉突触传递和神经发生,缺陷可促成特发性逼尿肌不稳定的病理生理情况)；422aa；pI:7.63；MW:47206；TM:1[P]基因染色体:17p13.3,Genbank登录号NP_002552.2；Le et al.(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(权利要求10)；Touchman et al.(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(权利要求20)；WO2003093444(权利要求1)；WO2003087768(权利要求1)；WO2003029277(第82页)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72,Lyb-2)；pI:8.66；MW:40225；TM:1[P]基因染色体:9p13.3,Genbank登录号NP_001773.1；WO2004042346(权利要求65)；WO2003/026493(第51-52,57-58页)；WO200075655(第105-106页)；Von Hoegen et al.(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白,调节B细胞活化和凋亡,功能丧失与具有系统性红斑狼疮的患者中的疾病活性升高有关)；661aa；pI:6.20；MW:74147；TM:1[P]基因染色体:5q12,Genbank登录号NP_005573.1；US2002193567；WO9707198(权利要求11,第39-42页)；Miura et al.(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura et al.(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(权利要求8,第57-61页)；WO200012130(第24-26页)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1,含有C2型Ig样和ITAM域的推定的免疫球蛋白Fc域的受体,可能在B淋巴细胞分化中具有作用)；429aa；pI:5.28；MW:46925；TM:1[P]基因染色体:1q21-1q22,Genbank登录号NP_443170.1；WO2003077836；WO200138490(权利要求6,图18E-1-18-E-2)；Davis et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003089624(权利要求7)；
(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关的2,可能在B细胞发育和淋巴瘤发生中有作用的推定的免疫受体；基因通过易位的失调在一些B细胞恶性中发生)；977aa；pI:6.88；MW:106468；TM:1[P]基因染色体:1q21,Genbank登录号人:AF343662,AF343663,AF343664,AF343665,AF369794,AF397453,AK090423,AK090475,AL834187,AY358085；小鼠:AK089756,AY158090,AY506558；NP_112571.1；WO2003024392(权利要求2,图97)；Nakayamaet al.(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(权利要求3,图18B-1-18B-2)；
(36)TENB2(TMEFF2,tomoregulin,TPEF,HPP1,TR,推定的跨膜蛋白聚糖,涉及EGF/调蛋白家族的生长因子和促卵泡素抑制素)；374aa；NCBI登录号:AAD55776,AAF91397,AAG49451,NCBI RefSeq:NP_057276；NCBI Gene:23671；OMIM:605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登录号AF179274；AY358907,CAF85723,CQ782436；WO2004074320；JP2004113151；WO2003042661；WO2003009814；EP1295944(第69-70页)；WO200230268(第329页)；WO200190304；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie et al.(2000)Genomics 67:146-152；Uchida et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang et al.(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones et al.(2001)Int J Cancer.Oct 15；94(2):178-84；
(37)PMEL17(silver同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey,R.P.et al.(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.et al.(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306；
(38)TMEFF1(具有EGF样和两个促卵泡素抑制素样域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)Genes Dev.17(21),2624-2629；Gery,S.et al.(2003)Oncogene 22(18):2723-2727；
(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；U95847；BC014962；NM_145793NM_005264；Kim,M.H.et al.(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.et al.(1996)Nature 382(6586):80-83；
(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物,基因座E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.et al.(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.et al.(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952；
(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蟾Xenopus laevis)；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima,K.et al.(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.et al.(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；
(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物,基因座G6D；Ly6-D,MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.et al.(2002)Genomics 80(1):113-123；Ribas,G.et al.(1999)J.Immunol.163(1):278-287；
(43)LGR5(含富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5；GPR49,GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.et al.(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.etal.(2003)Hepatology 37(3):528-533；
(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.et al.(2009)CancerSci.100(10):1895-1901；Narita,N.et al.(2009)Oncogene 28(34):3058-3068；
(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物,基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.et al.(2007)Cancer Res.67(24):11601-11611；deNooij-van Dalen,A.G.et al.(2003)Int.J.Cancer 103(6):768-774；
(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.and Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O'Dowd,B.F.et al.(1996)FEBSLett.394(3):325-329；
(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot,J.M.et al.(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.et al.(2009)Anticancer Res.29(2):617-623；
(48)ASPHD1(含天冬氨酸β-羟化酶域的1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.et al.(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127；
(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.et al.(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.et al.(2009)Int.J.Cancer125(4):909-917；
(50)TMEM118(环指蛋白,跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark,H.F.et al.(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.etal.(2006)Nature 440(7082):346-351；
(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.et al.(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101；
(52)CD33,唾液酸结合性,免疫球蛋白样凝集素家族的一个成员,是一种67kDa糖基化跨膜蛋白。在定型的骨髓单核细胞和类红细胞祖细胞以外,CD33在大多数髓样和单核细胞性白血病细胞上表达。在最早的多能干细胞,成熟粒细胞,淋巴样细胞,或非造血细胞上没有看到它(Sabbath et al.(1985)J.Clin.Invest.75:756-56；Andrews et al.(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在它的胞质尾上含有两个酪氨酸残基,其中每一个继以疏水性残基,与在许多抑制性受体中看到的免疫受体基于酪氨酸的抑制性基序(ITIM)相似。
(53)CLL-1(CLEC12A,MICL,和DCAL2),编码C型凝集素/C型凝集素样域(CTL/CTLD)超家族的一个成员。此家族的成员分享共同的蛋白质折叠且具有多样的功能,诸如细胞粘附,细胞-细胞信号传导,糖蛋白周转,和炎症和免疫应答中的作用。由此基因编码的蛋白质是粒细胞和单核细胞功能的负调节物。此基因的数种可变剪接转录物变体已有描述,但是这些变体中一些的全长性质尚未确定。此基因与染色体12p13上的天然杀伤基因复合物区中的其它CTL/CTLD超家族成员紧密连锁(Drickamer K.(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(5):585-90；van Rhenen A,et al.(2007)Blood 110(7):2659-66；Chen CH,et al.(2006)Blood 107(4):1459-67；Marshall AS,et al.(2006)Eur.J.Immunol.36(8):2159-69；Bakker AB,et al.(2005)Cancer Res.64(22):8443-50；Marshall AS,et al.(2004)J.Biol.Chem.279(15):14792-802)。已经显示CLL-1是一种II型跨膜受体,其包含单一C型凝集素样域(预测其不结合钙或糖),茎区,跨膜域和含有ITIM基序的短胞质尾。
在某些实施方案中,可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于它在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般地,可基于下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,抗体衍生物是否将用于限定条件下的治疗等。
在另一个实施方案中,提供了抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。
可以使用重组方法和组合物来生成抗体,例如如记载于US 4,816,567的。此类核酸可以编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中,提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中,提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中,宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化):(1)包含核酸的载体,所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列,或(2)第一载体和第二载体,所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸,所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中,宿主细胞是真核的,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。
对于抗体的重组生成,将编码抗体的核酸(例如如本文中描述的)分离并插入一种或多种载体中,以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体的重和轻链的基因)。
适合于克隆或表达抗体编码载体的宿主细胞包括本文中描述的原核或真核细胞。例如,可以在细菌中生成抗体,特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达,参见例如US 5,648,237；US 5,789,199；和US 5,840,523(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254,其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达之后,可以将抗体在可溶性级分中自细菌细胞团糊分离并可进一步纯化。
在原核生物以外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母是适合于抗体编码载体的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株(参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li etal.,Nat.Biotech.24:210-215(2006))。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定众多杆状病毒株,其可以与昆虫细胞联合使用,特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如US 5,959,177；US 6,040,498；US6,420,548；US 7,125,978；US 6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如,适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或如记载于例如Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4细胞,如记载于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TR1细胞,如记载于例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0,NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki and Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
接头
“接头”(L)是可用于将一个或多个司维司群药物模块(D)连接至抗体(Ab)以形成式IIa和IIb的抗体-药物缀合物(ADC)的双官能或多官能模块。在一些实施方案中,可以使用具有用于共价附着至药物和抗体的反应性官能度的接头来制备抗体-药物缀合物(ADC)。例如,在一些实施方案中,抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头或药物-接头中间体的反应性官能基形成键以生成ADC。
在一个方面,接头具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能度。非限制性例示性此类反应性官能度包括马来酰亚胺,卤代乙酰胺,α-卤代乙酰基,吡啶基二硫化物,活化的酯诸如琥珀酰亚胺酯,N-羟基琥珀酰亚胺,4-硝基苯基酯,五氟苯基酯,四氟苯基酯,酸酐,氯化酸,磺酰氯,异氰酸酯,和异硫氰酸酯。参见例如Klussman etal.(2004)Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773的第766页上的缀合方法和本文中的实施例。
