CN1080959A

CN1080959A - 神经受体的重组体刺激因子

Info

Publication number: CN1080959A
Application number: CN93106970A
Authority: CN
Inventors: D·Z·文; E·佩利斯; Y·亚登
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Amgen Inc
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Amgen Inc
Priority date: 1992-04-29
Filing date: 1993-04-29
Publication date: 1994-01-19
Also published as: NO944112D0; AU4228693A; ZA933021B; KR950701379A; MX9302475A; FI945085A0; FI945085A; JPH07506488A; CA2134564A1; WO1993022424A1; NO944112L; EP0583050A2; EP0583050A3

Abstract

公开了重组体神经受体刺激因子、该因子的类似物、对其编码的DNA序列、以及制备方法。也公开了治疗涉及神经受体表达紊乱的药物组合物和方法。

Description

本发明涉及一种新颖的，非天然存在而是以重组DNA法产生的多肽，它与该神经受体相配合，并对其进行刺激，而且调节细胞的增殖和分化。本发明还涉及该多肽的类似物和衍生物，以及涉及对该多肽、类似物及衍生物编码的DNA序列。

细胞的生长及分化部份地是由多肽分子传送的细胞外信号调节的（Aaronson，S.A.，Science 254：1146-1152，1991）。这些因子和特定的细胞表面受体间的相互作用起动了一个在调节基因表达和DNA复制的原子核转变中达到顶点的生物化学级联（Ullrich，A，and Schlessinger J，Cell 61：203-212，1990）。这种细胞调节机制对于在发育过程中确定细胞的演变趋向是有意义的，而且这种机制的破坏则会导致致癌转变。后者可由生长调节因子的构型产生或由其同源受体改变了型类而诱发（Yarden，Y，and Ullrich，A.，Ann.Rev，Biochem，57：443-448，1988）。这类致癌受体属于横垮膜糖蛋白族，该类糖蛋白是在其胞质区中具有共同的催化功能，即，酪氨酸-特种蛋白激酶活性（Hanks，S，K.，Cur，Op，Struct，Biol，1：364-383，1991）。该神经原始致癌基因（也称作erbB-2和HER-2）将与表皮生长因子的受体高度相关的酪氨酸激酶编码（king，C.R.et al.，EMBO J.7：1647-1651，1988;Coussens，L，et al.，Science 230：1132-1139，1985;Bargmann，C.I.et.al.，Cell45：649-657，1986;Yamamoto，T.et al.，Nature 319：230-234，1986）。该神经受体和EGF-受体在其细胞外区域两者都具有富半胱氨酸结构，该结构是经过一段氨基酸单一横垮膜路程连到一个大的，有酶功能的胞质区。该神经受体的致癌潜在危险可通过多种基因机制而释放出来，这包括在该横垮膜区域中的点突变（Bargmann et al.，上文）及在胞质区及细胞外区中的非催化序列的平截（DiFiore，P.P.et al.，Science 237：178-182，1987;Bargmann，C.I.，and Weinberg，R.A.，EMBO J.7：2043-2053，1988）。

与人体癌症致病原因有关的致癌激活的第三种机制包括正常基因明显的过表达。该神经受体的增强和过表达频繁地在得自某些组织的人体腺癌中测出（Kraus，M.H.et al.，EMBO J.6：605-610，1987）Slamon，D.J.et al.，Sience 235：177-182，1987;Varley，J.M.et al.，Oncogene 1：423-430，1987;van de Vijver，M.et al.，Mol.Cell Biol，7：2019-2023，1987）。此外，基因增长和过表达间的结合及临床结果已以乳癌和卵巢癌进行了报导（Slamon et al.，supra;Varley et al.，supra，Venter，D.J.et al.，Lancet ii：67-72，1987，Zhou，D.et al.，Cancer Res.47：6123-6125，1987;Berger M.S.et al.，Cancer Res 48：1238-1243，1988;Tsuda，H.et al.，Cancer Res 49：3104-3108，1989;Slamon D.J.et al.，Science 244：707-712，1989）。按照这些恶性肿瘤中包含该神经受体的可能性，在实验模型中的这种受体的过表达导致了转变表型的出现（DiFiore et al.，supra;Hudziak，R.M.et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 84：7159-7163，1987）。造成过表达神经蛋白的转变潜势的机理尚不知道，但它可能与缺乏配位体的内在酪氨酸激酶的组成活性有关（Lonardo，F.et al.，New Biol.2：992-1003，1990）。

该神经受体及EGF-受体的同时过表达协同地使侵蚀性成纤维细胞转变（Kokai，Y.et al.，Cell 58：287-292，1989），这已在人的癌症中被观察到（Harris，A.L.et al.，Molecular Diagnostics of Human Cancer，Volume 7，edited by Furth，M.，and Grreaves，M.，Cold Spring Harbor Press，New York，1989;Gullick，M.，J.，Int.J.Cancer Suppl，5，pp.55-61，1990）。这两种受体间的协同作用可能是由EGF-受体对该神经受体的转调节作用所媒介的，这包括增加后者的酪氨酸磷酸化（Stern，D.J.，and kamps，M.P.，EMBO J.7：995-1001，1988;King C.R.et al.，EMBO J.7：1647-1651，1988;Kokai，Y.et al.，Proc.Natl.Acad Sci.USA 85：5389-5393，1988）。从机理上说，这类相互作用都是以EGF-受体和该神经受体的杂二聚为媒介的（Goldman，R.et al.，Biochemistry 29：11024-11028，1990;Wada T.，et al.，Cell 61：1339-1347，1990）。这些观察提高了该神经受体可由属于EGF-受体亚族的其它受体酪氨酸激酶（比如erbB-3蛋白）调节的可能性（Kraus，M.H.et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 86：9193-9197，1989;Plowman，G.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.87：4905-4909，1990）。

与已知的具有共有一个EGF-类型（motif）的多个配位体分子的EGF-受体（Carpenter，G.，and Cohen，S.，J.Biol.Chem.265：7709-7712，1990）相反，一种直接与该神经受体相互作用的配位体此前尚未被描述。在ras-转变的成纤维细胞培养基中存有候选神经配位体已见报导（Yarden，Y.，and Weiberg，R.A.，Proc，Natl，Acad，Sci.USA 86：3179-3188，1989）。该因子基于其提高该神经受体对酪氨酸残基磷酸化能力而从这种来源中被部分提纯（Yarden，Y.，and Peles，E.，Biochemistry 30：3543-3550，1991）。这种活性相应于在色谱分析中相当于30-35千道尔顿蛋白的热稳定的和含二硫化物的糖蛋白。通过采用不同配位体分析，一种30千道尔顿的糖蛋白已从MDA-MB-231人乳房癌细胞中被分离出来（Lupu，R.et al.，Science 249：1552-1555，1990），而且另一种因子则从转变的人T细胞培养基中被部分提纯（Dobashi，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8582-8586，1991）。

最近，刺激并明显地与该神经受体结合的因子已从ras-转变的大鼠成纤维细胞的条件培养基中提纯为同种。当检测人乳房癌细胞时，这种大约为44千道尔顿蛋白的因子能诱发分化而成为成熟的泌乳细胞（Peles，E.et al.，Cell 69：205-216，1992）。

本发明提供了一种新的，非天然存在神经受体刺激因子以及被分离的将全部或部分该因子编码的DNA序列。本发明的因子是一种多肽，该多肽具有复制的天然存在的神经受体刺激因子的氨基酸序列（即，Peles，E.et al.，于Cell 69：205-216，1992中所述的多肽），这足以使该多肽具有该天然存在因子的一种或多种生物活性（即，人体神经刺激受体活性、人乳房肿瘤细胞分化活性、与天然存在神经受体刺激因子对人体受体结合方面的竞争能力等）。

