JPH03130089A - サル変換成長因子―β１のクローニング及び発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はサル（特に″類人猿（ｓｉｍｉａｎ）”、以下
サルと称する）変換成長因子−β１　（ｒＴＧＦ−β１
）のクローニング及び発現に関する。本発明の生成物は
真正の成熟ヒｌ−ＴＧＦ−ａｌと等価の対生物作用活性
を有している。

〔従来の技術〕

成長調節（ことに低下）性ペプチドの変換因子（ＴＧＦ
）族は構造的及び機能的に異なる２種の分子、ＴＧＦ−
α及びＴＧＦ−βから成っている。レトロウィルス的に
変換されたゲラ歯動物細胞系（ＤｅＬａｒｃ。

ｅｔ　ａｌ、、１９７８．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５　：４００１−４
００５　；Ｔｗａｒｄｚｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２
．５ｃｉｅｎｃｅ　２１６：８９４−８９７）及びある
種のヒトの腫瘍細胞系（Ｔｅｄａｒ。

ｅｔ　ａｌ、＋１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ＬＩＳＡ　７７：５２５８−
５２６２）で合成及び放出されたＴＧＦ−αは、ＴＧＦ
受容体への結合で上皮成長因子（ＥＧＦ）と競争しくＴ
ｏｄａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９７６、　Ｎａｔｕｒｅ
　２６４．２６−２９）そしてＥＧＰ受容体のチロシン
特異的リン酸化を刺激する（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　ｅｔ　
ａｌ、、１９８１．　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：２５９−
２６２）。

間葉起源の細胞用の強いマイトジェンであるＴＧＦ−α
の成熟型は５０個のアミノ酸残基から成り、ゲラ歯動物
及びヒ）　ＥＧＦと配列相同性を共有しくＭａｒ−ｑｕ
ａｒｄｔ　ａｔ　ａｔ、、１９８３．　ｐｒＯｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０：４６８４−４６８８）、１５９アミノ酸
前駆体から分裂する（Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、
１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：２８７−２９７　；Ｌｅ
ｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１３
：４８９−４９１）。

牛の脱無機質から分離されたクンバク質がＴＧＦβと関
係あるものとして最近同定された（Ｓｅｙｅｄｉｎｅｔ
　ａｌ、、１９８７．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　２６２：１９４６−４９４９）。

このタンパク質は豚の血小板（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ　ｅｔ
　ａｌ、。

１９８７　　Ｃｅ１ｌ　４８：４０９−４１５）、ヒト
の前立腺癌細胞系ＰＣ−３（Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、
＋１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：２４
０６２４１０）、及びヒトの膠芽腫細胞系（Ｗｒａｎｎ
　ｅｔ　ａｌ。

１９８７、門Ｂ０６：１６３３−１６３６）からも分離
されている。

このタンパク質の部分的アミノ酸配列はＴＧＦ−βに相
同であることを示し、そしてＴＧＦ−β２と名付けられ
ている。ヒト（Ｄｅｒｙｎｃｋ　ａｔ　ａｌ、＋１９８
５＋　Ｎａｔｕｒｅ３１６　ニア０ｌ−７０５）、マウ
ス（Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６＋　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：４３７７−４３７９
）及びサル（Ｓｈａｒｐｌｅｓｅｔ　ａｌ、、１９８７
．　ＤＮＡ　６：２３９−２４４）ＴＧＦ−βとこれ迄
記述されたものは、以後ＴＧＦ−β１と称される。

ジスルフィド結合したホモダイマー（鎖当り９個のシス
ティン残基）であるＴＧＦ−ａｌは２個の同一のサブユ
ニット　（サブユニット当り　１１２個のア≧）酸残基
）を有し、そしてＴＧＦ−α又はＢＧＩ？とは異なって
受容体を利用する（Ｆｒｏｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９
８４＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：１０９
９５−１１０００　；　Ｔｕｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８４、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ　８１　：　６７５７６７６１）。この
細胞性質の強力なモジューレーターは非常にさまざまの
正常及び変換された細胞で培養中に合成され（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８１＋　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８：５
３３９−５３４３）　、胎盤（Ｆｒｏｌｉｋ　ｅｔ　ａ
ｌ、、１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０：３６７６−３６８０）、腎臓（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３゜Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　２２：５６９２−５６９８）、尿（Ｔｗａｒｄ
ｚｉｋ　ｅｔａｌ、　１９８５．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２８：２８９−２９７）及び血小板
（Ｃｈｉｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８２．　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：５３１２−５３１６）を含め
たさまざまの源から精製されている。ＴＧＦ−ａｌは、
正常なラットの腎臓（ＮＲＫ）繊維芽細胞の固定源非依
存性の成長促進にはＴＧＦ−α又はＥＧＰのいずれかを
必要とするが；しかしネズミの示指伸筋細胞ＡＫＲ−２
の固定源非依存性の成長の促進用にはＴＧＦ−α又はＥ
ＧＦの必要性はそれ程厳格ではない（Ｔｕｃｋｅｒ　ｅ
ｔ　ａｌ、＋１９８３＋Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４３
：１５８１−１５８６）　、細胞成長促進とは対照的に
、ヒトの血小板由来のＴＧＦ−ａｌ及びアフリカミドリ
ザル細胞（ＢＳＣ−１）から分離された殆んどの同一の
生化学的性質を持つ機能的に関係のあるポリペプチドは
培養中のある種の細胞に成長抑制作用を示すことも明示
されている（Ｔｕｃｋｅｒ　ｅｔａｌ、、１９８４．５
ｃｉｅｎｃｅ　２２６：７０５−７０７＞　。ＴＧＦ−
β１の二官能性（印刻／刺激）と、いたるところに分布
している状態とが、これが哺乳動物細胞の成長と行動を
調節する核心的役割を演していることを示唆する。

ヒ　ト　　（Ｄｅｒｙｎｃｋ　　ｅｔ　　ａｌ、、１９
８５．　　Ｎａｔｕｒｅ　　３１６：７０１７０５）及
びマウス（Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８６＋
　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１：４３７７−４３７９）起源のＴＧ
Ｆ−β１前駆体をコードしているｃＤＮΔから導かれる
アミノ酸配列は、成熟ＴＧＦ−β■配列の範囲だけでな
くアミン末端前駆体領域でも高度の相同性を示す。

ヒトのＴＧＦ−ａｌの遺伝子は同定され且つ配列決定さ
れているが、活性丁ＧＦ−β１のクローニング及び大量
発現はこれ迄に報告されていない。活性ＴＧＦ−βｌの
発現上の困難性には多くの因子が関与しているであろう
が、その一つには分子の三次構造の複雑性が関っていよ
う。成熟ＴＧＦ−β１は多数の鎖内及び鏡開ジスルフィ
ド結合を有し、二〇形成には遺伝子生成物の発現時に適
切な処理を必要とする。さらにグリコシル化されたより
大きな前駆体分子からＴＧＰ−ａｌの成熟型が導かれる
。前駆体の正しいグリコシル化パターンが、ＴＧＦ−β
１の成熟型の正しい処理、分泌及び切断には必要であろ
う。従って不適切な発現ベクター／宿主細胞系での正し
いコード化配列を持つ遺伝子のクローニングと発現は、
適切な一次構造（即ちアミノ酸配列）を持ってはいるが
、正しくない二次及び三次構造（即ち折り重なり及び配
座）を持つ生成物を発現させて不活性な分子を生ずるこ
ととなろう。

従って多量のＴＧＦ〜β１の製造が妨げられていた。

〔発明の要約〕

本発明は、発現調節エレメントで制御された、サルＴＧ
Ｆ−β１コード化配列を含有する組換え体ＤＮＡベクタ
ーでトランスフエクション（狭義の“感染“を含む）さ
れた真核宿主細胞によルサルＴＧＦβｌの多量の製造に
関する。サルＴＧＦ−β１前駆体をコードするｃＤＮＡ
クローンは、アフリカミドリザル細胞系、ＢＳＣ−４０
からつくられたｃＤＮＡライブラリーから得られた。成
熟サルＴＧＦ−βｌの演鐸されたアミノ酸配列は、成熟
ヒトＴＧＦ−β１のそれと１００％の相同性を示す。強
い配列相同性がヒト及びサルのタンパク質の前駆体領域
で見出され、２７８の残基中僅か５個のアミノ酸しか異
なっていなかった。サル（及びネズミ）前駆体配列はヒ
トよりも１個のアミノ酸残基を少くコードすることが判
明した。

ＳＶ４０発現エレメントの制御下に置かれたサルＴＧＦ
−β１の全コード化配列を含有する発現ベクターが構成
された。それらはチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ細胞）をトランスフェクションさせるのに用いられ
た。得られたＣＨＯ）ランスフェクタントは、真正ＴＧ
Ｆ−βｌと同様な生物学的活性を有する成熟ｒＴＧＦ−
β１並びにこれも生物学的活性を有しているｒＴＧＦ−
β１の前駆体型の両方を産生し、分泌する。

〔図面の説明〕

第１図はサルＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡのヌクレオチド配
列と演鐸されたアミノ酸配列。Ｍ１３ｍｐ１８及びＭ１
３ｍｐ１９クローニングベクター中にρＴＧＦ−β１−
２の１６００ｂｐインサートをサブクローニングしくＹ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎｅｔ　ａｌ、、１９８５．
　Ｇｅｎｅ　３３：１０３４１９）、両ストランドを鎖
−末端化法で配列決定した（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、。

１９７７　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７）。

演鐸されたサルＴＧＦ−β１のアミノ酸配列をｃＤＮＡ
配列の上に直接示した。サルｃＤＮＡ配列の下にヒトＴ
ＧＦ−β１ヌクレオチド配列を並べて直接示し、ドツト
は配列中の相同ヌクレオチド残基を示している。ヒト及
びサルタンパク質問のアミノ酸の差は上の行に示す。或
ｇｐ　Ｔ　Ｇ　Ｆ−β１配列を線で囲んで、シグナルペ
プチドには上線を付した。

第２図、サルＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡプローブを用いた
ヒト　（ＭＣＦ−７）及びサル（ＢＳＣ−４０）細胞系
由来のＲＮＡのノザンブロット分析。ポリアデニル化Ｒ
ＮＡは文献（Ｐｕｒｃｈｉｏ　ｅｔ　ａｌ、、１９７９
．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２９ニア６３−７６９）のよ
うにＭＣＦ−７細胞及びＢＳＣ−４０細胞から分離し、
１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル（１２）上で分
別し、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ
）に移し、［”Ｐ］−標識化ｐＴＧＦ−β１−２プロー
ブにハイブリッド形成する。レーン１、ヒトＭＣＦ−７
ＲＮＡ　（５ｕｇ）　；レーン２、サルＢ５Ｃ−４０Ｒ
ＮＡ　（５ｕｇ）。

２８Ｓ及び１８Ｓは２８Ｓ及び１８Ｓ　リボゾームＲＮ
への移動位置を示す。

第３図、増幅可能な発現プラスミドｐｓｖ　２　（ＴＧ
Ｆ−β１−ｄｈｆｒ）の構築。構築の詳細は第７節に述
べである。最終の組換え体プラスミドは縦列的にＴＧＦ
β１の全前駆体型をエンコードしているＴＧＦ−β１ｃ
ＤＮＡとマウスｄｈｆｒ　ｃＤＮＡを並べて有している
。ＴＧＦ−β１及びｄｈｆｒ　ｍＲＮＡの転写の開始は
ＳＶ４０初期プロモーターによって行なわれる。ポリア
デニル化シグナル及び正しいＲＮＡ処理を引き受けるそ
の他の配列は３’ＳＶ４０配列で供給される。カッコ内
の制限部位は増幅可能な発現プラスごドの構成中に失な
われる。

第４図、　　ＭＴ×選別のさまざまの段階でのＣｌｌ０
細胞中のＴＧＦ−β１核酸配列の検出。ハネルＡ：ＴＧ
Ｆ−β１　ｍＲＮＡ配列検出用のノザンプロット分析、
ポリ囚゛含有ｍＲＮＡ　（５ｕｇ）を１％アガロース−
ホルムアルデヒドゲルで分別し、１ｌｙｂｏｎｄ　Ｎ膜
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に塗布し“材料及び方法”記載の
ように放射化標識ＴＧＦ−βＩ　ＤＮＡで検査した。非
トランスフェクションＣ１１ＯｍＲＮＡ含有レーンを４
８時間露出させて２．５Ｋｂ　ＴＧＰ−β１情報の内在
的レヘルを検知した。

ＴＧＦ−β１−３細胞からのｍＲＮＡ含有レーンは５分
露出した。リボゾームマーカーを右側に示す。パネルＢ
：ＰＩＴＸ選別のさまざまの段階テＴＧＦ−β１−３　
ＣＩ（０細胞トランスフェクタントからのゲノムＤＮＡ
のサザンプロット分析。ＴＧＦ−β１−３トランスフェ
クタントからの高分子量ＤＮＡはＢａｍＨｊ又はＥｃｏ
ＲＩで消化し、２０μｇを１％アガロースゲル上で分別
した。

ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ　Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）膜に移
しニック翻訳ＴＧＰ−βＩ　ＤＮＡで検査した。露出時
間はＴＧＦ−β１−３−０細胞について３０時間ならび
にＴＧＦ−β１−３−２００及び２０００細胞について
１０時間であった。ＤＮＡサイズマーカーを図の左側に
示す。矢印はＴＧＦ−β１プローブへのハイブリッド形
成が予想されるＤＮＡサイズを示す。