在一些实施方案中,接头具有能够与抗体上存在的亲电子基团反应的官能度。例示性此类亲电子基团包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中,接头的反应性官能度的杂原子能与抗体上的亲电子基团反应并与抗体单元形成共价键。非限制性例示性反应性官能度包括但不限于酰肼(hydrazide),肟(oxime),氨基(amino),肼(hydrazine),硫代半卡巴腙(thiosemicarbazone),肼羧酸酯(hydrazine carboxylate),和芳酰肼(arylhydrazide)。
接头可包含一种或多种接头构件,包括但不限于延伸物单元,肽模拟物单元,肽单元,和间隔物单元。例示性接头构件包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”),马来酰亚胺基丙酰基(“MP”),缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”),丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”),苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys),对氨基苄氧羰基(“PAB”),4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯(“SPP”),和环己烷-1羧酸4-(N-马来酰亚胺基甲基)酯(“MCC”)。本领域已知多种接头构件,下文描述了其中一些。
接头可以是便于释放药物的“可切割接头”。非限制性例示性可切割接头包括酸不稳定接头(例如包含腙),蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头,光不稳定接头,或含二硫化物接头(Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)；US 5,208,020)。
接头的例示性实施方案记载于US 7,498,298,通过援引明确将其收入本文。
司维司群药物-接头中间体化合物
司维司群(CAS注册号697235-38-4),名称是(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯(化合物16,实施例1a),是自米兰(Aglaia foveolata)分离的洛克米兰酸酯(rocaglate)衍生物(Pan,L.et al.(2014)Nat.Prod.Rep.31:924-939)且独立于p53活性而调节G2/M检查点基因(Mi,Q.et al.(2006)Anticancer Res.26(5A):3349-56)。司维司群和类似物是有力且选择性的蛋白质合成抑制剂且已经研究了它们的抗过度增殖性特性(Liu,T.et al.(2012)Journal of Medicinal Chemistry,55(20):8859-8878；WO 2015085221；WO 2013016658；WO 2004041812；US 8,137,509；US 8,404,088；WO 2006007634；US 7,816,544)。司维司群具有结构:
Figure BDA0001945712510000491
依照实施例的规程制备式II的司维司群-接头中间体。
Figure BDA0001945712510000492
其中
Ra是选自CH3O,CN,NO2,和Cl的基团；
R1选自-OCH3和L-X；且
R2选自-CH(OH)CH2OH和L-X
L是接头；且
X包含选自马来酰亚胺,硫醇,氨基,溴化物,溴乙酰胺基,碘乙酰胺基,p-甲苯磺酸酯,碘化物,羟基,羧基,吡啶基二硫化物,和N-羟基琥珀酰亚胺的反应性官能团。
在一个例示性实施方案中,L-X选自-CH2CH2-X,-CH2CR2-X,-C(O)NRCH2-X,-CH2O-X,-CH2N(R)-X,-N(R)-X,-N(R)(C1-C12亚烷基)-X,-N(R)(C2-C8亚烯基)-X,-N(R)(C2-C8亚炔基)-X,和-N(R)(CH2CH2O)n-X；
n是1至6；
R独立选自H,C1-C12烷基,和C6-C20芳基；或者两个R形成C3-C7碳环环；且
亚烷基,亚烯基,亚炔基,烷基,和芳基是任选用一个或多个选自F,Cl,Br,N(CH3)2,NO2,和OCH3的基团取代的。
在一个例示性实施方案中,亚烷基选自-CH2CH2-,-CH2CH2CH2--CH(CH3)CH2-,和-C(CH3)2CH2-。
在一个例示性实施方案中,X选自:
Figure BDA0001945712510000501
其中波形线指示对L的附着；且
R3是NO2,Cl,F,CN或Br,且q是0,1,或2。
在一个例示性实施方案中,R1是-OCH3且R2是L-X。
在一个例示性实施方案中,R1是L-X且R2是-CH(OH)CH2OH。
在一个例示性实施方案中,L是具有下式的蛋白酶可切割的非肽接头:
-Str-PM-Y-,
其中Str是共价附着至X的延伸物单元；PM是肽模拟物单元；且Y是共价附着至该司维司群药物模块的间隔物单元。
肽模拟物接头描述于WO 2015/095227,WO 2015/095124或WO 2015/095223,据此通过援引将其完整收录。
在一个例示性实施方案中,Str是(CH2)5。
在一个例示性实施方案中,PM具有下式:
Figure BDA0001945712510000502
其中R7和R8一起形成C3-C7环烷基环,且
AA是选自H,-CH3,-CH2(C6H5),-CH2CH2CH2CH2NH2,-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,-CHCH(CH3)CH3,和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2的氨基酸侧链。
在一个例示性实施方案中,R7和R8一起形成环丁基。
在一个例示性实施方案中,Y包含对氨基苄基或对氨基苄基氧基羰基。
在一个例示性实施方案中,L是具有下式的肽接头:
-Str-Pep-Y-,
其中Str是共价附着至该抗体的延伸物单元；Pep是2至12个氨基酸残基的肽；且Y是共价附着至该司维司群药物模块的间隔物单元。
在一个例示性实施方案中,Str是(CH2)5。
在一些实施方案中,Str包括下面的,其中波形线指示对抗体,药物,或另外的接头构件的共价附着的位点:
Figure BDA0001945712510000511
在一个例示性实施方案中,Pep包含两个独立选自甘氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,赖氨酸,精氨酸,缬氨酸,和瓜氨酸的氨基酸残基。
在一个例示性实施方案中,该司维司群-接头中间体化合物选自表5的化合物。
司维司群-接头中间体化合物(LD)可以依照常规方法和实施例1-3来纯化和分离。纯化和分离方法是本领域知道的且包括沉淀,结晶,过滤,离心,超滤,和各种层析技术。层析可牵涉任何数目的方法,包括例如:反相和正相；大小排阻；离子交换；高,中和低压液体层析方法和装置；小规模分析性；模拟移动床(SMB)和制备性薄或厚层层析,以及小规模薄层和急骤层析的技术。在一些此类方面,可以将完成后的反应混合物蒸发至干燥,接着在极性非质子溶剂中再溶解。可以将溶液过滤,然后通过组合该溶液与非极性反溶剂(antisolvent),诸如例如己烷或环己烷来沉淀。然后可以通过过滤来收集沉淀物,任选清洗,然后干燥。
表5:司维司群-接头中间体
Figure BDA0001945712510000512
Figure BDA0001945712510000521
Figure BDA0001945712510000531
抗体-药物缀合物
本发明提供具有经由接头共价附着至司维司群药物模块的抗体的抗体-药物缀合物,其选自式la和Ib:
Figure BDA0001945712510000532
Figure BDA0001945712510000541
或其药学可接受盐,
其中
Ra是选自CH3O,CN,NO2,和Cl的基团；
L是接头；
p是1至8的整数；且
Ab是结合一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体。
在一个例示性实施方案中,该抗体结合一种或多种选自(1)-(53)的肿瘤相关抗原或细胞表面受体:
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型)；
(2)E16(LAT1,SLC7A5)；
(3)STEAP1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；
(4)MUC16(0772P,CA125)；
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核细胞强化因子,间皮素)；
(6)Napi2b(NAPI-3B,NPTIIb,SLC34A2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)；
(7)Sema 5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白5b Hlog,sema域,七次血小板反应蛋白重复(1型和1型样),跨膜域(TM)和短胞质域,(脑信号蛋白)5B)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因)；
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体)；
(10)MSG783(RNF124,假设的蛋白质FLJ20315)；
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白)；
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体潜在阳离子通道,亚家族M,成员4)；
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎瘤衍生的生长因子)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃巴二氏病毒受体)或Hs73792)；
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29)；
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含SH2域的磷酸酶锚定蛋白1a),SPAP1B,SPAP1C)；
(17)HER2；
(18)NCA；
(19)MDP；
(20)IL20Rα；
(21)短小蛋白聚糖；
(22)EphB2R；
(23)ASLG659；
(24)PSCA；
(25)GEDA；
(26)BAFF-R(B细胞活化性因子受体,BLyS受体3,BR3)；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同等型)；
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α)；
(29)CXCR5(伯基特氏淋巴瘤受体1)；
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72,Lyb-2)；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；
(35)FcRH5(IRTA2,免疫球蛋白超家族受体易位相关的2)；
(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；
(37)PMEL17(silver同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；
(38)TMEFF1(具有EGF样和两个促卵泡素抑制素样域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；
(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；
(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物,基因座E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)；
(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蟾(Xenopus laevis))；SHISA2)；
(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物,基因座G6D；Ly6-D,MEGT1)；
(43)LGR5(含富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5；GPR49,GPR67)；
(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；
(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物,基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；
(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；
(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；
(48)ASPHD1(含天冬氨酸β-羟化酶域的1；LOC253982)；
(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；
(50)TMEM118(环指蛋白,跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；
(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；
(52)CD33；和
(53)CLL-1。
在一个例示性实施方案中,Ab选自抗HER2 4D5,抗CD22,抗CD33,抗Ly6E,抗Napi3b,抗HER2 7C2,和抗CLL-1。
在一个例示性实施方案中,Ab是半胱氨酸工程化改造的抗体。
在一个例示性实施方案中,该半胱氨酸工程化改造的抗体是选自HC A118C,LCK149C,HC A140C,LC V205C,LC S121C,和HC L177C的突变体。
在一个例示性实施方案中,L是具有下式的蛋白酶可切割的非肽接头:
-Str-PM-Y-,
其中Str是共价附着至该抗体的延伸物单元；PM是肽模拟物单元；且Y是共价附着至该司维司群药物模块的间隔物单元。
在一个例示性实施方案中,Str具有下式:
Figure BDA0001945712510000571
其中R6选自由C1-C12亚烷基,C1-C12亚烷基-C(＝O),C1-C12亚烷基-NH,(CH2CH2O)r,(CH2CH2O)r-C(＝O),(CH2CH2O)r-CH2,和C1-C12亚烷基-NHC(＝O)CH2CH(噻吩-3-基)组成的组,其中r是范围为1至10的整数。
在一个例示性实施方案中,R6是(CH2)5。
在一个例示性实施方案中,PM具有下式:
Figure BDA0001945712510000572
其中R7和R8一起形成C3-C7环烷基环,且
AA是选自H,-CH3,-CH2(C6H5),-CH2CH2CH2CH2NH2,-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,-CHCH(CH3)CH3,和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2的氨基酸侧链。
在一个例示性实施方案中,Y包含对氨基苄基或对氨基苄基氧基羰基。
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000573
其中D是该司维司群药物模块。
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000574
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000581
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000582
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物选自下式:
Figure BDA0001945712510000583
在一个例示性实施方案中,L是具有下式的肽接头:
-Str-Pep-Y-,
其中Str是共价附着至该抗体的延伸物单元；Pep是2至12个氨基酸残基的肽；且Y是共价附着至该司维司群药物模块的间隔物单元。
在一个例示性实施方案中,Str具有下式:
Figure BDA0001945712510000584
其中R6选自由C1-C12亚烷基,C1-C12亚烷基-C(＝O),C1-C12亚烷基-NH,(CH2CH2O)r,(CH2CH2O)r-C(＝O),(CH2CH2O)r-CH2,和C1-C12亚烷基-NHC(＝O)CH2CH(噻吩-3-基)组成的组,其中r是范围为1至10的整数。
在一个例示性实施方案中,R6是(CH2)5。
在一个例示性实施方案中,Pep包含2至12个独立选自甘氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,赖氨酸,精氨酸,缬氨酸,和瓜氨酸的氨基酸残基。
在一个例示性实施方案中,Pep选自缬氨酸-瓜氨酸,丙氨酸-苯丙氨酸,和苯丙氨酸-赖氨酸。
在一个例示性实施方案中,Y包含对氨基苄基或对氨基苄基氧基羰基。
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000591
其中AA1和AA2独立选自氨基酸侧链。
在一个例示性实施方案中,该氨基酸侧链独立选自H,-CH3,-CH2(C6H5),-CH2CH2CH2CH2NH2,-CH2CH2CH2NHC(NH)NH2,-CHCH(CH3)CH3,和-CH2CH2CH2NHC(O)NH2。
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000592
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000593
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000601
在一个实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000602
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000603
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000604
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物具有下式:
Figure BDA0001945712510000605
