CN1129805A - 人促血小板生成素变异体、其cDNA克隆表达及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人促血小板生成素(TPO)变异体，其互补DNA克隆和表达，以及其活性检测方法及应用。本发明的人促血小板生成素变异体与天然TPO具有至少50％的同源性，其保留原始氨基酸序列第170位的胱氨酸，但第113位氨基酸由glu变异为gln。本发明TPO变异体的发现、成功地克隆和真核细胞表达为血小板增殖/分化异常性疾病及其他相关疾病的诊断和治疗提供了新的工具。本发明使用TF-1细胞株和小鼠骨髓干细胞作为体外活性检测的反应细胞，进一步提高了TPO活性检测的再现性和灵敏性，而且操作更为简便。

Description

人促血小板生成素变异体、其cDNA克隆表达及检测方法

本发明涉及新的人促血小板生成素变异体，其cDNA克隆和表达，以及其活性检测方法和应用。

一般认为，血小板产生是受谱系特异性体液因子调节的，且其中主要因子是称为促血小板生成素(TPO)的细胞激活素(Mcdonald，T.P，P.Expl，Hematol，16：201～～205(1988))。也已报导了称为巨核细胞集落刺激因子(meg-CSF)或促血小板生成素(TPO)的活性，前者影响巨核细胞的分化，后者影响巨核细胞的成熟与血小板的产生(Williams，N.et al，Blood cell，15：123-133(1989))。另外，一些研究结果揭示，原致癌基因C-Mpl的配体可能是与meg-CSF或TPO活性相似的巨核细胞谱系特异性生长因子。最近，de Sauvage F.J等人从再生障碍性贫血猪的血浆中纯化了Mpl配体(ML)，并利用所得到的氨基酸序列信息分离了人ML互补DNA(cDNA)(Nature，369：533-538(1994))。证明ML与促红细胞生成素(EPO)有序列同源性，并且具有meg-CSF和促血小板生成素样活性。Si Lok等人也克隆了由原致癌基因C-Mpl编码的蛋白的配体的成熟cDNA序列(Nature，369：565-568(1994))。结果揭示C-Mpl的配体即是促血小板生成素。谱系特异性的C-GMpl的配体支持巨核细胞集落形成，在发育的晚期阶段增大巨核细胞体积，多倍体化及分化标志的表达。在体内，C-Mpl配体通过扩充骨髓与脾巨核细胞及其祖细胞刺激血小板产生(K.Kaushansky et.al，Nature，369：568-571(1994))。另外，F.Wendling等人(Nature，369：571-574(1994))的实验显示，C-Mpl编码的受体与参予血小板体内平衡节之体液因子的配体(C-Mpl配体)结合，并提示C-Mpl配体、TPO和meg-CSF是同一种分子。

R.C.Skoda等人(The EMBO J.12(7)：2645-2653(1993))曾报导了一种新的截短形式的Mpl蛋白质，并证明可从被转化的COS-1细胞的溶胞产物中同时免疫沉淀出全长和截短形式的Mpl蛋白质，而这种含分泌信号但无跨模序列的截短形式的Mpl，则不存在于培养液中。最近，在我们的发明完成之后，Gurney，A.L.等人(Blood，85：981～988，1995)进一步报导了称为TPO2的新的TPO变异体。

已经证明，在TPO的生物合成系统中因存在RNA替换剪切(RNAAlternative Splicing)过程，导致全长TPO序列中四个连续的氨基酸序列¹³²LPPQ¹³⁵丢失，从而得到该变异体。一般认为，TPO变异体(TPOV)蛋白质参予胚胎早期巨核细胞干细胞的分化和增殖，且随着胚胎发育过程的进展，TPO和TPOV之间形成一个特有的生理平衡，从而调整节TPO表达水平。任何内在和外在干扰因素的影响，打破这种正常平衡状态，均可导致血小板细胞分化和发育的异常或障碍。因此，这些新的血细胞生长因子的发现及对其功能的阐述，将有利于进一步了解血小板功能异常相关疾病的发病机理，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供依据。

就下述本发明TPOV的一级结构而言，特别值得注意的是，其C末端氨基酸顺序和其完整顺序中段出现的glu→gln氨基酸突变。虽然目前对TPO和TPOV的C末端氨基酸顺序的功能尚未完全阐明(Nature 369：365～568，1994)，但据信该多肽片段可以用作例如使用核糖核酸酶保护检测法(RNase Protection Assay)和利用特异性单克隆抗体的免疫检测法诊断某些血小板生成异常性疾病或其他恶性血液病的标记物。另外，尽管TPOV序列中glu-gln氨基酸突变的意义尚有待进一步研究，但这一突变对于鉴别TPO和TPOV无疑是十分重要的。

再者，业已发现，主要以膜结合蛋白质形式存在的TPOV，在微量条件下即表现出对骨髓干细胞的刺激作用，此揭示TPOV也同样会影响某些髓样白血病细胞或髓样间变细胞。因此，对TPOV的进一步深入研究，将有助于了解这些恶性病变的机理，为寻找进行基因治疗和蛋白质工程治疗的途径提供基础。

因此，本发明的目的是基于某些细胞因子广泛存在的RNA替换剪选(RNA Alternative Splicing)机制，而产生多种与细胞分化过程有关的细胞因子变异体这一事实，利用DNA重组技术分子克隆可能存在的新的TPO变异体。

本发明的再一个目的是建立检测本发明的TPOV活性的新的检测方法，即本说明书下文所述的TF-1细胞增殖活性检测法和CFU-MK(CFU-meg)为基础的活性检测法。

本发明进一步的目的是制备特异性结合TPO变异体中变异氨基酸或氨基酸片断的抗体，用以鉴别TPO和TPO变异体；建立一种简易准确的核苷酸分析方法，以区分TPO和TPO变异体，从而用于血小板及其他血液病的诊断。

因此，本发明提供了如图2所示的一种新的促血小板生成素变异体多肽序列及其cDNA编码序列。

本发明进一步提供了以DNA重组技术制备上述促血小板生成素变异体的方法，该方法包括以下步骤：

1)提供人胚肝细胞cDNA库作为模板，

2)以下列合成的寡核苷酸对为引物，经逆转录酶—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增所需的DNA序列，

①5′CTAG ATC  AAG CTT AAC AGG GAG CCA

②5′GAT CCT  AGA ATT CTT ACC CTT CCT GAG ACA 3′

3)将所得到的扩增产物与适当的质粒载体连接，

4)用所得到的重组质粒转化适当的宿主细胞，

5)在适于表达TPOV多肽的条件下培养被转化的宿主细胞并回收所需的TPOV多肽产物。

本发明进一步提供了以TF-1细胞增殖检测法检测样品中TPO活性的方法，特征在于其改进包括使用TF-1细胞作检测程序中的效应细胞。

另外，本发明还提供了以骨髓干细胞反应检测法体外检测TPO活性的方法，该方法包括以下步骤：

1)提供适当数目作为效应细胞的小鼠骨髓干细胞；

2)在有丝分裂素激活的脾细胞悬液存在下，向培养的小鼠骨髓干细胞中加入待检TPO或TPOV样品；

3)待半固体凝胶形成后进行乙酰胆碱脂酶(AchE)染色；

4)基于AchE阳性巨核细胞数判断被检测样品中的TPO或TPOV活性。

本发明进一步提供了本发明的TPOV蛋白质在血小板生成异常相关疾病的诊断中的应用，其中所用的诊断方法包括核糖核酸酶保护检测法和使用特异性单克隆抗体的免疫检测法。

最后，本发明提供了以本发明的TPOV蛋白质为活性成分，并含有医药上可接受的载体及赋形剂的药物组合物，以及该组合物在治疗血小板细胞分化与发育异常相关疾病中的应用。

为了实现本发明的上述目的，我们以已建立的人胚肝细胞cDNA库为模板，利用反转录酶—聚合酶链反应(ET-PCR)技术，以下列合成的寡核苷酸对作为引物，经30次循环(95℃1分钟、52℃1分钟、72℃2分钟)扩增所说的引物对：