从天然来源中提纯的该神经受体刺激因子（也就是本文所称的“NRSF”）具有刺激人神经原发致癌基因的多肽产物的酪氨酸磷酸化的能力及诱发人乳房肿瘤细胞分化成产乳的、生长被抑制的细胞的能力（Peles E.et al.，Cell supra）。NRSF的生物活性证实了其作为人体细胞生长和分化因子的作用及其在各种治疗处置中的潜在用途。本发明的非天然存在的神经受体刺激因子单独或与其它治疗方法结合对治疗同一种人体无序与天然存在的神经受体刺激因子一样有效。

本发明所提供的分离的DNA序列在确保本发明的非天然存在的神经受体刺激因子（“即重组体NRSF”）于原核和/或其核寄主细胞中的表达方面是有效的。本发明专门提供将未经处理的氨基酸序列编码的DNA序列，以及将NRSF经处理（成熟的）形态编码的DNA序列。这类DNA序列包括：

（a）图4和5中所列的DNA序列（分别为序列标号3和4）以及它们的补充股;

（b）与（a）中所定义的DNA序列或其片段杂交的DNA序列;及

（c）与（a）和（b）中所定义的DNA序列杂交DNA序列，但遗传码退化的除外。

特别包括在部分（b）和（c）中的是将NRSF的变体形式编码的cDNA和基因组DNA序列（包括得其它哺乳动物物种的NRSF），以及将NRSF、NRSF片段及NRSF类似物编码的制造的DNA序列。该DNA序列可将有利于转录和翻译寄主细胞中的信使RNA的密码子包括进去。按Alton等人的方法（PCT公开申请WO 83/04053）很容易构建制造的序列。

还提供了含这类DNA序列的载体以及用这类载体转变或转染的寄主细胞。另外，本发明包括以重组DNA技术制造NRSF的方法以及用重组体NRSF治疗无序的方法。也提供了含重组体NRSF的药用组合物以用重组体NRSF生长的抗体。

图1描绘了一幅自以ras-转变的大鼠成纤维细胞调整的培养基中提纯的天然存在的神经受体刺激因子的酪氨酸水解液的高压液相色谱，它是按上文所述的Peles等人（Cell，见上文））的方法完成的。洗脱面被显示出来，而得自与各峰相对应的馏份的氨基酸序列用常规单个字母符号标出。括号中的氨基酸代表一个天门冬酰胺连接的糖基化位点，而虚线代表一个较长的，其中氨基酸未被标出的序列。其中插入的图所示是二硫苏糖醇还原后的27.3分钟峰的再色谱分离。

图2所示是哺乳动物COS-7细胞表达载体ppJT-2/NRSF的结构。大鼠NRSF cDNA插入物是图5的克隆44cDNA序列（序列标号4）。

图3证实了重组体NRSF对人神经受体酪氨酸磷酸化的刺激作用。人体MDA-MB-453乳腺癌细胞用一种浓缩条件培养基培育成熟，所述培养基得自用给定的部分提纯cDNA克隆（左图）或用充分提纯的cDNA克隆（右图）转染的COS-7猴细胞。正对照物包含10ng/ml（左道）和100ng/ml的提纯的天然存在的大鼠NRSF。负对照物包含由未转染COS-7细胞（道的符号为“COS”），或由以含不相关cDNA的p^JT-2质粒转染的细胞（道标为“克隆27”和“克隆29”）及未作任何添加（“无”）所调整的浓缩培养基。溶菌产物由受刺激的MDA-MB-453细胞制取，并经受SDS-PAGE。被示出的还有带按千道尔顿（KDa）给定的分子量标记蛋白位置抗磷酸化Western印迹的自动射线照相。在含0.1%BSA总体积为0.125ml PBS中，对于克隆4，19和44分别使用下述体积的COS-7上清液：0.01ml-（左侧）和0.1ml（右侧）。该提纯的克隆分析是在含0.2ml细胞上清液的0.25ml总体积或按标定体积中进行的。

图4（序列标号3）示出了大鼠NRSF cDNA的核苷酸序列及推定的氨基酸序列。四种cDNA克隆的组合核苷酸序列也被描述。克隆44 DNA序列的开端特地用箭头标出。在左侧和右侧分别给出了核苷酸数和氨基酸数。N-连接的糖蛋白的潜在位点用星号标出，在推定的细胞外的区中发现的半胱氨酸残基被圈出。上标线表示直接从提纯的天然存在NRSF中确定肽序列。下标线表示潜在的横跨膜区，而下虚线表示多聚腺苷酸化位点。含免疫坏蛋白（Ig）同系性单元和表皮生长因子（EGF）样型（motif）的蛋白序列的部份被标在右手侧。

图5（序列标号4）单独地示出NRSF cDNA克隆44的核苷酸序列及推定的氨基酸序列。核苷酸数标在右手列。

图6描绘了大鼠神经受体刺激因子前体的水疗法图。采用了Kyte Doolittle（J.Mol.Biol，157：105-132（1982）），窗口尺寸为9个氨基酸残基。正值表示增加疏水性。氨基酸数标在该图下方。

图7表示EGF类区域及含有EGF族有代表性成负的大鼠NRSF（序列号5号）的侧羰基未端序列的氨基酸序列的线列。划线和编号始于EGF型的最多氨基未端半胱氨酸残基处。氨基酸残基用单字母密码标出。虚线表示为介入最大型线而留的缝隙。残基被括起来以表示它们与NRSF的相应的氨基酸相同。下横线表示假设的横跨膜区的氨基未端部分，该区在某些EGF型的羰基未端侧的侧方。星号表示该羰基的端点。将下列蛋白与NRSF比较：大鼠转变生长因子α（TGFα（序列标号：6号）;Marquardt，H.et al.，Science 223：1079-1082，1984））;人的对边条曲菌素（AR（序列标号：7）;Shoyab，M.et al.，Science 243：1074-1076，1989））;绵羊纤维瘤病毒生长因子（SFGF（序列标号：8）;Chang，W.et al.，Mol.Cell.Biol.7：535-540 1987）;粘液瘤病毒生长因子（MGF（序列标号：9）;Upton，C.et al.，J.Virol，61.1271-1275，1987）;小鼠EGF（（序列标号：10），Gray，A.et al.，Nature 303：722-725，1983;Scott J.et al.，Science 221：236-246，1983）;人的肝素结合的EGF（HB-EGF（序列标号：11）;Higa-Shiyama，S.et al.，Science 251：936-939，1991）;大鼠神经鞘瘤衍生的生长因子（SDGF（序列标号：12）;kimura，H.et al.，Nature 348：257-260，1990）以及牛痘病毒生长因子（VGF（序列标号：13）;Blomquist，M.D.et al.，Proc.Natl Acad，Sci.USA81：7363-7367，1984）。

图8示出了大鼠NRSF的免疫球蛋白（lg）类区的列线（序列标号：14），该列线带有鼠的神经细胞粘附分子第4Ig相关序列（序列标号：15）（NCAM;Barthels，D.et al.，EMBO.6：97-914，1987），一种免疫球蛋白总科的C₂一组的有代表性的蛋白。在该C₂一组中高度保守的残基被标在线的下面，而跨越该总科的保守位置是跨线的（根据Williams，A.，and Barclay，A.，Rev.Immunol.6：381-405，1988）。可能与β-链的形成相关的氨基酸段用浓重的下横线标出，并且从B标到F，这与免疫球蛋白区相类似。方框表示在NRSF和NCAM中的相同的残基。虚线（缝隙）是为最大线列而引入的。

图9是该神经受体刺激因子前体的假设二级结构和膜取向的示意图。与该免疫球蛋白（Ig）区及表皮生长因子（EGF）型相对应的位置用粗线表示，而其半胱氨酸残基用圆圈表示。该Ig区的二硫化物键用氨基酸序列分析直接证实（实施例1D），而该EGF区的次级结构是以与该EGF族同源为基础的。还被示出的是三个在该横跨膜区中发现的半胱氨酸残基。箭头标出在该氨基酸未端（按大鼠NRSF蛋白的N-未端排序）的该前体蛋白的处理位点及靠近该原生质膜处的推定的蛋白水解位点。枝线表示被证实的N-糖基化位点的位置，而短竖线代表O-糖基化的推定位点。

