JP2004524810A - Ｃｒｉｐｔｏ変異体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、各々、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドからの少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＣＲＩＰＴＯ変異体が腫瘍のブロッキング効果を示すことを発見したことに基づく。本発明は、ＣＲＩＰＴＯ変異体（これらのＣＲＩＰＴＯ改変体およびフラグメントを含む）、好ましくは、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのフコシル化部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＣＲＩＰＴＯ変異体に関し、ここで、このアミノ酸は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸で置換される。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、ＣＲＩＰＴＯ変異体およびその使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＣＲＩＰＴＯ−１（ＣＲ−１、ヒト；Ｃｒ−１、マウス）（これはまた、奇形癌由来増殖因子−１（米国特許第５，７９２，６１６号；同第５，２５６，６４３号；同５，６５４，１４０号）として公知である）、およびＣＲＩＰＴＯ−３（ＣＲ−３、ヒト；Ｃｒ−３、マウス）（米国特許第５，２６４，５５７号；同第５，６２０，８６６号；同第５，６５０，２８５号）（これらは、本明細書中においてＣＲＩＰＴＯと総称される）は、ＥＧＦ関連タンパク質である。これらの遺伝子は、発達中の胚、正常な成体の組織、および腫瘍細胞（乳癌細胞および結腸癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない）において発現される。
【０００３】
本発明の発見は、図１に示されるような、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸残基スレオニン−８８で、哺乳類細胞において発現されたＣＲＩＰＴＯが、Ｏ結合型フコース（Ｏ結合型グリコシル化の異常形態）によって修飾されることである。タンパク質にフコース修飾を付与する酵素は、７つのアミノ酸立体配置（「フコシル化部位」）を認識する。本発明の発見は、特にＮ−１位（すなわち、図１に示されるＣＲＩＰＴＯポリペプチド由来のグリシン残基８６）およびＮ−２位（図１に示されるＣＲＩＰＴＯポリペプチド由来のグリシン残基８７）における２つの残基が、スレオニン−８８のフコシル化が発生するために必要とされることである。さらに、本発明の発見は、ＣＲＩＰＴＯの非フコシル化形態（これは、機能性アンタゴニストとして作用する）が抗腫瘍活性を有することである。機能性アンタゴニストとして作用し得るＣＲＩＰＴＯの非フコシル化形態として、ＣＲＩＰＴＯの、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとの結合を変化させる変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。任意の可溶性ＥＧＦリガンド（すなわち、上皮増殖因子、トランスホーミング増殖因子α、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ））における、Ｏ結合型フコース修飾についての根拠はない。
【０００４】
診断的展望または治療的展望から、所望の抗発癌性特性を有するＣＲＩＰＴＯ変異体の開発について、考慮すべき興味が存在する。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、ＣＲＩＰＴＯ変異体（これらのＣＲＩＰＴＯ改変体およびフラグメントを含む）、好ましくは、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのフコシル化部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＣＲＩＰＴＯ変異体に関し、ここで、このアミノ酸は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸で置換される。
【０００６】
１つの実施形態において、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはその機能性フラグメントに由来する、少なくとも１つのアミノ酸残基は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸で置換され、ここで、このアミノ酸置換は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列の、アミノ酸残基８６、８７、および８８からなる群より選択される。
【０００７】
１つの実施形態において、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドは、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドまたはそれらの機能性フラグメント；関連するシグナルペプチドを欠く、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチド、またはそれらの機能性フラグメント；あるいは、配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］で示されるポリペプチドのドメインまたはそれらの機能性フラグメント、からなる群より選択される。好ましい実施形態において、この１つ以上の置換は、アラニンまたはグリシンからなる群より選択されるアミノ酸である。
【０００８】
別の実施形態において、ＣＲＩＰＴＯ変異体は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドの８８位での脱フコシル化修飾を含む。このＣＲＩＰＴＯポリペプチドは、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）で示されるポリペプチドまたはそれらの機能性フラグメント；関連するシグナルペプチドを欠く、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）で示されるポリペプチドまたはそれらの機能性フラグメント；あるいは、配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］で示されるポリペプチドのドメインまたはそれらの機能性フラグメント、からなる群より選択される。
【０００９】
上記のＣＲＩＰＴＯ変異体およびそれらの機能性フラグメントをコードする、核酸配列もまた提供される。１つの実施形態において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号３６（ＣＲ−１）または配列番号３７（ＣＲ−３）のコード配列、あるいは、配列番号３６（ＣＲ−１）または配列番号３７（ＣＲ−３）のコード配列の相補体からなるプローブのヌクレオチド配列）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列をコードし、そして少なくとも１つのアミノ置換をさらに含む。ここでこのアミノ酸置換は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、８７、および８８からなる群より選択される。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、上記のＣＲＩＰＴＯ変異体に従う変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドおよびそれらの機能性フラグメントを含み、そして、異種ポリペプチドをさらに含む、キメラ分子を提供する。１つの実施形態において、この異種ポリペプチドは、変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのＣ末端に融合される。代替の実施形態において、この異種ポリペプチドは、変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのＮ末端に融合される。この異種ポリペプチドとして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ポリメラーゼ活性化ドメイン、ヒスチジンタグ、ＨＳＡタグ、エピトープタグ配列および免疫グロブリンのＦｃ領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、上記のＣＲＩＰＴＯ変異体に従う変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドを含み、そして、合成ポリマーをさらに含む、キメラ分子を提供する。合成ポリマーの非限定的な例として、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が挙げられる。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、有効量の上記の修飾ポリペプチドに腫瘍細胞を曝露する工程を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、この腫瘍細胞は、インビボで曝露される。別の特定の実施形態において、この腫瘍細胞は、インビトロで曝露される。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、有効量の上記ポリペプチドを被験体に投与する工程を含む、所望されない細胞増殖に関連する疾患の進行、重症度または影響を処置するかまたは減少させる方法を提供する。特定の実施形態において、この疾患または状態は、所望されない細胞増殖に関連する。第２の特定の実施形態において、所望されない細胞増殖に関連するこの疾患または状態は、癌である。第３の特定の実施形態において、この癌は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、黒色腫または白血病からなる群より選択される。
【００１４】
上記の、ならびに上記以外の、本発明の目的、特徴、局面および利点、ならびに本発明自体は、以下の、好ましい実施形態の説明からより完全に理解される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明の発見は、哺乳類細胞において発現されるヒトＣＲＩＰＴＯがフコース基により「フコシル化部位」で修飾されること、および、この修飾が生理活性のために重要であることである。フコシル化部位内に修飾を伴うＣＲＩＰＴＯポリペプチドは、ＣＲＩＰＴＯ機能をブロックし得、従って、これらのＣＲＩＰＴＯ改変体が機能性変異体として役立つことを可能にする。
【００１６】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１−全長ＣＲＩＰＴＯ−１（ＣＲ−１）−アミノ酸残基１〜１８８
配列番号２−全長ＣＲＩＰＴＯ−３（ＣＲ−３）−アミノ酸残基１〜１８８
配列番号３−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１
配列番号４−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１
配列番号５−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１
配列番号６−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ
配列番号７−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ
配列番号８−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１−Ｆｃ
配列番号９−全長ＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１０−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１１−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１２−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１３−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号１４−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号１５−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号１６−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３
配列番号１７−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３
配列番号１８−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３
配列番号１９−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ
配列番号２０−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ
配列番号２１−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３−Ｆｃ
配列番号２２−全長ＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２３−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２４−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２５−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２６−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号２７−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号２８−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号２９−プライマー ＮＥＷ−５４７
配列番号３０−プライマー ＮＥＷ−５８７
配列番号３１−プライマー ＮＥＷ−５８８
配列番号３２−プライマー ＮＥＷ−４２３
配列番号３３−プライマー ＮＥＷ−６７０
配列番号３４−プライマー ＮＥＷ−６５８
配列番号３５−プライマー ＮＥＷ−６５９
配列番号３６−ＣＲ−１をコードする核酸配列
配列番号３７−ＣＲ−３をコードする核酸配列
（選択された定義）
本明細書中で用いられる用語（「ＤＮＡ」、「遺伝子」、「ポリペプチド」、「アミノ酸」などを含む）は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡまたは遺伝子工学、および免疫学の分野における、技術的に認識されているそれらの意味で用いられる。このような意味は、広範に入手可能な以下の文献の１つ以上の参照によって決定される：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号、発明者Ｍｕｌｌｉｓら；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、１９８７発行；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８９発行；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（特に第１５４巻および第１５５巻）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編）、１９８６；ならびに、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８６。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、「ＣＲＩＰＴＯポリペプチド」は、天然に存在する任意のＣＲＩＰＴＯタンパク質またはＣＲＩＰＴＯポリペプチドであり、これらとして例えば、配列番号１に示されるようなＣＲＩＰＴＯ−１または配列番号２に示されるようなＣＲＩＰＴＯ−３、あるいはそれらのフラグメントまたは改変体が挙げられる。改変体は、アミノ酸配列において、または、配列と関係ない様式で、あるいはその両方において、天然に存在するＣＲＩＰＴＯポリペプチドと異なり得る。アミノ酸配列における改変体は、天然に存在するＣＲＩＰＴＯポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸が異なる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体または非天然アミノ酸で置換される場合に、作製される。特に好ましい置換改変体として、１つ以上の保存的なアミノ酸置換によって、野生型配列と異なる、天然に存在するＣＲＩＰＴＯポリペプチド、またはそれらの、生物学的に活性な固有のフラグメントが挙げられる（このアミノ酸置換は代表的に、このタンパク質またはペプチドの２次構造および疎水的性質に対して最小の影響しか有さない）。保存的な置換として、代表的に、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換（例えば、以下の群内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン）が挙げられる。他の保存的な置換は、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｄａｙｈｏｆｆら編），１９７８において定義されるような、「一般に認められる点変異」についての基準を満たす置換である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４４４６０もまた参照のこと。改変体は、天然に存在するか、あるいは合成技術または分子操作技術を通じて産生され得る。当業者は、操作されたＣＲＩＰＴＯ改変体が、（例えば、精製の容易化、安定性の改善、生物学的機能の調節などにおける）有利な性質を提供し得ることを、理解および認識する。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、「ＣＲＩＰＴＯ変異体」は、ＣＰＩＰＴＯポリペプチドからの少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸（これは、ＣＲＩＰＴＯポリペプチド中に存在するアミノ酸と異なり、かつＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックまたは阻害し得る）で置換された、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはＣＲＩＰＴＯ改変体である。１つの実施形態において、このアミノ酸置換として、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはＣＲＩＰＴＯタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、８７または８８が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＰＴＯ変異体結合は、ＣＲＩＰＴＯとＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとの連結によって他の様式では誘発される細胞応答を、ブロックまたは阻害する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＰＴＯ変異体は、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯ結合を、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％、阻害またはブロックし得る。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドの「機能性フラグメント」は、全長ポリペプチドより短いポリペプチドフラグメントであり、そして、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックまたは阻害する能力を有する。好ましい実施形態において、この機能性フラグメントは、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合を、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％、阻害またはブロックし得る。変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのフラグメントが機能性であるか否かを証明する方法は、当該分野において公知である。例えば、目的のフラグメントは、組換え方法、合成方法、またはタンパク質分解消化方法のいずれかによって作製され得る。次いで、このようなフラグメントは単離され得、そして、競合的ブロック実験を含む、当業者に公知の方法による手順によって、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックまたは阻害する能力について試験され得る。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、「腫瘍細胞の増殖を阻害する」とは、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）（これは、胸部、腹部、骨盤および頭部における罹病部位をモニターするために、代表的に用いられる）；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（これは、腹部、骨盤、脳、脊椎および他の骨における罹病部位をモニターするために、代表的に用いられる）；乳房Ｘ線撮影（これは、乳房における罹病部位をモニターするために代表的に用いられる）を含む、放射線学的画像法技術によって腫瘍をモニターする工程を含む当業者に公知の技術によって測定される場合、腫瘍細胞の成長または増殖を、約２０％、あるいは約３０％、約４０％または好ましくは約５０％、阻害またはブロックし得る、分子を意味する。当業者に公知の腫瘍マーカーの例として、結腸直腸癌の患者を疾患の進行についてモニターするため、ならびに、診断またはより後の疾患過程で、癌胎児抗原（ＣＥＡ）レベルの実証された増大を伴う、例えば胃腸腫瘍または乳房腫瘍の患者をモニターするためにしばしば用いられる、癌胎児抗原（ＣＥＡ）；膵臓癌の患者をモニターするためにもっとも一般的に用いられるが結腸直腸癌においても増大する、ＣＡ１９−９；乳癌の患者においてしばしば増大する、ＣＡ１５−３およびＣＡ２７．