CN1044125A - 猴转化生长因子β1的克隆和表达 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了重组转化生长因子-β1(TGF-β1)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中高水平表达。在增加浓度的氨甲蝶呤中逐步选择转染CHO细胞会产生表达放大的TGF-β1核酸顺序的细胞系。由这些细胞分泌的主要蛋白质包括潜伏性TGF-β1和TGF-β1前体多肽，由这些细胞所分泌的重组TCF-β1蛋白质的水平接近于30μg/24小时/10个细胞。本发明还描述了编码指导在转染哺乳细胞中合成和分泌TGF-β1的TGF-β1前体变异体的表达载体。

Description

1.前言

本发明涉及猴转化生长因子β1（rTGF-β1）的克隆、表达和使用。本发明的产品与成熟人类TGF-β1具有相当的生物活性。

2.发明背景

生长调节多肽的转化生长因子（TGF）族是由TGF-α和TGF-β，两个功能和结构上均不相同的分子组成的。TGF-α，还原病毒转化啮齿动物细胞系（De

Larco et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：4001-4005;Twardzik et al.，1982，Science 216：894-897）和一些人类肿瘤细胞系（Todaro et al.，1980，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 77：5258-5262）合成及释放的，与表皮生长因子（EGF）竞争结合在EGF受体上（Todaro et al.，1981，Nature 292：259-262），并且刺激EGF受体的酪氨酸特异性磷酸化作用。成熟的TGF-α是一种间质起源细胞的强的促细胞分裂剂，它由50个氨基酸残基组成，顺序与啮齿动物及人类EGF同源，是从一个159个氨基酸前体上切下来的（Derynck et al.，1984，Cell 38：287-297;Lee et al.，1985，Nature 313：489-491）。

最近，从牛脱矿质的骨头分离出的一个蛋白质被证明是与TGF-β有关的（Seyedin        et        al.，1987，J，Biol.Chem.262：1946-1949）。这种蛋白质也可从猪血小板（Cheifetz        et        al.，1987，Cell        48：409-415，人类前列腺癌细胞系PC-3（Ikeda        et        al.，1987，Biochemistry        26：2406-2410），人类恶性胶质癌细胞系（Wrann        et        al.，1987，EMBO        6：1633-1636）中分离出来。此蛋白的部分氨基酸顺序表明它与TGF-β同源，被命名为TGF-β2。前面所述的人类（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705），鼠（Derynck        et        al.，1986，J.Biol.Chem.261：4377-4379）和猴（Sharples        et        al.，1987，DNA        6：239-244）的TGF-β1已经并在以后被称为TGF-β1。

TGF-β1是个二硫键连接的等二聚体（每链有9个半胱氨酸残基）包含两个相同的亚基（每个亚基有112个氨基酸残基），并且利用一个与TGF-α或TGF中不同的受体（Frolik        et        al.，1984，J.Biol.Chem，260：10995-11000;Tucker        et        al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci        USA        81：6757-6761）。这个强的细胞行为调节子是由各种各样的培养基中的普通细胞及转化细胞合成的（Robert        et        al.，1981，Proc，Natl，Acad，Sci.USA        78：5339-5343）并且已纯化了不同来源的TGF-β1，这些来源包括胎盘（Frolick        et        al.，1983，Proc.Natl，Acad.Sci        USA        80：3676-3680），肾（Roberts        et        al.，1983，Biochemistry        22：5692-5698），尿（Twardzik        et        al.，1985，J.Cell.Biochem.289-297）和血小板（Childs        et        al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci        USA        79：5312-5316）。TGF-β1需要TGF-α和EGF中的一个来促进正常鼠肾（NRK）成纤维细胞的安抗独立生长，但是，对促进鼠指示细胞，AKR-2的安抗独立生长，TGF-α或E        GF的需要不那么严格（Tucker        et        al.，1983，Cancer        Res，43：1581-1586）。从人类血小板中得到的TGF-β1与从非洲绿猴细胞（BSC-1）分离得到的几乎与TGF-β1具有同样的生化性质的功能相关肽，对一些培养细胞有抑制生长作用，而不是促进细胞生长。（Tucker        et        al.，1984，Science        226：705-707）。TGF-β1的双重功能（抑制或促进）和它显示出极为广泛的分布提示它在控制哺乳动物细胞的生长和行为方面具关健作用。

从编码人类（Derhynck        et        al.，1985，Natare        316：701-705）和鼠（Derynck        et        al.1986，J.Biol.Chem.261：4377-4379）起源的TGF-β1前体分子的cDNA推测出的氨基酸顺序，表明两者不仅在成熟TGF-β1顺序区域而且在前体氨基末端区域有很大程度上的同源性。

虽然人类TGF-β1的基因已被确定并测序，大量活性TGF-β1的克隆和表达目前尚未有报道。可能有一系列因素影响活性TGF-β1的表达，其中之一可能是因为该分子三级结构的复杂性。成熟TGF-β1有许多链内和链间的二硫键，它们是在基因产物的表达中通过适当的加工形成的。此外，TGF-β1的成熟形式是前体大分子糖基化后形成的。成熟形式TGF-β1的正确加工、分泌和酶切可能需要前体分子的正确糖基化。因此，一个具有正确编码顺序的基因在一个不合适的表达载体/宿主细胞系统中的克隆和表达可能产生正确的初级结构（即氨基酸顺序），但是错误的二级和三级结构（即折叠和构象），从而得到非活性分子。这样，就阻碍了大量TGF-β1的产生。

3.本发明的概况

本发明涉及大量猴TGF-β1的产生，主要是用含猴TGF-β1编码顺序的由表达调节因子控制的重组DNA载体转染真核细胞而产生的。从非洲绿猴细胞系，BSC-40的cDNA库中获得编码猴TGF-β1前体的cDNA克隆。从成热猴TGF-β1推测出的氨基酸顺序表明它同成为人类TGF-β1具有100%的同源性。人类和猴蛋白质前体区域中的278个氨基酸残基中只有5个不同，顺序具有很强的同源性。猴（和鼠）前体顺序编码的氨基酸比人类少一个。

已构建了含猴TGF-β1整个编码顺序的表达载体，这一顺序被置于SV40表达因子的控制下。它们用来转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）。所提到的CHO转染子产生和分泌与真正TGF-β1具有类似生物活性的成熟rTGF-β1，也产生具生物活性的rTGF-β1前体。

4.附图说明

图1：猴TGF-β1        cDNA的核苷酸顺序和推测的氨基酸顺序。1600        bP的pTGF-β1-2插入子亚克隆进M13mp18和M13mp19克隆载体（Yanisch-Perron        et        al.，1985        Gene        33：103-119），两链均用双脱氧链末端终止法（Sanger        et        al.，1977        Proc.Natl.Acad.Sci        USA        74：5463-5467）测序。所推测的猴TGF-β1氨基酸顺序直接置于cDNA顺序上。人类TGF-β1核苷酸顺序排成一行，并且直接置于猴cDNA顺序下，点表示顺序中的同源核苷酸残基。人和猴蛋白中氨基酸的差异在最上面一行中表示。成熟TGF-β1顺序被用方框划出，信号肽上面则有划线。

图2：用猴TGF-β1 cDNA探针对人类（MCF-7）和猴（B SC-40）细胞的RNA作Northern blot分析。从所述的MCF-7和BSC-40（Purchio et al.，1979，J.Virol 29：763-769）细胞中分离得多聚腺苷化RNA，在1%琼脂糖-甲醛凝胶（12）上分级分离，转移到尼龙膜（Hybond，Amersham）上，与³²P标记的pTGF-β1-2探针杂交。第1道，人类MCF-7 RNA（5μg）;第2道，猴BSC-40 RNA（5μg），28S和18S表示28S和18S核糖体RNA的迁移位置。

图3：扩增表达质粒p        SV2（TGF-β1-dhfr）的构建。构建的细节在下面第七部分中阐述。最终得到的重组质粒包含前后排列的编码整个TGF-β1前体分子的TGF-β1        cDNA和鼠dhfrcDNA。TGF-β1和dhfr        mRNA转录的起始是由SV40早期启动子启动的。与RNA正确加工有关的多聚腺苷化信号和其它顺序由3′SV40顺序提供。括号中的限制性位点在构建扩增表达质粒时丢失。

图4：在MTX选择的不同阶段对CHO细胞中的TGF-β1核苷酸顺序的检测。A图：用Northern blot分析检测TGF-β1 mRNA顺序。含Poly（A⁺）的mRNA（5μg）在1%琼脂-甲醛胶上分级分离，印迹在Hybond N膜上（Amersham），用如材料和方法中所述的同位素标记的TGF-β1 DNA作探针检测。含非转染CHO mRNA的一列曝光48小时以显示2.5kb TGF-β1信使RNA的内源性程度。含TGF-β1-3细胞mRNA的一列曝光5分钟。核糖体标记在右边。B图：在MTX选择的不同阶段对TGF-β1-3CHO细胞转染子的基因组DNA的Southern blot分析。来自TGF-β1-3转染子的高分子量DNA用BamHI或EcoRI酶切，取20μg在1%琼脂糖凝胶上分级分离。将DNA转移到Hybond N（Amersham）膜上，用切口转译的TGF-β1 DNA作探针检测。TGF-β1-3-0细胞曝光30小时，TGF-β1-3-200和2000细胞为10小时。DNA大小标记在图左表示。箭头表示预计同TGF-β1探针杂交的DNA的大小。

图5：重组或天然β1-TGF对CCL-64水貂肺上皮细胞生长抑制作用测定。A图：使用从牛脾中纯化得到的天然TGF-β的生长抑制作用测定。使用8-12微微克的TGF-β1一般可有50%抑制效果。B图：在扩增的不同阶段从TGF-β1-3转染子的融合单层中收集无血清上清液。培养基在0.2M乙酸中充分透析，并如后面7.1.6部分中所述的测定生长抑制效果。所列的结果按1×10⁷细胞/5ml收集液进行标准化。□-□为非扩增TGF-β1-3细胞，●-●在2μM氨甲蝶呤中的TGF-β1-3细胞。○-○在20μM氨甲蝶呤中的TGF-β1-3。

图6：重组TGF-β1的酸激活作用。24小时收集TGF-β1-3/2000细胞无血清上清液。在0.2M乙酸或50m M NH₄HCO₃（pH7.0）中等量透析。作为对照上清液先在50mM NH₄HCO₃中透析，然后在0.2M乙酸中透析。图中显示了经不同处理后的材料剂量-生物活性曲线。△-△，在NH₄HCO₃中透析的上清液，●-●，在0.2M乙酸中透析的上清液。○-○，先用NH₄HCO₃处理后，再在0.2M乙酸中透析的材料。

图7：描述rTGF-β1蛋白质的结构特点及产生位点特异性抗多肽抗血清的多肽区域的线图。用单字符号表示氨基酸：A（丙氨酸），C（半胱氨酸），D（天冬氨酸），E（谷氨酸），F（苯丙氨酸），G（甘氨酸），H（组氨酸），I（异亮氨酸），K（赖氨酸）L（亮氨酸），M（甲硫氨酸），N（天冬酰胺），P（脯氨酸），Q（谷氨酰胺），R（精氨酸），S（丝氨酸），T（苏氨酸），V（缬氨酸），W（色氨酸），Y（酪氨酸）。TGF-β1的重要的功能性区域已被检出：前导顺序，前体顺序和成熟TGF-β1。

图8：用免疫印迹法对在条件培养基中的TGF-β-3细胞中重组TGF-β1的测定。从融合培养细胞中收集无血清上清液，在0.2M乙酸中充分透析。冷冻干燥后，材料溶解于SDS样品缓冲中，以相当于2×10⁵细胞的量在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，通过免疫印迹法测定免疫活性TGF-β1蛋白。抗-TGF-β1_369-381。

在免疫印迹中应用。在肽阻断实验中，在免疫印迹前，先在抗体中加入50μg/ml肽369-381。A图：收集与在0，2，或20μM氨甲蝶呤中的TGF-β1-3上清液中的免疫印迹物质，在还原条件下在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分级分离。选择天然牛脾TGF-β1（100ng）为对照进行比较。B组：在非还原条件下上清液分级分离。包括牛脾TGF-β1（250ng）。

图9：由TGF-β1-3细胞产生的经分泌的重组TGF-β1的免疫印迹，TGF-β1由抗-TGF-β1_81-94和抗TGF-β1_225-236探针检测。收集上清液，如图8所述处理，在梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。（A）在还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离的上清液进行免疫印迹。在最后一图显示了特异性前体和特异性TGF-β1的抗体混合物的免疫印迹试验，表示重组材料的三种不同形式。（B）在非还原条件下在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离的上清液做的免疫印迹试验。在最后一图显示特异性前体和TGF-β1特异性的抗体的混合物。

图10：在TGF-β1-3/0和TGF-β1-3/2000细胞总的分泌蛋白中对成熟和前体形式的rTGF-β1的测定，在60mm组织培养皿中融合生长细胞在缺少甲硫氨酸，半胱氨酸和胎牛血清但包含100μCi/ml³⁵S-甲硫氨酸和³⁵S-半胱氨酸的3ml DMEM中标记。18小时后，收集及澄清无血清标记上清液，在还原7.5-17.5% SDS-聚丙烯酰胶凝胶上分级分离。电泳后，凝胶用En³Hance处理，放射自显影。显示的结果是用3μl标记上清液曝光8小时所得。

图11：对TGF β3-2000细胞分泌的TGF-β1相关蛋白的测定。A）TGF-β1前体的线图，参见讨论的内容 B）如先前所述（Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7：3418-3427）在100培养皿中生长融合的TGF β3-2000细胞。收集无血清上清液（5ml），在0.2M乙酸中透析，冷冻干燥0.5ml样品，用一个抗氨基酸残基369-381和81-94的抗肽抗体库（anti TGF β_369-381和antiTGF β_81-94如（Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7：3418-3427）前所述做免疫印迹：第1道，非还原样品;第2道，还原样品，在左边（第1道）和后边（第2道）的数字是用千道尔顿表示标准分子量的位置。C）在60mm组织培养皿中的TGF-β3-2000细胞生长融合，在缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸但包含100-200μCi/ml[³⁵S]半胱氨酸和[³⁵S]-甲硫氨酸的3ml无血清培养基中脉冲标记15分钟。然后细胞在含甲硫氨酸和半胱氨酸的无血清培养基中追加4小时，在非还原条件下（第1道）如（Laemmli 1970，Nature 227：680-685）前所述将10μl样品在7.5%-15%聚丙烯酰胺-SDS梯度凝胶上分析。第二个皿中的细胞在含200μCi/ml[³H]-氨基葡糖无血清培养基中标记24小时，无细胞上清液在0.2M乙酸中透析48小时。冷冻干燥200微升此材料，在非还原条件下在7.5%-15%聚丙烯酰胺-SDS梯度凝胶上分析。凝胶经荧光X线照相用Cronx-4 X射线胶片（Dupont），曝光后放射自显影。D）基本同C）一样，只是样品置于还原环境下。E）TGF β3-2000在无血清和磷酸盐培养基中用1mCi/ml[³²P]-正磷酸盐标记。无细胞上清液如前所述处理，在还原条件下在15%聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分级分离，凝胶放射自显影。F）通过两轮聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳及在6M Hcl中95℃水解1小时（Cooper et al.，1983，Meth.Enzymol.99：387-402）纯化标记前体。在pH1.9和pH3.5电泳分离消化产物，用放射自显影测定，用茚三酮测定产物内部氨基酸（P-ser，P-tyr，p-tyr）。

图12：用各种糖酵解酶消化来自TGF        β3-2000细胞的无血清上清液。A）TGF        β3-2000细胞生长融合，在无血清培养基中，培养24小时。培养基在0.2M乙酸中透析，冷冻干燥，样品用神经氨糖酸苷酶（0.25单位/ml，第3道），N-多糖酶（20单位/ml，第2道，或糖苷内切酶H（0.2单位/ml，第4道）消化。在还原条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离消化产物，如图11说明所述作免疫印迹分析。第一道包含未处理样品。B）如图11说明所述，用[³⁵S]-甲硫氨酸和[³⁵S]一半胱氨酸标记来自TGF β3-2000细胞的无血清上清液，如上所述用糖苷内切酶H（第2道），神经氨糖酸苷酶（第3道）和N-多糖酶消化。第1道包含未处理样品。在还原条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离消化产物，凝胶放射自显影。N-多糖酶从Genzyme（Boston，Mass）购得，糖苷内切酶H和神经氨糖酸苷酶从Calbiochem（La Jolla，CA）购得，缓冲液条件如生产者所推荐。

图13：TGF-β1特异性转录本的无细胞翻译。A）包含TGF-β1整个编码区域的1350碱基对的Pst I-EcoR片段亚克隆进pSR64（pharmacia），用从Bethesda Research Labs（Baltimore，MD）购得的SP6聚合酶在先前描述过（Pelham and Jackson，1976，Eur.J.Biochem.67：247-251）的离子化条件下转录5μg线性质粒。反应用DNase酶切，用苯酚∶氯仿∶异戊醇（24∶24∶1）抽提二次，乙醇使之沉淀。RNA溶解于50μl水中，取10μl（第2道）在1%琼脂糖一脲-凝胶上如（Purchio et al.，1980，J.Virol.35：629-639）前所述分级分离。第一道包含网织红细胞核糖体RNA标记物。凝胶用溴乙锭染色，在UV光照下照像。B）如上述的RNA在22℃10m M甲基汞处理10分钟，调节到20m M2-巯基乙醇中，取1μg在信使依赖型网织红细胞无细胞翻译系统中（Purchio et al.，1983，J.Virol.48：320-324），用[³⁵S]-甲硫氨酸和在前描述（Sharples et al.，1987，DNA6：239-244）离子条件下，总量为50μl，进行翻译。反应物在10%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中分级分离（Laemmli，1970，Nature227：680-685）;凝胶用荧光X线照相，曝光于Cronex-4X射线胶片上。第1道，不加RNA，第2列，1μg        TGF-β1        RNA。

