JPH07506488A - ｎｅｕレセプターの組換え刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３０．請求項２０に記載のＤＮＡ配列の、原核性または真核性宿主細胞中での発 現のポリペプチド産物。

３１、天然ｎｅｕレセプター刺激因子のポリペプチドフラグメントまたはポリペ プチド類縁体をコードするＤＮＡ配列。

３２、メチオニルｎｅｕレセプター刺激因子を特徴とする請求項３１に記載のＤ ＮＡ配列。

３３、図５に示したアミノ酸配列（配列番号４）の一部または全部を有し、天然 ｎｅｕレセプター刺激因子の１ｎｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏ生物学的活性 を１つ以上有するポリペプチド。

３４、天然ｎｅｕレセプター刺激因子の二次構造の一部または全部を有し、図５ に示したアミノ酸配列（配列番号４）の一部または全部を有し、天然ｎｅｕレセ プター刺激因子の１つ以上の生物学的特性を有するポリペプチド。

３５、ａ）［Ｍｅ　ｔ−１］ｎｅｕレセプター刺激因子；及びｂ）１つ以上のン スティンがアラニンまたはセリンで置換されているｎｅｕレセプター刺激因子か らなる群から選択される、ヒトｎｅｕレセプター刺激因子の類縁体をコードする ＤＮＡ配列。

３６、請求項３５に記載のＤＮＡ配列の、原核性または真核性宿主細胞中での発 現のポリペプチド産物。

３７、天然ｎｅｕレセプター刺激因子の１つ以上の生物学的活性を有する、図５ に示したアミノ酸配列（配列番号４）を有する非天然ポリペプチド、または、そ の任意の誘導体、欠失類縁体、置換類縁体もしくは付加類縁体であって、外来Ｄ ＮＡ配列の原核性または真核性発現の産物であることを特徴とする前記非天然ポ リペプチド。

３８、ｎｅｕレセプター刺激因子を生産する方法であって、請求項１７に記載の ＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクトした原核性または真核性宿主細 胞を、適当な栄養条件下で増殖させ、 前記ベクター中のＤＮＡ配列の所望のポリペプチド発現産物を単離する ことからなる方法。

３９、細胞成長及び分化を調節する方法であって、細胞を有効量の組換えｎｅｕ レセプター刺激因子に接触させることからなる方法。

４０、哺乳動物において実施される請求項３９に記載の方４１、前記哺乳動物が ヒトである請求項４０に記載の方法。

４２、ｎｅｕレセプターを発現するヒト組織の修復及び再生を増強する方法であ って、有効量の組換えｎｅｕレセプター刺激因子を投与することからなる方法。

４３、前記組織が、胃腸管、気道、尿路及び生殖路の組織からなる群から選択さ れる請求項４２に記載の方法。

４４、前記組織がヒト皮膚からなる請求項４２に記載の方法。

４５、前記組織が神経組織である請求項４２に記載の方法。

４６、ｎｅｕレセプターを発現するヒト組織におけるｎｅＵレセプター刺激因子 欠乏を治療する方法であって、有効量の組換えｎｅｕレセプター刺激因子を、か かる欠乏を有するヒトに投与することからなる方法。

４７、腫瘍細胞の表面にｎｅｕレセプターを発現する哺乳動物腫瘍を治療する方 法であって、かかる腫瘍を有する哺乳動物に、腫瘍増殖を低減するのに有効な量 の組換えｎｅＵレセプター刺激因子を投与することからなる方法。

４８、前記哺乳動物がヒトである請求項４７に記載の方法。

４９、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、及び皮膚癌からなる群か ら選択される癌の治療に使用される請求項４８に記載の方法。

５０、有効量の組換えｎｅｕレセプター刺激因子並びに医薬的に容認可能な希釈 剤、アジュバント及び担体を含む医薬組成物。

５１、請求項１２に記載のポリペプチドを用いた免疫によって特異的に生産され た抗体。

５２、モノクローナル抗体である請求項５１に記載の抗体。

５３、水溶性ポリマーに共有結合された請求項１に記載のポリペプチドを含む生 物学的に活性な組成物。

５４、前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、及びポリエチレングリコール とポリプロピレングリコールのコポリマーからなる群から選択される請求項５３ に記載の組成物。

５５、ヒト細胞または組織におけるｎｅｕレセプター刺激因子の過少発現または 過剰発現を検出する方法であって、（ａ）前記細胞または組織からＲＮＡを単離 し；（ｂ）前記ＲＮＡを、ｎｅｕレセプター刺激因子ｍＲＮＡ中に存在する核酸 配列にハイブリダイズし得る核酸プローブと、該プローブがそれが特異性を示す 核酸とハイブリダイズするのに適した条件下で接触させ；更に（ｃ）ｎｅｕレセ プター刺激因子ｍ　ＲＮ　Ａの過少発現または過剰発現の指標として、前記ＲＮ Ａとプローブとのハイブリダイゼーションレベルを判定することからなる方法。

明細書 ｎｅｕレセプターの組換え刺激因子 発明の分野 本発明は、ｎｅｕレセプターと相互作用してそれを刺激し、細胞増殖及び分化を 調節する、組換えＤＮＡ法によって生産される新規の非天然ポリペプチドに係わ る。本発明は更に、該ポリペプチドの類縁体及び誘導体、並びに該ポリペプチド 、類縁体及び誘導体をコードするＤＮＡ配列にも係わる。

発明の背景 細胞の成長及び分化は、一部には、ポリペプチド分子にｒｏｎｓｏｎ、Ｓ、Ａ、 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５４　：　１１４６−１１５２．　１９９１）　ｏかか る因子と特異的細胞表面レセプターとの相互作用によって、遺伝子発現及びＤＮ Ａ複製を調節する核内事象を盛んにする生化学的カスケード反応が開始される（ 　Ｕｌｌｒｉｃｈ、　Ａ、及びＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｊ、、　Ｃｅ１ｌ　 ６１　：　２０３−２１２．１９９０）　ｏこの細胞調節機構は、発生時の細胞 の運命決定に係わっており、この機構の破壊は腫瘍原性形質転換につながり得る 。腫瘍原性形質転換は、成長調節因子の構成的産生またはそれらの同系レセプタ ーの変形によ、て誘導され得る（　Ｙａｒｄｅｎ、　Ｙ。

及びＵｌｌｒｉｃｈ、＾、、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５７：　４ ４３−４４８．１９８８）。

腫瘍原性レセプターは、細胞質ドメイン内に共通の触媒機能、即ちチロシン特異 的タンパク質キナーゼ活性を有する膜貫通糖タンパク質ファミリーに属する（　 Ｈａｎｋｓ、　Ｓ、　Ｋ、　、　Ｃｕｒ、　Ｏｐ、　５ｔｒｕｃｔ、　Ｂｉｏｌ 、　１　：　３６４−３８３．１９９１）。

（ｅｒｂＢ−２及びＨＥＲ−２とも称される）ｎｅｕ原腫瘍遺伝子は、上皮成長 因子のレセプターと高度に関連するチロシンキナーゼをコードする（　Ｋｉｎｇ 、　Ｃ，Ｒ，ら、　ＥＭＢＯＪ、　７＋　１６４７−１６５１．　１９９８　； 　Ｃｏｕｓｓｅｎｓ、　Ｌ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　１１３２−１ １３９、　１９８５　；　Ｂａｒｇｍａｎｎ、Ｃ，ｒ、ら、　Ｃｅ１ｌ　４５： 　６４９−６５７．　１９８６；　Ｙａｍａｍｏｔｏ、　Ｔ、ら、Ｎａｔｕｒｅ 　３１９　：　２３０−２３４．　１９８６）　、　ｎ　ｅ　ｕレセプター及び ＥＧＦレセプターはいずれも、システィンに富む構造体を細胞外ドメインに有し ており、この構造体は単一の膜貫通アミノ酸伸長部を介して、酵素機能を有する 大きな細胞質ドメインに結合されている。ｎｅｕレセプターの腫瘍原性たる可能 性は、膜貫通領域における点変異（Ｂａｒｇｍａｎｎら、前出）及び細胞質及び 細胞外の両ドメインにある非触媒配列の切欠（ＤｉＦｉｏｒｅ、　Ｐ、　Ｐ、ら 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３７＋　１７８−１８２．２９８７　：　Ｂａｒｇｍａ ｎｎ、Ｃ，Ｉ、及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、　Ｒ，＾、、　ＥＭＢＯＪ、　７　：　 ２０４３−２０５２．１９８８）を含む複数遺伝機構によって顕在化され得る。

ヒト癌の病因論において示唆されている腫瘍原性活性化の第３の機構は、見掛は 上正常な遺伝子の過剰発現を含む。

ｎｅｕレセプターの増幅及び過剰発現が、数種の組織由来のヒト腺癌に高い頻度 で検出されている（　Ｋｒａｕｓ、　Ｍ、　Ｈ，ら。

ＥＭＢＯＪ、６　：　６０５−６１０．　１９８７　；　Ｓｌａｍｏｎ、ＤＪ、 ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３５　：　１７７−１８２．　１９８７　；　Ｖａｒ ｌｅｙ、１．Ｍ、ら、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１　：　４２３−４３０、　１９８ ７　；　Ｖａｎ　ｄｅ　Ｖｉｊｖｅｒ、Ｍ、ら、Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 ７：　２０１９−２０２３．１９８７）。更に、遺伝子の増幅及び過剰発現と臨 床徴候との関係が乳癌及び卵巣癌において報告されている（　Ｓｌａｍｏｎら、 前出ＨＶａｒｌｅｙら、前出；　Ｖｅｎｔｅｒ、　Ｄ、　Ｊ、ら、　Ｌａｎｃｅ ｔ　ｉｉ　：　６７−７２．　１９８７　；　Ｚｈｏｕ、Ｄ、ら、　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅｓ、　４７　：　６１２３−６１２５．　１９８７　；　Ｂｅｒｇｅｒ 、Ｍ、Ｓ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８　：　１２３８　：　１２４３、 　１９８８　；　Ｔｓｕｄａ、　Ｈ，ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９：　 ３１０４−３１０８．　１９８９　；　Ｓｌａｍｏｎ、　Ｄ、　Ｊ、ら、　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２４４　：　７０７−７１２．　１９８９）　、　ｎ　ｅＵレセプ ターが上記悪性疾患に関与し得る可能性と一致し、実験モデルにおいてこのレセ プターを過剰発現させると、表現型に形質転換が見られる（　ＤｉＦｉｏｒｅら 、前出；　Ｈｕｄｚｉａｋ。

Ｒ］、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾８４　：　７１５ ９−７１６３．　１９８７）。

過剰発現されたｎｅｕタンパク質が形質転換し得る原因たる機構は知られていな いが、リガンド不在下での固有チロシンキナーゼの構成的活性がこれに関与し得 る（　Ｌｏｎａｒｄｏ。

Ｆ、ら、Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、２：　９９２−１００３．　１９９０）　。

ｎｅｕレセプターとＥＧＦレセプターとの同時過剰発現は、醤歯動物線維芽細胞 を相乗的に形質転換しく　Ｋｏｋａｉ、　Ｙ。

ら、　Ｃｅ１ｌ　５８：　２８７−２９２．１９８９）　、ヒト癌においても認 められている（　Ｈａｒｒｉｓ、　Ａ、　Ｌ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｎｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｖｏｌ、７．　Ｆｕ ｒｔｈ、Ｍ、及びＧｒｅａｖｅｓ、　Ｍ、編、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［］ ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９；　Ｇｕｌｌｉｃｋ 、ｌ、Ｊ、、　Ｉｎｔ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、５ｕｐｐ１．５．　ｐｐ、５５−６１．１９９０）　ｏ　２ つのレセプターの協同作用は恐らく、ｎｅｕレセプターにおけるＥＧＦレセプタ ーの調節移行作用（ｔｒａｎｓｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ）によって 行われ、これにはｎｅｕレセプターのチロシンリン酸化の増加が含まれる（　５ ｔｅｒｎ、　Ｄ、　Ｊ、及びＫａｒａｐｓ、Ｍ、Ｐ、、　ＥＭＢＯＪ、７　：　 ９９５−１００１．　１９８８　；　Ｋｉｎｇ、Ｃ，Ｒ，ら、ＥＭＢＯＪ、７　 ：　１６４７−１６５１、　１９８８　；　Ｋｏｋａｉ、　Ｙ、ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５：５３８９−５３９３．１９８８）。