①5′CTAG ATC  AAGCTTAAC AGG GAGCCA

②5′GAT CCT A GA ATT CTT ACC CTT CCT GAG ACA 3′所得PCR反应混合物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，发现除TPO主带外，还可见一个分子量较小的可能的TPO变异体带，但也不能排除该带是由混入杂质而出现的PCR非特异性反应带。为了区别这两种可能性，我们将PCR产物直接连接到一种TA克隆质粒pCR II(InVitrogen，CA，USA Cat# K2000-01)上，分别得到重组质粒pCRT和pCRTV(见实施例1)。将这些重组载体转化到大肠杆菌(Ecoli)中并培养该重组体大肠杆菌细胞。然后从中分离并纯化质粒DNA，并进行DNA序列分析。将所得序列与de Sauvage等人(Nature 369：533～538，1994)报导的原始TPO编码DNA序列相比较，发现扩增的pCRT的PNA序列与已知的TPO编码序列完全相同，但扩增的pCRTV的DNA序列则比原始TPO编码DNA序列短116个碱基对。令人惊奇的是，除存在个别碱基的改变，导致第113位glu改变为gln外，TPOVDNA序列中前159个密码子所编码的氨基酸顺序与已公开的原始TPO编码顺序所对应的氨基酸顺序完全相同，但自第160个密码子之后，却出现移码，导致TPOV的C末端氨基酸序列全部发生变异(尽管核苷酸序列仍相同)(见实施例2和附图2)。另外，还发现在TPOV中第170位上的胱氨酸仍然保留。并在该DNA序列的C末端第273个密码子至第286个密码子间存在一个潜在的疏水部分。

DNA序列分析证实，TPOV是因为应用了与TPO不同的替换剪接接收位点(alternative splice acceptor sites)而产生的替换剪接变异体，这种变异体的存在很可能是TPO的表达调控机制之一。而且鉴于存在C末端疏水部分，推测其可能构成一个细胞膜结合区域，进而导致TPOV与野生型TPO功能活性上的差异。另外由于仍存在原始TPO序列中的170位胱氨酸，故推测本发明TPOV仍保留有与原始(野生型)TPO蛋白质相似的二级结构。

为了进一步了解已构建好的pCDIT1、pCDIT2和pCDIT3转录和翻译产物的结构差异及特征，并明确其实际分子量，我们使用TNT免网织红细胞体外转录/翻译系统(Promega，Cat.USA)，按试剂盒制造商推荐的方法进行了体外转录/翻译实验。在琼脂糖凝胶上对体外翻译产物进行电泳分离，并与分子量标志物相比较，测得TPOV翻译产物的分子量约为31,500道尔顿和29,100道尔顿(参见实施例5)。这一结果与我们使用计算机序列分析程序预测的分子量(29,172道尔顿)基本相同。而TPO野生型和截短体的分子量分别为62 KDa和16.5 KDa。

下列表1总结了本发明的TPOV蛋白质与已报导的原始(野生型)TPO蛋白质一级结构特征的比较。

表1 TPOV与原始TPO蛋白质结构比较

	原始TPO	TPO变异体(TP0V)
			氨基酸数目N-糖链蛋白酶切点EPO相符区域氨基酸组成存在方式单氨基酸变异C末端疏水区	353个(成熟为332个)6个(位于C段)有有(位于N末端)约50％序列完全不同膜结合蛋白质332氨基酸分泌蛋白质153氨基酸Glu113无	286个(成熟为265个)1个(位于C段)无部分保留(N端)50％序列不同可能为一种265个氨基酸的膜结合蛋白质Gln118有潜在的膜结合部位

为进一步证实TPOV的活性，本发明人将pcRT和pcRTv质粒分子HindIII和ECOR1切割的插入片段分别克隆到pcDNAI/Amp和pcDNA3(购自InVitrogen，CA，USA)真核细胞表达载体上(MolecularCloning，F6～F7，2nd，Edition，1989)，从而得到暂短转染载体pCDI/T1和pCDI/T3(TPO)及稳定表达载体pcD3/T1和pcD3/T3(TPOV)。截短体TPO153即由TPO分子N端153个氨基酸组成，也以相同方法克隆到上述表达载体中，分别称为pCDI/T2和pCD3/T2。

应用pcDNAI/Amp和pcDNA3为基础的重组表达载体pCDI/T1～T3和pCD3/T1～T3，用经典的DNA-磷酸钙沉积转染法(Mol.Cell.Biol.7：2745～2752，1987)转染COS-1和NIH3T3细胞(ATCC，LRL1658)。转染的细胞经无血清培养后，收集上清液、浓缩提纯继而进行活性分析。

我们利用以小鼠骨髓细胞为指示细胞的外体检测系统，在细胞有丝分裂素刺激的小鼠脾细胞悬液或其培养物上清液存在下，检测上述被转染的COS-1细胞或NIH3T3细胞培养物上清液。结果令人惊奇地发现，只有同时存在美洲商陆刺激的小鼠脾细胞PWM-SCM培养物的实验组才显示有巨噬核细胞的分化和增殖，而未加PWM-SCM的对照组，无论是TPO还是本发明的TPOV表达产物，均没有表现出对体外小鼠骨髓祖细胞的增殖/分化刺激作用。根据这一发现，我们推测骨髓干/祖细胞，在其发育成熟的特定阶段可能在细胞表面上存在特异性受体。而这正与本文前面讨论过的，在细胞发育的早期阶段产生并存在促血小板生成素变异体这一发现相符合。

如前所述，在经DNA序列分析，进一步弄清本发明TPOV序列特征的基础上，我们可以基于其序列特征，适当设计包含变异氨基酸的肽片段，并以其作为免疫原材料免疫动物(如羊或兔)，按已知的杂交瘤技术(Kohler，G.and Milstein，C.，Nature 256：495-497，1975)制备对本发明TPOV特异的单克隆抗体，为血小板生成与发育异常性疾病的诊断和治疗提供有用的材料和工具。