第５図１組換え体又は天然β１−ＴＧＦを用いたＣＣＬ
−６４ミンク肺上皮細胞の成長阻害検定。パネルＡ：牛
の肺臓から精製した天然ＴＧＦ−β１を用いる成長阻害
検定；８−１２ピコグラムのＴＧＦ−β１を用いて５０
％阻害が典型的に到達する。パネルＢ：増幅のさまざま
の段階のＴＧＦ−β１−３の集密的単層から集めた無血
清上澄み液。培地を０．２Ｍ酢酸に対して透析し後述す
る第７．１．６節記載の成長阻害検定を行なった。表示
した結果は５成蒐集物当り１×１０’　ＩＩＩ胞に正規
化する。　　、未増幅ＴＧＦ−β１−３細胞；・−・２
μｈメトトレキセート適応ＴＧＦ−β１−３；０−０２
０μＨメトトレキセート適応ＴＧＦ−β１−３細胞。

第６図１組換え体ＴＧＦ−β１の酸活性化。ＴＧＦ−β
１−３／２０００細胞からの無血清上澄みの２４時間採
集物を作成した。等量を次に０．２Ｍ酢酸又は５０ｍＭ
　ＮＨ４ＨＣＯ：ｌ　（＋）Ｈ７，Ｏ）に対して透析し
た。対照として先ず５０ｍＭ　ＮＨ４ＨＣＯ，に対して
透析した上澄みを、次に０．２Ｍ酢酸に対して透析した
。異なる方法で処理した用量−反応対生物活性曲線を示
す。ムーム、ＮＨ，Ｉ（ＣＯ，に対して透析された上澄
、・−・、０．２Ｎ酢酸に対して透析された上澄、〇−
〇、ＮＨ４ＨＣＯ３で処理し更に０．２Ｍ酢酸に対して
透析した上澄み液。

第７図、　　ｒＴＧＦ−β１タンパク質の構造的特徴を
示し、部位特異的抗ペプチド抗血清の作成に用いられる
ペプチド領域を示す線図、アミノ酸についての一文字記
号を用いる：Ａ（アラニン）、Ｃ（システィン）、Ｄ（
アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｆ（フェニル
アラニン）、Ｇ（グリシン）、Ｈ（ヒスチジン）、■（
イソロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｌ（ロイシン）、門（
メチオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、
Ｑ（グルタミン）、Ｒ（アルギニン）、Ｓ（セリン）、
Ｔ（トレオニン）、Ｖ（バリン）、１ｌｌ（トリプトフ
ァン）、Ｙ（チロシン）、　ＴＧＦ−β１の機能的に重
要な領域：リーダー配列、前駆体配列及び成熟ＴＧＦ−
β１が同定されている。

第８図、イムノブロッテングによるＴＧＦ−β１−３細
胞の条件付は培地中の組換え体ＴＧＦ−βｌの同定。

無血清上澄み液を細胞の集約的培養から集めて０．２門
酢酸に対して透析した。凍結乾燥後、該材料を５ＯＳ−
試料緩衝液で可溶化し、２Ｘ１０５細胞の当量を５Ｏ５
−ポリアクリルアミドゲルで分別し、イムノプロンテン
グで免疫的に活性なＴＧＦ−β１タンパク質を検知した
。抗−ＴＧＦ−β１　’Ｊｂ９−３８＋　をイムノプロ
ントに用いた。ペプチドブロッキング実験にはイムノプ
ロットに先立ち５０μｇ／ｒｒｄｌのペプチド３６９−
３８１を抗体に加えた。パネルＡ　：　０．２、又は２
０μ門メトトレキセ−１・に適応したＴＧＦ−β１−３
からの上澄中から集め還元条件下で５ＯＳ−ボリアクリ
ルアごドゲルで分別した物質のイムノプロット。比較の
ために天然牛肺臓ＴＧＦ−β１　（１００ｎｇ）を包含
した。パネルＢ：上澄みを非還元条件で分別した。牛肺
臓ＴＧＦ−β１　（２５０ｎｇ）を包含させた。

第９図、抗−ＴＧＦ−β１８１−９４及び抗−ＴＧＦ−
β１□２゜２３６をプローブとしたＴＧＦ−β１−３細
胞でつくられた分泌組換え体ＴＧＦ−βｌのイムノプロ
ット。上澄み液を集め、第８図に従って処理し、勾配付
５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲル上で分別した。（Ａ）
還元性５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分別した上
澄み液のイムノプロット。組換え体物質の３種の異なっ
た型を示すのに、最後のパネルでは前駆体特異性及びＴ
ＧＦ−β（特異的抗体の混合物で実施したイムノプロッ
トを示した。（Ｂ）非還元性条件下で５Ｏ５−ポリアク
リルアミドゲル上で分別した上澄み液のイムノプロット
。前駆体特異性及びＴＧＦ−β１特異的抗体の混合物を
最後のパネルに示す。

第１０図、　ＴＧＦ−β１−３１０及びＴＧＦ−βｌ−
３／２０００細胞の全分泌タンパク質中のｒＴＧＦ−β
１の成熟及び前駆体型の検出。６０ｍｍ円形組織培養皿
に集密に成長させた細胞をメチオニン、システィン及び
ウシの胎児血清がなく、１００ｐＣｉ／成の３５３−メ
チオニンと３５３−システィンを含有する３ｄのＤＭＥ
Ｍ中で標識した。■８時間後、無血清、標識化上澄を集
め、清澄化し、還元性７．５−１７，５％５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で分別した。電気泳動に続いてゲ
ルをＥｎ’Ｈａｎｃｅで処理してオートグラフにかけた
。

結果は３μｉの標識化上澄み液を用いた８時間の露出を
示す。

第１１図、　　ＴＧＦβ３−２０００細胞から分泌され
たＴＧＦβｌ関連タンパク質の検出。Ａ）　ＴＧＦ−β
１前駆体の線図。本文参照。Ｂ）　　ＴＧＦβ３−２０
００細胞を１００ｍｍ皿に前述（Ｇｅｎｔｒｙ　ｅｔ　
ａｌ、、１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　７：３４１８−３４２７）のように集密的
に成長させた。無血清上澄（５ｄ）を集め、０．２Ｍ酢
酸に対して透析し、０．５　ｄ試料を凍結乾燥し、（Ｇ
ｅｎｔｒｙａｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｍｏｌ、　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏｌ、　７：３４１８−３４２７）記載の
ように、アミノ酸残基３６９−３８１　（抗−ＴＧＦβ
３６゜、□）及び８１−９４　（抗−ＴＧＦβ８１−□
）に対する抗ペプチド抗体を用いてイムノプロットした
：レーンｌ、非還元試料；レーン２、還元試料、左（レ
ーン１）及び右（レーン２）の数字はキロダルトンの分
子量標準品の位置を示す。Ｃ）　　ＴＧＦβ３−２００
０細胞を６０帥組織培養皿で集密に成長させ、メチオニ
ン及びシスティンがなく　１００　２００１１Ｃ１／ｍ
ｌ　［”Ｓ　］−システィン及び［：Ｉ５３］−メチオ
ニンを含有する無血清培地で１５分パルスした。次に細
胞をメチオニン及びシスティンを含有する無血清培地中
に４時間入れ、非還元性条件下で（Ｌａｅｍｍｌｉ、　
１９７０゜Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５）記
載のように１ｏａｎ、試料を７．５−１５％ポリアクリ
ルアミド−３ＯＳゲル上で分析した（レーン１）、第２
の皿の細胞は２００μＣ４／ｄ［’Ｈ］　　−グルコサ
ミンを含有する無血清培地中で２４時間標識化し、無細
胞上澄み液を０．２Ｍ酢酸に対し４８時間透析した。こ
の試料の２００マイクロリツトルを凍結乾燥し、非還元
性条件下で７．５％−１５％ポリアクリルアミド−５Ｏ
Ｓ勾配ゲル上で分析した。ゲルをフルオログラフィーに
かけ、Ｃｒｏｎｘ−４Ｘ線フィルム（ＤｕＰｏｎ　ｔ）
を用いてオートラジオグラフィーにかけた。Ｄ）還元条
件で行なった以外は試料はＣと同じ。Ｅ）　　ＴＧＦβ
３−２０００細胞を血清中の１ｍＣ１／ｍｆｆ１の［”
Ｐ］−正燐酸塩と燐酸塩のない培地で標識化した。無細
胞上澄み液を上記のように処理し、還元性条件下で１５
％ポリアクリルアミドゲル−５ＯＳゲル上で分別して、
ゲルをオートラジオグラフにかけた。Ｆ）［”Ｐ］標識
化前駆体を２サイクルのボリアクリルアξドーＳＤＳゲ
ル電気泳動で精製し、１時間９５°Ｃで６？’ｌ　ＨＣ
ｌ中で加水分解した（Ｃｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１
９８３＋Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９９：３８７−
４０２）　、消化生成物をｐＨ１，９及びｐＨ３，５で
の電気泳動で分離しオートラジオグラフィーで検出した
。内部標準（Ｐ−ｓｅｒ　、　Ｐｔｈｒ、　Ｐ−ｔｙｒ
）はニンヒドリンで検出した。

第１２図、　　ＴＧＦβ３−２０００細胞からの無血清
上澄みをさまざまの解糖酵素で消化。Ａ）　　ＴＧＦβ
３−２０００細胞を集密に成長させ、２４時間無血清培
地で培養した。培地を０．２門酢酸に対し透析し、凍結
乾燥し、試料をノイラミニダーゼ（０，２５ユニツト／
　ｍｌ、レーン３）、　Ｎ−グリカナーゼ２０ユニット
／　ｍｌ、レーン２〉又はエンドグリコシダーゼＨ（０
，２ユニツト／　ｍｌ　、レーン４）で処理した。消化
物を還元性条件下でＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分別し第１１図と同様にイムノブロッティング
した。レーン１は未処理試料を含む。Ｂ）　　ＴＧＦβ
３−２０００細胞からの無血清上澄みを第１１図と同し
く　［”Ｓ］−システィン及び［３５Ｓコーメチオニン
で標識化し、エンドグリコシダーゼＨ（レーン２）、　
ノイラミニダーゼ（レーン３）及びＮ−グリカナーゼ（
レーン４）で上と同じく消化した。

レーンｌは未処理試料を含む。還元性条件下での５Ｏ５
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で消化物を分別し、
ゲルをオートラジオグラフィーにかけた。Ｎ−グリカナ
ーゼはＧｅｎｚｙｍｅ　（Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓ、
）から、エンドグリコシダーゼＨ及びノイラミニダーゼ
はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ
）から購入し、推奨緩衝条件を用いた。

第１３図、　ＴＧＦ−βｌ特異性転写物の無細胞翻訳。

Ａ）　ＴＧＦ−β１の全コード化領域（３）を含む１３
５０塩基対Ｐｓｔ　Ｉ−ＥｃｏＲ断片をｐＳＰ６４　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中にサブクローニングし、文献（
Ｐｅｌｈａｍ　ａｎｄ　Ｊａｃｋｓｏｎ＋１９７６、　
Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６７：２４７−２
５１）記載のイオン性条件を用いＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　（Ｂａｌｔｉ−ｍＯｒｅ＋
　ＭＤ）から購入のＳＰ６ポリメラーゼ（Ｋｒｅｉｇａ
ｎｄ　Ｍｅｌｔｏｎ＋　１９８＋４＋　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８ニア０５７−７０７０　
）を用いて５μｇの直線化プラスミドを転写した。反応
物をＤＮアーゼで消化し、フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（２４：　２４　：１）で２回抽
出し、エタノールで沈澱させた。

ＲＮＡを５０μｌのβ２０にとかし、１０μ２（レーン
２）を１％アガロース−尿素ゲルで（Ｐｕｒｃｈｉｏ　
ｅｔ　ｅｌ、。

１９８０、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　３５：６２９−６３９
）記載のように分別した。レーン１は網状赤血球リポソ
ームＲＮＡマーカーを有している。ゲルをエチジウムプ
ロ旦ドで染めてＵＶ光をあてて写真をとった。Ｂ）上述
のＲＮＡを１０分間２２°ＣＴ：１０ｍＭメチル水銀で
処理し、２０ｍＭ２−メルカプトエタノールに調節し、
１μｇをメツセージ依存性無網状赤血球細胞翻訳系（Ｐ
ｕｒｃｈｉ。

ｅｔ　ａｌ、、１９８３．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４８
：３２０−３２４）中に、５０ｐＥの全容積に［”Ｓ］
−メチオニン及び（Ｓｈａｒｐ−１ｅｓ　ｅｔ　ａｌ、
、１９８７．　ＤＮＡ　６：２３９−２４４）記載のイ
オン性条件を用いて翻訳した。反応物をｌ０％ポリアク
リルアミド−３ＯＳゲル（Ｌａｅｍｍｌｉ、　１９７０
．　Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５）上で分別し
；ゲルをフルオログラフィーにかけてＣｒｏｎｅｘ−４
Ｘ線フイルムに露光させた。レーンｌ添加ＤＮＡなし；
レーン２１μｇＴＧＦ−βＩ　ＲＮＡ。

第１４図、ＴＧＦ−β３−２０００細胞の５００成無血
清上澄み液の硫酸アンモニウム沈澱後の、２０ｍｇタン
パク質のＢｌｏ−５ｉｔ　ＴＳＫ−２５０カラム（２１
，５Ｘ　６００ｍｍ　）上のゲルパーメージョンクロマ
トグラフィー。カラムは２ｍ／ｍｉｎ、　２２°Ｃで４
０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含有する水中の０．１
％ＴＦＡで平衡化し、４　ｍｉＶ、フラクションを集め
た。同フラクションの一部をミンク肺上皮細胞の生成阻
害活性（−〇−）について検定した。実線は２５４ｎｍ
でのタンパク質吸光度を示す。次のタンパク質をマーカ
ーとして使用した：α−キモトリプシノーゲン（Ｍｒ　
２５．７００）、牛のスイ臓リボヌクレアーゼＡ　（Ｍ
ｒ　１３，７００）、及びインシュリン（Ｍｒ　５，７
００）。