機構的には、これらの相互作用はＥＧＦレセプターとｎｅｕレセプターのへテロ ダイマー化によって行なわれる（　Ｇｏｌｄａ＋ａｎ、　Ｒ，ら、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　２９　：　１１０２４−１１０２８、　１９９０　；　Ｗａｄ ａ　Ｔ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６１　：　１３３９−１３４７．　１９９０）。

上記知見は、ｎｅｕレセプターが、ＥＧＦレセプターサブファミリーに属する他 のレセプターチロシンキナーゼ、例えばｅｒｂＢ−３タンパク質（Ｋｒａｕｓ、 　Ｍ、　Ｂ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｆ、ＵＳＡ　８６　 ：　９１９３−９１９７．　１９８９　；　Ｐｌｏｗｍａｎ、　Ｇ、　Ｄ、ら、 　Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　８７：　４９０５−４９０９．１９９０） によって調節され得る可能性を生起するものである。

ＥＧＦ様モチーフを共通に有する多数のリガンド分子（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、　 Ｇ、及びＣｏｈｅｎ、Ｓ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：　７７０９ −７７１２、１９９０）を有することが公知のＥＧＦレセプターに対して、ｎｅ ｕレセプターと直接相互作用するりガントはこれまで完全には特性化されていな い。ｒａｓ形質転換線維芽細胞の培地中にｎｅｕリガンドの候補が存在すると報 告されている（　Ｙａｒｄｅｎ、　Ｙ、及びｆｅｉｎｂｅｒｇ、ＲｌＡ、、　Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾Ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：　３１７９−３１８８ ．１９８９）　。このリガンド供給源から、ｎｅｕレセプターのチロシン残基の リン酸化を増大する能力に基づき、因子が部分精製された（　Ｙａｒｄｅｎ、　 Ｙ。

及びＰｅ１ｅｓ、Ｅ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０　：　３５４３−３ ５５０．１９９１）　ｏこの活性は、クロマトグラフィーでは３０−３５　ｋＤ ａタンパク質として挙動する、熱安定性のジスルフィドを含む糖タンパク質に該 当する。別のリガンドアッセイを使用することにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒ ト乳癌細胞の培地から３０ｋＤａ糖タンパク質が単離され（Ｌｕｐｕ、　Ｒ，ら 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：　１５５２−１５５５．１９９０）　、形質転換 ヒトＴ細胞培地からは別の因子が部分精製されている（　Ｄｏｂａｓｈｉ、　Ｋ 、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８　：　８５８２−８５８６．１９９１）。

最近、ｒａｓ形質転換ラッうッ維芽細胞のならし培地から、ｎｅｕレセプターを 刺激すると共に見掛は上それに結合する因子が均一に精製されている。ヒト乳癌 細胞において試験したところ、約４４ｋＤａタンパク質である該因子は、成熟孔 分泌細胞への分化を誘導し得た（　Ｐｅ１ｅｓ、　Ｅ、ら、　Ｃｅ１１６９　： 　２０５−２１．６．１９９２）。

発明の要約 本発明によれば、新規の非天然ｎｅｕレセプター刺激因子及び該因子の全部また は一部をコードする単離ＤＮＡ配列が提供される。本発明の因子は、天然因子の １種以上の生物学的活性（例えば、ヒトｎｅｕレセプター刺激因子、ヒト乳癌細 胞分化活性、ヒトレセプター結合を天然ｎｅｕレセプター刺激因子と競合する能 力など）の発現を可能にするのに十分に、天然ｎｅｕレセプター刺激因子（即ち Ｐｅ１ｅｓ、　Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６９　：　２０５−２１６に記載されてい るポリペプチド）のアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を有するポリペプチド である。

天然源から精製されたｎｅｕレセプター刺激因子（本明細書においてはＮＲ３Ｆ ”とも表記する）は、ヒトｎｅＵ原腫瘍遺伝子のポリペプチド産物のチロシンリ ン酸化を刺激し、ヒト乳癌細胞の、成長が停止した孔度生細胞への分化を誘導す る能力（Ｐｅｌｅｓ　Ｅ、ら、　Ｃｅ１１．前出）を有する。

ＮＨ２Ｆの生物学的活性は、ヒト細胞成長及び分化因子としてその役割を発揮し 、種々の治療状況において潜在的な用途を有する。本発明の非天然ｎｅｕレセプ ター刺激因子は、天然ｎｅｕレセプター刺激因子と同じヒト疾患に対して、単独 でも他の療法と組み合わせても有効である。

本発明によって与えられる単離ＤＮＡ配列は、原核性及び／または真核性宿主細 胞における本発明の非天然ｎｅｕレセプター刺激因子（即ち“組換えＮＨ２Ｆ” ）の発現を保証する上で有効である。本発明は特に、プロセッシング前のアミノ 酸配列をコードするＤＮＡ配列、及びプロセッシング後の（成熟）形態のＮＨ２ ＦをコードするＤＮＡ配列を与える。かかるＤＮＡ配列としては以下のものが挙 げられる： （ａ）図４及び図５に示したＤＮＡ配列（それぞれ配列番号３及び配列番号４） 並びにこれらの相補鎖；（ｂ）（ａ）で定義したＤＮＡ配列またはそのフラグメ ントにハイブリダイズするＤＮＡ配列；（Ｃ）遺伝コードの縮重がなかったなら ば（ａ）及び（ｂ）で定義したＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列。

（ｂ）及び（Ｃ）群には特に、（他の哺乳動物種由来のＮＲＳＦを含む）種々の 形態のＮＲＳＦをコードするｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列、並びに、ＮＲＳＦ 、ＮＲＳＦのフラグメント、及びＮＲＳＦの類縁体をコードする人よりＮＡ配列 も含まれる。ＤＮＡ配列は、宿主細胞中でのメツセンジャーＲＮＡの転写及び翻 訳を容易にするコドンを含み得る。人工配列は、Ａｌ　ｔｏｎらのＰＣＴ出願公 開第ＷＯ３３１０４０５３号明細書の方法に従って容易に構築し得る。

上記のごときＤＮＡ配列を含むベクター、及びかかるベクターを用いて形質転換 またはトランスフェクトされた宿主細胞も提供される。更に本発明は、組換えＤ ＮＡ法によってＮＲＳＦを生産する方法及び組換えＮＲＳＦを使用して疾患を治 療する方法をも提供する。組換えＮＲＳＦ及び組換えＮＲＳＦを用いて生産され た抗体を含む医薬組成物も提供される。

図面の簡単な説明 図１は、Ｐｅ１ｅｓら、　Ｃｅ１ｌ、前出の方法に従うｒａｓ形質転換ラッうッ 維芽細胞によって調整した培地から精製した天然ｎｅｕレセプター刺激因子のト リプシン消化の高圧液体クロマトグラムを示す。溶出分布を示すと共に、各ピー クに対応するフラクションから得られたアミノ酸配列を慣用の一文字表示で示す 。かっこ内のアミノ酸はアスパラギン結合グリコジル化部位を表わしており、点 線は、アミノ酸を同定しなかった延長配列を表わしている。四角枠内は、ジチオ トレイトール還元後２７．３分のピークのクロマトグラフィー分離を示している 。

図２は、哺乳動物ＣＯ３−７細胞発現ベクターｐ　Ｊ　Ｔ−２／ＮＲ３Ｆの構造 を示す。ラットＮＲ３Ｆ　ｃＤＮＡ挿入物とは図５のクローン４４　ｃＤＮＡ配 列（配列番号４）である。

図３は、組換えＮＲＳＦによるヒトｎｅｕレセプターチロシンリン酸化の刺激を 示す。ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞を、表示の部分精製ｃＤＮＡクローン （左側部分）または完全精製ｃＤＮＡクローン（右側部分）を用いてトランスフ ェクトしたＣＯ３−７サル細胞由来の濃縮ならし培地を用いてインキュベートし た。陽性対照は１０ｎｇ／ｍｌ（左側レーン）及び１００　ｎｇ／　ｍｌの精製 天然ラットＮＲ８Ｆを含んだ。陰性対照は、トランスフェクトしていないＣ０８ −７細胞によって（ＣＯ８”と記したレーン、）または未開連ｃＤＮＡ（“クロ ーン２７”及び“クローン２９”と記したレーン）を含むｐ　Ｊ　Ｔ−２プラス ミドを用いてトランスフェクトした細胞によって調整した濃縮培地か、なにも添 加していない濃縮培地（“Ｎ０ＮＥ″）からなった。刺激したＭＤＡ−ＭＢ−４ ５３から溶解物を調製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。抗ホスホチロシンウェ スターンプロットのオートラジオグラムを、分子量マーカータンパク質の位置を キロダルトン（ｋＤａ）で与えて示す。クローン４．１９及び４４に対し、０． １％ＢＳＡを含む合計量０．１２５ｍ１のＰＢＳ中で０．０１ｍ１（左側レーン ）及び０．１１１（右側レーン）のＣ０８−７上清を使用した。精製クローンの 分析は、０．２１１の細胞上清または表示のものを含む合計量０．２５ｍ１にお いて実施した。

図４（配列番号３）は、ラットＮＲ３Ｆ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定 アミノ酸配列を示す。４つのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を合わせて示 しである。

クローン４４のＤＮＡ配列の開始を特に矢印で示す。ヌクレオチド番号及びアミ ノ酸番号はそれぞれ左側及び右側に縦に並べて与えである。Ｎ結合糖タンパク質 の可能性のある部位はアスタリスクで印してあり、推定細胞外ドメインに認めら れるシスティン残基は円で囲んである。上に引いた線は、精製した天然ＮＲ３Ｆ から直接決定されたペプチド配列を示す。下線は膜貫通領域と考えられる部分を 示しており、破線の下線はポリアデニル化部位を示す。免疫グロブリン（Ｉｇ） 相同単位及び上皮成長因子（ＥＧＦ）様モチーフを含むタンパク質配列の部分は 右側に示しである。

図５（配列番号４）は、ＮＲＳＦ　ｃＤＮＡクローン４４のヌクレオチドと推定 アミノ酸配列とをそれぞれ示す。

ヌクレオチド番号は右側に縦に与えである。

図６は、ラットｎｅｕレセプター刺激因子の前駆体のヒトロバシー（ｈｙｄｒｏ ｐａｔｈｙ）分布を示す。Ｋｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、　Ｊ、ｍｏｌ、Ｂ ｉｏｌ、　１５７　＋　１０５−１３２　（１９３２）の方法を、９アミノ酸残 基のウィンドウサイズで使用した。正値は疎水性が高いことを示す。分布の下に はアミノ酸番号を与えである。

図７は、ラットＮＲ３Ｆ　（配列番号５）のＥＧＦ様ドメイン及びフランキング カルボキシ末端のアミノ酸配列を、ＥＧＦファミリーの代表的なメンバーと並べ て示すものである。整列及び番号付けは、ＥＧＦモチーフの最もアミノ末端側に あるシスティン残基がら開始した。アミノ酸残基は一文字コードで示す。ハイフ ンは、最も多く揃うよう導入されたギャップを示す。ＮＨ２Ｆの対応アミノ酸と 同一であることを示すには、残基は四角で囲んである。下線は、一部のＥＧＦモ チーフのカルボキシ末端側にフランクしている推定膜貫通ドメインのアミノ末端 部分を示す。アスタリスクはカルボキシ末端を示す。以下のタンパク質をＮＨ２ Ｆと比較した：ラット形質転換成長因子α（ＴＧＦα（配列番号５　）　）　、 　Ｍａｒｑｕａｒｄｔ、Ｈ，ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２３　：　１０７９−１ ０８２、１９８４；ヒトアンフィレグリン（ＡＲ（配列番号７））、　５ｈｏｙ ａｂ、Ｍ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３　：　１０７４−１０７６、１９８９ 　；ヒツジ線維腫ウィルス増殖因子（ＳＦＧＦ　（配列番号８））、Ｃｈａｎｇ 、　Ｗ、ら、　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７　＋　５３５−５４０． １９８７　；粘液腫ウィルス増殖因子（ＭＧＦ　（配列番号９）　）　、　Ｕｐ ｔｏｎ、Ｃ，ら。

ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　６１　：　１２７１−１２７５．１９８７　；　７ウスＥＧ Ｆ　（配列番号１　０　）　、Ｇｒａｙ、Ａ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：　 ７２２−７２５．　１９８３．　５ｃｏｔｔ。

Ｊ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２１　：　２３６−２４０．１９８３　；ヒトヘ パリン結合ＥｃＦ（ＨＢ−ＥＧＦ　＜配列番号１１　）　）　、　Ｈｉｇａｓｈ ｉ’ｙａｍａ、Ｓ。

ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５１　；　９３６−９３９．１９９１）　；ラット神 経鞘腫誘導成長因子（ＳＤＧＦ　（配列番号１２　）　）　、　Ｋｉｉ＋ｕｒａ 、Ｈ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：　２５７−２６０．１９９０）　；及びワタ シニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ　（配列番号１３　）　）　、　Ｂｌｏｍｑｕ ｉｓｔ、Ｍ、Ｄ、ら。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８１　ニア３６３−７ ３６７、１９８４゜図８は、ラットＮＲ８Ｆの免疫グロブリン様（Ｉｇ）様ドメ イン（配列番号１４）を、免疫グロブリンスーパーフッ細胞接着分子（配列番号 １５　）　（ＮＣＡＭ　；　Ｂａｒｔｈｅｌｓ、Ｄ、ら、ＥｌｌＢＯＪ、　６： ９０７−９１４．１９８７）の４番目のＩｇ関連配列と並べて示すものである。

０２セツトにおいて高度に保存されている残基を下段に示し、（Ｗｉｌｌｉａｍ ｓ、　Ａ、及びＢａｒｃｌａｙ、＾、、　ＲｅｖＪａ＋ａ＋ｕｎｏ１．６　：　 ３８１−４０５．１９８８に従い）スーパーファミリーを超えて保存されている 箇所を上の線で示す。免疫グロブリンドメインから類推して、β鎖形成に関与し 得るアミノ酸部分には太い下線を引き、符号Ｂ−Ｆを付した。四角は、ＮＨ２Ｆ 及びＮＣＡＭにおいて同一の残基を示す。ハイフン（ギャップ）は最も多く揃え るために導入した。

図９は、ｎｅｕレセプター刺激因子の前駆体の推定二次構造及び膜の向きの概略 図である。免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン及び上皮成長因子（ＥＧＦ）モチー フに対応する位置は太線で示されており、それらのシスティン残基は円で示され ている。１ｇドメインのジスルフィド結合はアミノ酸配列分析（実施例ＩＤ）で 直接示され、ＥＧＦドメインの二次構造はＥＧＦファミリーとの相同性に基づく 。膜貫通ドメインに認められる３つのシスティン残基も示されている。矢印は、 前駆体タンパク質の（ラットＮＲ３Ｆタンパク質のＮ末端配列決定に基づ（）ア ミノ末端におけるプロセッシング部位と、形質膜に近い推定タンパク質分解部位 とを表わす。分岐線は、Ｎ−グリコジル化部位と立証された位置を示し、短い横 線は推定Ｏ−グリコジル化部位を表わす。

図１０は、ｒａｓ形質転換ラッうッ維芽細胞ならし培地から精製された放射性標 識天然ｎｅｕレセプター刺激因子（“”’Ｉ−ＮＲ８Ｆ”）を使用したレセプタ ー競合アッセイを示す。標識ＮＲ３ＦをヒトＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞と一 緒に、組換えｎｅｕレセプター刺激因子じＣ−ＮＲＳＦ″）または組換えＴＧＦ αじＣ−ＴＧＦα”）のいずれかを発現するＣＯ３−７細胞由来のならし培地の 不在下（“Ｎ０ＮＥ“）または存在下でインキュベートした。細胞に結合した放 射能を平均±Ｓ、Ｄ、（ｎ＝３）で示す。

図１１は、別のレセプター競合アッセイを示す。Ｉ！ＢＩ標識天然ＮＲ８Ｆをヒ トＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞と一緒に、未標識の“低温型（ｃｏｌｄ）　”天然 ＮＲ８Ｆ　（”ＮＲＳＦ’；　２００　ｎｇ／ｍｌ）　、または図２のＮＲＳＦ 発現プラスミド（“Ｃ−ＮＨ２Ｆ”）もしくはＴＧＦαコーディングベクター（ “Ｃ−ＴＧＦα”）のいずれかでトランスフェクトしたＣＯ３−７細胞によって 調整した培地の不在下（“Ｎ０ＮＥ”）または存在下においてインキュベートし た。ＢＳ３で架橋した後、細胞を溶解し、ｎｅｕレセプタータンパク質をモノク ローナル抗体を使用して免疫沈降した。ポリアクリルアミドゲル分離した免疫複 合体のオートラジオグラム（３日間露光）を示す。マーカータンパク質の分子量 をｋＤａで示す。推定レセプターダイマーはほとんど放射性標識された。

図１２は、クローン４４　ＮＨ２Ｆ　ｃＤＮＡをプローブとして使用し、培養細 胞（パネルＡ及びＣ）または生体ラットの新規単離組織から単離したｍＲＮＡの ノーザンブロットから得られたオートラジオダラムを示す。このオートラジオダ ラムは、フィルムに３時間（パネルＡ）または２４時間（パネルＢ及びＣ）！露 した後に得られたものである分子量はキロベースで示す。分子量推定は、ＧＩＢ ＣＯＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｆｅｓ、Ｉｎｃ、　（Ｇａｉｔｈｅ ｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）製のマーカー分子の混合物を使用して実施した。

発明の詳細 な説明のＤＮＡ配列は、種々の組換え法によってＮＲＳＦを大規模合成する上で 有効な製品として価値がある。即ち、本発明によって与えられるＤＮＡ配列は、 新規の有効なウィルス及び環状プラスミドＤＮＡベクター、新規の有効な形質転 換及びトランスフェクトされた原核性及び真核性宿主細胞（培地中で増殖された 細菌及び酵母細胞並びに哺乳動物細胞を含む）、並びにＮＲＳＦ及びその関連産 物を発現し得る宿主細胞を培養増殖する新規の有効な方法を生み出す上で有用で ある。

本発明のＤＮＡ配列は、ＮＲＳＦをコードするヒトｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ、 並びに他の哺乳動物種のｃ　ＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ配列を含む、関連タンパク 質をコードする他の遺伝子を単離する際のプローブとして使用するのに適した材 料でもある。ＤＮＡ配列は、（例えば昆虫宿主細胞における）種々の別のタンパ ク質合成方法またはヒト及び他の哺乳動物における遺伝子治療にも有効となり得 る。

本発明のＤＮＡ配列は、ＮＲ３Ｆ生産に真核性“宿主”として作用し得るトラン スジェニック哺乳動物種を開発したり、ＮＲ８Ｆ産物を大量に生産する上で有効 であることが期待される。一般にＰａ１ｍ１ｔｅｒら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２ ２．８０９−８１４（１９８３）参照。遺伝子の変異並びにｍＲＮＡの構造及び 発現レベルの検出など、本発明のＮＲＳＦ　ＤＮＡ配列の診断用途も考えられる 。

本発明の組換えＮＲＳＦは、特に慣用方法に従って自己複製ＤＮＡプラスミドま たはウィルスベクター上に担持された外来ＤＮＡ配列を使用し、ゲノムもしくは ｃＤＮＡクローニングまたは遺伝子合成によって得られた外来ＤＮＡ配列の（例 えば培養物中の細菌、酵母、高級植物、昆虫または哺乳動物細胞による９原核性 または真核性宿主発現産物であることを特徴とする。典型的な酵母（例えばＳａ ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または原核性（例えばＥ、　 ｃｏｌｉ）宿主細胞における発現産物は哺乳動物タンパク質と関連はない。

を推動物（例えばヒト以外の哺乳動物（例えばＣＯ８またはＣＨＯ））細胞にお ける発現産物はヒトタンパク質と関連はない。使用する宿主に従い、本発明の組 換えＮＲＳＦは哺乳動物または他の真核生物炭水化物によってグリコジル化され ていてもよいし、グリコジル化されていな（でもよい。本発明の組換えＮＲＳＦ は最初のメチオニンアミノ酸残基を（−１位に）含み得る。

本発明は更にＮＲＳＦのポリペプチド類縁体のごとき産物をも含む。かかる類縁 体はＮＲＳＦのフラグメントを含む。公知の方法に従い、１つ以上の残基の種類 または位置に関して本明細書に定義のものとは異なる一次構造（例えば置換、末 端及び中間の付加、並びに欠失）を有する関連ポリペプチドをコードする遺伝子 を容易に設計及び製造し得る。或いは、ｃＤＮＡ及びゲノムヌクレオチド配列の 修飾を公知の部位特異的突然変異誘発によって容易に行い、これを使用してＮＲ ＳＦの類縁体または誘導体を生成し得る。かかる産物は天然ＮＲ５Ｆの生物学的 特性を１つ以上は共通に有するが、他の点では異なり得る。例を挙げると、本発 明の産物は、例えば欠失によって短縮されたちの；加水分解に対してより安定な もの（従って天然ＮＲ３Ｆより増強された作用またはより長期持続性の作用を有 し得る）；０−グリコジル化及び／またはＮ−グリコジル化の可能性がある１つ 以上の部位を欠失するよう変性されたちの：１つ以上のシスティン残基が欠失も しくは他の残基、例えばアラニンもしくはセリン残基で置換されており、微生物 系から活性形態でより容易に単離し得る可能性があるもの；または、１つ以上の チロシン残基がフェニルアラニンによって置換されており、標的タンパク質また は標的細胞レセプターに程度の差こそあれ容易に結合するものであり得る。

ＮＲ８Ｆ内の連続アミノ酸配列または二次構造の一部のみを重複して有し、ＮＲ ＳＦの１つの特性は有するが他の特性は有さないポリペプチドフラグメントも含 まれる。１つ以上の本発明の産物が、治療的有用性、またはＮＲＳＦ拮抗作用の ごとき他の状況における有用性を有するうえで、上述の活性は必要でないことは 特記に値する。競合アンタゴニストは、例えばＮＲＳＦの過剰産生の場合にかな り有効となり得る。

本発明は更に、ＮＲＳＦのヒトｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列のタンパク質コ ーディング鎖に相補的なりＮＡの部分によってコードされる種類のポリペプチド をも含む。

ｎｅｕレセプター発現に関連する生物学的疾患を治療する上で有効な医薬組成物 であって、治療有効量の本発明のポリペプチド産物と、適当な希釈剤、保存剤、 可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／または組換えＮＲ３Ｆ療法に有効な担体 とを含む組成物も本発明に含まれる。本明細書において使用される“治療上有効 量”とは、所与の病状及び投与方式において治療効果を与える量を指す。かかる 組成物は、種々の緩衝能（例えばＴｒｉｓ　−ＨＣＩ、アセテート、ホスフェー ト）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤；洗剤及び可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ　８ ０、Ｐｏ１ｙｓｏｒｂａｔｅ　８０）　、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メ タ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばＴｈ１ｍ、ｅｒｏｓｏｌ、ベンジルア ルコール）及び増量剤（例えばラクトース、マンニトール）などの添加剤；１ｎ ｖｉｖｏ半減期を延長し且つ効力を増強するためにポリペプチドに共有結合する ポリマー（例えばポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールとポリプ ロピレングリコールのコポリマーのごとき水溶性ポリマー、Ｄａｖ　ｉ　ｓらの 米国特許第４．１７９．３３７号明細書参照）：ポリ乳酸、ポリグリコール酸な どのポリマー化合物の粒剤形態またはリポソーム中への配合材料を含む。かかる 組成物は、組換えＮＨ２Ｆの物理的状態、安定性、ｉｎ　ｖｉｖｏ放出速度、及 びｉｎ　ｖｉｖｏクリアランス速度に影響する。