图10描绘了用放射性同位素示踪的，自ras-转变的大鼠成纤维细胞条件培养基中提纯的天然存在的神经受体刺激因子（“¹²⁵Ⅰ-NRSF”所作的受体组成分析。该被示踪NRSF与人体MDA-MB-453乳房癌细胞在没有（无）或存有得自表达重组体神经受体刺激因子（“C-NRSF”）或重组体TGFα（“C-TGFα”）的COS-7细胞的条件培养基进行培育。此细胞结合放射性以平均值±S.D.（n＝3）示出。

图11描绘了另一种受体竞争分析。¹²⁵Ⅰ-示踪的天然存在的NRSF与人体MDF-MB-453细胞在没有（“无”）或存有未示踪的“冷”天然存在的NRSF（“NRSF”，200ng/ml），或以由图2的NRSF表达质粒（“C-NRSF”），或由TGFα-编码载体（“C-TGFα”）转染的COS-7细胞调整培养基进行培育。接着与BS³交联，该细胞被溶解，并通过采用单克隆抗体使该神经受体蛋白免疫沉淀。聚丙烯酰胺凝胶分离的免疫配合物的自动照相（曝光三天）也被展示。大部分假定的受体二聚物被放射性同位素示踪。

图12示出得自Northen印迹的自动照相，所述的印迹是由经培养的细胞中分离出的mRNA印迹（A图和C图），或是新分离的成年大鼠组织的印迹（B图），采用的探针是克隆44 NRSF cDNA。在底片曝光3小时（A图）或24小时（B图和C图）后得到该自动照相。分子量以千碱基对来表示。采用得自GIBCOBRL Life Technologies，Inc.（Gaithersburg，MD）的标志分子混合物作分子量估算。

本发明的DNA序列很有价值地用于以各种重组技术大规模合成NRSF。换句话说，本发明所提供的DNA序列在产生新的和有用病毒的及环质粒DNA载体;新的和有效的转变的和转染的原核和真核寄主细胞（包括在培养基中生长的细菌和酵母细胞及哺乳动物细胞）;以及新的和有用的培育这类能表达NRSF的寄主细胞生长的方法及其相关产物方面是有效的。

本发明的DNA序列还适于用作分离人体cDNA和将NRSF编码的染色体DNA以及将相关蛋白编码的其它基因（这包括其它哺乳动物种的cDNA和染色体DNA序列）的探针材料。DNA序列在各种可选择的蛋白合成方法方面（如在昆虫寄主细胞中），或在人或其它哺乳动物的遗传治疗方面也可能是有用的。期望本发明的DNA序列在开发可作为大量生产NRSF及NRSF产品的真核“寄主”的转基因哺乳动物种方面是有用的。一般参见Palmiter et al.，Science 222，809-814（1983）。本发明的NRSF DNA序列可能有诊断用途，如检测基因变化，mRNA结构及表达程度。

本发明重组体NRSF以其是外源DNA序列的原核或真核寄主表达产物（如，培养基中的细菌、酵母，高等植物、昆虫或哺乳动物细胞）为特征，所述的DNA序列是通过遗传或cDNA克隆，或通过基因合成，特别是采用载于自发复制DNA质粒或病毒载体上的外源DNA序列以常规技术进行上述处理而获得的。表达在典型的酵母（如酿酒酵母或原核（如，大肠杆菌（E.coli））寄主细胞中的产物是与任何哺乳动物蛋白无关的。表达在脊椎动物（如非人类哺乳动物（如COS或CHO）和鸟）细胞中的产物是与任何人体蛋白无关的。按所用寄主，本发明的重组体NRSF可用哺乳动物或其它真核碳水化合物进行糖基化，或进行非糖基化。本发明的重组体NRSF还可包括一种起始蛋氨酸氨基酸残基（在1位）。

本发明还包括诸如NRSF的多肽类似物之类的产物。这类类似物包含NRSF片段。按已知方法，人们可很容易地设计和制造将相关多肽编码的基因，所述的多肽具有不同于本文在鉴别或定位一种或多种残基（如，取代、末端及中间加成和缺失）方面所作规定的原始结构，任选地，cDNA序列和遗传核苷酸序列的修饰可很容易用已知的位点引导的诱变技术完成，并可用来产生NRSF的类似物及衍生物。这类产物具有天然存在的NRSF的一种或多种生物特性，但在其它方面则不相同。作为例子，本发明的产物包括那些通过如，缺失而按比例缩小的;或者那些对水解更为稳定的（因而具有比天然存在的NRSF更明显和延长的效果）的;或者那些已被改变而除去一个或多个O-糖基化和/或N-糖基化潜在位点的;或者那些具有一个或多个缺失的或被其它残基（如丙氨酸或丝氨酸残基）所取代的半胱氨酸，并且是潜在地易于以活性态与微生物系统分离的;或者那些具有一个或我个被苯丙氨酸取代的酪氨酸残基并或多或少易于与目标蛋白或与目标细胞上的受体结合的那些产物。还包括仅复制该连续氨基酸序列的一部分或NRSF中的次级构象的多肽片段，这类片段只具备NRSF的一种性能而不具有其它性能。值得注意的是，对于本发明一种或多种产物而言，不必具有治疗用途或其它方面的用途，如NRSF拮抗。竞争性的拮抗作用如在NRSF过度产生的情况下将是很有用的。

本发明还包括用部份补充到人体NRSF的cDNA或遗传DNA序列的蛋白编码链中的DNA编码的多肽类别。

本发明还包括用于治疗与神经受体表达有关的生物学无序的药用组合物，这类组合物包括与治疗有效量的本发明多肽产物一起存在的用于重组体NRSF治疗的适宜的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。本文所用的“治疗有效量”指的是这样的量：该量对指定的症状及给药群体具有治疗效果。这类组合物包括各种缓冲液含量（如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐）、pH和离子浓度的稀释剂、添加剂如降解剂和增溶剂（如Tween 80、多乙氧基醚80）、抗氧化剂（如抗坏血酸、偏二硫酸钠）、防腐剂（如乙基汞硫代水杨酸钠、苄醇）及填充物（如乳糖、甘露糖醇）;共价附着于该多肽以延长体内半存留期及增强效力的聚合物（例如水溶性聚合物，如聚乙二醇及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，见Davis等人的美国专利（US，4，179，337）;及掺入聚合化合物（如多乳酸、多葡糖酸等）的造粒过程中的或掺入脂质体中的原料。这类组合物将影响重组体NRSF的物理状态、稳定性、体内释放速率及体内消除速率。

本发明的非天然存在的神经受体刺激因子可望在治疗与将神经受体表达在其表面的细胞相关的无序及症状方面，单独地或与其它疗法相结合使用都是有效的。特别地，本发明的重组体NRSF作为某些人的癌细胞的生长抑制因子和分化因子，并可用于治疗各种与神经受体表达有关的各种类型肿瘤，这类肿瘤包括乳癌、卵巢癌、前列腺癌和胃癌。

该因子还可与其它物质如放射性同位素示踪分子、毒素、细胞分裂素及其它对治疗肿瘤有用的化合物结合，以便增加这些化合物在高水平表达神经受体的人体肿瘤上固定。

其它的生物和治疗应用也是可能的。比如应用在将该神经受体表达在其表面上的正常人的胃肠道、呼吸道、尿道和生殖道以及皮肤的上皮细胞（Press et al.，Oncogene 5：953-962，1990）与该受体结合的，或相互作用并改变细胞生长或代谢作用的物质在需要细胞重新布居，（即在导致细胞破坏的物理伤害之后），或在期望提高或刺激该细胞的代谢活性或因细胞生长或分化（如从皮肤的毛囊中再生毛发的生长）所产生的特性的场合下将是有用的。