图14：用硫酸铵沉淀来自TGF-β-3-2000细胞的500ml无血清上清液后，20mg蛋白在Bio-Sil        TSK-250柱（21.5×600mm）上作凝胶渗透色谱法分析。用包含40%（V/V）乙腈的0.1%TFA水溶液，以2ml/min，在22℃平衡柱，收集4ml分部。所述分部的一部分用来分析测定对水貂肺上皮细胞的生长抑制活性（-O-）实线给出在254nm处蛋白质的吸收峰。以下的蛋白用作标记物：α-胰凝乳蛋白酶原（Mr        25，700），牛胰腺核糖酸酶A（Mr        13，700），和胰岛素（Mr        5，700）。

图15：反相HPLC纯化rTGF-β1。从μBondapak C₁₈柱（颗粒10μm，3.9×300mm）上得到来自凝胶渗透色谱法纯化的TGF-β1（图2，B库）的0.65mg蛋白质的洗脱图。洗脱是由一个0.05%TFA水溶液到0.045%TFA溶液含30%乙腈的线性10分钟梯度，和0.045%TFA溶液中含36-60%乙腈的10分钟梯度完成的。柱流出速度控制在0.2ml/min，在22℃进行。所述分部的一部分用来分析测定对水貂肺上皮细胞的生长抑制活性（-O-）。水平的线表示已收集的rTGF-β1。在214mm连续监测紫外线吸收物质（-）;虚线（---）表示乙腈浓度。

图16：纯化rTGF-β1蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析。在非还原（A）或还原（B）条件下用SDS-PAGE分级分离前体和成熟形式的TGF-β1，用考马斯蓝R-250染色。从牛脾中分离nTGF-β1作为对照。在图的左和右用千道尔顿标明标记蛋白。

图17：表明此蛋白的考马斯蓝染色图，此蛋白来自表达TGF-β1的扩增CHO细胞的条件培养基。透析这一条件培养基，在还原条件下在15%        SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，用考马斯蓝R-250染色。作为参考，在图左标明的a，b和c表示rTGF-β1分子。第一道，0.25ml条件培养基，第二道，表示用千道尔顿标明分子量的标记蛋白。

图18：在Bio-Sil        TSK-250柱上（7.5×600mm）rTGF-β1-前体CNBr肽的凝胶渗透色谱法。用溴化氰裂解rTGF-β1-前体的800pmol洗脱图。在22℃，以0.25ml/min，用包含40%乙腈的0.1%TFA水溶液平衡柱。在214mm处测定紫外吸收物质。用M标明的峰表示易受埃德曼降解的CNBr肽，数字是指指定的一个片段或一些片段在整个顺序中由二硫键连结的位置（Sharples        et        al.，1987，DNA6：239-234）。

图19：纯化TGF-β1蛋白对水貂肺指示细胞的生长抑制曲线。生长抑制作用由文中所述评价。通过氨基酸分析确定TGF-β1多肽的浓度。-△-，重组前体蛋白;-●-，从牛脾中得到nTGF-β1;-○-，rTGF-β1。

图20：（A）TGF-β1前体的假设结构，重点表明二硫交叉相连的性质。（B）在转染CHO细胞中pre-pro-TGF-β1加工的总结。蛋白水解加工的位点已显著标明。星号表示糖基化位点。涂黑为信号肽;空心为前区域;画斜线的为成熟TGF-β1。

图21：TGF-β1和TGF-β2对裸鼠中A549人类肺肿瘤生长的作用。雄性裸鼠（Balb/c^-nu⁺/nu⁺）在12周龄时，在近背部颈区域皮下注入含1.3×10⁶人类肺癌细胞（A549）的0.2ml体积磷酸缓冲液。在大约80%动物中20天内形成可触摸的肿瘤（10mm-3×3×1mm）。带肿瘤的动物随机分入不同的笼中。处理的第一天对应于动物形成可测量的肿瘤后进行处理的第一天动物。每组5个动物如所述在邻近肿瘤（肿瘤周围的）皮下注入0.10ml载体。对照组或者注入经高压液相层析纯化的牛血清白蛋白（2μg），或者注入对应于表皮生长因子环状区域（残基11-21）的合成肽（200ng）。先用双脚规在三维空间中测量肿瘤大小，然后按横坐标上标明的日子进行注射。每个点的值表示平均肿瘤体积。如先前所述（Massaque        et        al.，1986，Proc.Nat.Acad.Sci.，83：8206-8210;Sporn        et        al.，1983，Science        219;1329）将从牛骨中得到的TGF-β1和TGF-β2纯化至均一性，在十倍过量牛血清白蛋白中稳定化。在这个特定实验过程中，所给的每个成份的总量为每个动物1.4μg。

图22：TGF-β1对裸鼠中A549人类癌肿块抑制作用与剂量的关系。过程与图21中所述基本一致，除了在处理的第一天，肿瘤的起始大小要大些（在肿瘤细胞接种后第25天）。对照组动物注入BSA，在15天时间中，处理动物组每隔3天接受注射TGF-β1，在肿瘤周围，或者是12.5，或者是50，或者是200ng，共5次。所标的值代表15天时每组动物平均肿瘤体积。

图23：未处理过及用TGF-β1处理过的带A549肺癌裸鼠的照片。照片顶部为第20天的带，用大的皮下肿瘤的对照动物（由图21所述的实验中的鼠真实照片），照片下部代表TGF-β1处理组的动物（同一个实验）。插图（右上角）表示从对照（左边）和处理（右边）动物上切下的肿瘤。（照片上动物中及切下肿瘤大小上的差异反映了照相机距离的不同）。

图24：从模拟的和TGF-β1处理动物上切下的肿瘤的组织学观察。新鲜切下的肿瘤（处理的第20天，图21）在缓冲福尔马林中固定石蜡包埋，切片，用Gamoris's三色染色。从模拟处理动物中来的肿瘤切片，A图（20X），C图（100X）。从TGF-β1处理动物中来的肿瘤切片，B图（20X）。D图（100X）。D图插图，从TGF-β1处理的动物中来的肿瘤切片的血管壁。

图25：来自模拟处理及TGF-β1处理动物的经固定的人类肺部肿瘤切片的染色图。从模拟处理动物中来的肿瘤切片用PAS染色（A图），100X;用Alcian        Blue染色，（C图），100X;从TGF-β1处理动物中来的肿瘤切片用PAS染色，（B图），100X;用Alcian        Blue染色，（D图），100X。

图26：从17号克隆的细胞中释放的TGF-β1前体蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。（A）TGF-β1蛋白线状图，

表示磷酸化的糖基化位点; ，表示非磷酸化的糖基化位点。来自17号克隆细胞的无细胞上清液在无血清培养基中用[³⁵S]-甲硫氨酸和[³⁵S]-半胱氨酸（B），[³H]-氨基葡糖（C），[³H]-甘露糖（D）和[³²P]-磷酸盐（E）标记，样品在7.5%-15%梯度SD S-聚丙烯酰胺凝胶（B和C）上，或在15% SD S-聚丙烯酰胺凝胶（D和E）上处理和分析。

图27：由17号克隆细胞产生的TGF-β1前体蛋白的N-多糖酶酶切。（A）[³⁵S]标记无细胞上清液用N-多糖酶加工和处理，在7.5%-15%梯度SD S-聚丙烯酰胺凝胶上分析：第1道，无酶;第2道，加N-多糖酶。（B）基本同A，除用[³²P]-磷酸盐标记。

图28：TGF-β1前体糖肽的氨基酸顺序。已标明用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶（E）和胰蛋白酶酶切获得的肽。 ，表示磷酸化的糖基化位点;

，表示非磷酸化糖基化位点。数字是指TGF-β1前体整个顺序中特定糖肽的位置。X，未确定残基。

图29：[³²P]标记TGF-β1前体CNBr肽的凝胶渗透色谱法。色谱法在Bio-Sil TSK-250柱（7.5×600mm）上进行，用CNBr裂解的650pmol S-吡啶乙醇盐TGF-β1前体和165，000cpm S-吡啶乙醇盐[³²P]-TGF-β1前体的洗脱图。对标出的部分进行[³²P]放射活性测定（-O-）。实线给出在214nm处蛋白吸收值。以下的蛋白用作标记;α-乳球蛋白（Mr        18，400），细胞色素C（Mr        12，300），和胰岛素（Mr        5，700）。用M表示的峰指CNBr肽，数字指在TGF-β1前体整个顺序中这个特定片段的位置（Sharples        et        al.，1987，DNA        6：239-244）。

图30：CNBr肽M（39-113）的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶肽的反相高性能液相色谱法。色谱法在RP-300柱（2.1×30mm）上进行。金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化的含12，500cpm[³²P]-M（39-113）的370pmol M（39-113）的洗脱图。在35℃，以100μl/min的流出速率，用2小时在0.1%的三氟乙酸水溶液到含0.08%三氟乙酸的60%乙腈溶液的线性梯度下完成多肽的洗脱。测215mm处紫外吸收物质（-）。用L S6000液相闪烁计数器（Beckman）测定[³²P]放射性（-O-）。用E标明的峰值指易受埃德曼降解的V蛋白酶肽。

图31：CNBr肽M（134-253）的金黄色葡萄球菌V8蛋白酶肽和胰蛋白酶肽的反相高性能液相色谱法。色谱法在RP-300柱（2.1×30mm）上进行。（A）经金黄色葡萄球菌V8蛋白酶消化的含44，000cpm[³²P]-M（134-253）的400pmol M（134-253）的洗脱图。（B）来自含3，100cpm[³²P]-E（170-194）的库A（图31A）的胰蛋白酶肽的洗脱图。色谱法条件同图30说明的一致。用E标明的峰表明V8蛋白酶肽，用T标明的峰指易受埃德曼降解的胰蛋白酶肽。

图32：甘露糖-6-磷酸盐的鉴定。（A）[³²P]标记的TGF-β1前体蛋白在酸中水解2小时。水解产物与非放射活性磷酸氨基酸和甘露糖-6-磷酸盐混合，在pH1.9，垂直方向pH为3.5，进行电泳分离。图上表示了一个放射自显影图。样品点在右下角（箭头）。甘露糖-6-磷酸盐（M6 P），磷酸丝氨酸（P S），磷酸苏氨酸（P T），磷酸酪氨酸（P Y）和无机磷酸盐均被指明。经测定，[³²P]与甘露糖-6-磷酸盐共同迁移，并且在磷酸寡糖的位置（小箭头）。（B）（B）E（76-91）和（C）E（134-139）经1小时水解的产物作类似的分析。（D）[³²P]标记TGF-β1前体蛋白水解，在pH8.9用电泳分离，接着作色谱分析。

图33A：纯化的溴化氰肽（134-153）的SD        S-聚丙烯酰胺凝胶分析。M（134-253）在（1）非还原或（2）还原条件下在15%        SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，用考马斯亮蓝R-250染色，分子量标记以千道尔顿表示。

图33B：pre-pro-TGF-β1的线性图。pro TGF-β1，前体的前区域，及成熟TGF-β1，依次用线段a.b.c表示。cys（C）残基在前区域中已被指明，显示了包含N连结糖基化的位点（ ）和非磷酸化位点（ ）的甘露糖-6-磷酸盐。

图33C：TGF-β1前体类变体。上标表示SE        R取代氨基酸的位置。粗线表示未配对核苷酸，新的SE        R密码子下面划线。

图33D，E：由转染CO S细胞分泌的TGF-β1突变体蛋白的免疫印迹。收集无血清上清液，在0.2M乙酸中透析，在7.5-17.5% SD S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，在还原（D）或非还原（E）条件下用免疫印迹法分析。印迹用抗前区域（抗TGF-β1_81-94）和抗成熟（抗TGF-β1_369-381）特定抗肽抗体的混合物作探针进行检测，CO S细胞只用载体（πH3M）（第2道），或用编码TGF-β1（第3道），TGF-β1^S33（第4道），TGF-β1^S223（第5道），TGF-β1^S225（第6道），和TGF-β1^S223/225（第7道）的载体进行转染。第1道含从非转染CO S细胞得到的上清液。分子量标准用千道尔顿表示。

图33F，G：对TGF-β1突变体前体和成熟蛋白S223/225的鉴定。收集用πH3M（第2道），pTGF-β1（第3道），pTGF-β1^S33（第4道），pTGF-β1^S223（第5道），pTGF-β1^S225（第6道）或pTGF-β1^S223/225（第7道）转染CHO细胞的上清液，如在图33D，E中所述的进行处理。用对（F）抗成熟顺序（抗TGF-β1_369-381）或（G）抗前区域（抗TGF-β1_81-94）特定的抗体在非还原条件下做免疫印迹。第1道包非转染CHO细胞上清液。分子量标准用千道尔顿表示。

图34：¹²⁵I标记的TGF-β1前体与纯化甘露糖-6-磷酸盐受体的结合。纯化的人类甘露糖-6-磷酸盐/IGF-Ⅱ受体（Roth et al.，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun，149：600-606）被包被抗此受体的抗体的微滴定板吸收。在已知未标记竞争结合物浓度下，加入¹²⁵I标记TGF-β1前体（100，000cpm每井），4℃3小时后，洗涤井，切下并计数。到出的结果为差别少于10%的重复井的平均数，并且是三个试验的代表。在无竞争物的井中（抑制作用为0），5.2%标记配体结合上去。TGF，TGF-β1前体;M1 P，甘露糖1-磷酸盐;M6 P，甘露糖6-磷酸盐。

图35：胰岛素引起IGF-Ⅱ和重组TGF-β1前体与鼠脂肪细胞的结合的增加。同胰岛素预处理或没有处理的鼠脂肪细胞与重组¹²⁵I-TGF-β1前体（4.9×10⁴cpm）或¹²⁵I-IGF-Ⅱ（4.2×10⁴cpm）一起孵育。为估计非特异性结合，采用100nMIGF-Ⅱ或3mM man6 P。结果为三次重复测定的平均数。

图36：IGF-Ⅱ和重组TGF-β1前体同CHO细胞结合，及CHO细胞超表达人类IGF-Ⅱ/man6 P受体（CHO-IGF-ⅡR）。细胞与¹²⁵I-IGF-Ⅱ（8.0×10cpm）或重组¹²⁵I-TGF-β1前体（1.3×10⁵cpm）一起孵育，如所标明的，加入5mM man6 P或100 nM IGF-Ⅱ来估计非特异性结合。结果为三次重复测定的平均数。

图37：重组TGF-β1前体与CHO细胞超表达人类TGF-Ⅱ/man6 P受体结合的专一性。细胞同重组¹²⁵I-TGF-β1前体（6.7×10⁴cpm）及指明浓度的竞争性未标记配体一起孵育。结果为三次重复测定的平均值。

图38：重组TGF-β1前体的内在化。超表达TGF-Ⅱ/man 6P受体的CHO细胞在37℃在有或无5mM man6 P存在时与重组¹²⁵I-TGF-β1前体（5×10⁴cpm）一起孵育。在指定时间，测定全部或与抗酸（即内在化的）细胞有关的数字。结果为三次重复测定的平均值。

图39：血小板TGF-β1前体与分离的IGF-Ⅱ/man6 P受体的结合。纯化的IGF-Ⅱ/man6 P受体吸附在微量滴定板中，在指明浓度的从血小板得到的纯化潜伏性TGF-β1（□）或者重组TGF-β1（■）存在下与¹²⁵I标记的重组TGF-β1前体一起孵育。在4℃3小时后，测定受体结合放射活性量。

图40：IGF-Ⅱ/man6        P受体与重组TGF-β1前体而不是血小板TGF-β1结合：Western        blot分析，重组子（R）（0.5μg）和血小板（P）TGF-β1前体（2.5μg）在还原SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到硝酸纤维素滤纸上，与对前体中一段顺序特异的（左）抗肽抗体或与IGF-Ⅱ/man6        P受体和受体的抗体（右）反应。用与抗兔Ig结合的碱性磷酸酶测定结合的兔抗体。用组织化学法染色碱性磷酸酶。分子量标记物（以千道尔顿为单位）的位置用箭头表明。重组的未经酶切前体（a），重组前体残余（b）和血小板前体（c）的位置也已标明。

图41：从经衣霉素（TU）处理的CHO细胞和未经处理的CHO细胞中得到的，具免疫活性的TGF-β1的鉴定。细胞在完全培养基中生长融合，用2.5μg/ml        TU在0.1%（V/V）二甲亚砜最终浓度中处理4小时。然后加含TU的无血清培养基，在24小时后收集。对照细胞只用0.1%（V/V）二甲亚砜处理。对分泌蛋白，培养基在0.1M乙酸中透析，干燥，然后免疫印迹法分析。免疫印迹中心标的a，b和c表示TGF-β1的三种形式。这个免疫印迹表示2×10⁵细胞分泌到1ml培养基中的蛋白。对于与细胞有关的TGF-β1形式，收集5×10⁵细胞并作免疫印迹分析。所用的抗体为前体和成熟特异性抗肽抗体的混合物（第7.1.8部分，以下）。