第１５図、逆相ＨＰＬＣによるｒＴＧＦ−β１の精製。

μＢｏｎｄｐａｋ　Ｃ，８カラム（１０ｐｍ粒子サイズ
、３．９Ｘ　３００ｍｍ）上でゲルパーメージョンクロ
マトグラフィー精製したＴＧＦ−β１（第２図、ブール
Ｂ）からの０．６５■タンパク質の溶離パターン、溶離
は水中の０．０５％ＴＦＡから０．０４５％ＴＦ八中の
３０へアセトニトリルのＩＯ分間の直線勾配、及び０．
０４５％ＴＦＡ中の３６−６０％アセトニトリルの１０
分間の勾配を用いて行なった。カラムは０．２　Ｉｎｌ
／ｍｉｎの流速にて２２°Ｃで操作した。このフラクシ
ョンの一部についてミンク肺上皮細胞の生成阻害活性を
検定した（−０−）、水平バーはプールしたｒＴＧＦ−
β１を示す。ＵＶ吸収性物質を２１４ｎｍにて連続的に
モニターＬ（−）；破線（−−−−）はアセトニトリル
濃度を示す。

第１６図、精製ｒＴＧＦ−β１タンパク質の５ＯＳ−ポ
リアクリルアミドゲル分析。非還元性（ト）又は還元性
０条件下でＴＧＦ−β１の前駆体及び成熟型を５ＯＳ−
ＰＡＧＥで分別し、クーマシープルーＲ−２５０で染め
た。ｎＴＧＦ−ａｌをウシ肺臓から分離して比較に用い
た。マーカータンパク質はＫＤａ　ｌにより図の左及び
右に示す。

第１７図、　ＴＧＦ−β１発現性増幅Ｃ）１０細胞の条
件付は培地からのタンパク質のクーマシーブルー染色パ
ターン。条件付は培地を、透析し、１５％ＳＯＳポリア
クリルアミドゲルで還元性条件下で分別し、クーマシー
プルーＲ−２５０で染めた。参考のため図の左側に記し
た文字ａ、ｂ及びｅはｒＴＧＦ−β１分子を示している
。レーン１．０．２５ｍｆｔの条件付は培地；レーン２
、ＫＤａｌでの表示分子量を持つマーカータンパク質を
示す。

第１８図、ｒＴＧＦ−β１前駆体のＣＮＢｒペプチドの
Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（７，５Ｘ　６
００ｍｍ）のゲルパーメーシゴンクロマトグラフィー。

カラムは４０％アセトニトリル含有する水中の０．１％
ＴＦ＾で０．２５ｍｆ／ｍｉｎ、　２２’Ｃで平衡化し
た。ＵＶ−吸収性物質は２１４ｎｍでモニターした。Ｍ
で示したピークはエドマン分解を受けたＣＮＢｒペプチ
ドを示す；数字は全配列中でジスルフィド結合で結ばれ
たその特定のフラグメントの位置を示す（Ｓｈａｒｐｌ
ｅｓ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８７、　ＤＮＡ　６：２３９
−２４４）。

第１９図、ミンク肺インデケーター細胞を用いた精製Ｔ
ＧＦ−βｌタンパク質の成長阻害曲線、成長阻害は発明
の詳細に記載した方法で実施した。ＴＧＦ−β１ポリペ
プチド濃度はアミノ酸配列で決定した。

−△−１組換え前駆体タンパク質；−・−、ウシ肺臓か
らのｎＴＧＦ−βｌ；−〇−ｒＴＧＦ−ａｌ。

第２０図、（八）ジスルフィド架橋結合性に重点を置い
たＴＧＦ−β１前駆体の提案構造。（Ｂ）トランスフェ
クションしたＣＨＯ細胞中のプレープローＴＧＦβ１の
プロセシング現象の要約。タンパク質加水分解プロセシ
ング部位に重点をおいている。アステリスクはグルコシ
ル化部位を示す。黒塗り、シグナルペプチド；無地、プ
ロ領域；斜線部、成熟ＴＧＦ−β１゜ 第２１図、ヌード・マウス中のＡ３４９ヒト肺腫瘍の成
長に対するＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の作用。１２
週の年令の雄のヌードマウス（Ｂａｌｂ／　ｃ　−ｎｕ
＋ｎｕ＋　）の後頚部に１．３　Ｘｌ０６ヒト肺癌腫細
胞（Ａ５４９）を０．２−のリン酸塩緩衝食塩水として
皮下注射した。

２０日内で約８０％の動物に触知できる腫瘍（＜１０ｍ
ｍ’−３ｘ３Ｘ１ｍｍ）を生じた。ＩＩＩ瘍のある動物
を無作為に異なるカゴに分けた。処置の第１日は測定可
能な腫瘍が生じた後、動物に処置を行なった最初の日に
対応する。５匹の各群に上記したように０．１０ｄのキ
ャリヤー容積で腫瘍の近傍に皮下的に注射した。対照群
には高圧液クロ精製ウシ血清アルブミン（２μｇ）か上
皮成長因子のループ領域（残基１ｌ−２１）に対応する
台底ペプチド（２００ｎｇ）かを注射した。腫瘍サイズ
は横軸に示した日に注射を行なう前にキャリバーを用い
て三次元で測定した。各点の値は平均した腫瘍容積を示
す。ＴＧＦβ１及びＴＧＦ−β２は文献（Ｍａｓｓａｑ
ｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、＋　８３：８２０６−８２１０　
　；　５ｐｏｒｎｅｔ　ａｌ、、１９８３．５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２１９：１３２９　）のようにウシの骨から均質
に精製して、ウシの血清アルブミンの１０倍過剰で安定
化した。この特定実験中に投与した各因子の合計量は１
．４μｇ／匹であった。

第２２図、ヌードマウス中のＡ３４９ヒト癌腫瘍のＴＧ
Ｆ−β１阻害の用量反応。処置の第１日（腫瘍細胞培養
後２５日）の当初の腫瘍サイズが大きい（２０＋ｎｍ”
　）以外は、プロトコルは第２１図の記載と同一である
。対照動物群はＢＳＡを注射し；処置動物群は１５日間
中に３日毎に１２．５．５０又は２００ｎｇのＴＧＦ−
β１を腫瘍近傍に合計５回注射した。値は１５日目の各
群の平均腫瘍容積を示す。

第２３図、非処置及びＴＧＦ−β１処置したＡ３４９肺
癌腫を保持するヌードマウスの写真。上方は大きな皮下
腫瘍を持っている２０日目の対照動物（第２１図に記載
した実験からのマウスの実際写真）；下方はＴＧＦ−β
１処置群（同一実験）を代表する動物である。挿入図は
対照（左）及び処置（右）動物から摘出した腫瘍を示す
。（動物中のと、摘出後の写真の大きさの差はカメラ位
置の差による。）第２４図、モック及びＴＧＦ−βｌ−
処置動物から摘出したｌ１ｆｆｌ瘍の組織学的検査。新
たに摘出した腫瘍（第２１図の処置２０日）を緩衝ホル
マリンで固定し、パラフィンに植込み、切断してＧａｍ
ｏｒｉ’ｓ　ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色した。モック処
理動物からの腫瘍の断面はパネルＡ　（２０Ｘ）　、パ
ネルＣ（１００Ｘ）で、ＴＧＦ−βｌ処置動物からの腫
瘍の断面はパネルＢ（２０Ｘ）、パネルＤ（１００Ｘ）
である。パネルＤはＴＧＦ−β１処置動物からの腫瘍の
断面からの容器壁（１００Ｘ　）がある。

第２５図、モック処置及びＴＧＦ−β１処置動物からの
固定したヒトの肺腫瘍断面の染色パターン。モック処置
動物からの腫瘍の断面はＲＡＳ（パネルＡ）で１００Ｘ
　ｉアルシアンプル（パネルＣ）１００ｘで染色、　Ｔ
ＧＦ−βｌ処置動物からの腫瘍の断面はＰＡＳ　（パネ
ルＢ）で１００Ｘｉアルシアンブルー（パネルＤ）１０
０×に染色。

第２６図、クローン１７細胞により放出されたＴＧＦβ
ｌ前駆体タンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルア旦ドゲル
電気泳動。（ト）ＴＧＦ−β１タンパク質の線図；〒、
リン酸化されているグリコシル化部位を示し；？、非リ
ン酸化グリコシル化部位を示す。クローン１７細胞から
の無細胞上澄を［３５３１−メチオニンと［１５３］−
システィン■、［３Ｈ］−グルコサミン０、［３Ｈ］−
マンノース０及び［３２ｐ］−リン酸塩０を用い無血清
培地中で標識付けし；試料を処理し、７．５−１５％勾
配５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｂ及びＣ）、又は
１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｄ及びＥ）上
で分析した。

第２７図、クローン１７により産生されたＴＧＰ−βｌ
前駆体タンパク質のＮ−グリカナーゼ消化。囚［ｆｆ５
Ｓ］−標識化無細胞上澄を処理し、Ｎ−グリカナーゼで
処理して、７．５−１５％勾配５ＯＳ−ポリアクリルア
ミドゲル上で分析：レーン１、無酵素；レーン２、Ｎ−
グリカナーゼ添加。■標識が［３２ｐ］−リン酸塩であ
る以外はＡに同じ。

第２８図、　ＴＧＦ−β１前駆体糖ペプチドのアミノ酸
配列。Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼ■、及びト
リプシン（Ｔ）を用いての分解で得たペプチドを示す、
〒、リン酸化されているグリコシル化部位を示し；？、
非リン酸化グリコシル化部位を示す。番号はＴＧＦ−β
１前駆体の全配列中の特定の糖ペプチドの位置を表わす
。×、未同定残基。

第２９図　［３２ｐ］−標識ＴＧＦ−β１前駆体のＣＮ
Ｂｒペプチドのゲルパーメージョンクロマトグラフイ。

Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＴＳＫ−２５０カラム（７，５Ｘ６０
０ｍｍ）上のクロマトグラフィー。ＣＮＢｒで分解した
６５０ｐｍｏ　ｌのＳ−ピリジルエチル化ＴＧＦ−β１
前駆体及び１６５，０００ｃｐｍのＳ−ピリジルエチル
化［”Ｐｌ　−ＴＧＦ−β１前駆体の溶離パターン。上
記フラクションは［”Ｐｌ−放射能（−〇−）で測定し
た。実線は２１４ｎｍのタンパク質吸光度を示す。次の
タンパク質をマーカーとして用いた：α−ラクトアルブ
ミン（Ｍｒ　１８，４００）　、チトクロームＣ（Ｍｒ
　１２，３００）、及びインシュリン（Ｍｒ　５，７０
０）。Ｍで示したピークはＣＮＢｒペプチドを示す二数
室はＴＧＦ−βｌ前駆体の全配列中の特定フラグメント
の位置を示す（ＳｈａｒｐＩｅｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、
１９８７．　　ＤＮＡ　　６：２３９−２４４）　　。

第３０図、　ＣＮＢｒペプチドＭ　（３９−１１３）の
Ｓ、ａｕｒｅｕｓｖ８プロテアーゼペプチドの逆相高速
液体クロマトグラフィー。ＲＰ−３００カラム（２，Ｉ
　Ｘ　３０ｍｍ　）上のクロマトグラフィー。Ｓ、ａｕ
ｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼで消化した１２．５００ｃ
ｐｍの［”Ｐｌ　−Ｍ　（３９−１１３）を含有する３
７０ｐｍｏｌのＭ　（３９−１１３）の溶離パターン。

ペプチドの溶離は流速１００　ｕ　ｌ　／ｍｉｎ、３５
°Ｃでの水中の０．１％トリフルオロ酢酸から０．０８
％トリフルオロ酢酸含有６０％アセトニトリルへの２時
間の直線的勾配を用いて行なった。ＵＶ吸収性物質を２
１５ｎｍ　（−−−）でモニターシタ。［”Ｐ　］　１
射能（−〇−）はＬＳ６８００液体シンチレーションカ
ウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ　）で測定した。Ｅで示したピ
ークはエドマン分解を受けたｖ８プロテアーゼペプチド
である。

第３１図、ＣＮＢｒペプチドＭ　（１３４−２５３）の
Ｓ、ａｕｒｅｕｓｖ８プロテアーゼペプチドとトリプシ
ンペプチドの逆相高速液体クロマトグラフィー。ＲＰ−
３００カラム（２，Ｉ　Ｘ　３０ｍｍ　）上のクロマト
グラフィー。（Ａ）Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアー
ゼ消化した４４，０００ｃｐｍの［３”Ｐｌ　−Ｍ　（
１３４−２５３）を含有する４００ｐｍｏｌのＭ　（１
３４−２５３）の溶離パターン。（Ｂ）　３，１１００
ｃｐの［ｆｆ２Ｐ］　Ｅ（１７０−１９４）を含有する
ブールＡ（第３１図Ａ）から誘導されたトリプシンペプ
チドの溶離パターン。クロマトグラフィー条件は第３０
図に記載されている。Ｅで示したピークはｖ８プロテア
ーゼを示し、Ｔで示したピークはエドマン分解を受けた
トリプシンペプチドを示す。

第３２図、マンノース−６−リン酸の同定。（Ａ）［３
２ｐ］標識ＴＧＦ−β１前駆体タンパク質を酸で２時間
加水分解した。加水分解生成物を非放射性情アミノ酸及
びマンノース−６−リン酸と混合し、ｐ＋＋　１．９で
、とｐｔ１３．５で直交的に電気泳動させた。