本发明的多肽根据待治的特定无序、具体病人的症状、该因子的输送位点给药方法及医师所知的其它有关事项进行配制和确定剂量。因此，出于本文的目的，重组体NRSF，或类似物，或衍生物的有效量是这样一个量：该量有效地改变细胞繁殖和分化，或有效地防止、减少使用该多肽的症状的恶化，缓解或治愈该症状。本多肽的活性可通过采用对治疗正施用本发明多肽的同样症状有用的一种或多种添加的生物活性剂而得以增强和补充，所述生物活性剂比如是治疗癌症的IL-2、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子以及用于伤口愈合的类似物等。

在下列实施例中，本发明得以说明，但这些实施例不限制本发明。用于这些实施例中的生物材料是按以下途径获得的。对该神经受体的羰基末端的单克隆抗体（Ab-3）得自Oncogene Science（Uniondale，NY），对磷酪氨酸，PY＝20，的单克隆抗体得自Amersham（Arlington Heights IL）。对人体酪蛋白的小鼠单克隆抗体（β和K型）是R.C.Coombs（Charing Cross Medical School，London）的赠品。AU-565人乳癌细胞得自Cell Culture Laboratory，Naval Supply Center（Oakland，CA）。大鼠1-EJ细胞系（ATCC CRL 10984）是通过将人体EJ ras致癌基因转染成大鼠1成纤维细胞而产生的（如由Peles E.等人述于Cell 69：205-216，1992及由Land，H.等人述于Nature 304：596-602，1983），得自American Type Culture Collection（Rockville，MD）的细胞系包括：MDA-MB-231（ATCC HTB 26）、MDA-MB-453（ATCC HTB131）、Hs294T（ATCC HTB 140）、SK-BR-3（ATCC HTB 30）、HT-1080（ATCC CCL121）、BALB/C 3T3（ATCC CRL 6587）及COS-7（ATCC CRL 1651）。细胞按American Type Culture Collection所推荐的方法培养，或在用10%胎牛血清（Hyclone，Logan Utah）供给的Dulbecco改性Eagle培养基（GIBCO，Grolld Island，NY）中培养。

实施例1

天然存在的大鼠NRSF氨基酸序列分析

A.胰蛋白酶的消化作用

约44千道尔顿得自ras-转变的大鼠成纤维细胞（大鼠1-EJ细胞）条件培养基的天然存在的NRSF糖蛋白的提纯和氨基酸末端定序已被叙述过（Peles E.et al.，Cell 69：205-216，1992））。为获取用于设计单独的低核苷酸探针的多个氨基酸序列，按如下所述，将300微摩尔纯化大鼠蛋白用酪氨酸进行部分蛋白水解。10毫克蛋白在200μl的0.1M碳酸氢铵.缓冲液（pH7.8）中重新构建。用L-1-甲苯磺酰基酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮处理的酪氨酸（Serva）在37℃将此消化作用进行18小时，所用的酶与基质之比为1∶10。

B.用HPLC分离胰蛋白酶消化液

将所得肽混合物用反相HPLC分离，再用Vydac C₄微柱（2.1mm直径×15cm，300

）及带有二极管矩阵探测器和工作站的HP1090液相色谱系统在215nm处进行监测（图1）。该柱用0.1%的三氟乙酸（流动相A）补偿，而洗脱以线性梯度从0-55%的流动相B（90%的乙腈溶于0.1%三氟乙酸中的溶液）在70分钟内完成。流量为0.2ml/分，而该柱的温度控制在25℃。很早就从该柱上得到三个洗脱的吸收峰（保持时间小于5分钟），这说明这些馏分与短长度肽相对应。为确定氨基酸序列，回收三个其它的主要馏份：13分钟后洗脱的第一馏份（T13.3），21分钟后洗脱的第二馏份（T21.8）、及27分钟后洗脱的第三馏份（T27.3）。

C.洗脱的肽馏份的定序

与这三个主要洗脱馏份相对应的肽的氨基酸序列是以自动Edman降解来确定的。该肽的氨基酸序列分析用带有联机乙内酰苯硫脲（PTH）氨基酸分析仪的Model 477蛋白定序器（Applied Biosystems，Inc.，Foster City CA）和Model 900数据分析系统（Hunkapiller M.W.et al.，Methods of Protein Microcharacterization，Humana Press Clifton NJ，pages 223-247，1986）来进行。该肽被放在用polybrene和NaCl予循环的经三氟乙酸处理的玻璃纤维碟上。该PTH-氨基酸分析以采用复式喷射泵和反相（C-18）窄腔柱（Applied Biosystems 2.1mm×250mm）的微液色谱系统（Model 120）完成。第一馏份（T13.3）产生两个可辨别的主序列信号（信号比为5∶1）而长度为3和4个氨基酸（该序列示于图1）。第二馏份（T21.8）给出一个信号序列，它始于先前确定的基本N-末端氨基酸序列（Peles et al.，见上文，此第8个残基是精氨酸）的9号残基。肽T21.8的序列就这样地证实了得自整个蛋白的N-末端序列分析的信息，并将一个天冬氨酸配置于17位，该位在先前是以未配位的残基作报导的。第三馏份（T27.3）给出了达到Edman定序的12环的三个清晰的定序信号，及一个从环13到24的清楚的序列，这表明此第三肽是相当长的。

D.共洗脱肽的再色谱分析及定序

为精确确定馏份T27.3中的共洗脱肽的氨基酸序列，按下文方法处理此馏份的等分试样。将该肽馏份的70%的等分试样在真空中干燥。然后在100μl的0.2M碳酸氢铵缓冲液中重新构建。将二硫苏糖醇（最终浓度为2mM）加入此溶液，该液随后在37℃培育30分钟。此经还原的肽混合物随后以采用Vydac柱（2.1mm直径×15cm）的反相HPLC分离，洗脱条件及流量与前述相同。

两个主肽峰被发现，然后以上述的自动Edman降解来定序，即T34.4，一个11-残基精氨酸肽和T40.4，一个12-氨基酸长的赖氨酸肽（图1，插入图）。肽T34.4的残基1和来自T40.4的环11保持未配位，这表明它们可能是与馏份T27.3中的肽的二硫化物键相关的半胱氨酸残基。这种可能性为采用API-Ⅲ质谱仪（SCIEX，Toronto Canada）的电喷质谱分析所证实。分析肽T34.4和T40.4，结果得到分别为1261.5和1274.0的平均质数。因此结论是，这两种肽通过二硫化物键一起固定在天然存在的蛋白中。基于这些数据，可再检验峰T27.3的混合序列信号。当肽T34.4和T40.4的序列被从馏份T27.3的混合信号中扣除时，较长的第三肽的序列对于第一个12环也变得明显了。这个被扣除的肽的24-氨基酸的长序列被示于图1。在这种肽序列中的第9个氨基酸以天冬酰胺，但以很低的产率配置（约为该序列信号的10%），这表明一个N-连接的糖基化位点。

由于糖基团是构成天然存在的NRSF的分子重量以及估计约四分之一的分子质量的原因之一（Pales E.et al.，Cell 69：205-216，1992），在部分蛋白水解后只能回收到很少量的肽是未料想到的。一种可能性是该天然存在的蛋白含有在蛋白水解过程中保持完整，但是发生变性的蛋白酶-抗性核区，因而不能通过HPLC色谱法而溶解。

实施例2

将大鼠NRSF编码的cDNA克隆

A.cDNA库的建立

用标准方法（Maniatis，T.et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold spring Harbor Laboratory cold spring Harber，NY，1982）将RNA从Rat1-EJ细胞中分离，并用“mRNA Separator（分离器）”仪（Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA）选择多聚腺苷酸mRNA。用“Superscript”（上角标）仪（GIBCO BRL Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD）合成cDNA。将柱上分级的双链cDNA绑扎在SalⅠ-和NotⅠ-消化的pJT-2质粒载体上，以得到如图2中所示的含cDNA插入物的质粒。该pJT-2质粒载体由V19.8载体（ATCC 68124）衍生得到。特别是，V19.8的HindⅢ和SacⅡ克隆位点通过用合成低核苷酸联接物转变成SalⅠ和NotⅠ位点以产生pJT-2载体。通过电穿孔法将含cDNA插入物的质粒转化成DH10B E.coli细胞（Dower，W.J.et al.，Nucleic Acids Res.16：6127-6145，1988）。