本発明の非天然ｎｅｕレセプター刺激因子は、ｎｅｕレセプターを表面に発現す る細胞を含む疾患及び症状を治療する際、単独でも他の療法と組み合わせても有 効であるとことが期待される。特に本発明の組換えＮＨ２Ｆは所定のヒト癌細胞 における成長阻害及び分化因子として有効であり、乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び 胃癌を含む、ｎｅｕレセプター発現に関連する種々のタイプの腫瘍の治療に適用 可能である。

本発明因子は、放射性標識分子、毒素、サイトカイン、及び腫瘍治療に有効な他 の化合物のごとき物質と組合せ、これらの物質を、高レベルのｎｅｕレセプター を発現するヒト腫瘍により集中させ得る。

他の生物学的または治療的用途も考えられる。例えば、胃腸管、気道、尿路及び 生殖路、並びに皮膚の正常ヒト上皮細胞はそれらの表面上にｎｅｕレセプターを 発現する（　Ｐｒｅｓｓら、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５：　９５３−９６２．　１ ９９０）　ｏこのレセプターに結合するかまたはこれと相互作用し、細胞成長ま たは代謝を変性する物質は、細胞の再集成（ｒｅｐｏｐｕｉａｔｉｏｎ）が必要 な状況、即ち細胞破壊をもたらす肉体的損傷後や、細胞の代謝活性または細胞成 長及び分化から生じる特性、例えば皮膚の毛包から再生される毛髪の成長を増大 または刺激することが所望される状況に有効である。

本発明のポリペプチドは、治療すべき特定の疾患、個々の患者の病状、該因子の 送達部位、投与方法、及び当業者には公知の他の環境に従って調製及び投与され る。このために、組換えＮＨ２Ｆまたは類縁体もしくは誘導体の有効量とは、細 胞増殖及び分化を変える、即ちポリペプチドが投与される目的の症状を防止、悪 化低減、緩和または治癒するのに有効な量である。本発明のポリペプチドの活性 は、本発明のポリペプチドが投与される目的の同じ病状を治療する上で有効であ ることが公知の１種以上の別の生物学的有効物質、例えば癌治療用ＩＬ−２、血 小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、創傷治癒因子などの使 用により増強または補助され得る。

特定の実施態様 以下の非限定的な実施例によって本発明を説明する。これらの実施例に使用され る生物材料は次のように入手した。

ｎｅｕレセプターのカルボキシ末端に対するモノクローナル抗体（Ａｂ−３）は Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　（Ｌｌｎｉｏｎｄａｌｅ、　ＮＹ）から得 た。ホスホチロシンに対するモノクローナル抗体ＰＹ２０はＡａ＋ｅｒｓｈａｍ 　（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、几）から得た。

ヒトカゼイン（タイプβ及びに）に対するマウスモノクローナル抗体はＲ，Ｃ， Ｃｏｏｍｂｓ　（Ｃｈａｒｉｎｇ　Ｃｒｏｓｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｏｏｌ。

Ｌｏｎｄｏｎ）からの寄贈であった。ＡＵ−５６５ヒト乳癌細胞はＣｅ１ｌ　Ｃ ｕ１ｔｕｒｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎａｖａｌ　５ｕｐｐｌｙ　Ｃｅｎｔ ｅｒ　（Ｏａｋｌａｎｄ、　、Ｃ＾）から得た。Ｒａｔｌ−ＥＪ細胞系（ＡＴＣ ＣＣＲＬ　１０９８４）は、Ｐｅ１ｅｓ、　Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６９：　２０ ５−２１６．　１９９２及びＬａｎｄ、　Ｈ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３０４　： 　５９６−６０２．１９８３に記載のごと（ヒトＥＪ　ｒａｓ腫瘍遺伝子をＲａ ｔｌ線維芽線維生細胞中ンスフェクトすることにより作製した。Ａｍｅｒｉｃａ ｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 　ＭＤ）から以下の細胞系を得た＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１　（ＡＴＣＣＨＴＢ　 ２６）　、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣＨＴＢ　１３１）、Ｈｓ　２９４Ｔ 　（ＡＴＣＣＨＴＢ　１４０）　、５Ｋ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣＨＴＢ　３０）　 、ＨＴ−１０８０（ＡＴＣＣＣＣＬ　１２１）、ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３　（ＡＴ ＣＣＣＲＬ　６５８７）及びＣ０８−７（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ　１６５１　）　、 　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎによっ て推奨される通り、即ち１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、　Ｌｏｇａｎ。

Ｕｔａｈ）を補充したダルベツコ改良イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　 ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）中で細胞を培養した。

実施例１ 天然ラットＮＲ８Ｆのアミノ酸配列分析Ａ、トリプシン消化 ｒａｓ形質転換ラッうッ維芽細胞（Ｒａｔｌ−ＥＪ細胞）によって調整した培地 から約４４ｋＤａの天然ＮＦＳＦ糖タンパク質を精製し、アミン末端を配列決定 することがＰｅ１ｅｓ、Ｅら、　Ｃｅ１ｌ　６９　：　２０５−２１６（１９９ ２）に記載されている。複数の独立のオリゴヌクレオチドプローブを設計するた めにより多くのアミノ酸配列情報を得るよう、３００　ｐｍｏｌの精製ラットタ ンパク質をトリプシンを用いて以下のように部分タンパク質分解した。１０μｇ のタンパク質を２００μｍの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，８） 中で再構成した。Ｌ−１−１−シルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケ トンで処理したトリプシン（５ｅｒｖａ）を酵素対基質比１：１０で用いて３７ ℃で１８時間消化した。

Ｂ、ＨＰＬＣによるトリプシン消化物の分離得られたペプチド混合物を逆相ＨＰ ＬＣによって分離し、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４？イクロカラム（内径２．１！ＩＩＸ　 １５ｃｔｒ、３００人）、並びにダイオードアレー検出装置及びワークステーシ ョンを備えたＨＰ　１０９０液体クロマトグラフィー装置を使用して２１５ｎｍ でモニターした（図１）。カラムを０．１％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）で平 衡化し、０〜５５％移動相Ｂ（０゜１％トリフルオロ酢酸中９０％アセトニトリ ル）の直線濃度勾配を用いて７０分間溶出した。流速は０　、２　ｍｌ／分とし 、カラム温度は２５℃に調節した。３つの吸収ピークが極めて早期に（保持時間 ５分未満に）カラムから溶出したが、これは、かかる３つのフラクションが短ペ プチドに対応することを示している。３つの他の主フラクション、即ち１３分後 に溶出した第１フラクシコン（７１３，３）　、２１分後に溶出した第２フラク シヨン（Ｔ２１．８）、及び２７分後に溶出した第３フラクシコン（Ｔ２７．３ ）をアミノ酸配列決定のために回収した。

Ｃ１溶出したペプチドフラクションの配列決定上記３つの主溶出フラクションに 対応するペプチドのアミノ酸配列を、自動エドマン分解によって決定した。ペプ チドのアミノ酸配列分析は、オンラインフェニルチオヒダントイニル（ＰＴＨ） アミノ酸アナライザー及びモデル９００データ分析システム（Ｈｕｎｋａｐｉｌ ｌｅｒ、　Ｍ、　？、ら、輩ｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｍｉｃｒｏｃ ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃ１１ｆｔｏｎ 、　ＮＪ、　ｐｐ、２２３−２４７．１９８６）を備えたモデル４７７タンパク 質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ、Ｉｎｃ、、　Ｆ ｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾）を使用して実施した。トルフルオロ酢酸処理し ポリブレン及びＮａＣ１を用いてプレサイクルしたガラスファイバディスク上に 、タンパク質を載せた。ニシリンジポンプ及び逆相（Ｃ−１８）細腔カラム（Ａ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、２．１ｍｍＸ　２５０１１１１１）を使 用し、マイクロ液体クロマトグラフィー装置（モデル１２０）を用いてＰＴＨア ミノ酸分析を実施した。第１フラクシヨン（Ｔ１３．３）は、３及び４アミノ酸 の長さを有する２つの区別可能な主配列シグナル（シグナル比５：１）を与えた （これらの配列は図１に示す）。第２フラクシヨン（Ｔ２１．８）は、既に決定 されている一次Ｎ末端アミノ酸配列（Ｐｅ１ｅｓら、前出、８番目の残基がアル ギニン）の残基番号９から始まる単一配列を与えた。ペプチド７２１．８の配列 は、全タンパク質のＮ末端配列分析から得られた情報を立証すると共に、未同定 残基として報告されている１７位をアスパルテートと同定した。第３フラクシヨ ン（Ｔ２７．３）は、工２サイクルまでのニドマン配列決定で３つの別個の配列 シグナルを与え、またサイクル１３〜２４で１つの明らかな配列を与えたが、こ れは、この第３のペプチドがより長いことを示している。

フラクションＴ２７．３の同時溶出ペプチドのアミノ酸配列を正確に決定するた め、該フラクションのアリコートを以下のように処理した。ペプチドフラクショ ンの７０％アリコートを真空下に乾燥し、１００μｍの０．２Ｍ重炭酸アンモニ ウム緩衝液（ｐＨ７，８）中で再構成した。この溶液にジチオトレイトール（終 濃度２ｍＭ）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。還元したペプチド 混合物を、Ｖｙｄａｃカラム（内径２．１ｍｍＸ１５ｃｍ）を使用する逆相ＨＰ 　Ｌ　Ｃによって分離した。溶出条件及び流量は前述のものと同一とした。

２つの主ペプチドピークを回収し、前述のごとき自動エドマン分解によって配列 決定し、Ｔ３４．４．１１残基アルギニンペプチド及びＴ４０．４．１２アミノ 酸長リシンペプチド（図１の四角枠内）を得た。ペプチドＴ３４．４の残基１及 びＴ４０．４のサイクル１１は依然として同定されず、これは、それらがフラク ションＴ２７，３のペプチドのジスルフィド結合に関係するシスティン残基であ り得ることを示している。この可能性は、ＡＰｉｍ質量分析計（ＳＣＩＥＸ、　 Ｔｏｒｏｎｔｏ、カナダ）を使用する電子衝撃質量分析によって確認された。両 ペプチドＴ３４．４及びＴ２Ｏ，４を分析し、それぞれ１２６１．５及び１２７ ４．０の平均質量値を得た。従って、これら２つのペプチドは天然タンパク質に おいてはジスルフィド結合によって相互に保持されていると結論された。かかる データをもとに、ピークＴ２７．３の混合配列シグナルを再検査し得る。ペプチ ドＴ３４．４及びＴ２Ｏ，４の配列をフラクションＴ２７゜３の混合シグナルか ら抜き去ると、より長い第３のペプチドの配列が最初の１２サイクルで明らかと なった。長さ２４アミノ酸のこのペプチドの推定配列を図１に示す。このペプチ ド配列の９番目のアミノ酸はアスパラギンと同定されたが、収量ははるかに低く （配列シグナルの約１０％）、これはＮ結合グリコジル化部位を示している。

天然ＮＲ８Ｆの分子量及びその分子量の約４分の１が糖部分で占められているこ と（Ｐｅ１ｅｓ、　Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６９　：　２０５−２１６、１９９２ ）を鑑みると、部分タンパク質分解後に数個のペプチドしか回収されないことは 予想外であった。１つ考えられることは、天然タンパク質が、タンパク質分解の 間は無傷のままであったが、変性を受け、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって 分離されなかったプロテアーゼ耐性コア領域を含むということである。