２９（ＣＡは癌抗原を意味する）が挙げられる。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、「異種」は、比較される実体の残りと異なる実体に由来することを意味する。異種の例は、遺伝子操作技術によって、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。ＤＮＡ結合ドメイン、ヒスチジンタグ；エピトープタグ配列。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、「Ｆｃ領域」とは、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およびヒンジ領域を含むが抗原結合部位を欠く、抗体の部分をいう。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「フコシル化部位」は、特定のアミノ酸残基に対するフコース基に特徴的な１４６ダルトンの質量付加の同定によって、質量分析を用いて実験的に定義され得る、アミノ酸配列である。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドが以下の性質のうちの少なくとも１つを有する場合、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドは「活性」を有する：（ｉ）ｓｍａｄ２のリン酸化を誘導する；（ｉｉ）ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター構築物の誘導によって測定される、ＦＡＳＴ依存活性を調節する；（ｉｉｉ）ボイデンチャンバー遊走アッセイにおける、乳腺細胞株の移動を刺激する；（ｉｖ）コラーゲンゲルにおける、乳房上皮細胞の分枝を刺激する（Ｅｂｅｒｔら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５：２２３〜２２９，２０００を参照のこと）。ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックする変異体ＣＲＩＰＴＯは、野生型ＣＲＩＰＴＯと比較して、これらの活性のレベルの減少を示す。例えば、本明細書中に定義されるＣＲＩＰＴＯ変異体は、コントロールと比較した場合、２０％、好ましくは３０％、そしてより好ましくは５０％少ないＳＭＡＤ２のリン酸化を生じる。あるいは、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックする変異体ＣＲＩＰＴＯは、ＦＡＳＴ調節エレメント（すなわち、ルシフェラーゼレポーター）の阻害によって測定されるＦＡＳＴ依存活性を、コントロールと比較した場合、２０％、好ましくは３０％、さらに好ましくは５０％、調節する。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、「脱フコシル化改変」とは、フコース基の化学的または酵素的な除去を意味する。例えば、本明細書中で用いられる場合の本発明のＣＲＩＰＴＯポリペプチド上のＴｈｒ８８におけるフコースは、フコシダーゼによって酵素学的に除去され得るか、あるいは、本発明のＣＲＩＰＴＯポリペプチド上のＴｈｒ８８におけるフコースは、酸処理によって化学的に除去され得る。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、核酸サンプルへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、代表的に、「ストリンジェントな条件」下で行われる。核酸二重鎖または核酸ハイブリッドの安定性は、融解温度またはＴｍ（これは、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である）として表される。この融解温度は、必要なストリンジェンシー条件を定義するために用いられる。関連があり、かつ（同一ではないが）実質的に同一な配列が同定される場合、特定の塩（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）濃度で、相同的なハイブリダイゼーションのみが発生する最低温度を最初に確立することは、有用である。次いで、１％の不一致がＴｍの１℃の低下を生じると仮定すると、それに応じて、ハイブリダイゼーション反応における最終的な洗浄の温度は減少する（例えば、プローブと、９５％を超える同一性を有する配列が探索される場合、最終的な洗浄の温度は５℃低下する）。実際には、Ｔｍの変化は、１％の不一致当たり０．５℃〜１．５℃であり得る。ストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中で６８℃でハイブリダイゼーションする工程、および、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温で洗浄する工程を含む。「中程度にストリンジェントな条件」は、３×ＳＳＣ中で４２℃で洗浄する工程を含む。塩濃度パラメーターおよび温度パラメーターは、プローブと標的核酸との間の最適なレベルの同一性を達成するために変動し得る。このような条件に関するさらなる手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）によって、当該分野において容易に利用可能である。
【００２７】
（本発明の化合物の治療的な使用）
本発明は、本発明の薬学的組成物の投与による、種々の疾患および障害の処置または防止を提供する。
【００２８】
特定の実施形態において、本発明の薬学的な組成物は、被験体における所望されない細胞増殖を処置または防止するために用いられる。興味深い実施形態において、本発明の薬学的な組成物は、腫瘍（これらは、増殖についてＣＲＩＰＴＯタンパク質に依存する）の増殖を阻害またはブロックするために、治療的に用いられ得る。特定の局面において、所望されない細胞増殖に関連する疾患または状態は、癌である。好ましい実施形態において、この癌は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、黒色腫または白血病からなる非限定的な群より選択される。
【００２９】
（薬学的組成物）
本発明は、有効量の本発明の薬学的組成物の、被験体への投与による、処置方法を提供する。好ましい局面において、この薬学的組成物は、十分に精製されている。本明細書中で用いられる場合、用語「被験体」は、本発明の薬学的組成物が投与され得る任意の哺乳動物を意味するために採用される。本発明の方法を用いる処置に特に意図される被験体として、ヒト、ならびに非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラットおよびマウスが挙げられる。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、ヒトにおける使用の前に、所望の結果についてインビトロで試験され、次いで、インビボで試験される。種々の特定の実施形態において、例えば、実施例４に記載されるように、被験体の障害に関与する細胞型の代表的な細胞（例えば、乳癌細胞）を用いて、ＣＲＩＰＴＯ変異体がこのような細胞型に対して所望の影響を有するか否かを決定するために、インビトロアッセイが行われ得る。
【００３１】
一般に、本発明の化合物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤中で、懸濁、溶解、または分散される。得られた薬学的組成物は、被験体のホメオスタシス（特に、電解質バランス）に不利に影響しない。従って、例示的なキャリアは、通常の生理食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）を含む。他の受容可能なキャリアは当該分野において周知であり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０に記載される。受容可能なキャリアとしては、生体適合性であるか、不活性であるか、または生体吸収性である塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、増粘剤、保存剤などが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、用語「キャリア」は、リポソームおよびＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：１６８〜１７５，１９９５を参照のこと）ならびに任意のプラスミド発現ベクターおよびウイルス発現ベクターを包含する。
【００３２】
本発明の任意のＣＲＩＰＴＯ変異体は、薬学的に受容可能な塩の形態で用いられ得る。本発明のポリペプチド、核酸およびベクターと塩を形成し得る、適切な酸および塩基としては、当業者に周知であり、そして無機および有機の、酸および塩基が挙げられる。
【００３３】
本発明のＣＲＩＰＴＯ変異体は、キャリアにおいて、治療的に有効な量（これは検出可能な（好ましくは、医学的に有益な）効果を被験体において生じるために十分な量である）の化合物を被験体に送達するために十分な濃度にまで分散される。医学的に有益な効果として、被験体の医学的状態の悪化の防止、遅延または減弱、あるいは、被験体の医学的状態を検出可能に改善することが挙げられる。医学的に有益な効果を生じるＣＲＩＰＴＯ変異体の濃度または量は、本発明が実施される状況に伴ってかなり変動することが予測される。有効量は、通常の技術を有する医師または開業医によって、慣用的な実験法のみを介して決定され得る。例えば、所望でない細胞の増殖の状態の指標は、例えば、上記のＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７．２９またはＣＡ１５−３のレベルを測定する、１つ以上の慣用的な実験室での試験を用いてモニターされ得る。これらの試験によって測定されたパラメーターは、疾患の進行または退行を評価するために、医師によって用いられ得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＰＴＯ変異体は、リポソーム送達システムにおいて処方され、これらとして、任意の種々の単層ベシクル、複層ベシクル、または安定な多層ベシクルが挙げられるがこれらに限定されず、これらは全て、当業者に周知の方法に従って（例えば、米国特許第５，１６９，６３７号、同第４，７６２，９１５号、同第５，０００，９５８号または同第５，１８５，１５４号の教示に従って）、調製および投与され得る。さらに、リポソームへの本発明の新規なポリペプチド、ならびに選択された他のポリペプチドの結合を増強するために、リポタンパク質としてこれらのポリペプチドを発現することが、所望であり得る。例えば、所望されない細胞増殖に関連する疾患または状態の、リポソーム被包性ＣＲＩＰＴＯ変異体を用いる処置は、リポソームを用いるこのような治療を必要とする患者にＣＲＩＰＴＯ変異体を導入する工程によって、インビボで行われ得る。このリポソームは、カテーテルを介して、被験体の動脈に送達され得る。被胞性タンパク質は、所望されない細胞増殖の阻害への任意の影響について、インビトロで試験され得る。
【００３５】
（投与経路）
本発明の化合物は、医学的に受容可能な任意の様式において投与され得る。特定の状況に依存して、局所投与または全身投与が所望であり得る。好ましくは、この化合物は、非経口経路を介して（例えば、脈管内、静脈内、動脈内、皮下、筋内、腫瘍内、眼窩内、心室内、腹腔内、被膜下、頭蓋内、脊椎内、あるいは鼻腔内の、注射、注入または吸入によって）投与される。この化合物はまた、被験体への、注入ポンプ、または、生体適合性もしくは生体侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）の徐放性インプラントの移植、あるいは、（例えば、腎動脈における）カテーテルの導入によって、投与され得る。あるいは、本発明の特定の化合物、またはそれらの処方物は、経口投与または経腸投与のために適切であり得る。本発明のさらに他の化合物は、局所投与のために適切である。
【００３６】
（処置レジメン）
個体に投与される、任意の特定のＣＲＩＰＴＯ変異体を用いる処置の、適切な投薬量および頻度の決定は、通常の開業医の技術および臨床的判断に入る。一般的な投薬量および処置日程は、前臨床試験および臨床試験（これらは、化合物の最適な投与パラメーターを決定するための、広範であるが慣用的な研究を含む）によって確立される。このような勧告がなされた後でさえ、開業医はしばしば、種々の考慮（例えば、個体の年齢、医学的状況、体重、性別、および他の医薬品との同時発生的な処置）に基づいて、異なる個体に対してこれらの投薬量を変動させる。各ＣＲＩＰＴＯ変異体に対する最適な投薬量および投与レジメンを決定することは、製薬および医学の分野の当業者にとって慣用的な問題である。
【００３７】
（実施例）
（実施例１：組換えＣｒｉｐｔｏの産生）
（Ａ．ＣＨＯ細胞におけるヒトＣｒｉｐｔｏｃＣ−Ｆｃの発現および精製）
ｐＳＧＳ４８０と命名した発現プラスミドを、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ；配列番号６）に融合した、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基メチオニン１〜セリン１６９をコードするｃＤＮＡをサブクローン化することによって、ベクターｐＥＡＧ１１００（構築物を、図２に概略的に示す）内に構築した。このベクターｐＥＡＧ１１００は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ プラスミド ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−ｂｅｔａｇａｌ（ＣＨＯ一過性トランスフェクションにおけるこの使用は、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｉら、１９９９、Ｆｏｃｕｓ ２１：１６に記載された）の誘導体である。このベクターを、プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−Ｂｅｔａｇａｌ（カタログ番号１０５８６−０１４）からレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼのＮｏｔＩフラグメントを除去することによって、以下のように産生した：このプラスミドをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、４．３８ｋｂのＮｏｔＩベクター骨格フラグメントをゲル精製し、そして連結した。連結したＤＮＡを、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。ｐＥＡＧ１１００を、単離された単一のコロニーから所望の組換え体を含むプラスミドとして単離した。プロモーター、ポリリンカーおよび転写終結シグナルにわたるｐＥＡＧ１１００の配列を確認した。
【００３８】
プラスミドｐＳＧ４８０を、ＣＨＯ細胞内に一時的にトランスフェクトし、そしてこの細胞を、２８℃で７日間増殖させた。これらの細胞および馴化培地におけるＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃタンパク質の存在を、ウエスタンブロット分析によって試験した。ウエスタンブロット分析のために、Ｃｒｉｐｔｏトランスフェクト細胞由来の馴化培地および細胞を、還元条件下において、４〜２０％勾配のゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースに電気泳動的に転写し、そしてＣｒｉｐｔｏを、Ｃｒｉｐｔｏ １７マーペプチド（配列番号１の残基９７〜１１３を含む）−キーホールリンペットヘモシアニン結合に対して惹起したウサギポリクローナル抗血清で検出した。遠心分離してこの細胞を除去した後、ウエスタンブロット分析は、ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃタンパク質が馴化培地（上清）へと効率的に分泌されることを示した。この上清を、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、そして結合タンパク質を、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。溶出されたタンパク質を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）で中和し、そして２４０〜３４０ｎｍでの吸光度測定からタンパク質の総量について、および、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について、分析した。溶出されたタンパク質を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして−７０℃で貯蔵した。
【００３９】
Ｎ末端配列決定を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＥ−ＡＢＤ）Ｐｒｏｃｉｓｅ ＨＴ配列決定装置（パルス液体モードで作動させた）上で実行した。得られたＰＴＨアミノ酸を、ＰＴＨ Ｃ１８ ２．１×２５０ｍｍのカラムを備えるＰＥ ＡＢＤ １４０Ｃ Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いて分離し、ＰＥ ＡＢＤ ７８５Ａ（プログラム可能な吸光度検出器）を用いて、オンラインで分析した。ＡＢＩ ６１０Ａデータ分析ソフトウェアを用いて、データを分析した。配列決定は、単一のＮ末端：Ｌ３１ＧＨＱＥＦＡＲを同定した。
【００４０】
（Ｂ．ＣＨＯ細胞におけるヒトＣｒｉｐｔｏ（７５−１１２）−Ｆｃの発現および精製）
ｐＳＧＳ４２２と命名した発現プラスミドを、本質的にはＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ（図２）について上に記載したように、ベクターｐＥＡＧ１１００におけるヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃ、配列番号８）に融合した、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏ−１残基７５〜１１２に融合した、ヒトＶＣＡＭ−１シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡをサブクローン化することによって構築した。プラスミドｐＳＧＳ４２２を、ＣＨＯ細胞内に一時的にトランスフェクトした。ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃタンパク質は上清中に効率的に分泌された。そして、ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃタンパク質を、ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃについて上に記載したように、プロテインＡのクロマトグラフィーによって、馴化培地から精製した。
【００４１】
（実施例２：ＣｒｉｐｔｏでのＯ結合型グリコシル化の特徴付け）
精製された組換えｈｕ ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃおよび組換えｈｕ ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃを、Ｎ−脱グリコシル化の前および後の質量分析によって特徴付けた。酵素または臭化シアンでの処置によるペプチドマッピングによって、逆相（ｒｐ）−ＨＰＬＣによって分離され、そしてＭＡＬＤＩおよびエレクトロスプレー（ＥＳＩ）質量分析によって特徴付けられるフラグメントを得た。ペプチドマッピング、質量分析法およびグリコシダーゼ処理による生化学的特徴づけにより、Ａｓｎ−７９を、約９０％の占有率を有するＮ結合型グリコシル化部位として、そして、Ｓｅｒ−４０およびＳｅｒ−１６１を、それぞれ約８０％および約４０％の占有率を有するＯ結合型グリコシル化部位として、同定した。さらに、以下に詳述するように、単一のＯ結合型フコースを用いて、Ｔｈｒ８８位でＣｒｉｐｔｏを修飾した。
【００４２】
（Ａ．ＣｒｉｐｔｏのＰＮＧａｓｅ処理）
ＰＮＧａｓｅ Ｆを、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．６）、５ｍＭのＥＤＴＡ中のＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ糖タンパク質を、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で、室温で６時間還元し、次いで、１ｍｇのＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃあたり１５０ミリ単位のＰＮＧａｓｅ Ｆで、３７℃で１６時間処理した。Ｎ−脱グリコシル化された生成物を、三連四重極装置（Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）上で、ＥＳＩ−ＭＳ分析によって分析した。
【００４３】
Ｎ−脱グリコシル化および還元されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃに対する、エレクトロスプレーイオン化質量分析のデータは、４１１１６〜４２８７０Ｄａの範囲に及ぶ質量を有する、多くの種を示した（図３）。これらの多くの種は、残基３１で始まり、そしてＯ結合型グリカン（ＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃ）で修飾されるＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃに対して予測された質量と一致する、実測質量を有した。対照的に、多くの種が同定され、これらの質量は、利用可能ないかなる予測とも一致しないが、各々の種に対する１４６Ｄａという質量の差異はフコース基の添加と矛盾しなかった（図３）。
【００４４】
Ｎ−脱グリコシル化および還元されたＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃタンパク質の逆重畳積分された（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量スペクトルもまた、予測されたよりも１４６Ｄａ高い質量（フコース修飾と矛盾しない）を有する多くの種を示した。
【００４５】
（Ｂ．エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃペプチドマッピング）
ヒトＣｒｉｐｔｏ配列における、明白な１４６Ｄａの翻訳後修飾の同一性および結合位置を、ペプチドマッピングと質量分析との組み合わせを用いて、さらに決定した。図４は、用いたストラテジーおよび結果を概略的に示す。
【００４６】