图1显示人促血小板生成素(TPO)的互补DNA序列，以及由该DNA推测的人促血小板生成素的氨基酸序列。

图2显示人促血小板生成素变异体(TPOV)的互补DNA序列，以及由该DNA序列推断的TPOV氨基酸序列。

图3显示以聚合酶链反应(PCR)扩增人胚肝细胞cDNA库的1％琼脂电泳图谱。

图4显示对经过快速组装的含PCR片段之重组分子的1％琼脂电泳图谱。

图5显示对质粒pCRT7和pCRT8所作限制性酶切分析。

图6显示对质粒pCRT7和pCRT8中HindIII/EcoRI酶切片段所作1％琼脂胶电泳分析。

图7显示对三种不同类型TPO重组表达质粒的限制性酶切分析。

图8显示重组质粒pcD1T1的基因构建图。

图9显示重组质粒pcD1T2的基因构建图。

图10显示重组质粒pcD1T3的基因构建图。

图11显示重组质粒pcD3T1的基因构建图。

图12显示重组质粒pcD3T2的基因构建图。

图13显示重组质粒CD3T3的基因构建图。

图14显示利用兔纲织红细胞系统对pcD1T重组质粒DNA所作体外翻译产物的电泳分析。

图15显示对TPO及其变异体所作体外TF-1细胞增殖活性实验的结果。

图16显示TPO及其变异体对小鼠骨髓细胞的增殖/分化刺激活性。

如前所述，本发明提供了新的人促血小板生成素变异体互补DNA序列，以及由之编码的具有促进哺乳动物骨髓干细胞向巨噬细胞转化及血小板增殖活性的新的多肽。该多肽全长度为286个氨基酸，其去掉前导序列的成熟形式包含265个氨基酸。经琼脂糖凝胶电泳分析其cDNA序列的体外转录/翻译产物，证实分子量约为29.1KDa。另外，相伴随还有一截短形式的TPO cDNA翻译产物，其包含153个氨基酸(并因此称之为TPO153)，分子量约16.45KDa。

为了得到本发明的TPOV，我们利用市场上可购得的人胚肝细胞cDNA库，设计并合成适当的引物，以聚合酶链反应(PCR)技术扩增得到一大小约1.100bp的PCR产物。进一步的序列分析证实其为编码人TPO的cDNA，其序列示于图1中。在该PCR产物琼脂糖凝胶电泳谱上除了PTO主带外，还令人惊奇地见有一较小的副带，经反复检测和分析，推测该带即是本发明的TPO cDNA的变异体。经DNA序列分析，表明其大小约862bp，编码含286个氨基酸的多肽，即本发明的人促血小板生成素变异体。

从图1所示的序列可以看出，我们从人胚肝细胞cDNA库中经PCR扩增得到的cDNA核苷酸序列及由之推测的氨基酸顺序与已报导的TPO序列完全相同(de Sauvage et al.，Nature 369：533-538，1984；Si LOK et al.，Nature 369：565-568，1994)。图1中单线标出信号肽，

号为成熟分子的第一个氨基酸；△为四个胱氨酸位置；*号为N-联糖链位点；↓为蛋白酶切点。此位点之前的氨基酸序列即为TPO的153个氨基酸截短体形式(TPO153，即T2)。RNA替换剪切接收位点(第476～477的AG)已框出，双底线为TPOV缺失片段。

如图2所示，本发明的新型TPO变异体(TPOV)具有21个氨基酸长的信号肽序列，而其成熟多肽分子起始于第22位丝氨酸处。特别令人感兴趣的是，TPOV在160位残基之前与已知的野生型序列完全相同，而自第160位残基开始其cDNA编码序列发生移码现象，致使下游大约50％的氨基酸序列完全改变，以此构成本发明TPO变异体TPOV的特征性序列。

图2中，记号·标示为核苷酸突变或变异点，双底线注明由单一硷基变化导致的第113位氨基酸Glu突变为Gln。C未端的下标曲线标示可能存在的疏水区域，即膜结合区域。

附图3显示以人胚肝细胞cDNA库为模板，以已知的TPO序列5′和3′端正反序列为引链进行聚合酶链反应的结果。其中

第一带区出现主带(大箭头)和副带(小箭头)两种产物。

第二带区为TPO的截短体(153个氨基酸)的PCR产物。

第三带区为硷基对标准物(Φ×174/HaeIII片段)，片段大小自上而下分别为1353、1078、872、603，和310bp。第一带区的主带约1100bp，副带约1000bp长。从此图中可以推测，主带是正常TPO，而副带可能是假PCR产物或一种新的变异体。

为了获得本发明TPOV的重组表达，本发明人使用TA克隆试剂盒(InVitrogen)以PCR产物直接克隆法，将按上述方法制得的，如图3所示的PCR扩增片段直接克隆到质粒载体pCRII(文献)中。用所得重组质粒转化大肠杆菌后，根据其抗生素(氨苄青霉素)抗性标志选择适当的转化株，并从中分离所需的TPO及TPOV cDNA。从10个阳性菌落中分离DNA样品并分别用HindIII和EcoRI消化，然后对消化产物进行1％琼脂糖电泳分离。图4标出数字1-10分别指示点样10份DNA样品的泳道。图中，左侧M为λ噬菌体DNA/HindIII的片段标记物，分子大小自上而下分别为23，130、9，416、6，557、4，361、2，322和2.027bp。右侧M为Φ×174/HaeIII片段，片段大小自上而下为1，353、1，078、872、603、310、271、234、194、118和72bp。其中泳道2和7为主PCR产物；6和8为副PCR产物。由此2，6，7和8泳道样品而来的重组质粒，即分别命名为pCRT2，pCRT6，pCRT7和pCRT8。其他菌落样品没有出现插入片段，故去除之。

为了证实按下文实施例1-2中所述方法构建的质粒pCRT7和pCRT8中分别以正确方向携带有TPO和TPOV cDNA编码序列，我首先用EcoRI、SacI及用于对照的Ctrl消化已经分离并纯化的质粒pCRT7和pCRT8。然后收集消化反应混合物，在1％琼脂上进行电泳分析。电泳结果如图5所示。

由图5中可以看出，pCRT7(主带)含有Sac I酶切点与TPO序列的616位硷基处的AacI相同，故可以推测pCRT7代表TPO序列。与此相反，pCRT8(副带)则缺少SacI酶点，可以推知其TPO序列可能在616位点前后发生变化或缺失。这种推测的确定只能由DNA序列分析证实。左侧M和右侧M分别代表分子大小标记物(同图4所示)。

为了进行大量质粒DNA制备，我们进一步用1％低熔点琼脂胶分离重组质粒pCRT7和pCRT8的HindIII/EcoRI消化产物，得到如图6所示的电泳图谱。在紫外光灯下切下含有所需DNA插入片段的凝胶条。在T4 DNA连接酶的存在下，将其分别与已用HindIII和EcoRI消化过的质粒pcDNAI/Amp和pcDNA3连接，然后用所得连接混合物转化适当的宿主细胞，以实现该片段的亚克隆。图6中以箭头标示电泳后分离出的代表HindIII/EcoRI插入段的带的位置。

为了实现真核细胞表达，我们首先将按前述方法克隆分离的编码TPO、TPO153和TBOV的cDNA，经用HindIII和EcoRI酶切后分别得到称为T1，T2和T3的插入片段。将这些片段分别与质粒载体pcDNAI/Amp和pcDNA3重组后，得到重组质粒pcDNA I T1、pcDNAIT2和pcDNAIT3；以及pcD3T1、pcD3T2和pcD3T3。将这些重组质粒分别用HindIII/EcoRI消化后，在1％琼脂糖凝胶上电泳，结果表明上述克隆是完全成功的。图7显示了对本发明重组真核细胞表达质粒的电泳分析结果，其中箭头指示出T1、T2和T3的DNA插入片段在1％琼脂糖凝胶中展示的电泳带。