実施例２ ラットＮＲ３ＦをコードするｃＤＮＡのクローニングＡ、ｃＤＮＡライブラリー の構築 標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ：　Ａ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　１９ ８２）によってＲａｔｌ−ＥＪからＲＮＡを単離し、“ｍＲＮＡセパレーター” キット（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ、、　Ｐａ１ｏ　Ａ ｌｔｏ、　ＣＡ）を使用してポリ（Ａ）”ｍ　ＲＮ　Ａを選択した。“５ｕｐｅ ｒｓｃｒｉｐｔ”キット（ＧＩＢＣＯＢＲＬ　Ｌｆｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を用いてｃＤＮＡを合 成した。カラム分画した二本鎖ｃＤＮＡを５ａｌｌ及びＮｏｔｌ消化したｐ　Ｊ 　Ｔ−２プラスミドベクターに連結し、図２に示したようなｃＤＮＡ挿入物を含 むプラスミドを得た。ｐ　Ｊ　Ｔ−２プラスミドベクターはＶ２Ｏ。

８ヘクター（八ＴＣＣ６８１２４）カラ誘導シタ。特＋：ｖｉ９．ｓのＨｉ　ｎ 　ｄ　ｍ及び５ａｃｌｌクロ一ニング部位を合成オリゴヌクレオチドリンカーを 使用してＳａｌ！及びＮｏｔ１部位に変換し、ｐ　Ｊ　Ｔ−２ベクターを得た。

ｃＤＮＡ挿入物を含むプラスミドをＤＨＩＯＢ　Ｅ、ｃｏｌｉ細胞中にエレクト ロポレーションによって形質転換した（　Ｄｏｗｅｒ、　ｆ、　Ｊ、ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　６１２７−６１４５．１９ ８８）。

Ｂ、ｃＤＮＡプローブの調製及びクローンの単離的５Ｘ１０５の一次形質転換体 を、実施例ＩＣに記載のごときＮＲＳＦのＮ末端領域の結合アミノ酸配列、特に 残基５〜２４　（ＲＧＳＲＧＫＰＧＰＡＥＧＤＰＳＰＡＬＰＰ）（配列番号１） と７４０．４１−リブシンペプチドの残基７〜１２　（ＧＥＹＭＣＫ）（配列番 号２）との組合せをベースとした２つのオリゴヌクレオチドプローブを用いてス クリーニングした。それぞれの配列（アンチセンス方向で示す）は以下の通りで あった（“Ｎ”は４つ全てのヌクレオチドを示す）。

（１）　５’−ＡＴＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣＧＧＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＧＴ ＣＮＣＣＣＴＣＮＧＣＡＧＧＴ ＧＣＣＧＧＧ　ＣＴＴ　ＧＣＣＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＣＴＣＴ−３’　（配列番 号１６）（２）　５’−ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＴＴＣＮＣＣ−３’ 　（配列番号１７）ＣＧ　ＧＣ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成オリゴヌクレオチドをα−３２Ｐ　 −Ａ　Ｔ　Ｐで末端標識し、これを使用してニトロセルロースフィルターの複製 セットをスクリーニングした。ハイブリダイゼーション溶液は、６ＸＳＳＣ，５ ０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，８）　、０．１％ビロリン酸ナトリウム、２ Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０μｇ／ｌｌサケ精子ＤＮＡを含み、更に２０％ ホルムアミド（プローブ１用）を含みか、またはホルムアミドは含まなかった（ プローブ２用）。ハイブリダイゼーションは４２℃（プローブ１）または３７℃ （プローブ２）で１４時間実施した。フィルターを５０℃の０．５　Ｘ　Ｓ　Ｓ 　Ｃ１０，２％ＳＤＳ／２ｍＭＥＤＴＡ　（プローブ１）または３７℃の２ｘＳ ＳＣ１０，２％ＳＤＳ／２ｗＭ　ＥＤＴＡ　（プローブ２）で洗浄した。フィル ターのオートラジオグラフィーにより、１０個のクローンが両プローブにハイブ リダイズしたことが判った。これらのクローンを、前述のごとき再平板培養及び プローブハイブリダイゼーションにより精製した。

実施例３ 実施例２Ｂに記載の一次スクリーニング操作において検出されたｃＤＮＡがＮＲ ３ＦＲ３的転写物に対応することを検証するため、クローンをＣＯ５−７サル細 胞において一時的に発現させた。このために、ｃＤＮＡクローンをｐＪＴ−２真 核性発現ベクター中にＳＶ４０プロモーターの制御下に挿入し、ＳＶ４０終結及 びポリアデニル化シグナルを３′末端にフランキングした。クローン４４　ｃＤ ＮＡを有するｐ、ＪＴ−２／ＮＲ８Ｆプラスミド（図２）を含む得られたプラス ミドを使用し、ＣＯ３−７細胞をエレクトロボーレーションによって以下のよう にトランスフェクトした。０．８１１１ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ ）及び１０％ウシ胎児血清中の６Ｘ１０’個の細胞を０．４ｃｍキュベツトに移 し、１０μｌのＴＥ溶液（１０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ｍＭ 　ＥＤＴＡ）中の２０μｇのプラスミドＤＮＡと混合した。エレクトロボーレー ションは、２００オームにセットされたパルスコントローラーヲ備工たＢｉａＲ ａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ装置を使用し、室温、１６００ポルト及び２５μ Ｆで実施した。次いで細胞を２０ｍ１のＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清で希釈し 、Ｔ７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）内に移した。３７℃で１４時間インキュベー トした後、培地をＤＭＥＭ／１％ウシ胎児血清で置き換え、更に４８時間インキ ュベーションを続行した。

次いで、得られたならし培地を、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞におけるｎ ｅｕレセプターのチロシンリン酸化を刺激する能力について以下のように評価し た。ならし培地を０．２ｔｔ無菌フイルター装置（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ、　Ｍ＾）を通して濾過し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０装置（＾ｔａ ｉｃｏｎ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ。

菖＾）を使用することにより１６倍に濃縮した。濃縮培地を、０．１％ウシ血清 アルブミンを含むリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で希釈し、１ウエル当たり３Ｘ １０ｓ個のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を含む４８ウ工ル皿の個々のウェルに添加 した。３７℃で５分間インキュベートした後、培地を吸引し、ホスホチロシン（ ＰＹ２０）に対するモノクローナル抗体を使用するウェスターンブロッティング 用に細胞を処理した。細胞溶解及びウェスターンブロッティングに使用される方 法はＰｅ１ｅｓ、　Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６９　：　２０５−２１６　（１９９ ２）に記載されている。

分析の結果は図３に示す。トランスフェクトレなかりたＣＯ３−７細胞の培地は チロシンリン酸化を僅かに増加しただけであったが、クローン４４（即ちｐ　Ｊ 　Ｔ−２／ＮＲ８Ｆプラスミド）でトランスフェクトした細胞から回収した培地 は著しく活性であった。従って、クローン４４　ｃＤＮＡを、再平板培養及びフ ィルターハイブリダイゼーションスクリーニングによって完全に精製した。図３ （右側パネル）は、完全精製クローン４４の活性と、ランダムに選択した対照ク ローン２７及び２９の活性との比較を示す。

ＣＯ５−７細胞中にトランスフェクトした後、完全精製クローン４４のｃＤＮＡ は、対照プラスミドまたは部分精製クローン４４を含む部分精製クローンより高 い活性を誘導したことは明らかである。２つの独立のオリゴヌクレオチドプロー ブに対するハイブリダイゼーション（実施例２Ｂ）及び生物学的に活性なＮＲ３ Ｆの合成を誘導する能力をもとに、クローン４４を、ＤＮＡ配列決定による更な る分析のために選択した。

実施例４ ラットＮＲ３ＦｃＤＮＡの配列決定 ３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサー及び＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ’ ｓ、Ｉｎｃ、　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾）製の“Ｔａｑ　ＤｙｅＤｅ ｏｘｙ”　Ｔｅｒ層１ｎａｔｏｒ”サイクルシーフェンシングキットを使用し、 製造業者指示に従ってクローン４４ｃＤＮＡの一次配列を決定した。一部の配列 決定は、”Ｓ　−ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＵｎｉｔｅｄ　５ ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０ｈｉｏ） 製の“５ｅｑｕｅｎａｓｅ””キットを使用し、製造業者指示に従って実施した 。クローン４４のｃＤＮＡの両鏡の配列を、プライマーとして合成オリゴヌクレ オチドを使用して決定した。クローン４４のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列 分析から、ｃＤＮＡの５′末端まで伸長する４３６アミノ酸の長い読み枠を含む １８９４ｂｐ配列が明らかとなった。

この読み枠の３′末端の下流には長さ５９４塩基の非翻訳域がある。これは、ポ リアデニル化シグナル（ＡＡＡＴＡＡＡ）に先導されたポリ（Ａ）テールを含ん でいる。終結コドン及び同定可能なシグナルペプチドが最長の読み枠のアミノ末 端に認められないので、３つの他の独立の陽性ＣＤＮＡクローンのヌクレオチド 配列を同じ方法で分析した。

３つ全てのクローンはフレーム内終結コドンを含む２９２ｃＤＮＡクローンの結 合ヌクレオチド配列を図４に示し、クローン４４　ｃＤＮＡの配列を図５に示す 。結合配列は、ポリ（Ａ）テールを含む２．１８６塩基対に広がり、アミノ末端 メチオニンを開始コドンと考えると４２２残基の読み枠を含む。ヒトロバシー分 析（図６）では、タンパク質のアミノ末端に、タンパク質分泌のためのシグナル ペプチドとして機能し得る顕著な疎水性配列は見られなかった（ｖｏｎ　ｔｌｉ ｊｎｅ、Ｇ、、　Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　１８４：　９９−１０５．１９８５ ）　ｏしかしながらこの分析から、膜貫通領域と考えられる適当な２３アミノ酸 （図４の下線部）からなる高度疎水性域の存在が判明した。この領域はＮＨ２Ｆ の推定前駆体を２つに分け、１５７アミノ酸の推定細胞質内ドメインを規定する 。

推定細胞外ドメインは、精製タンパク質から直接決定された全てのペプチド配列 （図４の上線部）を含む。これらは全てが、ペプチド７２７．３においてイソロ イシンと同定されたトレオニン残基１３７を除き（図１）、ｃＤＮＡから誘導さ れた配列と完全に一致した。５種類のｃＤＮＡクローンが対応位置にトレオニン 残基をコードしており、この変異はタンパク質のイソ形態に起因するものでない ことを示している。或いは、タンパク質配列を再調査すると、イソロイシンシグ ナルは先のエドマンサイクルから持ち越され、トレオニンはＯ−グリコジル化に より検出を免れていることが判った。配列決定したこれら全てのペプチドが推定 外部ドメインのアミノ末端側半分に位置することは重要である。他の半分は、（ ｌＩａｓｓａｇｕ６．Ｊ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　’１５５　：　２１ ３９３−２１３９６．１９９０において検証された）極めてコンパクトな構造の 故にタンパク質分解に対して耐性であることが知られている上皮成長因子（Ｅ　 Ｇ　Ｆ）様ドメイン（図７）を構成する６つのシスティン残基を含む。（実施例 ＩＤに記載の）ＮＨ２Ｆにおいてジスルフィド結合であると見られる外部ドメイ ンの他の２つのシスティン残基は、免疫グロブリン（Ｉ　ｇ）相同単位（図８） を規定する。更に、推定タンパク質配列はＮ結合グリコジル化用と考えられる４ つの部位を含み、これら全ては、（図４にアスタリスクで示した）膜貫通領域に 対してアミノ末端側に存在する。ＮＲ３Ｆ前駆体の全推定構造を図９に示す。

図９に示した膜貫通領域のために、ＮＨ２Ｆは、高レベルのＮＨ２Ｆ　ｍＲＮＡ を発現する細胞の表面上に蓄積すると推定される。膜結合前駆体タンパク質は、 ＥＧＦ成長因子ファミリーの他のメンバーにも認められる。例えば、Ｂｒａｃｈ ａ＋ａｎｎ、　Ｒ，ら、　Ｃｅ１ｌ　５６：　６９１−７００．１９８９は、形 質転換成因子αが存在することを示している。ＮＨ２Ｆに特異的に結合する分子 は、治療用分子を、ＮＨ２Ｆを過剰発現する細胞に選択的に導き得る。例えば組 換えＮＨ２Ｆに対して産生され、治療用分子に結合されたモノクローナル抗体は 、高レベルの膜結合ＮＲ８Ｆを発現する細胞の表面に治療用分子を選択的に集中 させ得る。このような細胞としては、活性化されたｒａｓ遺伝子を含む腫瘍細胞 が挙げられる。