图42：转染CHO细胞系TGF-β3-2000克隆17分泌TGF-β1的时间。（A）在不同时间从脉冲标记CHO细胞中收集的条件培养基的SD        S-PAGE电泳图。细胞用[35-C]-半胱氨酸和[35-S]-甲硫氨酸脉冲标记0.5小时。在还原条件下，培养基在7.5-20%梯度SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离。标记蛋白（KDal）列在图右侧。（B）在不同追加时间对CHO细胞分泌的TGF-β1的定量。因为在分泌中成熟TGF-β1与TGF-β1前体量的比率是不变的，分泌的重组生长因子的相对水平可通过对可在荧光X线照相中观察到的12KDal        TGF-β1的光密度扫描来测量。每个点代表三次重复实验的平均数，且包括标准差。在20小时成熟TGF-β1分泌的相对量定为1.0。

图43：糖基化的抑制物对CHO细胞分泌TGF-β1的作用。（A）融合培养细胞在缺乏血清，甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中培养1小时，然后是用[³⁵S]-半胱氨酸和[³⁵S]-甲硫氨酸脉冲标记0.5小时。抑制剂的使用浓度如下;0.23mM SW，0.52mM CA，4m M dN，4mM dMM，和6μM TU。经过6小时追加，条件培养基在SD S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离及荧光X线照相。标记物与图41中所述的一致。（B）经抑制剂处理的CHO细胞分泌重组生长因子的定量。生长因子的相对量由荧光X线照相光密度扫描测定。结果得自3个独立的实验并表明了标准差。对照CHO细胞中的成熟TGF-β1相对量被定为1.0。

图44：经抑制剂处理的细胞分泌的TGF-β1蛋白用糖基化修饰酶进行消化。转染CHO细胞用[35-S]-甲硫氨酸和[35-S]-半胱氧酸标记，来自转染细胞的条件培养基，经6小时追加后被收集，用内切酶H，神经氨糖酸苷酶或N-多糖酶消化。消化产物在还原7.5-20%梯度聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，荧光X线照相。在荧光照相左侧和右侧标明的标记物与图41中所描述的相同。

图45：来自经糖基化抑制剂处理的CHO细胞的TGF-β1前体的磷酸化作用。用[32-P]-正磷酸标记TGF-β3-2000克隆17CHO细胞的融合培养物，如在12.1部分中所述进行处理收集标记的培养基，用一个Sephadex        G-25脱盐柱去除多余的[32-P]-正磷酸，用还原SD        S-PAGE分级分离32-P-标记的蛋白，并进行放射自显影，标记蛋白（KDal）标在放射自显影图的右侧，左侧的“a”和“b”表达TGF-β1前体多肽。

图46：缺少三个糖基化信号的缺失突变体不能由细胞中分泌。（A）缺少糖基化信号顺序的TGF-β1缺失突变体及它插入到瞬时表达质粒CDM8的构建图。用SacⅡ去除编码TGF-β1三个糖基化顺序的DNA。这个缺少导致框架中160个氨基酸的去除，突变体蛋白在Arg-50和Gly-211间连结，用Sharples        et        al.的定位法标数，以后被称作△51-210        TGF-β1。（B）△51-210        TGF-β1在CO        S-1细胞中的瞬时表达。CO        S-1细胞长成半融合，然后用含有△51-210        TGF-β1        cDNA插入子的CDM8转染。转染条件以下12.1.7中所述。转染48小时后，细胞在无血清的培养基中培养，48小时后收集。条件培养基在0.1M乙酸中透析，干燥，用对TGF-β1前体和成熟TGF-β1特异性的抗肽抗体免疫印迹分析。

图47：影响溶酶体内pH的离子载体或弱碱基，抑制CHO细胞内TGF-β1分子的蛋白水解。（A）在6小时追加后收集的条件培养基，SD        S-PAGE分析，细胞在标明的浓度下处理。图右和左的标记同图41中的相同。（B）分泌出的TGF-β1分子蛋白水解加工的定量。在实验中，细胞用200        μM氯喹，1μM莫能菌素或10μM氯化铵处理。通过计算分泌的TGF-β1总量及校正重组生长因子水平，通过荧光X线照相的光密度扫描计算出重组生长因子的相对量。在校正后，通过光密度计测定成熟TGF-β1的量，这表明了蛋白水解加工的水平。每一点代表三个独立的实验，并已含标准差。对照细胞重组TGF-β1的相对加工水平被定为1.0。

图48：用氯喹，莫能菌素和氯化铵处理CHO细胞，用糖苷酶处理CHO细胞分泌的重组TGF-β1肽。来自TGF-β3-2000克隆17细胞的条件培养基脉冲标记，与10m        M氯化铵，200μM氯喹或1μM莫能菌素一起孵育，用糖苷内切酸H，神经氨糖酸苷酶或N-糖苷酶处理。消化产物做SD        S-PAGE和荧光X线照相进行分析。标记物如图41所述。

图49：通过单核细胞的Ln TGF-β1₇干扰素诱导激活与剂量有关。单核细胞（2×10⁶细胞/ml）在Costar 96-井微量滴定板上与5μg/ml纯化的潜在rTGF-β1（Ln TGF-β1），在没有（对照）或有从10-1000U/ml递增浓度的 r_rINF存在下一起培养。培养井中在加入Ln TGF-β1的同时加入细胞素，24小时后收集上清液，用如第7.1.6部分中所述生长抑制试验测定TGF-β1活性。

图50：γINF介导的单核细胞激活的TGF-β1与来自血小板的TGF-β功能上的一致性。从存在100 U/ml r_γTGF的单核细胞培养物中收集无血清的24小时上清液，在所收集的样品中测定5 μg/ml n TGF-β的活性，所用方法为以后第7.1.6部分中所述的生长抑制测试方法，采用已知的TGF-β血小板标准，通过测定三个重复系列的稀释液。在30 μg/ml如过去所述抗牛TGF-β1中性单克隆抗体ID 11.16（Dasch et al.，1989 J.I mmunol.142：1536-1541）存在或不存在下，用普通鼠肾（NRK）细胞安抗独立生长测试方法（Twardzik et al.，1982，Science 216：894-897测定单核细胞激活的TGF-β稀释液对数值（1，10，100ng）。在8个随机低倍镜视野计数大于20个细胞的菌落。

图51：γTNF诱导的，单核细胞激活的TGF-β1的SD S-PAGE分析。来自亲代TGF-β3-2000细胞系的细胞在含³H亮氨酸，45-70Ci/m M，0.5m Ci/ml的无血清DMEM中培养过夜。收集上清液，如以下第13.1.1部分所述纯化³H亮氨酸标记的Ln TGF-β1复合物。在100 U/ml r_γINF存在或不存在下，单核细胞（1×10⁷细胞/ml）在含有0.5%人体血清的DMEM中和1.6×10⁶cpm³H亮氨酸标记的TGF-β1 P复合物共同孵育12小时，澄清上清液，在非还原条件下用SD S-PAGE（12.5%）进行分析。标记物包含牛血清白蛋白，68kd;卵白蛋白，45kd;碳酸酐酶，30kd;细胞色素C，14kd和TGF-β，24kd，用银染色法使之显色（Dasch et al.，1989，J，I mmunol，142：1536-1541）。使用带增感屏的曝光匣在KodakX-omat AR胶片上进行放射自显影，测试³H亮氨酸标记蛋白。A道，单核细胞加γ（gamma）TGF;B道无_r-INF的单核细胞。

5.本发明的说明

本发明涉及从猴TGF-β1前体基因编码顺序中产生有生物活性的成熟rTGF-β1以及生产的产物。成熟的具生物活性的TGF-β1可通过在宿主细胞中克隆和表达猴TGF-β1全长核苷酸编码顺序而生产，该宿主细胞能正确加工前体分子，因而可以得到一个成熟的r        TGF-β1与真正天然TGF-β1实质上具有相同的生物活性。

本发明还涉及可用猴TGF-β1前体基因生产的具生物活性的rTGF-β1前体蛋白。具生物活性的rTGF-β1前体可通过在一个能够分泌TGF-β1前体的适当的宿主中克隆和表达猴TGF-β1全长核苷酸编码顺序而得到。

本发明的方法，仅为了便于说明，可分成几个步骤：（a）分离或产生编码猴TGF-β1前体形式的顺序;（b）构建表达载体，它将指导猴TGF-β1编码顺序的表达;（c）转染可复制和表达基因及加工基因产物合适的宿主细胞，以生产成熟的具生物活性的TGF-β1和/或TGF-β1前体。（d）鉴定和纯化TGF-β1前体和成熟的具生物活性的TGF-β1。

当一个转染子被鉴定可表达高水平TGF-β1前体和/或具生物活性的成熟TGF-β1时，本发明实施还包括克隆的扩增和表达基因产物的分离。

本发明方法，通过以下实施例得到证实，其中包括猴TGF-β1前体编码区cDNA的制备、克隆和测序。编码区域置于SV40表达控制因子的控制下，用来转染CHO细胞。CHO转染子可产生同天然TGF-β1很难区分的具生物活性的成熟TGF-β1，也产生更大的生物活性前体分子。

本发明方法的各方面在以下几个部分和实施例中更详尽地描述。

5.1猴TGF-β1编码顺序的分离和生产

图1中描述了猴TGF-β1的核苷酸编码顺序。本发明方法实施中，此核苷酸顺序，或其功能上同当物可被用来生产指导TGF-β1产物表达的重组分子。由于核苷酸编码顺序的简并，其它可编码与图1中描述的相同的氨基酸顺序的DNA顺序，可在本发明实施中用于克隆TGF-β1。图1中核苷酸顺序的这些改动包括缺失、增加或不同核苷酸残基的置换，结果可得到编码相同或功能上同当的基因产物的顺序。这个基因产物可能包含在顺序中有氨基酸残基的缺失，增加或置换，但无表型变化，因此产生一个生物活性产品。这些氨基酸置换可能是基于残基极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性分子性质相似而形成的。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;非电荷极性头部基因或非极性头部基因氨基酸具相似的亲水值，包含有亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸;甘氨酸，丙氨酸;天冬酰胺，谷氨酰胺;丝氨酸，苏氨酸;苯丙氨酸，酪氨酸。

编码TGF-β1的核苷酸顺序可从产生高的类TGF-β1活性的猴细胞获得。编码顺序可从克隆从细胞中分离和纯化的RNA的cDNA克隆或从基因组克隆得到。cDNA或克隆的基因组库可以从产生的DNA片段制备，用在本技术领域中已知的技术，包含但不局限于使用限制性酶。编码TGF-β1的片段可以通过用核苷酸探针筛选识别，这个探针同图1中描述的顺序中任何部分有大量互补。可选择全长克隆，即包含编码TGF-β1前体的整个编码区域的克隆用来表达。

在本发明的另一个实施例中，用本技术领域众所周知的化学方法，可全部或部分合成图1的编码顺序。

在以下描述的例子中，可通过TGF-β1前体的cDNA克隆得到猴TGF-β1编码顺序，该前体编码从非洲绿猴细胞株B        SC-40分离的多聚腺苷化RNA，B        SC-40能产生高水平生长抑制剂，功能上同TGF-β1有关。对整个编码区域测序，并且与已公布的人类与鼠TGF-β1顺序（见图1）比较，所推得的成熟猴TGF-β1氨基酸顺序证明与成熟人类TGF-β1具100%的同源性。人类与猴的前体顺序也证明有强烈的顺序同源性，只有5个氨基酸不同。有趣的是，猴（和鼠）前体顺序比已报道的人类TGF-β1顺序少一个氨基酸残基（见图1，氨基酸残基数目158-159）。

猴、鼠和人类之间TGF-β1顺序的高度保守性提示需要强大的进化压力来保留重要的功能。这不仅应用于成熟形式的TGF-β1，它作为生长调节因子有重要的双重功能，也应用于成熟TGF-β1顺序上游的前体多肽区域，它可能也显示同样的生长调节活性。

在B        SC-40细胞中主要的TGF-β1        mRNA为2.5kb，与编码鼠和人类TGF-β1特定区信息的结果一致（图2）。在4kb和1.45kb处可见的小带可能代表经异常加工的转录本，或者可能是编码最近由Seyedin描述的类TGF-β1分子（CIF-B）的（1987，J.Biol，Chem.262：1946-1949）。这种分子与TGF-β1具强烈的同源性。

推测的猴、人类和鼠克隆的多肽顺序克隆包含在8-21位几乎一致的邻近伸展的14个疏水残基，它可能构成氨基端信号肽。另外，一个Arg-Arg二肽紧接在成熟TGF-β1氨基端前面，提示有相似蛋白水解切点。猴TGF-β1前体还包含在成熟分子中没有的三个潜在的N-糖基化位点。因此，不仅在种中保留了TGF-β1成熟和前体多肽的初级结构，还有独特的翻译后修饰位点。

B        SC-40合成及释放高水平的与我们测试的其它细胞系有关的TGF-β1。培养B        SC细胞的培养基有一个活性，在毫微克水平的EGF和TGF-α存在下，可刺激NRK细胞的安抗独立生长，并且显示与从人类血小板纯化而来的TGF-β1一致的生化性质（Frolik        et        al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA        80：3676-3680;Roberts        et        al.，1983，Biochemistry        22：5692-5698）。另外，从B        SC-1细胞分离出与TGF-β1功能上相似的生长抑制剂，此抑制剂与来自血小板的TGF-β1竞争结合TGF-β1膜受体。（Tucker        et        al.，1984，Science        226：705-707）。由来自B        SC-1细胞的细胞系，B        SC-40细胞合成的大量TGF-β1特异性mRNA表明由Tucker等人在B        SC-1条件培养基中鉴定出的双重功能生长调节因子确实是TGF-β1。这一结论也得到最近数据的支持，这些数据证实Tucker等观察到的其它来源的TGF-β1也抑制一些培养中的肿瘤细胞的生长（Roberts        et        al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci        USA        82：119-123）。但是，证明来自B        SC-1抑制剂确实是这儿所描述的基因的产物还需要对由培养中的B        SC-1细胞释放的TGF-β1类似活性作顺序分析。

5.2含TGF-β1编码顺序的表达载体的构建

为了表达有生物活性的成熟形式的TGF-β1，需选择表达载体/宿主系统，它不仅能提供高水平的转录和翻译，而且能对基因产物进行正确加工。在表达构建物中使用猴TGF-β1前体的整个编码顺序尤其重要，因为成熟形式TGF-β1看来是前体产物经过细胞加工而来。假设的加工方案在图20中显示。另外，还要选择能使产物分泌的表达/宿主细胞系统。

尤其是，看来成熟TGF-β1是由二硫相连接的等二聚体，每个亚基有112个氨基酸，通过细胞加工形成，加工包括在Arg-Arg氨基酸（图1中残基位数277和278）处对全长前体进行蛋白水解酶切。另外，在猴TGF-β1前体含有在成熟形中没有的三个潜在N-糖基化位点，对来自中国仓鼠卵巢细胞系（该细胞系可分泌高水平重组TGF-β1）的[³H]氨基葡糖标记无血清上清液的分析表明，TGF-β1前体，而不是成熟形式，是糖基化的。因此，前体分子的正确糖基化对细胞合成及释放或分泌成熟分子是重要的。TGF-β1前体（而不是成熟形式）的磷酸化，进一步说明前体的功能重要性。而且，成熟形式TGF-β1是由二硫键相连的二聚体组成，每个亚基含有9个半胱氨酸残基。其中一些在链间，其它的是链内二硫键，影响成熟分子的三级结构和构型，因而影响它的生长活性。因此，在表达系统中所用的宿主细胞能正确表达和加工猴TGF-β1基因产物的能力对生产具生物活性的成熟的TGF-β1是重要的。

在此中描写的例子中，在中国仓鼠卵巢（CHO）宿主细胞系统中用猴病毒40（SV40）表达控制因子成功地生产了成熟的、具生物活性的TGF-β1。但是，各种各样其它动物宿主/表达载体系统（即含有在一个合适的宿主细胞中，指导复制，转录和翻译TGF-β1编码顺序所必需的一些因子的载体）同样可在本技术领域应用。这些载体包括，但不局限于，病毒表达载体/哺乳类宿主细胞系统（即：细胞巨化病毒，牛痘病毒，腺病毒等等），昆虫病毒表达载体/昆虫细胞系统（即杆状病毒），或从哺乳类细胞基因组来的非病毒启动子表达系统（即鼠金属硫堇启动子）。

这些载体的表达因子在强度和特异性上不同。根据所用的宿主/载体系统，可用一系列合适的转录和翻译因子中的任何一个。例如，当在哺乳类细胞系统中克隆时，可用从哺乳类细胞基因组中分离出的启动子（例如，鼠金属硫堇启动子），或用在这些细胞中生长的病毒中分离出的启动子（例如，牛痘病毒7.5k启动子）。通过重组DNA或合成技术生产的启动子也可用来转录插入顺序。

插入蛋白编码顺序的充分翻译也需要特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码和邻近的顺序。如果在适当的表达载体中已插入整个TGF-β1基因，包括它自己的起始密码子和邻近顺序，就不再需要另外的翻译控制信号。但是，如果仅插入部分编码顺序，则必须提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。而且，起始密码必须与TGF-β1编码顺序的阅读框架同相，以保证整个插入子的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以来自各种来源，天然的和合成的。表达效率可以通过加入转录衰减顺序，增强子等来得到提高。