後のペプチドマッピング実験のために用いられるＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃサンプルを、上記のようにＤＴＴで還元し、そしてこのサンプルを６Ｍのグアニジンまで調節した後、さらなる１０ｍＭのＤＴＴで、４５℃で３５分間還元し、そして３０ｍＭのヨードアセトアミドで、暗所において室温で３０分間アルキル化した。インタクトな、Ｎ−脱グリコシル化された、還元された、そして完全にアルキル化されたタンパク質の質量は、予測よりもなお１４６Ｄａ高かった。このことは、＋１４６Ｄａがシステイン残基と関連しないことを示した。
【００４７】
還元およびアルキル化されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ物質を、エンドプロテイナーゼ Ｌｙｓ−Ｃ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ；ＷＡＫＯ）を用いて、１Ｍの尿素、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中で、酵素対基質比が１：１０で、室温で１６時間消化した。還元およびアルキル化されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃサンプルの、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物から得られたペプチドを、１２０分間の０〜４５％溶媒Ｂ勾配（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ／７５％アセトニトリル）を用いて、流速０．０５ｍｌ／分で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いるＹＭＣ Ｃ１８カラムでの逆相（ｒｐ）−ＨＰＬＣによって分離し、そして質量分析（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ 三連四重極装置）によってオンラインで分析した。データは、＋１４６Ｄａ修飾が、残基７７〜１１２を含むエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで産生したＣｒｉｐｔｏペプチドと関連することを示した。Ｃｒｉｐｔｏ上の＋１４６修飾のさらなる局在化は、還元およびアルキル化されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃの、分離用エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物に由来した。ペプチドを、ＹＭＣ Ｃ１８カラム上でのｒｐ−ＨＰＬＣによって分析し、以下の溶媒Ｂの勾配で溶出した：０〜１０％Ｂ（１０分）；１０〜２８％Ｂ（１０〜４６分）；２８％で維持（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）（４６〜７０分）；２８〜５０％Ｂ（７０〜１４５分）；５０〜１００％Ｂ（１４５〜１５５分）。各々のＣｒｉｐｔｏペプチド（または混合物）を収集し、そして、α−シアノ−４ ヒドロキシ−桂皮酸をマトリックスとして用いるＭＡＬＤＩ質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＳＴＲ装置、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。特定されたピークを網羅する溶出液（２μｌ）をＭＡＬＤＩプレートに塗布し、そして部分的に空気乾燥させた。各スポットに、０．７μＬのマトリックス（１０ｍｇのα−シアノ−４ ヒドロキシ−桂皮酸／１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル）を添加し、そして完全に空気乾燥させた。線形モードでサンプルを分析した。ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃのＥｎｄｏＬｙｓ−Ｃ消化物において先に見られた７７〜１１２Ｃｒｉｐｔｏペプチドに加えて、非特異的切断現象を起こす、この７７〜１１２フラグメントから得られる、２つのペプチドもまた観察した。この分析から、７７〜８２ペプチドが、予測された質量を有することを見出し、そして、１４６Ｄａ質量付加を、残基８３〜１１２（図４）に対応するＣｒｉｐｔｏペプチド上に、さらに局在化した。このペプチドの同一性を、Ｎ末端Ｅｄｍａｎ配列決定によって確認した。
【００４８】
（Ｃ．臭化シアンマッピング）
１４６Ｄａ修飾の部位に対するさらなる根拠を、還元されていないＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃを臭化シアン（ＣＮＢｒ）で処理することによって得た。上記のように調製されたが、還元されていない、ＰＮＧａｓｅ処理されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃを、２００μＬの７０％ギ酸中に再懸濁させた。アセトニトリル中の１０ＭのＣＮＢｒ溶液を、最終濃度の１Ｍまで、反応混合物に添加した。このサンプルを、暗所において室温で２４時間保持した。ＣＮＢｒ処理されたＣｒｉｐｔｏペプチドを、以下の溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）、溶媒Ｂ（０．０８５％ＴＦＡ、７５％アセトニトリル）の勾配を用いるＶｙｄａｃ Ｃ４カラム上でのｒｐ−ＨＰＬＣによって分画した：０〜２０％Ｂ（０〜１０分）；２０〜７５％Ｂ（１０〜１２０分）；７５〜１００％Ｂ（１２０〜１３０分）。ＣＮＢｒ切断は、残基９１〜１５４にジスルフィド結合した、予測される残基７１〜９０に対応するフラグメントを与える（図４）。還元後、ＭＡＬＤＩ質量分析によって測定された分子量は、ペプチド７１〜９０の質量が、予測よりも１４６ダルトン高いことを示した。
【００４９】
ＣＮＢｒ処理されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃフラグメントを、さらに１Ｍの尿素中のエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで、１：５の推定された酵素：基質比で、室温で１８時間消化した。ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃサンプルのＣＮＢｒ／エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物由来のペプチドを、上記のように、ＹＭＣ Ｃ１８カラムでの逆相（ｒｐ）−ＨＰＬＣによって分離した。データは、＋１４６Ｄａ修飾物が、残基８３〜９０を含むＣＮＢｒ／エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ生成Ｃｒｉｐｔｏペプチドと関連することを確証した。
【００５０】
残基９１〜１５４にジスルフィド結合した残基７１〜９０を含むＣＮＢｒフラグメントを、５ｍＭのＤＴＴで還元し、そしてカルボキシペプチダーゼＹ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理した。この消化物の一部を、ＭＡＬＤＩ質量分析によって、１０分間隔で分析した。結果は、ペプチド７１〜９０のＣ末端ホモセリンラクトン（ＣＮＢｒ切断後にホモセリンラクトンに転換されるＭｅｔ）が、追加の１４６Ｄａ物の損失なく、除去され得ることを示した（図４）。
【００５１】
ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化（実施例２、パートＢ）は、１４６Ｄａ修飾物を、残基８３〜１１２を含むＣｒｉｐｔｏペプチドに局在させた。ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃのＣＮＢｒ／エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物（実施例２、パートＣ）は、１４６Ｄａ修飾物を、残基７１〜９０を含むＣｒｉｐｔｏペプチドに局在させた。これらの２つの分析は、総合すると、１４６ダルトン修飾物を残基８３〜９０に局在させた。カルボキシペプチダーゼＹ処理は、１４６ダルトン修飾物を、Ｃｒｉｐｔｏ残基８３〜８９（ＣＬＮＧＧＴＣ）にさらに局在させた。この配列内のシステイン残基は、アルキル化のために利用可能であることが上で示されたので、１４６ダルトン物によって修飾されない。ロイシン、グリシンは、代表的には修飾されない。Ｇｌｙの前のＡｓｎは、１７Ｄａの関連する損失（ＮＨ３の損失）を伴って、環状イミドを形成し得、この環状イミドは、塩基性条件下でαアスパラギン酸またはβアスパラギン酸（ＯＨの付加）を形成し、このペプチドに対して１Ｄａの正味の増加を生じる。これは、修飾の起こりそうな部位であるＴｈｒ８８から離れる。Ｔｈｒ８８がフコシル化されたことを本発明者らに結論付けさせる、１４６Ｄａ修飾物をＴｈｒ８８が有することは、本発明の発見であった。フコシル化は、タンパク質修飾の中では希な現象である。１４６Ｄａ修飾物が局在されるＣｒｉｐｔｏ配列は、Ｃ２ＸＸＧＧＳ／ＴＣ３のフコシル化コンセンサス配列（この部位は、ＥＧＦ様配列の第２および第３の保存されたシステインの間に位置し、Ｘは任意のアミノ酸であり、そしてフコースはセリンまたはスレオニン上にある）に関して記載されたモチーフと一致する（Ｈａｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：６５３９〜６５４７、１９９３を参照のこと）。
【００５２】
（実施例３：８８位のＯ−フコースを欠くＣｒｉｐｔｏ改変体Ｔｈｒ８８Ａｌａ）
部位特異的な変異誘発を用いて、８８位でスレオニンではなくアミノ酸残基アラニンを有するＣｒｉｐｔｏ改変体をコードするｃＤＮＡを発現し得る、発現ベクターを構築した。変異体構築物を、図５に概略的に示す。
【００５３】
（Ａ．変異体の構成）
ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の、スレオニン８８からアラニンへの変異誘発（Ｔ８８Ａ）を、スプライスドオーバーラップ伸長（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ ＰＣＲ）によって達成した（Ｓｔｅｐｈａｎ Ｈｏら、Ｇｅｎｅ ７７、１９８９、５１〜５９頁を参照のこと）。
【００５４】
以下のプライマー（５’→３’）（各々の長さが４４ヌクレオチドであり、Ｔｈｒ８８Ａｌａ変異を作製する上端鎖および下端鎖である）を、変異誘発のために用いた。アスタリスクは、変異（Ｔｈｒ→Ａｌａ）コドンを示す。
ＮＥＷ−６５８： ＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣ ３’（配列番号３４）
ＮＥＷ−６５９： ＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧ＊Ｇ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣ ３’（配列番号３５）
これらのオリゴは、スレオニンコドン（ＡＣＣ）を、アラニンに対するコドン（ＧＣＣ）に変化させる。変異誘発性のプライマーの設計において、所望の変異が制限部位変化を生じなかった場合、変異は隣接するコドンに導入されて、変異誘発の後の変異クローンの同定を容易にした。同一のオリゴはまた、ＢａｍＨ１部位を導入するための配列にサイレント変化をもたらし、グリシン６２コドンをＧＧＧからＧＧＡに変化させる。この新しい部位は、変異体クローンをスクリーニングする能力を与えた。
【００５５】
野生型Ｃｒｉｐｔｏ構築物およびＴ８８Ａ Ｃｒｉｐｔｏ構築物を、それぞれ図２および図５に概略的に示す。第１の変異体（ＣＲ（ｃＣ）Ｔ８８Ａ、配列番号１０）（ｐＳＧＳ９０１と命名した）を、テンプレートｐＳＧＳ１４０（これは、一過性トランスフェクトのためのｐＥＡＧ１１００ベクターにおいて、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基メチオニン１〜セリン１６９をコードするｃＤＮＡである）用いて生成した。第２の変異体（ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃ Ｔ８８Ａ、配列番号１５）（ｐＳＧＳ９０２と命名した）を、テンプレートｐＳＧＳ４２２（これは、ベクターｐＥＡＧ１１００において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（配列番号８）に融合した、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏ−１残基セリン７５〜リシン１１２に融合した、ヒトＶＣＡＭ−１シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡである）から生成した。第３の変異体（ＣＲ Ｔ８８Ａ、配列番号９）（ｐＳＧＳ９０３と命名した）は、テンプレートｐＳＧＳ１５１（これは、一過性トランスフェクトのためのｐＣＳ２ベクター（Ｒａｐｐら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：１３１１〜１３２３，１９９４；およびＴｕｒｎｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：１４３４〜１４４７，１９９４を参照のこと）において、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基１〜１８８をコードするｃＤＮＡである）を用いて生成される。
【００５６】
ＳＯＥ ＰＣＲには２つの段階がある。段階Ｉは、２つの生成物Ａ＋Ｂを生成するためのＰＣＲであった。生成物Ａ（ｃＤＮＡの５’端）を、５’配列の上端鎖オリゴ（ｐＳＧＳ９０１およびｐＳＧＳ９０３に対するＮＥＷ−５４７（配列番号２９）、ならびにｐＳＧＳ９０２に対するＮＥＷ−４２３（配列番号３２））、そして、下端鎖変異誘発性オリゴ（ＮＥＷ−６５９（配列番号３５））を用いることによって生成した。生成物Ｂ（ｃＤＮＡの３’端）を、上端鎖変異誘発性オリゴ（ＮＥＷ−６５８（配列番号３４））、ならびに、３’配列の下端鎖オリゴ（ｐＳＧＳ９０１に対するＮＥＷ−５８７（配列番号３０）、ｐＳＧＳ９０３に対するＮＥＷ−５８８（配列番号３１）、およびｐＳＧＳ９０２に対するＮＥＷ−６７０（配列番号３３））を用いることによって生成した。
【００５７】
ＳＯＥ ＰＣＲの段階ＩＩは、変異誘発されたｃＤＮＡの全体である生成物Ｃを生成することであった。この工程は、生成物Ａ＋Ｂ（オーバーラップ配列の４４ヌクレオチドを有する）、ならびに、上の工程Ｉで考察された５’上端鎖オリゴおよび３’下端鎖オリゴを用いた。
【００５８】
変異体ｐＳＧＳ９０１、ｐＳＧＳ９０２、およびｐＳＧＳ９０３の全てに対する生成物Ａおよび生成物Ｂのための段階Ｉを、以下のように行った。１００マイクロリットル（μｌ）の総体積で、５ナノグラム（ｎｇ）のテンプレートｃＤＮＡ、各３０ピコモル（ｐｍｏｌ）の５’オリゴおよび３’オリゴ、各２００ナノモル（ｎｍｏｌ）のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、１×クローン化Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの反応緩衝液（２ｍＭのＭｇＣｌ２）、ならびに、ホットスタート後に添加される２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号６００２５２）を用いて、ＰＣＲを行った。９４℃−１分の融解工程、５８℃−１分のアニーリング工程、７２℃−２分の伸長工程の３０サイクル、その後の７２℃−７分の伸長の１サイクルを必要とした。この手順の唯一の例外は、ＮＥＷ−４２３（配列番号３２）に対するアニーリング温度が５０℃であることだった。
【００５９】
変異体ｐＳＧＳ９０１、ｐＳＧＳ９０２、およびｐＳＧＳ９０３のための段階ＩＩを、以下のように行った。各１０μｌの生成物Ａ＋Ｂを、２００ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、各３０ｐｍｏｌの５’オリゴおよび３’オリゴ、Ｐｆｕ緩衝液、ならびに、ホットスタート後に添加される２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ酵素と混合した。段階ＩＩのＰＣＲ反応工程を、アニーリング温度を除いて、上記のように行った。ｐＳＧＳ９０１およびｐＳＧＳ９０３の生成物ＣのＰＣＲに対するアニーリング温度は６５℃であり、ｐＳＧＳ９０２の生成物ＣのＰＣＲに対するアニーリング温度は５５℃であった。この反応を、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ カタログ番号４００７７１）で行い、未使用オリゴから離して生成物を精製した。次いで、ｐＳＧＳ９０１およびｐＳＧＳ９０２に対するＰＣＲ生成物Ｃを、６０ユニットのＮｏｔ１制限酵素を用いて、３７℃で１６時間消化した。ｐＳＧＳ９０３に対するＰＣＲ生成物Ｃを、６０単位のＸｈｏ１制限酵素およびＨｉｎｄ１１１制限酵素を用いて、３７℃で１６時間消化した。この酵素を、フェノールおよびクロロホルムを一緒に用いて１回抽出し、クロロホルムを用いて１回抽出し、そしてＤＮＡを、キャリアとしてグリコーゲンを有する０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えたエタノールを用いて、沈殿させた。ＤＮＡペレットを、水を加えた７０％エタノールで洗浄し、そして１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）中に再懸濁させた。ここで、ｐＳＧＳ９０１構築物およびｐＳＧＳ９０２構築物について、Ｎｏｔ１で消化された生成物Ｃの挿入物（２０ｎｇ）と、Ｎｏｔ１で消化され、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたｐＥＡＧ１１００ベクター（５０ｎｇ）との間で、１０μｌの総体積で、１６℃で１６時間連結を行った。ｐＳＧＳ９０３に対する連結を、２０ｎｇの、Ｘｈｏ１／Ｈｉｎｄ１１１で消化された生成物ＣおよびＸｈｏ１／Ｈｉｎｄ１１１で消化されたｐＣＳ２＋ベクターを用いて行った。この反応物のうちの２μｌを、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中に形質転換し、そして、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）寒天板にプレートした。コロニーを摘出し、そして２ｍｌのＬＢブロスにおいて、３７℃で１６時間増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いて精製し、ＢａｍＨ１で１．５時間消化し、そしてアガロースゲル上で泳動させて、どのクローンがサイレンと変異を含むか、従って、どのクローンがスレオニン８８からアラニンへの変化を含むかを可視化した。クローン挿入物の配列（Ｃｒｉｐｔｏ配列およびＩｇ配列）を、ジデオキシＤＮＡ配列決定によって、点検および確認した。
【００６０】
（Ｃ．ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション）
ＤＮＡ配列決定によって、変異を確認した。正しい変異体クローンを確認した後、大規模な一過性トランスフェクションを行い、変異体Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を得た。このトランスフェクションは、スピナフラスコにおいて、懸濁培養物として増殖されたＣＨＯ細胞（ＣＤ−ＣＨＯ）を用いて行われた。培養物の１リットル毎に、２ｍｇのｃＤＮＡを、コレステロール溶液を加えたＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カチオン性脂質と、総体積２４０ｍｌの無血清培地（ＣＤ−ＣＨＯ培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、室温で１５分間混合した。次いで、２４０ｍｌの同一の培地中の１．５×１０９個のＣＨＯ細胞を、ＤＭＲＩＥ−Ｃを加えたＤＮＡに添加し、１リットルのスピナフラスコに移し、そして３７℃で４時間増殖させた。次いで、この細胞を、５２０ｍｌの培地で希釈し、３リットルのスピナフラスコに移し、そして２８℃で８日間増殖させた。細胞を除去するための遠心分離の後、馴化培地を、ＰＥＳ（Ｎａｌｇｅｎｅ）フィルターで濾過し、そして−７０℃で凍結した。
【００６１】
（実施例４：Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達活性の機能および調節について、Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストを試験する工程）
Ｃｒｉｐｔｏ活性の過剰発現は、間葉細胞特性、増殖の増加、および細胞移動（新生物形成において見られる細胞形質転換に関連する全ての表現型）を促進する、脱分化状態を導き得る（Ｓａｌｏｍｏｎら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２１：６１〜７０，１９９９；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２９１〜２９８，１９９４；およびＢａｌｄａｓｓａｒｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：５３８〜５４３，１９９６）。Ｃｒｉｐｔｏ活性をブロックするＣｒｉｐｔｏアンタゴニストは、癌に対して、治療的に有益であり得、そして潜在的な処置であり得る。
【００６２】
Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストの活性およびＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する能力を試験する１つの方法は、Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏノックアウト（ＫＯ）細胞株（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３〜１４２，２０００）を伴う。Ｃｒｉｐｔｏは、Ｘｅｎｏｐｕｓの胚におけるｓｍａｄ２リン酸化および転写因子ＦＡＳＴを刺激し、そして、転写因子ＦＡＳＴの活性は、ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター遺伝子に由来するルシフェラーゼ活性を測定することによってモニターされ得る（Ｓａｉｊｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：３５〜４７，２０００）。Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子が欠失しており、従って、ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｏ依存性シグナル伝達についてヌルである（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３〜１４２，２０００）。Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達は、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において、Ｃｒｉｐｔｏ、ＦＡＳＴおよびＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ遺伝子の構築物（図６）にトランスフェクトすることによって、評価され得る。Ｃｒｉｐｔｏ ｃＤＮＡおよびＦＡＳＴ ｃＤＮＡがこれらの細胞株にトランスフェクトされない限り、これらの細胞株において、Ｃｒｉｐｔｏ依存性ＦＡＳＴルシフェラーゼ活性は見られなかった（図６）。