在一个例示性实施方案中,L包含二硫化物基团。
在一个例示性实施方案中,p是1,2,3,或4。
在一个例示性实施方案中,该抗体-药物缀合物化合物构成该抗体-药物缀合物化合物的混合物,其中该抗体-药物缀合物化合物混合物中的平均药物载荷每抗体是约2至约5。
本发明的抗体-药物缀合物化合物包括那些具有抗癌活性的。本发明的抗体-药物缀合物将有效剂量的药物选择性投递至肿瘤组织,由此在提高治疗指数(“治疗窗”)的同时可实现更大的选择性(即更低的有效剂量)。
药物载荷以p代表,式I的分子中每个抗体的司维司群药物模块的数目。药物载荷的范围可以是1至约8个药物模块(D)每个抗体。式I的抗体-药物缀合物包括缀合有一定范围的药物模块(1至约8个)的抗体的混合物或集合。在一些实施方案中,可缀合至抗体的药物模块的数目受到游离半胱氨酸残基的数目限制。在一些实施方案中,通过本文中描述的方法将游离半胱氨酸残基引入抗体氨基酸序列中。在此类方面,p可以是1,2,3,4,5,6,7,或8,而且其范围是诸如1至8或2至5。在任何此类方面,p和n相等(即p＝n＝1,2,3,4,5,6,7,或8,或其之间的一些范围)。式I的例示性抗体-药物缀合物包括但不限于具有1,2,3,或4个工程化改造的半胱氨酸氨基酸的抗体(Lyon,R.et al.(2012)Methods in Enzym.502:123-138)。在一些实施方案中,抗体中早就存在一个或多个游离半胱氨酸残基,无需使用工程化改造,在这种情况中,可使用现有的游离半胱氨酸残基将抗体缀合至药物。在一些实施方案中,在缀合抗体之前将抗体暴露于还原条件,从而生成一个或多个游离半胱氨酸残基。来自缀合反应的抗体-药物缀合物制备物中每个抗体的药物模块的平均数(DAR)可通过常规手段来表征,诸如质谱术,ELISA测定法,和HPLC。还可测定抗体-药物缀合物在p方面的定量分布。在一些情况中,将p为某数值的均质抗体-药物缀合物自具有其它药物载荷的抗体-药物缀合物分离,纯化,和表征可通过诸如反相HPLC或电泳等手段来实现。
对于一些抗体-药物缀合物,p可能受到抗体上附着位点的数目限制。例如,在附着是半胱氨酸硫醇的情况中,正如上文描述的某些例示性实施方案中的那样,抗体可能只有一个或有限数目的半胱氨酸硫醇基团,或者可能只有一个或有限数目的有足够反应性的硫醇基团,可附着药物。在某些实施方案中,较高的药物载荷(例如p>5)可引起某些抗体-药物缀合物的聚集,不溶性,毒性,或丧失细胞通透性。在某些实施方案中,抗体-药物缀合物的平均药物载荷的范围是1至约8；约2至约6；或约3至约5。事实上,对于某些抗体-药物缀合物已经显示了每个抗体的药物模块的最佳比率可以是小于8,而且可以是约2至约5(参见例如US 7,498,298)。
在某些实施方案中,在缀合反应期间少于理论最大值的司维司群药物模块缀合至抗体。抗体可含有例如不与药物反应的半胱氨酸残基,如本文中讨论的。一般地,抗体不包含许多可连接至药物模块的游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团；事实上,抗体中的大多数天然半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在。在某些实施方案中,可以在部分或完全还原条件下用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)还原抗体以生成反应性半胱氨酸硫醇基团。在某些实施方案中,使抗体经受变性条件以暴露反应性亲核基团,诸如赖氨酸或半胱氨酸。
抗体-药物缀合物的载荷(药物/抗体比)可以以不同方式来控制,例如通过:(i)限制司维司群-接头中间体化合物相对于抗体的摩尔过量,(ii)限制缀合反应的时间或温度,和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。
要理解的是,在多于一个亲核基团与药物反应的情况中,所得产物是具有一个或多个药物模块附着于抗体之分布的抗体-药物缀合物化合物的混合物。可通过对抗体特异性的和对药物特异性的双重ELISA抗体测定法自混合物计算每个抗体的药物的平均数。混合物中的各种抗体-药物缀合物分子可通过质谱术来鉴定,并通过HPLC来分离,例如疏水相互作用层析(参见例如McDonagh et al.(2006)Prot.Engr.Design&Selection 19(7):299-307；Hamblett et al.(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Hamblett,K.J.et al.,“Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity ofan anti-CD30antibody-drug conjugate,”Abstract No.624,American Association forCancer Research,2004Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of the AACR,Volume 45,March 2004；Alley,S.C.et al.,“Controlling the location of drugattachment in antibody-drug conjugates,”Abstract No.627,American Associationfor Cancer Research,2004Annual Meeting,March 27-31,2004,Proceedings of theAACR,Volume 45,March 2004)。在某些实施方案中,可通过电泳或层析自缀合混合物分离具有单一载荷值的均质抗体-药物缀合物。
在一些方面,为了缀合反应中的反应性,该抗体可以是如本文中其它部分描述的半胱氨酸工程化改造的抗体和/或可以用还原剂处理。在本领域知道的不会对抗体的稳定性或抗原结合特异性有不利影响的生理缓冲系统中溶解Ab。在一些方面,使用磷酸盐缓冲盐水。在包含至少一种如本文中其它部分描述的极性非质子溶剂的溶剂系统中溶解司维司群-接头中间体化合物。在一些此类方面,在pH 8Tris缓冲液(例如50mM Tris)中溶解司维司群-接头中间体至约5mM,约10mM,约20mM,约30mM,约40mM或约50mM的浓度,和其诸如约5mM至约50mM或约10mM至约30mM的范围。在一些方面,在DMSO或乙腈中,或在DMSO中溶解司维司群-接头中间体。在缀合反应中,稀释当量过量的司维司群-接头中间体溶液并与冷藏的抗体溶液(例如约1℃至约10℃)组合。司维司群-接头中间体溶液可以恰当地用至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂(它的例子包括水,甲醇,乙醇,正丙醇,和乙酸)稀释。在一些特定方面,在DMSO中溶解司维司群-接头中间体并用乙腈和水稀释,之后与抗体溶液混合。司维司群对抗体的当量可以恰当地是约1.5:1,约3:1,约5:1,约10:1,约15:1或约20:1,和其诸如约1.5:1至约20:1,约1.5:1至约15:1,约1.5:1至约10:l,约3:1至约15:1,约3:1至约10:1,约5:1至约15:1或约5:1至约10:1的范围。可以通过本领域知道的方法(诸如如本文中其它部分描述的LC-MS)恰当地对反应监测完全,而且反应典型地在约1小时至约24小时中完全。在反应完全之后,将试剂添加至反应混合物以淬灭反应并给未反应的抗体硫醇基团加帽。合适的试剂的一个例子是乙基马来酰亚胺。
在依照实施例5的缀合之后,可以通过本领域知道的纯化方法诸如例如且不限于大小排阻层析,疏水相互作用层析,离子交换层析,层析聚集,超滤,离心超滤,和其组合自未缀合的反应物和/或缀合物聚集物纯化和分出抗体-司维司群缀合物。例如,纯化之前可以稀释抗体-司维司群缀合物,诸如在20mM琥珀酸钠,pH 5中。将稀释的溶液应用于阳离子交换柱,接着用例如至少10个柱体积的20mM琥珀酸钠,pH 5清洗。可以恰当地用PBS洗脱缀合物。
表6:抗体-药物缀合物(ADC)
Figure BDA0001945712510000631
Figure BDA0001945712510000641
DAR＝药物/抗体比平均值
A118C(EU编号方式)＝A121C(连续编号方式)＝A114C(Kabat编号方式)野生型(“WT”),半胱氨酸工程化改造的突变体抗体(“thio”),轻链(“LC”),重链(“HC”),6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”),马来酰亚胺基丙酰基(“MP”),缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”),丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”),对氨基苄基(“PAB”),和对氨基苄基氧基羰基(“PABC”)
体外细胞增殖测定法
一般地,如下测量抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制性活性:在细胞培养培养基中使具有受体蛋白(例如HER2)的哺乳动物细胞暴露于ADC的抗体；将细胞培养约6小时至约5天的时段；并测量细胞存活力。使用基于细胞的体外测定法来测量本发明ADC的凋亡诱导(胱天蛋白酶活化),细胞毒性,和存活力(增殖)。
通过细胞增殖测定法测量抗体-药物缀合物(ADC)的体外效力(实施例6)。本发明的ADC在抑制肿瘤细胞增殖方面显示令人惊讶且出乎意料的效力。ADC的效力与细胞的靶抗原表达有关。所测试的缀合物在体外能够结合在细胞的表面上表达的特定抗原并引起那些细胞的死亡。
Figure BDA0001945712510000651
发光细胞存活力测定法是一种可商购的(Promega Corp.,Madison,WI)基于鞘翅目(Coleoptera)萤光素酶的重组表达的均质测定法方法(US 5,583,024；US 5,674,713；US 5,700,670)。此细胞增殖测定法基于对存在的ATP(代谢活性细胞的一种指示剂)的量化来测定培养物中可存活细胞的数目(Crouch et al.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6,602,677)。以96孔格式进行
Figure BDA0001945712510000652
测定法,使之易于进行自动化高通量筛选(HTS)(Cree et al.(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。该均质测定法规程牵涉将单一试剂(
Figure BDA0001945712510000653
试剂)直接添加至在补充有血清的培养基中培养的细胞。无需细胞清洗,去除培养基和多个吸移步骤。该系统在添加试剂并混合之后10分钟里检测384孔格式中低至15个细胞/孔。可以用ADC连续处理细胞,或者可以处理它们并与ADC分开。一般地,短暂(即3小时)处理的细胞显示与连续处理的细胞相同的效力作用。
在体外对细胞增殖的抑制可使用CellTiter-GloTM发光细胞存活力测定法来测定,它的一个实施方案如实施例6详述的。此类测定法基于对存在的ATP(代谢活性细胞的一种指示剂)的量化来测定培养物中可存活细胞的数目(Crouch et al.(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6,602,677)。该测定法可以以96或384孔格式进行,使之易于进行自动化高流通量筛选(HTS)。参见Cree et al.(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。该测定法规程牵涉将单一试剂(
Figure BDA0001945712510000654
试剂)直接添加至培养的细胞。这导致细胞裂解和通过萤光素酶反应产生的发光信号的生成。发光信号与所存在的ATP的量成比例,后者与培养物中存在的可存活细胞的数目成正比。可以通过光度计或CCD照相机成像装置来记录数据。发光输出表述成相对光单位(RLU)。
均质“添加-混合-测量”格式导致细胞裂解和与所存在的ATP的量成比例的发光信号的生成。ATP的量与培养物中存在的细胞的数目成正比。
Figure BDA0001945712510000655
测定法产生“辉光型”发光信号,它是由萤光素酶反应产生的,具有一般大于5小时的半衰期,取决于所使用的细胞类型和培养基。以相对发光单位(RLU)反映可存活细胞。底物甲虫萤光素被重组萤火虫萤光素酶氧化脱羧基,伴随ATP转化成AMP并产生光子。
使用基于细胞的体外测定法来测量存本发明ADC的凋亡诱导(胱天蛋白酶活化),细胞毒性,和活力(增殖)。一般地,如下测量抗体-药物缀合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制性活性:在细胞培养培养基中使表达抗原(诸如Her2或MUC16多肽)的哺乳动物细胞暴露于ADC；将细胞培养约6小时至约5天的时段；并测量细胞存活力。对于针对抗MUC16ADC的细胞增殖测定法有用的哺乳动物细胞可包括:(1)表达MUC16多肽的细胞系OVCAR-3；(2)工程化改造成在它的细胞表面上稳定表达MUC16多肽一部分的PC3衍生细胞系(PC3/MUC16)；(3)不表达MUC16多肽的亲本PC3细胞系；和(4)不表达MUC16多肽但携带用于驱动外源MUC16表达的载体的PC3细胞系(PC3/neo)。
图1A和1B以SK-BR-3(图1A)和KPL-4(图1B)细胞中5天时的体外细胞存活力对ADC浓度(μg/ml)的图显示抗体-药物缀合物的功效。在96孔板中分配细胞(SK-BR-3,5000个细胞/孔；KPL-4,1500个细胞/孔),并容许贴壁过夜,依照实施例6进行。然后取出培养基并用含有不同浓度的缀合物的新鲜培养培养基替换。在药物施用后5天使用Cell Titer-Glo测量细胞存活力。在两种细胞系SK-BR-3(图1A)和KPL-4(图1B)中,ADC-103,Thio抗Her27C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺比ADC-106,Thio Hu抗Her2 7C2HC:A140C氨基司维司群类似物更加有力。脱靶对照,ADC-105,Thio Hu抗CD22 10F4v3HC:A140C氨基司维司群类似物没有活性。
游离药物司维司群胺(下文)由于它的不透性而无活性,而游离药物氨基司维司群类似物有活性(表7)。7C2氨基司维司群类似物ADC-106不如7C2司维司群胺ADC-103有力。对7C2氨基司维司群类似物ADC-106观察到两阶段剂量响应曲线。游离药物氨基司维司群类似物具有pM或低nMIC50,而司维司群胺游离药物由于它的不透性而显示无活性。因此,难以确定两种缀合物之间的效力差异是否是由游离药物效力的差异引起的。7C2氨基司维司群类似物ADC-106在SK-BR-3细胞中展现的效力不如KPL-4细胞,尽管游离药物氨基司维司群类似物在SK-BR-3(1.6nM)和KPL-4(1.2nM)细胞中具有相似的IC50值。
Figure BDA0001945712510000661
Figure BDA0001945712510000671
表7:游离药物司维司群化合物的体外功效
Figure BDA0001945712510000672
体内功效
本发明的抗体-药物缀合物(ADC)的体内功效可通过小鼠中的肿瘤异种移植物研究来测量(实施例7-10)。本发明的ADC在抑制肿瘤生长方面显示令人惊讶且出乎意料的靶依赖性和剂量依赖性的效力。ADC的功效与肿瘤细胞的靶抗原表达有关。
如下在体内测量抗体-药物缀合物的功效,即在啮齿动物中植入癌细胞的同种异体移植物或异种移植物并用ADC处理肿瘤。预期结果可变,取决于细胞系,ADC对癌细胞上存在的受体的抗体结合的特异性,剂量给药方案,和其它因素。使用表达中等至高水平的肿瘤相关抗原的转基因外植体小鼠模型(包括Her2表达性KPL4和CD22表达性BJAB)测量ADC的体内功效。将受试者用ADC处理一次并监测3-6周以测量肿瘤倍增前时间,log细胞杀伤,和肿瘤收缩。进行跟踪剂量-响应和多剂实验。
例如,本发明的抗HER2ADC的体内功效可通过高表达HER2的转基因外植体小鼠模型来测量(Phillips et al.(2008)Cancer Res.68:9280-90)。自不响应
Figure BDA0001945712510000681
(Genentech,Inc.)疗法或响应较差的Fo5mmtv转基因小鼠繁殖同种异体移植物。将受试者用某些剂量水平(mg/kg)的ADC和安慰剂缓冲液对照(媒介)处理一次或多次并监测2周或更多以测量肿瘤倍增前时间,log细胞杀伤,和肿瘤收缩,依照实施例7进行。
图2以CB-17Fox Chase SCID小鼠中的CD22表达性Bjab-luc人异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效,依照实施例9进行,是在用下述各项IV剂量给药一次之后。
1)媒介(HisAc 20mM,蔗糖240mM,TW-20 0.02％,pH 5.5),100μL,IV一次
2)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,1mg/kg IV一次
3)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,3mg/kg IV一次
4)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,6mg/kg IV一次
5)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,10mg/kg IV一次
6)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,3mg/kg IV一次
与媒介组相比,对CD22司维司群-胺ADC-104测试的所有剂量水平看到活性。以1和3mg/kg给药的ADC-104显示中等活性而6和10mg/kg在停滞左右。以3mg/kg给药的Her2对照司维司群-胺ADC-103有一些生长延迟。作为安全性信号,没有看到体重损失。观察到肿瘤抑制的证据,但是不是确定性的,因为肿瘤体积高度可变。
图3以scid米色小鼠中的HER2表达性KPL4人乳房异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效,依照实施例10进行。
1)媒介(HisAc 20mM,蔗糖240mM,TW-20 0.02％,pH 5.5),100μL,IV一次
2)司维司群,0.09mg/kg,IV一次
3)司维司群,1mg/kg,IP qdX5达2周
4)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,1mg/kg IV一次
5)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,3mg/kg IV一次
6)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,6mg/kg IV一次
7)Thio抗Her2 7C2LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,10mg/kg IV一次