过去所述的将DNA片段插入一个载体中的任何方法都可用来构建包含TGF-β1基因和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法可能包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组技术（基因重组）。

如果一个腺病毒被用作表达载体，TGF-β1编码顺序就可与一个腺病毒转录/翻译控制复合物，如晚期启动子和三重前导顺序连结。这个嵌合基因然后可通过体外或体内重组技术插入腺病毒基因组。插入到病毒基因组的非重要区域（例如，E1或E3区），就可使重组病毒存活并在感染宿主中表达TGF-β1。同样地，也可使用牛痘7.5k启动子。

另一个可用来表达TGF-β1的表达系统为昆虫系统。在一个这样的系统中，Autographa        californice核多角体病病毒（A        cNP        V）被用作表达外源基因的载体。这病毒在Spodoptera        frugiperda、（灰翅夜蛾）细胞中生长。TGF-β1编码顺序可以克隆入病毒的非重要区域（例如多面体基因），并且置于A        cN        P        V启动子（例如多面体启动子）的控制下。TGF-β1编码顺序的成功插入将引起多面体基因的失活，并且产生非闭合重组病毒（即缺乏由多面体基因编码的蛋白质外壳的病毒）。然后用这些重组病毒感染已表达插入基团的Spodopera        frugiperda（灰翅夜蛾）细胞。

另外，可选择这样的宿主细胞株，它能调节插入顺序的表达，或以所需的特定的方式修饰及加工基因产物。在特定的诱导物存在下，可以提高特定启动子下表达，（如锌和镉离子对金属硫堇启动子）。因此，可控制基因工程得的TGF-β1的表达。如果克隆的外源基因蛋白产物对宿主细胞是致命的，则这点很重要。而且，蛋白产物的修饰（如糖基化）和加工（如切割）对蛋白的功能是重要的。不同宿主细胞对翻译后的蛋白质加工和修饰有特异和特征性机制。可选择合适的细胞系或宿主系统以确保外源蛋白表达后的正确修饰和加工。

5.3表达TGF-β1基因产物的转染子或转化子的鉴别

含有猴TGF-β1编码顺序，并表达有生物活性的成熟产物的宿主细胞可由至少四个普通方法鉴别：（a）DNA-DNA杂交;（b）“标记物”基因功能的有在与否;（c）通过测定TGF-β1        mRNA转录本在宿主细胞中的表达来评估转录水平;（d）通过免疫测定及最后通过生物活性测定来检测成熟基因产物。

在第一个方法中，通过DNA-DNA杂交，用含有与猴TGF-β1编码顺序（如图1所示）基本同源的核苷酸顺序，或部分顺序或其衍生物的探针，来检测插入在表达载体中的猴TGF-β1编码顺序。

在第二个方法中，重组表达载体/宿主系统可依据特定的“标记物”基因功能的存在与否来鉴别和选择（例如胸苷激酶的活性，对抗生素的抗性，对氨甲蝶呤的抗性，转化表型，杆状病毒的闭合体形成等等）。例如，如果TGF-β1编码顺序插入载体的标记物基因区域，就可通过标记物基因功能的缺失来鉴别含有TGF-β1编码顺序的重组子。还可以在控制TGF-β1编码顺序表达的相同或不同启动子的控制下，将一标记物基因与TGF-β1顺序前后排列。对诱导或选择作出反应的标记物的表达表示TGF-β1编码顺序的表达。

在第三个方法中，可通过杂交测试评估TGF-β1编码顺序的转录活性。例如，用一个与TGF-β1编码顺序或其特定部分同源的探针做Nothern        blot来分离和分析多腺苷化RNA。还可以提取宿主细胞的整个核苷酸与这些探针杂交而分析。

在第四个方法中，可用免疫学方法评估成熟蛋白产物的表达，例如用Western        blot，免疫测定（如放射免疫沉淀，酶联免疫测定等等）。然而，表达系统成功性的最终测试包括检测具生物活性TGF-β1基因产物。在宿主细胞分泌基因产物的地方，收集培养转染宿主细胞的无细胞培养基，检测TGF-β1活性。在没有分泌基因产物的地方，可用细胞溶胞产物测定这一活性。在任何一种情况下，生物学测试例如这儿所述的生长抑制测试，或这儿所述的在靶细胞中安抗独立生长的激活作用的测试等均可使用。

一旦一个生产高水平的生物活性的成熟的TGF-β1的克隆被鉴别，它可以被扩增，可用本技术领域熟知的技术纯化TGF-β1。这些方法包括免疫亲和纯化，包括高性能液相色谱的色谱方法，等等。

尽管猴TGF-β1前体的氨基酸顺序与预计的人类前体的有点儿不同，依照本发明生产的具生物活性的成熟形式猴TGF-β1的氨基酸顺序与人类成熟形式的一致。另外，本发明的生产猴TGF-β1具有同天然TGF-β1不能区分的生物活性。这表明本发明的表达/宿主细胞系统能够加工表达产物，因而能产生具有与真正天然TGF-β1相同生物活性的分子。因此，根据本发明生产的猴TGF-β1可在使用TGF-β1的所在方面应用。

5.4TGF-β1基因产物的最初定性

来自人类、鼠和猴的TGF-β1前体区域的氨基部分表现了高程度的同源性（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705;Derynck        et        al.，1986，J，Biol.Chem.261：4377-4379;Sharples        et        al.，1987，DNA6：239-244），表明分子的这部分可能与重要的生物功能有关。在以下第8部分表示的数据，证明TGF-β1前体的这个部分是糖基化和磷酸化的，这些数据支持了这个论点，因为人们可能推测，如果不是因为这特定的功能，细胞不会化代价完成这些二级修饰。这些修饰对前体的二聚化或对指导它在细胞外的运动是重要的：也许这个磷酸-糖蛋白可自由地完成其它细胞内或细胞外功能。有证据表明在成熟TGF-β1运输出细胞时涉及前体的糖基化。

5.5TGF-β1前体：细胞加工，结构性质和可能功能

在以下第6部分所述的TGF-β1        cDNA克隆，表明分子在分泌出去以前经历种种翻译后的加工（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705，Derynck        et        al.，1986，J.Biol.Chem.261：4377-4379;Sharples        et        al.，1987，DNA        6：239-244）。用蛋白纯化和氨基端测序技术对由CHO-TGF-β1-3-2000细胞生产和释放的重组TGF-β1蛋白作定性分析（以下第8部分）。

以下第8.3和8.4部分描述的对分离的前体及成熟TGF-β1多肽的氨基端顺序分析，为蛋白水解加工提供了资料。从还原聚丙烯酰胺凝胶分离的前体多肽产生一个主要蛋白顺序，根据对猴cDNA的预测（Sharples        et        al.，1987，DNA        6：239-244），这一顺序在TGF-β1前体的Leu-30处开始。在氨基端顺序中没观察到不均一性，这表明了蛋白水解加工中的特异性。这一结果表明Gly-29/Leu-30肽键为信号肽酶切位点，这一结果与Von        Heijne的信号肽预测方法所预测的一致（VonHeijne，1986，NucleicAcid，Res，14：4683-4690）。除信号肽酶切外，成熟TGF-β1的纯化和观察（以下8.2和8.4部分）显示r        TGF-β1在预测的二元蛋白酶位点经蛋白水解加工（Sharples        et        al.，1987，DNA        6：239-244），而产生成熟多肽。另外，成熟TGF-β1的CNBr片段的羧基端蛋白顺序分析表明这是一个完整分子。因此，CHO细胞拥有正确加工pre-pro-TGF-β1所必需的合适蛋白酶。

由转染CHO细胞分泌的主要生物活性成份为成熟的两聚体生长因子。在以下第8.2部分显示的结果表明CHO条件培养基与成熟TGF-β1一起纯化显示出大于95%活性，而与更大的r        TGF-β1前体一起纯化活性少于5%。另外，重组TGF-β1与n        TGF-β1表现一致，拥有相同的特异性生物活性（以下8.5部分）。r        TGF-β1前体，与成熟生长因子相比，其活性低50倍。对水貂肺抑制作用方面的比较显示一个稍有变化的剂量-反应曲线，提示与成熟TGF-β1相比对前体的受体亲和性不同。

虽然在以下第8.5部分出的结果及以上所进行的讨论表明r        TGF-β1前体是具生物活性的，对其进行深入的结构分析显示了一些令人感兴趣的异常使对其的说明复杂化。蛋白顺序分析和SD        S-PAGE揭示分离的前体由通过二硫键相连的前体pro-TGF-β1，成熟TGF-β1和前体前区域组成。用CNBr化学裂解此由二硫键相连混合物并分离CNBr肽，显示前体的CYS-33与成熟TGF-β1的一个半胱氨酸残基形成一个二硫键（图20A）。与前体顺序相连的TGF-β1单体链的存在限制了人们得出关于完整前体生物活性的任何明确结论。在CHO细胞内这个二硫连接的复合物的形成提出一个问题，即在天然分泌TGF-β1的组织和细胞中它起的作用。CHO细胞高水平分泌rTGF-β1多肽可能导致非天然的交叉连接，因为不正确折叠的rTGF-β1，可引起表达赝品。另一个方面，二硫连接的前体复合物可能在TGF-β1加工中代表一个重要的中间物。但是，研究表明由前体CYS-33形成的二硫连接对表达成熟的具生物活性的TGF-β1不是必需的，提示这些复合物可能不是必需的中间体（以下5.7和10部分）。两硫相连的前体复合物可在潜伏分离形式的TGF-β1中观察到（Miyazono        et        al.，1988，J.Cell        Biochem.Suppl.12        A：200;Wakefieldet        al.，1987，J.Biol.Chem，Suppl.11A：46）。

根据以下第8.2-8.5部分中所列的结果，提出了在转染的CHO细胞中pre-pro-TGF-β1的加工（图20B）。虽然提出的加工方案是不完善的，但它强调了几个至少已部分确定的步骤。虽然还没完全确定各种加工步骤的顺序，但把它们描绘成依次发生的以使之容易理解。第一步涉及在Gly-29/Leu-30肽键处切去信号肽。这一切除很可能在前体传送通过粗面内质网膜时与翻译协同发生的（Blobel        and        Dobberstein，1975，J.Cell.Biol.67：835-851;Walter        et        al，1984，Cell        38：5-8）。在信号肽切除后，核心糖基化单体在位于Asn-82，Asn-136和Asn17（8.1和9部分）的每个预测N-糖基化位点处加到pro-TGF-β1上。核心糖基化pro-TGF-β1随后在传送通过高尔基体时加工，产生一个磷酸化糖蛋白，含有复合物，唾液酸化的低聚糖。在合成或传送的某些阶段，在二元残基处出现蛋白水解酶切，并出现二硫异构化，释放成熟TGF-β1。

在第12部分及以后所述的结果表明合适的糖类处理对从转染CHO系TGF-β3-2000克隆17分泌TGF-β1多肽是必需的。影响早期糖加工的糖基化抑制剂可强烈地改变分泌过程的效率。对缺失三个糖基化位点的TGF-β1缺失突变体的进一步研究也显示了分泌中的缺陷，而且极可能在细胞内传送有缺陷，有可能在内质网上积聚。相反地，通过抑制高尔基体内甘露糖酶的存在而影响后阶段加工的抑制剂，可导致TGF-β1分泌的增加。虽然对涉及细胞内传送的信号通知得还不多，这些结果提示糖加工对TGF-β1适当的分泌通道是必需的，而且加工的早期阶段对细胞内传送是最关键的。糖本身在分泌中可能直接起作用，低聚糖侧链的特异受体可能帮助指导蛋白的分泌。也可能，通过对TGF-β1传输的特异的及需要的确定，糖可能起更为间接的作用。

蛋白分泌有两类的通道，调节的及非调节的（组成型的）。调节通道主要存在于分泌细胞型中，需要外来刺激以释放分泌囊内的物质。这儿描述的转染CHO细胞极可能是非调节型。申请人所得到的结果，即在CHO细胞内有低水平蛋白水解加工的TGF-β1，显示无成熟生长因子的积累，这与释放的非调节型是一致的。TGF-β1也可由调节通道来分泌和释放。这个多肽生长因子是血小板的主要组成部分，是通过凝血酶处理从血小板中释放。

TGF-β1前肽在四个碱基残基羧基端酶切，在Ala-279开始的释放成熟TGF-β1。在第12部分及以后所述的使用影响囊内pH的试剂的研究证实，酶切在酸性囊室内发生，与胰岛素和神经肽前体的加工一致。这些加工蛋白酶的性质普通还没有搞清楚。在酶切位点处的碱性残基对的存在，可能是有效蛋白水解所必需的。有趣的是所有最近被鉴定的TGF-β族成员中，成熟TGF-β多肽的氨基端残基前是几个碱性氨基酸残基。可改变TGF-β1肽三级结构的糖基化加工的抑制剂对蛋白水解加工没有或只有一点儿作用，表明这个区域在前体中可能是充分暴露的，不管糖加工如何。成熟TGF-β族成员的氨基端基团前的多种碱基残基可能是为了加强这个区域的特异蛋白水解。

5.6TGF-β1前体与类胰岛素生长因子-Ⅱ/甘露糖6-磷酸盐受体的相互作用。

在以下第9部分描述的结果，显示在TGF-β1前体中存在甘露糖-6-磷酸盐，并且提出了前体拥有独立功能的可能性。在第11部分及以后的继续研究证实TGF-β1前体与类胰岛素生长因子Ⅱ/甘露糖-6-磷酸盐细胞表面受体结合。这些研究也提出被结合的TGF-β1前体是内在化的证据。

甘露糖-6-磷酸盐，磷酸化糖类似物，看来在目标的传输及溶酶体酶的细胞内交换中起根本作用（von        Figura，1986，Ann.Rev，Biochem.55：167-193）。识别溶酶体酶的甘露糖-6-磷酸盐残基的特异性受体已被鉴别，并且是传输系统中重要组成部分。在组织培养细胞的条件培养基中已鉴定出包含甘露糖-6-磷酸盐的被分泌的溶酶体的蛋白（Gal        and        Gottesman，1986，J.Biol.Chem        261：1760-1765;Capony        et        al.，1981.J.Cell.Biol        104：253-262;Baumbach        et        al.，1984        Proc.Natl.Acad        Sci.USA        81：2985-2989;Sahagian        and        Gottesman，1982，J.Biol.Chem        257：11145-11150）。所有这些蛋白质，显示酸水解酶活性。TGF-β1前体的甘露糖-6-磷酸盐残基可能引导pro-TGF-β1到溶酶体去进行蛋白水解加工以产生成熟TGF-β1。或者是，甘露糖-6-磷酸盐残基可能起作用引导已酶切的TGF-β1前体到溶酶体内去降解。

最近有报导阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸盐受体与类胰岛素生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）受体一致（Morgan        et        al.，1987，Nature        329：301-307;Roth        et        al.，1987，Biochem，Biophys，Res.Comm.149：600-606;Mac        Donald，1988，Science239：1134-1137）。这个受体表现有双重功能，包含公开的IGF-Ⅱ和甘露糖-6-磷酸盐的结合位点。虽然与IGF-Ⅱ和包含甘露糖-6-磷酸盐的蛋白质结合的单个受体的生物学意义还不清楚，这个双重功能受体可能在信号传送和/或在对受体结合蛋白作有目标地分类中起重要作用。多育曲菌素，一种与催乳素有关糖蛋白，被认为是自动分泌生长调节子（Lee        and        Nathens，1987，Endocrinology        120：208-213，显示包含甘露糖-6-磷酸盐，及与IGF-Ⅱ甘露糖-6-磷酸盐受体紧密地结合（Lee        and        Nathens，1988，J.Biol.Chem，263：3521-3527）。TGF-β1前体可能与这个双重功能受体或其它甘露糖-6-磷酸盐细胞表面受体特异性地作用。

申请人已确定重组TGF-β1前体能与位于细胞质膜上的IGF-Ⅱ/man6        P受体结合，这是根据体外实验的结果得到的，如在第11部分及以后所述。证明：（1）胰岛素诱导IGF-Ⅱ/man        6P受体移位到细胞膜上促进rTGF-β1前体与鼠脂肪细胞的结合。（2）rTGF-β1前体与超表达IGF-Ⅱ/man        6        P受体的CHO细胞的结合大于与亲代CHO细胞的结合;和（3）rTGF-β1前体与鼠脂肪细胞和CHO细胞结合被甘露糖-6-磷酸盐特异性抑制。

甘露糖-6-磷酸盐在浓度为10μm时，半完全抑制rTGF-β1与超表达IGFⅡ/man        6P受体的CHO细胞结合（转染的CHO细胞），这个浓度值接近以前发现的（8μm）半完全抑制与游离受体结合的浓度（第9.2部分，在前）另外，甘露糖-1-磷酸盐在抑制结合上的效果比man        6        P差，这结果与已知IGF-Ⅱ/man6        P受体对此两糖的特异性一致（Von        Figuro        and        Hasilik，1986，Ann，Rev.Biochem.55：167-193）。