【００６３】
野生型Ｃｒｉｐｔｏ構築物および変異体Ｃｒｉｐｔｏ構築物の活性は、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞へのトランスフェクションによって測定され得る。Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞（６．５×１０５個の細胞／ウェル）を、等量のＦＡＳＴ、ＦＡＳＴルシフェラーゼレポーターＤＮＡを用いて、ならびに、Ｃｒｉｐｔｏ全長野生型ＤＮＡの非存在下および存在下において、ならびに、Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ変異体全長ＤＮＡの非存在下および存在下において、トランスフェクトした。トランスフェクトされた総ＤＮＡは常に１．０μｇであり、必要な場合、コントロールベクターＤＮＡ（ｐＥＡＧ１００またはｐＣＳ２）を用いて、全量を１．０μｇに引き上げた（当業者にとって標準的な条件を用いて、リポフェクタミンでトランスフェクションを行った。リポフェクタミンは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓから購入した）。トランスフェクトの４８時間後、ＬｕｃＬｉｔｅ（ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）で細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を、発光カウンターにおいて測定した。本発明者らは、野生型Ｃｒｉｐｔｏ（配列番号１）がＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ（ＦＡＳＴ−ｌｕｃ）レポーター活性（図６、Ｃｒｉｐｔｏ ＷＴ＋ＦＡＳＴ＋ＦＡＳＴ−ｌｕｃレポーター、４列目）を刺激すること、および、この活性がＣｒｉｐｔｏおよびＦＡＳＴの両方の存在を必要とすることを示した（図６）。対照的に、Ｔｈｒ８８Ａｌａ Ｃｒｉｐｔｏ変異体（配列番号９、ｐＳＧＳ９０３）は、ＦＡＳＴ−ルシフェラーゼ活性を殆ど有さなかった（図６、Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ＋ＦＡＳＴ＋ＦＡＳＴ ｌｕｃレポーター、５列目）。
【００６４】
等量のＣＲ Ｔｈｒ８８Ａｌａ変異体ｃＤＮＡとＣＲ野生型ｃＤＮＡとを混合し、Ｆ９ ＫＯ細胞に同時にトランスフェクトする競合実験は、野生型ＣＲがＦＡＳＴルシフェラーゼ活性を刺激する能力が、単独の野生型ＣＲと比較した場合、ＣＲ Ｔ８８Ａ変異体の存在下において減少することを示し（図６、Ｃｒｉｐｔｏ ＷＴ＋Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ＋ＦＡＳＴ＋ＦＡＳＴ ｌｕｃレポーター、６列目）、Ｔｈｒ８８Ａｌａ変異体が、野生型Ｃｒｉｐｔｏの活性をアンタゴナイズするように作用することを示した。
【００６５】
（実施例５：抗癌剤としてのＣｒｉｐｔｏアンタゴニストをインビボで試験する工程）
Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストは、当業者によって用いられる通常のプロトコルに従って、マウスにおける潜在的な抗癌剤としてのインビボ活性についてスクリーニングされる。このようなプロトコルの例は、以下に列挙され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって、「ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」プロトコル（ＮＩＨ出版番号８４−２６３５（１９８４年２月））において概説されるものである。
【００６６】
（Ａ）６週齢のヌードマウスに、１００μｇの抗ＬＦＡ３コントロール抗体（１Ｅ６）、１００μｇのＣｒｉｐｔｏアンタゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１３）を腹腔内注射するか、または注射しない（コントロール）。次いで、この動物を、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を発現した癌細胞株（例：１×１０６ＧＥＯ結腸腺癌細胞）を皮下注射する。ＣｒｉｐｔｏアンタゴニストおよびコントロールＡｂで処理されたマウスを、１００μｇのタンパク質で毎週再処理する。腫瘍のサイズを毎週測定し、そして腫瘍球（ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅ）の体積を計算する。動物を、腫瘍が２．０ｃｍ３の体積（直径１６ｍｍ）に達したときに、屠殺し、そして全ての異常な観察を記録する。実験を、最適な治療的プロフィールを決定するために、Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストタンパク質の範囲で繰り返す。
【００６７】
（Ｂ）体重が約（１８ｇ）である、６週齢のヌードマウス（ｎ＝１０（実験用）およびｎ＝１０（コントロール））に、皮下腫瘍（腫瘍組織は、乳房、結腸、肺、頚部などの、ヒトの腫瘍に由来し得、腫瘍組織はＣｒｉｐｔｏを発現する）の２５ｍｇの断片を、０日目に移植する。腫瘍サンプル上での細菌培養を行い、汚染された場合はただちに廃棄する。処置初日（ステージング日）：重量１００ｍｇ以上、７００ｍｇ以下の腫瘍を有するマウスを選択する。個体の体重によって、無作為化および処置する。１〜５０ｍｇ／ｋｇの、広い用量範囲を試験する。Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストタンパク質、コントロール抗体、およびＰＢＳコントロール動物に、ステージング日にｉｐを注射し、そして全３回の注射を４日間にわたって毎日継続する。体重および腫瘍の測定を、処置初日（ステージング日）および選択された測定日に記録する。評価最終日は、最適な（最良な）腫瘍の重量を与える測定日である。ｔ／ｃ％を評価最終日に指定する。実験を終了し、そして評価する。
【００６８】
（等価物）
本発明は、本発明の精神または本質的な特性から逸脱しない、他の特定の形態において実施され得る。従って、前記の実施形態は、本明細書中に開示される本発明を限定せず、あらゆる点で、本発明の例示であると考えられる。従って、本発明の範囲は、前記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、その特許請求の範囲の等価性の意味内および範囲内で生じる全ての変化は、その特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【００６９】
（配列表）
配列番号１は、全長ヒトＣｒｉｐｔｏ−１（残基１〜１８８を含む）である（「ＣＲ」）。
【００７０】
【表１】
配列番号２は、全長ヒトＣｒｉｐｔｏ−３（残基１〜１８８を含む）である（「ＣＲ−３」）。
【００７１】
【表２】
配列番号３は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態（配列番号１の残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ（ｃＣ）」）。
【００７２】
【表３】
配列番号４は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態（配列番号１の残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ３８（ｃＣ）」）。
【００７３】
【表４】
配列番号５は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のフラグメント（配列番号１の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ（７５−１１２）」）。
【００７４】
【表５】
配列番号６は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態（配列番号１の残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ」）。
【００７５】
【表６】
配列番号７は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態（配列番号１の残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ３８（ｃＣ）−Ｆｃ」）。
【００７６】
【表７】
配列番号８は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のフラグメント（配列番号１の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃ」）。
【００７７】
【表８】
配列番号９は、配列番号１の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、全長ヒトＣｒｉｐｔｏ−１（残基１〜１８８を含む）である（「ＣＲＴ８８Ａ」）。
【００７８】
【表９】
配列番号１０は、配列番号３の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態（残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ（ｃＣ）Ｔ８８Ａ」）。
【００７９】
【表１０】
配列番号１１は、配列番号４の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態（残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ３８（ｃＣ）Ｔ８８Ａ」）。
【００８０】
【表１１】
配列番号１２は、配列番号５の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１のフラグメント（配列番号１の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ（７５−１１２）Ｔ８８Ａ」）。
【００８１】
【表１２】
配列番号１３は、配列番号６の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されたヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態である（「ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ Ｔ８８Ａ」）。
【００８２】
【表１３】
配列番号１４は、配列番号７の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されたヒトＣｒｉｐｔｏ−１のＣ末端短縮形態である（「ＣＲ３８（ｃＣ）−Ｆｃ Ｔ８８Ａ」）。
【００８３】
【表１４】
配列番号１５は、配列番号８の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されたヒトＣｒｉｐｔｏ−１のフラグメント（配列番号１の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ（７５−１１２）−ＦｃＴ８８Ａ」）。
【００８４】
【表１５】
配列番号１６は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３（ｃＣ）」）。
【００８５】
【表１６】
配列番号１７は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３３８（ｃＣ）」）。
【００８６】
【表１７】
配列番号１８は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のフラグメント（配列番号２の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ−３（７５−１１２）」）。
【００８７】
【表１８】
配列番号１９は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３（ｃＣ）−Ｆｃ」）。
【００８８】
【表１９】
配列番号２０は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３３８（ｃＣ）−Ｆｃ」）。
【００８９】
【表２０】
配列番号２１は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のフラグメント（配列番号２の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ−３（７５−１１２）−Ｆｃ」）。
【００９０】
【表２１】
配列番号２２は、配列番号２の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、全長ヒトＣｒｉｐｔｏ−３（残基１〜１８８を含む）である（「ＣＲ−３Ｔ８８Ａ」）。
【００９１】
【表２２】
配列番号２３は、配列番号１６の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３（ｃＣ）Ｔ８８Ａ」）。
【００９２】
【表２３】
配列番号２４は、配列番号１７の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３３８（ｃＣ）Ｔ８８Ａ」）。
【００９３】
【表２４】
配列番号２５は、配列番号１８の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＣｒｉｐｔｏ−３のフラグメント（配列番号２の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ−３（７５−１１２）Ｔ８８Ａ」）。
【００９４】
【表２５】
配列番号２６は、配列番号１９の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されたヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３１〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３（ｃＣ）−Ｆｃ Ｔ８８Ａ」）。
【００９５】
【表２６】
配列番号２７は、配列番号２０の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されたヒトＣｒｉｐｔｏ−３のＣ末端短縮形態（配列番号２の残基３８〜１６９を含む）である（「ＣＲ−３３８（ｃＣ）−Ｆｃ Ｔ８８Ａ」）。
【００９６】
【表２７】
配列番号２８は、配列番号２１の残基スレオニン８８がアラニン残基で置換された、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと融合されたヒトＣｒｉｐｔｏ−３のフラグメント（配列番号２の残基７５〜１１２を含む）である（「ＣＲ−３（７５−１１２）−ＦｃＴ８８Ａ」）。
【００９７】
【表２８】
（ＰＣＲオリゴ（５’→３’）：Ｃｒｉｐｔｏ構築物を作製するのに使用したオリゴヌクレオチドプライマー）
【００９８】
【表２９】
（配列番号３６（ＣＲ−１コード領域の核酸配列）は、ｎｔ１３（ＡＴＧ）＝ＭＥＴコドンで開始し、（ＴＡＡ）＝終止コドンで終了する）
【００９９】
【表３０】
（配列番号３７（ＣＲ−３コード領域の核酸配列）は、ｎｔ１（ＡＴＧ）＝ＭＥＴコドンで開始し；ｎｔ５６７（ＴＡＡ）＝終止コドンで終了する）
【０１００】
【表３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１タンパク質およびヒトＣｒｉｐｔｏ−３タンパク質（それぞれ、配列番号１および２）の並列である。Ｃｒｉｐｔｏ−１およびＣｒｉｐｔｏ−３のスレオニン８８を太字で示す。Ｃｒｉｐｔｏ−１のシグナル配列（配列番号１の残基１〜３０を含む）を下線で示す。
【図２】
図２は、記載されるＣｒｉｐｔｏ発現構築物の略図である。実施例３に記載されるように、構築物を作製した。
【図３】
図３は、Ｎ−脱グリコシル化ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃタンパク質の、エレクトロスプレー質量分析である。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中のＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ糖タンパク質を、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で、室温で６時間還元し、次いで、１ｍｇのＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ当たり１５０ミリユニットのＰＮＧａｓｅ Ｆで、３７℃で１６時間処理した。このＮ−脱グリコシル化生成物を、三連四重極装置（Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）上で、ＥＳＩ−ＭＳ分析によって分析した。
【図４】
図４は、ＣＲＩＰＴＯタンパク質のペプチドマッピングおよび質量分析の略図である。Ｎ−脱グリコシル化ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃを、実施例２に記載されるように、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ，ＣＮＢｒ、およびカルボキシペプチダーゼＹを各々用いて消化した。この消化から得られたＣｒｉｐｔｏポリペプチドを、ｒｐ−ＨＰＬＣによって分離し、そして質量分析によって分析した。
【図５】
図５は、記載される変異体Ｃｒｉｐｔｏ発現構築物の略図である。実施例３に記載されるように、構築物を作製した。
【図６】
図６は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達アッセイである。ヒトＣｒｉｐｔｏ−１（配列番号１）およびヒトＣｒｉｐｔｏ−１ Ｔ８８Ａ（配列番号５）の生理活性を、実施例４に記載されるようなＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトされたＦ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において評価した。Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞（６．５×１０５細胞／ウェル）を、等量のＦＡＳＴ、ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーターＤＮＡを用いて、そして、Ｃｒｉｐｔｏ全長野生型ＤＮＡの非存在下または存在下において、Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ変異体全長ＤＮＡの非存在下または存在下において、トランスフェクトし、そして、等量の野生型ＣＲ ｃＤＮＡおよびＣＲ Ｔ８８Ａ ｃＤＮＡを用いて、ブロッキング活性を評価した。トランスフェクトの４８時間後、ＬｕｃＬｉｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）で細胞を溶解し、そして、発光カウンターにおいて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（発明の分野）
本発明は、一般に、ＣＲＩＰＴＯ変異体およびその使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＣＲＩＰＴＯ−１（ＣＲ−１、ヒト；Ｃｒ−１、マウス）（これはまた、奇形癌由来増殖因子−１（米国特許第５，７９２，６１６号；同第５，２５６，６４３号；同５，６５４，１４０号）として公知である）、およびＣＲＩＰＴＯ−３（ＣＲ−３、ヒト；Ｃｒ−３、マウス）（米国特許第５，２６４，５５７号；同第５，６２０，８６６号；同第５，６５０，２８５号）（これらは、本明細書中においてＣＲＩＰＴＯと総称される）は、ＥＧＦ関連タンパク質である。これらの遺伝子は、発達中の胚、正常な成体の組織、および腫瘍細胞（乳癌細胞および結腸癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない）において発現される。
【０００３】
本発明の発見は、図１に示されるような、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸残基スレオニン−８８で、哺乳類細胞において発現されたＣＲＩＰＴＯが、Ｏ結合型フコース（Ｏ結合型グリコシル化の異常形態）によって修飾されることである。タンパク質にフコース修飾を付与する酵素は、７つのアミノ酸立体配置（「フコシル化部位」）を認識する。本発明の発見は、特にＮ−１位（すなわち、図１に示されるＣＲＩＰＴＯポリペプチド由来のグリシン残基８６）およびＮ−２位（図１に示されるＣＲＩＰＴＯポリペプチド由来のグリシン残基８７）における２つの残基が、スレオニン−８８のフコシル化が発生するために必要とされることである。さらに、本発明の発見は、ＣＲＩＰＴＯの非フコシル化形態（これは、機能性アンタゴニストとして作用する）が抗腫瘍活性を有することである。機能性アンタゴニストとして作用し得るＣＲＩＰＴＯの非フコシル化形態として、ＣＲＩＰＴＯの、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとの結合を変化させる変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。任意の可溶性ＥＧＦリガンド（すなわち、上皮増殖因子、トランスホーミング増殖因子α、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ））における、Ｏ結合型フコース修飾についての根拠はない。
【０００４】
診断的展望または治療的展望から、所望の抗発癌性特性を有するＣＲＩＰＴＯ変異体の開発について、考慮すべき興味が存在する。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、ＣＲＩＰＴＯ変異体（これらのＣＲＩＰＴＯ改変体およびフラグメントを含む）、好ましくは、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのフコシル化部位に少なくとも１つのアミノ酸置換を有するＣＲＩＰＴＯ変異体に関し、ここで、このアミノ酸は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸で置換される。