图8至13分别图解显示了本发明人构建的携带T1、T2和T3编码DNA插入段(分别表达TPO、TPO153和TPOV多肽)的重组质粒。图中使用的缩写词或字母的含义如下：PCMV是人巨细胞病毒启动子/增强子片段；Amp是氨苄青霉素抗性基因；M13 ori是来源于λM13噬菌体的反义单股DNA复制原点；Co1E7是大肠杆菌内复制原点；SV40 ori是来源于SV40病毒的复制原点(外显子复制原点)；Polyoma ori是来源于多瘤病毒的复制原点(外显子复制原点)；SV40 intro/pA是来源于SV40病毒的内含子终止信号和RNA合成信号，用以提高RNA的稳定性；Neomycin是指新霉素抗性基因；Psv40 ori是SV40启动子原点；fl ori是正链(有意义链)单股DNA复制原点；BGH PA是牛生长激素基因的转录终止和聚腺嘌呤合成信号，用以提高RNA的稳定性。实施例3和4中描述了这些重组质粒的构建。

为了证明本发明已正确地克隆了TPOV cDNA，并证实其表达产物的糖基化性质，我们使用兔纲织红细胞体外翻译系统，成功地获得了分子量与计算值相同的，没有糖基化的多肽产物。电泳分析结果如图14所示。图中泳道1和6为阳性对照；泳道2和7为pcD1T1；泳道3和8为pcD1T2；泳道4和9为pcD1T3；泳道5和10为未加DNA样品的阴性对照。其中泳道1～5是直接体外翻译产物；泳道6-10是加入狗胰腺细胞微粒体膜后的修饰产物。基于各被检样品的电泳迁移率，参照分子量标准品估测出原始TPO翻译产物分子量约为35KDa(未糖基化的)和62KDa(糖基化的，泳带7)；TPO₁₅₃分子量约为18.5KDa和16.5KDa(去除前导序列后的)；而TPOV的分子量则约为31KDa和29KDa(去掉前导序列后的，泳道9)。图中M列为分子量标准品，它们自上而下是：1.肌球蛋白：200KDa；2.磷酸酶B：97KDa；3.血清白蛋白：68KDa；是4.卵白蛋白：43KDa；5，碳酸酐酶：31KDa；6.胰蛋白酶抑制物：21.5KDa；7.溶菌酶：14.4KDa。

为了鉴定本发明TPOV重组表达产物的生物学活性，建立一套简便可靠的活性检测手段是十分重要的。

以往报道的TPO活性检验都采用经C-mpl(TPO受体)转染的Ba/F3细胞(称为Ba/F3-mpl)(de Sauvage et al，Nature 369：533～538，1994；Si LOK et al.，Nature 369：565～568，1994)。这种Ba/F3-mpl细胞高度表达MPL(TPO受体)，故使TPO的活性检测比较敏感。然而Ba/F3-mpl并非生理状态的TPO受体表达细胞，除其表达稳定性可能出现问题外，其MPL分子在细胞表面的含量和分布上也显然不同于自然表达的细胞。因此，为了更接近正常生理水平检测TPO对其受体含有细胞的生理效应，我们筛选了数种人或小鼠的红/白血病细胞株，其中发现TF-1细胞对人TPO有较好的反应。TF-1细胞株是从红白血病患者骨髓细胞中培养和分离出来的(Kitamura，T.，et al.，J.Cell Physiol.(1989)140；323-334)。最初发现，TF-1对GM-CSF和IL-3有完全的生长依赖性，故TF-1被广泛用于GM-CSF和IL-3的体外活性检验。晚近，Meth ia，N等人(Blood 1993，82；1395～1401)和Debili，N等人(Blood 1995，85；391-401)分别在mRNA和蛋白质水平上证明TF-1表达c-Mpl的信使RNA和MPL蛋白质。因此应用TF-1细胞，进行TPO的活性检测具有以下特点：

1.TF-1细胞培殖试验的方法简便易行，其细胞培养没有添加选择药物(Drag for Selection)″(如G418等)，因此细胞生长多不受额外药物影响；

2.TF-1细胞表达MPL(TPO受体)相当稳定；

3.TF-1细胞表达MPL的量及其在细胞表面的分布是自然的；

4.可以同时观察TF-1对IL-3、GM-CSF、EPO等其他生长因子的影响及相互叠加作用；

以上所列四点都是以往常用的人工转录的Ba/F3-mpl细胞不能实现的。我们应用TF-1细胞增殖试验测定TPO及其变异体的活性，在其灵敏度及可重复性上均获得了令人满意的结果(详见实施例6)。

图15显示了应用Cell Titer 96细胞增殖/杀伤非放射性核素试验盒(Promega)及TF-1细胞对TPO、TPO1 53和TPOV(TPO变异体)三种类型的促血小板生成素的活性检测结果。其中pcD1T1为TPO；pcD1T2为153个氨基酸TPO截短体TPO153；pcPD1T3为TPOV变异体；而pcD1载体是阴性对照物。横座标为因子稀释度，纵座标为阳性结果的吸收光谱读数。该实验结果证明TPO和TPO153对TF-1细胞有明显的增殖活性；而TPOV未测出此活性，说明其对TF-1细胞没有增殖作用，或者其没有分泌到培养液中，或分子量极低而不足以刺激TF-1增殖。

众多证据表明，TPO可在体内促进血液祖细胞和干细胞的扩增和分化(Kaushansky，K.et al.，Nature 1994，369：568～571)，而且这种作用在联合应用IL-3、IL-6、IL-11或KL(干细胞因子)，时可提高30～70％。Zeigler，F.等人(Blood 1994；84：4045～4052)也报道了TPO在体外对小鼠造血干细胞的巨核细胞增殖和血小板细胞增殖活性，同时还发现在联合应用IL-3和KL等前祖细胞刺激因子后可使这一活性得以显著增高。概括这些结果，我们设计了一种应用半固体干细胞培养基检测TPO对造血干细胞巨核细胞增殖/分化效应的方法，并称之为CFU-Meg为基础的TPO活性检测法。这种体外检测TPO对造血干细胞活性的方法的基本原理是：

1.以美洲商陆(PWM)激活的脾细胞悬液(PWM-SCM)为前祖细胞或造血干细胞因子来源，借以提供IL-3、SCF、或″Meg-CSF″等。其中利用PWM-SCM在体外刺激造血干细胞或祖细胞增殖或分化。

2.将TPO加入到PWM-SCM处理的小鼠骨髓细胞中，可以选择性地刺激已经增殖了的巨核细胞祖细胞，从而促使巨核细胞进一步增殖和分化。

本发明的利用祖、干细胞作为指示细胞的体外检测方法比体内试验操作更为简便，而且节约时间。另外，利用半固体凝胶膜也更易于观察和计数细胞团。经乙酰胆硷脂酶染色，可以特异性地鉴别巨核细胞。若在1000倍放大的显微镜下观察，计数细胞核多于3个以上的细胞，便可以比较准确地鉴定出普通光学显微镜难以分辨的巨核细胞。这种方法优越于Kaushansky，K.等人的琼脂半固体法，因为该已知方法很难在高倍显微镜下直接观察到多核的巨核细胞。同时，这种方法也比液相干细胞培养法(Zeigler，F，等人，同上文)在计数和形态观察巨核细胞上改进了一步。应用这种方法分别检测人TPO和其变异体对造血干细胞和祖细胞的增殖/分化活性，可以获得重复性高而又灵敏的结果(详见实施例7)。