抗体結合体は、化学療法化合物、サイトカイン、毒素、リンホカインまたは放射 性核種を使用して構築し得る。

実施例５ ｒａｓ形質転換ラッうッ維芽細胞から分泌された均一精製天然ＮＲ８Ｆが培養ヒ ト乳癌細胞の増殖を阻害し、細胞分化を示す乳成分の生成を誘導することが以前 に報告されている（　Ｐｅ１ｅｓ、　Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６９：　２０５−２ １６．１９９２）　、かかる活性をクローン化ＤＮＡと直接相関させるため、ク ローン４４から誘導した組換えＮＨ２Ｆの、培養乳癌細胞における作用を試験し た。特に、Ａ　Ｕ−５６５またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の培養物を、クロー ン４４　ｐ　Ｊ　Ｔ−２／ＮＲ３Ｆ発現ベクター（図２）または未処理の、ｃ　 Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物（クローン２７）を含む対照ｐ　Ｊ　Ｔ−２プラスミドのいず れかでトランスフェクトしたＣ０８−７細胞由来のならし培地を１６倍に濃縮し たもので処理した。両培地は最終希釈度１：５０で使用し、細胞と一緒に３７℃ で３日間インキュベートした。血球計数器を用いて細□胞数を決定し、コンピュ ータイメージ分析によって核面積を測定した。Ｂａｃｕｓ、　Ｓ、ら、　Ｍｏ１ ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　３　：　３５０−３６２　（１９９０）に記 載のごとく、脂質及びカゼインの染色を行なった。実験は３回繰返したが、量的 に同様の結果を得た。これを表１に示す。

上記結果から、対照ならし培地で処理したＡＵ−５６５及びＭＤＡ−ＭＢ−４５ ３培養物はほとんどの場合に未成熟の形態を示したが、組換えＮＲＳＦを含むな らし培地で処理した細胞のほとんどは、大きな核を含むと共に細胞質中に脂質小 包が出現するという特徴的な成熟形態を示したことが判る。ヒトカゼイン（タイ プβ及びχ）に特異的な免疫組織化学染色は、これらの細胞のほとんどが、対照 処理培養物とは異なり、カゼインを合成したことを示した。結論として、クロー ン４４はＮＲＳＦ　ｃＤＮＡの５′末端の一部を欠失しているにもかかわらず、 このｃＤＮＡクローンは、トランスフェクトＣＯ３−７細胞によって産生される 機能的に活性なＮＲＳＦの合成を誘導する。

上記結論は、リガンド置換分析において組換えＮＲＳＦが天然ＮＲ３Ｆと競合し 得る能力によっても裏付けされた。

精製天然ラットＮＲ３Ｆを、Ｉｏｄｏｇｅｎ　（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏ ｒｄ。

ＩＬ）を製造業者指示に従って使用し、１ｍｃｉのＮａ”’Ｉで放射性標識した 。未反応のヨウ素は、Ｅｘｃｅｌｌｕｏｓｅ　ＧＦ−５脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃ ｅ）においてゲル濾過することによりタンパク質から分離した。放射性標識天然 ＮＲ３Ｆ　（”ｆｉｌＮＲ３Ｆ）の比活性は３　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／　ｎｇで あった。放射性標識ＮＲ８Ｆ　（１０ｐｍｏｌ）を、２４ウ工ル皿（Ｃｏｓｔａ ｒ）内で増殖させた単層をなすＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞と一緒に４℃で６０分 インキュベートした。このインキュベーションは、トランスフェクトＣＯ３−７ 細胞由来のならし培地の存在下に実施した。未結合の１２Ｊ−ＮＲＳＦは、リン 酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄して除去し、細胞を、０゜１％ＳＤＳを含 む０．ＩＮ　ＮａＯＨ溶液中に溶解した。γ計数器を用いて放射能を測定した。

図１０に示したように、ＣＯ３−７細胞においてｐＪＴ−２／ＮＲＳＦ発現ベク ター（図２）から発現された組換えＮＲＳＦを含むならし培地は、全１２’Ｉ− ＮＲ３Ｆ結合を約５０％低下させた。随性対照には、ラットＴＧＦα　ｃＤＮ　 Ａ　（Ｂｌａｓｂａｎｄ、＾、ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０：　２１ １１−２１２１．　１９９０）を含むｐ　Ｊ　Ｔ−２発現ベクターでトランスフ ェクトした細胞由来のＣＯ３−７ならし培地を使用した。組換えＮＲＳＦならし 培地と比較し、ＴＧＦαならし培地はｌ！Ｊ−ＮＲＳＦ結合を阻害しなかった。

組換えＮＲＳＦならし培地の一部阻害作用は、非標識の精製天然Ｎ　ＲＳ　Ｆ　 （Ｐｅｌｅｓ。

Ｅ、ら、　Ｃｅ１ｌ　６９　：　２０５−２１６．１９９２）と比較し、結合ア ッセイにおいてその濃度が比較的低かったことに起因し得る。更に、高い非特異 的リガンドの結合にも起因し得る。

上記問題を解消するため、及びｎｅｕレセプターとの直接相互作用を示すため、 共有架橋アッセイを使用した。これは、上述のごときトランスフェクトＣ０８− ７細胞ならし培地の存在下にＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞を”６ｌ−ＮＲＳＦに結 合させることにより行なった。４℃で１時間結合させた後、化学架橋剤ビス（ス ルホスクシンイミジル）スベレート（Ｂ　Ｓ　ｓ、　Ｐｉｅｒｃｅ）を終濃度１ ｍＭで添加し、次いでＰＢＳで簡単に洗浄した。２２℃で４５分間インキュベー トした後、単層を反応停止用緩衝液（ＰＢＳ中１００＋Ｍグリシン、ｐＨ７，４ ）と共に１０分間インキュベートした。

次いで細胞を水冷ＰＢＳで２回洗浄し、溶解用緩衝液中に溶解し、Ｐｅ１ｅｓ、 　Ｅら、　ＥＭＢＯＪ、　１０　：　２０７７−２０８６　（１９９１）に記載 の方法に従ってモノクロナール抗体Ａｂ−３を用いてｎｅｕタンパク質を免疫沈 降した。よく洗浄した免疫複合体をゲル電気泳動（６％アクリルアミド）によっ て分割し、オートラジオダラム処理した。この分析の結果（図１１）、組換えＮ ＲＳＦは、組換えＴＧＦαとは異なり、レセプターニ結合した”５ｌ−ＮＲＳＦ のほとんどを置換し得ることが判った。この結果は、クローン４４　ｃＤＮＡが 機能的ＮＲＳＦ分子をコードすることを立証するものである。

実施例６ ＮＲ３Ｆ発現のノーザンプロット分析 ＮＲ８Ｆ　ｍＲＮＡの大きさ及び組織分布を測定するため、ハイブリダイゼーシ ョンプローブとしてクローン４４のｃＤＮＡ挿入物を使用し、ノーザンブロット ハイブリダイゼーシコン実験を行なった。成体雌ラットを外科切開して組織を得 、ＲＮＡを抽出し、標準方法（１ｌａｎｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら。

１１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２）を 使用してポリ（Ａ　）＋ＲＮ　Ａを選択した。クローン４４の長さ１．９ｋｂの ｃＤＮＡ挿入物をランダムブライミング法（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ、＾、Ｐ、及びＶ ｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ、、　Ａｎａｌ、ＢｉｏｃｈｅＩ１１３２　：　６−１ ３．１９８３）によってα−３！Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。

ハイブリダイゼーション条件は以下の通りとした：　６ＸＳＳＣ，５０ｍＭリン 酸ナトリウム（ｐＨ６，８）　、０．１％ビロリン酸ナトリウム、２ｘ　Ｄｅｎ ｈａｒｄｔ溶液、５０μｇ／＋ａｌサケ精子ＤＮＡ及び５０％ホルムアミド。ハ イブリダイゼーションを４２℃で１４時間実施し、次いで、０，２ｘＳｓｃ１ｏ 、ｉ％ＳＤＳ及び２ＩＩＭＥＤＴＡを用いて６０℃で３０分間洗浄した。フィル ターを、増感スクリーンを有するＫｏｄａｋ　ＸＡＲＸ線フィルムに一７０℃で 表示された時間だけ暴露した。

図１２（パネルＡ）から、Ｒａｔｌ−ＥＪ線維芽細胞のポリ（Ａ）選択ＲＮＡに ついてのノーザンプロットで３つバンドが可視化されたことが判る。それらの分 子サイズは６．８．２．６及び１　、７　ｋｂに相当した。更にオートラジオグ ラフ処理すると、別の２つのｍＲＮＡ種が可視となった（図示せず）。正常Ｒａ ｔｌまたは３Ｔ３線維芽細胞におけるＮＲＳＦの相対発現レベルは、ｒａｓ形質 転換細胞よりも著しく低く、ｎｅｕレセプター刺激活性を腫瘍原性ｒａＳ遺伝子 による形質転換と相関させた先の知見（Ｙａｒｄｅｎ。

Ｙ、及びｆｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ、ｃｉ、 ＵＳ＾８６　：　３１７９−３１８８、　１９８９）と一致する。

成体ラット組織の試験において（図１２、パネルＢ）、最高のＮＲ８ＦｍＲＮＡ 発現はを髄に認められた。ＮＲＳＦ　ｍＲＮＡは脳組織においても検出された。

上述のｍＲＮＡのほかに、かかる組織は、サイズが３．４　ｋ　ｂのｍＲＮＡ変 種を発現する。ＮＲＳＦに刺激されるｎｅｕレセプターはヒト胎児を髄及び脳に 存在しくＱｕｉｒｋｅ、Ｐ、ら、　Ｂｒ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　６０　：　６５−６９．１９８９）　、これは、ＮＲＳＦ及 びｎｅＵレセプターの両方の発現が神経組織の成長及び分化を調節することを示 している。ラット神経芽細胞におけるｎｅＵレセプター遺伝子の腫瘍原性活性化 （Ｂａｒｇｍａｎｎ、　Ｃ，ら、ｎａｔｕｒｅ　３１９　：　２２６−２３０． １９８６）は、神経組織成長調節におけるｎｅｕレセプター及びＮＲＳＦを示唆 している。

ｎｅｕレセプター刺激活性によって、ＮＲ３Ｆ発現は他の細胞種の成長及び分化 をも調節し得る。ｎｅｕレセプターは、胃腸管、気道、尿路及び生殖路、並びに 皮膚の正常に分化したヒト上皮細胞の表面に認められ、対応するヒト胎児組織に おいて発現される（　Ｐｒｅｓｓ、　Ｍ、ら、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５　：９５ ３−９６２．１９９０）。図１２のパネルＢは、成体ラット組織におけるＮＲＳ Ｆ　ｍＲＮＡ発現レベルの組織特異的調節を示す。陽性組織としては肺、卵巣及 び胃が挙げられる。

皮膚、腎及び心臓では、比較的低量の中間サイズの転写物が示されている。肝、 牌及び筋肉は検出可能なＮＲ３ＦｍＲＮＡを含まなかった。図１２のパネルＢは 更に、種々のＮＲＳＦ　ｍＲＮＡ種の組織特異的変化を相対的な割合で示してい る。種々のｍＲＮＡの各々は、異なる生物学的特性を有する種々のＮＲ３Ｆタン パク質をコードし得る。

天然ＮＲ３Ｆは、ＮＲＳＦ　ｍＲＮＡの構造及び発現レベルの組織特異的変化に よって、細胞の増殖及び分化を調節し得る。特に正常レベルの天然ＮＲ８Ｆタン パク質を欠いた損傷または疾患組織に本発明の非天然ＮＲＳＦを投与すると、ｎ ｅｕレセプターを刺激し、治療組織における細胞成長及び分化を調節し得る。特 に、心臓、胃、脳、を髄、卵巣、肺、腎及び皮膚の組織は天然ＮＲ８Ｆを発現す るので、本発明の組換えＮＲＳＦを用いた治療に対して応答することが期待され る。