8)Thio抗CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,3mg/kg IV一次
与媒介和脱靶对照ADC-104相比,对抗HER2 7C2司维司群-胺ADC-103测试的所有剂量水平看到活性。以1和3mg/kg给药的ADC-103显示中等活性而6和10mg/kg在停滞左右。以3mg/kg给药的CD22对照司维司群-胺ADC-104没有生长延迟。作为安全性信号,没有看到体重损失。
图4以CB-17Fox Chase SCID小鼠中的CD22表达性Bjab-luc人异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效。
1)媒介(组氨酸缓冲液#8),100μL,IV一次
2)Thio CD22LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-104,10mg/kg IV一次
3)Thio Her2(7C2)LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺,ADC-103,10mg/kg IV一次
4)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,1mg/kg IV一次
5)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,3mg/kg IV一次
6)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,6mg/kg IV一次
7)Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105,10mg/kg IV一次
8)Thio Her2(7C2)HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-106,3mg/kg IV一次
9)Thio Her2(7C2)HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-106,10mg/kg IV一次
两种剂量水平的Her2(7C2)HC A140C MC-vc-PAB-氨基司维司群,ADC-106,以及Her2(7C2)LC K149C MC-vc-PAB-司维司群胺,ADC-103作为对照存在。在第1,3,和7天自第7组(10mg/kg剂量Thio CD22HC-A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群,ADC-105)收集血浆用于稳定性分析。以10mg/kg给药的CD22LC K149C-MC-vc-PAB-司维司群胺,ADC-104导致肿瘤停滞(102％TGI)。与图2中的结果(其中看来动物或是较好地响应治疗或是根本不响应)相比,这些结果看来确认肿瘤停滞应答(5/5只动物具有肿瘤停滞,但是趋势朝向消退)。以10mg/kg给药的对照Her2(7C2)LC K149C-MC-vc-PAB-司维司群胺,ADC-103导致32％TGI。以1-10mg/kg给药的CD22HC A140C-MC-vc-PAB-氨基-司维司群(CNJ 3592,G03063194)导致在1mg/kg时的中等TGI(81％)和在所有更高剂量时的消退。还有,氨基-司维司群看来比司维司群-胺更加有力,如果我们比较两种10mg/kg剂量(第2组对第7组)的话,但是要说明的是它们在两个不同的附着位点上。3和10mg/kg剂量的对照Her2(7C2)HC A140C-MC-vcPAB-氨基-司维司群(CNJ 3593,G03063194)导致相似的中等响应(30-40％TGI)。在所有剂量组中没有观察到体重损失。
图5以CB-17Fox Chase SCID小鼠中的CD22表达性Bjab-luc人异种移植物模型中体内拟合的肿瘤体积随时间的变化的图显示抗体-药物缀合物的功效。
1)媒介(组氨酸缓冲液#8),100μL,IV一次
2)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-110,3mg/kg IV一次
3)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-110,6mg/kg IV一次
4)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-110,10mg/kg IV一次
5)Thio Hu抗LY6E 9B12v12LC K149C-MC-sq-cit-PAB-司维司群-胺,ADC-109,10mg/kg IV一次
6)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,0.3mg/kg IV一次
7)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,1mg/kg IV一次
8)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,3mg/kg IV一次
9)Thio Hu抗CD22 10F4v3LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-108,6mg/kg IV一次
10)Thio Hu抗LY6E 9B12v12LC K149C-MC-sq-cit-PAB-氨基-司维司群,ADC-107,6mg/kg IV一次
司维司群胺ADC-110在10mg/kg给出中等响应(第4组),在第20天导致81％肿瘤生长抑制。氨基司维司群ADC-108在3mg/kg给出完全肿瘤消退(第8组)。在这两种情况中,功效均是剂量依赖性的,较低的剂量给出较少的响应。功效还是靶特异性的,因为靶向性CD22ADC(ADC-108和ADC-110)和两种非靶(LY6E)对照ADC(ADC-109(第5组)和ADC-107(第10组))之间有分离。
药用配制剂
本发明的治疗性抗体-药物缀合物的药用配制剂典型地以期望的纯度且与一种或多种任选的药学可接受载剂,赋形剂,和/或媒介(Remington's PharmaceuticalSciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1980))一起以冻干配制剂或水溶液的形式制备供以单位剂量可注射形式胃肠外施用,即推注,静脉内,肿瘤内注射。药学可接受载剂一般在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,而且包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rHuPH20(
Figure BDA0001945712510000721
Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面,将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
例示性冻干抗体和免疫缀合物配制剂记载于US 6,267,958。水性抗体或免疫缀合物配制剂包括那些记载于US 6,171,586和WO 2006/044908的,后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗的特定适应症所必需的活性组分,优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶状药物投递系统中(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳剂,纳米颗粒和纳米胶囊),或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体或免疫缀合物的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质处于成形物品的形式,例如膜或微胶囊。
要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现,例如通过穿过无菌滤膜过滤。
治疗方法
涵盖的是本发明的抗体-药物缀合物可用于治疗各种疾病或病症,例如特征在于肿瘤抗原的过表达的。例示性状况或过度增殖性病症包括良性或恶性实体瘤和血液学病症诸如白血病和淋巴样恶性。其它包括神经元,胶质,星形细胞,下丘脑,腺体,巨噬细胞,上皮,基质,囊胚腔,炎性,血管发生性和免疫学(包括自身免疫)病症。
在一个方面,本文中提供的抗体-药物缀合物在抑制癌细胞增殖的方法中使用,该方法包含在允许该抗体或抗体-药物缀合物结合细胞的表面上的肿瘤相关抗原的条件下将细胞暴露于抗体-药物缀合物,由此抑制细胞的增殖。在某些实施方案中,该方法是体外或体内方法。在又一些实施方案中,该细胞是淋巴细胞,成淋巴细胞,单核细胞,或骨髓单核细胞的细胞。
在另一个方面,提供了抗体-药物缀合物,其供作为药物使用。在又一些方面,提供了抗体-药物缀合物,其供在治疗方法中使用。在某些实施方案中,提供了抗体-药物缀合物,其供在治疗癌症中使用。在某些实施方案中,本发明提供抗体-药物缀合物,其供在治疗个体的方法中使用,包含对该个体施用有效量的该抗体-药物缀合物。在一个此类实施方案中,该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如本文中描述的。
在又一个方面,本发明提供抗体-药物缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中,该药物用于治疗癌症,该方法包含对具有癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中,该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂,例如如本文中描述的。
在又一个方面,本发明提供一种用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中,该方法包含对通过检测肿瘤相关抗原表达表征的具有此类癌症的个体施用有效量的本发明的抗体-药物缀合物。在一个此类实施方案中,该方法进一步包含对该个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂,如本文中描述的。
在疗法中可以单独或与其它药剂组合使用本发明的抗体-药物缀合物。例如,可以与至少一种另外的治疗剂,诸如化疗剂共施用本发明的抗体-药物缀合物。
本文中记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一配制剂或分开的配制剂中),和分开施用,在该情况中,可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前,同时,和/或之后发生本发明的抗体-药物缀合物的施用。也可以与放射疗法组合使用本发明的抗体-药物缀合物。
可以通过任何合适的手段,包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用来施用本发明的抗体-药物缀合物(和任何另外的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用,推注施用,和脉冲输注。
本发明的抗体-药物缀合物会以一种符合优秀医学实践的方式配制,定剂量,和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用方法,施用日程表,和医学从业人员知道的其它因素。抗体-药物缀合物无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体-药物缀合物的量,病症或治疗的类型,和本文中讨论的其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量和施用途径,或以本文所述剂量的约1-99％,或以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
为了预防或治疗疾病,本发明的抗体-药物缀合物(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型,抗体或免疫缀合物的类型,疾病的严重性和过程,施用抗体-药物缀合物是出于预防还是治疗目的,先前的疗法,患者的临床史和对抗体-药物缀合物的响应,和主治医师的斟酌。抗体-药物缀合物恰当地一次性地或在一系列治疗里施用于患者。取决于疾病的类型和严重性,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg–10mg/kg)的抗体-药物缀合物可作为初始候选剂量施用于患者,无论是例如通过一次或多次分开的施用,或者是通过连续输注。取决予本文中提到的因素,一种典型的日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间里的重复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生期望的疾病症状遏制。抗体-药物缀合物的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此,可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg,2.0mg/kg,4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用,例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂,或例如约6剂抗体)。可施用较高的初始加载剂量,接着是一个或多个较低的剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测此疗法的进展。
认为靶细胞中来自抗体-司维司群缀合物的司维司群的细胞内释放源自对接头单元的切割以释放活性司维司群模块,诸如谷胱甘肽对二硫化物接头键的还原性切割或蛋白酶对肽或肽模拟物单元的切割。谷胱甘肽介导的释放与现有技术已知的某些接头,诸如酸不安定的肼接头相比提供优势。更加特别地,已知谷胱甘肽的血液浓度很低,诸如在微摩尔范围中,而细胞内谷胱甘肽浓度典型地要大高至三个数量级,诸如在毫摩尔范围中。进一步认为由于还原酶的活性升高,癌细胞中的谷胱甘肽浓度甚至更大。因此,认为本公开文本的司维司群-抗体缀合物提供改善的血流中的稳定性和改善的细胞内释放速率。
制品
在本发明的另一个方面,提供了一种制品,其含有对于治疗,预防和/或诊断本文中描述的病症有用的材料。制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋,等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有本身或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断病症的组合物且可具有无菌存取口(例如,容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体-药物缀合物。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况。此外,制品可包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的抗体-药物缀合物；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定状况的包装插页。或者/另外,制品可进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液或右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于本文中提供的一般性描述,可以实践多种其它实施方案。
实施例1a:司维司群-接头中间体LD-51(表5)。(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((4R)-2-(4-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯LD-51的合成
步骤1:1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐10a的制备
Figure BDA0001945712510000761
将马来酸酐,呋喃-2,5-二酮(150g,1.53mol)添加至6-氨基己酸(201g,1.53mol)在HOAc(1000mL)中的搅动溶液。将混合物于室温搅动2小时之后,将它回流加热8小时。在减压下去除有机溶剂并用EtOAc(500mL x 3)萃取残留物,用H2O清洗。在Na2SO4上干燥合并的有机层并浓缩以给出粗制产物。用石油醚清洗它以给出6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸,为白色固体(250g,77.4％)。将DPPA(130g,473mmol)和TEA(47.9g,473mmol)添加至6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸(100g,473mmol)在t-BuOH(200mL)中的溶液。将混合物在N2下回流加热8小时。浓缩混合物,并通过硅胶上的柱层析(PE:EtOAc＝3:1)来纯化残留物以给出5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨基甲酸叔丁酯(13g,10％)。对5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨基甲酸叔丁酯(28g,992mmol)在无水EtOAc(30mL)中的溶液逐滴添加HCl/EtOAc(50mL)。将混合物于室温搅动5小时之后,将它过滤并干燥固体以给出1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐10a(16g,73.7％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.02(s,2H),6.99(s,2H),3.37-3.34(m,2H),2.71-2.64(m,2H),1.56-1.43(m,4H),1.23-1.20(m,2H)。
步骤2:(S)-1-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基氨甲酰基)环丁烷羧酸10b的制备
Figure BDA0001945712510000771
对(S)-2-氨基-5-脲基戊酸10g(17.50g,0.10mol)在二氧杂环己烷和H2O的混合物(50mL/75mL)中的混合物添加K2CO3(34.55g,0.25mol)。于0℃缓慢添加Fmoc-Cl(30.96g,0.12mol)。将反应混合物温热至室温2小时。在减压下去除有机溶剂,并用6M HCl溶液将水浆调节至pH＝3,并用EtOAc(100mL x3)萃取。在Na2SO4上干燥有机层,过滤,并在减压下浓缩以给出(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酸10f(38.0g,95.6％)。10f可商购。