图16显示TPO(左上)，TPO153(右上)和TPOV(左或右下)对小鼠骨髓细胞CFV-Meg的活性观察。图中集落细胞表现含有巨大和多个细胞核，而且AchE染色呈深褐色。其背景为半固体胶状支持物。放大倍数为420倍。

本发明的人促血小板生成素变异体可用于诊断和治疗与血小板增多或减少相关的疾病，例如可以将有效量的本发明TPOV多肽或其截短形式与医药上可接受的载体与及赋形剂混合制成医药组合物，以各种适当的给药方式用于需要进行这样预防或治疗的人或动物，以治疗血小板分化/增殖异常性疾病及其他相关疾病。

特别是，由于包括人在内的哺乳动物体内的复杂的免疫作用机制及血细胞生成与分化过程，故可以在进一步认识本发明的TPOV作用机理、生物学活性，结构—功能关系的基础上，按已知方法制备出TPOV与其他细胞因子，如EPO、IL-3、SCF等的融合蛋白质，以提高其应用范围及效果。

以下借助实施例和相应附图详细描述本发。这些实施例旨在进一步举例阐述本发明，而不以任何方式构成对本发明权利要求范围的限制。

实施例1 cDNA克隆分离TPO及其变异体

1.PCR法克隆人TPO cDNA：

人胚胎肝细胞cDNA文库购自美国ClonTech公司(HumanQuick-Clone cDNA，Catlog.NO.7171-1)。PCR反应盒购自美国Perkin-Elmer公司。PCR引物链1为5′CTAGATC  AAGCTT AACAGGGAGCCA3′；引物链2为5′GATCCTA  GAATTC TTACCCTTCCTGAGACA3′。每100μl反应液中加入10μl PCR浓缓冲液、8μl dNTP、5μl 20μM引链1和2、2μl人胚肝cDNA、60μl水及10μl 1∶20稀释的Tag聚合酶，经94℃6分钟预热后，进行30次PCR循环(94℃→52℃→72℃各1分钟)，72℃10分钟结束反应。去除反应管中矿物油，取10μl的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(80～100V，60分种)，照相记录结果，详见附图3。凝胶经染色后，除出现一条与预定长度(1100bp)相符的主带处，还出现较小的副带，推测该副带很可能是一种变异体，故须将主副两带都组建在质粒分子上，以便作进一步的分析检验。

2.PCR产物直接组建到PCRII质粒分子上：

应用美国InVitrogen公司新型的TA克隆试剂盒(TA CloningKit，Catalog No.K2000-01)以快速直接组装技术将以上所得的PCR产物亚克隆到pCRII载体上。根据1％琼脂糖凝胶电泳结果计算出PCR产物的DNA浓度，以插入体：载体约等于1∶1的比例进行连接酶反应，即1μl浓缩缓冲液，2μl载体，6μl插入体(PCR产物)和1μl T4连接酶混合后，16℃保温18小时。随后取1.5μl连接反应物混于50μl″One Shot″大肠杆菌中，再加入2μl的0.5M B-巯基乙醇，先在冰上保温30分钟，然后转移到40℃温水浴中保温30秒钟后，立即再次移到冰上保温2分钟。然后加入450μl SOC细菌培养液，于37℃下保温60分钟。与此同时用X-gal处理细菌琼脂板(25μl的40mg/ml X-gal涂板，净干60分钟)；以165μl划板后，37℃保温18小时。第二日取十个白色菌落接种于6μl的LB/Amp(LB加100μg/ml氨苄青霉素)中37℃培养10～16小时。收集细菌，用Miniprep质粒DNA盒(Qiagen Co.)提取质粒DNA。

应用限定性内切酶HindIII和ECORI消化10个单一菌落的质粒DNA样品。即1.5μl消化酶缓冲液，6μl质粒DNA，0.5μl HindIII(20单位/μl)，0.5μl EcoRI(20单位/μl)，6.5μl dH₂O混合后于37℃下保温1小时。再加入2～3μl DNA加样液之后，加热至65℃并保持5分钟。然后加样到1％琼脂糖凝胶中，80伏电泳约1小时。照相记录得到如附图4所示的结果。仅泳道2、6、7和8的样品出现插入片段的电泳带，而且泳道2和7为主带长度(1100bp)，6和8为副带长度。样品7和8被用于以下全部试验。其相应重组质粒称为pcRT7和pcRT8。

3.大量质粒DNA制备和限定性内切酶分析：

为进一步研究pcRT7和pcRT8，需有足够量的质粒DNA，为此应用Maxiprep质粒DNA提纯盒(Qiagen)，提纯250ml(LB/Amp)过夜培养的含pcRT7和pcRT8质粒的大肠杆菌。读出OD₂₆₀读数求得其DNA浓度。因为TPO DNA原序第616位有SacI单一酶切点，正好与载体SacI单一切点配合而切割出约625bp的片段。根据这一特点，以SacI酶为标记对pcRT7和pcRT8质粒进行内切酶分析。取1.5μl10×缓冲液，2μl/0.5μg质粒DNA，1μl EcoRI或Sac或dH₂O，加6.5μl dH₂O后，37℃下酶消化反应1小时。再以1％琼脂糖凝胶电泳，得出如附图5所示的结果。pcRT7的SacI处理出现625bp的片段，故为TPO原型DNA。而pcRT8无SacI酶切点，因此可说明其为污染成份，或一种没有SacI切点的TPO变异体。为进一步证实该pcRT8质粒的本质，尚须对其进行DNA序列分析。

实施例2 DNA序列分析和核苷酸/氨基酸序列比较

1，pcRT7和pcRT8的DNA定序分析：

应用Sequenase version 2.0 DNA定序盒(UBS CO.)，³⁵S标记的dATP(Amersham)，分别对pcRT7和pcRT8质粒DNA进行定序分析。所用的引物对分别为

①CTAGATCAAGCTTAACAGGGAGCCA3′，

②GATCCTAGAATTCTTACCCTTCCTGAG ACA3′；

③GATCCT AGA ATT CTT AGGGGA CAG CTG TGG3′，

④CTT CTG CTGGAGGGA；

⑤ATT CCT GGT CTG CTG，

⑥CAG CG ACC AGG AAT。

根据Sanger氏创建的酶学DNA定序法(Molecular Cloning，2nd Edition，13.42～13.74)对pcRT7和pcRT8的插入片段进行序列分析，经过①氢氧化钠变性分股；②引物链粘联(退火)；③核苷酸标记dATP-S³⁵，④终止反应等步骤完成序列测定。再经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳(1400伏)，干胶和胶片暴光等处理，得到DNA序列底片。经过人工读片记录定序结果，并将所得序列数据输入DNAStrider和gcg软件包(Genetics Computer Group，Inc.)，进一步分析。