B.cDNA探针的制备和克隆的分离

用两个低核苷酸探针来筛选约5×10⁵初级转化体，该探针是以NRSF的N-未端区域的联合氨基酸序列为基础的（如实施例1C中所述），特别是残基5-24（RGSRGKPGPAEGDPSPALPP）（序列标号：1）和T40.4胰蛋白酶肽的残基7-12（GEYMCK）（序列标号：2）。它们相应的序列（以反义表示）如下（“N”表示全部四个核苷酸）：

（1）5′-ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG GTC NCC

A

CTC NGC AGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA

T

GCC TCT-3′（序列标号：16）

（2）5′-TTT ACA CAT ATA TTC NCC-3′

C G G C

（序列标号：17）

这些合成的低核苷酸用具有T4聚核苷酸酶的α^-32p-ATP作端标记，并用于筛选各组复制的硝化纤维素滤器。该杂交溶液含有6×SSC，50mM磷酸钠（pH 6.8）、0.1%焦磷酸钠、2×Denhardt溶液，50μg/ml鲑精子DNA和20%甲酰胺（对探针1）或不含甲酰胺（对探针2）。杂交在42℃（对探针1）或37℃（对探针2）进行14小时。或者在50℃用0.5×SSC/0.2%SDS/2mM EDTA（对于探针1）或者在37℃用2×SSC/0.2%SDS/2mM EDTA（对于探针2）洗涤这些过滤器。过滤器的放射自显影给出与两个探针杂交了的10个克隆。通过如前面所述的再培养和探针杂交来纯化这些克隆。

实施例3

以转染的COS-7细胞表达重组体大鼠NRSF

为了验证按实施例2B中所述的初级筛选步骤所确定的cDNA克隆相应于NRSF-特种转录体，将这些克隆暂时表达在COS-7猴细胞中。为此目的，在SV40启动子和SV40未端侧的3′及聚腺苷酸化信号的控制之下将该cDNA克隆插入pJT-2真核表达载体中。所得质粒，这包括含克隆44cDNA的pJT-2/NRSF质粒（图2），如下所述地用于以电穿孔来转染COS-7细胞。将于0.8ml Dulbecco改性Eagle培养基（DEME）中的6×10⁶个细胞和10%胎牛血清转染到0.4cm小杯中，并同于10μl TE溶液（TE溶液为10mM三-HCl，PH8.0，1mM EDTA）中的20μg质粒DNA混合。电穿孔是在室温，1600伏和25μF，并用具有200欧姆的脉冲控制系统的BioRad Gene Pulser设备进行。然后将细胞稀释于20ml DMEM/10%胎牛血清中并转染到T75烧瓶（Falcon）中。在37℃培育14小时后，用DMEM/1%胎牛血清替换该介质，并再继续培养48小时。

然后，如下所述，测定所得经调整培养基的刺激MDA-MB-453人乳房肿瘤细胞中的该神经受体的酪氨酸磷酸化的能力。将该经调整的培养基用0.2目无菌滤器（Costar，Cambridge，MA）过滤并用Centriprep 10设备（Amicon，Beverly，MA）将其浓缩16倍。将该浓缩的培养基在含0.1%胎牛血清的磷酸缓冲盐水（PBS）中稀释，然后加到含3×10⁵MDA-MB-453细胞的48井皿的各个井中。接着于37℃培育5分钟后，将培养基吸出，再用磷酸酪氨酸（PY20）的单克隆抗体对该细胞进行western印迹。用于细胞溶解和western印迹的方案公开在Pele，E.等人的Cell69：205-216（1992）中。

该分析结果绘于图3中。尽管未经转染的COS-7细胞的培养基稍微诱发增加了酪氨酸的磷酸化，但由克隆44（即pJT-2/NRSF质粒）转染细胞所得的该培养基显著地更具活性。因此，克隆44cDNA通过再培养和通过过滤器杂交筛选而被完全纯化。图3（右图）将完全纯化克隆44的活性与任选的对照克隆27和29的活性进行了比较。很显然，在转染入COS-7细胞后，该完全纯化的克隆44cDNA产生的活性比对照质粒或部份纯化克隆（包括部份纯化的克隆44）高。基于克隆44杂交为两种单独的低核苷酸探针（实施例2B）及其导致合成生物活性NRSF的能力选择克隆44作进一步的DNA定序分析。

实施例4

大鼠NRSF cDNA的定序

根据制造商的说明，用373A自动DNA定序仪及“Taq DyeDeoxy^TMTerminator”循环定序仪（从Applied Biosytems，Inc.，购得，Foster City，CA）对克隆44 CDNA进行初级定序。按照制造商的说明，用³⁵S-dATP（Amersham）和“Sequenase^TM仪（从United Statas Biochemicals（Cleveland，Ohio）购得），来进行某些定序。用合成低核苷酸作为引物将克隆44的cDNA两链定序。克隆44的cDNA插入物的核苷酸序列分析得出一个含有扩展至该cDNA5′未端的436氨基酸长的开放解读密码（open reading frame）的1894bp序列。该解读密码3′未端的下游是594碱基长的未解释段落。后者包括多聚腺苷酸的尾端，在其前面是多聚腺苷酸化信号（AAATAAA）。由于在最长的开放解读密码的氨基未端未发现终止密码子和可识别的信号肽，则以相同方式来分析三个其他独立阳性cDNA克隆核苷酸序列。所有3个加入到5′的克隆终止了包括内-码（in-frame）终止密码子的292bp序列，这表明克隆44为缺少0.3千碱基的5′截形cDNA。

该cDNA克隆的组合核苷酸序列示于图4，而且克隆44 cDNA序列示于图5。该组合序列跨2186个碱基对，这包括多聚腺苷酸尾端，并且，如果该氨基末端蛋氨酸被认为是起始因子密码子，则其含有422个残基的开放解读密码。水疗法分析（图6）表明在该蛋白质的氨基末端没有凸出的疏水序列，该蛋白质对于蛋白质分泌可起到信号肽的作用（Von Hijne，G.，J.，Mol.Biol.184：99-105，1985）。然而，这种分析表明存在23个氨基酸的较高疏水段（图4中下面划线的），这被看作为潜在的横跨膜区。该区域对切NRSF的假定前体，且确定157个氨基酸的假定胞质区。该推断的细胞外区含有所有的直接由纯化蛋白质确定的肽序列（图4中指出的）。它们都完全比得上由除苏氨酸残基137外的cDNA所导出的序列，该残基是被赋予肽T27.3中的异亮氨酸的作用的（图1）。五个不同cDNA克隆在相应位置上将一个苏氨酸残基编码，表明这些变化不是由蛋白质的异构所造成。相反，蛋白质序列数据的重检测表明该异亮氨酸信号被从先前的Edman循环转换，并表明该苏氨酸由于O-糖基化而逃脱了探测。很明显，所有这些经定序的肽均位于假定外区的氨基酸末端的半区内。另半区内含有六个半胱氨酸残基，它们包含表皮生长因子（EGF）类似区（图7），由于它的结构非常紧密，知其是抗蛋白水解的（参照Massague，J.，J.Biol.Chem.265：21393-21396，1990）。该外区的另两个半胱氨酸残基（看来是象在NRSF中由二硫键联接的（实施例1D中所述））定义一种免疫蛋球白（Ig）同源单元（图8）。另外，该经断定的蛋白质序列包括4个N-键联糖基化的潜在位点，它们全部按氨基末端的意义归属于横跨膜区（在图4中用星号“＊”标注）。NRSF前体的经断定的全部结构示于图9。