对10f(4g,10mmol)在DCM和MeOH的混合物(100mL/50mL)中的溶液添加(4-氨基苯基)甲醇(1.6g,13mmol,1.3eq)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉,EEDQ,Sigma-Aldrich,CAS注册号16357-59-8(3.2g,13mmol,1.3eq)。在N2下将混合物于室温搅动16小时之后,将它浓缩以给出褐色固体。添加MTBE(200mL)并将它于15℃搅动2小时。通过过滤来收集固体,用MTBE(50mL x 2)清洗以给出(S)-(1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯10e,为橙色固体(4.2g,84％)。LCMS(ESI):m/z503.0[M+1]。
于室温对10e(4.2g,8.3mmol)在无水DMF(20mL)中的搅动溶液逐滴添加哌啶(1.65mL,17mmol,2eq)。将混合物于室温搅动30分钟,固体沉淀物形成。添加无水DCM(50mL),混合物立即变成透明。将混合物于室温搅动另外30分钟,LCMS显示10e耗尽。在减压下将它浓缩至干燥(确保没有哌啶剩余),并在EtOAc和H2O(50mL/20mL)之间分配残留物。用EtOAc(50mL x 2)清洗水相并浓缩以给出(S)-2-氨基-N-(4-(羟基甲基)苯基)-5-脲基戊酰胺10d,为油性残留物(2.2g,94％)(含有少量的DMF)。
将可商购的1,1-环丁烷二羧酸1,1-二乙酯(CAS注册号3779-29-1)用碱水溶液通过有限皂化转变成半酸/酯1,1-环丁烷二羧酸,1-乙酯(CAS注册号54450-84-9)并通过用偶联试剂诸如TBTU(四氟硼酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲
Figure BDA0001945712510000781
也称作:四氟硼酸N,N,N'N'-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲
Figure BDA0001945712510000782
CAS No.125700-67-6,Sigma-Aldrich,B-2903)和N-羟基琥珀酰亚胺的活化转变成NHS酯环丁烷-1,1-二羧酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯1-乙基酯。
对环丁烷-1,1-二羧酸1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)1-乙基酯(8g,29.7mmol)在DME(50mL)中的溶液添加10d(6.0g,21.4mmol)和NaHCO3(7.48g,89.0mmol)在水(30mL)中的溶液。将混合物于室温搅动16小时之后,在减压下将它浓缩至干燥并通过柱层析(DCM:MeOH＝10:1)来纯化残留物以给出(S)-1-((1-(4-(羟基甲基)苯基)-2-氧代-6-脲基己烷-3-基)氨甲酰基)环丁烷羧酸乙酯10c,为白色固体(6.4g,68.7％)。LCMS(ESI):m/z 435.0[M+1]。
于室温对10c(6.4g,14.7mmol)在THF和MeOH的混合物(20mL/10mL)中的搅动溶液添加LiOH·H2O(1.2g,28.6mmol)在H2O(20mL)中的溶液。将反应混合物于室温搅动16小时之后,在减压下去除溶剂,通过prep-HPLC来纯化获得的残留物以给出(S)-1-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基氨甲酰基)环丁烷羧酸10b(3.5g,产率:58.5％)。LCMS(ESI):m/z406.9[M+1]。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.86(d,J＝8.4Hz,2H),8.51(d,J＝8.4Hz,2H),5.88-5.85(m,1H),5.78(s,2H),4.54-4.49(m,3H),4.38-4.32(m,1H),3.86-3.75(m,1H),3.84-3.80(m,2H),3.28-3.21(m,1H),3.30-3.24(m,1H),3.00-2.80(m,1H),2.37-2.28(m,2H)。
步骤3:(S)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)-N-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)环丁烷-1,1-二羧酰胺10的制备
Figure BDA0001945712510000791
于0℃将二异丙基乙胺DIPEA(1.59g,12.3mmol)和二(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酸氯,BOP-Cl(CAS注册号68641-49-6,Sigma-Aldrich,692mg,2.71mmol)添加至(S)-1-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基氨甲酰基)环丁烷羧酸10b(1g,2.46mmol)在DMF(10mL)中的溶液,接着添加1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐10a(592mg,2.71mmol)。将混合物于0℃搅动0.5小时。用柠檬酸溶液(10mL)淬灭反应混合物,用DCM/MeOH(10:1)萃取。干燥有机层并浓缩,并通过硅胶上的柱层析(DCM:MeOH＝10:1)来纯化残留物以给出(S)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)-N-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)环丁烷-1,1-二羧酰胺10(1.0g,71％),也称作MC-CBDK-cit-PAB-OH。LCMS(ESI):M+H+＝571.28。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.00(s,1H),7.82-7.77(m,2H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.19(d,J＝8.4Hz,2H),6.96(s,2H),5.95(t,J＝6.4Hz,1H),5.39(s,2H),5.08(t,J＝5.6Hz,1H),4.40-4.35(m,3H),4.09(d,J＝4.8Hz,1H),3.01(d,J＝3.2Hz,2H),3.05-2.72(m,4H),2.68-2.58(m,3H),2.40-2.36(m,4H),1.72-1.70(m,3H),1.44-1.42(m,1H),1.40-1.23(m,6H),1.21-1.16(m,4H)。
步骤4:(S)-N-(1-(4-(氯甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)环丁烷-1,1-二羧酰胺11的制备
Figure BDA0001945712510000792
于0℃用亚硫酰氯,SOCl2(1.25g,10.5mmol)分批逐滴处理(S)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)-N-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)环丁烷-1,1-二羧酰胺10(2.0g,3.5mmol)在N,N-二甲基甲酰胺,DMF或N-甲基吡咯烷酮,NMP(50mL)中的溶液。反应体系保持黄色。通过LC/MS来监测反应,指示>90％转化。将反应混合物于20℃搅动30分钟或数小时之后,用水(50mL)稀释它并用EtOAc(50mL x 3)萃取。干燥有机层,浓缩并通过急骤柱(DCM:MeOH＝20:1)来纯化以形成11,也称作MC-CBDK-cit-PAB-Cl,为灰色固体。LCMS:(5-95,AB,1.5min),0.696min,m/z＝589.0[M+1]+。
步骤5:碳酸(S)-4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯4-硝基苯基酯12的制备
Figure BDA0001945712510000801
对(S)-N-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)-N-(1-(4-(羟基甲基)苯基氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)环丁烷-1,1-二羧酰胺10在无水DMF中的溶液添加二异丙基乙胺(DIEA),接着添加PNP碳酸酯(碳酸二(4-硝基苯基)酯)。将反应溶液于室温(r.t.)搅动4小时并通过prep-HPLC来纯化混合物以提供12。LCMS(ESI):M+H+＝736.29。
步骤6:LD-51的制备
Figure BDA0001945712510000802
使碳酸(S)-4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯4-硝基苯基酯12的溶液和(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((4R)-2-(4-氨基苯基)-1,3-二氧杂环戊-4-基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯13反应以给出LD-51。
或者,通过下面的步骤7-12来制备司维司群-接头中间体LD-51(表5):
步骤7:1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯15的制备
Figure BDA0001945712510000811
于20℃对1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷羧酸14(100mg,0.324mmol)在THF(10mL)中的搅动溶液添加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮,N-羟基琥珀酰亚胺,NHS(39mg,0.34mmol),接着添加二环己基碳二亚胺,DCC(70mg,0.34mmol)。在氮气,N2下将混合物于20℃搅动16小时。过滤混合物并浓缩滤出液以给出1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯15,为无色油(131mg,100％)。
步骤8:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((4R)-2-(4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)苯基)-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯17的制备
Figure BDA0001945712510000821
在无水甲苯(5.0mL)中溶解司维司群,(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯16(50mg,0.076mmol)和(4-(二甲氧基甲基)苯基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(149mg,0.382mmol)。将所得混合物于100-120℃加热2小时。将它冷却至室温之后,浓缩混合物并通过prep-TLC(DCM/MeOH＝30/1)来纯化以给出17,为白色固体(43mg,57％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.928min,m/z＝1002.2[M+Na]+。
步骤9:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((4R)-2-(4-氨基苯基)-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯13的制备
于20℃对17(30mg,0.031mmol)在无水DMF(2.0mL)中的溶液添加哌啶(5.2mg,0.061mmol)。将混合物于20℃搅动2小时。浓缩混合物以给出粗制13(24mg,100％),在没有进一步纯化的情况下用于下一个步骤。
步骤10:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((4R)-2-(4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯18的制备
Figure BDA0001945712510000831
于20℃对13(24mg,0.031mmol)和(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酸(18.5mg,0.0465mmol)在DCM/MeOH(3.0mL/0.5mL)中的搅动溶液添加2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉,EEDQ(CAS注册号16357-59-8,Sigma-Aldrich,16mg,0.062mmol)。在N2下将混合物于20℃搅动16小时。浓缩混合物并通过prep-TLC(DCM/MeOH＝30/1)来纯化以给出18(30mg,86％)。
步骤11:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((4R)-2-(4-((S)-2-氨基-5-脲基戊酰胺基)苯基)-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯19的制备
Figure BDA0001945712510000832
于20℃对18(30mg,0.0264mmol)在无水DMF(2.0mL)中的溶液添加哌啶(4.5mmol,0.0528mmol)。将混合物于20℃搅动2小时。浓缩混合物以给出粗制19,在没有进一步纯化的情况下用于下一个步骤(24mg,100％)。
步骤12:司维司群-接头中间体LD-51的制备
在无水DMF(2.0mL)中溶解中间体19(24mg,0.0264mmol)和15(22mg,0.0528mmol)。容许混合物于20℃搅动2小时。浓缩混合物并通过prep-TLC(DCM/MeOH＝10/1)来纯化以给出LD-51(13mg,41％)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.889min,m/z＝1227.5[M+Na]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,2H),7.61-7.50(m,2H),7.44(d,J＝8.8Hz,2H),7.05-7.00(m,5H),6.92-6.70(m,4H),6.59(d,J＝9.2Hz,2H),6.41-6.35(m,2H),5.84(s,1H),5.69(s,1H),5.32(s,1H),5.18(s,2H),4.86(s,1H),4.75(d,J＝4.8Hz,2H),4.62(s,1H),4.51-4.38(m,1H),4.37-4.20(m,2H),4.18-3.98(m,1H),3.98-3.91(m,4H),3.74(s,1H),3.59(m,7H),3.43-3.38(m,5H),2.61(s,2H),2.44(d,J＝10.0Hz,4H),1.80-1.55(m,4H),1.53-1.45(m,6H),1.27-1.22(m,4H)。
实施例1b:司维司群-接头中间体LD-52(表5)。(2-((1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-甲酰胺基)乙基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯LD-52的合成
步骤1:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸20的制备
Figure BDA0001945712510000841
对司维司群16(40.0mg,0.060mmol)在THF(1.0mL)中的混合物逐滴添加水(1.0mL)中的LiOH(11.71mg,0.490mmol)。将反应混合物于15℃搅动24小时。用水(3.0mL)稀释混合物,调节至pH 3,并用DCM(5.0mL x 3)萃取。干燥合并的有机层并浓缩以给出20(39mg,0.0597mmol,97.6％产率),为白色固体,在没有进一步纯化的情况下直接用于下一个步骤。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.798min,[M+Na]+663.1。
步骤2:(2-氨基乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯的制备
Figure BDA0001945712510000851
于0℃对(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(200.0mg,1.25mmol),碳酸氢钠(157mg,1.87mmol)在THF(5.0mL)和水(5.0mL)中的混合物添加9-芴基甲氧基羰基氯化物,氯甲酸9-芴基甲酯,Fmoc-Cl(484mg,1.87mmol)。将混合物于15℃搅动1小时。用EtOAc(15mL x 3)萃取混合物。用盐水(15mL)清洗合并的有机层,干燥并浓缩。通过硅胶层析(0-40％EtOAc,在PE中)来纯化残留物以给出乙烷-1,2-二基二氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯叔丁基酯(250mg,0.595mmol,47.7％产率),为黄色油。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.931min,[M+Na]+405.1。
对乙烷-1,2-二基二氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯叔丁基酯(100.0mg,0.260mmol)在EtOAc(2.0mL)中的混合物添加HCl(1.0mL,4mol/L,在EtOAc中)。将反应混合物于0℃搅动30分钟之后,浓缩它以给出(2-氨基乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(73mg,0.199mmol,76.1％产率),为白色固体,在没有进一步纯化的情况下直接用于下一个步骤。
步骤3:(2-((1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-甲酰胺基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯21的制备
Figure BDA0001945712510000852