申请人根据以下11.2.1.部分中所述结果，相信rTGF-β1前体与转染CHO细胞上的IGF-Ⅱ/man        6P受体结合后迅速内在化。在37℃与转染CHO细胞上IGF-Ⅱ/man6        P受体结合后，对细胞进行酸洗，rTGF-β1前体迅速变得对酸洗无反应。例如，在37℃10分钟后，大于75%特异性结合放射性配体对酸洗产生抗性，提示在这段时间中大部分结合r        TGF-β1前体内在化（Haigler，1980，J.Biol.Chem.255：1239-1241）。在37℃孵育更长时间后，观察到细胞吸收放射性材料进一步增加，因为甘露糖-6-磷酸盐不阻断附加吸收，它可能是由于吸收了降解TGF-β1前体的分解产物。

进行了进一步的研究以确定从血小板分离的潜伏TGF-β复合物是否也可与IGF-Ⅱ/man        6P受体结合。在以下11.2.2部分给出的这些实验的结果表明，从血小板来的TGF-β1复合物与rTGF-β1前体强烈竞争结合受体，提示潜伏TGF-β复合物也含有甘露糖-6-磷酸盐。试图用电泳及转移到硝化纤维上测定IGF-Ⅱ/man        6P受体与来自血小板的TGF-β1前体残余物的结合，但没有成功，这可能是因为在血小板TGF-β1前体上，man        6P残基数比rTGF-β1前体上的少。这种解释与观察到的血小板和重组TGF-β1前体间与rTGF-β1前体竞争结合游离man        6P受体的能力上的差异一致：在这个方面来自血小板的前体的能力大约为rTGF-β1的三分之一。另一个可能是，在获取来自血小板的TGF-β1前体的冗长纯化步骤中，一些磷酸被磷酸酯酶去除了。

关于血小板TGF-β1前体的最近的研究表明，它的糖结构在保持此复合物在非活性状态下是重要的（Miyazono        and        Heldin，1989，Nature，in        press），发现用内切糖苷酶或唾液酸酶（sialidase）消化能激活潜在血小板TGF-β1复合物。而且，发现此复合物与man        6P和唾液酸，不是其它糖一起孵育能激活潜在的TGF-β1，支持了糖有维持血小板TGF-β1前体在潜伏状态的作用。在第11.2部分及以后所描述的结果表明，在TGF-β1前体上的man        6P通过与ⅠGF-Ⅱ/man        6P受体的作用引导这个分子到达细胞。这个相互作用可能通过其内在化和输送到内吞室，导致TGF-β1前体的激活或降解。

5.7        TGF-β1的生物活性

本发明的成熟TGF-β1产物在体内和体外是肿瘤细胞生长的有效抑制剂。测量TGF-β1对水貂肺上皮细胞的抗增殖作用的实验证实，本发明的重组TGF-β1（r        TGF-β1）和天然TGF-β1（η        TGF-β1）具相同的特异性活性（以下8.5部分）。另外，n        TGF-β1和η        TGF-β1的剂量反应曲线实质上不能区分。

以下第8.6部分中的结果证明，天然TGF-β1及本发明的rTGF-β1都在体内抑制肿瘤生长。用TGF-β处理人类肺肿瘤后观察到肿瘤停滞，这一现象伴随一个更加类似分化的表型的诱导。粘液分泌细胞，在模拟处理的分化差的肿瘤中占少部分，在TGF-β处理肿瘤中占主导地位。与正常组织中杯状细胞分泌作用一致（Robbins        and        Angell，1971，Basic        Pathology，W.B.Sander        G.，Philidelphia，PA），这样，一种更为分化的状态，就是在用TGF-β处理肿瘤中发现的类似粘蛋白和透明质酸产物的表达增强。无数其它组织学指标也提示TGF-β1介导的分化表型的诱导作用，包括围绕管壁的柱上皮细胞组织的形成，及细胞外基质即胶原蛋白沉积的增加。

rTGF-β1对无胸腺裸鼠中人类肺部腺癌生长和分化的有效抑制作用，提供了进一步的证据，即本发明的rTGF-β1可能用于发展新的，也许细胞毒性小的癌症治疗方案。

5.8生产成熟TGF-β1的改进方法。

在本发明的特定实施例中，通过去除图1中33位的半胱氨酸（CYS-33），用丝氨酸代换之来修饰TGF-β1前体。修饰是通过在DNA水平上用定点突变完成的。用编码经修饰前体基因的质粒转染CO        S细胞，它最后比表达未修饰前体基因的CHO细胞分泌的成熟TGF-β1多三至五倍。人们认为，这种修饰阻止某些由二硫键相连的前体复合物的形成，因此允许分泌更多的成熟TGF-β1。初步分析表明用此方法生产的成熟TGF-β1是经正确加工的，并且在生物学上与天然TGF-β1相同。

在TGF-β1前体另外两个半胱氨酸（CYS-223和CYS-225）上的修饰，也导致分泌成熟TGF-β1，但不引起更高水平的分泌。在以下的第10部分给出了经修饰的TGF-β1基因的构建和表达细节。

虽然位于TGF-β1前体的前（pro）区域的三个半胱氨酸对生产成熟r        TGF-β1不是很重要的，它们的重要性可能在TGF-β1的调节。在这点上，前体的二聚化看来对成熟TGF-β1的蛋白水解酶切是不需要的，但可能在潜伏性形式上需要它。

用编码pre-pro-TGF-β1^S223/225的质粒转染的细胞释放活性形式的TGF-β1（以下第10.2.4部分）。最近，潜伏的TGF-β1已从人类血小板中纯化出来，为高分子量复合物，其中TGF-β1前体的二聚前（pro）部分同一未知蛋白质以二硫键相连，且与成熟TGF-β1非共价相连（Miyazono et al.，1988，J.Biol.Chem.263：6407-6415;Wakefield et al.，1988，J.Biol.Chem.263：7646-7654）。在CHO细胞表达系统中，无证据表明有其它蛋白质参与和前体和成熟型TGF-β1一起形成复合物。在CO S细胞系统中也是如此，因为由CO S细胞生产的r TGF-β1前体和成熟型用免疫印迹看上去同CHO细胞生产的如果不是一致的话也是相似的。

申请人的实验结果表明成熟r TGF-β1与前体前（pro）区域非共价结合，若前（pro）区域不能形成二聚体，则没有潜伏性。虽然这很可能归因于非共价联系的破坏，申请人不能排除此可能性，即成熟TGF-β1非共价与单体的TGF-β1^S223/225前（pro）区域结合（形成非潜伏性的复合物，因为其活性所需的成熟顺序已充分暴露）。

最近的研究（Migazono        et        al.，1988，J.Biol.Chem.263：6407-6415）表明在前（pro）区域的糖结构参与与TGF-β1非共价结合以形成潜伏性复合物。也许，前（pro）区域的二聚体化为这种作用提供了合适的框架和稳定性。关于TGF-β1体内调控还知道得很少。因力大多数细胞类型释放潜伏性TGF-β1（Lawren-ce        et        al.，1984，J，Cell.Physiol.121：184-188;Pitcher        et        al.，1986，Biochem.Biophys，Res.Commun，136：30-37;Wakefield        et        al.，1987        J.Cell.Biol（105：965-975），潜伏复合物的激活看来是很重要的调控步骤。对于此潜伏性的本质的更清楚了解将有助于确定激活的生理机制。

重组TGF-β1的高水平表达和分泌可能导致非天然交叉连接，使位于成熟多肽上半胱氨酸残基和Cys-33二硫键连接成为表达系统赝品。或者，Cys-33可能通过与其它蛋白质相互作用而起调控作用。从血小板分离出来的二硫键连接的复合物，尤有这种可能。

由此，位于前体前（pro）部分的三个半胱氨酸可能以二个方式影响TGF-β1的成熟和激活。CYS-223和CYS-225可能使前体形成二聚体，并随后以非共价方式与成熟TGF-β1作用形成潜伏性复合物，而CYS-33可能通过与成熟TGF-β1和/或其它蛋白形成二硫键而起作用，从而调节TGF-β1的作用。

6.实施例：TGF-β1前体的c        DNA克隆

以下实施例描述从非洲绿猴细胞系（B        SC40，B        SC-1细胞的一个亚系）来的TGF-β1前体编码顺序的c        DNA克隆，它在前面已显示生产功能上与TGF-β1有关的高水平生长抑制剂。发现猴前体及预测的人类和鼠TGF-β1基因产物间有极强烈的顺序同源性。

6.1材料和方法

用以下步骤克隆编码TGF-β1前体的c        DNA。

6.1.1.细胞生长和RNA提取

B        SC-40细胞生长在含10%胎牛血清的Dublbecco′s改良Eagle培养基中。MCF-7细胞生长在含6单位/ml胰岛素的同样培养基中。用如前所描述的寡聚[dT]-纤维素色谱法从细胞中分离多聚腺苷RNA（Purchio        et        al.，1979，J.Virol.29：763-769）。

6.1.2        cDNA库的构建和筛选

双链cDNA从所述的B SC-40 poly A RNA中合成（Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning：A Laborat-ory Manual，Cold Sping Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，371-372），用E co R I甲基化酶处理后，与包含E co R I限制酶识别位点的寡聚核苷酸接头（EcoRI接头）连接。c DNA用EcoRI酶切在Sephacryl S-1000用色谱法分级分离。收集大于750碱基对（bP）的cDNA接入用EcoRI酶切过的λgt10（Davis et al.，1980，A manual for genetic Engineering;Advanced Bacterial Genetics;Cold Spring Har bur Laboratory，Cold Spring Harbour，NY），包装并在Ecoli C₆₀₀rk^-mk⁺hfl上（Grosveld et al.，1981，Gene 13：227-237）平板生长。用与成熟TGF-β1分子6-17密码子互补的[³²P]标记寡聚核苷酸探针[5′-CACGCAGCAGTTCTTCTC        GTGGAGCTGAAGCAATA-3′]杂交，以空斑杂交（Bentonet        et        al.，1977，Science        196：180-182）筛选基因库（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705）。在第三次筛选后分离得几个c        DNA克隆，亚克隆进pBR322。一个含1600bp插入子的克隆（pTGF-β1-2）亚克隆进M13mp        18和M13mp        19克隆载体（Yanisch-Perron        et        al.，1985，Gene        33：103-119），用双脱氧链终止法测双链顺序（Sanger        et        al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA        74：5463-5467）。

6.1.3        Northern        blot分析

如前所述从MCF-7细胞和B SC-40细胞中分离PolyA RNA（Purchio et al.，1979，J.Virol.29：763-769），在1%琼脂糖-甲醛凝胶上分级分离（Lehrach et al.，1977，Biochemistry 16：4743-4751），转移到尼龙膜上（Hybond，Amersham），与[³²P]标记的pTGF-β1-2探针杂交。杂交在42℃，50%甲酰胺溶液中进行，溶液中还有0.9MNa Cl，50m M磷酸钠，5m M EDTA，0.1% SD S，4XDenharts（Maniatis et al.，1982，Molecular Clning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold Spring Harbour，NY，371-372），0.4mg/ml酵母t RNA和0.25mg/ml变性了的小牛胸腺DNA。滤纸于65℃在0.25X S SC（Maniatis et al.，1982），0.1%SD S中洗涤，干燥及在带有增感屏的曝光匣（Dupont）中曝光于Cronex-4 X射线胶上。

6.2结果

如上所述，来自B        SC-40细胞的polyA        RNA在λgt10中构建的cDNA库，用一个与成熟TGF-β1分子6-17密码子互补的36单体脱氧寡核苷酸筛选（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705）。由于牛TGF-β1（Roberts        et        al.，1983，Biochemistry        22：5692-5698）和人类TGF-β1（Deryncket        al.，1985，Nature        316：701-705）之间极为相似，我们选择来自人类顺序的探针筛选猴TGF-β1        c        DNA克隆。

在三轮空斑纯化后，共鉴别出13个阳性克隆。一个1600        bp克隆，p        TGF-β1-2，经限制性内切酶分析包含整个TGF-β1前体编码顺序，被选择用来进行测序。DNA顺序，与推出的氨基酸顺序在图1中表示。发现一个编码390氨基酸多肽的单个阅读框架。成熟TGF-β1多肽由羧基端112残基组成。这个排列与人类TGF-β1（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705）和鼠TGF-β1（Derynck        et        al.，1986，J.Biol.Chem        261：4377-4379）中所述的一样。猴cDNA克隆与人类c        DNA克隆具98%的同源性，在编码区域只有27个错配（图1）和三个碱基的一个间隔。

在5′-非编码区中，人类和和猴TGF-β1        DNA顺序有91%同源性，有3个间隔，而3′-非编码区域有94%同源性，没有间隔。在5′起始密码子的上游为一有效的分枝结构，在人类c        DNA克隆中存在，而鼠克隆中则没有。鼠克隆中在这个区域中有明显的插入会抑制此结构的形成。象人类和鼠克隆一样，猴c        DNA克隆不是全长的，因为未鉴别出3′多聚腺苷化。TGF-β1前体m        RNA的3′-末端富含G-C的性质可能会产生防止在这个区域中合成DNA的二级结构。3′非编码区表现出显著的重复嘌呤顺序，CCCC，接在终止密码子后。这顺序有人类顺序中出现9次，并有一个单个碱基差别的重复。猴和鼠克隆含8个重复，并有二个单个碱基差别的重复。

用TGF-β1-2探针的Northerm        blot分析显示与来自B        SC-40细胞和人类乳房癌细胞系MC        F-6的主要2.5kb多聚腺苷化RNA种的杂交（图2）。这与在人类细胞系（Derynck        et        al.，1985        Nature        316：701-705）和鼠细胞系（Derynck        et        al.，1986，J.Biol.Chem.261：4377-4379）中发现的主要转录本大小相同。在4kb和1.45kb处的带也可在图2第2道上看见。

图1中也显示了人类和猴TGF-β1前体蛋白的氨基酸同源性。只有5个氨基酸出现变化，而且它们都在氨基端前体区：猴和人类成熟TGF-β1蛋白在氨基酸水平上有完全的同源性。与之相反，在猴和鼠前体TGF-β1分子之间只存在84%同源性（在氨基酸水平上）。差别包括以下：一个氨基酸改变，在成熟TGF-β1编码区丝氨酸（鼠）变成丙氨酸（猴）。在前体中编码一额外氨基酸（精氨酸，158位）的密码子，在猴和鼠克隆中没有。推测这个变化是因为在人类基因中有一个插入，该基因已被测序（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705）。猴、鼠和人类TGF-β1前体区之间的极为相似性表明分子的这一部分可能也有重要生物功能。

前体羧基端包含成熟型猴TGF-β1        12个氨基酸，并通过它与相应人类基因产物的同源性而鉴别。前体的这个富含半胱氨酸（9个残基）区域代表分泌型的TGF-β1，且不包含任何假定的糖基化位点，而在前体的其它区域也可鉴定三个有效的N-糖基化位点（在82，136和177位的Asn）。已知人类和鼠源的TGF-β1等二聚体，需要完整的二硫键以保持活性（Messague.1984        J.Biol.Chem.259：9756-9761）。通过初级顺序分析确立的成熟人类TGF-β1的氨基端（Derynck        et        al.，1985，Nature        316：701-705）前面有Arg-Arg两肽。这个相似的酶切位点也存在于猴同源物的相同位置上。在翻译过程中或翻译后酶切，伴随链内或链间或两者二硫键的形成，引起具活性的等二聚体的产生（二聚化）。关于这点，TGF-β1前体一个含有14个疏水氨基酸的富含亮氨酸区（8-21位，图1），它可能具信号肽功能，而且在分泌/加工中起作用。

7.实施例：TGF-β1的表达

以下实施例描述了活性TGF-β1在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达，该细胞用含编码TGF-β1顺序的重组质粒转染，编码顺序在猴病毒40（SV40）表达因子控制下。这儿所述的实验证明许多CHO转染子生产和分泌高水平TGF-β1。由转染细胞释放的TGF-β1通过用对TGF-β1敏感的靶细胞做生长抑制测定证实同真正天然TGF-β1具类似的生物活性。

7.1材料和方法

7.1.1细胞培养

二氢叶酸还原酶（dhfr）缺失的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞（Urlaub        and        Chasin，1980        Proc，Natl        Acad.Sci，U.S.A77：4216）在Ham′sF-12培养基中增殖（Gibco        Laboratories，NY）培养基内补充10%胎牛血清（FBS）和150        μg/ml        L-脯氨酸。分别含100        U/ml青霉素和100        μg/ml的链霉素。CHO转染子在含上述补充物的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基上生长。CHO细胞和它们的衍生物通过胰蛋白酶作用以1∶5分裂速率常规传代。

制备氨甲蝶呤（Sigma，MO）在水中常规浓度，为10mg/ml。加稀释Na        OH（0.2M）使药物溶解（最终pH为6）。溶液过滤灭菌并保藏在-20℃。在培养基（100        μm）中氨甲蝶呤溶液保存在4℃不超过一个月。

7.1.2        DNA操作及质粒构建

限制性酶，T4连结酶，牛肠磷酸酯酶，DNA多聚酶的Klenow片段及其它DNA制剂从Bethesda        Research        Laboratories，MD购得。标准DNA操作如Maniatis        T.，et        al，1982，Molecular        Cloning：A        Laboratory        Manual.Cold        Spring        Harbour        Laboratory，New        York中所述。