オートラジオグラフを示す。試料は右下方（矢印の先）
につける。マンノース−６−リン酸（Ｍ　６　Ｐ）、燐
セリン（ＰＳ）燐トレオニン（ＰＴ）、燐チロシン（Ｐ
Ｙ）及び無機燐酸塩（Ｐｔ）がマークされた。［：１２
ｐ］−はマンノース−６−リン酸とＰｉと同時に移動し
、燐オリゴ糖（小矢印の先）と考えられる位置に検出さ
れた。（Ｂ）　Ｅ　（７６−９１）及び（Ｃ）　　Ｅ（
１３４−１３９）の１時間加水分解生戒物の同様な分析
。（Ｄ）［３２ｐ］−標識ＴＧＦ−β１前駆体タンパク
質を加水分解し、ｐＨ８，９の電気泳動で分離し、クロ
マトグラフィーにかけた。

第３３図Ａ、精製シアノゲンブロマイドベプチドＭ　（
１３４−２５３）の５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル分
析。Ｍ　（１３４−２５３）を、１５％５Ｏ５−ポリア
クリルアミドゲル上で（１）非還元条件下、または（２
）還元条件下にて分画し、クーマシーブリリアントブル
−Ｒ−２５０で染色した。分子量マーカーは、キロドル
トンで示しである。

第３３図Ｂ、プレープローＴＧＦ−βＩの線図。プロＴ
ＧＦ−β１、前駆体のプロ領域、および成熟ＴＧＦβ１
を、レーンａ、ｂおよびＣにそれぞれ示しである。プロ
領域中のＣＹＳ　（Ｃ）残基を示しである。Ｎ結合グリ
コシル化のマンノース−６−リン酸含有部位（〒）およ
び非−リン酸化部位（？）を示しである。

第３３図Ｃ，ＴＧＦ−βｌ前駆体変異体。肩文字は、Ｓ
ＥＲ置換のアミノ酸位置を示す。合致しないヌクレオチ
ドは、大文字で印刷し、新たなＳＥＩ？コドンには下線
を付しである。

第３３図りおよびＥ、）ランスフェクトされたＣＯＳ細
胞により分泌されたＴＧＦ−β１変異体蛋白質のイムノ
プロット。無血清上澄を採集し、０．２門酢酸に対して
透析し、７．５−１７．５％５ＯＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル上で分画し、そして還元（Ｄ）記または非還元（
Ｅ）条件下にてイムノプロット分析を行った。プロット
は、プロ領域（抗−ＴＧＦ−β１□−７４）および成熟
（抗−ＴＧＦ−β１＋Ｈ−３ａｔ）特異的抗−ペプチド
抗体類の混合物を用いてプローブにかけた。ＣＯ３細胞
は、ベクター（πｌ（３Ｍ）のみ（レーン２）、または
ＴＧＦ−β１（レーン３）　、ＴＧＦ−β１”３　（Ｌ
／−ン４）、ＴＧＦ−β１　””　（Ｌ／−ン５）、Ｔ
ＧＦ−β１ｆｆ２２Ｓ（レーン６）およびＴＧＦ−βＩ
　５２２３／２２５（レーン７）をコードするベクター
を用いてトランスフェクトした。レーン１は、トランス
フェクトされていないＣＯ３細胞からの上澄を含んでい
る。

分子量標準はキロドルトンで表示されている。

第３３図ＦおよびＧ、変異体ＴＧＦ−β１前駆体および
成熟蛋白質の同定。πＨ３Ｍ　（レーン２）、ｐＴＧＦ
β１（レーン３）、　ｐＴＧＦ−β１３３３（レーン４
）、ｐＴＧＦβ１３２２３（レーン５）　、ｐＴＧＦ−
β１３！２５（レーン６）またはｐＴＧＦ−β１　！２
２：ｌ／２２％（レーン７）によりトランスフェクトさ
れたＣＯ８細胞からの上澄を採集し第３３図り、Ｅの記
述に示したものと同様に処理した。イムノプロットは、
（Ｆ）成熟配列（抗−ＴＧＦ−β１３ｂ’ｉ−３□）、
または（Ｇ）プロ領域（抗−ＴＧＦ−β１１１１−９４
）に対して特異的な抗体を用いて、非還元条件下で行な
った。レーンｌは、トランスフェクトしないＣＯ８細胞
上澄を含んでいる。分子量標準は、キロドルトンで表示
されている。

第３４図、精製マンノース６−リン酸受容体に対する１
２５１−標識ＴＧＦ−β１前駆体の結合。精製ヒトマン
ノース６−リン酸／ＩＧＦ−Ｉｆ受容体（Ｒｏｔｈ　ｅ
ｔａｌ、、１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１４９：６００−
６０６）を、この受容体に対する抗体類で被覆したマイ
クロタイターのウェルに吸着させた。＋′Ｉ標識ＴＧＦ
−βｌ前駆体（ウェルあたり１００．　ＯＯＯｃｐｍ）
を、非標識競合物の表示された濃度での存在下に添加し
た。４°Ｃにて３時間後に、ウェルを洗浄し、切断して
計数した。結果は、１０％未満の差をもった２検体の平
均であり、３つの実験の代表値である。競合物を含まな
い（０％阻害）ウェルにおいて、５．２％の標識リガン
ドが結合した。ＴＧＦ、ＴＧＦ−β１前駆体；　　ＭＩ
Ｐ、マンノース１−リン酸；Ｍ６Ｐ、マンノース６−リ
ン酸。

第３５図、ラット樹脂細胞に結合するＩＧＦ−ｎおよび
組換えＴＧＦ−β１前駆体におけるインシュリン刺激さ
れた増加。インシュリンにより前処理された、またはさ
れないラット脂肪細胞を、組換え１２５１ＴＧＦ−β１
前駆体（４，９Ｘ　１０’ｃｐｍ）または”’ｒ４ＧＦ
ＩＩ　　（４，２Ｘ　１０’ｃｐｍ）のいずれかと共に
培養した。

非特異的な結合を評価するために、１１００ｎ　ＩＧＦ
−ＩＩまたは３ｍＭｍａｎ６Ｐを示されているように含
めた。

結果は、３検体測定の平均である。

第３６図ｊＧＦ−ＩＩおよび組換えＴＣＰ−βｌ前駆体
の、ＣＨＯ細胞およびヒトＩＧＦ−ＩＩ　／ｍａｎ　６
　Ｐ受容体（ＣＨＯＩＧＦ−ＩＩ　Ｉ？）を過剰発現す
るＣＨＯ細胞に対する結合。

細胞は、”Ｊ−ＩＧＦ−Ｉ［（８，ＯＸ１０’ｃｐｍ）
または組換え”５ｌ−ＴＧＦ−β１前駆体（１，３Ｘ１
０’ｃｐｍ）のいずれかと共に培養し、示された場合は
５ｍＭｍａｎ６Ｐまたは１１００ｎ　ＩＧＦ−Ｕのいず
れかを、非特異的結合の評価のために含めた。結果は、
３検体測定の平均である。

第３７図、ヒトＩＧＦ−ＩＩ　／ｍａｎ　６　Ｐ受容体
を過剰発現するＣＨＯ細胞に対する組換えＴＧＦ−β１
前駆体の結合の特異性。細胞を、組換え＋２’Ｉ−ＴＧ
Ｆ−β１前駆体（６，７Ｘ　１０’ｃｐｍ）および、示
された濃度の競合非標識リガンドと共に培養した。結果
は、３種体測定の平均である。

第３８図１組換えＴＧＦ−β１前駆体の内在化。ＩＧＦ
ＩＩ　／ｒａａｎ　６　Ｐ受容体を過剰発現するＣＩＯ
細胞を、３７°Ｃにて、組換え”５ｌ−ＴＧＦ−β１前
駆体（５Ｘ’ＩＯ’ｃｐｍ）と共に、５ｍＭのｍａｎ　
６　Ｐの存在または不在下で培養した。示された時間に
おいて、全、または酸抵抗性（すなわち内在化）細胞に
伴われる計数を測定した。結果は３種体測定の平均であ
る。

第３９図、単離されたＩＧＦ−ＩＩ　／ｍａｎ　６　Ｐ
受容体に対する血小板ＴＧＦ−βｌ前駆体の結合。マイ
クロタイターウェルに吸着した精製ＩＧＦ−Ｉｆ　／ｍ
ａｎ　６　Ｐ受容体を、示された濃度の血小板由来精製
潜在性ＴＧＦ−β１（ロ）または組換えＴＧＦ−β１（
■）のいずれかの存在下に＋　２５１−標識組換えＴＧ
Ｆ−β１前駆体と共に培養した。４°Ｃにて３時間後に
、受容体結合放射活性の量を測定した。

第４０図、　ＩＧＦ−ＩＩ　／ｍａｎ　６　Ｐ受容体の
組換えＴＧＦ−βｌ前駆体への結合を示し、血小板ＴＧ
Ｆ−β１には結合しない：ウエスタンプロット分析。組
換え（Ｒ）（０，５μｇ）および血小板（Ｐ）　ＴＧＦ
−β１前駆体（２，５μｇ）を還元ＳＯＳポリアクリル
アミドゲル上で電気泳動にかけ、ニトロセルロースフィ
ルタに移し、前駆体中の配列に対して特異的な抗−ペプ
チド抗体類のいずれか（左側〉、またはＩＧＦ−ＩＩ　
／ｍａｎ６Ｐ受容体および該受容体に対する抗体（右側
）と反応させた。結合したウサギ抗体の存在が、抗−ウ
サギＩｇに結合したアルカリホスファターゼおよびアル
カリホスファターゼの組織化学的着色により検出された
。分子量マーカー（キロドルトン）の位置が、矢印によ
り示されている。組換え非切断前駆体（ａ）、組換え前
駆体残存物（ｂ）および血小板前駆体残存物の位置も示
しである。

第４１図、ツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）
　（ＴＵ）処理ＣＨＯ細胞由来、および非処理ＣＨＯ細
胞由来の免疫反応性ＴＧＦ−β１の同定。完全培養培地
中で密に成育させた細胞を、ジメチルスルフオキシドの
最終濃度０．１％（ｖ／ｖ）において、２．５μｇ／ｄ
のＴＯにて４時間処理した。次いで、ＴＵを含有する無
血清培地を添加し、２４時間後に採集した。対象細胞に
は、０．１％（Ｖ／ν）のジメチルスルフオキシドのみ
を与えた。分泌された蛋白質類について、培地を０．１
Ｍ酢酸に対して透析し、乾燥させ、そしてイムノブロッ
ティングにより分析を行なった。イムノプロットの中心
に付されたａ、ｂおよびＣの文字は、ＴＧＦ〜β１の３
種の形態を示している。このイムノプロットは、１ｒｎ
１の培地中に２Ｘ１０’個の細胞から分泌された蛋白質
を示している。細胞会合形態のＴＧＦ−βＩについては
、５Ｘ１０’個の細胞を採集し、イムノプロッティング
により分析を行なった。使用した抗体類は、前駆体−お
よび成熟−特異的抗ベプチド抗体類（後述する第７．１
．８節）。

第４２図、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞株τＧＦ
−β３−２０００クローン１７によるＴＧＦ−β１の分
泌の時間経過。（Ａ）パルス標識ＣＨＯ細胞から種々の
時間１において採集された調節培地の５ＤＳ−ＰＡＧＥ
、細胞は、［３５−Ｃ］−システィンおよび［３５−Ｓ
　］−メチオニンの組合せを用いて０．５時間パルス標
識した。培地は、７．５−２０％勾配５ＯＳ−ポリアク
リルアミドゲル上で、還元条件下で分画した。マーカ蛋
白’１（ｋＤａｌ）は、図面の右側に位置している。（
Ｂ）種々の追跡時間におけるＣＨＯ細胞から分泌された
ＴＧＦ−β１の定量。ＴＧＦ−βｌ前駆体の量に対する
戒Ｗ、Ｉｔ　Ｔ　Ｇ　Ｆ−β１の比は、分泌の間におい
て不変であるので、分泌された組換え成長因子の相対的
水準は、フルオログラフにおいて観察された１２ｋＤａ
ｌ　ＴＧＦ−β１の密度測定的走査により測定した。各
点は、３種体実験の平均を表わし、標準偏差も含めであ
る。２０時間において分泌された成Ｐ　Ｔ　ｃ　Ｆ−β
１の相対量は、１．０と考えられた。

第４３図、　　ＣＨＯ細胞におけるＴＧＦ−β１分泌に
対するグリコシル化阻害剤の効果。（＾）細胞の密な培
養物を、（３５−Ｓ　］−システィンおよび一メチオニ
ンを用いた０、５時間のパルス標識に先立って、血清、
メチオニンおよびシスティンを欠いた培地中で１時間培
養した。阻害剤は、次の濃度で使用した：　０．２３ｍ
Ｍ　ＳＷ　、　０．５２ｍＭ　ＣＡ　、　　４ｍＭ　ｄ
Ｎ　、　　４ｍＭｄＭＭおよび６μＭＴＵ、６時間の追
跡に続けて、調節培地をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、フルオログラフにかけた。マーカ類は、
第４図に記載したものと同じである。（Ｂ）阻害剤によ
る処理に続いてＣＨＯ１ｌｌ胞から分泌された組換え成
長因子の定量。成長因子の相対量は、フルオログラフの
密度測定的走査により測定した。結果は、３回の独立し
た実験から得られ、標準偏差を示しである。対照Ｃｌｌ
０細胞中の戒ＰＴ　Ｇ　Ｆ−β１の相対量は１，０とみ
なされた。

第４４図、阻害剤処理細胞由来の分泌ＴＧＦ−β１蛋白
質のグリコシル化修飾酵素による消化。［３５−Ｓ　］
−メチオニンおよび−システインにより標識された、ト
ランスフェクトされたＣＩ（Ｏ細胞からの調節培養培地
を、６時間の追跡の後に採集し、ｅ　ｎ　ｄ　ｏ　ｔｌ
、ノイラミニダーゼまたはＮ−グルカナーゼによって消
化した。消化生成物を還元性７．５−２０％勾配ポリア
クリルアミドゲル上で分画し、フルオログラフィにかけ
た。フルオログラフの左および右側に示したマーカは、
第４１図に記載したものと同じである。