2.计算机软件分析pcRT7和pcRT8的插入片段：

利用GenBank数据库，借助计算机分析所得到的pcRT7和pcRT8插入片段序列，表明pcRT7完全相同于已发表的人促血小板生成素的DNA序列(Nature 369：533～538，1994；和Nature 369：565～568，1994)，而pcRT8在第160位氨基酸序列前的核苷酸及氨基酸序列几乎与前者相同，其中仅出现三处硷基差异和一处氨基酸变异(见图2)，即第318位硷基T→C；第333位硷基G→A；第337位硷基G→C变化；而第337位硷基变化导致由Glu变为Gln。第160位氨基酸之后的核苷酸序列相同于TPO的相应序列，但由于发生移码，故其编码氨基酸序列完全改变，表达得到一个全新的多肽，成为本发明TPO变异体的主要特征。尽管160位氨基酸之后肽链变化，但依然出现第四个胱氨酸(169位)，故整个分子的二级结构变化不大。经基因序列移码而产生的新的多肽，缺少了典型的成熟肽序列第153位的精氨酸对(RR，图1)，因此可推测这种TPO变异体可能不发生蛋白酶切割现象。同时，TPOV下游新肽链仅含有一个N-联糖化位点，故可以推知该蛋白质糖化的程度极低，迥异于TPO本身的特点(TPO原序含6个N-联糖化位点)。加之，TPOV在第273～286位氨基酸处出现较短的疏水集团，推测有可能是一个膜结合区域。一般认为，细胞膜蛋白和/或分泌蛋白的糖基化是蛋白质稳定化的一种方式，同时也与蛋白质的抗原性有关。根据促红细胞生成素(EPO)研究观察，其糖基化是保持EPO体内活性的重要因素，对于维持其自身稳定性和肝细胞清除率(半衰期)有正向作用(Yamaguchi，K.et al.，JBC 266：20434～20439，1991)。另外，根据无N-联糖基化EPO的分泌量低于有N-联糖基化EPO的90％这一事实，可以推测这种TPO变异体很可能是机体调节糖化TPO因子含量的一种机制。鉴于N端159个氨基酸与TPO序列的一致性，我们也推测TPOV很可能是具有生物活性的因子。特别是在其第4位胱氨酸被保留的情况下，其二级结构与TPO153截短体应当是一致或极为相近的。计算机理论计算的TPO，TPO153和TPOV的分子量分别为35，446；16，448和29，172道尔顿。

3.RNA替换剪切导致的TPOV形成：

DNA序列分析的结果还进一步证实，本发明分离并纯化的TPO变异体，其产生系由于RNA替换剪切(RNA Alternative Splicing)。众所周知，RNA分子在剪接过程中可以利用某些替换剪切接受位点(Alternatire Splice Accepter Sites)。其保守的序列为前内含子最后“ag”对后内含子最前的“gt”，从而构成内含子/外显子联合点的 模式。有些情况外显子的“ag”成为替换剪切的接受位点，结果就导致外显子“ag”之后的编码序理因被剪切而缺失。TPOV的形成正是其TPO编码DNA第476位的AG提供了这种替换剪切接受位点(图1，方框内)所致，从而造成116个硷基的缺失，而且下游部分的编码序列发生移码，最终造成下游编码氨基酸序列的变异。

实施例3用于暂短型转化的pcDIT1～T3表达载体的构建、

COS-1细胞转染和表达产物的分离

1.PCD1T1～T3表达载体的构建：

因在克隆分离TPO、TPO153和TPOV时将限制性内切酶Hind III位点引入其5′端，并将EcoRI位点引入其3′端，故相应重酶组质粒经过HindIII和EcoRI复合酶切后，即可得到TPO、TPO153和TPOV的插入片段，并分别定名为T₁、T₂和T₃插入片段。真核细胞表达中所使用的载体pcDNAI/Amp购自InVitrdogen公司，它是一种以巨细胞病毒启动子带动的表达载体，专用于暂短型细胞转染(Transient trangsfection)。在含有大T抗原的细胞中，其载体可以扩增复制，从而高度表达其所携带的外源基因。

含T₁、T₂和T_a插入片段质粒及pcDNAI/Amp表达载体经用HindIII和EcoRI于37℃联合消化2-4小时后，取1/20等分样品检查酶切情况。全部样品均加样于制备型1％低溶点琼脂糖凝胶上，4℃下低压(50伏)电泳3小时，即可观察片段分离情况(见图6)。在紫外灯下切割含相应DNA片段和表达载体DNA的凝胶。于65℃加热切下的含DNA琼脂块5分钟。取5μl表达载体分别与5μlT₁、T₂或T_a插入片段混合，在加入10μl连接酶溶液(7μl dH₂O，2μl连接酶缓冲液，1μlT₄连接酶)后16℃保温16小时。随后将50μl 10mM TCM缓冲液(10mM Tris，PH7.4，10mM CaCl₂，10mM MgCl₂)加入连接混合物内，加热至65℃溶化之。然后用经稀释的连接混合物转化100μl(约10⁸细胞)感受态大肠杆菌DB5α菌株。首先在冰上保温30分钟，然后于42℃保温90秒，最后再于冰上保温2分钟。加入400μ1 SOC培养液(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.05％NaCl，50mM葡萄糖，PH7.0)后于37℃温育1小时。以166μl/板划线接种平板，并于37℃培养16小时。第二日，取单一健康菌落接种于6ml的LB/Amp培养液中，37℃培养10小时。然后收集细菌，应用Qiagenminiprep质粒DNA提取盒提取质粒DNA。每组选6株进行Hind III/EcoRI内切酶消化，检查有无插片段。其结果详见附图7中的pcDIT1～T3。全部选出的菌落均含pcDIT1～T3质粒，且都有T11～T3 DNA片段。

为准备转染所需DNA，应用maxiprep质粒DNA提取分离盒(Qiagen)，每组选一株制备约0.5mg左右的质粒DNA。提纯的DNA也经HindIII/EcoRI酶切分析，进一步核实后用于转染目的。重组质粒示意图详见附图8，左纵列。

2.转染COS-1细胞

COS-1细胞(ATCC，CRL1650)是最常用的哺乳动物宿主细胞之一，系由非洲绿猴肾细胞CV-1经SV40转化而得到的，常规在DMEM+5～10％FBS培养液中培养。以0.05％胰蛋白酶，0.53mM EDTA，37℃消化10分钟，分离COS-1细胞。离心收集细胞，并以每盘2.5×10⁵个细胞接种之，然后37℃保温过夜。次日，COS-1达50％的汇合度时，加入混合的A液(3μg质粒DNA/100μl无血清DMEM)和B液(24μlLipofect AMINE＋76μl无血清DMEM)并于室温下保温30分种。Lipofect AMINE是购自美国BRL公司的脂质体衍生物。届时以5ml PBS清洗盘中COS-1细胞三次。将2.4ml无血清DMEM加入A/B混合液中，并将此混合溶液铺敷在单层COS-1细胞上，于37℃保温5小时。然后，再加入2倍营养的完全培养液(20％FBS/DMEM)2.6ml，37℃保温过夜。次日，更换新鲜培养基(10％FBS/DMEM)5ml。37℃保温1～2日。再更换无血清培养基(DMEM)37℃保温2日。届时收集含有TPO、TPO153和TPOV的上清液。