质粒P        SV2（β1-TGF-dhfr），含前后排列的猴TGF-β1        cDNA及鼠dhfr基因，以及插入的SV40顺序，如图3中所述的进行构建。先开始制备pSV2-β1-TGF质粒。含TGF-β1蛋白整个编码区域的TGF-β1        cDNA的1378        bp        P        ST-ECORI片段接入pSP65的多聚接头区，使Hind        Ⅲ限制性位点5′置于P        STI识别顺序处。得到的质粒用EcoRI酶切，用DNA多聚酶I的Klenow片段修复平头，然后分离含TGF-β1编码顺序的Hind        Ⅲ-EcoRI（平头）片段。将Hind        Ⅲ-EcoRI（平头）片段加入pSV2-neo的新霉素抗性基因（geo）处，与载体Hind        Ⅲ-HpaI段连接，构建质粒pSV2-β1-TGF。

在这点上，构建pSV2-（β1-TGF-dhfr）需两步。第一步是分离pSV2-β1-TGF的NdeI-EcoRI（平头）片段。通过用EcoRI酶切pSV2-β1-TGF质粒，用DNA多聚酶的Klenow片段修平末端，用NdeI和PvuI酶切平头载体，分离2.6kb        NdeI-EcoRI平头片段而完成的。PvuI酶切是必需的，这样可避免污染质粒片段在琼脂糖凝胶电泳上一起纯化。构建中最后一步是将含β1-TGFc        DNA和SV40顺序的NdeI-EcoRI（平头）片段插入pSV2-dhfr的NdeI-PvuⅡ片段。结果得到的pSV2-（β1-TGF-dhfr）质粒含有单一的NdeI位点，它可使DNA线性化。

7.1.3        DNA转染

10⁶缺失dhfr的CHO细胞接种到100mm皿上24小时后，培养物用20ug的NdeI线型pSV2-（β1-TGF-dhfr）质粒以磷酸钙沉淀法转染（Wigler，M.，et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：1373-1376）。简要地说，在1ml250mm无菌CaCl₂中，加入20ug线型DNA。滴加入1ml 2XHEPES溶液（280mMNa Cl，50mMHEPES，1.5mM磷酸钠，pH7.1），混合物置于冰上30分钟。沉淀物分散滴加到含细胞的10ml F12培养基中。在37℃培养4小时后，更换培养基，换成包含25%甘油的10ml F12培养基，在室温放90秒，再次用20ml F12培养基冲洗细胞，然后细胞于非选择性F12培养基（20ml）中另培养48小时。通过用补充了10%透析过的FBS（Gibco，N.Y.）和150ug/ml L-脯氨酸的DMEM置换培养基来选择表达dhfr的转染子。在选择性培养基中细胞培养10-14天，可以观察到菌落。用巴斯德吸管抽吸十个菌落，然后扩增。

7.1.4.选择抗氨甲蝶呤细胞

扩增二氢叶酸还原酶（dhfr）的细胞主要来自如前所述的初级转染子（Gasser，C.S.and Schimke，R.T.1986，J，Biol.Chem.261：6938-6946）。扩增后，10⁵细胞接种于100mm皿中，与浓度增加的氨甲蝶呤相适应。氨甲蝶呤的起始浓度为50，100，200nM在最高氨甲蝶呤浓度含可见菌落的平板用胰蛋白酶消化，然后在此氨甲蝶呤浓度至少以1∶5细胞再传二代。然后，细胞（10⁵）接种于2，5和10倍此氨甲蝶呤浓度的100mm培养皿上。含可见菌落的皿再次用胰蛋白酶消化，然后在含氨甲蝶呤的培养基中生长适应。在扩增的各个阶段，细胞有含40%FBS，10%二甲亚砜和50%DMEM的培养基中冷冻。在冷冻的培养基中不含氨甲蝶呤。

7.1.5        β-TGF        mRNA水平的定量

用溶液杂交法来估评TGF-β1 m RNA水平（Uhler.M.D.，et al.，1986，Proc.Natl.Acad Sci，U.S.A，83：1300-1304）.β1-TGF cDNA的600bp Sma I-Sma I片段克隆进pSP65，通过SP 6RNA多聚酶合成[³²P]标记的互补RNA，合成细节由产者详述（Promega        Biotech，Madison        WI）。含整个β1-TGF        cDNA的单键M13DNA，即和mRNA一样，用作标准。通过蛋白酶K酶切和苯酚/氯仿抽提，从转染细胞中分离所有核苷酸（Mcknight，G.S.，et        al.，1980，J.Biol.Chem，255：144-147）。通过染料结合试验法测量所有核苷酸样品中的DNA量（Labarca，C.，and        Paigen，K.，1980.Anal.Bio.chem.102：334-352）。与M13        β1-TGF标准比较，假设每个细胞中有7微微克DNA来估计每个细胞中mRNA分子数。

7.1.6生长抑制试验

水貂肺上皮细胞，Mvl Lu（Accession Number CCL-64，American Type Culture Collection），对TGF-β1极其敏感，被用来做生长抑制试验。该试验是用胸腺嘧啶类似物5′-[¹²⁵I]-碘代-2′脱氧尿嘧啶（¹²Idu）来估计DNA的合成。与未处理CCL-64细胞相比，抑制50%¹²⁵Idu的掺合所需的量被定义为具一个单位的活性，以分离的TGF-β1作标准，一个单位活性一般来说对应于80-100pg/ml TGF-β1。

为了测定转染细胞对活性TGF-β1的分泌，收集融合培养细胞24小时的无血清上清液，在0.2M乙酸中充分透析。冻干除去乙酸，样品重新溶于无菌完全培养基中进行测定。

7.1.7        安抗独立生长的刺激作用

测试上清液刺激普通鼠肾纤维细胞（NRK;克隆49）在软琼脂上长成菌落的能力。用经酸透析的上清液按所述方法完成软琼脂测试（Twardzik        and        Sherwin，1985，J.Cell.Biochem.28：289-297;Delarco        and        Todaro，1978        Proc.Natl.Acad        Sci.U.S.A.75：4001-4005）。

7.1.8        肽的合成及抗体产生

在Beckman        990仪器上用固相技术会成肽，用如前所述的方法从树脂上切下（Gentry，L.E.，et        al.，1983，J.Biol.Chem        258：11219-11228;Gentry，L.E.and        Lawton，A.，1986，Virology.152：421-431）。用准备好的高性能液相色谱法进行纯化。通过氨基酸分析确定肽的组成。

合成的肽通过半胱氨酸残基与牛γ-球蛋白相连。连接反应基本如前所述（Gentry        and        Lawton，1986，Supra）。肽连接的效果为，每个分子的γ-球蛋白的共价连续8到26个分子的肽。

肽连结构（相当于100μg肽）乳化于福氏完全佐剂中，结合皮下和皮内注射，在三到六个位置注入新西兰兔子。隔2-3星期给与增强注射。增强注射7-14天后取血。

7.1.9免疫印迹

蛋白在7.5%-17.5%梯度SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，在4℃200mA转移到未修饰的硝化纤维素上14-18小时（0.45μm;Schilicher和Schuell）、（Burnette，W.N.，1981，Anal.Biochem.112：195-203）。硝化纤维素的剩余结合能力通过与2.5%BLOTTO（Johnson，D.A.，et        al.，1984，Gene        Anal.Technl：3：-8）在含0.2%NP-40的磷酸盐缓冲碱（P        B        S）中孵育而阻断。兔血清抗体在2%BLOTTO中1∶75稀释，与经阻断的硝化纤维素纸在室温孵育2小时。在2.5%BLOTTO中洗涤5分钟洗去多余的抗体，硝化纤维素纸与在2.5%BLOTTO中稀释为1∶500的碱性磷酸酯酶结合蛋白A一起孵育。孵育一小时后，硝化纤维素纸在含0.2%NP-40的P        B        S中洗涤5次（洗涤5分钟），然后显影（Leary        et        al.，1983，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：4045-4049）。

7.1.10        Northern        Blot分析

如前所述（Pwchio        and        Fareed，1979，J.Virol        29：763）从组织培养细胞中制备细胞质多聚腺苷化RNA，在1%琼脂糖-甲醛凝胶上分级分离（Lehrach        et        al.，1977，Biochemistry        16：4743）。此RNA转移到Hybond尼龙膜（Amersham）上，与放射标记的pTGF-β1-2探针杂交。在0.9M        Na        Cl，50        mM磷酸盐（pH7.0），5mM        EDTA，0.1%        SD        S，4XDenhardts，0.4mg/ml酵母tRNA，0.25mg/ml小牛胸腺DNA和50%甲酰胺中，在42℃杂交20小时。滤纸在65℃于0.25×SSC中洗四次（30分钟/洗涤），干燥，进行放射自显影。

7.1.11        Southern        Blot分析

抽提RNA后得到片状沉淀核，从核中分离高分子量DNA（Purchio        and        Fareed，下面），核片状沉淀物分散于TE缓冲液中，然后置于1%十二基磺酸钠/10mM        Tris-HCl，pH7.4/10m        M        EDTA。加入100ug/ml蛋白酶K，在37℃孵育16-18小时，用酚/氯仿抽提DNA，并用乙醇沉淀，用不含DNAseA的RNAse在TE缓冲液中酶切2小时去除剩余的RNA，然后在TE中充分透析。

为了作Southern Bolt分析，用适当地限制性内切酶酶切DNA，然后印迹到Hybond尼龙膜上（Southern，E.M.，1975，J.Mol.Biol 98：503-517）。Hybond尼龙膜在含有5×16⁶cpm/ml的变性β1-TGF cDNA切口转译EcoRI-EcoRI片段的杂交缓冲液中65℃杂交2小时，其中β1-TGF cDNA来自pTGF-β1-2，洗涤的详细过程在产品中描述。

7.2        TGF-β1在CHO细胞中的表达

为了表达高水平重组生物活性TGF-β1，我们使用原先描述的pSV2载体（Mulligan，R.C.and        Berg，P.，1981.Mol.Cell        Biol.1：449-459;Subramani，S.，et        al.，1981，Mol.Cell        Biol.1：854-864）制备一个表达质粒（pSV2-β1-TGF-dhfr），在同一质粒中，前后排列猴TGF-β1和鼠二氢叶酸还原酶cDNA（图3）。表达载体带有很大一部分的TGF-β1        cDNA，它编码整个TGF-β1前体分子。在同一质粒中两基因的这种连接可以使在扩增dhfr时，能同时扩增TGF-β1。对每个cDNA转录起始，终止，多聚腺苷化和剪切所需的信号是一致的，均由猴病毒40（SV40）DNA顺序提供。

pSV2-β1-TGF-dhfr按磷酸钙沉淀法转染dhfr缺失CHO细胞。表达dhfr表型的十个CHO转染子通过在选择性培养基上扩增而分离。所有十个转染子用杂交溶液控测都显示含TGF-β1        mRNA。为了提高TGF-β1的表达水平，来自10个起始转染子的细胞在浓度增加的氨甲蝶呤（MTX）中一步步筛选。在扩增的不同阶段，用溶液杂交法测试细胞的TGF-β1        mRNA水平。10个起始转染子中的4个表现出TGF-β1        mRNA水平提高。这儿，我们描述其中的一个克隆（TGF-β1-3），它在用MTX的扩增中，表现出很高水平的TGF-β1mRNA。

表1显示在扩增的不同阶段每个TGF-β1-3细胞中TGF-β1        mRNA拷贝数。在扩增的不同阶段的CHO细胞被称作TGF-β1-3-0，TGFβ1-3-300，TGFβ1-3-2000，它们依次对应于在0，2μm和20μm        MTX中选择的CHO细胞。

表1

在CHO转染子中TGF-β1        mRNA的表达

培养细胞        每个细胞中TGF-β1        mRNA的数目′

MTX        浓度（μM）

（0）        （2）        （20）

TGF-β1-3        350        34，000        76，000

CHO＃7        700        -        -

非转染CHO        20

1.每个细胞中mRNA的拷贝数用溶液杂交法测定。按一个细胞中DNA含量为7微微克的近似值作计算。

我们用非转染CHO细胞及起始表现出表达低水平重组TGF-β1的CHO转染子（CHO＃7），作为对照，CHO＃7是通过pSV2-β1-TGF（图3）和pSV2-neo共转染获得的，接着在Gentecidin（Gibco，NY）中选择。起始的TGF-β1-3转染子显示与CHO＃7相似的β1-TGF        mRNA水平，在非转染CHO细胞约高20倍。但是，经过MTX选择，在TGF-β1-3细胞中观察到的β1-TGF        mRNA拷贝数急剧增加，在20μMMTX中，达到每个细胞约有80，000拷贝数。与起始TGF-β1-3转染子相比，扩增了200倍以上，与非转染CHO细胞相比，扩增了约4000倍。

图4A中显示了从不同圹增阶段的TGF-β1-3细胞中来的poly（A）选择mRNA的northern        blot分析。图中也包括非转染CHO细胞mRNA，用来显示这些细胞中低水平的内源性2.5kb        TGF-β1        mRNA（星号，图4A）。在几个其它细胞系中也曾观察到低水平的TGF-β1        mRNA表达TGF-β1-3转染子显示大量移至预计2kb大小的可杂交RNA。

在MTX选择后，TGF-β1-3细胞中TGF-β1 mRNA的急剧增加的最有可能的机制是扩增的结果。为检查基因扩增，在MTX选择的不同阶段从TGF-β1-3中分离DNA，用限制性酶酶切，转移到Hybond尼龙膜上，与[³²P]标记TGF-β1 DNA杂交。在所述的质粒中，用两个限制酶EcoR        I和BamH        I酶切两次产生缺少侧面顺序的质粒DNA线性拷贝。因为BamH        I位点中有一个位于猴TGF-β1        cDNA中，用此酶酶切应产生两个与切口转译探计杂交的片段。

图4B中显示了Southern        blot的结果。在经MTX选择的细胞中，可观察到与TGF-β1探针的强烈杂交。这些片段的大小精确地对应于预测的含pSV2-TGF-β1-dhfr（由EcoR        I酶切而来的4.7kb片段和由BamH        I酶切而来的4.4和0.51kb）片段的TGF-β1的大小。在起始非选择转染子（TGF-β1-3/0）中，可观察到低水平的相似的酶切产物。光密度计扫描比较不同的TGF-β1-3细胞，揭示在TGF-β1-3/200和TGF-β1-3/2000细胞中分别至少有15和35倍TGF-β1顺序的扩增。

7.3分泌的生物活性重组TGF-β1的检测

为了确定TGF-β1蛋白是在转染TGF-β1-3细胞中生产和分泌的，从这些细胞中收集条件培养基，并测试其生物活性。根据β1-TGF抑制水貂肺上皮细胞（CCL-64）生长的能力所进行的一种敏感而特异的生物测定是最初的测试。在图5A中显示了使用高度纯化真正人类TGF-β1的一个典型标准剂量反应曲线。在这个测试中，TGF-β1为8-12微微克（80-120pg/ml）时一般可观察50%水貂肺细胞生长抑制作用。在扩增的各个阶段从TGF-β1-3细胞收集的条件培养基显示了抑制CCL-64细胞生长的活性。在图5B中显示了这些上清液的剂量反应曲线。这些图与观察到的真正人类天然β1-TGF的抑制曲线具相似的斜率。

表Ⅱ显示了在TGF-β1-3细胞培养上清液中存在的生物活性物质水平，是从图5B曲线计算出来的。

表Ⅱ

从CHO转染子中收集到的生物活性TGF-β1的浓度

根据生物活性的在CHO转染子的条件

培养基中TGF-β1的浓度

培养细胞        MTX        浓度（μM）

（0）        （2）        （20）

TGF-β1-3 5.8ng/ml 1000ng/ml 5600ng/ml²

CHO＃7        -        -

非转染CHO        1ng/ml        -        -

1.在无细胞上清液中生物活性物质的浓度用ng/ml表示，是根据图2B中的数据决定的。计算是根据10微微克天然β-TGF对CCL-64细胞产生50%抑制作用而得出的。

2.由TGF-β1-3/200细胞系生产的TGF-β1绝对量从1.5mg/l到6.5mg/l不等。这可能是由于几个因素，包括指示细胞（CCL-64）和TGF-β1-3/2000细胞的组织培养条件。

在非扩增TGF-β1-3细胞的上清液中可观察到低水平分泌的生物活性TGF-β1。这些水平与在CHO＃7转染子中观察到的相似。经MTX选择的TGF-β1-3细胞表达很高水平的重组生物性TGF-β1。在20μmMMTX选择下，TGF-β1-3细胞（TGF-β1-3/2000）分泌约6μg/ml活性TGF-β1到无血清培养上清液中。

表Ⅲ表示了在MTX选择的各个阶段，分泌在TGF-β1-3转染子培养上清液中的生物活性物质的水平。用水貂肺细胞抑制测定评估生物活性，得到的值换算为每个细胞每24小时的值。与TGF-β1-3转染子相反，在非扩增TGF-β1转染子中观察到低水平分泌的生物活性TGF-β1。生产重组TGF-β1最高的为TGF-β1-3/2000细胞。由10⁷这种细胞在24小时内分泌到5ml组织培养基中的生物活性重组物质的量接近30μg TGF-β1。在每个转染子的条件上清液中检测到的生物活性量与在这些细胞系中观察到的TGF-β1 mRNA的相对水平相关。