【０００６】
１つの実施形態において、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはその機能性フラグメントに由来する、少なくとも１つのアミノ酸残基は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる、別のアミノ酸で置換され、ここで、このアミノ酸置換は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列の、アミノ酸残基８６、８７、および８８からなる群より選択される。
【０００７】
１つの実施形態において、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドは、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドまたはそれらの機能性フラグメント；関連するシグナルペプチドを欠く、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチド、またはそれらの機能性フラグメント；あるいは、配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］で示されるポリペプチドのドメインまたはそれらの機能性フラグメント、からなる群より選択される。好ましい実施形態において、この１つ以上の置換は、アラニンまたはグリシンからなる群より選択されるアミノ酸である。
【０００８】
別の実施形態において、ＣＲＩＰＴＯ変異体は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドの８８位での脱フコシル化修飾を含む。このＣＲＩＰＴＯポリペプチドは、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）で示されるポリペプチドまたはそれらの機能性フラグメント；関連するシグナルペプチドを欠く、配列番号１（全長ＣＲ−１）もしくは配列番号２（全長ＣＲ−３）で示されるポリペプチドまたはそれらの機能性フラグメント；あるいは、配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］で示されるポリペプチドのドメインまたはそれらの機能性フラグメント、からなる群より選択される。
【０００９】
上記のＣＲＩＰＴＯ変異体およびそれらの機能性フラグメントをコードする、核酸配列もまた提供される。１つの実施形態において、本発明は、ハイブリダイゼーションプローブ（配列番号３６（ＣＲ−１）または配列番号３７（ＣＲ−３）のコード配列、あるいは、配列番号３６（ＣＲ−１）または配列番号３７（ＣＲ−３）のコード配列の相補体からなるプローブのヌクレオチド配列）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列をコードし、そして少なくとも１つのアミノ置換をさらに含む。ここでこのアミノ酸置換は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、８７、および８８からなる群より選択される。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、上記のＣＲＩＰＴＯ変異体に従う変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドおよびそれらの機能性フラグメントを含み、そして、異種ポリペプチドをさらに含む、キメラ分子を提供する。１つの実施形態において、この異種ポリペプチドは、変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのＣ末端に融合される。代替の実施形態において、この異種ポリペプチドは、変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのＮ末端に融合される。この異種ポリペプチドとして、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ポリメラーゼ活性化ドメイン、ヒスチジンタグ、ＨＳＡタグ、エピトープタグ配列および免疫グロブリンのＦｃ領域が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、上記のＣＲＩＰＴＯ変異体に従う変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドを含み、そして、合成ポリマーをさらに含む、キメラ分子を提供する。合成ポリマーの非限定的な例として、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）が挙げられる。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、有効量の上記の修飾ポリペプチドに腫瘍細胞を曝露する工程を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、この腫瘍細胞は、インビボで曝露される。別の特定の実施形態において、この腫瘍細胞は、インビトロで曝露される。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、有効量の上記ポリペプチドを被験体に投与する工程を含む、所望されない細胞増殖に関連する疾患の進行、重症度または影響を処置するかまたは減少させる方法を提供する。特定の実施形態において、この疾患または状態は、所望されない細胞増殖に関連する。第２の特定の実施形態において、所望されない細胞増殖に関連するこの疾患または状態は、癌である。第３の特定の実施形態において、この癌は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、黒色腫または白血病からなる群より選択される。
【００１４】
上記の、ならびに上記以外の、本発明の目的、特徴、局面および利点、ならびに本発明自体は、以下の、好ましい実施形態の説明からより完全に理解される。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明の発見は、哺乳類細胞において発現されるヒトＣＲＩＰＴＯがフコース基により「フコシル化部位」で修飾されること、および、この修飾が生理活性のために重要であることである。フコシル化部位内に修飾を伴うＣＲＩＰＴＯポリペプチドは、ＣＲＩＰＴＯ機能をブロックし得、従って、これらのＣＲＩＰＴＯ改変体が機能性変異体として役立つことを可能にする。
【００１６】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１−全長ＣＲＩＰＴＯ−１（ＣＲ−１）−アミノ酸残基１〜１８８
配列番号２−全長ＣＲＩＰＴＯ−３（ＣＲ−３）−アミノ酸残基１〜１８８
配列番号３−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１
配列番号４−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１
配列番号５−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１
配列番号６−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ
配列番号７−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ
配列番号８−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１−Ｆｃ
配列番号９−全長ＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１０−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１１−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１２−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１＋Ｔ８８Ａ
配列番号１３−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号１４−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−１−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号１５−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−１−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号１６−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３
配列番号１７−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３
配列番号１８−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３
配列番号１９−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ
配列番号２０−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ
配列番号２１−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３−Ｆｃ
配列番号２２−全長ＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２３−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２４−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２５−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３＋Ｔ８８Ａ
配列番号２６−アミノ酸残基３１〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号２７−アミノ酸残基３８〜１６９のＣＲ−３−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号２８−アミノ酸残基７５〜１１２のＣＲ−３−Ｆｃ＋Ｔ８８Ａ
配列番号２９−プライマー ＮＥＷ−５４７
配列番号３０−プライマー ＮＥＷ−５８７
配列番号３１−プライマー ＮＥＷ−５８８
配列番号３２−プライマー ＮＥＷ−４２３
配列番号３３−プライマー ＮＥＷ−６７０
配列番号３４−プライマー ＮＥＷ−６５８
配列番号３５−プライマー ＮＥＷ−６５９
配列番号３６−ＣＲ−１をコードする核酸配列
配列番号３７−ＣＲ−３をコードする核酸配列
（選択された定義）
本明細書中で用いられる用語（「ＤＮＡ」、「遺伝子」、「ポリペプチド」、「アミノ酸」などを含む）は、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡまたは遺伝子工学、および免疫学の分野における、技術的に認識されているそれらの意味で用いられる。このような意味は、広範に入手可能な以下の文献の１つ以上の参照によって決定される：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ編），１９８４；米国特許第４，６８３，１９５号、発明者Ｍｕｌｌｉｓら；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、１９８７発行；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９８９発行；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（特に第１５４巻および第１５５巻）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編）、１９８６；ならびに、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８６。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、「ＣＲＩＰＴＯポリペプチド」は、天然に存在する任意のＣＲＩＰＴＯタンパク質またはＣＲＩＰＴＯポリペプチドであり、これらとして例えば、配列番号１に示されるようなＣＲＩＰＴＯ−１または配列番号２に示されるようなＣＲＩＰＴＯ−３、あるいはそれらのフラグメントまたは改変体が挙げられる。改変体は、アミノ酸配列において、または、配列と関係ない様式で、あるいはその両方において、天然に存在するＣＲＩＰＴＯポリペプチドと異なり得る。アミノ酸配列における改変体は、天然に存在するＣＲＩＰＴＯポリペプチドにおける１つ以上のアミノ酸が異なる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体または非天然アミノ酸で置換される場合に、作製される。特に好ましい置換改変体として、１つ以上の保存的なアミノ酸置換によって、野生型配列と異なる、天然に存在するＣＲＩＰＴＯポリペプチド、またはそれらの、生物学的に活性な固有のフラグメントが挙げられる（このアミノ酸置換は代表的に、このタンパク質またはペプチドの２次構造および疎水的性質に対して最小の影響しか有さない）。保存的な置換として、代表的に、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換（例えば、以下の群内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン）が挙げられる。他の保存的な置換は、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｄａｙｈｏｆｆら編），１９７８において定義されるような、「一般に認められる点変異」についての基準を満たす置換である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４４４６０もまた参照のこと。改変体は、天然に存在するか、あるいは合成技術または分子操作技術を通じて産生され得る。当業者は、操作されたＣＲＩＰＴＯ改変体が、（例えば、精製の容易化、安定性の改善、生物学的機能の調節などにおける）有利な性質を提供し得ることを、理解および認識する。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、「ＣＲＩＰＴＯ変異体」は、ＣＰＩＰＴＯポリペプチドからの少なくとも１つのアミノ酸が別のアミノ酸（これは、ＣＲＩＰＴＯポリペプチド中に存在するアミノ酸と異なり、かつＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックまたは阻害し得る）で置換された、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはＣＲＩＰＴＯ改変体である。１つの実施形態において、このアミノ酸置換として、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはＣＲＩＰＴＯタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、８７または８８が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＲＩＰＴＯ変異体結合は、ＣＲＩＰＴＯとＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとの連結によって他の様式では誘発される細胞応答を、ブロックまたは阻害する。好ましい実施形態において、ＣＲＩＰＴＯ変異体は、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯ結合を、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％、阻害またはブロックし得る。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドの「機能性フラグメント」は、全長ポリペプチドより短いポリペプチドフラグメントであり、そして、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックまたは阻害する能力を有する。好ましい実施形態において、この機能性フラグメントは、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合を、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％、阻害またはブロックし得る。変異体ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのフラグメントが機能性であるか否かを証明する方法は、当該分野において公知である。例えば、目的のフラグメントは、組換え方法、合成方法、またはタンパク質分解消化方法のいずれかによって作製され得る。次いで、このようなフラグメントは単離され得、そして、競合的ブロック実験を含む、当業者に公知の方法による手順によって、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックまたは阻害する能力について試験され得る。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、「腫瘍細胞の増殖を阻害する」とは、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）（これは、胸部、腹部、骨盤および頭部における罹病部位をモニターするために、代表的に用いられる）；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）（これは、腹部、骨盤、脳、脊椎および他の骨における罹病部位をモニターするために、代表的に用いられる）；乳房Ｘ線撮影（これは、乳房における罹病部位をモニターするために代表的に用いられる）を含む、放射線学的画像法技術によって腫瘍をモニターする工程を含む当業者に公知の技術によって測定される場合、腫瘍細胞の成長または増殖を、約２０％、あるいは約３０％、約４０％または好ましくは約５０％、阻害またはブロックし得る、分子を意味する。当業者に公知の腫瘍マーカーの例として、結腸直腸癌の患者を疾患の進行についてモニターするため、ならびに、診断またはより後の疾患過程で、癌胎児抗原（ＣＥＡ）レベルの実証された増大を伴う、例えば胃腸腫瘍または乳房腫瘍の患者をモニターするためにしばしば用いられる、癌胎児抗原（ＣＥＡ）；膵臓癌の患者をモニターするためにもっとも一般的に用いられるが結腸直腸癌においても増大する、ＣＡ１９−９；乳癌の患者においてしばしば増大する、ＣＡ１５−３およびＣＡ２７．２９（ＣＡは癌抗原を意味する）が挙げられる。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、「異種」は、比較される実体の残りと異なる実体に由来することを意味する。異種の例は、遺伝子操作技術によって、異なる種由来のプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。ＤＮＡ結合ドメイン、ヒスチジンタグ；エピトープタグ配列。
【００２２】
本明細書中で用いられる場合、「Ｆｃ領域」とは、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域およびヒンジ領域を含むが抗原結合部位を欠く、抗体の部分をいう。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「フコシル化部位」は、特定のアミノ酸残基に対するフコース基に特徴的な１４６ダルトンの質量付加の同定によって、質量分析を用いて実験的に定義され得る、アミノ酸配列である。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドが以下の性質のうちの少なくとも１つを有する場合、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドは「活性」を有する：（ｉ）ｓｍａｄ２のリン酸化を誘導する；（ｉｉ）ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター構築物の誘導によって測定される、ＦＡＳＴ依存活性を調節する；（ｉｉｉ）ボイデンチャンバー遊走アッセイにおける、乳腺細胞株の移動を刺激する；（ｉｖ）コラーゲンゲルにおける、乳房上皮細胞の分枝を刺激する（Ｅｂｅｒｔら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５：２２３〜２２９，２０００を参照のこと）。ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックする変異体ＣＲＩＰＴＯは、野生型ＣＲＩＰＴＯと比較して、これらの活性のレベルの減少を示す。例えば、本明細書中に定義されるＣＲＩＰＴＯ変異体は、コントロールと比較した場合、２０％、好ましくは３０％、そしてより好ましくは５０％少ないＳＭＡＤ２のリン酸化を生じる。あるいは、ＣＲＩＰＴＯ結合パートナーとのＣＲＩＰＴＯの結合をブロックする変異体ＣＲＩＰＴＯは、ＦＡＳＴ調節エレメント（すなわち、ルシフェラーゼレポーター）の阻害によって測定されるＦＡＳＴ依存活性を、コントロールと比較した場合、２０％、好ましくは３０％、さらに好ましくは５０％、調節する。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、「脱フコシル化改変」とは、フコース基の化学的または酵素的な除去を意味する。例えば、本明細書中で用いられる場合の本発明のＣＲＩＰＴＯポリペプチド上のＴｈｒ８８におけるフコースは、フコシダーゼによって酵素学的に除去され得るか、あるいは、本発明のＣＲＩＰＴＯポリペプチド上のＴｈｒ８８におけるフコースは、酸処理によって化学的に除去され得る。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、核酸サンプルへのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、代表的に、「ストリンジェントな条件」下で行われる。核酸二重鎖または核酸ハイブリッドの安定性は、融解温度またはＴｍ（これは、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である）として表される。この融解温度は、必要なストリンジェンシー条件を定義するために用いられる。関連があり、かつ（同一ではないが）実質的に同一な配列が同定される場合、特定の塩（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）濃度で、相同的なハイブリダイゼーションのみが発生する最低温度を最初に確立することは、有用である。次いで、１％の不一致がＴｍの１℃の低下を生じると仮定すると、それに応じて、ハイブリダイゼーション反応における最終的な洗浄の温度は減少する（例えば、プローブと、９５％を超える同一性を有する配列が探索される場合、最終的な洗浄の温度は５℃低下する）。実際には、Ｔｍの変化は、１％の不一致当たり０．５℃〜１．５℃であり得る。ストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中で６８℃でハイブリダイゼーションする工程、および、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で室温で洗浄する工程を含む。「中程度にストリンジェントな条件」は、３×ＳＳＣ中で４２℃で洗浄する工程を含む。塩濃度パラメーターおよび温度パラメーターは、プローブと標的核酸との間の最適なレベルの同一性を達成するために変動し得る。このような条件に関するさらなる手引きは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）；およびＡｕｓｕｂｅｌら（上記）によって、当該分野において容易に利用可能である。