根据绘于图9中的横跨膜区，NRSF前体应该聚积在高度表达NRSF mRNA的细胞表面上。对于EGF生长因子族中其他成员，已经发现膜结合的前体蛋白。例如，Brachmann，R.等人在Cell 56：691-700（1989）中已证明在表达转化生长因子αmRNA的细胞表面上存在转化生长因子α。特定结合NRSF的分子选择性地将治疗学分子导向过表达NRSF细胞。例如，增加抗重组NRSF能力并与治疗学分子配合的单克隆抗体可选择性地使治疗分子固定在高度表达膜结合的NRSF的细胞表面上。这类细胞包括具有激活ras基因的肿瘤细胞。抗体配对物可用化学疗法化合物、细胞分裂素、毒质、淋巴激活素或放射核素来构成。

实施例5

由转染的COS-7细胞表达的重组体NRSF的功能分析

先前已经报导过：由ras-转化的大鼠成纤维细胞分泌的同源纯化的、天然存在的NRSF抑制经培养的人乳房癌细胞的生长并诱导它们产生标志细胞分化的乳组分（Peles E.et al.，Cell 69：205-216，1992）。为了直接使这些活性与该克隆的DNA发生关系，测定由克隆44衍生的重组体NRSF对经培养的乳房癌细胞的作用。更具体地是，Au-565或MDA-MB-453细胞培养物用16倍浓缩的经调整的培养基处理，该培养基是由用克隆44pJT-2/NRSF表达载体（图2）或者用含有不相关cDNA插入物（克隆27）的对比pJT-2质粒所转染的COS-7细胞而得到。以1∶50的最终稀释度来使用这两种培养基，并用该细胞在37℃培育3天。然后用血细胞计数器来测定细胞数量，通过计算机处理图象分析来测量核面积。按Bacus，S.等人（Mol.Carinogensis 3：350-362（1990））所述的方法进行脂类和酪蛋白的染色。该实验重复三次并得到定性上类似的结果，结果列于表1中。

表1

具有脂滴的细胞数核面积具有酪蛋白的

细胞(%) (10⁴/cm²) (μ²) 细胞(%)

AU-565

细胞

对比 10 4×10⁴106 小于1

重组体 74 1.3×10⁴215.8 大于90

NRSF

MDA-MB

-453

细胞

对比 9 3.6×10⁴79.8 大于1

重组体 56 1.8×10⁴115.7 78

NRSF

该结果表明，用对比-调整过的培养基处理的Au-565和MDA-MB-453培养物大部份呈现为未成熟形态，而用含重组体NRSF的调整培养基处理的细胞则大部份呈现出有特征的成熟形态，这包括大的核和在细胞质中出现脂滴。对人体酪蛋白（P和X型）的免疫组织化学染色特性表明大部份这种细胞也合成酪蛋白，而用对照物处理的培养物则不同。结论是，尽管克隆44缺乏NRSF cDNA的5′未端部份，这种cDNA克隆导致功能活性NRSF的合成，它是由转染的COS-7细胞而产生的。

这一结论进一步被在配位体替代分析中重组体NRSF与天然存在NRSF竞争能力支持。根据制造商的说明，使用Iodogen（Pierce，Rockford，IL）以1mCi Na¹²⁵I将纯化的天然存在的大鼠NRSF作放射性同位素示踪。通过在Excellalose GF-5脱盐柱（Pierce）上的凝胶过滤将未反应的碘从该蛋白质中分离。该放射性同位素示踪的天然存在NRSF（¹²⁵I-NRSF）的具体活性是3×10⁶cpm/ng。该经放射性同位素示踪的NRSF（10微微摩尔）在4℃用生长于24井皿（costar）中单层MDA-MB-453细胞培育60分钟。该培育过程也可在存有由转染的COS-7细胞而得到的经调整的培养基时进行。通过用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次将未结合的¹²⁵I-NRSF去除、并可将该细胞溶于含0.1%SDS的0.1N NaOH溶液中。用γ-计数器来测定放射活性。

如图10中所示含有由COS-7细胞中的pJT-2/NRSF表达载体（图2）所表达的重组体NRSF的调整培养基将总¹²⁵I-NRSF结合减少约50%。对于负对照组而言，则使用由以含大鼠TGEα cDNA的pJT-2表达载体转染的细胞而得到的COS-7调整培养基（Blasband，A.et al.，Mol.Cell Biol.10：2111-2121，1990）。与该重组NRSF调整培养基相反，该TGFα调整培养基并不抑制¹²⁵I-NRSF结合。与纯化的、天然的、未示踪的NRSF（Peles，E.et al.，cell 69：205-216，1992）相比较，该重组体NRSF调整培养基的部份抑制效果被认为是由于其在结合测试中相当较低的浓度而造成的。另外，这也可能是由于高的非规定配位体结合之故。

为解决这一问题，也为证明与神经受体之间的直接相互作用，采用了共价交联分析。如上所述，通过在存有转染的COS-7细胞的调整的培养基时将MDA-MB-453细胞与¹²⁵I-NRSF结合而完成该分析。在于4℃结合1小时之后，以1mM最终浓度加入化学交联剂双（硫代琥珀酰亚胺基）辛二酸（BS³，Pierce），随后用PBS进行简单洗涤。在22℃培育45分钟之后，用淬火缓冲剂（在PBS中的10mM苷氨酸PH7.4）培育该单层物质10分钟。然后用冰冷的PBS洗涤该细胞两次，将之溶解于溶解缓冲液中，再根据Peles，E.等人在EMBO J.10：2077-2086（1991）中公开的方案，用单克隆抗体Ab-3对该神经蛋白质进行免疫沉淀。该经彻底洗涤的免疫复合物通过凝胶电泳（6%酰胺）而溶解并进行放射自显影。该分析结果（图11）表示该重组体NRSF不象重组体TGFα那样，它能替代大多数的受体-结合的¹²⁵I-NRSF。该结果证明克隆44cDNA将功能NRSF分子编码。

实施例6

NRSF表达的Northern印迹分析

为了确定NRSF mRNA的尺寸和组织分布，使用克隆44的cDNA插入物作为杂交探针进行Northern印迹杂交试验。通过对成年雌大鼠作手术而得到组织，用标准方法提取其RNA以及选择多聚腺苷酸+RNA（Manniatis，T.et al.，Molecular cloning：A Laboratory Manual，cold spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1982）。通过随机活化化方法（Feinberg，A.P.，and Vogelstein，B.，Anal.Biochem 132：6-13，1983），用α-³²P-dCTP将该1.9Kb长的克隆44的cDNA插入物进行标记。杂交条件如下：6×SSC，50mM磷酸钠（PH6.8），0.1%焦磷酸钠，2×Denhardt溶液，50μg/ml鲑精子DNA和50%甲酰胺。于42℃进行此杂交14小时，随后在60℃用0.2×SSC、0.1%SDS和2mMEDTA洗涤30分钟。将过滤物于-70℃以指示的时间通过一个增强滤光镜曝露于Kodak XAR X-Kay胶片。

图12（A）表明，在用多聚腺苷酸选择的Rat1-EJ成纤维细胞的RNA的Northern印迹中，显出三条带。它们的分子尺寸相应于6.8′2.6和1.7Kb。进一步的放射自显影后可看到两种附加的mRNA（未示）。NRSF在正常Rat或3T3成纤维细胞中表达的相对水平明显地低于在ras-转化细胞中的表达水平，这与早先的观察：由致癌基因ras基因所引起的转化与神经受体刺激活性相关是一致的（Yarden，Y.，and Weinberg，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：3179-3188，1989）。

在观察成年大鼠组织时（图12（B）），在脊髓中观察到了最高的NRSF mRNA表达。在脑组织中也检测到了最高的NRSF mRNAS。除了上述mRNA外，这些组织表达了一种其尺寸为3.4kb的变异体mRNA。被NRSF刺激的神经受体出现在人胎儿脊髓和脑中（Quirke，P.，et al.，Br.J.Cancer 60：64-69，1989），这说明NRSF和神经受体两者的表达调节了神经组织的生长和分化。在大鼠成神经细胞瘤中的神经受体基因的致癌基因活性（Bargmann，C，et al.，Nature 319：226-230，1986），在神经组织生长调节过程中进一步牵涉到该神经受体和NRSF。