第４５図、グリコシル化阻害剤により処理したＣＩ（Ｏ
細胞からのＴＧＦ−β１前駆体のリン酸化。ＴＧＦ−β
３−２０００クローン１７　Ｃｌｌ０細胞の密な培養物
を、＋３２−　Ｐ　］−オルトリン酸で標識し、実施例
７（１）に後述するように処理した。標識培養培地を採
集し、過剰の［３２−Ｐ　］−オルトリン酸を５ｅｐｈ
ａｄｅｘ　Ｇ−２５脱塩カラムにより除去した。３２−
Ｐ−標識蛋白質を還元性Ｓ［ｌＳ　−ＰＡＧＥにより分
画し、オートラジオグラフィにかけた。マーカ蛋白質（
ＫＤａｌ）は、オートラジオグラフの右側に位置してお
り、左側に示された“ａ”および“ｂ”の文字は、ＴＧ
Ｆ−βｌ前駆体ポリペプチドを示す。

第４６図、３個のグリコシル化シグナルを欠失している
削除型変異体は、細胞から分泌されない。

（Ａ）グリコシル化シグナル配列を欠失するＴＧＦβ１
の削除型変異体の構造、およびその−時的発現プラスミ
ドＣＤＭ　８への挿入に関するダイアグラム。ＴＧＦ−
β１の３個のグリコシル化配列をコードするＤＮＡを除
去するために、Ｓａｃ　ＩＩを使用した。この削除は、
１６０個のアミノ酸の枠内での除去をもたらし、該変異
蛋白質は５ｈａｒｐｌｅｓらの番号付は命名を用いてＡ
ｒｇ−５０およびＧｌｙ−２１１の間で融合され、△５
１−２１０　ＴＧＦ−β■と称する。（Ｂ）　Ｃｏ５−
１細胞内でのΔ５１−２１０　ＴＧＦ−βｌの一時的発
現。Ｃｏ５−１細胞を準密的に成育させ、△５１−２１
０　ＴＧＦ−β１　ｃＤＮＡ挿入物を含むＣＤＭ　８に
よりトランスフェクトした。

ｌ・ランスフェクトの条件は、後述する実施例７（１，
７）に記載のものと同様であり、トランスフェクション
から４８時間後に該細胞を血清欠失培地で培養し、４８
時間後に採集した。調節培地を０．１’酢酸に対して透
析し、乾燥させ、ＴＧＦ−β１に対する前駆体−および
成熟−特異的抗ペプチド抗体を用いてイムノブロッティ
ングにより分析した。

第４７図、リソソーム内ｐＨに影響をおよぼすイオノホ
アまたは弱酸は、ＣＩ（Ｏ細胞内におけるＴＧＦβ１分
子の蛋白質分解的処理を阻害した。（Ａ）６記時間の追
跡の後に採集された調節培地の５ＯＳＰＡＧＥ分析。細
胞は、示された濃度において処理された。図の左および
右側のマーカは、第４１図に示したものと同じである。

（Ｂ）分泌されたＴＧＦ−β１分子の蛋白質分解的処理
の定量的評価。これらの実験のために、細胞を２００μ
Ｈのクロロキン、１μｈのモネンシンまたは１０ｍＭの
塩化アンモニウムを用いて処理した。組換え成長因子の
相対量は、フルオログラフの密度測定的走査にて、分泌
された全ＴＧＦ−β１を合せ、かつ組換え成長因子の水
準を標準化することによって計算した。標準化の後に、
存在する成７ｊＨＴ　ｃ　Ｆ−β１の量を、密度測定法
により測定し、蛋白質分解的処理の水準を示した。

各点は、３回の独立した実験を代表し、標準偏差を含ん
でいる。対照細胞からの組換えＴＧＦ−β１の相対的処
理を１．０として扱った。

第４８図、クロロキン、モネンシンおよび塩化アンモニ
ウムにより処理されたＣ１１０細胞から分泌された組換
えＴＧＦ−βｌポリペプチドのグリコシダーセ処理。パ
ルス標識され、塩化アンモニウム（１０ｍＭ）　、クロ
ロキン（２００μＭ）またはモネンシン（１μ旧と共に
培養されたＴＧＦ−β３−２０００クローン１７紹胞由
来の調節培地を、ＥｎｄｏＨ，ノイラミニダーゼ、また
はＮ−グリコシダーゼにより処理した。消化生成物を５
Ｏ５−ＰＡＧＥおよびフルオログラフィにより分析した
。マーカは、第４１図に記載したものと同じである。

第４９図、単球によるＬｎＴＧＦ−β１のガンマインタ
ーフェロン−誘発活性化は用量依存性である。単球（２
ＸＩＯｂ細胞／戚）を、Ｃｏ５ｔｅｒ　９６−ウェルマ
イクロタイタープレートで、５μｇ／ｒｒｄｌの精製潜
在性ｒＴＧＦ−β１　（ＬｎＴＧＦ−ａｌ）と共に、ｒ
　ｒ　ＩＦＮのＩＯから１０００ｔｌ／ｄまでの増大す
る濃度の不在（対照）および存在下で培養した。サイト
力インを、培養ウェルにＬｎＴＧＦ−ａｌと同時に添加
し、上澄を２４時間後に採取し、後述する実施例２　（
１，６）に記載の成長阻害アッセイを用いてＴＧＦ−β
１活性についてアッセイした。

第５０図、ｒｒＦＮ−媒介単球活性化ＴＧＦ−βｌと血
小板−誘導ＴＧＦ−βとの機能的同等性。無血清２４時
間上澄を、１００Ｕ／ｄのｒｙｌＦＮの存在下に培養さ
れた単球から採取し、後述する実施例２　（１，６）に
記載された成長阻害アッセイにおいて既知のＴＧＦ〜β
血小板標準を使用して、３倍連続希釈により試験して貯
留試料に５μｇ／ｍｌのＬｎＴＧＦ−β活性を定量した
。次いで、単球−活性化ＴＧＦ−β　（１，１０，１０
１００ｎのＬｏｇ希釈を、正常ラット腎臓（ＮＲＫ）細
胞における固定源非依存性成長アッセイ（Ｔｗａｒｄｚ
ｉｋｅｔ　ａｌ、、１９８２．５ｃｉｅｎｃｅ　２１６
：８９４−８９７）にて、先に記述されているように（
Ｄａｓ’ｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　１４２：１５３６−１５４１）　、ウシＴＧ
Ｆ−β１に対して作成された中和化モノクローナル抗体
、ＩＤ１１．１６の３０μｇ７ｍｌの存在下で試験を行
なった。２０個の細胞以上のコロニーを、８種の無作為
低能力場（ｌｏｗ　ｐｏｗｅｒ　ｆｉｅｌｄ）中で計数
した。

第５１図、ｙｒＮｐ−誘発、単球活性化ＴＧＦ−β１の
ＳＯ３−ＰＡＧＥ分析。ＴＧＦ−β３〜２０００親細胞
株から誘導された細胞を、３Ｈ−ロイシン（八ｍｅｒｓ
ｈａｍ　Ｌ−Ｃ４，５−３Ｈ）を含む無血清ＤＭＥＭ　
；　４５−７０Ｃｉ　／　ｍＭ、０．５ｍＣ１１ｄ中で
一夜培養した。上澄を採取し、３Ｈ−ロイシン標識Ｌｎ
ＴＧＦ−β１複合体を後述する実施例８（１，１）に記
載のように精製した。単球（ＩＸＩＯ７細胞／成）を、
０．５％ヒト血清を含むＤＭＥＭ中で、１、６　Ｘ　１
１０６ｃｐの３Ｈ−ロイシン標識ＴＧＦ−β１ｐ複合体
と共に、１０００／ｄのｒｙ−ＩＮＦの存在または不在
下で１２時間培養し、上澄を清澄化し、非還元条件下で
５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（１２，５％）により分析した。マ
ーカは、ウシ血清アルブミン、６８ｋｄ　；卵アルブミ
ン、４５ｋｄ　ｉカルボネート・アンヒドラーゼ、３０
ｋｄ　；チトクロームＣ，１４ｋｃｆおよびＴＧＦ−β
、２４ｋｄを含み、銀染色により可視化した（Ｄａｓｃ
ｈ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８９．Ｊ。

ｒｍｍｕｎｏｌ、　１４２：１５３６−１５４１）　、
　３Ｈ−ロイシン標識蛋白質は、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−ｏｍ
ａｔ　ＡＲフィルム上に光源と増感スクリーンを用いて
オートラジオグラフィにより検出された。レーンＡ、単
球とγ−ＩＮＦ。レーンＢ、７−ＩＮＦを含まない単球
。

〔発明の説明〕

本発明は、サル（ｓｉｍｉａｎ）ＴＧＦ−βＩ前駆体遺
伝子コード化配列からｒＴＧＰ−ａｌの生物学的に活性
な、成熟型の生産とその生成物に関する。成熟した、生
物学的に活性なＴＧＦ−β１は、前駆体を正しく処理す
る宿主細胞中にサルＴＧＦ−βｌの全長のヌクレオチド
コード化配列をクローニングし発現させることにより、
真正天然ＴＧＦ−β１と実質上区別できない生物学的活
性を有する成熟ｒＴＧＦ−βｌを製造することができる
。

本発明は又、サルＴＧＦ−β１前駆体遺伝子を用いて製
造できる生物学的に活性なｒＴＧＦ−β１前駆体タンパ
ク質に関する。生物学的に活性なｒＴＧＦβ１前駆体は
、ＴＧＦ−βｌ前駆体を分泌できる適切な宿主細胞中に
サルＴＧＦ−βｌの全長ヌクレオチド化配列をクローニ
ングし、発現させることにより製造できる。

記述上だけであるが、本発明の方法は（ａ）サルＴＧＦ
−β１前駆体型のためのコード化配列の分離又は発生：
（ｂ）サルＴＧＦ−β１コード化配列の発現をめざす発
現ベクターの構築；（Ｃ）成熟した生物学的に活性な型
のＴＧＦ−ａｌ及び／又はＴＧＦ−β１前駆体の製造の
ための、遺伝子を複製及び発現することができ且つ遺伝
子生成物をプロセスできる適切な宿主細胞のトランスフ
ェクション；及び（ｄ）Ｔ　Ｇ　Ｆ−β１前駆体及び成
熟した、生物学的に活性なＴＧＦ−βｌの同定と精製に
区分できる。

高いレベルのＴＧＦ−β１前駆体及び／又は生物体に対
して活性な成ＰＴ　ｃ　Ｆ−βｌを発現するトランスフ
ェクシントが同定されたならば、本発明の実施は、発現
した遺伝子生成物のそのクローンの展開とその分離を伴
なう。

本発明の方法はここでは例示として、サルＴＧＦβｌ前
駆体コード化領域のｃＤＮＡを調製し、クローニングし
、そして配列した。コード化領域を次に、ＳＶ４０発現
制御エレメントの制御下においてＣＨＯ細胞をトランス
フェクションするのに用いた。ＣＨＯトランスフェクタ
ントは、天然ＴＧＦ−β１と区別できない生物学的活性
を持つ戒ＰｒＴＧＦ−β１並びにより大きな生物学的に
活性な前駆体型を製造した。

本発明の方法のさまざまの態様は、以下及びそれに続〈
実施例中で節をわけてより詳しく説明する。

（１）サルＴＧＦ−１コード　　　の　　　はサルＴＧ
Ｆ−βｌについてのヌクレオチドコード化配列を第１図
に示す。本発明の方法の実施では、このヌクレオチド配
列、又はその機能的に均等な物をＴＧＦ−β１生成物の
発現をめざす組換え体分子を生成させるのに用いること
ができる。ヌクレオチドコード化配列の縮退により、第
１図に示したのと同一のアミノ酸配列を実質上エンコー
ドしている他のＤＮＡ配列もＴＧＦ−β１のクローニン
グ用に本発明の実施に用いられる。第１図のヌクレオチ
ド配列のかかる変換には、欠失、異なるヌクレオチド残
基の付加又は変換で同−又は機能的に均等な遺伝子生成
物をエンコードする配列を生ずることが含まれる。遺伝
子生成物は、配列中でのアミノ酸残基の欠失、付加又は
置換を有していても良いが、これは表立たぬ変化しか生
じないものであって、生物体に対して活性な生成物を製
造するものに限定されている。かかるアミノ酸置換は、
関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及
び／又は両親媒性の類似にもとづいて行なうことができ
る。例えば負帯電アミノ酸には、アスパラギン酸とグル
タミン酸が含まれ；正帯電アミノ酸には、リジン及びア
ルギニンが含まれ；帯電していない極性ヘッド基又は非
極性ヘッド基で同一の親水性値を有しているのは：ロイ
シン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；ア
スパラギン、グルタミン：セリン、トレオニン；フェニ
ルアラニン、チロシンを含む。

高いレベルのＴＧＦ−β１様活性をつくり出すサル細胞
源から、ＴＧＦ−βＩ用のヌクレオチドコード化配列を
得ることができる。コード化配列は、かかる細胞源から
分離及び精製されたＲＮＡのｃＤＮＡクローニング又は
ゲノムクローニングにより得られる。どちらか一方のｃ
ＤＮＡ又はクローンのゲノムライブラリーは、発生した
ＤＮＡフラグメントから、制限酵素の使用を含むが限定
されない当業者周知の方法を用いて生成させたＤＮＡフ
ラグメントから製造できる。ＴＧＦ−β１をエンコード
しているフラグメントは、第１図に示した配列の如何な
る部分かに実質上相補性のヌクレオチド・プローブでか
かるライブラリーをスクリーニングすることにより同定
できる。全長クローン、即ちＴＧＦ−βｌ前駆体につい
ての全コード化領域を含んでいるものを発現用に選択で
きる。