異常なＮＲＳＦまたはｎｅｕレセプターの発現は、異常増殖の原因たる細胞自身 の（ＢＨｔ□ｃｒｉｎｅ）相互作用をもたらし得る（　Ｂｒｏａｄｅｒ、　Ｔ、 ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　１　：　９−１７．１９８９　；Ｙａｒｄｅ ｎ、　Ｙ、及びＵｌｌｒｉｃｈ、Ａ、、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 ５７：　４４３−４４８、１９８８）。ｎｅｕレセプター遺伝子の過剰発現また は増幅は、卵巣、肺及び腎組織から誘導されるヒト腫瘍において起こる（　Ｓｌ ａｍｏｎ、　Ｄ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　７０７−７１２．１９８ ９　；　Ｔａｌ、　Ｍ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８　：　１５１７−１ ５２０．　１９８８　；　Ｃ１１ｎｅ、ｊら。

Ｃａｎｃｅｒ　６０　：　２６６９　ｅｔ　ｓｅｑ、、　１９８７）　ｏこれら の組織は、腫瘍の増殖に影響し得るｎｅｕレセプター刺激因子を発現する（図１ ２のパネルＢ）。図１２のパネルＣは、ヒト腫瘍細胞がＮＲＳＦ　ｍＲＮＡを過 剰発現し得ることを示す。

ヒト腫瘍細胞系の最初の試験から、ＨＴ−１０８０線維肉腫細胞、Ｈｓ２９４Ｔ メラノーマ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌細胞が、通常より高いレベルの ＮＲＳＦ　ｍＲＮＡを発現することが判った（図１２のパネルＣ）。ｎｅＵレセ プターまたは同系ｎｅｕレセプター刺激因子のいずれかの発現は正常な細胞成長 及び分化を明らかに変化させ得、腫瘍が発生するなどの病理的な結果をもたらす 。本発明の組換えＮＲＳＦは、天然ＮＲ３Ｆが不足しているかまたはｎｅｕレセ プターが過剰発現されているケースで、ｎｅｕレセプターとＮＲＳＦとのバラン スのとれた相互作用を回復すべ（使用し得る。

腫瘍細胞の異常なＮＲ３Ｆ発現は、活性化されたｒａｓ腫瘍遺伝子からもたらさ れ得る。ＮＲＳＦ　ｍＲＮＡ発現は、ｒａｓ腫瘍遺伝子を用いて形質転換した細 胞において驚異的に増加する（図１２のパネルＡ）。活性化されたｒａＳ遺伝子 は、多数の癌細胞系や、結腸、肺、胆のう、膀胱、及び膵臓癌並びにメラノーマ 、肉腫及び白血病を含む数種の器官由来のヒト腫瘍において認められている（Ｐ ｉａ＋ｍｅｎｔａｌ、Ｅ、、　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、第２版、Ｖｏｌｌｌ、　Ｃ ＲＣＰｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　ＦＬ、　１９８９）　、活性化ｒａ ｓ突然変異は更に、ヒト結腸直腸アデノーマのごとき前癌性組織にも認められ、 腫瘍形成の原因となるとも考えられている（　Ｆｅａｒｏｎ、　Ｅ、及びＶｏｇ ｅｌｓｔｅｉｎ、Ｂ、、　Ｃｅ１ｌ　６１　：　７５９−７６７、１９９０）　 。癌性または前癌性ヒト組織、特に活性化ｒａｓ遺伝子を含むものにおける通常 より高いＮＲ８Ｆ発現は、本発明のＮＲＳＦ　ＤＮＡ及びＮＲＳＦ　ｍＲＮＡ検 出方法を用いて発見し得る。他の方法によっても、ヒト組織における通常以上の ＮＲ３Ｆ発現を同定し得る。タンパク質及びｍＲＮＡ発現を分析する当業者には 公知のかかる方法としては、免疫組織化学アッセイ、ラジオイムノアッセイ、酵 素結合免疫吸着法、及びポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。ＮＲＳＦを過剰発 現する癌性または前癌性細胞の同定は、ヒト癌の診断に特に有効である。

〔配列表〕

配列番号、ｌ 配列の長さ＝２０ 配列の型、アミノ酸 配列 Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ：　Ａｒｇ　Ｇｉｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　入１ａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　入ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓ＠Ｔ：　ｆfｒｏ　１６ 配列番号・２ 配列の長さ、６ 配列の型二アミノ酸 配列 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　６配列番号：３ 配列の長さ・２１８６ 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー二未知 配列 ｃｒｃ　ｃＧＧ　’ｒｃｃ　ｃ入入　ＡＣＣＡＧＣ丁ＣＣＧＡＧ　丁入ＣＴＣＣ ＴＣＡ　ＣＴＣＡＧＡ　ＴＴＣ大入ＡＴＧＧ　５４６Ｌ＠ｕ　Ａｒｑ　Ｃｙｓ　 Ｇｌｕτｈｒ　５ｅｒ　Ｓｅｘ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅ＋：　Ｓｅｔ　Ｌｅｕ　 Ａｒｇ　Ｐｈ＊　Ｌｙｓ　ＴｒｐτＣＣＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＣＴＣＴ　ＧＧＡ 　ＧＡＧ　？入子　ＡτＧＴＧＣ大入へ　Ｇ丁ＯＡｒｃ　入ｃｃ　へ人ＧＴフ入 　６ｇ０Ｓ＠ｒ　Ｌａｕ　人工ａ　Ａｓｐ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｉ　 Ｍａｌ＝　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉ工＊　５＊ｒ　Ｌｙｓ　！、魔■ 丁ＴＣＡ丁ＣＡＣＴ　ＧＧＣＡＴＧ　ＣＣＡ　ＧＣＣＴＣＧ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　 ＡＣＡ　ＧＣＣ丁Ａ丁　ＣＴＧ　ＴＣＣ丁ＣＡ　７８６ｔｈｅ　１１ａ　Ｔｈｒ 　Ｇｌｙ　Ｍａｃ　Ｐｒｏ　八Ｌａ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　人工ａ 　Ｔｙｉ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ａｒＧＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＣＡ丁τ　＾ＧＡＡ丁 ＣＴＣＡ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　八ＣＡ　ＧＡＡ　ＧＧＣＣＣＡ　大入ＣＡＣτ　７ ０丁　８３４Ｇｉｕ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌ＠　入ｔｑ　Ｉｌ＠　Ｓａｔ　Ｖａ Ｌ　Ｓｅ＋：　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　入１ａ　＾ｓｎ　Ｔｈｘ　５ｅ■ ＴＣＡ　丁ＣＣＡＣＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＣＡＣＧ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＡＣ ＣＡＧＣＣ入τ　ＣＴＣＡＴＡ　入＾ＧｒＧτ　８８２Ｓ＠ｒＳ＠ｒＴｈｒＳｅ ｒＴｈｒＳ＠ｒＴｈｒ丁ｈｒＧｌｙＴｈｘＳ＠ｔＨｉｓア一−１１ｕエニー＊Ｌ ｙｓＣｙｓＧＧＧ　ＣＣＴ　ＣＡＣｃＡｃ　ｃｃＡ　ｙ、ＣＣＣＡ　ＣＣＧ　Ｃ ＣＡ　ＧＡＧ　ＭＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　１２６U Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｚｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒ口Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇ ニーＪＬｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｖａｎ　Ａｓ。

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配列番号、８ 配列の長さ＝６１ 配列の型二アミノ酸 配列 ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓ酊　Ｔｙｒ　Ｊｕｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＣｙＳ　Ｌ ａｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　P６ ）１ｉｓ　ｌ１ｌｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅ１：　Ｌａｕ　Ａｓｐ　５＠ｒ　７ｙ１：　 Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ@Ｔｙｒ　３２ ５＠ｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｔｈｘ　Ａｒｇ　入！ｐ　 Ｌ命ｕ　＾ｒ９　Ｔｒｐ　τｒｐＧ工ｕ　Ｉａｕ　ｋｌ：ｑ@４８ ＨＬｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ＨＬｓ　Ａｓｐ　 ＸＬ＠　Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　６１配列番号＝９ 配列の長さ二６０ 配列の型二アミノ酸 配列 Ｖａよ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ａｚｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　 Ｘｉｓ　Ｃｙｓ　）Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　丁ｙｒｏ工３@３２ 配列番号＝ｌＯ 配列の長さ：６０ 配列の型二アミノ酸 配列 Ｃｙｓ　＾工１　Ａｉａ　Ｌｙｓ　Ｔ？ｈ＠　Ｇｉｎ　ｋｓｎ　Ｐｈｅ　Ｃｙａ 　エｉ＠　１４ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　入ｘｑ　テ凾■@１６ ＩＩ＠Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉａｕ　Ｇｌｕ　ＶａｌＶａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｈｉ ｓ　Ｃｙｓ　Ｍｉｓ　Ｇｉｎ＾ｓρτｙｒＰｈ＊　、３２Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌ、ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇ ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌ、ｙｓ　入ｓｐ　Ａ唐吹@４８ Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　工１＠Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ｘ１ｅ工１ｅ　６０配列番号：１１ 配列の長さ・６１ 配列の型二アミノ酸 配列 Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｚｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　 Ｌａｕ　１４ｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ工ｌ＠　Ｈｉｓ@１６ Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｊｐ　エエｅ　入ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　丁ｙｔ　Ｃｙｓ　 ＾ｘｑ　Ｃｙｓ　Ｓｅｘ　１４１ｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　丁ｈ秩@３２ Ｇｌｙ　Ｉｌ＠　ｋｘｑ　Ｃｙｓ　Ｇ工ｎ　１４１ｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌａｕ 　ＶａＩ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｘ　Ｇｌ普@４！Ｉ Ａｓｎ　Ｐｚｏ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｘ　丁ｈｒ　Ｓａｒ　Ｔｙｔ　工１４１ 　Ｐｔｏ　Ｓｅｘ　Ｐｒｏ　６０配列番号：１２ 配列の長さ＝４８ 配列の型、アミノ酸 配列 Ｃｙｓ　Ａｓｎ　１４ｉｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｘ　Ｃｙｓ 　Ｌａｕ　Ａｓｎ　ｘｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　ｔｈ■@１６ Ｔｈｒ　１１＠　Ａｉａ　Ｌａｕ　ｋｓｐ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　５＠ｒ　Ｈ会　Ｔ ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　R２ 工１ｅ　Ａｓｎ　丁ｙｒＱ工ｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐ ｈｅ　Ｉｌ＠　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｖａｉ　Ｔｈｅ　Ｔｙｒ　Sｇ 配列番号：１３ 配列の長さ：４９ 配列の型　アミノ酸 配列 Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｊｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔ７Ｅ　Ｃ’ｙＳ 　Ｌａｕ　入ｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　丁ｈｒ　Ｃｙｓ　ｔｈ■@１６ Ｔｈｒ　ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｚ　Ｌｓｕ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　ＣｙＳ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　１４１R　３２ 工ｉ＠　八ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　 Ｐｈｅ　Ｘｉｓ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　工１ｅ　丁ｈｒ　ｍｉｓ@４８ Ｌｙ５　４ｇ 配列番号：１４ 配列の長さ・６５ 配列の型・アミノ酸 配列 Ｉａｕ　Ｖａｌ　Ｌ４１ｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ 　Ｇｌｕ　Ｔｙｌ：　５４１１：　Ｓｅｘ　ｔａｕ　ｋｌ：早@Ｐｈｅ　１６ ＾ｒｇ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ@３２ ＧＩＬＩ　Ａｓｎ　Ｘ１＠　ＬＹＳ　１１＊　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ＬＹＳ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　ＬＹＳ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｉａｕ　ｋｌ：ｑ　ＸP＠　４１１ Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｉａ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ　＾１ａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｇよｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　Ｘｉｓ@６４ Ｓｅｒ　６５ 配列番号：１５ 配列の長さ二６５ 配列の型二アミノ酸 配列 ｖ１ユ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｘ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　工ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｓ・ｒ　Ｉｌ＠　丁ｈｒ@１６ Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　丁ｈｒ　Ａｒｇ　入ｓｎ　Ｉｌ＋＋　Ｓａｒ 　５＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｊｕｐ　Ｉａｕ　Ａｓ吹@３２ Ｇｌｙ　ｕｓ　Ｍｅｔ　ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｘ　Ｈｌｓ　八ｌａ　Ａ ｒｇ　Ｖａｌ　Ｓａｔ　Ｓａｒ：　Ｌａｕ　フｈｅ　Ｌａｕ@４８ Ｌｙｓ　Ｓａｒ　１１ｍ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　入１ａ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　ｇｅｔ　ＣＹＳ　Ｔｈｅ　入１ａ　Ｓｉｒ@６４ 配列番号：１６ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数；−重鎖 トボロジー：直鎖状 配列 ＾ＴＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣＧＧＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＲＴＣＮＣＣＹＴＣ ＮＧＣＡＧＧ　ＧＣＣＧＧＧ　ＣＴＴ　ＧＣＣ４８ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＣＣＴＣ Ｔ　６０ 配列番号＝１７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数ニー重鎖 トポロジー、直鎮状 配列 ＹＴＴ　ＲＣＡ　ＣＡＴ　ＲＴＡ　ＹＴＣＮＣＣ１８ＬＬＩＬＪｇＬ′？、１Ｖ ｎＶＬＬＩ ＦＩＧ、２ ロ　Ｏ。