将化合物20(31.42mg,0.160mmol),1-羟基苯并三唑(HOBt,22.15mg,0.160mmol)和(2-氨基乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(46.25mg,0.160mmol)在DCM(5.0mL)中的混合物于0℃搅动5分钟。将过量的二环己基碳二亚胺,DCC和二异丙基乙胺,DIEA(70.57mg,0.550mmol)添加至混合物。将反应混合物于15℃搅动1小时。用DCM(20mL)稀释混合物,并用盐水(10mL x 2)清洗。干燥有机层并通过prep-TLC(5％MeOH,在DCM中,Rf＝0.4)来纯化残留物以给出21(40mg,0.0438mmol,80.1％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.898min,[M+H]+905.3。
步骤4:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-N-(2-氨基乙基)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酰胺21a的制备
Figure BDA0001945712510000861
对21(40.0mg,0.040mmol)在DMF(1.0mL)中的混合物添加哌啶(15.05mg,0.180mmol)。将反应混合物于15℃搅动1小时。通过prep-HPLC(乙腈20-50％/10mM NH4HCO3-ACN)来纯化混合物以提供21a(5.6mg,0.0081mmol,18.4％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.599min,[M+H]+683.1。
步骤5:司维司群-接头中间体LD-52的制备
对通过WO 2012/113847；WO 2014/194247；US 7659241；US 7498298；US 2009/0111756；US 2009/0018086；US 6214345；Dubowchik et al.(2002)Bioconjugate Chem.13(4):855-869中记载的方法制备的碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯4-硝基苯基酯,MC-vc-PAB-PNP(13.91mg,0.020mmol)和二异丙基乙胺,DIEA(8.12mg,0.060mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液添加21a(0.020mmol)。将混合物于25℃搅动12小时。通过prep-HPLC(乙腈35-65/0.225％FA,在水中)来纯化混合物以提供LD-52,为白色固体。LCMS m/z[M+Na]+1303.6。
实施例1c:司维司群-接头中间体LD-53(表5)。(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯LD-53的合成
步骤1:(3R,6S)-6-(2-(苄基氧基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-醇23b的制备
Figure BDA0001945712510000871
于0℃对((丁-3-烯-1-基氧基)甲基)苯(15.0g,92.46mmol)在DCM(200mL)中的溶液添加间-氯过苯甲酸,m-CPBA(37.54g,184.92mmol)。将反应混合物于20℃搅动12小时。用Na2SO3水溶液(100mL)淬灭反应混合物并用DCM(100mL x 3)萃取水层。用NaHCO3水溶液(100mL x 3)清洗有机层,干燥并浓缩。通过急骤柱层析(0～5％EtOAc,在PE中)来纯化残留物以给出2-(2-(苄基氧基)乙基)氧杂环丙烷(10.5g,59.3％),为无色油。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.646min,[M+CH3CN]+219.8。
或者,在N2下于0℃在THF(100mL)中悬浮NaH(3.05g,60％,76.27mmol),并于0℃添加丁-3-烯-1-醇(5.0g,69.34mmol)。将反应混合物于0℃搅动30分钟,然后于0℃添加苄基溴(BnBr,9.95mL,83.21mmol)。将混合物于20℃搅动12小时。于0℃用NH4Cl饱和水溶液(15mL)淬灭反应并用水(50mL)稀释。用EtOAc(100mL x 2)萃取混合物,并浓缩合并的有机层,并通过急骤层析(0～2％EtOAc,在石油醚中)来纯化以给出((丁-3-烯-1-基氧基)甲基)苯(7.15g,63.6％产率),为无色油。于0℃对((丁-3-烯-1-基氧基)甲基)苯(15.0g,92.46mmol)在DCM(200mL)中的溶液添加间-氯过苯甲酸(mCPBA,37.54g,184.92mmol)。将反应混合物于20℃搅动12小时。用冷的Na2SO3水溶液(100mL)淬灭反应混合物,然后用DCM(100mL x 3)萃取水层。用NaHCO3水溶液(100mL x 3)清洗有机层,干燥并浓缩(注意:需要在浓缩之前去除所有过氧化物)。通过急骤层析(0～5％EtOAc,在石油醚中)来纯化它以给出2-(2-(苄基氧基)乙基)氧杂环丙烷(10.5g,59.3％),为无色油。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.646min,[M+CH3CN+H]+219.8。
于20℃对装有甲苯(10mL)中的HOAc(0.03mL,0.450mmol)的圆底烧瓶添加(R,R)-(-)-N,N'-二(3,5-二-叔丁基亚水杨基)-1,2-环己烷二氨基钴(II)(135.5mg,0.220mmol)并将所得溶液于20℃搅动0.5小时,同时烧瓶对空气敞开以吸收氧。在减压下去除挥发物。添加纯净的2-(2-(苄基氧基)乙基)氧杂环丙烷(8.0g,44.89mmol),接着于0℃逐滴添加蒸馏水(0.45mL,25.14mmol)。容许所得反应混合物缓慢温热至20℃并于20℃搅动2小时。用DCM(50mL)稀释反应混合物,并用水(50mL x 3)清洗混合物,在无水硫酸钠上干燥,并在真空中浓缩。在硅胶柱层析(0-5％MeOH,在DCM中)上纯化残留物以提供(S)-4-(苄基氧基)丁烷-1,2-二醇(3.80g,43.1％),为灰色油,将它与其它批次合并(共6.5g)并通过SFC(OD50mm*30mm,5μm；15％碱-EtOH；流速:60mL/min)来分离以提供(S)-4-(苄基氧基)丁烷-1,2-二醇(5.30g,81.5％),为褐色油,EE为96％。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.585min,[M+Na]+218.8。
在搅动中对2-甲氧基乙酸甲酯(10.00g,96.06mmol)在四氯化碳(200mL)中的溶液添加偶氮二异丁腈(AIBN,78.87mg,0.480mmol)和N-溴琥珀酰亚胺(NBS,18.80g,105.67mmol)。将反应混合物于85℃搅动2小时。将混合物冷却至20℃,过滤并在Na2SO4上干燥,并在减压下浓缩滤出液以给出2-溴-2-甲氧基乙酸甲酯(15.00g,85.3％),为黄色油,在没有进一步纯化的情况下用于下一个步骤。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.99(s,1H),3.83(s,3H),3.55(s,3H)。
对(S)-4-(苄基氧基)丁烷-1,2-二醇(1.00g,5.1mmol)在MeOH(15mL)中的溶液添加二丁基氧化锡(1.52g,6.11mmol)。将反应混合物于65℃搅动12小时。将它冷却至室温之后,在真空中去除溶剂并将白色固体在高真空下干燥30分钟。然后在甲苯(15mL)中溶解所得残留物。然后添加四丁基碘化铵(471mg,1.27mmol)和2-溴-2-甲氧基乙酸甲酯(2.05g,11.21mmol)并将所得反应混合物于120℃搅动另外2小时。浓缩混合物并通过硅胶柱层析(EtOAc:PE10％-20％)来纯化以给出(3R,6S)-6-(2-(苄基氧基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-酮22b(600mg,44.2％)和(3S,6S)-6-(2-(苄基氧基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-酮22a(580mg,42.7％),二者为无色油。
22b:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.36-7.28(m,5H),4.90(s,1H),4.83-4.82(m,1H),4.50-4.49(m,2H),3.93-3.90(m,1H),3.76-3.75(m,1H),3.63-3.60(m,2H),3.49(s,3H),1.89-1.87(m,2H)。
22a:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.37-7.29(m,5H),4.94-4.91(m,2H),4.51-4.50(m,2H),4.14-4.10(m,1H),3.69-3.61(m,3H),3.50(s,3H),2.05-1.90(m,2H)。
在N2下于-78℃对22b(580.0mg,2.18mmol)在甲苯(15mL)中的溶液添加甲苯中的二异丁基氢化铝,DIBAl-H溶液(CAS注册号1191-15-7,Sigma-Aldrich,1.0M,619.53mg,4.36mmol)。将混合物于-78℃搅动1小时。于-25℃用0.5mL甲醇淬灭反应并将混合物搅动2分钟。添加罗谢尔(Rochelle)盐溶液(15mL 20％w/w)并于室温搅动另外1小时。用EtOAc(15mL x 2)萃取残留物。用水(10mL x 2),盐水(10mL x 2)清洗合并的有机层并在硫酸钠上干燥。蒸发溶剂以给出粗制化合物23b(580mg,99.2％),为无色油,在没有进一步纯化的情况下直接使用。
步骤2:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-(苄基氧基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯25的制备
Figure BDA0001945712510000891
对(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,6,8b-三羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯24(400.0mg,0.840mmol)和23b(576mg,2.15mmol)在甲苯(10mL)中的溶液添加三苯基膦,PPh3(570.09mg,2.17mmol)。将混合物于20℃搅动30分钟。对上述溶液添加DMEAD(509.06mg,2.17mmol)在甲苯(2.0mL)中的溶液。将混合物于20℃搅动12小时。浓缩混合物并通过prep-HPLC(乙腈60-80/0.225％FA,在水中)来纯化以提供两种异构体,包括25(HPLC上的峰2,242mg,LCMS(5-95AB/1.5min)RT＝0.836min,[M+Na]+751.1,38.9％),为白色固体,和一种异构体(HPLC上的峰1,130mg,LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.809min,[M+Na]+751.0,20.7％产率),为白色固体。
25,峰2:LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.836min,[M+Na]+751.1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.33-7.29(m,1H),7.13-7.09(m,8H),7.07-7.03(m,3H),6.81-6.68(m,2H),6.51-6.50(m,1H),6.34(s,1H),5.29(s,1H),4.98-4.96(m,1H),4.61(s,1H),4.33-4.20(m,4H),3.84-3.50(m,17H),1.78-1.73(m,2H),1.32(s,1H)。
异构体,峰1:LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.809min,[M+Na]+751.1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32-7.30(m,4H),7.05-7.00(m,5H),6.81-6.80(m,2H),6.61-6.59(m,2H),6.45(s,1H),6.30(s,1H),5.27(s,1H),5.02-5.01(m,1H),4.66-4.62(m,2H),4.48-4.45(m,1H),4.28-4.25(m,2H),3.83-3.55(m,19H),1.82-1.77(m,3H)。
步骤3:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,8b-二羟基-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯26的制备
Figure BDA0001945712510000901
对25(242.0mg,0.330mmol)在MeOH(2.0mL)中的溶液添加Pd/C(354mg,3.32mmol)。在氢气,H2(1atm)下将混合物于30℃搅动2小时之后,将它过滤并浓缩以给出26(209mg,0.321mmol,96.6％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.717min,[M+Na]+661.0。
步骤4:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-6-(((2S,3R,6S)-3-甲氧基-6-(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯27的制备
Figure BDA0001945712510000902
对26(200.0mg,0.310mmol)在DCM(15mL)中的溶液添加三乙胺(0.22mL,1.57mmol)和甲磺酰氯(0.54mL,6.99mmol)。将混合物于15℃搅动30分钟。用DCM(25mL)稀释混合物并用水(25mL x 3)清洗。浓缩有机层以给出粗制27(224mg,0.313mmol,99.8％产率),为黄色油。在没有进一步纯化的情况下直接使用粗品。
步骤5:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-叠氮基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯28的制备
Figure BDA0001945712510000911
于15℃对27(200.0mg,0.270mmol)在DMF(10mL)中的搅动溶液添加叠氮化钠(60.09mg,0.920mmol)。将混合物于60℃搅动1小时。对混合物添加Na2CO3水溶液(5mL),并搅动5分钟。用EtOAc(30mL)稀释混合物并用水(30mL x 3)和盐水(10mL x 3)清洗。在Na2SO4上干燥有机层,浓缩并通过prep-TLC(5％MeOH,在DCM中,Rf＝0.5)来纯化以给出28(40mg,0.0554mmol,20.3％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.799min,[M+Na]+686.1。
步骤6:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-氨基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯29的制备
Figure BDA0001945712510000912
对28(40.0mg,0.060mmol)在MeOH(5.0mL)中的溶液添加叔丁胺(4.41mg,0.060mmol)和Pd/C(64.19mg)。在H2(1atm)下将混合物于30℃搅动1小时。过滤混合物,浓缩并通过prep-HPLC(乙腈10-40/0.225％FA,在水中)来纯化以给出29(8.0mg,0.0125mmol,20.8％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.661min,[M+H]+638.1。HPLC(10-80AB.met/8min):RT＝4.09min。
步骤7:司维司群-接头中间体LD-53的制备
Figure BDA0001945712510000921
对通过WO 2012/113847；WO 2014/194247；US 7659241；US 7498298；US 2009/0111756；US 2009/0018086；US 6214345；Dubowchik et al.(2002)Bioconjugate Chem.13(4):855-869中记载的方法制备的碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯4-硝基苯基酯,MC-vc-PAB-PNP(13.91mg,0.020mmol)和二异丙基乙胺,DIEA(8.12mg,0.060mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液添加29(10.0mg,0.020mmol)。将混合物于25℃搅动12小时。通过prep-HPLC(乙腈35-65/0.225％FA,在水中)来纯化混合物以提供LD-53(2.0mg,0.0015mmol,9.8％产率),为白色固体。LCMS(5-95_1.5min):RT(220/254nm)＝0.759min,[M+Na]+1258.2。HPLC(10-80AB/8min):RT＝4.89min。
实施例1d:司维司群-接头中间体LD-54(表5)。(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-6-(((2S,3R,6S)-3-甲氧基-6-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙基)-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯LD-54的合成
步骤1:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-(乙酰基硫基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯30的制备
Figure BDA0001945712510000922