本発明の別の態様では、第１図のコード化配列を当業者
周知の化学的方法を用いて、全体又は−部分を台底でき
る。

本明細書記載の実施例では、サルＴＧＦ−β１コード化
配列は、ＴＧＦ−βｌと機能的に関連する成長阻害剤を
高いレベルでつくり出すことが示されている、アフリカ
ミドリザル細胞系、Ｂ５Ｃ−４０から単離したポリアデ
ニル化ＲＮＡから導かれるＴＧＦ−β１前駆体コード化
配列のｃＤＮＡクローニングにより得た。

全コード化領域を配列し、ヒト及びネズミＴＧＦβ１（
第１図参照）の公刊された配列と比較した。

成熟サルＴＧＦ−β１の推測されたアミノ酸配列は、成
熟ヒトＴＧＦ−β１のそれと１００％の相同を示す。

前駆体配列も、ヒト前駆体配列とサル前駆体配列とで５
個のアミノ酸しか違っていない強い配列相同を示す。興
味あることには、サル（及びネズミ）前駆体配列は、ヒ
トＴＧＦ−β１について報告された配列よりも１個のア
ミノ酸残基が少くエンコードされている（第１図、アミ
ノ酸残基番号１５８−１５９参照）。

サル、ゲラ歯動物及びヒトの種の間でのＴＧＦβ１の配
列中での著しい保全は、必要上、重要な機能性を保全す
るために強い進化的圧力が必要であったことを示唆する
。これは、成長調節剤として重要な二面的な機能上の役
割を演するＴＧＦ−β１の成熟型のみならず、これも同
等の成長調節活性を示し得る成熟ＴＧＦ−β１配列の上
流の前駆体のポリペプチド領域についても成り立つ。

Ｂ５Ｃ−４０１１１胞中の主要なＴＧＦ−β１　ｍＲＮ
Ａ種は、２．５ｋｂで、ネズミ及びヒトＴＧＦ−βｌ特
異的メンセージで得られる結果と一致する　（第２図）
、４ｋｂ及び１４．５ｋｂで見られる僅かなバンドは、
異常プロセスの写しか、又はＴＧＦ−β１に床机な相同
を有する近年５ｅｙｅｄｉｎ（１９８７，Ｊ、　Ｂｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：１９４６−１９４９）によ
って報告されたＴＧＦ−β１様分子（ＣＩＦ−Ｂ）用の
コードであろう。

サル、ヒト及びマウスのクローンの推測されたポリペプ
チド配列は、アミノ末端シグナル・ペプチドを構築して
いる８−２１位の１４個の疎水性残基で殆んど同一の同
−限界内の拡がりを含む。さらに、成熟ＴＧＦ−β１の
アミノ末端へと即時に進むＡｒｇ　−Ａｒｇジペプチド
は、類似するタンパク質加水分解部位を示唆する。サル
ＴＧＦ−β１前駆体は、成熟分子には見られない３個の
潜在的Ｎ−グリコシル化部位も含んでいる。従ってＴＧ
Ｆ−β１の成熟及び前駆体ポリペプチドが種の間で保全
されているばかりでなく、後翻訳モデイフィケーション
（修飾）部位でもはっきりと保全されている。

他の細胞系に対比して高いレベルのＴＧＦ−β１を合威
し放出するＢ５Ｃ−４０細胞を、テストに用いた。

ＢＳＣ細胞で調整した培地は、ナノグラムのレベルのＥ
ＧＦ及びＴＧＦ−αの共存下でＮＲＫ細胞の支えに無関
係の成長を促進し、ヒト血小板から精製したＴＧＦ−β
１（Ｐｒｏｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３．　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：３６７６−３６８０　；　Ｒ
ｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３゜Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　２２：５６９２−５６９８）と同一の生
化学的特性を示す活性を示す。更にＢ５Ｃ−１からのＴ
ＧＦβｌに機能的に類似し、ＴＧＦ−β１膜受容体への
結合について血小板から誘導したＴＧＦ−β１と競争す
る成長抑制剤の単離が報告されている（Ｔｕｃｋｅｒｅ
ｔ　ａｌ、、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２６：７０
５−７０７）。Ｂ５Ｃ−１細胞から誘導された細胞系Ｂ
５Ｃ−４０１Ｂ胞で合成された多量のＴＧＦ−β１特異
性ｍＲＮＡは、Ｂ５Ｃ−１で調整された培地中でＴｕｃ
ｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ、により同定された三機能性成長調
節剤が実１ＴＧＦ−β１であることを示唆している。こ
れは他の源からのＴＧＦ−ａｌが、培養中のある種の腫
瘍細胞の成長も卯制するというＴｕｃｋｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、、の観察を支持する最近のデータでも支持される。

（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、＋１９８５．Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２
：１１９−１２３）　、然しＢ５Ｃｌ誘導仰制剤がここ
で記載した遺伝子の生成物であるという公式の証明は、
培養中のＢ５Ｃ−１ｆＩＩｌ胞から放出されるＴＧＦ−
β１様活性の配列分析を必要とする。

ＴＧＦ−β１の生物学的に活性な、成熟型を発現させる
ために、高いレベルの転写と翻訳を与えるだけでなく遺
伝子生成物の正しいプロセシング用の発現ベクター／宿
主系を選ぶべきである。これは発現構成でサルＴＧＦ−
β１前駆体の全コード化配列を用いる時に特に大切であ
り、ＴＧＦ−β１の成熟型が細胞プロセシング現象を経
て前駆体生成物から語意されるとみられるためである。

提案されたプロセシングスキームは第２０図に示されて
いる。更に発現／宿主細胞系は生成物の分泌を与えるよ
うに選ぶのが良い。

特に、サブユニット当り　１１２個のアミノ酸のジスル
フィド結合ホモダイマーの、成熟Ｔ　Ｇｐ−β１はＡｒ
ｇ−Δｒｇア宅ノ酸（第１図の残基番号２７７及び２７
８）での全長の前駆体のタンパク質加水分解的開裂を伴
なう細胞プロセシングで形成されるようにみえる。更に
、サルＴＧＦ−βｌ前駆体は成熟型には検出されない３
個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含み、高いレベルの
組換え体ＴＧＦ−β１を分泌するチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞系からの標識［３Ｈ］グリコサミンの血清の
ない上澄液の分析は成熟型でなく、ＴＧＦ−β１前駆体
がグリコシル化されていることを示している。従って前
駆体の適切なグリコシル化が細胞合成にとって重要であ
って、成熟分子の放出又は分泌にも大切であろう。成熟
型でなく、ＴＧＦ−β１前駆体はリン酸化もされており
、前駆体の機能的重要性が更に示唆される。更にＴＧＦ
−β１の成熟型はサブユニット当り９個のシスティン残
基を伴なうジスルフィド結合ダイマーから成る。それら
のいくつかは鎖内で他方は鏡開でのジスルフィド結合に
関与しており、それらは成熟分子の三次構造と立体配置
に影響し、その結果として生物学的活性に影響する。従
って発現系で使用した宿主細胞のサルＴＧＦ−β１遺伝
子生戒物を正しく発現し且つプロセスする能力は生物学
的に活性な、成熟ＴＧＦ−β１の製造上重要である。

本明細書に示した実施例ではＴＧＦ−β１の成熟した、
生物学的に活性な型が、サルウィルス４０　（ＳＶ４０
）発現制御エレメントを用いて、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＩＩＯ）宿主細胞系中に成功裡に製造された
。然しさまざまの他の動物宿主／発現ベクター系（即ち
適切な宿主細胞中にＴＧＦ−β１コード化配列の複製、
転写及び翻訳を指示するために必要なエレメントを含む
ベクター）は、当業者によって同様に良好に利用されよ
う。これらには、それに限定されるものではないが、ウ
ィルス発現ベクター／哺乳動物の宿主細胞系（例えばサ
イトメガロウィルス、ワタシニアウィルス、アデノウィ
ルス等）；昆虫ウィルス発現ベクター／昆虫細胞系（例
えばバキュロウィルス）；又は哺乳動物細胞のゲノムか
ら誘導された非ウィルス系プロモーター発現系（例えば
マウスのメタロチオネイン・プロモーター）を含む。

これらのベクターの発現エレメントは、強度と特異性が
違っている。使用した宿主／ベクター系次第で、沢山の
適切な転写及び翻訳エレメントのいずれか一つを使用で
きる。例えば哺乳類細胞系のクローニング時に、哺乳類
細胞のゲノムから放出されたプロモーター（例えばマウ
スのメタロチオネイン・プロモーター〉又はそれら細胞
中で成長するウィルスから遊離されたプロモーター（例
えばワタシニアウイルス７．５にプロモーター）を使用
できる。組換えＤＮＡでつくられたか又は合成的方法で
つくられたプロモーターは、挿入された配列の転写を与
えるのに使用できる。

特異性ある開始シグナルはまた挿入されたタンパク質コ
ード化配列の充分な翻訳に必要である。

これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が
含まれる。自分自身の開始コドン及び隣接配列を含んで
いる全ＴＧＦ−β１ｉ！ｉ伝子が適切な発現ベクターに
挿入された時には、更なる翻訳制御シグナルを必要とし
ない。然し、コード化配列の一部分だけが挿入された時
は、ＡＴＧ開拍コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを
与える必要がある。さらに開始コドンは、全挿入物の翻
訳をたしかにする上でＴＣＰ−βｌコード化配列の読取
り枠（ｒｅａｄｉｎｇｆｒａＩＩｌｅ）と位相が合って
いる必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナル及び
開始コドンは、天然及び合成のいずれかでのさまざまな
由来のものであり得る。発現の効率は、転写アテニュエ
ーション配列、エンハンサ−エレメント等ヲ包含するこ
とで増進できる。

ベクター中にＤＮＡフラグメントを挿入するためのこれ
迄に公刊されている方法のどれもが、ＴＧＦβ１遺伝子
及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベク
ターの構築に使用できる。これらの方法には、インビト
ロ組換えＤＮＡ法、合成法及びインビボ組換え（遺伝的
組換え）を含む。

発現ベクターとしてアデノウィルスを用いる時には、Ｔ
ＧＦ−β１コード化配列をアデノウィルス転写／翻訳制
御コンプレックス、例えば後期のプロモーター及び三分
割のリーダー配列、に連結させることが可能である。次
いで、このキメラ遺伝子は、インビトロ又はインビボ組
換えでアデノウィルスのゲノムに挿入できる。ウィルス
のゲノムの非必須領域（例えば領域Ｅ１又はＥ３）への
挿入は、生存能力があり感染した宿主中にＴＧＦ−β１
を発現し得るＭｉ換えウィルスを生しよう。同様にワク
シニア７．５にプロモーターも使用できる。

ＴＧＦ−β１の発現に使用できる他の発現系は、昆虫系
である。かかる系の一つでは、■以旺叶田ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ核多角体ウィルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺
伝子を発現するベクターとして用いられる。ウイルスは
、鎚Ｕヨｔｅｒａ」力１匡旺鼓細胞中で成育する。ＴＧ
Ｆ−β１コード化配列をウィルスの非必須領域（例えば
ポリヘトリン遺伝子）中にクローニングして、ＡｃＮＰ
ジブロモ−ター（例えばポリへドロンプロモーター）の
制御下に置くことができる。

ＴＧＦ−βｌコード化配列の成功した挿入は、ポリヘト
リン遺伝子の不活性化と非閉塞組換えウィルス（即ちポ
リへドロン遺伝子にコード化されているタンパク質被膜
の欠如したウィルス）の生産を生じる。これらの組換え
ウィルスは、次に挿入した遺伝子を発現させる鎚列ヨ〕
ニロヱ１厘吐包細胞のインフェクションに用いる。

更に宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか
又は所望の特異性的古注で遺伝子生成物を修飾し、プロ
セスするものが選ばれよう。あるプロモーターからの発
現はある種のインデューサー（例えばメタロチオネイン
・プロモーターについての亜鉛及びカドミウムイオン）
の存在で高めることができる。従って、遺伝的組換えＴ
ＧＦ−β１の発現は、制御■できる。クローニングした
外来遺伝子のタンパク質生成物が宿主細胞にとって致死
的である時には、これは重要である。更にタンパク質生
成物の修飾（例えばグリコシル化）及びプロセシング（
例えば開裂）は、タンパク質の機能にとって重要である
。異なった宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシン
グ及び修飾について、特徴的且つ特異的機構を有してい
る。外来の発現タンパク質の正しい修飾とプロセシング
を確保するのに適切な細胞系又は宿主系を選べる。

サルＴＧＦ−β１コード化配列を含み且つ、生物学的に
活性な、或塾生戊物を発現する宿主細胞は、少なくとも
次の４方法で同定可能である：（ａ）　ＤＮＡ−ＤＮＡ
　ハイブリッド形成；（ｂ）″マーカー遺伝子機能の有
無；（Ｃ）宿主細胞中のＴＧＦ−β１ｍＲＮ＾転写物（
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）の発現を尺度とする転写レベ
ルの評価；（ｄ）イムノアッセイで測った成熟遺伝子生
成物の検知；及び究極的にはその生物学的活性である。

第１の方法では、発現ベクター中に挿入したサルＴＧＦ
−β１コード化配列が存在することは、実質上第１図に
示したサルＴＧＦ−β１コード化配列と相同のヌクレオ
チド配列、又はタンパク質又はその誘導体から成るプロ
ーブを用いるＤＮＡ　−ＤＮＡハイブリッド形成で検知
できる。