【００２７】
（本発明の化合物の治療的な使用）
本発明は、本発明の薬学的組成物の投与による、種々の疾患および障害の処置または防止を提供する。
【００２８】
特定の実施形態において、本発明の薬学的な組成物は、被験体における所望されない細胞増殖を処置または防止するために用いられる。興味深い実施形態において、本発明の薬学的な組成物は、腫瘍（これらは、増殖についてＣＲＩＰＴＯタンパク質に依存する）の増殖を阻害またはブロックするために、治療的に用いられ得る。特定の局面において、所望されない細胞増殖に関連する疾患または状態は、癌である。好ましい実施形態において、この癌は、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、黒色腫または白血病からなる非限定的な群より選択される。
【００２９】
（薬学的組成物）
本発明は、有効量の本発明の薬学的組成物の、被験体への投与による、処置方法を提供する。好ましい局面において、この薬学的組成物は、十分に精製されている。本明細書中で用いられる場合、用語「被験体」は、本発明の薬学的組成物が投与され得る任意の哺乳動物を意味するために採用される。本発明の方法を用いる処置に特に意図される被験体として、ヒト、ならびに非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラットおよびマウスが挙げられる。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、好ましくは、ヒトにおける使用の前に、所望の結果についてインビトロで試験され、次いで、インビボで試験される。種々の特定の実施形態において、例えば、実施例４に記載されるように、被験体の障害に関与する細胞型の代表的な細胞（例えば、乳癌細胞）を用いて、ＣＲＩＰＴＯ変異体がこのような細胞型に対して所望の影響を有するか否かを決定するために、インビトロアッセイが行われ得る。
【００３１】
一般に、本発明の化合物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤中で、懸濁、溶解、または分散される。得られた薬学的組成物は、被験体のホメオスタシス（特に、電解質バランス）に不利に影響しない。従って、例示的なキャリアは、通常の生理食塩水（０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０〜７．４）を含む。他の受容可能なキャリアは当該分野において周知であり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０に記載される。受容可能なキャリアとしては、生体適合性であるか、不活性であるか、または生体吸収性である塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、増粘剤、保存剤などが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、用語「キャリア」は、リポソームおよびＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質（Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７：１６８〜１７５，１９９５を参照のこと）ならびに任意のプラスミド発現ベクターおよびウイルス発現ベクターを包含する。
【００３２】
本発明の任意のＣＲＩＰＴＯ変異体は、薬学的に受容可能な塩の形態で用いられ得る。本発明のポリペプチド、核酸およびベクターと塩を形成し得る、適切な酸および塩基としては、当業者に周知であり、そして無機および有機の、酸および塩基が挙げられる。
【００３３】
本発明のＣＲＩＰＴＯ変異体は、キャリアにおいて、治療的に有効な量（これは検出可能な（好ましくは、医学的に有益な）効果を被験体において生じるために十分な量である）の化合物を被験体に送達するために十分な濃度にまで分散される。医学的に有益な効果として、被験体の医学的状態の悪化の防止、遅延または減弱、あるいは、被験体の医学的状態を検出可能に改善することが挙げられる。医学的に有益な効果を生じるＣＲＩＰＴＯ変異体の濃度または量は、本発明が実施される状況に伴ってかなり変動することが予測される。有効量は、通常の技術を有する医師または開業医によって、慣用的な実験法のみを介して決定され得る。例えば、所望でない細胞の増殖の状態の指標は、例えば、上記のＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１５−３、ＣＡ２７．２９またはＣＡ１５−３のレベルを測定する、１つ以上の慣用的な実験室での試験を用いてモニターされ得る。これらの試験によって測定されたパラメーターは、疾患の進行または退行を評価するために、医師によって用いられ得る。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＰＴＯ変異体は、リポソーム送達システムにおいて処方され、これらとして、任意の種々の単層ベシクル、複層ベシクル、または安定な多層ベシクルが挙げられるがこれらに限定されず、これらは全て、当業者に周知の方法に従って（例えば、米国特許第５，１６９，６３７号、同第４，７６２，９１５号、同第５，０００，９５８号または同第５，１８５，１５４号の教示に従って）、調製および投与され得る。さらに、リポソームへの本発明の新規なポリペプチド、ならびに選択された他のポリペプチドの結合を増強するために、リポタンパク質としてこれらのポリペプチドを発現することが、所望であり得る。例えば、所望されない細胞増殖に関連する疾患または状態の、リポソーム被包性ＣＲＩＰＴＯ変異体を用いる処置は、リポソームを用いるこのような治療を必要とする患者にＣＲＩＰＴＯ変異体を導入する工程によって、インビボで行われ得る。このリポソームは、カテーテルを介して、被験体の動脈に送達され得る。被胞性タンパク質は、所望されない細胞増殖の阻害への任意の影響について、インビトロで試験され得る。
【００３５】
（投与経路）
本発明の化合物は、医学的に受容可能な任意の様式において投与され得る。特定の状況に依存して、局所投与または全身投与が所望であり得る。好ましくは、この化合物は、非経口経路を介して（例えば、脈管内、静脈内、動脈内、皮下、筋内、腫瘍内、眼窩内、心室内、腹腔内、被膜下、頭蓋内、脊椎内、あるいは鼻腔内の、注射、注入または吸入によって）投与される。この化合物はまた、被験体への、注入ポンプ、または、生体適合性もしくは生体侵食性（ｂｉｏｅｒｏｄａｂｌｅ）の徐放性インプラントの移植、あるいは、（例えば、腎動脈における）カテーテルの導入によって、投与され得る。あるいは、本発明の特定の化合物、またはそれらの処方物は、経口投与または経腸投与のために適切であり得る。本発明のさらに他の化合物は、局所投与のために適切である。
【００３６】
（処置レジメン）
個体に投与される、任意の特定のＣＲＩＰＴＯ変異体を用いる処置の、適切な投薬量および頻度の決定は、通常の開業医の技術および臨床的判断に入る。一般的な投薬量および処置日程は、前臨床試験および臨床試験（これらは、化合物の最適な投与パラメーターを決定するための、広範であるが慣用的な研究を含む）によって確立される。このような勧告がなされた後でさえ、開業医はしばしば、種々の考慮（例えば、個体の年齢、医学的状況、体重、性別、および他の医薬品との同時発生的な処置）に基づいて、異なる個体に対してこれらの投薬量を変動させる。各ＣＲＩＰＴＯ変異体に対する最適な投薬量および投与レジメンを決定することは、製薬および医学の分野の当業者にとって慣用的な問題である。
【００３７】
（実施例）
（実施例１：組換えＣｒｉｐｔｏの産生）
（Ａ．ＣＨＯ細胞におけるヒトＣｒｉｐｔｏｃＣ−Ｆｃの発現および精製）
ｐＳＧＳ４８０と命名した発現プラスミドを、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ；配列番号６）に融合した、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基メチオニン１〜セリン１６９をコードするｃＤＮＡをサブクローン化することによって、ベクターｐＥＡＧ１１００（構築物を、図２に概略的に示す）内に構築した。このベクターｐＥＡＧ１１００は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ プラスミド ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−ｂｅｔａｇａｌ（ＣＨＯ一過性トランスフェクションにおけるこの使用は、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｉら、１９９９、Ｆｏｃｕｓ ２１：１６に記載された）の誘導体である。このベクターを、プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−Ｂｅｔａｇａｌ（カタログ番号１０５８６−０１４）からレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼのＮｏｔＩフラグメントを除去することによって、以下のように産生した：このプラスミドをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、４．３８ｋｂのＮｏｔＩベクター骨格フラグメントをゲル精製し、そして連結した。連結したＤＮＡを、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａｌｐｈａに形質転換した。ｐＥＡＧ１１００を、単離された単一のコロニーから所望の組換え体を含むプラスミドとして単離した。プロモーター、ポリリンカーおよび転写終結シグナルにわたるｐＥＡＧ１１００の配列を確認した。
【００３８】
プラスミドｐＳＧ４８０を、ＣＨＯ細胞内に一時的にトランスフェクトし、そしてこの細胞を、２８℃で７日間増殖させた。これらの細胞および馴化培地におけるＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃタンパク質の存在を、ウエスタンブロット分析によって試験した。ウエスタンブロット分析のために、Ｃｒｉｐｔｏトランスフェクト細胞由来の馴化培地および細胞を、還元条件下において、４〜２０％勾配のゲル上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースに電気泳動的に転写し、そしてＣｒｉｐｔｏを、Ｃｒｉｐｔｏ １７マーペプチド（配列番号１の残基９７〜１１３を含む）−キーホールリンペットヘモシアニン結合に対して惹起したウサギポリクローナル抗血清で検出した。遠心分離してこの細胞を除去した後、ウエスタンブロット分析は、ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃタンパク質が馴化培地（上清）へと効率的に分泌されることを示した。この上清を、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にアプライし、そして結合タンパク質を、２５ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出した。溶出されたタンパク質を、０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）で中和し、そして２４０〜３４０ｎｍでの吸光度測定からタンパク質の総量について、および、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について、分析した。溶出されたタンパク質を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、そして−７０℃で貯蔵した。
【００３９】
Ｎ末端配列決定を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＰＥ−ＡＢＤ）Ｐｒｏｃｉｓｅ ＨＴ配列決定装置（パルス液体モードで作動させた）上で実行した。得られたＰＴＨアミノ酸を、ＰＴＨ Ｃ１８ ２．１×２５０ｍｍのカラムを備えるＰＥ ＡＢＤ １４０Ｃ Ｍｉｃｒｏｇｒａｄｉｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍを用いて分離し、ＰＥ ＡＢＤ ７８５Ａ（プログラム可能な吸光度検出器）を用いて、オンラインで分析した。ＡＢＩ ６１０Ａデータ分析ソフトウェアを用いて、データを分析した。配列決定は、単一のＮ末端：Ｌ３１ＧＨＱＥＦＡＲを同定した。
【００４０】
（Ｂ．ＣＨＯ細胞におけるヒトＣｒｉｐｔｏ（７５−１１２）−Ｆｃの発現および精製）
ｐＳＧＳ４２２と命名した発現プラスミドを、本質的にはＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ（図２）について上に記載したように、ベクターｐＥＡＧ１１００におけるヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃ、配列番号８）に融合した、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏ−１残基７５〜１１２に融合した、ヒトＶＣＡＭ−１シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡをサブクローン化することによって構築した。プラスミドｐＳＧＳ４２２を、ＣＨＯ細胞内に一時的にトランスフェクトした。ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃタンパク質は上清中に効率的に分泌された。そして、ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃタンパク質を、ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃについて上に記載したように、プロテインＡのクロマトグラフィーによって、馴化培地から精製した。
【００４１】
（実施例２：ＣｒｉｐｔｏでのＯ結合型グリコシル化の特徴付け）
精製された組換えｈｕ ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃおよび組換えｈｕ ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃを、Ｎ−脱グリコシル化の前および後の質量分析によって特徴付けた。酵素または臭化シアンでの処置によるペプチドマッピングによって、逆相（ｒｐ）−ＨＰＬＣによって分離され、そしてＭＡＬＤＩおよびエレクトロスプレー（ＥＳＩ）質量分析によって特徴付けられるフラグメントを得た。ペプチドマッピング、質量分析法およびグリコシダーゼ処理による生化学的特徴づけにより、Ａｓｎ−７９を、約９０％の占有率を有するＮ結合型グリコシル化部位として、そして、Ｓｅｒ−４０およびＳｅｒ−１６１を、それぞれ約８０％および約４０％の占有率を有するＯ結合型グリコシル化部位として、同定した。さらに、以下に詳述するように、単一のＯ結合型フコースを用いて、Ｔｈｒ８８位でＣｒｉｐｔｏを修飾した。
【００４２】
（Ａ．ＣｒｉｐｔｏのＰＮＧａｓｅ処理）
ＰＮＧａｓｅ Ｆを、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．６）、５ｍＭのＥＤＴＡ中のＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ糖タンパク質を、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で、室温で６時間還元し、次いで、１ｍｇのＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃあたり１５０ミリ単位のＰＮＧａｓｅ Ｆで、３７℃で１６時間処理した。Ｎ−脱グリコシル化された生成物を、三連四重極装置（Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）上で、ＥＳＩ−ＭＳ分析によって分析した。
【００４３】
Ｎ−脱グリコシル化および還元されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃに対する、エレクトロスプレーイオン化質量分析のデータは、４１１１６〜４２８７０Ｄａの範囲に及ぶ質量を有する、多くの種を示した（図３）。これらの多くの種は、残基３１で始まり、そしてＯ結合型グリカン（ＨｅｘＮＡｃ−Ｈｅｘ−ＮｅｕＡｃ）で修飾されるＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃに対して予測された質量と一致する、実測質量を有した。対照的に、多くの種が同定され、これらの質量は、利用可能ないかなる予測とも一致しないが、各々の種に対する１４６Ｄａという質量の差異はフコース基の添加と矛盾しなかった（図３）。
【００４４】
Ｎ−脱グリコシル化および還元されたＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃタンパク質の逆重畳積分された（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）質量スペクトルもまた、予測されたよりも１４６Ｄａ高い質量（フコース修飾と矛盾しない）を有する多くの種を示した。
【００４５】
（Ｂ．エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃペプチドマッピング）
ヒトＣｒｉｐｔｏ配列における、明白な１４６Ｄａの翻訳後修飾の同一性および結合位置を、ペプチドマッピングと質量分析との組み合わせを用いて、さらに決定した。図４は、用いたストラテジーおよび結果を概略的に示す。
【００４６】
後のペプチドマッピング実験のために用いられるＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃサンプルを、上記のようにＤＴＴで還元し、そしてこのサンプルを６Ｍのグアニジンまで調節した後、さらなる１０ｍＭのＤＴＴで、４５℃で３５分間還元し、そして３０ｍＭのヨードアセトアミドで、暗所において室温で３０分間アルキル化した。インタクトな、Ｎ−脱グリコシル化された、還元された、そして完全にアルキル化されたタンパク質の質量は、予測よりもなお１４６Ｄａ高かった。このことは、＋１４６Ｄａがシステイン残基と関連しないことを示した。
【００４７】
還元およびアルキル化されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ物質を、エンドプロテイナーゼ Ｌｙｓ−Ｃ（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ；ＷＡＫＯ）を用いて、１Ｍの尿素、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中で、酵素対基質比が１：１０で、室温で１６時間消化した。還元およびアルキル化されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃサンプルの、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物から得られたペプチドを、１２０分間の０〜４５％溶媒Ｂ勾配（溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：０．０８５％ＴＦＡ／７５％アセトニトリル）を用いて、流速０．０５ｍｌ／分で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍを用いるＹＭＣ Ｃ１８カラムでの逆相（ｒｐ）−ＨＰＬＣによって分離し、そして質量分析（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ 三連四重極装置）によってオンラインで分析した。データは、＋１４６Ｄａ修飾が、残基７７〜１１２を含むエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで産生したＣｒｉｐｔｏペプチドと関連することを示した。Ｃｒｉｐｔｏ上の＋１４６修飾のさらなる局在化は、還元およびアルキル化されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃの、分離用エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物に由来した。ペプチドを、ＹＭＣ Ｃ１８カラム上でのｒｐ−ＨＰＬＣによって分析し、以下の溶媒Ｂの勾配で溶出した：０〜１０％Ｂ（１０分）；１０〜２８％Ｂ（１０〜４６分）；２８％で維持（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）（４６〜７０分）；２８〜５０％Ｂ（７０〜１４５分）；５０〜１００％Ｂ（１４５〜１５５分）。各々のＣｒｉｐｔｏペプチド（または混合物）を収集し、そして、α−シアノ−４ ヒドロキシ−桂皮酸をマトリックスとして用いるＭＡＬＤＩ質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＳＴＲ装置、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。特定されたピークを網羅する溶出液（２μｌ）をＭＡＬＤＩプレートに塗布し、そして部分的に空気乾燥させた。各スポットに、０．７μＬのマトリックス（１０ｍｇのα−シアノ−４ ヒドロキシ−桂皮酸／１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸、５０％アセトニトリル）を添加し、そして完全に空気乾燥させた。線形モードでサンプルを分析した。ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃのＥｎｄｏＬｙｓ−Ｃ消化物において先に見られた７７〜１１２Ｃｒｉｐｔｏペプチドに加えて、非特異的切断現象を起こす、この７７〜１１２フラグメントから得られる、２つのペプチドもまた観察した。この分析から、７７〜８２ペプチドが、予測された質量を有することを見出し、そして、１４６Ｄａ質量付加を、残基８３〜１１２（図４）に対応するＣｒｉｐｔｏペプチド上に、さらに局在化した。このペプチドの同一性を、Ｎ末端Ｅｄｍａｎ配列決定によって確認した。