对(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-6-(((2S,3R,6S)-3-甲氧基-6-(2-((甲基磺酰基)氧基)乙基)-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯27(34.0mg,0.050mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液添加硫代乙-S-酸,硫代乙酸,KSAc(54.18mg,0.47mmol)。将混合物于35℃搅动1小时。浓缩混合物并通过prep-TLC(4％MeOH,在DCM中,Rf＝0.5)来纯化以给出30(15mg,0.0213mmol,44.9％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.939min,[M+Na]+719.1。
步骤2:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-1,8b-二羟基-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-巯基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯31的制备
Figure BDA0001945712510000931
对30(12.0mg,0.02mmol)在MeOH(2.0mL)中的溶液添加K2CO3(7.14mg,0.050mmol)。将混合物于35℃搅动1小时。通过prep-TLC(4％MeOH,在DCM中,Rf＝0.5)和prep-HPLC(FA)来纯化混合物以给出31(6.0mg,0.0091mmol,52.7％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.805min,[M+Na]+677.1。HPLC(10-80AB/8min):RT＝5.23min。
步骤3:司维司群-接头中间体LD-54的制备
在N2下将1,2-二(5-硝基吡啶-2-基)乙硫烷和31在无水DCM:CH3OH/(1:1)中的溶液于室温搅动24小时。在真空下浓缩混合物之后,用DCM稀释残留物。添加氧化锰(ΜnO2)并将混合物于室温搅动另外0.5小时。通过LCMS来纯化混合物以提供LD-55。
实施例1e:司维司群-接头中间体LD-55(表5)。(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酰胺LD-55的合成
步骤1:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯32的制备
Figure BDA0001945712510000941
对(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸20(20.0mg,0.030mmol)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮,N-羟基琥珀酰亚胺,NHS,HOSu(3.59mg,0.0300mmol)在THF(4.0mL)中的混合物添加二环己基碳二亚胺,DCC(6.44mg,0.030mmol)。将反应混合物于15℃搅动16小时以生成32,直接用于下一个步骤。
步骤2:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-N-(2-巯基乙基)-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酰胺33的制备
Figure BDA0001945712510000942
对含有32的反应混合物添加2-氨基乙烷硫醇和TEA(8.23mg,0.080mmol)。将反应混合物于15℃搅动1小时。浓缩混合物,在DMF(2.0mL)中溶解,并通过prep-HPLC(乙腈30-60％/10mM NH4HCO3-ACN)来纯化以提供33(1.74mg,0.0024mmol,9％产率),为白色固体。LCMS(5-95AB/1.5min):RT＝0.828min,[M+H]+700.2和RT＝0.898min,[M+Na]+1420.0(有17％的二硫化物)。
步骤3:司维司群-接头中间体LD-55的制备
Figure BDA0001945712510000951
在N2下将1,2-二(5-硝基吡啶-2-基)乙硫烷和33在无水DCM:CH3OH(1:1)中的溶液于室温搅动24小时。在真空下浓缩混合物之后,用DCM稀释残留物。添加氧化锰(MnO2)并将混合物于室温搅动另外0.5小时。通过LCMS来纯化混合物以提供LD-55。
实施例If:司维司群-接头中间体LD-58(表5)。(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-((((4-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯LD-58的合成
对碳酸(S)-4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯4-硝基苯基酯12(17.31mg,0.020mmol)和DIEA(0.01mL,0.060mmol)在DMF(3.0mL)中的溶液添加(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6S)-6-(2-氨基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯29(10.0mg,0.0200mmol)。将混合物于25℃搅动12小时。通过prep-HPLC(乙腈35-65/0.225％FA,在水中)来纯化混合物以提供LD-58(4.8mg,24.5％),为白色固体。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.750min,m/z＝1256.6[M+Na]+。
实施例1g:司维司群-接头中间体LD-59(表5)。(2-((1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2R,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-甲酰胺基)乙基)氨基甲酸4-((S)-2-(1-((5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨甲酰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄酯LD-59的合成
步骤1:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯35的制备
Figure BDA0001945712510000961
对24(300.0mg,0.6300mmol)和碳酸(1R)-2-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-((2R,5R)-6-羟基-5-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)乙基酯(4-硝基苯基)酯34(445.4mg,0.940mmol)在甲苯(15mL)中的溶液添加Ph3P(427.6mg,1.63mmol)。将混合物于20℃搅动10分钟。于0℃对上述溶液添加偶氮二羧酸二-2-甲氧基乙酯,DMEAD(381.8mg,1.63mmol)在甲苯(5.0mL)中的溶液。将混合物于20℃搅动12小时。过滤混合物,浓缩并通过prep-HPLC(85-90(0.225％FA,在水-ACN中),25mL/min)来纯化以提供35(200mg,23.2％),为白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.24-8.21(m,4H),7.14-7.11(m,2H),7.07-7.05(m,3H),6.87-6.86(m,2H),6.71-6.69(m,2H),6.53(d,J＝2.0Hz,1H),6.31(d,J＝1.6Hz,1H),5.35(s,1H),5.25-5.23(m,1H),5.04-5.02(m,1H),4.65-4.63(m,2H),4.36-4.32(m,1H),4.09-3.89(m,5H),3.81(s,3H),3.74(s,3H),3.71(s,3H),3.58(s,1H),3.51(s,3H),0.83(s,9H),0.02(d,J＝10.8Hz,6H)。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝1.012min,[M+7]+940.3。
步骤2:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸甲酯16的制备
Figure BDA0001945712510000962
对35(150.0mg,0.1600mmol)在THF(10mL)中的溶液添加四丁基氟化铵(TBAF,125.97mg,0.480mmol)。将反应混合物于25℃搅动12小时。用水(20mL)淬灭反应混合物,并用EtOAc(10mL x 2)萃取。用盐水(20mL)清洗合并的有机层,在Na2SO4上干燥,并在真空中浓缩。通过急骤层析(0-10％MeOH,在DCM中,Rf＝0.4)来纯化粗制产物以提供司维司群16(95mg,90.4％),为白色固体。LCMS(5-95,AB,1.5分钟):RT＝0.724min,[M+Na]+677.1。
步骤3:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酸20的制备
Figure BDA0001945712510000971
对16(50.0mg,0.0800mmol)在THF(6.0mL)和MeOH(2.0mL)中的溶液添加水(2.0mL)中的LiOH(9.15mg,0.380mmol)。将混合物于20℃搅动12小时。用水(10mL)淬灭混合物,用EtOAc(10mL x 2)萃取。用1.0M HCl将水层酸化至pH＝4-5,并用EtOAc(10mL x 2)萃取。在Na2SO4上干燥有机层并浓缩以提供20(41mg,68.7％),为白色固体。在没有进一步纯化的情况下直接使用粗品。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.669min,[M+Na]+663.1。
步骤4:(2-((1R,2R,3S,3aR,8bS)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-甲酰胺基)乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯21的制备
Figure BDA0001945712510000972
对20(40.0mg,0.060mmol)在DCM(5.0mL)中的溶液添加(2-氨基乙基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(26.44mg,0.090mmol),HOBt(12.66mg,0.090mmol),DCC(19.32mg,0.090mmol)和DIEA(0.03mL,0.190mmol)。将混合物于20℃搅动12小时。浓缩混合物并通过prep-TLC(10％MeOH,在DCM中,Rf＝0.3)来纯化以提供21(30mg,51.5％),为白色固体。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.785min,[M+H]+905.4。
步骤5:(1R,2R,3S,3aR,8bS)-N-(2-氨基乙基)-6-(((2S,3R,6R)-6-((R)-1,2-二羟基乙基)-3-甲氧基-1,4-二氧杂环己烷-2-基)氧基)-1,8b-二羟基-8-甲氧基-3a-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2,3,3a,8b-四氢-1H-环戊并[b]苯并呋喃-2-羧酰胺21a的制备
Figure BDA0001945712510000981
对21(15.0mg,0.0200mmol)在DMF(2.0mL)中的溶液添加哌啶(0.02mL,0.050mmol)。将混合物于25℃搅动1小时。LCMS显示起始材料耗尽且发现期望的产物。浓缩混合物以提供化合物7(11mg,97.2％),为白色固体,并在没有进一步纯化的情况下直接使用。LCMS(5-95,AB,1.5min):RT＝0.607min,[M+H]+683.2。
步骤6:LD-59的制备
对碳酸(S)-4-(2-(1-(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基氨甲酰基)环丁烷甲酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯4-硝基苯基酯12(17.78mg,0.0200mmol)和DIEA(0.010mL,0.0600mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液添加21a(11.0mg,0.020mmol)。将混合物于25℃搅动12小时。LCMS显示起始材料耗尽且发现期望的产物。通过prep-HPLC(乙腈35-50/0.225％FA,在水中,25mL/min)来纯化混合物以提供LD-59(10.1mg,48.5％),为白色固体。LCMS(5-95,AB,1.5分钟):RT＝0.688min,[M/2+H]+640.5。
实施例2:半胱氨酸工程化改造的抗体的制备
对于大规模抗体生产,在CHO细胞中生成抗体。将编码VL和VH的载体转染入CHO细胞并通过蛋白A亲和层析自细胞培养液纯化IgG。
如初始分离时那样,抗体中的工程化改造的半胱氨酸残基作为与细胞硫醇(例如谷胱甘肽)的混合二硫化物存在,因此不可用于缀合。如先前描述的,例如Junutula et al.(2008)Nat.Biotechnol.26:925-932和US 2011/0301334,这些抗体的部分还原(例如用DTT),纯化,和用脱氢抗坏血酸(DHAA)的再氧化给予抗体以可用于缀合的游离半胱氨酸硫氢基基团。简言之,组合抗体与活化的司维司群药物模块以容许缀合至抗体的游离半胱氨酸残基。数小时后,纯化抗体-药物缀合物。
在某些条件下,通过在含2mM EDTA的50mM Tris pH 7.5中用还原剂(诸如DTT(Cleland氏试剂,二硫苏糖醇)或TCEP(盐酸三(2-羧乙基)膦；Getz et al.(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)于37℃处理3小时或于室温处理过夜,可以使得半胱氨酸工程化改造的抗体对于与药物缀合成为反应性的。例如,将在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化改造的单克隆抗体(THIOMABTM)(Gomez et al.(2010)Biotechnology and Bioeng.105(4):748-760；Gomez et al.(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445)于室温用约50倍过量的DTT还原过夜以还原可能在新引入的半胱氨酸残基和培养培养基中存在的半胱氨酸之间形成的二硫键。在pH 5的10mM乙酸钠中稀释还原的THIOMABTM,加载到HiTrap S柱上,并用含有0.3M氯化钠的PBS洗脱。或者,通过添加1/20体积的10％乙酸来酸化抗体,用10mM琥珀酸盐pH 5稀释,加载到柱上,然后用10个柱体积的琥珀酸盐缓冲液清洗。用50mM Tris pH7.5,2mM EDTA洗脱柱。
轻链氨基酸依照Kabat(Kabat et al.,Sequences of proteins ofimmunological interest,(1991)5th Ed.,US Dept of Health and Human Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)编号。除了像Kabat系统注释的地方,重链氨基酸依照EU编号系统(Edelman et al.(1969)Proc.Natl.Acad.of Sci.63(1):78-85)编号。使用单字母氨基酸缩写。
由于细胞培养条件,在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程化改造的单克隆抗体(THIOMABTM)携带半胱氨酸加合物(胱氨酸)或在工程化改造的半胱氨酸上谷胱甘肽化。为了解放工程化改造的半胱氨酸的反应性硫醇基团,在约pH 8.0的500mM硼酸钠和500mM氯化钠中溶解THIOMABTM并用约50-100倍过量的1mM TCEP(盐酸三(2-羧乙基)膦)(Getz et al.(1999)Anal.Biochem.Vol 273:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)于37℃还原约1-2小时。或者,可使用DTT作为还原剂。或是通过非还原性SDS-PAGE或是通过变性反相HPLC PLRP柱层析来监测链间二硫键的形成。在pH 5的10mM乙酸钠中稀释还原的THIOMABTM,加载到HiTrap SP FF柱上,并用含有0.3M氯化钠的PBS或含有150mM氯化钠的50mM Tris-Cl pH7.5洗脱。
通过进行再氧化,在亲本单抗中存在的半胱氨酸残基之间重新建立二硫键。将洗脱的还原的THIOMABTM用pH 7的15X或2mM脱氢抗坏血酸(dhAA)处理约3小时,或在50mMTris-Cl pH 7.5中处理约3小时,或用200nM至2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液于室温处理过夜。可以使用本领域已知的其它氧化剂(即氧化性试剂)和氧化性条件。环境空气氧化也可能是有效的。这种温和的部分再氧化步骤以高保真度有效形成链内二硫化物。通过在SephadexG25树脂上洗脱来更换缓冲液,并用含1mM DTPA的PBS洗脱。如下检查硫醇/抗体值,即自溶液在280nm处的吸光度确定还原的抗体的浓度及通过与DTNB(Aldrich,Milwaukee,WI)反应并测定412nm处的吸光度来确定硫醇浓度。
在具有扩大的质量范围的TSQ量子三联四极TM质谱仪(Thermo Electron,SanJose,California)上实施液体层析/质谱分析。将样品在加热至75℃的
Figure BDA0001945712510001001
1000A,Microbore柱(50mm x 2.1mm,Polymer Laboratories,Shropshire,UK)上进行层析。使用30-40％B的线性梯度(溶剂A:含0.05％TFA的水,溶剂B:含0.04％TFA的乙腈),并使用电喷射源直接电离洗提液。通过
Figure BDA0001945712510001002
数据系统收集数据,并使用
Figure BDA0001945712510001003
(Novatia,LLC,New Jersey)实施解卷积。在LC/MS分析之前,将抗体或药物缀合物(50微克)用PNG酶F(2 U/ml；PROzyme,San Leandro,CA)于37℃处理2小时以去除N连接的碳水化合物。