借助其神经受体刺激活性，NRSF表达也可调节其他细胞类型的生长和分化。在正常分化的人体胃肠、呼吸、泌尿和生殖道以及皮肤的上皮细胞表面发现了该神经受体，而且该受体也表达在相应的人胎儿组织中（Press，M.et al.，Oncogene 5：953-962，1990）。图12（B）证明了在成年大鼠组织中NRSFmRNA表达水平的特定组织调节作用。阳性组织包括肺、卵巢和胃。在皮肤、肾和心脏中呈现量相对低的中等尺寸的转录产物。在肝、脾和肌肉中不含有可探测到的NRSFmRNA。图12（B）还表明与不同NRSFmRNA种类成相关比例的特定组织的改变。每一种变异体mRNA都将具有不同生物性质的变异体NRSF蛋白编码。天然的NRSF可以通过特定组织中的NRSFmRNA结构和表达水平的变化而调节细胞的增殖和分化。本发明非天然的NRSF的施用，特别是对缺乏正常水平的天然NRSF蛋白的被损伤的或患病组织，可提供神经受体刺激作用，也可调节所治疗组织的细胞生长和分化。特别是，心脏、胃、脑、脊髓、卵巢、肺、肾和皮肤组织表达天然存在的NRSF并可期望响应用本发明重组体NRSF的治疗。

异常的NRSF或神经受体的表达可导致对瘤产生影响的autocrine相互作用，（Browder，T.et al.，Cancer Cells，1：9-17，1989;Yarden Y.，and Ullrich，A.，Ann.Rev.Biochem.57：443-448，1988）。在由孵巢、肺和胃组织衍生的人肿瘤中出现神经受体基因的过表达或加强（Slamon，D.et al.，Science 244：707-712，1989;Tal.M.et al.，Cancer Res.48：1517-1520，1988;Cline，M.et al.，Cancer 60：2669 et seq.，1987）。这些组织表达神经受体刺激因子（图12（B）），这可影响肿瘤的生长。图12（C）表明人体肿瘤细胞可过表达NRSFmRNA。对人体肿瘤细胞系的初始观察发现：HT-1080纤维肉瘤细胞、Hs294T黑素瘤细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞表达了其含量有所增加的NRSFmRNA（图12（C））。对神经受体或者对其同源神经受体刺激因子表达的干扰可以明显改变正常细胞的生长和分化，同时具有病理学后果，例如肿瘤发育。本发明的重组体NRSF可以在天然NRSF不足、或当神经受体被过表达时的情况下用于恢复神经受体和NRSF之间的被平衡的相互作用。

NRSF异常肿瘤细胞表达可能是由活化的致癌基因造成。NRSFmRNA表达在用ras致癌基因转化的细胞中显著地增加（图12（A））。活化的ras基因在多种癌细胞系和在几种器官（包括结肠、肺、胆囊、尿囊）的人肿瘤和胰腺癌以及黑色素瘤、肉瘤和白血病中被发现（Pimmental，E.，Oncogenes，2nd Edition，Volume Ⅱ，CRC Press，Boca Raton FL，1989）。在恶化前的组织（例如人结肠直肠腺瘤）中也发现了活化的ras突变，并认为这对于肿瘤发生产生影响（Fearon，E.，and Vogelstein，B.，Cell 61：759-767，1990）。用本发明的NRSFDNA和NRSFmRNA探测方法，可以在恶化和恶化前的人体组织中发现增加了的NRSF表达。其他方法也可在人体组织中鉴定增加了的NRSF表达。为分析蛋白质和mRNA表达技术领域的普通技术人员所知的这些方法包括免疫组织化学分析法、放射免疫测定法、酶连接免疫吸收测定法、及聚合酶链反应测定法。恶化前的和恶性细胞中过表达NRSF的鉴定对于疹治人体癌症特别有用。

序列表

（1）序列标号：1的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：20氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：1

Arg Gly Ser Arg Gly Lys Pro Gly Pro

Ala Glu Gly Asp Pro Ser Pro Ala Leu

Pro Pro

（2）序列标号2的信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：6氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：2

Gly Glu Tyr Met Cys Lys

（3）序列标号3信息：

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：2186碱基对

（B）类型：核酸

（C）线型：双链

（D）拓补学：未知

（ⅹⅰ）序列描述：SEQ ID NO：3

（4）序列标号：4的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：1894碱基对

（B）类型：核酸

（C）线型：双链

（D）拓补学：未知

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：4

（5）序列标号：5的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：64氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：5

Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Thr Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn Val Pro Met Lys Val Gln Thr Gln Glu Lys Ala Glu Leu Tyr Gln Lys Arg Val Leu Thr

（6）序列标号：6的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：60氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：6

Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Tyr Cys Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Glu Lys Pro Ala Cys Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Val Arg Cys Glu His Ala Asp Leu Leu Ala Val Val Ala Ala Ser Gln Lys Lys Gln Ala Ile Thr Ala Ala Val Val Val

（7）序列标号：4的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：60氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：7

Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Asn Cys Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys Thr His Ser Met Ile Asp Ser Ser Leu Ser Lys Ile Ala Leu Leu Ala Ile Ala

（8）序列标号：8的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：61氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：8

Cys Pro Ser Ser Tyr Asp Gly Tyr Cys Leu Asn Gly Gly Val Cys Met His Ile Glu Ser Leu Asp Ser Tyr Thr Cys Asn Cys Val Ile Gly Tyr Ser Gly Asp Arg Cys Gln Thr Arg Asp Leu Arg Trp Trp Glu Leu Arg His Ala Gly Tyr Gly Gln Lys His Asp Ile Met Val Val

（9）序列标号：9的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：60氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：9

Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Val Tyr Thr Tyr Asp His Thr Thr Ile Leu Ala Val Val Ala

（10）序列标号：10的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：60氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：10

Cys Ala Ala Lys Phe Gln Asn Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Arg Tyr Ile Glu Asn Leu Glu Val Val Thr Cys His Cys His Gln Asp Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Thr Met Lys Thr Gln Lys Lys Asp Asp Ser Asp Leu Ser Lys Ile Ala Leu Ala Ala Ile Ile

（11）序列标号：11的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：61氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：11

Cys Gly Pro Glu Gly Asp Gly Tyr Cys Leu His Gly Asp Cys Ile His Ala Arg Asp Ile Asp Gly Met Tyr Cys Arg Cys Ser His Gly Tyr Thr Gly Ile Arg Cys Gln His Val Val Leu Val Asp Tyr Gln Arg Ser Glu Asn Pro Asn Thr Thr Thr Ser Tyr Ile Pro Ser Pro

（12）序列标号：12的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：48氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：12

Cys Asn His Asp Tyr Glu Asn Tyr Cys Leu Asn Asn Gly Thr Cys Phe Thr Ile Ala Leu Asp Asn Val Ser Ile Thr Pro Phe Cys Val Cys Arg Ile Asn Tyr Glu Gly Ser Arg Cys Gln Phe Ile Asn Leu Val Thr Tyr

（13）序列标号：13的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：49氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：13

Cys Asn Asp Asp Tyr Lys Asn Tyr Cys Leu Asn Asn Gly Thr Cys Phe Thr Val Ala Leu Asn Asn Val Ser Leu Asn Pro Phe Cys Ala Cys His Ile Asn Tyr Val Gly Ser Arg Cys Gln Phe Ile Asn Leu Ile Thr Ile Lys

（14）序列标号：14的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：65氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：14

Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Arg Phe Arg Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Asn Arg Lys Asn Asn Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ser Glu Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser

（15）序列标号：15的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：65氨基酸残基

（B）类型：氨基酸

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：15

Val Thr Leu Thr Cys Glu Ala Ser Gly Asp Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Arg Thr Ser Thr Arg Asn Ile Ser Ser Glu Glu Gln Asp Leu Asp Gly His Met Val Val Arg Ser His Ala Arg Val Ser Ser Leu Thr Leu Lys Ser Ile Gln Tyr Arg Asp Ala Gly Glu Tyr Met Cys Thr Ala Ser Asn