3.表达产物的分离：

收集到的上清液经3000×g高速离心，去除细胞和碎片成分，后收集上清。上清液经用CentriCon 30(用于TPO或TPOV)或CentriCon 10(用于TPO153)膜超滤浓缩，0.22μM孔径滤膜过滤消毒，制成TPO上清浓缩液。此液可进一步经过离子交换层析或亲合层析分离出主要为TPO及其变异体，截短体的主峰。将如此分离和提纯的促血小板生成素及其变异形式用于继后的活性检测。

实施例4稳定型转染用pcD3T1～T3表达载体的构建

NIH3T3细胞转染及表达产物的分离

1.pcD3T1～T3表达载体的构建：

暂短型真核细胞转染表达TPO及其变异体虽然表达量较高，但不能持续表达，其COS-1细胞在转染第5天之后即接近死亡。因此，为进一步研究TPO及其变异体的生物学活性与结构，建立稳定持久的真核细胞表系统是十分必要的。持久表达外来蛋白质的真核细胞表达载体的类型有多种，所用宿主细胞很广泛。其中比较常用的是新霉素抗性选择，以及二氢叶酸还原酶(CHFR)或胸腺嘧啶激酶等可选择标志。所用的选择基因编码的某些蛋白质是经载体转后的特定宿主细胞生长或存活所必须的，同时在这种选择压力下，表达载体可持续扩增复制，而使其携带的外来基因不断提高表达水平。

本发明例举以G418(新霉素)为选择压力，建立TPO、TPO153和TPOV高表达的N1H3T3(ATCC，CRL1658)细胞株的实例。pcDNA3是一种商业化的携带新霉素抗性基因的真核细胞表达载体，经HindIII/EcoRI复合酶切之后，即可应用实施例3-1中所述的快速克隆组建法，将其与TPO、TPO153和TPOV的cDNA片段连接起来，从而构建成pcD3T1，pcD3T2和pcD3T3的重组表达载体(详见实施例3-1)。这三种表达载体经HindIII/EcoR1酶切谱分析，证明均含有相应大小的插入体片段(参见附图7)。三种表达载体各选一株进行大量质粒DNA提取，以备转染细胞之用。pcD3T1～T3的表达载体示意图详见附图8。

2.转化N1H3T3细胞

应用传统的磷酸钙/DNA沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.7：2745～2752，1987)转化N1H3T3细胞。实验前日分离和清洗N1H3T3细胞，以每平皿2.5×10⁶细胞接种培养皿，并于37℃保温过夜。实验当日清晨预先更换新鲜DMEM/10％FBS培养液，37℃温育至少3小时。在此期间准备DNA-磷酸钙沉淀液。取10μg/20μlpcD3T1或T2，或T3，向其中加30μl 2M CaCl₂，再加入250μldH₂O。混均后加入300μl 2×HBS液(280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM Na₂HPO₄·2H₂O、12mM Dextrose，50mM HEPES，PH7.4)室温混合30分钟。然后将此混合液均匀地分散于半层细胞表面上。37℃保温18小时之后用PBS液洗细胞3次，换以新鲜DMEM/10％FBS液，继续温育3天。第四天加入0.8mg/ml的Geniticin-G418(BRL)到新鲜培养液内进行选择培养。当G418抗性集落直径达3-5毫米时，即可将集落转移到96孔盘上进行单集落培养。经35mm盘扩增培养后，离心收集上清并经TF-1细胞增殖试验筛选出表达TPO的被转化的细胞株。该转化株再经单细胞分离，从而克隆出表达TPO及其截短体、变异体的细胞株。

将所得到的转化细胞株分别定名为3T3t1、3T3t2和3T3t3。这些细胞株可在含0.8mg/ml G418、10％FBS的DMEM培养基中长期传代培养。

3.表达产物的分离：

3T3t1，3T3t2和3T3t3细胞株经过向无血清培养液过渡培养后，收集无血清的上清液。经过5000×g离心去除细胞及颗粒成分，这种无血清上清即经过Centricon 30或CentriCon 10进一步10倍浓缩。浓缩的上清液即可经亲和层析或离子交换层析进一步分离与纯化。

实施例5体外转录/翻译/修饰的TPO及其变异体

计算机计算的TPO、TPO153和TPOV成熟多肽分子(经转译后加工去除信号肽之后)分子量分别是35，446、16，448和29，172道尔顿。为进一步核实本发明分离和制备的各种TPO cDNA所编码之蛋白质的真正分子量，我们应用TNT网织红细胞溶解产物系统(TNTReticulocyte Lysate System，Promega)及pcD1T1，pcD1T2和pcD1T3质粒DNA进行快速一步法体外转录/翻译/修饰实验。将27.5μl TNT兔网织红细胞溶解液、2μl TNT反应缓冲液、1μlRNA(T7)聚合酶，1μl无亮氨酸的氨基酸混合液、6μl 5mCi/ml的HaH标记的亮氨酸、2μl RNAsin，4μl质粒DNA模板和6.5μl无核酸酶水以50μl总体积混合均匀，若为修饰实验尚需在反应混合物中再加2.5 μl狗胰腺细胞微粒体膜。反应在37℃下进行1.5小时。然后加入15μl SDS-PAGE样品缓冲液，加热煮沸5分种。取5～10μl点样进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。其中阳性和阴性对照也用相同方法处理。结果详见附图14。泳道1和6代表阳性对照；5和10为阴性对照。这项实验结果表明体外翻译表达的TPO及其变异体的分子量与计算分子量一致，并且间接证实了T1，T2和T3 cDNA核苷酸序列的正确。同时也在体外证明TPO发生明显糖基化，而TPO153和TPOV则没有糖基化，反而因信号肽的切除，而减少了分子量(附图9，泳道8和9的下方带)。相反，TPO在加入微粒体膜之后出现糖基化产物，其分子量约为62KDa(泳道7的上方带)。

实施例6 TF-1细胞增殖试验检测TPO活性

使用细胞增殖检测试剂盒(Cell Titer 96，Promega)，以非放射性染色沉积法，并用TF-1细胞检测TPO及其变异体的体外生物学活性。

将用于这一检测法中的TF-1指示细胞培养在含有10％灭活胎牛血清、5ng/ml重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)标准品的RPMI1640培养基中。培养基一般每2-3日更换一次。测定前日，换培养基一次，并以1∶2比例接种微滴定板。先在96孔微量滴定板的每孔内加入50μl不完全培养基(10％FBS/RPMI1640)。从第一纵列孔开始，分别加入50μl的浓缩或提纯的TPO、TPO153或TPOV，每种因子占三孔，同时设其中只加入50μl细胞上清液的阴性对照孔。从第一排开始每孔取出依50μl样品，依次向右进行等倍稀释，直至第11纵列为止，第12纵列为无因子对照孔(空白孔)。将96孔板放置37℃温箱内平衡。同时准备TF-1细胞。请洗TF-1细胞两次，去除残留的GM-CSF，即以不完全培养基调细胞浓度至10⁵细胞/ml，然后每孔加入50μl单细胞悬液(5000个细胞/孔)。此时每孔液体达100μl，被测因子浓度由1/4稀释度至1/4896倍稀释(第11纵列)。96孔板于37℃5％ CO₂大气环境中保温4～5天。向各孔内加入15μl溴酚兰染料，37℃温育4小时以着染存活细胞。然后即加100μl稳定/终止液，并用塑料薄膜包裹96孔板，置入湿盘中避光室温保存16～24小时。在吸收波长570nm范围内读出其吸光率读数，计算平均值，将此值与稀释倍数～同输入Macintosh的Criket软件进行制图(图10)。