【００４８】
（Ｃ．臭化シアンマッピング）
１４６Ｄａ修飾の部位に対するさらなる根拠を、還元されていないＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃを臭化シアン（ＣＮＢｒ）で処理することによって得た。上記のように調製されたが、還元されていない、ＰＮＧａｓｅ処理されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃを、２００μＬの７０％ギ酸中に再懸濁させた。アセトニトリル中の１０ＭのＣＮＢｒ溶液を、最終濃度の１Ｍまで、反応混合物に添加した。このサンプルを、暗所において室温で２４時間保持した。ＣＮＢｒ処理されたＣｒｉｐｔｏペプチドを、以下の溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）、溶媒Ｂ（０．０８５％ＴＦＡ、７５％アセトニトリル）の勾配を用いるＶｙｄａｃ Ｃ４カラム上でのｒｐ−ＨＰＬＣによって分画した：０〜２０％Ｂ（０〜１０分）；２０〜７５％Ｂ（１０〜１２０分）；７５〜１００％Ｂ（１２０〜１３０分）。ＣＮＢｒ切断は、残基９１〜１５４にジスルフィド結合した、予測される残基７１〜９０に対応するフラグメントを与える（図４）。還元後、ＭＡＬＤＩ質量分析によって測定された分子量は、ペプチド７１〜９０の質量が、予測よりも１４６ダルトン高いことを示した。
【００４９】
ＣＮＢｒ処理されたＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃフラグメントを、さらに１Ｍの尿素中のエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃで、１：５の推定された酵素：基質比で、室温で１８時間消化した。ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃサンプルのＣＮＢｒ／エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物由来のペプチドを、上記のように、ＹＭＣ Ｃ１８カラムでの逆相（ｒｐ）−ＨＰＬＣによって分離した。データは、＋１４６Ｄａ修飾物が、残基８３〜９０を含むＣＮＢｒ／エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ生成Ｃｒｉｐｔｏペプチドと関連することを確証した。
【００５０】
残基９１〜１５４にジスルフィド結合した残基７１〜９０を含むＣＮＢｒフラグメントを、５ｍＭのＤＴＴで還元し、そしてカルボキシペプチダーゼＹ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理した。この消化物の一部を、ＭＡＬＤＩ質量分析によって、１０分間隔で分析した。結果は、ペプチド７１〜９０のＣ末端ホモセリンラクトン（ＣＮＢｒ切断後にホモセリンラクトンに転換されるＭｅｔ）が、追加の１４６Ｄａ物の損失なく、除去され得ることを示した（図４）。
【００５１】
ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化（実施例２、パートＢ）は、１４６Ｄａ修飾物を、残基８３〜１１２を含むＣｒｉｐｔｏペプチドに局在させた。ＣＲ（ｃＣ）−ＦｃのＣＮＢｒ／エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ消化物（実施例２、パートＣ）は、１４６Ｄａ修飾物を、残基７１〜９０を含むＣｒｉｐｔｏペプチドに局在させた。これらの２つの分析は、総合すると、１４６ダルトン修飾物を残基８３〜９０に局在させた。カルボキシペプチダーゼＹ処理は、１４６ダルトン修飾物を、Ｃｒｉｐｔｏ残基８３〜８９（ＣＬＮＧＧＴＣ）にさらに局在させた。この配列内のシステイン残基は、アルキル化のために利用可能であることが上で示されたので、１４６ダルトン物によって修飾されない。ロイシン、グリシンは、代表的には修飾されない。Ｇｌｙの前のＡｓｎは、１７Ｄａの関連する損失（ＮＨ３の損失）を伴って、環状イミドを形成し得、この環状イミドは、塩基性条件下でαアスパラギン酸またはβアスパラギン酸（ＯＨの付加）を形成し、このペプチドに対して１Ｄａの正味の増加を生じる。これは、修飾の起こりそうな部位であるＴｈｒ８８から離れる。Ｔｈｒ８８がフコシル化されたことを本発明者らに結論付けさせる、１４６Ｄａ修飾物をＴｈｒ８８が有することは、本発明の発見であった。フコシル化は、タンパク質修飾の中では希な現象である。１４６Ｄａ修飾物が局在されるＣｒｉｐｔｏ配列は、Ｃ２ＸＸＧＧＳ／ＴＣ３のフコシル化コンセンサス配列（この部位は、ＥＧＦ様配列の第２および第３の保存されたシステインの間に位置し、Ｘは任意のアミノ酸であり、そしてフコースはセリンまたはスレオニン上にある）に関して記載されたモチーフと一致する（Ｈａｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：６５３９〜６５４７、１９９３を参照のこと）。
【００５２】
（実施例３：８８位のＯ−フコースを欠くＣｒｉｐｔｏ改変体Ｔｈｒ８８Ａｌａ）
部位特異的な変異誘発を用いて、８８位でスレオニンではなくアミノ酸残基アラニンを有するＣｒｉｐｔｏ改変体をコードするｃＤＮＡを発現し得る、発現ベクターを構築した。変異体構築物を、図５に概略的に示す。
【００５３】
（Ａ．変異体の構成）
ヒトＣｒｉｐｔｏ−１の、スレオニン８８からアラニンへの変異誘発（Ｔ８８Ａ）を、スプライスドオーバーラップ伸長（ｓｐｌｉｃｅｄ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ ＰＣＲ）によって達成した（Ｓｔｅｐｈａｎ Ｈｏら、Ｇｅｎｅ ７７、１９８９、５１〜５９頁を参照のこと）。
【００５４】
以下のプライマー（５’→３’）（各々の長さが４４ヌクレオチドであり、Ｔｈｒ８８Ａｌａ変異を作製する上端鎖および下端鎖である）を、変異誘発のために用いた。アスタリスクは、変異（Ｔｈｒ→Ａｌａ）コドンを示す。
ＮＥＷ−６５８： ＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧ＊Ｃ＊Ｃ＊ＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣ ３’（配列番号３４）
ＮＥＷ−６５９： ＧＣＡＧＧＣＡＣＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧ＊Ｇ＊Ｃ＊ＴＣＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣ ３’（配列番号３５）
これらのオリゴは、スレオニンコドン（ＡＣＣ）を、アラニンに対するコドン（ＧＣＣ）に変化させる。変異誘発性のプライマーの設計において、所望の変異が制限部位変化を生じなかった場合、変異は隣接するコドンに導入されて、変異誘発の後の変異クローンの同定を容易にした。同一のオリゴはまた、ＢａｍＨ１部位を導入するための配列にサイレント変化をもたらし、グリシン６２コドンをＧＧＧからＧＧＡに変化させる。この新しい部位は、変異体クローンをスクリーニングする能力を与えた。
【００５５】
野生型Ｃｒｉｐｔｏ構築物およびＴ８８Ａ Ｃｒｉｐｔｏ構築物を、それぞれ図２および図５に概略的に示す。第１の変異体（ＣＲ（ｃＣ）Ｔ８８Ａ、配列番号１０）（ｐＳＧＳ９０１と命名した）を、テンプレートｐＳＧＳ１４０（これは、一過性トランスフェクトのためのｐＥＡＧ１１００ベクターにおいて、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基メチオニン１〜セリン１６９をコードするｃＤＮＡである）用いて生成した。第２の変異体（ＣＲ（７５−１１２）−Ｆｃ Ｔ８８Ａ、配列番号１５）（ｐＳＧＳ９０２と命名した）を、テンプレートｐＳＧＳ４２２（これは、ベクターｐＥＡＧ１１００において、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（配列番号８）に融合した、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏ−１残基セリン７５〜リシン１１２に融合した、ヒトＶＣＡＭ−１シグナルペプチドをコードするｃＤＮＡである）から生成した。第３の変異体（ＣＲ Ｔ８８Ａ、配列番号９）（ｐＳＧＳ９０３と命名した）は、テンプレートｐＳＧＳ１５１（これは、一過性トランスフェクトのためのｐＣＳ２ベクター（Ｒａｐｐら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：１３１１〜１３２３，１９９４；およびＴｕｒｎｅｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ８：１４３４〜１４４７，１９９４を参照のこと）において、配列番号１のヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基１〜１８８をコードするｃＤＮＡである）を用いて生成される。
【００５６】
ＳＯＥ ＰＣＲには２つの段階がある。段階Ｉは、２つの生成物Ａ＋Ｂを生成するためのＰＣＲであった。生成物Ａ（ｃＤＮＡの５’端）を、５’配列の上端鎖オリゴ（ｐＳＧＳ９０１およびｐＳＧＳ９０３に対するＮＥＷ−５４７（配列番号２９）、ならびにｐＳＧＳ９０２に対するＮＥＷ−４２３（配列番号３２））、そして、下端鎖変異誘発性オリゴ（ＮＥＷ−６５９（配列番号３５））を用いることによって生成した。生成物Ｂ（ｃＤＮＡの３’端）を、上端鎖変異誘発性オリゴ（ＮＥＷ−６５８（配列番号３４））、ならびに、３’配列の下端鎖オリゴ（ｐＳＧＳ９０１に対するＮＥＷ−５８７（配列番号３０）、ｐＳＧＳ９０３に対するＮＥＷ−５８８（配列番号３１）、およびｐＳＧＳ９０２に対するＮＥＷ−６７０（配列番号３３））を用いることによって生成した。
【００５７】
ＳＯＥ ＰＣＲの段階ＩＩは、変異誘発されたｃＤＮＡの全体である生成物Ｃを生成することであった。この工程は、生成物Ａ＋Ｂ（オーバーラップ配列の４４ヌクレオチドを有する）、ならびに、上の工程Ｉで考察された５’上端鎖オリゴおよび３’下端鎖オリゴを用いた。
【００５８】
変異体ｐＳＧＳ９０１、ｐＳＧＳ９０２、およびｐＳＧＳ９０３の全てに対する生成物Ａおよび生成物Ｂのための段階Ｉを、以下のように行った。１００マイクロリットル（μｌ）の総体積で、５ナノグラム（ｎｇ）のテンプレートｃＤＮＡ、各３０ピコモル（ｐｍｏｌ）の５’オリゴおよび３’オリゴ、各２００ナノモル（ｎｍｏｌ）のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、１×クローン化Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの反応緩衝液（２ｍＭのＭｇＣｌ２）、ならびに、ホットスタート後に添加される２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カタログ番号６００２５２）を用いて、ＰＣＲを行った。９４℃−１分の融解工程、５８℃−１分のアニーリング工程、７２℃−２分の伸長工程の３０サイクル、その後の７２℃−７分の伸長の１サイクルを必要とした。この手順の唯一の例外は、ＮＥＷ−４２３（配列番号３２）に対するアニーリング温度が５０℃であることだった。
【００５９】
変異体ｐＳＧＳ９０１、ｐＳＧＳ９０２、およびｐＳＧＳ９０３のための段階ＩＩを、以下のように行った。各１０μｌの生成物Ａ＋Ｂを、２００ｎｍｏｌのｄＮＴＰ、各３０ｐｍｏｌの５’オリゴおよび３’オリゴ、Ｐｆｕ緩衝液、ならびに、ホットスタート後に添加される２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ酵素と混合した。段階ＩＩのＰＣＲ反応工程を、アニーリング温度を除いて、上記のように行った。ｐＳＧＳ９０１およびｐＳＧＳ９０３の生成物ＣのＰＣＲに対するアニーリング温度は６５℃であり、ｐＳＧＳ９０２の生成物ＣのＰＣＲに対するアニーリング温度は５５℃であった。この反応を、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ カタログ番号４００７７１）で行い、未使用オリゴから離して生成物を精製した。次いで、ｐＳＧＳ９０１およびｐＳＧＳ９０２に対するＰＣＲ生成物Ｃを、６０ユニットのＮｏｔ１制限酵素を用いて、３７℃で１６時間消化した。ｐＳＧＳ９０３に対するＰＣＲ生成物Ｃを、６０単位のＸｈｏ１制限酵素およびＨｉｎｄ１１１制限酵素を用いて、３７℃で１６時間消化した。この酵素を、フェノールおよびクロロホルムを一緒に用いて１回抽出し、クロロホルムを用いて１回抽出し、そしてＤＮＡを、キャリアとしてグリコーゲンを有する０．３Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を加えたエタノールを用いて、沈殿させた。ＤＮＡペレットを、水を加えた７０％エタノールで洗浄し、そして１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）中に再懸濁させた。ここで、ｐＳＧＳ９０１構築物およびｐＳＧＳ９０２構築物について、Ｎｏｔ１で消化された生成物Ｃの挿入物（２０ｎｇ）と、Ｎｏｔ１で消化され、仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたｐＥＡＧ１１００ベクター（５０ｎｇ）との間で、１０μｌの総体積で、１６℃で１６時間連結を行った。ｐＳＧＳ９０３に対する連結を、２０ｎｇの、Ｘｈｏ１／Ｈｉｎｄ１１１で消化された生成物ＣおよびＸｈｏ１／Ｈｉｎｄ１１１で消化されたｐＣＳ２＋ベクターを用いて行った。この反応物のうちの２μｌを、５０μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α中に形質転換し、そして、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）寒天板にプレートした。コロニーを摘出し、そして２ｍｌのＬＢブロスにおいて、３７℃で１６時間増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレップキットを用いて精製し、ＢａｍＨ１で１．５時間消化し、そしてアガロースゲル上で泳動させて、どのクローンがサイレンと変異を含むか、従って、どのクローンがスレオニン８８からアラニンへの変化を含むかを可視化した。クローン挿入物の配列（Ｃｒｉｐｔｏ配列およびＩｇ配列）を、ジデオキシＤＮＡ配列決定によって、点検および確認した。
【００６０】
（Ｃ．ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション）
ＤＮＡ配列決定によって、変異を確認した。正しい変異体クローンを確認した後、大規模な一過性トランスフェクションを行い、変異体Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を得た。このトランスフェクションは、スピナフラスコにおいて、懸濁培養物として増殖されたＣＨＯ細胞（ＣＤ−ＣＨＯ）を用いて行われた。培養物の１リットル毎に、２ｍｇのｃＤＮＡを、コレステロール溶液を加えたＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カチオン性脂質と、総体積２４０ｍｌの無血清培地（ＣＤ−ＣＨＯ培地、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、室温で１５分間混合した。次いで、２４０ｍｌの同一の培地中の１．５×１０９個のＣＨＯ細胞を、ＤＭＲＩＥ−Ｃを加えたＤＮＡに添加し、１リットルのスピナフラスコに移し、そして３７℃で４時間増殖させた。次いで、この細胞を、５２０ｍｌの培地で希釈し、３リットルのスピナフラスコに移し、そして２８℃で８日間増殖させた。細胞を除去するための遠心分離の後、馴化培地を、ＰＥＳ（Ｎａｌｇｅｎｅ）フィルターで濾過し、そして−７０℃で凍結した。
【００６１】
（実施例４：Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達活性の機能および調節について、Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストを試験する工程）
Ｃｒｉｐｔｏ活性の過剰発現は、間葉細胞特性、増殖の増加、および細胞移動（新生物形成において見られる細胞形質転換に関連する全ての表現型）を促進する、脱分化状態を導き得る（Ｓａｌｏｍｏｎら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２１：６１〜７０，１９９９；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２９１〜２９８，１９９４；およびＢａｌｄａｓｓａｒｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：５３８〜５４３，１９９６）。Ｃｒｉｐｔｏ活性をブロックするＣｒｉｐｔｏアンタゴニストは、癌に対して、治療的に有益であり得、そして潜在的な処置であり得る。
【００６２】
Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストの活性およびＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する能力を試験する１つの方法は、Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏノックアウト（ＫＯ）細胞株（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３〜１４２，２０００）を伴う。Ｃｒｉｐｔｏは、Ｘｅｎｏｐｕｓの胚におけるｓｍａｄ２リン酸化および転写因子ＦＡＳＴを刺激し、そして、転写因子ＦＡＳＴの活性は、ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター遺伝子に由来するルシフェラーゼ活性を測定することによってモニターされ得る（Ｓａｉｊｏｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：３５〜４７，２０００）。Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子が欠失しており、従って、ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｏ依存性シグナル伝達についてヌルである（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３〜１４２，２０００）。Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達は、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において、Ｃｒｉｐｔｏ、ＦＡＳＴおよびＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ遺伝子の構築物（図６）にトランスフェクトすることによって、評価され得る。Ｃｒｉｐｔｏ ｃＤＮＡおよびＦＡＳＴ ｃＤＮＡがこれらの細胞株にトランスフェクトされない限り、これらの細胞株において、Ｃｒｉｐｔｏ依存性ＦＡＳＴルシフェラーゼ活性は見られなかった（図６）。
【００６３】
野生型Ｃｒｉｐｔｏ構築物および変異体Ｃｒｉｐｔｏ構築物の活性は、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞へのトランスフェクションによって測定され得る。Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞（６．５×１０５個の細胞／ウェル）を、等量のＦＡＳＴ、ＦＡＳＴルシフェラーゼレポーターＤＮＡを用いて、ならびに、Ｃｒｉｐｔｏ全長野生型ＤＮＡの非存在下および存在下において、ならびに、Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ変異体全長ＤＮＡの非存在下および存在下において、トランスフェクトした。トランスフェクトされた総ＤＮＡは常に１．０μｇであり、必要な場合、コントロールベクターＤＮＡ（ｐＥＡＧ１００またはｐＣＳ２）を用いて、全量を１．０μｇに引き上げた（当業者にとって標準的な条件を用いて、リポフェクタミンでトランスフェクションを行った。リポフェクタミンは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓから購入した）。トランスフェクトの４８時間後、ＬｕｃＬｉｔｅ（ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）で細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性を、発光カウンターにおいて測定した。本発明者らは、野生型Ｃｒｉｐｔｏ（配列番号１）がＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ（ＦＡＳＴ−ｌｕｃ）レポーター活性（図６、Ｃｒｉｐｔｏ ＷＴ＋ＦＡＳＴ＋ＦＡＳＴ−ｌｕｃレポーター、４列目）を刺激すること、および、この活性がＣｒｉｐｔｏおよびＦＡＳＴの両方の存在を必要とすることを示した（図６）。対照的に、Ｔｈｒ８８Ａｌａ Ｃｒｉｐｔｏ変異体（配列番号９、ｐＳＧＳ９０３）は、ＦＡＳＴ−ルシフェラーゼ活性を殆ど有さなかった（図６、Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ＋ＦＡＳＴ＋ＦＡＳＴ ｌｕｃレポーター、５列目）。
【００６４】
等量のＣＲ Ｔｈｒ８８Ａｌａ変異体ｃＤＮＡとＣＲ野生型ｃＤＮＡとを混合し、Ｆ９ ＫＯ細胞に同時にトランスフェクトする競合実験は、野生型ＣＲがＦＡＳＴルシフェラーゼ活性を刺激する能力が、単独の野生型ＣＲと比較した場合、ＣＲ Ｔ８８Ａ変異体の存在下において減少することを示し（図６、Ｃｒｉｐｔｏ ＷＴ＋Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ＋ＦＡＳＴ＋ＦＡＳＴ ｌｕｃレポーター、６列目）、Ｔｈｒ８８Ａｌａ変異体が、野生型Ｃｒｉｐｔｏの活性をアンタゴナイズするように作用することを示した。
【００６５】
（実施例５：抗癌剤としてのＣｒｉｐｔｏアンタゴニストをインビボで試験する工程）
Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストは、当業者によって用いられる通常のプロトコルに従って、マウスにおける潜在的な抗癌剤としてのインビボ活性についてスクリーニングされる。このようなプロトコルの例は、以下に列挙され、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって、「ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」プロトコル（ＮＩＨ出版番号８４−２６３５（１９８４年２月））において概説されるものである。
【００６６】