（16）序列标号：16的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：60碱基对

（B）类型：核酸

（C）线型：单链

（D）拓补学：线性

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：16

ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG RTC NCC YTC NGC AGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA GCC TCT

（17）序列标号：17的信息

（ⅰ）序列特征：

（A）长度：18碱基对

（B）类型：核酸

（C）线型：单链

（D）拓补学：线性

（ⅹⅰ）序列描述：序列标号：17

YTT RCA CAT RTA YTC NCC

Claims

1、一种非天然存在的多肽，该多肽含有充分复制的，足以使该多肽具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的生物活性的天然的神经受体刺激因子的氨基酸序列。

2、根据权利要求1的多肽，它是外源DNA序列的原核或真核表达的产物。

3、根据权利要求2的多肽，它是非人类哺乳动物细胞表达的产物。

4、根据权利要求3的多肽，其中的非人类哺乳动物细胞是CHO细胞。

5、根据权利要求2的多肽，它是E.Coli细胞表达的产物。

6、根据权利要求2的多肽，它是酵母细胞表达的产物。

7、根据权利要求2的多肽，其中的外源DNA序列是cDNA序列。

8、根据权利要求7的多肽，其中的cDNA序列是图5的DNA序列（序列标号：4）。

9、根据权利要求2的多肽，其中的外源DNA序列是图5的cDNA序列（序列标号：4）同源的基因DNA序列。

10、根据权利要求2的多肽，其中的外源DNA序列是经加工的DNA序列。

11、根据权利要求2的多肽，其中该外源DNA序列被载于自发复制的DNA质粒或病毒载体上。

12、根据权利要求1的多肽，该多肽含有列于图5中的大鼠神经受体刺激因子的氨基酸序列（序列标号：4），或其任一种遗传操纵的变体。

13、根据权利要求2的多肽，该多肽含有列于图7中的大鼠神经受体刺激因子的EGF-类区域的氨基酸序列（序列标号：5）。

14、根据权利要求1的多肽，它含有列于图8中的大鼠神经受体刺激因子的免疫球蛋白类区域的氨基酸序列（序列标号：14）

15、根据权利要求1的多肽，它具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的体内生物活性。

16、根据权利要求1的多肽，它具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的体外生物活性。

17、一种用于一种在确保多肽产物的原核或真核寄主细胞中的表达的经分离DNA序列，该多肽产物具有一种充分复制的，足以使该多肽具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的生物活性的天然存在的神经受体因子的氨基酸序列，所述DNA序列选自：

（a）列于图4和5中的DNA序列（序列标号：3和序列标号：4）或其辅链;

（b）杂交到（a）中所定义的DNA序列或其片段上的DNA序列;以及

（c）杂交到（a）和（b）中所定义的DNA序列上的，但不包括退化的遗传密码的DNA序列。

18、一种原核或真核寄主细胞，该细胞以可使该寄主细胞表达该多肽产物的方式被权利要求17的DNA序列所转化或转染。

19、一种在原核或真核寄主细胞中表达权利要求17的DNA序列的多肽产物。

20、一种使多肽的原核或真核寄主表达编码的经分离的DNA序列，该多肽具有一种充分复制的足以使该多肽具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的生物活性的天然存在的神经受体刺激因子的一种氨基酸序列。

21、根据权利要求20的CDNA序列。

22、根据权利要求20的遗传DNA序列。

23、根据权利要求20的经加工的DNA序列。

24、根据权利要求20的列于图4和图5中DNA序列（序列标号分别为3和4）。

25、根据权利要求20的DNA序列，它包括一种或多种易于在E.Codi细胞中表达的密码子。

26、根据权利要求20的DNA序列，它包括一种或多种易于在酵母细胞中表达的密码子。

27、根据权利要求20的DNA序列，它包括一种或多种易于在哺乳动物细胞中表达的密码子。

28、一种包括根据权利要求20的DNA序列的生物功能质粒或病毒DNA载体。

29、一种用根据权利要求20的DNA载体稳定转化或转染的原核或真核寄主细胞。

30、一种在根据权利要求20的DNA序列的原核或真核寄主细胞中表达的多肽产物。

31、一种DNA序列，该序列使天然存在的神经受体刺激因子的多肽片段或多肽类似物编码。

32、如权利要求31的DNA序列，该序列使甲硫氨酰基神经受体刺激因子编码。

33、一种多肽，该多肽具有部份或全部的列于图5中的氨基酸序列（序列标号：4）并具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的体内或离体外的生物活性。

34、一种多肽，该多肽具有部份或全部的天然存在的神经受体刺激因子的次级结构并具有部份或全部的列于图5中的氨基酸序列（序列标号：4），以及具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的生物活性。

35、一种DNA序列，该序列对选自下列物组的人体神经受体刺激因子的类似物进行编码：

a）[Met-1]神经受体刺激因子;和

b）其中的一个或多个半胱氨酸被丙氨酸或丝代替的神经受体刺激因子。

36、一种表达在根据权利要求35的DNA序列的原核或真核寄主细胞中的多肽产物。

37、一种具有一种或多种天然存在的神经受体刺激因子的生物活性的非天然存在的多肽，所说的多肽具有一种列于图5中的氨基酸序列（序列标号：4），或其任一种衍生物、缺失类似物、取代类似物、加成类似物，其特征是该多肽为外源DNA序列的原核或真核表达的产物。

38、一种制备神经受体刺激因子的方法，该方法包括：

在适宜的营养条件下，使用根据权利要求17的DNA转化或转染的原核或真核寄主细胞生长，和分离所需的在所述载体中的DNA序列表达的多肽产物。

39、一种调节细胞增殖和分化的方法，该方法包括用有效量的重组体神经受体刺激因子来接触该细胞。

40、权利要求39的方法，该方法是在哺乳动物中进行的。

41、权利要求40的方法，其中的哺乳动物是人。

42、一种增强修复和再生表达该神经受体的人体组织的方法，该方法包括施用有效量的重组体神经受体刺激因子。

43、权利要求42的方法，其中该组织选自胃肠的、呼吸的、泌尿的和生殖道的组织。

44、权利要求42的方法，其中该组织包括人体皮肤。

45、权利要求42的方法，其中该组织为神经组织。

46、一种治疗在表达神经受体的人体组织中神经受体刺激因子缺乏症的方法，该方法包括给患有这种缺乏症的病人施用有效量的重组体神经受体刺激因子。

47、一种治疗在肿瘤细胞表面上表达神经受体的哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括给患有这种肿瘤的哺乳动物施用一定量的重组体神经受体刺激因子以有效地降低肿瘤的生长。

48、权利要求47的方法，其中的哺乳动物是人。

49、权利要求48的方法，该法用于治疗选自由前列腺、卵巢、乳房、胃、肺、肾和皮肤癌所组成的组中的癌症。

50、一种药物组合物，该组合物含有有效量的重组体神经受体刺激因子和可药用的稀释剂、辅剂或载体。

51、一种通过用权利要求12的多肽进行的免疫作用而专门产生的抗体。

52、根据权利要求51的抗体，它是单克隆抗体。

53、一种生物活性组合物，该组合物含有共价联接在水溶性聚合物上的权利要求1的多肽。

54、根据权利要求53的组合物，在其中该聚合物选自由聚乙二醇及聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物所组成物的物组。

55、一种探测人体细胞或组织中神经受体刺激因子mRNA欠表达或过表达的方法，该方法包括：

（a）从该细胞或组织中分离出RNA;;

（b）用核酸探针与RNA接触，所述核酸探针在适于该探针与核酸杂交的条件下是能与存在于神经受体刺激因子mRNA中的核酸序列杂交的;以及

（c）确定该RNA和探针之间的杂交水平，作为鉴定该神经受体刺激因子mRNA的欠表达或过表达的指示。