第２の方法では、組換え発現ベクター／宿主系は、ある
種の″マーカー”遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ
活性、抗生物質耐性、メトトレキセート耐性、変換表現
型、バキュロウィルスでの包含体形成等）の有無を基準
として同定及び選択できる。例えばＴＧＦ−β１コード
化配列をベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入すると
、ＴＧＦ−β１コード化配列を含む組換え体がマーカー
遺伝子機能の不存在で同定できる。別の方法では、ＴＧ
Ｆβ１コード化配列の発現制御に使用する同一プロモー
ター又は別のプロモーターの制御下で、マーカー遺伝子
をＴＧＦ〜β１配列と一列に並べることができる。誘導
又は選択に応答したマーカーの発現は、ＴＧＦ−βｌコ
ード化配列の発現を示す。

第３の方法では、ＴＧＦ−β■コード化領領域ついての
転写活性が、ハイブリッド形成アッセイで評価できる。

例えばポリアデニシル化したＲＮＡを分離し、ＴＧＦ−
β１コード化配列又はその特定部分と相同なプローブを
用いるノーサンプロット法で分析できる。別の方法では
宿主細胞の全核酸を抽出し、かかるプローブへのハイブ
リッド形成で検定できる。

第４の方法では、成熟タンパク質生成物を免疫的に、例
えばウェスターンプロット法、免疫検定法例えばラジオ
イムノ沈でん法、エンザイムー結合イムノアッセイ等、
で評価できる。然し発現系の成功の究極の試験は、生物
学的に活性なＴＧＦβ１遺伝子生戒物の検知を伴なう。

宿主細胞が遺伝子生成物を分泌する時は、培養したトラ
ンスフェクタント宿主細胞から得られた細胞のない媒体
をＴＧＦ−β１活性で検定できる。遺伝子生成物が分泌
されない場合は、かかる活性を細胞溶解物で検定できる
。いずれでも生物学的検定例えば以下に記載の成長阻害
検定又はこれも記叙しである目的細胞中での支えに無関
係の成長促進等を使用できる。

高いレベルの生物学的に活性な、成熟ＴＧＦ−β１を産
生するクローンが同定されるや、クローンを拡大して、
周知の方法を用いてＴＧＦ−β１を精製できる。かかる
方法にはイムノアフィニティー精製、高速液体クロマト
グラフィーを含めたクロマトグラフ法等がある。

サルＴＧＦ−βｌ前駆体のアミノ酸配列は、予想された
ヒトの前駆体のものと若干界なる事実にも拘らず、本発
明の方法でつくったサルＴＧＦ−β■の生物学的に活性
な成熟型のアミノ酸配列は、ヒトの記成熟型のそれと同
一である。更に本発明のサルＴＧＦ−β１は、天然ＴＧ
Ｆ−β１と区別できない生物的活性を持つ。これは本発
明の発現／宿主細胞系は、発現生成物のプロセシングが
可能であって、真正の天然ＴＧＦ−β１同一の生物学的
活性を有する分子がつくられることを示している。その
結果、本発明によってつくられたサルＴＧＦ−β１は、
ＴＧＦ−β１が使用できるすべての用途で使用できる。

（４）ＴＧＦ−１’　　　　　　　　　　の　　　のヒ
ト、ゲラ歯動物及びサル源からのＴＧＦ−β１の前駆体
領域の７２ノ部分は、高度の相同を示しており　（Ｄｅ
ｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ
　３１６：７０１７０５　；　Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　
ａｌ、、１９８６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
２６１：４３７７−４３７９　；　５ｈａｒｐｌｅｓ　
ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　ＤＮＡ　６：２３９−２４
４）、重要な生物学的機能が分子のこの部分と結合され
ていてもよいことを示唆する。第８節以下に示すデータ
は、ＴＧＦ−βｌ前駆体のこの部分がグリコシル化及び
リン酸化されていることを示し、特異的機能のためでな
ければこれらの二次修飾を実施して細胞が変化すること
はないと仮定されるので、この主張を裏付ける。これら
の修飾は、前駆体の三量化及び細胞外へのその移動の目
的にとって重要であろう：多分このホスホ−糖タンパク
質は、他の細胞間又は細胞外機能の実施に無関係であろ
う。前駆体のグリコシル化は、細胞外への成熟ＴＧＦ−
β１の移動中におこることを示唆する証１処がある。

（５）　ＴＧＰ−プロセシング１ び　　　゛る 実施例１に記載したＴＧＦ−β■のｃＤＮＡクローニン
グは、分泌物が排出される前にさまざまの後翻訳プロセ
シング現象を分子が受けることを示唆している（Ｄｅｒ
ｙｎｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　
３１６：７０１７０５　；　Ｄｅｒｙｎｃｋ　ｅｔ　ａ
ｌ、、１９８６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２
６１：４３７７−４３７９　；　５ｈａｒｐｌｅｓ　ｅ
ｔ　ａｌ、、１９８７．　ＤＮＡ　６：２３９−２４４
）。タンパク質精製及びアミノ末端配列法がＣＨＯ−Ｔ
ＧＦ−β１−３−２０００細胞（実施例３）で製造、放
出された組換え体ＴＧＦ−β１タンパク質の特性化に用
いられた。

実施例３の（３）及び実施例３の（４）に記載された分
離された前駆体及び戒ｙｔＨＴ　Ｇ　Ｆ−β１ポリペプ
チドのアミノ末端配列分析は、それらのタンパク質加水
分解プロセシング現象についての情報を与える。主要タ
ンパク質配列を生じた還元されたポリアクリルアミドゲ
ルから単離された前駆体ポリペプチドは、サルｃＤＮＡ
　（Ｓｈａｒｐｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７ＤＮＡ
　６：２３９−２４４）からの予測されるものに従って
、ＴＧＦ−β１前駆体のＬｅｕ−３０で始まる。アミノ
末端配列に不均一性が観察されていないことは、タンパ
ク質加水分解プロセシングの特異性を示す。この結果は
、シグナルベプチターゼ開裂部位としてのＧｌｙ−２９
／　Ｌｅｕ−３０ペプチド結合を意味し、Ｖｏｎｌｌｅ
ｉｊｎｅ（Ｖｏｎ　ｔ（ｅｉｊｎｅ、　１９８６＋　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ。

１４　：　４６８３−４６９０）のシグナルペプチド予
測法の結果と一致する。シグナルペプチド開裂以外に、
成熟ＴＧＦ−β１の精製及び試験（実施例３の（２）及
び実施例３の（４））は、ｒＴＧＦ−β１が予測された
２塩基性プロテアーゼ部位（Ｓｈａｒｐｌｅｓ　ｅｔ　
ａｌ、、１９８７．　ＤＮＡ６　：　２３９−２４４）
でタンパク質加水分解的にプロセシングされて成熟ポリ
ペプチドを生しることを示した。

更に成７）３　Ｔ　ｃ　Ｆ−β１のカルボキシル末端Ｃ
ＮＢｒフラグメントのタンパク質配列分析は、完全な（
無傷の）の分子を示唆する。従ってＣｌｌ０細胞は、プ
レブローＴＧＦ−β１　（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＴＧＦ−ａ
ｌ）の正しいプロセシングに必要な適切なプロテアーゼ
を有する。

トランスフェクションされたＣ１１０細胞で分泌された
主要な生物的活性は、成熟したダイマー性或長因子であ
る。実施例３の（２）に示した結果は、ＣＨＯ条件付け
した培地中に存在する活性の９５％以上が戒ＰｒＴＧＦ
−βｌと共に精製され、一方５％以下がより大きなｒＴ
ＧＰ−β１前駆体と共に精製されることを示している。

更に組換えＴＧＦ−ａｌは、ｎＴＧＦ−β１と同一゛の
挙動で、そして同一の特異的生物学的活性を有していた
〈実施例３の（５））。これに反して、ｒＴＧＦ−βｌ
前駆体は、成熟成長因子の１１５０倍の低い活性であっ
た。ミンク肺仰制プロフィルの比較は、僅かに異なる用
量−反応曲線を示し、成熟ＴＧＦ−βＩに比して前駆体
の異なる受容体アフィニティーを示している。

実施例３の（５）に示し、上で述べた結果はｒＴＧＦβ
１前駆体が生物学的に活性であることを示唆しているが
、徹底的な構造分析は、いくつかの興味ある異性複合性
の決定的説明を明らかにしている。

タンパク質配列分析及びＳＯ３−ＰＡＧＥは、単離され
た前駆体がジスルフィド結合で相互結合したプローＴＧ
Ｆ−β１、成熟ＴＧＦ−β１及び前駆体のプロ領域から
成ることを示す。（：ＮＢｒを用いるこのジスルフィド
結合混合物の化学的開裂及びＣＮＢｒペプチドの分離は
、前駆体のＣｙｓ−３３が成熟ＴＧＦ−β１の１個のシ
スティン残基とジスルフィド結合を形成していることを
はっきりと示している　（第２０図Ａ）。

前駆体配列と相互結合したＴＧＦ−β１のモノマー鎮の
存在は、完全な前駆体の生物学的活性について出来る明
確な結論をさまたげている。Ｃ１１０細胞中のこのジス
ルフィド結合コンプレックスの形成は、ＴＧＦ−β１を
自然に分泌する組織及び細胞の重要性についての疑問を
生じさせる。Ｃ１１０１１１胞による極めて高いレベル
のｒＴＧＦ−β１ポリペプチドの分泌は、発現人為構造
を生じる不適切に折重なったｒＴＧＦ−β１による不自
然な交差結合に到達しよう。

別の考えとして、ジスルフィド結合した前駆体コンプレ
ックスは、ＴＧＦ−β１プロセシング中の重要な中間体
を示している可能性がある。しかし、前駆体のＣＹＳ−
３３によって形成されたジスルフィド結合が、天然の生
物活性ＴＧＦ−β１の産生に必要ないことを示す研究は
、その複合体が不必要な中間体である可能性を示唆して
いる　（前記（７）及びＸｊ１例５）。ジスルフィド結
合した前駆体コンプレックスは、ＴＧＦ−ａｌの潜在単
離型中にみられる（Ｍｉｙａｚｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、
１９８８＋　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｕ
ｐｐｌ。

１２Ａ：２００；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、＋
１９８７＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

５ｕｐｐ１．１１Ａ：４６）。

実施例３の（２）〜（５）に示した結果にともづいて、
トランスフェクションされたＣＨＯ細胞中のプレープロ
ーＴＧＦ−βＬのプロセシングが提案される（第２０図
Ｂ）。提案されたプロセシングスキームは完成していな
いが、工程のいくつかは少なくとも部分的に明確化され
ていることを強調したい。

さまざまのプロセシング工程の順序は完全に特徴付けら
れていないが、理解を促すために連続して生起するよう
に示しである。第１の工程はＧｌｙ２９／　Ｌｅｕ−３
０ペプチド結合でのシグナルペプチド開裂を伴なう。こ
の開裂現象は、粗い小胞体膜を前駆体が通過する時に同
時移行的に最も起り易い。

（Ｂｌｏｂｅｌ　ａｎｄ　Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ、　
１９７５＋　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

６７：８３５−８５１　；　Ｗａｌｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、、１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：５−８）。

シグナルペプチドの開裂に続いて、コア・グリコシル化
ユニット　（Ｒｏｔｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９７８
．　Ｃｅ１ｌ　１５：１４４７−１４５４）が、Ａｓｎ
−８２，Ａｓｎ−１３６及びＡｓｎ−１７６（実施例３
の（１）及び実施例４）にある予期されたＮ−グリコシ
ル化部位の各々でプローＴＧＦ−βｌに付加される。コ
アグリコシルされたプローＴＧＦβ１は、次にコジルを
通過する時に逐次的にプロセシングされて、コンプレッ
クス、シアル化オリゴ糖を含有するリン酸化糖タンパク
質を生しる。

合成又は通過のある段階で二塩基性残基でのタンパク質
加水分解開裂とジスルフィド異性化が起こり、成熟ＴＧ
Ｆ−β１を放出する。

実施例７以下に示された結果は、トランスフェクトされ
たＣＨＯ系ＴＧＦ−β３−２０００クローン１７からの
ＴＧＦ−β１の分泌に、適切な炭水化物プロセシングが
必要であることを示している。炭水化物の初期の段階に
影響するグリコシル化阻害剤は、分泌工程の効率を徹底
的に変更した。３個のグリコシル化部位を欠損した欠失
変異的を用いた更なる研究はまた分泌に欠陥を示し、お
そらく細胞のルーチングを欠けており更に多分小胞体に
蓄積する。逆にゴジル内におけるマンノース酵素の存在
を阻害することによる後期の段階のプロセシングに影響
する阻害剤は、ＴＧＦ−β１の分泌の増加をもたらす。

細胞内のルーチングに関与したシグナルは、良く理解さ
れていないが、これらの結果は炭水化物のプロセシング
がＴＧＦ−β１の適切な分泌出口のために必要であり、
初期の段階の改造は、その細胞内のルーチングに最も重
要であることを示唆している。炭水化物自体は、分泌に
直接的な役割を演じてもよく、かくしてオリゴ糖側鎖の
ための特異的レセプターは、分泌工程を通過するタンパ
ク質に役に立つ。代わりに、炭水化物は、ＴＧＦ−β１
運躍のための特異的および必要とされた確認を決定する
ことによって更に間接的役割に作用できる。

タンパク質の分泌をもたらす、制御されたおよび非制御
（本質的な）の２種の経路が有る。制御された経路は、
分泌細胞の種類に目立って見出され、分泌小胞内におけ
る物質を放出するのに外部の刺激を必要とする。ここに
示されたトランスフェクトされたＣ１１０細胞は、多分
非制御型である。

Ｃｌｌ０細胞内における低レベルのタンパクｌｔ加水分
解プロセシングされたＴＧＦ−β■を示している出願人
の結果は、成熟成長因子の未蓄積を示し、放出の非制御
型と矛盾しない。ＴＧＦ−β１は、また制御された経路
によって分泌および放出されうる。このポリペプチド成
長因子は、血小板の主要成分であり、トロンビン処理に
よって血小板から放出される。