Ｏ（）　ＯＯＯＯ０へ　の　マ ８　エ　冒　＝　＝　よ　累　：：＝ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、ｌｏ ＮＯＮＥ　Ｃ−ＮＲ３Ｆ　Ｃ−ＴＧＦαＦＩＧ、　ｌ　ｌ フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　ＡＤ Ｕ ＣＯ７Ｈ２１１０４Ｂ　８６１５−４ＣＣ０７Ｋ　７１０６　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５／１０ １５１０９　ＺＮＡ Ｃｌ３Ｆ　２１１０８　９１６１−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　９４５３−４ Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） ８３１４−４Ｃ （７２）発明者　ウエン、ドウアンツイアメリカ合衆国、カリフォルニア・９１ ３６０、サウザンド・オークス、レインダンス・ストリート・５１７ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＳ （７２）発明者　ベレス、エリオー イスラエル国、チル・アビブ・６３５０２、ペン・イエフダ・ストリート・２０ ９ （７２）発明者　ヤーデン、ヨセフ イスラエル国、レホボート、ハチータ・ストリート・７

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の１つ以上の生物学的活性を有するのに十分 に、天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子のアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を含 む非天然ポリペプチド。
2. ２．外来ＤＮＡ配列の原核性または真核性発現産物である請求項１に記載のポリ ペプチド。
3. ３．非ヒト哺乳動物細胞の発現産物である請求項２に記載のポリペプチド。
4. ４．前記非ヒト哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である請求項３に記載のポリペプチド 。
5. ５．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞発現産物である請求項２に記載のポリペプチド。
6. ６．酵母細胞発現産物である請求項２に記載のポリペプチド。
7. ７．前記外来ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である請求項２に記載のポリペプチド。
8. ８．前記ｃＤＮＡ配列が図５のＤＮＡ配列（配列番号４）である請求項７に記載 のポリペプチド。
9. ９．前記外来ＤＮＡ配列が、図５のｃＤＮＡ配列（配列番号４）と相同なゲノム ＤＮＡ配列である請求項２に記載のポリペプチド。
10. １０．前記外来ＤＮＡ配列が人工ＤＮＡ配列である請求項２に記載のポリペプチ ド。
11. １１．前記外来ＤＮＡ配列が、自己複製ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクタ ーに担持されている請求項２に記載のポリペプチド。
12. １２．図５に記載のラットｎｅｕレセプタ−刺激因子のアミノ酸配列（配列番号 ４）または遺伝子操作されたその変種を含む請求項１に記載のポリペプチド。
13. １３．図７に記載のラットｎｅｕレセプタ−刺激因子のＥＧＦ様ドメインのアミ ノ酸配列（配列番号５）を含む請求項１に記載のポリペプチド。
14. １４．図８に記載のラットｎｅｕレセプタ−刺激因子の免疫グロブリン様ドメイ ンのアミノ酸配列（配列番号１４）を含む請求項１に記載のポリペプチド。
15. １５．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の１つ以上のｉｎｖｉｖｏ生物学的活性を 有する請求項１に記載のポリペプチド。
16. １６．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の１つ以上のｉｎｖｉｔｒｏ生物学的活性 を有する請求項１に記載のポリペプチド。
17. １７．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の１つ以上の生物学的活性を有するのに十 分に、天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子のアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を 有するポリペプチド産物の、原核性または真核性宿主細胞中での発現を保征する のに使用される単離ＤＮＡ配列であって、（ａ）図４及び図５に示したＤＮＡ配 列（それぞれ配列番号３及び配列番号４）またはそれらの相補鎖；（ｂ）（ａ） で定義されたＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列またはそのフラグメン ト；及び（ｃ）遺伝コードの縮重がなかったならば（ａ）及び（ｂ）で定義され たＤＮＡ配列にハイブリダイズするＤＮＡ配列 から選択される前記単離ＤＮＡ配列。
18. １８．宿主細胞がポリペプチド産物を発現し得るように請求項１７に記載のＤＮ Ａ配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされた原核性または真核性宿主 細胞。
19. １９．原核性または真核性宿主細胞における請求項１７に記載のＤＮＡ配列の発 現のポリペプチド産物。
20. ２０．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の１つ以上の生物学的活性を有するのに十 分に、天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子のアミノ酸配列と重複するアミノ酸配列を 有するポリペプチド産物の、原核性または真核性宿主細胞中での発現をコードす る単離ＤＮＡ配列。
21. ２１．請求項２０に記載のｃＤＮＡ配列。
22. ２２．請求項２０に記載のゲノムＤＮＡ配列。
23. ２３．請求項２０に記載の人工ＤＮＡ配列。
24. ２４．図４及び５（それぞれ配列番号３及び配列番号４）に示した請求項２０に 記載のＤＮＡ配列。
25. ２５．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中での発現に好ましい１つ以上のコドンを含む請求項２ ０に記載のＤＮＡ配列。
26. ２６．酵母細胞中での発現に好ましい１つ以上のコドンを含む請求項２０に記載 のＤＮＡ配列。
27. ２７．哺乳動物細胞中での発現に好ましい１つ以上のコドンを含む請求項２０に 記載のＤＮＡ配列。
28. ２８．請求項２０に記載のＤＮＡ配列を含む生物学的機能性プラスミドまたはウ イルスＤＮＡベクター。
29. ２９．請求項２０に記載のＤＮＡベクターを用いて安定に形質転換またはトラン スフェクトされた原核性または真核性宿主細胞。
30. ３０．請求項２０に記載のＤＮＡ配列の、原核性または真核性宿主細胞中での発 現のポリペプチド産物。
31. ３１．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子のポリペプチドフラグメントまたはポリペ プチド類縁体をコードするＤＮＡ配列。
32. ３２．メチオニルｎｅｕレセプタ−刺激因子をコードする請求項３１に記載のＤ ＮＡ配列。
33. ３３．図５に示したアミノ酸配列（配列番号４）の一部または全部を有し、天然 ｎｅｕレセプタ−刺激因子のｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏ生物学的活性を １つ以上有するポリペプチド。
34. ３４．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の二次構造の一部または全部を有し、図５ に示したアミノ酸配列（配列番号４）の一部または全部を有し、天然ｎｅｕレセ プタ−刺激因子の１つ以上の生物学的特性を有するポリペプチド。
35. ３５．ａ）［Ｍｅｔ−１］ｎｅｕレセプタ−刺激因子；及びｂ）１つ以上のシス テインがアラニンまたはセリンで置換されているｎｅｕレセプタ−刺激因子から なる群から選択される、ヒトｎｅｕレセプタ−刺激因子の類縁体をコードするＤ ＮＡ配列。
36. ３６．請求項３５に記載のＤＮＡ配列の、原核性または真核性宿主細胞中での発 現のポリペプチド産物。
37. ３７．天然ｎｅｕレセプタ−刺激因子の１つ以上の生物学的活性を有する、図５ に示したアミノ酸配列（配列番号４）を有する非天然ポリペプチド、または、そ の任意の誘導体、欠失類縁体、置換類縁体もしくは付加類縁体であって、外来Ｄ ＮＡ配列の原核性または真核性発現の産物であることを特徴とする前記非天然ポ リペプチド。
38. ３８．ｎｅｕレセプタ−刺激因子を生産する方法であって、請求項１７に記載の ＤＮＡを用いて形質転換またはトランスフェクトした原核性または真核性宿主細 胞を、適当な栄養条件下で増殖させ、 前記ベクタ−中のＤＮＡ配列の所望のポリペプチド発現産物を単離する ことからなる方法。
39. ３９．細胞成長及び分化を調節する方法であって、細胞を有効量の組換えｎｅｕ レセプタ−刺激因子に接触させることからなる方法。
40. ４０．哺乳動物において実施される請求項３９に記載の方法。
41. ４１．前記哺乳動物がヒトである請求項４０に記載の方法。
42. ４２．ｎｅｕレセプターを発現するヒト組織の修復及び再生を増強する方法であ って、有効量の組換えｎｅｕレセプタ−刺激因子を投与することからなる方法。
43. ４３．前記組織が、胃腸管、気道、尿路及び生殖路の組織からなる群から選択さ れる請求項４２に記載の方法。
44. ４４．前記組織がヒト皮膚からなる請求項４２に記載の方法。
45. ４５．前記組織が神経組織である請求項４２に記載の方法。
46. ４６．ｎｃｕレセプターを発現するヒト組織におけるｎｅｕレセプタ−刺激因子 欠乏を治療する方法であって、有効量の組換えｎｅｕレセプタ−刺激因子を、か かる欠乏を有するヒトに投与することからなる方法。
47. ４７．腫瘍細胞の表面にｎｅｕレセプターを発現する哺乳動物腫瘍を治療する方 法であって、かかる腫瘍を有する哺乳動物に、腫瘍増殖を低減するのに有効な量 の組換えｎｅｕレセプタ−刺激因子を投与することからなる方法。
48. ４８．前記哺乳動物がヒトである請求項４７に記載の方法。
49. ４９．前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、肺癌、腎臓癌、及び皮膚癌からなる群か ら選択される癌の治療に使用される請求項４８に記載の方法。
50. ５０．有効量の組換えｎｅｕレセプタ−刺激因子並びに医薬的に容認可能な希釈 剤、アジュバント及び担体を含む医薬組成物。
51. ５１．請求項１２に記載のポリペプチドを用いた免疫によって特異的に生産され た抗体。
52. ５２．モノクローナル抗体である請求項５１に記載の抗体。
53. ５３．水溶性ポリマーに共有結合された請求項１に記載のポリペプチドを含む生 物学的に活性な組成物。
54. ５４．前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、及びポリエチレングリコール とポリプロピレングリコールのコポリマーからなる群から選択される請求項５３ に記載の組成物。
55. ５５．ヒト細胞または組織におけるｎｅｕレセプタ−刺激因子の過少発現または 過剰発現を検出する方法であって、（ａ）前記細胞または組織からＲＮＡを単離 し；（ｂ）前記ＲＮＡを、ｎｅｕレセプタ−刺激因子ｍＲＮＡ中に存在する核酸 配列にハイブリダイズし得る核酸プローブと、該プローブがそれが特異性を示す 核酸とハイブリダイズするのに適した条件下で接触させ；更に（ｃ）ｎｃｕレセ プタ−刺激因子ｍＲＮＡの過少発現または過剰発現の指標として、前記ＲＮＡと プローブとのハイブリダイゼーションレベルを判定することからなる方法。