表Ⅲ

在MTX选择的不同阶段由CHO转染子

分泌的生物活性TGF-β1的量

分泌生物活性TGF-β1的值/细胞/24h^a

0nm        2μm        20μm

转染子数目        MTX        MTX        MTX

TGF-β1-3 2.9 500 2800^b

a.由100mm圆形融合组织培养皿中分泌入5ml无血清DMEM中的生物活性TGF-β1量，用如材料和方法中所述的，通过测其对水貂肺细胞的抑制来确定。用血细胞计计数测定细胞数。

b.这些细胞的一个100mm圆形融合组织培养皿（c.a.1×10细胞）在5ml无血清上清液中分泌近30μg生物活性TGF-β1。

还用第二个生物测定来进一步确定分泌重组TGF-β1的特征。这测定是根据TGF-β1与EFG分子一起，在软琼脂中刺激NRK细胞生长的能力来进行的。在表Ⅳ中显示了生物测定的结果。重组TGF-β1与用作对照的人类天然血小板TGF-β1的活性是不能区分的。

1.普通鼠肾细胞在含1ng/ml上皮生长因子（EGF）的0.3%Difco        noble琼脂平板上生长。每个板上可数到8个低倍镜视野。当板中无TGF-β1或EGF时，不形成菌落。根据从水貂肺上皮细胞抑制测定而来的值估计加入重组TGF-β1的量。形成菌落的能力用从20μm        MTX选择TGF-β1-3细胞收集的上清液评估。

表Ⅳ

比较重组TGF-β1和天然TGF-β1

的软琼脂菌落测定

在软琼脂上形成的菌落数

TGF-β1        从限制性培养基中收集        人类血小板

（ng/ml）        的重组TGF-β1        TGF-β1

10.0        260        251

5.0        263        247

1.0        225        211

0.5        193        182

0.1        50        85

7.4酸激活便筛选的重组体TGF-β1，的生物活性最佳化

业已发现，很多类型的细胞能分泌以潜伏形式存在的天然TGF-β1，为了获得最佳的生物活性，需要将其酸化。在前面的图和表中所陈述的生物检定是采用经酸透析的物质来进行的。为了确定转染CHO细胞是否分泌呈潜伏性的非生物活性形式的TGT-β1，将从TGF-β1-3/2000细胞中收集得到的无血清上清液在0.2M乙酸或50m M NH₄HCO₃（PH7）中透析，并测定其对水貂肺细胞的抑制活性。结果示于图6中。经过酸透析的上清液具有有效的抑制CCL-64水貂肺细胞的能力。对比之下，经NH₄HCO₃透析的样品的抑制活性的水平低得多（低1%）。而首先在NH₄HCO₃中透析，然后再通过0.2M乙酸第二次透析处理的上清液则能恢复其抑制活性的能力。这种物质的剂量反应曲线与由仅经过酸透析的样品所显示的曲线是重叠的。

7.5在转染TGF-β1-3        CHO细胞培养基中成熟和前体形式的TGF-β1的鉴定

抗预计的TGF-β1分子中的肽顺序的抗肽抗体是以合成肽作为免疫原在兔子中产生的。所用的肽顺序显示于图7中，图7也表明了在TGF-β1前体多肽中它们的相应位置：TGF-β1_81-94，TGF-β1_225-236和TGF-β1_369-381。其中一种抗体（抗-TGF-β1_369-381）抗存在于TGF-β生长因子的成熟形式中的表位。其它两种抗体（抗-TGF-β1_81-94和抗-TGF-β1_225-236）是前体特异性的，并抗仅存在于TGF-β1的前体分子中的肽顺序。

7.5.1.成熟TGF-β1的鉴定

收集来自TGF-β-3转染子的上清液并采用抗-TGF-β1_369-381（它能容易地鉴定真实的成熟TGF-β1）进行免疫印迹试验（图8）。在免疫印迹前用合成肽免疫原预吸附抗体而证实特异性。

在还原条件下（图8A），真正的TGF-β1和大小为12-13kd的多肽一样迁移。在经MTX选择的TGF-β1-3细胞的上清液中，与真实TGF-β1共同迁移的蛋白质可容易地被鉴别（图8A）。采用免疫印迹发现，从非扩增的TGF-β1-3细胞中收集的上清液显示不能测定重组β1-TGF水平。经20μMMTX选择的TGF-β1-3细胞显示出能产生最高水平的成熟TGF-β1，比2μMMTX选择的细胞产生的水平约高2-4倍。这种提高和mRNA水平（表Ⅰ）以及生物活性（表ⅡA和ⅡB）的表达所得到的结果是一致的。在非还原条件下（图8B），重组TGF-β1蛋白质的迁移如真正的TGF-β1，以二聚体形式，其迁移位置在24kd处。

除成熟的TGF-β1外，还观察到较大形式的免疫反应性物质。在还原凝胶上，这些形式的物质的大小为44kd-56kd（图8A）。这些免疫反应性物质的主要性质表明了有广泛的糖基化作用。令人感兴趣的是在缺乏还原剂时，这些较大形式也显示出如大小为95-110kd的二聚体那样的迁移（图8B）。对这些较大形式的物质作为前体分子的鉴定是采用如下面的小节中描述的前体特异性抗体来证实的。

7.5.2前体TGF-β1的鉴定

收集来自TGF-β1-3转染子的上清液并采用前体特异性抗体进行免疫印迹试验（图9）。还原后，抗前体顺序的两个区的抗体（抗-TGF-β1_81-94和抗-TGF-β1_225-236）可识别44-56kd的较高分子量形式，并且不与存在于上清液中的成熟TGF-β1反应（图9A）。除了识别较大的44kd-56kd形式外，这些前体特异性抗体也可控测分子量在30-42kd范围内的前体多肽（图9A）。这些较小的前体分子不与抗-TGF-β1_369-381反应，可能只代表前体顺序。因此，在来自MTX选择的TGF-β1-3细胞的上清液中，除成熟β1-TGF外，还包含较大的前体形式。因为这些前体顺序在物种之间极为保守，所以它们可能显示其它重要的生物特性。为了列举还原后在转染子上清液中的全部三种TGF-β1形式，以前体特异性抗体（抗-TGF-β1_225-236）和成熟TGF-β1特异性抗体（抗-TGF-β1_369-381）的混合物为探针作免疫印迹（图9A）。

在非还原SD S-聚丙烯酰胺凝胶上，分级分离上清液，并且用前体特异性肽抗体或前体特异性抗体与成熟TGF-β1特异性抗体的混合物为探针检测上清液，示于图9B中。大小在95kd到110kd之间的较大分子量形式可容易地被每一种抗体测定。前体特异性抗体（抗TGF-β1_225-236）和成熟TGF-β1抗体（抗-TGF-β1_369-381）的混合物除可测定95-110kd带外，还可测定二聚体形式的TGF-β1（24kd）。

7.6重组TGF-β1构成了从TGF-β1-3-2000细胞中分泌的蛋白质的主要部分

TGF-β1-3/0和TGF-β1-3/2000细胞生长至融合，在无血清的培养基中用[³⁵S]-半胱氨酸和[³⁵S]-蛋氨酸标记18小时，将经放射标记的分泌蛋白质在SD S-聚丙烯酰胺还原凝胶上分级分离。结果示于图10中。从经放射标记的TGF-β1-3/0细胞中收集的上清液不显示可被测定的重组体TGF-β1蛋白质的水平。与之相反，从TGF-β1-3/2000细胞中收集的上清液则显示出在起始TGF-β1-3/0转染子中未发现的四种主要的分泌蛋白质。这些蛋白质的三种与通过免疫印迹识别的成熟和前体形式的TGF-β1迁移相同。被[³⁵S]-氨基酸大量标记并由TGF-β1-3/2000细胞释放的另一种蛋白质迁移的位置在22kd分子量处。该蛋白质的氨基末端顺序分析显示出它与二氢叶酸还原酶是相同的。

8.实例：TGF-β1基因产物的特性

下面的实例呈现了由CHO-TGF-β-3-2000细胞合成的rTGF-β1产物的纯化和许多特性的数据。结果表明rTGF-β1是在CHO细胞中，以pre-pro-TGF-β1形式合成的，后者在羧基末端Gly-29和Arg-278处加工。该rTGF-β1前体被糖基化和磷酸化，但成熟蛋白质未进行糖基化和磷酸化，该rTGF-β1具有与天然TGF-β1相当的特异性活性，并且成熟rTGF-β1在体外和体内是肿瘤细胞生长的潜在抑制因子。

8.1.rTGF-β1前体的糖基化和磷酸化

与本章节有关的rTGF-β1前体的结构特征用线型图解来列举，如图11A所示。从蛋白质的29氨基酸残基处切下一个疏水顶端，产生了一个361个氨基酸的多肽，在图11A中被定为‘a’。随后的修饰和裂解产生成熟rTGF-β1单体（在图11A中以‘c’作标记）和一种完全由氨基末端前体残基构成的249个氨基酸的蛋白质（在图11A中以‘b’示之）。

在该实例中所用的细胞系是TGF        β3-2000和由这些细胞所分泌的与TGF-β1有关的蛋白质，分析是通过免疫印迹进行的，结果列于图11B中。如前面的第7.5部分中所描述，在非还原条件下，通过SD S-聚丙烯酰胺凝胶分析，发现从TGF-β3-2000细胞中衍生的上清液含有一个95kd-110kd的大的形式的rTGF-β1以及成熟的24kd蛋白质二聚体;而在还原条件下分析时，发现这类上清液含有一个44kd-56kd的带（图11B中以｀a′示之，2道）、一个30kd-42kd的带（图11B中以｀b′示之，2道）和一个12kd的带（图11B中以｀c′示之，2道）的成熟TGF-β1单体。在图11B中所显示的a、b和c带含有图11中所显示的rTGF-β1前体区的证据在前面的第7.5部分中已陈述了。通过SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳，再进行荧光X线照相，直接分析来自TGF-β3-2000细胞的[³⁵S]-蛋氨酸和[³⁵S]-半胱氨酸标记的上清液，这些带就可以容易地辨别（图11c，1道和图11D，1道）;在来自非转染CHO细胞的上清液中，未检测到这些带。

在图11中所示的带｀a′和｀b′的扩散性能表示它们可能被糖基化了。为了研究这种可能性，用[³H]-葡萄糖胺标记TGF-β3-2000细胞，无细胞的上清液首先通过SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后再进行荧光X线照相分析，图11c（2道）显示了95-110kd形式已被标记;而在成熟的24kd蛋白质二聚体中未测到标记。当在还原条件下分析时（图11D，2道），带｀a′和｀b′被标记。在带｀c′中未发现标记。因此，rTGF-β1前体被糖基化了，而成熟的12kd单体没有。

该糖基化的性能可以通过用多种糖酵解酶处理来自TGF        β3-2000细胞的上清液，然后在SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离酶切产物来进行进一步研究。图12A显示了这些酶切产物的免疫印迹分析。用唾液酸苷酶处理可引起带｀a′和｀b′移动较快，但仍有扩散带（图12A，3道），这表明有唾液酸残基存在。主要裂解高分子甘露糖低聚糖的糖苷酶H无显著的效果（图12A，4道）。用可去除N-连接的糖的N-聚糖酶酶切引起带｀a′和｀b′迁移成两条细带，其中最大的迁移带分子量约为39kd（图12A，2道），如所预计的，未观察到成熟12kd单体的迁移变化。采用来自TGF β3-2000细胞的[³⁵S]-半胱氨酸标记的上清液也得到相同的结果（图12B）。

为了测定未修饰TGF-β1前体的大小，将含有整个TGF-β1编码区的1350个碱基对的Pst        I-EcoR        I片段（Sharples等人，1987，DNA        6：239-244）亚克隆进pSP64并用SP6聚合酶进行转录（Kreig等人，1984，Nucleic        Acids        Res        18：7057-70）。在琼脂糖-脲凝胶上分析这些转录本，表明产生了一种RNA（图13A），它可导致在无信使依赖性网状细胞的转译系统中合成42kd的多肽（图13B）。该凝胶进行较长时间爆光显示出有较小的40kd产物存在。无主要细胞的转化产物的大小（42kd）与所需要的一种390个氨基酸的蛋白质的大小非常一致，并且很可能与未修饰的TGF-β1多肽主链相应。在图12A（2道）和图12B（4道）中所显示的39kd带表示rTGF-β1的除去疏水顶端顺序（在图11A中为｀a′）脱糖基蛋白质核心。该带下面的带与图11A中脱糖基带｀b′相对应。

在[³²P]-正磷酸盐存在下培养TGF β3-2000细胞，然后在SD S-聚丙烯酰胺凝胶上分级分离，发现rTGF-β1前体，而不是成熟12kd单体，被磷酸化（图11E）。对酸解产物薄层电泳发现大多数磷酸盐不与丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸（图11F中的点X、Y、Z）相连接。在下面的第9部分的实例中所得到的数据表明磷酸盐被结合进天门冬酰胺连接的复合糖基团，如甘露糖-6-磷酸中。对该发现的意义也进行了讨论。

8.2.生物活性的TGF-β1的纯化

将表达rTGF-β1的CHO细胞转染子（TGF-β3-2000细胞）如上面第7部分中所述那般繁殖和传代。将在一个150cm²圆形融合组织培养皿中的TGF-β3-2000细胞接种到含有50ml Dulbecco′s改良Eagles′培养基（DMEM）的筒状瓶（850cm³）中，所述的培养基中补充有胎牛血清（10%v/v）、青霉素（100U/ml）、链霉素（100μg/ml）、L-脯氨酸（150μg/ml）和氨甲蝶呤（20μM），并在37℃下生长。当细胞结合并达到融合后，用50ml如上述那样补充的无血清培养基将融合细胞漂洗二次，然后在50ml另外再补充有浓度分别为100μg/ml和2μg/ml的抗坏血酸酯和还原谷胱甘肽的无血清培养基中培养24小时。

从筒状瓶中收集无血清的上清液，在200xg下离心除去细胞碎片，并立即加至10mg/升苯甲基磺酰基氟、50个胰蛋白酶抑制单位/升抑肽酶（Sigma）和0.2M乙酸中。通过超滤（YM10膜，可截留10，000分子量;Amicon）将上清液浓缩40倍，并将得到的浓缩液在0.2M乙酸中充分透析。在纯化前，将透析物冻干并保存于-20℃。

条件培养基首先通过凝胶渗透色谱分级分离。典型的洗脱图示于图14中。根据标记蛋白质，在分子量约为15，000处，95%以上的生物活性物质被洗脱。对nTGF-β1采用相同的柱，观察到相同的洗脱图。TGF-β1的明显低的分子量（由凝胶渗透色谱法确定的）可能是因为二聚体生长因子分子紧密的折叠式结构或因为非特异性吸附。在柱的无效容量中观察到高分子量的活性，并被认为其活性小于总的可利用的活性的5%。库A和B在非还原条件下进行SD        S-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）显示出所洗脱的大部分生物活性组分是24K        Dal多肽，而所洗脱的较少的生物活性组分是95-110KDal分子量的大组分（数据未显示）。

为了证实24KDal的组分代表了经适当加工的rTGF-β1，我们采用反相HPLC（高压液相色谱）将该组分纯化至均质以作随后的特征鉴定。库B在C18        μ        Bondapak载体上分级分离（图15）。在较浅的乙腈梯度（载体）上所洗脱的生物活性组分呈现一个均匀的峰，具有与nTGF-β1相同的滞留时间。采用SD        S-聚丙烯酰胺凝胶（电泳）在非还原和还原条件下分析发现该活性组分是均匀的，与从牛脾中分离得的nTGF-β1共同迁移（图16）。通过蛋白质顺序分析进一步确定rTGF-β1的特征（表Ⅴ）。

在测序前，用溴化氢将纯化的多肽化学裂解。因为成熟的TGF-β1仅含有一个在残基382处的蛋氨酸，故同时得到两个顺序;一个对应于生长因子的氨基末端顺序（在Ala-279处开始），另一上代表羧基末端的8个氨基酸（在I        Le-383处开始）。我们的结果（表Ⅴ）表明生物活性的rTGF-β1是经过合适的加工的。

rTGF-β1纯化步骤的概括示于表Ⅵ中。在两个纯化步骤中，生长因子被纯化30倍以上。在这个特例中，总产率为54%，结果为每升条件培养基含0.65mg        rTGF-β1。其它制备的加工使生物活性重组蛋白质有85%以上被回收，产率大于1mg/升。

表Ⅵ

从条件培养基中纯化成熟rTGF-β1

分离部分 蛋白质^b（mg） 单位^a比活性单位/mg 产率（%）

条件培养基^c39.0 14×10⁷3.6×10⁶100

T SK（部分B） 1.37 8.3×10⁷61×10⁶59

HPLC-C18 0.65^d7.5×10⁷119×10⁶54

^a在实验过程中确定的活性单位。

^b在280nm下假设测定的蛋白质有1个吸附单位＝1mg/ml蛋白质

^c用1升条件培养基开始。

^d通过氨基酸分析计算。

8.3        rTGF-β1前体的纯化和性能

rTGF-β1前体是利用它的糖基化性质来进行纯化的。将在T SK-250柱无效容量中洗脱的前体（库A）在中性缓冲液（50mMNH₄HCO₃，pH7.8）中透析，在伴刀豆球蛋白A外源凝集素柱中分级分离前，先在15，000×g下离心分离。用磷酸缓冲盐（PBS）充分地洗涤含有1ml与琼脂糖4B Pharmacia）共价连接的伴刀豆球蛋白A的柱，并用50m M NH₄HCO₃，pH7.0进行平衡。加入欲被吸附的样品，在用10倍体积的PB        S洗涤以前，循环过柱四次。用在PB        S中的100mM甲基-α-D-吡喃甘露糖苷洗脱特异性结合物。