ＴＧＦ−β１ポリペプチドは、Ａｌａ−２７９において
開始し成熟ＴＧＦ−β１を放出する４つの塩基性残基の
カルボキシ末端側で開裂される。血管内のｐＨに影響す
る試薬を使用している実施例７以下に示されて研究は、
インシュリンおよびニューロペプチド前駆体のプロセシ
ングとほぼ同等に酸性小胞区画で開裂が生ずることを示
している。これらのプロセシングプロテアーゼの性質は
、−ｍに良く理解されていない。開裂部位での対の塩基
性残基の存在は、効果的なタンパク質分解に必要であろ
う。

最近同定されたすべてのＴＧＦ−β科のメンバーにおい
て、戒７Ｑ　Ｔ　ｃ　ｐ−βポリペプチドのアミノ末端
残基の前にはいくつかの塩基性アミノ酸残基が並んでい
ることに注目することは興味のあることである。

ＴＧＦ−β１ペプチドの三次構造を変更すべきグリコシ
ル比的プロセシングの阻害剤は、タンパク質加水分解プ
ロセシングにほとんどまたは無影響であり、炭水化物プ
ロセシングにかかわらず、この領域が前駆体中に適切に
発現されうることを示唆している。戒９ｆｉ　Ｔ　ｃ　
Ｆ−β科のメンバーのアミノ末端基に先行している多数
の塩基性残基は、特異的なタンパク質加水分解のこの領
域に興味を集中させるであろう。

血狙 後述する実施例４に示される結果は、ＴＧＦ−β１前駆
体中のマンノース−６−リン酸の存在を示し、該前駆体
が独立した機能を有する可能性を生じさせる。実施例６
以下に記述される追加の研究は、該ＴＧＦ−β１前駆体
が、インシュリン様成長因子■／マンノース−６−リン
酸細胞表面受容体に結合することを示している。これら
の研究は、また、結合したＴＧＦ−βｌ前駆体が内在化
している証拠を与える。

リン酸化糖類似体であるマンノース−６−リン酸は、目
的とするりソソーム酵素の運搬および細胞間交換で基本
的役割を演じていると思われる（ｖｏｎ　Ｆｉｇｕｒａ
＋　１９８６．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　５５：１６７１９３）。リソソーム酵素のマンノー
ス−６−リン酸残基を認識する特異的受容体が同定され
ており、輸送系の必須成分である。分泌されたマンノー
ス−６−リン酸を含有するりソソーム・タンパク質が′
Ｍｉ織培養細胞の条件付けられた培地中で同定されてい
る　（Ｇａｌ　ａｎｄ　Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ＋　１９８
６．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１：１７６０−１７６５　；　Ｃａｐ
ｏｎｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８Ｌ　Ｊ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０４：２５３−２６２　　
；　Ｂａｕｍｂａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
　８１：２９８５−２９８９　；Ｓａｈａｇ：ａｎ　＆
　Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ＋　１９８２．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ。

２５７：１１１４５−１１１５０）。然しこれらのタン
パク質のすべては酸加水分解酵素活性を示す。ＴＧＦ−
３１前駆体のマンノース−６−リン酸残基はプローＴＧ
Ｆβ１をリソソームに向けて、タンパク質加水分解処理
して成熟ＴＧＦ−β１を生しるだろう。別の考えではマ
ンノース−６−リン酸残基は分解のために分割したＴＧ
Ｆ−β１前駆体をリソソームに向ける機能をするであろ
う。

カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体はイン
シュリン様成長因子Ｉｆ　（ＩＧＦ−ＩＩ　）受容体と
同一であることが近年報告されている。（Ｍｏｒｇａｎ
ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２９：３
０１−３０７　；　Ｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７＋　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ
ｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１４９：６００６０６；ＭａｃＤ
ｏｎａｌｄ、　１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：１
１３４−１１３７）。

この受容体はＩＧＦ−ＩＩとマンノース−６−リン酸に
別々に結合する部位を持つ２官能性であることが明らか
にされている。ＩＧＦ−ＩＩとマンノース−６リン酸を
含有する蛋白質と結合する単一受容体の生物学的重要性
は不明であるが、この２官能性受容体は受容体に結合し
た蛋白質のシグナルトランスダクション及び／又は目的
化分類に重要な役割を果していよう。プロラクチン関連
グリコタンパク質であるプロリフニリン（ｐｒｏｌｉｆ
ｅｒｉｎ）は、オートクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）成
長調節剤と考えられていて、（Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｎａｔ
ｈｅｎｓ、　１９８７＋　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
１２０：２０８−２１３）、マンノース−６−リン酸を
有し、ＩＧＦ−Ｉ［／マンノースー６−リン酸受容体と
ぴったりと結合することが示されている。（Ｌｅｅ　ａ
ｎｄＮａｔｈｅｎｓ、　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　２６３：３５２１−３５２７）。

ＴＧＦ−β１前駆体がこの２官能性又は他のマンノース
−６一リン酸細胞面受容体と特異的に相互作用すること
ができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）サル変換成長因子−β１をコードしているヌ
   クレオチド配列を含有する真核細胞を、遺伝子発現を調
   節する第２のヌクレオチド配列の制御下で培養して、変
   換成長因子−β１活性を有するペプチド又はタンパク質
   を真核細胞で製造させ；且つ （ｂ）培養物から変換成長因子−β１を回収する、こと
   を特徴とする変換成長因子−β１の製造方法。 ２、サル変換成長因子−β１をコードしているヌクレオ
   チド配列が第１図のヌクレオチド番号１乃至１１７３に
   図示されているものと実質上同一のヌクレオチド配列を
   有している請求項１に記載の方法。 ３、該サル変換成長因子−β１をコードするヌクレオチ
   ド配列が、３３番のアミノ酸残基に対するコドンが“Ａ
   ＧＣ”に変更された第１図中の１から１１７３番のヌク
   レオチドに記述されたものと実質的に同一のヌクレオチ
   ド配列を有している請求項１に記載の方法。４、真核細
   胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞を有して成る請求
   項１に記載の方法。 ５、遺伝子発現を調節する第２のヌクレオチド配列がＳ
   Ｖ４０プロモーターを有する請求項１に記載の方法。 ６、第２のヌクレオチド配列がプロモーターと真核細胞
   が欠失している選択可能なマーカーをコードしている配
   列を有しており、サル変換成長因子−β１をコード化し
   ている配列を含有している真核細胞を同定することが出
   来る請求項１に記載の方法。 ７、選択可能なマーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼか
   ら成る請求項６に記載の方法。 ８、真核細胞をメトトレキセートに曝露して、ジヒドロ
   葉酸レダクターゼ及びサル変換成長因子−β１のコード
   化配列の増幅されたレベルを含有する耐性コロニーを選
   択する工程を更に有する請求項７に記載の方法。 ９、真核細胞がジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイニ
   ーズハムスター卵巣細胞を有して成る請求項８に記載の
   方法。 １０、（ａ）ＡＴＣＣに寄託され且つ寄託番号ＣＲＬ９
   ４３４を付されたトランスフェクタントＣＨＯ−ＴＧＦ
   −β１−３／２０００を培養し；且つ （ｂ）培養物から変換成長因子−β１を回収すること、 を特徴とする変換成長因子−β１の製造方法。 １１、トランスフェクタントをメトトレキセートの存在
   下で培養する請求項１０に記載の方法。 １２、遺伝子発現を調節して真核細胞に活性な変換成長
   因子−β１を製造させる第２のヌクレオチド配列の制御
   下にあるサル変換成長因子−β１をコードしているヌク
   レオチド配列を含有している真核細胞。 １３、サル変換成長因子−β１をコードしているヌクレ
   オチド配列が第１図のヌクレオチド番号１乃至１１７３
   に図示されているものと実質上同一のヌクレオチド配列
   を有している請求項１２に記載の真核細胞。 １４、３３番のアミノ酸残基に対するコドンが、“ＡＧ
   Ｃ”に変更された請求項１２に記載の真核細胞。 １５、チャイニーズハムスター卵巣細胞から成る請求項
   １１に記載の真核細胞。 １６、形質発現を調節する第２のヌクレオチド配列がＳ
   Ｖ４０プロモーターを有する請求項１１に記載の真核細
   胞。 １７、第２のヌクレオチド配列がプロモーターと真核細
   胞が欠失している選択可能なマーカーをコードしている
   配列を有していて、サル変換成長因子−β１をコード化
   している配列を含有している真核細胞を同定させること
   が出来る請求項１２に記載の真核細胞。 １８、選択可能なマーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼ
   から成る請求項１５に記載の真核細胞。 １９、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠失チャイニーズハム
   スター卵巣細胞から成る請求項１６に記載の真核細胞。 ２０、ＡＴＣＣに寄託され且つ寄託番号ＣＲＬ９４３４
   を付されたＣＨＯ−ＴＧＦ−β１−３／２０００から成
   る細胞系。 ２１、第１図に図示したものと実質上同一のアミノ酸配
   列から成る実質上純粋なポリペプチド。 ２２、アミノ酸残基番号１乃至３９０から成る請求項２
   １に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ２３、アミノ酸残基番号３０乃至３９０から成る請求項
   ２１に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ２４、アミノ酸残基番号３０乃至２７８から成る請求項
   ２１に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ２５、グリコシル化されている請求項２１、２２、２３
   、又は２４のいずれか一に記載の実質上純粋なポリペプ
   チド。 ２６、リン酸化されている請求項２１、２２、２３又は
   ２４のいずれか一に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ２７、少なくとも１個のマンノース−６−リン酸を含む
   請求項２６に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ２８、マンノース−６−リン酸がｒＴＧＦ−β１前駆体
   のアスパラギン結合糖鎖に結合している請求項２７に記
   載の実質上純粋なポリペプチド。 ２９、アスパラギン部位がアミノ酸残基番号８２である
   請求項２８に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ３０、アスパラギン部位がアミノ酸残基番号１３６であ
   る請求項２８に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ３１、アスパラギン部位がアミノ酸残基番号１７６であ
   る請求項２８に記載の実質上純粋なポリペプチド。 ３２、３３番のアミノ酸残基がセリンである第１図に実
   質的に示されたアミノ酸配列を含有する実質的に純粋な
   ポリペプチド。 ３３、２２３番のアミノ酸残基がセリンである第１図に
   実質的に示されたアミノ酸配列を含有する実質的に純粋
   なポリペプチド。 ３４、２２５番のアミノ酸残基がセリンである第１図に
   実質的に示されたアミノ酸配列を含有する実質的に純粋
   なポリペプチド。 ３５、２２３および２２５番のアミノ酸残基がセリンで
   ある第１図に実質的に示されたアミノ酸配列を含有する
   実質的に純粋なポリペプチド。 ３６、１から３９０番のアミノ酸残基を含む請求項３２
   、３３、３４または３５に記載の実質的に純粋なポリペ
   プチド。 ３７、３０から３９０番のアミノ酸残基を含む請求項３
   ２、３３、３４または３５に記載の実質的に純粋なポリ
   ペプチド。 ３８、３０から２７８番のアミノ酸残基を含む請求項３
   ２、３３、３４または３５に記載の実質的に純粋なポリ
   ペプチド。 ３９、グリコシル化されている請求項３２、３３、３４
   、３５、３６、３７または３８に記載の実質的に純粋な
   ポリペプチド。 ４０、リン酸化されている請求項３２、３３、３４、３
   ５、３６、３７または３８に記載の実質的に純粋なポリ
   ペプチド。 ４１、少なくとも１個のマンノース−６−リン酸を含む
   請求項４０に記載の実質的に純粋なポリペプチド。 ４２、該マンノース−６−リン酸が、ｒＴＧＦ−β１前
   駆体のアスパラギン結合糖鎖に連結される請求項４１に
   記載の実質的に純粋なポリペプチド。 ４３、該アスパラギン部位が、８２番のアミノ酸残基で
   ある請求項４２に記載の実質的に純粋なポリペプチド。 ４４、該アスパラギン部位が、１３６番のアミノ酸残基
   である請求項４２に記載の実質的に純粋なポリペプチド
   。 ４５、該アスパラギン部位が、１７６番のアミノ酸残基
   である請求項４２に記載の実質的に純粋なポリペプチド
   。 ４６、第１図中のほぼ１から１１７３番のヌクレオチド
   に記述されたものと実質的に同じヌクレオチドコード配
   列を含有する変換成長因子−β１前駆体をコードするヌ
   クレオチド配列。 ４７、第１図中のほぼ１から１１７３番のヌクレオチド
   に記述されたものと実質的に同じであり、３３番アミノ
   酸残基に対するコドンが“ＡＧＣ”に変更されたヌクレ
   オチドコード配列を含有する変換成長因子−β１前駆体
   をコードするヌクレオチド配列。 ４８、第１図中のほぼ１から１１７３番のヌクレオチド
   に記述されたものと実質的に同じであり、２２３番のア
   ミノ酸残基に対するコドンが“ＡＧＣ”に変更されたヌ
   クレオチド配列を含有する変換成長因子−β１前駆体を
   コードするヌクレオチド配列。 ４９、第１図中のほぼ１から１１７３番のヌクレオチド
   に記述されたものと実質的に同じであり、２２５番のア
   ミノ酸残基に対するコドンが“ＴＣＴ”に変更されたヌ
   クレオチド配列を含有する変換成長因子−β１前駆体を
   コードするヌクレオチド配列。 ５０、第１図中のほぼ１から１１７３番のヌクレオチド
   に記述されたものと実質的に同じであり、２２３および
   ２２５番のアミノ酸残基に対するコドンがそれぞれ“Ａ
   ＧＣ”および“ＴＣＴ”に変更されたヌクレオチド配列
   を含有する変換成長因子−β１前駆体をコードするヌク
   レオチド配列。 ５１、変換成長因子−β１を殺腫瘍性有効投与量をもっ
   て投与することを含む￥イン￥・￥ピボ￥における腫瘍
   の治療方法。