将疏水相互作用层析(HIC)样品注射到丁基HIC NPR柱(2.5微米粒度,4.6mm x3.5cm)(Tosoh Bioscience)上并以0.8ml/min用0-70％B的线性梯度洗脱(A:含1.5M硫酸铵的50mM磷酸钾pH 7,B:50mM磷酸钾pH 7,20％异丙醇)。使用配备有多波长检测仪和Chemstation软件的Agilent 1100系列HPLC系统来解析和量化具有不同药物每抗体比的抗体种类。
实施例3:司维司群-接头中间体对抗体的缀合
在实施例1的还原和再氧化规程之后,在PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中溶解半胱氨酸工程化改造的抗体(THIOMABTM)并在冰上冷却。在DMSO中溶解过量(约1.5摩尔至20个当量)的用硫醇反应性基团(诸如吡啶基二硫化物,马来酰亚胺,或溴乙酰胺)活化的司维司群-接头中间体,在乙腈和水中稀释,并添加至PBS中的冷却的,还原的,并再氧化的抗体。典型地,自50mM Tris,pH 8中约20mM浓度的DMSO储液将药物添加至抗体并监测直至反应完全,约1至约24小时,如通过反应混合物的LC-MS分析确定的。当反应完全时,添加过量的加帽试剂,诸如乙基马来酰亚胺以淬灭反应并给任何未反应的抗体硫醇基团加帽。可以在HiTrap SP FF柱上加载并洗脱缀合混合物以去除过量的药物和其它杂质。通过离心超滤来浓缩反应混合物并将半胱氨酸工程化改造的抗体-药物缀合物通过在PBS中经由G25树脂洗脱来纯化和脱盐,在无菌条件下穿过0.2μm滤器过滤,并冷冻,供贮存。
例如,在用20mM琥珀酸钠pH 5稀释之后将粗制抗体-药物缀合物应用至阳离子交换柱。用至少10个柱体积的20mM琥珀酸钠pH 5清洗柱,并用PBS洗脱抗体。使用凝胶过滤柱将抗体-药物缀合物配制入含240mM蔗糖的20mM His/乙酸pH 5。在用赖氨酸C内肽酶处理之前和之后通过UV光谱术(用于测定蛋白质浓度),分析性SEC(大小排阻层析)(用于聚集分析)和LC-MS来表征抗体-药物缀合物。
以0.75ml/min的流速在含0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾pH6.2中使用Shodex KW802.5柱实施大小排阻层析。通过280nm处吸光度洗脱峰面积的积分来测定缀合物的聚集状态。
可以使用Agilent QTOF 6520ESI仪器实施LC-MS分析。作为一个例子,将抗体-药物缀合物用Tris,pH 7.5中的1:500w/w内切蛋白酶Lys C(Promega)于37℃处理30分钟。将所得切割片段加载到加热至80℃的
Figure BDA0001945712510001011
(埃),8μm(微米)PLRP-S(高度交联的聚苯乙烯)柱上并用5分钟里30％B至40％B的梯度洗脱。流动相A是含0.05％TFA的H2O,而流动相B是含0.04％TFA的乙腈。流速是0.5ml/min。通过280nm处的UV吸光度检测来监测蛋白质洗脱,之后进行电喷射离子化和MS分析。通常实现未缀合的Fc片段,残余的未缀合的Fab和带药物的Fab的层析解析。使用Mass HunterTM软件(Agilent Technologies)解卷积获得的m/z谱以计算抗体片段的质量。
实施例4:体外细胞增殖测定法
通过采用下述方案的细胞增殖测定法来测量抗体-药物缀合物Thio Hu抗CD2210F4v3LC K149C司维司群和Thio Hu抗Ly6E 9B12.v12LC K149C司维司群的功效(CELLTITER GLOTM发光细胞存活力测定法,Promega Corp.Technical Bulletin TB288；Mendoza et al.(2002)Cancer Res.62:5485-5488):
1.在壁不透明的384孔板的每个孔中分配在培养基中含有约4000个细胞(HER表达性SK-BR-3和KPL-4,CD22阳性BJAB,CD22阳性WSU-DLCL2或Jurkat)的40μl细胞培养物等分试样。
2.制备含有培养基且没有细胞的对照孔。
3.将抗体-药物缀合物(n＝3)添加至实验孔并温育3至5天。
4.将板平衡至室温达大约30分钟。
5.添加与每个孔中存在的细胞培养培养液的体积相等体积的CELLTITER GLOTM试剂。
6.在轨道摇床上将内容物混合15分钟以诱导细胞裂解。
7.将板于室温温育5分钟以稳定发光信号。
8.记录发光并作为％活性以图报告,其中RLU(相对发光单位)相对于对照(无抗体对照减去无细胞对照)标准化。
将数据绘图并在图1A和1B中图示,各个点代表每种抗体的每份复制品(n＝3)。方案是CELLTITER GLOTM发光细胞的一种改良。培养基:BJAB,WSU-DLCL2,和Jurkat可以在包括RPMI-1640,20％HI-FBS,2mM L-谷氨酰胺的培养基中生长。
实施例5:高表达HER2的转基因外植体小鼠中的体内功效,肿瘤生长抑制
建立肿瘤并容许生长至体积为150-200mm3(如使用测径器测量的),之后是第0天的单次处理。依照公式使用测径器测量肿瘤体积:V(mm3)＝0.5A X B2,其中A和B分别是长和短直径。在肿瘤体积达到3000mm3之前或当肿瘤显示溃疡迫近的迹象时对小鼠处以安乐死。自每个实验组(10只小鼠每组)收集的数据表述成均值±SE。
如先前所述(Phillips GDL,Li GM,Dugger DL,et al.,Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1,an Antibody-Cytotoxic DrugConjugate.(2008)Cancer Res.68:9280-90,通过援引收入本文),采用Fo5小鼠乳房肿瘤模型来评估本发明的抗体-药物缀合物在单剂静脉内注射之后的体内功效。可以用Fo5模型测试抗Her2抗体-药物缀合物,Fo5模型是一种转基因小鼠模型,其中在乳房上皮中在鼠乳房肿瘤病毒启动子的转录调节下过表达人HER2基因(MMTV-HER2)。HER2过表达引起乳房肿瘤的自发发生。通过连续移植肿瘤碎片(约2x 2mm尺寸),在FVB小鼠的后续世代中扩充这些建立者动物之一(建立者#5[Fo5])的乳房肿瘤。所有研究依照实验动物护理和使用指南进行。在研究开始时及在移植后14天给九只动物静脉内给药每种抗体-药物缀合物(单剂)。初始肿瘤尺寸是约200mm3体积。
可以如记载的那样(Chen et al.(2007)Cancer Res 67:4924-4932)采用其它乳房脂肪垫移植物功效模型,在静脉内单剂之后评估肿瘤体积,并使用自携带腹膜内肿瘤的小鼠切除的肿瘤,然后在接受者小鼠的乳房脂肪垫中连续传代。
能以这种方式测试的其它细胞系包括AU565,HCC1954,HCC1008,HCC2157,HCC202,HCC1419,HCC2218和HCC1569。
实施例6:司维司群抗体-药物缀合物的功效
自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得乳腺癌细胞系HCC1569(CRL-2330)。HCC1569X2细胞系是亲本HCC1569细胞系(ATCC,CRL-2330)的衍生物,优化了体内生长。在雌性SCID米色小鼠的右体侧中皮下注射亲本HCC1569细胞,收获一个肿瘤,切碎并体外生长,产生HCC1569XI细胞系。再次在雌性SCID米色小鼠的右体侧中皮下注射HCC1569XI系,试图改进该细胞系的生长。收集来自这项研究的肿瘤并再次适应体外生长以生成HCC1569X2细胞系。这种细胞系和自这种系衍生的肿瘤表达Ly6E。
在组氨酸缓冲液#8媒介中给SCID米色小鼠接种约2x 106个细胞。当肿瘤体积达到大约80-200mm3时(第0天),将动物随机化入各组,每组约6至10只,并施用媒介对照或下述剂量的抗体-药物缀合物任一的单次静脉内(IV)注射:0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg,6mg/kg和10mg/kg。每周两次测量肿瘤体积直至21天时研究结束。肿瘤体积是基于二维测量和计算的,使用测径器来测量,并依照公式表述成mm3:V＝0.5a X b2,其中a和b分别是肿瘤的长和短直径。为了分析随时间来自同一动物的肿瘤体积的重复测量,使用一种混合模拟办法(参见例如Pinheiro J.et al.,nlme:linear and nonlinear mixed effects models.2009；Rpackage,version 3.1-96)。这种办法能解决重复测量和在研究结束之前由非治疗相关动物移除所致的适度退出率二者。使用三次回归样条将非线性概况拟合至每个剂量水平的log2肿瘤体积的时间过程。然后使这些非线性概况与混合模型内的剂量相关。所有动物方案都得到了科研动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
实施例7:Thio抗CD22 LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺在CB-17 Fox ChaseSCID小鼠中的Bjab-luc人异种移植物模型中的功效
在体侧中以每只小鼠0.2mL的体积给55只C.B-17 SCID小鼠皮下接种20x 106个Bjab-luc细胞。当肿瘤达到150-250mm3的均值肿瘤体积时,将它们分组成6个组,每组5只小鼠。在第0天施用单次处理。体积不超过0.2ml,针尺寸是28或29号。
实施例8:Thio抗Her2 7C2 LC-K149C-MC-vc-PAB-司维司群-胺在scid米色小鼠中的KPL4人乳房异种移植物模型中的功效
以0.2ml的体积在胸部2/3乳房脂肪垫中以3x 106个细胞/小鼠给n＝60只小鼠接种在HBSS/Matrigel中悬浮的KPL-4细胞。当肿瘤达到150-250mm3的均值肿瘤体积时,它们会分组成8个组,每组5只小鼠。会在第0天施用单次处理。体积不超过0.2ml,针尺寸是28或29号。
虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明较为详细地描述了前述发明,但是描述和例子不应解释为限制本发明的范围。通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
在介绍本公开文本或其优选实施方案的要素时,冠词“一个”,“一种”,“该”和“所述”意图意味着有一个/种或多个/种该要素。术语“包含”,“包括”和“具有”意图是包括的且意味着可以有除了所列要素以外的另外的要素。
此书面说明使用例子来披露本发明,包括最佳模式,还有使得本领域任何技术人员能够实施本发明,包括生成和使用任何装置或系统和实施任何并入的方法。本发明的可授予专利权的范围通过权利要求书来限定,而且可包括本领域技术人员想到的其它例子。此类其它例子意图在权利要求书的范围内,如果它们具有与权利要求书的字面语言没有不同的结构要素的话,或者如果它们包括与权利要求书的字面语言具有非实质性差异的等同结构要素的话。

Claims (11)

1.一种司维司群(silvestrol)-接头中间体化合物,其选自:
Figure FDA0003680389980000011
Figure FDA0003680389980000021
2.权利要求1的司维司群-接头中间体化合物,其选自:
Figure FDA0003680389980000022
Figure FDA0003680389980000031
3.一种包含经由接头共价附着至司维司群药物模块的抗体的抗体-药物缀合物化合物,其选自式Ia和Ib:
Figure FDA0003680389980000032
或其药学可接受盐,
其中该抗体-药物缀合物化合物是通过使抗体Ab与权利要求2的司维司群-接头中间体化合物反应而生成的，
Ra是CH3O；
L是接头；
p是1至8的整数；且
Ab是结合一种或多种选自(1)-(53)的肿瘤相关抗原或细胞表面受体的抗体:
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型)；
(2)E16(LAT1,SLC7A5)；
(3)STEAP1(前列腺的六次跨膜上皮抗原)；
(4)MUC16(0772P,CA125)；
(5)MPF(MPF,MSLN,SMR,巨核细胞强化因子,间皮素)；
(6)Napi2b(NAPI-3B,NPTIIb,SLC34A2,溶质载体家族34(磷酸钠),成员2,II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)；
(7)Sema 5b(FLJ10372,KIAA1445,Mm.42015,SEMA5B,SEMAG,脑信号蛋白5b Hlog,sema域,七次血小板反应蛋白重复(1型和1型样),跨膜域(TM)和短胞质域,(脑信号蛋白)5B)；
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKEN cDNA2700050C12基因)；
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体)；
(10)MSG783(RNF124,假设的蛋白质FLJ20315)；
(11)STEAP2(HGNC_8639,IPCA-1,PCANAP1,STAMP1,STEAP2,STMP,前列腺癌相关基因1,前列腺癌相关蛋白1,前列腺的六次跨膜上皮抗原2,六次跨膜前列腺蛋白)；
(12)TrpM4(BR22450,FLJ20041,TRPM4,TRPM4B,瞬时受体潜在阳离子通道,亚家族M,成员4)；
(13)CRIPTO(CR,CR1,CRGF,CRIPTO,TDGF1,畸胎癌衍生的生长因子)；
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃巴二氏病毒受体)或Hs73792)；
(15)CD79b(CD79B,CD79β,IGb(免疫球蛋白相关β),B29)；
(16)FcRH2(IFGP4,IRTA4,SPAP1A(含SH2域的磷酸酶锚定蛋白1a),SPAP1B,SPAP1C)；
(17)HER2；
(18)NCA；
(19)MDP；
(20)IL20Rα；
(21)短小蛋白聚糖；
(22)EphB2R；
(23)ASLG659；
(24)PSCA；
(25)GEDA；
(26)BAFF-R(B细胞活化性因子受体,BLyS受体3,BR3)；
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同等型)；
(28)CD79a(CD79A,CD79α,免疫球蛋白相关α)；
(29)CXCR5(伯基特氏淋巴瘤受体1)；
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原))；
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72,Lyb-2)；
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105),富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白)；
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1)；
(35)FcRH5(IRTA2,免疫球蛋白超家族受体易位相关的2)；
(36)TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；
(37)PMEL17(silver同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；
(38)TMEFF1(具有EGF样和两个促卵泡素抑制素样域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；
(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；
(40)Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物,基因座E；Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1)；
(41)TMEM46(shisa同系物2(非洲爪蟾(Xenopus laevis))；SHISA2)；
(42)Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物,基因座G6D；Ly6-D,MEGT1)；
(43)LGR5(含富亮氨酸重复的G蛋白偶联受体5；GPR49,GPR67)；
(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；
(45)LY6K(淋巴细胞抗原6复合物,基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；
(46)GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；
(47)GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；
(48)ASPHD1(含天冬氨酸β-羟化酶域的1；LOC253982)；
(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；
(50)TMEM118(环指蛋白,跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；
(51)GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；
(52)CD33；和
(53)CLL-1。
4.依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物,其中Ab选自抗HER24D5,抗CD22,抗CD33,抗Ly6E,抗Napi3b,抗HER2 7C2,和抗CLL-1。
5.依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物,其中Ab是半胱氨酸工程化改造的抗体。
6.依照权利要求5的抗体-药物缀合物化合物,其中该半胱氨酸工程化改造的抗体是选自HC A118C,LC K149C,HC A140C,LC V205C,LC S121C,和HC L177C的突变体。
7.依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物,其中p是1,2,3,或4。
8.依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物,其构成该抗体-药物缀合物化合物的混合物,其中该抗体-药物缀合物化合物的混合物中的平均药物载荷每抗体是2至5。
9.一种药用组合物,其包含依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物和药学可接受稀释剂,载剂或赋形剂。
10.依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物在制造用于在哺乳动物中治疗癌症的药物中的用途。
11.一种生成依照权利要求3的抗体-药物缀合物化合物的方法,该方法包含使抗体与权利要求2的司维司群-接头中间体化合物反应。
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