（Ａ）６週齢のヌードマウスに、１００μｇの抗ＬＦＡ３コントロール抗体（１Ｅ６）、１００μｇのＣｒｉｐｔｏアンタゴニスト−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１３）を腹腔内注射するか、または注射しない（コントロール）。次いで、この動物を、細胞表面Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を発現した癌細胞株（例：１×１０６ＧＥＯ結腸腺癌細胞）を皮下注射する。ＣｒｉｐｔｏアンタゴニストおよびコントロールＡｂで処理されたマウスを、１００μｇのタンパク質で毎週再処理する。腫瘍のサイズを毎週測定し、そして腫瘍球（ｔｕｍｏｒ ｓｐｈｅｒｅ）の体積を計算する。動物を、腫瘍が２．０ｃｍ３の体積（直径１６ｍｍ）に達したときに、屠殺し、そして全ての異常な観察を記録する。実験を、最適な治療的プロフィールを決定するために、Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストタンパク質の範囲で繰り返す。
【００６７】
（Ｂ）体重が約（１８ｇ）である、６週齢のヌードマウス（ｎ＝１０（実験用）およびｎ＝１０（コントロール））に、皮下腫瘍（腫瘍組織は、乳房、結腸、肺、頚部などの、ヒトの腫瘍に由来し得、腫瘍組織はＣｒｉｐｔｏを発現する）の２５ｍｇの断片を、０日目に移植する。腫瘍サンプル上での細菌培養を行い、汚染された場合はただちに廃棄する。処置初日（ステージング日）：重量１００ｍｇ以上、７００ｍｇ以下の腫瘍を有するマウスを選択する。個体の体重によって、無作為化および処置する。１〜５０ｍｇ／ｋｇの、広い用量範囲を試験する。Ｃｒｉｐｔｏアンタゴニストタンパク質、コントロール抗体、およびＰＢＳコントロール動物に、ステージング日にｉｐを注射し、そして全３回の注射を４日間にわたって毎日継続する。体重および腫瘍の測定を、処置初日（ステージング日）および選択された測定日に記録する。評価最終日は、最適な（最良な）腫瘍の重量を与える測定日である。ｔ／ｃ％を評価最終日に指定する。実験を終了し、そして評価する。
【００６８】
（等価物）
本発明は、本発明の精神または本質的な特性から逸脱しない、他の特定の形態において実施され得る。従って、前記の実施形態は、本明細書中に開示される本発明を限定せず、あらゆる点で、本発明の例示であると考えられる。従って、本発明の範囲は、前記の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、その特許請求の範囲の等価性の意味内および範囲内で生じる全ての変化は、その特許請求の範囲に含まれることを意図する。
【００６９】
（配列表）
配列番号１は、全長ヒトＣｒｉｐｔｏ−１（残基１〜１８８を含む）である（「ＣＲ」）。
【００７０】
【表１】
【００７１】
【表２】
【００７２】
【表３】
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【００７５】
【表６】
【００７６】
【表７】
【００７７】
【表８】
【００７８】
【表９】
【００７９】
【表１０】
【００８０】
【表１１】
【００８１】
【表１２】
【００８２】
【表１３】
【００８３】
【表１４】
【００８４】
【表１５】
【００８５】
【表１６】
【００８６】
【表１７】
【００８７】
【表１８】
【００８８】
【表１９】
【００８９】
【表２０】
【００９０】
【表２１】
【００９１】
【表２２】
【００９２】
【表２３】
【００９３】
【表２４】
【００９４】
【表２５】
【００９５】
【表２６】
【００９６】
【表２７】
【００９７】
【表２８】
【００９８】
【表２９】
【００９９】
【表３０】
【０１００】
【表３１】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＣｒｉｐｔｏ−１タンパク質およびヒトＣｒｉｐｔｏ−３タンパク質（それぞれ、配列番号１および２）の並列である。Ｃｒｉｐｔｏ−１およびＣｒｉｐｔｏ−３のスレオニン８８を太字で示す。Ｃｒｉｐｔｏ−１のシグナル配列（配列番号１の残基１〜３０を含む）を下線で示す。
【図２】
図２は、記載されるＣｒｉｐｔｏ発現構築物の略図である。実施例３に記載されるように、構築物を作製した。
【図３】
図３は、Ｎ−脱グリコシル化ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃタンパク質の、エレクトロスプレー質量分析である。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中のＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ糖タンパク質を、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中で、室温で６時間還元し、次いで、１ｍｇのＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃ当たり１５０ミリユニットのＰＮＧａｓｅ Ｆで、３７℃で１６時間処理した。このＮ−脱グリコシル化生成物を、三連四重極装置（Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）上で、ＥＳＩ−ＭＳ分析によって分析した。
【図４】
図４は、ＣＲＩＰＴＯタンパク質のペプチドマッピングおよび質量分析の略図である。Ｎ−脱グリコシル化ＣＲ（ｃＣ）−Ｆｃを、実施例２に記載されるように、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ，ＣＮＢｒ、およびカルボキシペプチダーゼＹを各々用いて消化した。この消化から得られたＣｒｉｐｔｏポリペプチドを、ｒｐ−ＨＰＬＣによって分離し、そして質量分析によって分析した。
【図５】
図５は、記載される変異体Ｃｒｉｐｔｏ発現構築物の略図である。実施例３に記載されるように、構築物を作製した。
【図６】
図６は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達アッセイである。ヒトＣｒｉｐｔｏ−１（配列番号１）およびヒトＣｒｉｐｔｏ−１ Ｔ８８Ａ（配列番号５）の生理活性を、実施例４に記載されるようなＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトされたＦ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において評価した。Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞（６．５×１０５細胞／ウェル）を、等量のＦＡＳＴ、ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーターＤＮＡを用いて、そして、Ｃｒｉｐｔｏ全長野生型ＤＮＡの非存在下または存在下において、Ｃｒｉｐｔｏ Ｔ８８Ａ変異体全長ＤＮＡの非存在下または存在下において、トランスフェクトし、そして、等量の野生型ＣＲ ｃＤＮＡおよびＣＲ Ｔ８８Ａ ｃＤＮＡを用いて、ブロッキング活性を評価した。トランスフェクトの４８時間後、ＬｕｃＬｉｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）で細胞を溶解し、そして、発光カウンターにおいて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
Claims (22)
- ＣＲＩＰＴＯ変異体であって、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドまたはその機能的フラグメント由来の少なくとも１つのアミノ酸がＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる別のアミノ酸で置換されており、該アミノ酸置換がＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、８７、および８８からなる群より選択される、ＣＲＩＰＴＯ変異体。
- ＣＲＩＰＴＯ変異体であって、以下：
（ａ）配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠失した、配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；または
（ｃ）配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］に示されるポリペプチドのドメインあるいはその機能的フラグメント；
からなる群より選択されるＣＲＩＰＴＯポリペプチド由来の少なくとも１つのアミノ酸が、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドに存在するアミノ酸と異なる別のアミノ酸で置換されており、該アミノ酸置換がＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、８７、および８８からなる群より選択される、ＣＲＩＰＴＯ変異体。 - 前記１つ以上の置換が、アラニンまたはグリシンからなる群より選択されるアミン酸である、請求項１または２に記載のＣＲＩＰＴＯ変異体。
- ＣＲＩＰＲＯ変異体であって、以下：
（ａ）配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠失した、配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；または
（ｃ）配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］に示されるポリペプチドのドメインあるいはその機能的フラグメント；
からなる群より選択されるＣＲＩＰＴＯポリペプチドの８８位にアミノ酸置換を有する、ＣＲＩＰＴＯ変異体。 - ＣＲＩＰＲＯ変異体であって、以下：
（ａ）配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠失した、配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；または
（ｃ）配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］に示されるポリペプチドのドメインあるいはその機能的フラグメント；
からなる群より選択されるＣＲＩＰＴＯポリペプチドの８７位にアミノ酸置換を有する、ＣＲＩＰＴＯ変異体。 - ＣＲＩＰＲＯ変異体であって、以下：
（ａ）配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠失した、配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；または
（ｃ）配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］に示されるポリペプチドのドメインあるいはその機能的フラグメント；
からなる群より選択されるＣＲＩＰＴＯポリペプチドの８６位にアミノ酸置換を有する、ＣＲＩＰＴＯ変異体。 - 前記８６位、８７位、または８８位の置換が、アラニンまたはグリシンである、請求項３〜５に記載のＣＲＩＰＴＯ変異体。
- ＣＲＩＰＲＯ変異体であって、以下：
（ａ）配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；
（ｂ）関連するシグナルペプチドを欠失した、配列番号１（全長ＣＲ−１）または配列番号２（全長ＣＲ−３）に示されるポリペプチドあるいはその機能的フラグメント；または
（ｃ）配列番号５［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−１］、配列番号１８［アミノ酸７５〜アミノ酸１１２のＣＲ−３］、配列番号４［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ１］、配列番号１７［アミノ酸３８〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］、配列番号３［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−１］、または配列番号１６［アミノ酸３１〜アミノ酸１６９のＣＲ−３］に示されるポリペプチドのドメインあるいはその機能的フラグメント；
からなる群より選択されるＣＲＩＰＴＯポリペプチドの８８位に脱フコシル化修飾を有する、ＣＲＩＰＴＯ変異体。 - 請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＲＩＰＴＯ変異体をコードする配列を含む、単離された核酸。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異ＣＲＩＰＴＯポリペプチドを含み、そして異種ポリペプチドをさらに含む、キメラ分子。
- 前記異種ポリペプチドが、変異ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのＣ末端に融合されている、請求項１０に記載のキメラ分子。
- 前記異種ポリペプチドが、変異ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのＮ末端に融合されている、請求項１０に記載のキメラ分子。
- 前記異種ポリペプチドが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ポリメラーゼ活性化ドメイン、ヒスチジンタグ、ＨＳＡタグ、エピトープタグ配列、および免疫グロブリンのＦｃ領域からなる群より選択される、請求項１０に記載のキメラ分子。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異ＣＲＩＰＴＯポリペプチドを含み、そして合成ポリマーをさらに含む、キメラ分子。
- 前記合成ポリマーがＰＥＧである、請求項１４に記載のキメラ分子。
- 腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を、該腫瘍細胞に曝露する工程を包含する、方法。
- 前記曝露工程がインビトロで実施される、請求項１６に記載の方法。
- 前記曝露工程がインビボで実施される、請求項１６に記載の方法。
- 被験体における望ましくない細胞増殖に関連する疾患の進行、重篤度、または影響を処置または低減する方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチドの有効量を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患または状態が癌である、請求項１９に記載の方法。
- 前記癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、黒色腫、および白血病からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
- ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションプローブとハイブリダイズする配列をコードする単離された核酸であって、該プローブのヌクレオチド配列は、配列番号３６（ＣＲ−１）または配列番号３７（ＣＲ−３）のコード配列、あるいは配列番号３６（ＣＲ−１）または配列番号３７（ＣＲ−３）のコード配列の相補鎖から構成され、そして少なくとも１つのアミノ酸置換さらに含み、該アミノ酸置換は、ＣＲＩＰＴＯポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸残基８６、アミノ酸残基８７、およびアミノ酸残基８８からなる群より選択される、核酸。
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| US20090123470A1 (en) * | 2001-03-26 | 2009-05-14 | The Macfarlane Burnet Istitute For Medical Research And Public Health Ltd. | Antibodies Against Cancer |
| AUPR395801A0 (en) * | 2001-03-26 | 2001-04-26 | Austin Research Institute, The | Antibodies against cancer |
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| DE602004022315D1 (de) | 2003-09-15 | 2009-09-10 | Res Dev Foundation | Cripto-antagonismus von activin und tgf-b signalisierung |
| CA2539535A1 (en) * | 2003-10-03 | 2005-04-14 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services | Use of cripto-1 as a biomarker for neurodegenerative disease and method of inhibiting progression thereof |
| CA3062320C (en) | 2003-11-06 | 2022-11-15 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands |
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| US20100111856A1 (en) | 2004-09-23 | 2010-05-06 | Herman Gill | Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates |
| WO2006074397A2 (en) | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Cripto binding molecules |
| WO2006074341A2 (en) * | 2005-01-07 | 2006-07-13 | Glaxo Group Limited | Novel use |
| EP2021510A2 (en) * | 2006-04-28 | 2009-02-11 | Biogen Idec MA Inc. | Composition and methods for the detection of cripto-3 |
| WO2007130875A2 (en) * | 2006-05-02 | 2007-11-15 | Genentech, Inc. | Microwave assisted deglycosylation of proteins for molecular weight determination by mass spectrometry |
| WO2008040759A1 (en) * | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Pharmexa A/S | Method for down-regulation of cripto |
| JP2013504585A (ja) | 2009-09-09 | 2013-02-07 | セントローズ， エルエルシー | 細胞外標的化薬物複合体 |
| DK2528625T3 (da) | 2010-04-15 | 2013-10-14 | Spirogen Sarl | Pyrrolobenzodiazepiner og konjugater deraf |
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| BR112017003236A2 (pt) | 2014-09-12 | 2017-11-28 | Genentech Inc | anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica |
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| CN107148285B (zh) | 2014-11-25 | 2022-01-04 | Adc治疗股份有限公司 | 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物 |
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| IT202200007580A1 (it) * | 2022-04-15 | 2023-10-15 | Consiglio Nazionale Ricerche | Vescicole lipidiche per l’uso nel trattamento terapeutico di tumori aggressivi |
| WO2024138128A2 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-27 | Genentech, Inc. | Cereblon degrader conjugates, and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999045026A1 (en) * | 1998-03-05 | 1999-09-10 | Chiron Corporation | Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5256643A (en) * | 1990-05-29 | 1993-10-26 | The Government Of The United States | Human cripto protein |
| US5264557A (en) * | 1991-08-23 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3 |
| EP0879240A4 (en) * | 1995-06-05 | 2000-05-03 | Human Genome Sciences Inc | HUMAN CRIPTINE: GROWTH FACTOR |
| DE69737457T2 (de) * | 1997-01-31 | 2007-11-29 | Genentech, Inc., South San Francisco | O-fukosyltransferase |
| IL125608A0 (en) * | 1998-07-30 | 1999-03-12 | Yeda Res & Dev | Tumor associated antigen peptides and use of same as anti-tumor vaccines |
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Patent Citations (1)
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