实施例7 CFV-Meg为基础的小鼠骨髓细胞增殖/分化检测

虽然TPO对骨髓细胞在体内的增殖/分化活性已有报道，但TPO在体外对骨髓细胞增殖/分化活性尚未见报道。本发明将分离提取的TPO及其变异体在体外刺激小鼠骨髓细胞，观察TPO对造血干/祖细胞的促进增殖/分化活性。

选用Balb/c或C57BL/6小鼠(8～16周令)，经股骨针抽吸及冲洗后收集骨髓细胞，并以IMDM培养液加5％胎牛血清调细胞浓度为5×10⁵细胞/ml。在35mm直径盘中分别加入0.2ml 5×10⁵细胞/ml的小鼠骨髓细胞、0.2mlIMDM、0.2ml FBS、0.1ml PWM-SCM(美洲商陆激活的脾细胞悬液)、0.2ml纤维蛋白原和0.1ml凝血酶原。然后分别按不同的组在各盘内加入0.1、0.2或0.4ml的TPO、TPO153或TPOV。37℃ 5％ CO₂环境下培养10～15天，半固体凝胶形成后进行乙酰胆硷脂酶染色(Burstein，S.A.et al.J.Cell.Physiol.122：159～165，1985)。先用5％戊二醛室温固定10分钟，然后加入0.5ml酯酶染色液(1.73ml碘化乙酰硫胆硷，5mM醋酸钠，0.5mM氰铁化钾，0.1M碳酸钠，PH6.0)室温下保温5～6小时。经Harris苏木精复染后，以圆型盖玻片封盖。在缓冲甘油下观察着染的细胞。放大倍数为100、或250，或1000倍，计数多核(3个核以上)的胞浆为黄或黄褐色的细胞群，即为AchE阳性细胞。每组实验两个盘，除计数CFV-meg数外，经形态学观察选出AchE细胞作为最后比较指标。

本实验重要的发现是无论TPO，还是TPO153，还是变异体TPOV单独应用对体外小鼠骨髓细胞增殖/分化都没有刺激作用，这些因子只有在附加了刺激早期祖细胞的因子(如IL-3和KL，都存在于PWM-SCM之中)之后，方能出现刺激效果。TPOV对体外小鼠骨髓细胞的刺激作用特别令人惊奇，因为这种作用在TF-1细胞增殖试验上没有表现出来。很可能骨髓干/祖细胞膜表面上存在有对TPOV较特异的受体，故在极微量表达的上清提取液也出现中等强度的刺激骨髓细胞增殖效应。

表1 100×低倍镜5视野AchE计数及1000×高倍镜观察结果

编号	名称	第一盘	第二盘	形态	AchE阳性
						1234	PWM—SCM0.4ml IMDM0.2ml  ″0.1ml  ″	5114	8-31	小细胞为主″″″	2111
567	pcDNAI/Amp上清0.4ml0.2ml0.1ml	000	411	小细胞为主″″	111
						8910	0.4ml   TPO0.2ml   TPO0.1ml   TPO	98-	1011-	大细胞为主占80％-	85-
111213	0.4ml TPO1530.2ml TPO1530.1ml TPO153	111217	10138	大细胞为主80％″″	986
						141516	0.4ml TPOV0.2ml TPOV0.1ml TPOV	874	-75	大细胞为主″″	653
						171819202122	空白对照PWM—SCMpcDNAI/Amp上二清TPOTPO153TPOV	-6○○○○	-7○○○○	-小细胞为主----	-2----

由上表可以看出，本发明的促血小板生成素在体外活性实验中，与已知的野生型TPO相同，对小鼠骨髓干/祖细胞具有相似的剌激作用，表现出促进骨髓干细胞向巨噬细胞分化的生物学活性，另外，实验表明本发明TPOV和TPO153的上述生物学活性只有存在美洲商陆刺激的脾细胞悬液或细胞培养物上清液时，即存在其他由脾细胞产生的淋巴因子时才能表现出来。因此，设计本发明TPOV的特异性抗原决定基片段，并制备适用的抗TPOV单克隆抗体，对于进一步研究TPOV及其受体和相关细胞的行为，研究血小板异常性疾病的发病机理及寻找其诊断和治疗方法，将具有重要的意义。

Claims (14)

1，编码具有血小板增殖和/或分化促进活性的多肽的核苷酸序列，特征在于其具有核苷酸序列或及其部分，或其功能等同物。

2，根据权利要求1的核苷酸序列，其为互补DNA序列。

3，根据权利要求1的核苷酸序列，其来源于人胚肝细胞cDNA文库。

4，由权利要求1或2或3的DNA序列编码的具有血小板增殖和/或分化促进活性的多肽，特征在于其具有氨基酸序列或其部分，或其功能等同物。

5，根据权利要求4的生物学活性多肽，其与野生型促血小板生成素多肽不同在于第113位氨基酸由glu变为gln。

6，根据权利要求4的生物学活性多肽，其与野生型促血小板生成素多肽不同在于自160位氨基酸之后有完全不同的氨基酸序列。

7，根据权利要求4的生物学活性多肽，其与野生型促血小板生成素多肽不同在于其为截短形式的。

8，根据权利要求7的生物学活性多肽，其中所说的截短形式的多肽包含150～158个氨基酸。

9，制备根据权利要求4至8中任一项的生物学活性多肽的方法，该方法包括以下步骤：

1)提供人胚肝细胞cDNA库作为模板，

2)以下列合成的寡核苷酸对为引物，经逆转录酶—聚合酶链反应(RT-PCR)扩增所需的DNA序列，

5′CTAG ATC  AAG CTT AAC AGG GAG CCA

5′GAT CCT  AGA ATT CTT ACC CTT CCT GAG ACA 3′

3)将所得到的扩增产物与适当的质粒载体连接，

4)用所得到的重组质粒转化适当的宿主细胞，

5)在适于表达TPOV多肽的条件下培养被转化的宿主细胞并回收所需的TPOV多肽产物。

10，以TF-1细胞增殖检测法检测样品中促血小板生成素活性的方法，特征在于其改进包括使用TF-1细胞作为检测程序中的指示细胞。

11，以骨髓干细胞反应检测法体外检测促血小板生成素活性的方法，该方法包括以下步骤：

1)提供适当数目的作为指示细胞的小鼠骨髓干细胞，

2)在有丝分裂素激活的脾细胞存在下，向培养基的小鼠骨髓干细胞中加入待检样品，

3)待半固体凝胶形成后进行乙酰胆碱酯酶染色，

4)基于染色阳性的巨核细胞数判定被检样品中的促血小板增殖/分化活性。

12，根据权利要求1至3中任一项的核苷酸序列在诊断和治序与血小板减小或增多相关的疾病中应用。

13，一种医药组合物，该组合物含有作为活性成分的根据权利要求4至8中任一项的多肽以及医药上可接受的载体和/或赋形剂。

14，根据权利要求13的组合物，其用于血小板增殖/分化异常性相关疾病的诊断和治疗。

Images