与伴刀豆球蛋白A连接的前体可用α-甲基甘露糖苷特异地洗脱。用考马斯兰染色的纯化前体SD        S-聚丙烯酰胺凝胶图示于图16中。洗脱的蛋白质迁移位置在95-120KDal的分子量之间。大的形式可以与抗前体顺序和成熟的生长因子的抗体反应。在该制备过程中，未检测到污染的成熟rTGF-β1，即使在样品过量的SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上也未检测到。

尽管制备产物中不存在成熟的二聚体生长因子，但当用还原SD        S-PAGE分析纯化前体时，显示一个与单体rTGF-β1共同迁移的14KDal物质（图16）。两种前体：pro-TGF-β1（30-390）和前体的30-42KDal前区域（30-278;也可参见图17）在凝胶上是明显的。进一步尝试将这个较大的复合物分成各个独立的组分未获成功。伴刀豆球蛋白A纯化的物质的氨基酸末端顺序分析显示出两个氨基末端顺序，一种在Leu-30处开始，另一种则在Ala-279处开始。这些结果有力表明从CHO细胞条件培养基中纯化的95-120KDal        rTGF-β1前体代表了一个包含pro-TGF-β1（30-390）、前体的前区域（30-278）以及全部由二硫键内部连接的成熟rTGF-β1的链的混合物。为了证实这个观察结果，我们用CNBr裂解该前体并纯化该CNBr肽以确定该复合物的化学性质。将TGF-β1-前体（800pmol）溶解于30μl        70%的甲酸中，并加入16μl在100mul70%甲酸中含15mgCNBr的溶液（Gross和Witkop，1962，J.Biol.Chem.237：（856-1860）。反应在黑暗中，在氮气环境，于30℃进行4小时。消化产物在以如上所述的用含有40%乙腈的0.1%三氟乙酸（TFA）（Ikeda等人，1987，Biochemistry        26：2406-2410）平衡的Bio-Sil        T        SK-250凝胶渗透层析柱中层析分离。反相HPLC是在μBondpak        c-18柱（39×300mm，10μm粒径;Waters）中，用由0.05%        TFA水溶液作为初始缓冲液和0.045%TFA乙腈作为终止缓冲液所组成的线性梯度而进行。在聚丙烯试管中收集分部部分以使非特异性吸收的损失最小。用CNBr裂解的rTGF-β1前体的T        SK-250洗脱图示于图18中。各个峰通过测氨基酸的顺序而鉴定。一个含有前体半胱氨酸残基和成熟生长因子的半胱氨酸残基之间二硫键的主要CNBr肽片段是M（30-38/279-382/383-390），其氨基末端顺序分析示于表Ⅴ.Ⅱ中。这个特别的肽片段包含前体的Cys-33和成熟生长因子的一个半胱氨酸残基。该CNBr肽M氨基末端（30-38/262-382/383-390）代表一个包含pro-TGF-β1的二硫键连接肽。

8.4.rTGF-β1多肽的氨基末端顺序

自动顺序分析在一个475A型氨基酸测序器（Applied        Biosystems）上进行。如所述的（Marquardt等人，1987，J.Biol        Chem.262：12127-12136），苯基海硫因-氨基酸衍生物通过在线反相HPLC，在120        APTH分析器（Applied        Biosystems）中分离。

将得自能表达高水平猴rTGF-β1的CHO-TGF-β1-3/2000的无血清条件培养基在还原条件下，在SD        S-PAGE上进行电泳。考马斯兰染色发现由这些细胞分泌的三种rTGF-β1分子形式（图17）。最大的形式，在44-56KDal（图17中以a示之）范围内广泛迁移，且具有来自TGF-β1前体和成熟TGF-β1的免疫表位（见前面，第7.5部分），很可能代表未加工的TGF-β1前体。30-42KDal多肽（图17中以“b“示之）仅含有从前体衍生的表位（见前面，第7.5部分）表明该物质已经过旨在将它和成熟TGF-β1形式分离的蛋白质水解。14KDal物质（图17中以“C”示之）表示成熟的，完全加工后的TGF-β1单体。将重组前体蛋白质（图17中以“a”和“b”示之）从丙烯酰胺薄层电洗脱下来，并且通过氨基末端顺序分析确定其特征。结果示于上面的表Ⅴ中。顺序分析发现两个较大的前体形式具有相同的氨基末端顺序。将该顺序与预计从猴TGF-β1        cDNA中所得到的顺序（Sharples等人，1987.DNA        6：239-244）相比较，表明两种较大的蛋白质均经过特异性蛋白水解，在Gly29/Leu-30位置上去除完整的pre-pro-TGF-β1分子的前面29个氨基酸。这个疏水的29个氨基酸顶端顺序的切除很可能是信号肽酶作用的结果。Gly-29/Leu-30肽键是预计的信号肽裂解位点（Von        Heijne，1986，Nucleic        Acids        Res，14：4683-4690）。根据这些结果，44-56KDalTGF-β1多肽（图17中以“a”示之）代表pro-TGF-β1（30-390），而30-42KDal物质（图17中以“b”示之）则对应于缺乏信号肽和成熟TGF-β1顺序的前体前区域（30-278）。14KDal多肽的顺序分析（数据未显示）显示了在成熟生长因子的Ala-279位开始的完整氨基末端，这表明CHO-TGF-β1-3/2000细胞在二元裂解位点上对猴rTGF-β1进行了适当的加工。经设计的加工TGF-β1的方案的概要显示于图20中。

8.5.体外生物活性

如7.1.6.部分中所述测试纯化的成熟和前体形式的rTGF-β1对水貂肺上皮细胞的生物活性。成熟和前体rTGF-β1以及得自牛脾的天然TGF-β1的生物活性图示于图19中。摩尔浓度计算根据预计的氨基酸组成（对于前体rTGF-β1来说，采用的是pro-TGF-β1的氨基酸组成）。结果表明，成熟rTGF-β1是水貂肺细胞增殖的有效抑制剂（1-2p        M可达到半数最大抑制），且它的活性曲线与从天然TGF-β1中得到的活性曲线重叠。换句话说，本发明的重组TGF-β1和天然TGF-β1具有相同的比活性。与之相对照，前体产物的活性比成熟生长因子的活性小50倍（50-60p        M可达到半数最大抑制），图19中抑制情况的比较显示了剂量反应曲线的微小差异，这表明在成熟和前体形式之间受体亲和力不同。

8.6.体内生物活性

TGF-β1在体内的效应基本上不知道，尽管其在抑制乳腺生长（Silberstein和Daniel，1987，Science        237：291），伤口愈合（Sporn等人，1983，Science        219：1329）和胚胎发育上的作用已被揭示了，从天然来自骨中的TGF-β1和TGF-β2（Seyedin等人，1986.J.Biol.Chem.261：5693;Seyedin等人，1987，J.Biol.Chem.262：1946）和在CHO-TGF-β1-3-2000细胞中克隆（Sharples等人，1987，DNA        6：239-244）和表达的（Gentry等人，1987.Mol.Cell.Biol.7：3418）重组猴TGF-β1均是多种已建立的人体上皮起源的肿瘤细胞系DNA合成的有效抑制剂（Ranchalis等人，1987.Biochem.Biophys.Res.Comm.148：783）。在该研究中，我们陈述体内的证据，即TGF-β1也是在无胸腺裸鼠中生长的人体肺肿瘤生长的肿瘤抑制剂。尤其惊人的是TGF-β可以在被抑制的肿瘤细胞中诱导类分化的细胞表型。来自患有肺腺癌的高加索男人的，被称为A549的人肺癌细胞系是可通过皮摩尔浓度的天然TGF-β1或TGF-β2和本发明的重组TGF-β1被抑制的响应靶（在体外）。无胸腺裸鼠用A549细胞进行皮下接种;在三个星期内，约80%的动物内发育了可触知的肿瘤。图21显示了用TGF-β1和TGF-β2处理对A549肿瘤在这些鼠中进一步生长的效果。每一个实验组包括5个动物，纵坐标的值代表以三维量（体积）表示的平均肿瘤测定值。天数1对应于实验组接受处理的第一天;试验化合物被皮下注射至肿瘤的附近，但不注射入肿瘤本身。对照组动物接受注射牛血清白蛋白，后者在与经TGF-β处理的带肿瘤动物组相同的载体溶液中。对照组中肿瘤的体积每隔约7-8天增加一倍。在另外的实验中，在接受无生物活性的合成肽的带肿瘤动物中也观察到相似的肿瘤体积增加一倍的时间。与之相比较，在与横座标上所标出的那些天相应的时间连续注射200ng        TGF-β1和TGF-β2（对每一个动物来讲，每一个处理方式的总量为1.4μg）可以使肿瘤停滞并阻止肿瘤进一步生长。如图21中所示的，TGF-β1的效果比TGF-β2稍好。在另外一个实验中，观察了TGF-β1抑制A549肿瘤的剂量反应（图21）。所得到的数值是相对于得自模拟处理动物的肿瘤体而言的TGF-β处理动物的平均肿瘤体积。在最低的TGF-β1试验剂量（每次注射12.5ng）时，观察到约25%抑制。在较高的剂量，即每次注射50和200ng时，观察到抑制肿瘤生长作用相应增大（依次为37%和60%）。在一些试验中，在第1天时肿瘤体积越大，与对照组肿瘤相比，被抑制的肿瘤体积减少的百分率越低。即使接受最高剂量的TGF-β（20天后总共为1.4μg）的动物也未显示出大的TGF-β毒性表现。如图23中所示，经TGF-β1处理的动物表现出正常的特性;在活组织检查中，对于主要器官作大体的检查未发现明显的异常。插图是在实验结束时（20天），在作病理检查前，从每一组中得到的肿瘤大小的代表。从试验动物中取出的肿瘤（21天，图21）平均净重减轻90%以上。

当用这些研究中所用的包括A549肿瘤细胞在内的各种肿瘤细胞作试验时，来自无血清培养基上清液的纯化至均质的重组猴TGF-β1在体外具有与天然（牛骨）分子相似的剂量反应抑制曲线。重组和天然TGF-β1对无胸腺小鼠中A549人肺癌的生长作用的比较示于表Ⅷ中。在抑制肿瘤生长方面，重组产物比从（牛）骨中衍生的TGF-β1更有效，前者为60%抑制，后者为46%抑制。

表Ⅷ

重组和天然TGF-β1对于肿瘤生长作用的比较

TGF-β1        肿瘤大小        抑制（%）

对照        处理

重组        105.4        42.6        60.0

骨中衍生        83.4        45.4        46.0

＊这些实验的方案除了仅以二组数据测量肿瘤外，与图21的图解说明中所描述的相同。数值代表每一组的动物中的平均肿瘤面积。在肿瘤外围注射纯化的rTGF-β1和得自牛骨的天然TGF-β1（Seyedin等人，1986，J.Biol.Chem.261：5693）（200ng/每次注射，总量为1μg）。测量值代表在处理后17天的平均肿瘤大小。

从对照和处理的动物组中切除肿瘤，固定并进行组织病理检查。如图24中所示，组A，在低倍镜下，三色染色的对照肿瘤切片显示出绝大多数坏死区分散于不同细胞类型，大多是柱状上皮的相当不均匀的区域。对大多数血管也进行了观察。与之相比较，用相似方法制得的TGF-β1抑制的肿瘤标本的切片（图24中以“b”示之）显示出几乎无坏死、更明显的组织性以及各细胞类型有不同的分布。尤其明显的是与对照肿瘤样品相比，结缔组织带（染成蓝色）增加。此外，与对照肿瘤相应，通常的血管分布出现减少。当在较高的放大率下检查时，对照肿瘤（图24中以“c”示之）的未坏死区显示类上皮和分化差的细胞类型混合，高密度的染色核也是明显的，这表明肿瘤细胞以高速度繁值。与之相比较，经TGF-β处理的肿瘤标本（图25中以“d”示之）显示了很大的不同。所看到的主要细胞类型是大的和圆的;核多数分散于核区中，并显示了杯状细胞（一种正常的肺细胞类型，它可分泌粘蛋白）的月牙形态特征。尽管一些分泌粘液的细胞在对照肿瘤标本中也被观察到，它们仅代表了次要的细胞亚种群。组成环绕血管的柱状上皮细胞的散在点在TGF-β抑制肿瘤（图25中以“d”示之，插入物）的切片中也是较普遍存在的。

得自经处理的肿瘤的类杯状细胞型分泌粘液的性质可通过高碘酸席夫碱染色剂（PAS）所证实。对照肿瘤切片（图25中以“a”示之）显示出几个高糖蛋白密度的分散区。TGF-β处理的肿瘤切片（图25中以“b”示之）的各个部分中均可看到被大大地放大的PAS染色强度。可见到一个更分化的和组织化的表型。对对照和经TGF-β处理的肿瘤切片用Alcian兰染色，PH2.5下进行氨基葡糖聚糖（glycosaminoglycans）（GAGs）的检查。对照标本（图25中以“c”示之）显示出着色很弱，而经处理的标本（图25中以“d”示之）则显示出明显强的着色，这表明有较高水平的透明质酸合成和沉积。

9.实例：在rTGF-β1前体的两个天冬酰胺连接的糖链中甘露糖-6-磷酸的鉴定

下面的实例显示了在猴rTGF-β1中的全部三个潜在的糖基化位点（Asn-82，-136和-176）均被用作糖类加入的位点，并显示磷酸化是在低聚糖侧链中发生的。结果表明了rTGF-β1前体的独立功能作用。

9.1.材料和方法

9.1.1.材料

测序器用的试剂是从Applied        Biosystems取得的。HPLC用的溶剂是从Burdick和Jackson取得的。CNBr得自Kodak;4-乙基吡啶得自Aldrich        Chemical        Co;所有其它的化学物质均是试剂级的。金黄色葡萄球菌V8蛋白酶是从Miles        Laberatories取得的，经L-（甲苯磺酰氨基-2-苯基）乙基氯甲基酮处理的胰蛋白酶是从Worthington得到的。

9.1.2.细胞培养

TGF-β-3-2000细胞系如前面第7.1.1.部分中所述的进行繁殖。单个的克隆在96号测定板中通过限制性稀释而分离。发现一个克隆，TGF-β-3-2000-17（此后统称为克隆17）可产生约2μg活性TGF-β1/ml，它被用于进一步分析。这些细胞在含有10%胎牛血清、150        μg/ml        L-脯氨酸、100        U/ml青霉素、100        μg/ml链霉素和20        μM氨甲蝶呤的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基中常规地传代。

9.1.3.放射标记

克隆17生长至融合，用除去血清的无磷酸盐培养基洗涤三次，并在同样的培养基中，在37℃下培养30分钟。然后用新鲜的蛋氨酸、半胱氨酸和含有200 μCi/ml[³⁵S]-蛋氨酸和[³⁵S]-半胱氨酸的无血清培养基（NEN，Boston，MA）代替原先的培养基，在37℃下，将细胞培养4小时。为了用[³H]-糖进行标记，将细胞生长至融合，用无血清的培养基洗涤并在含有100 μci/ml[³H]-葡糖胺或[³H]-甘露糖的无血清培养基（NEN，Boston，MA）中标记20小时。收集经放射标记的无血清上清液，在4000×g下离心10分钟，在0.2M乙酸中充分透析并冻干。

9.1.4.聚丙烯酰胺凝胶电泳

经干燥的沉淀物在还原条件下，在15%的SD S-聚丙烯酰胺凝胶上或7.5-15%梯度SD S-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析，如已描述的（Laemmli，1970，Nature 227：680-685）。凝胶用考马斯兰染色，进行荧光X线照相（对[³⁵S]-和[³H]-标记的蛋白质）（Chamberlain 1979，Anal.Biochem.98：132-136）并在Cronex-4 X光胶片上曝光。或者，在聚丙烯酰胺凝胶电泳前，经冻干的样品用N-聚糖酶（Genzyme，Boston，MA），在37℃下采用由制造商所推荐的条件，消化16小时。

9.1.5.酸水解

[³²P]-标记的rTGF-β1前体和[³²P]-标记的糖肽在6NHCl中，95℃下水解2小时。在pH1.9和3.5下，通过电泳分离产物，并通过所述的（Cooper等人，1983，Meth Enzymol.99：387-402）放射自显影检测。或者，在pH8.9（1%碳酸铵）下进行电泳，然后层析分离（65%异丁酸、5%吡啶、3%乙酸、2%丁醇、25%水）。内部氨基酸（磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸）通过水合茚三酮染色进行检测。甘露糖-6-磷酸通过用70%高氯酸∶1MHCl∶4%钼酸铵∶丙酮（5∶10∶25∶60）喷淋、干燥并在紫外线下曝光而检测。

9.1.6.s-吡啶乙基化

为了进行还原，用在含有6M盐酸胍、0.1%Na₂EDTA的100μl 0.4 M Tris-HCl缓冲液中的二硫苏糖醇（20mM），pH8.5，处理50 μg TGF-β1前体和来自克隆17的无血清上清液的225，000cpm[³²P]-标记的rTGF-β1前体，在50℃下作用2小时，接着，用4-乙基吡啶（100m M）进行s-吡啶乙基化，在22℃下处理4小时。用20% TFA将此反应混合物酸化至pH2.0，并在RP-300柱（2.1×30mm;Applied Biosystems）上脱盐，采用TFA/乙腈梯度洗脱。乙腈的浓度线性增加，从0.1%TFA水溶液增加到含0.08%TFA的60%乙腈，在100 μl/分的流速和35℃下，洗脱1.5小时。

9.1.7.化学和酶裂解

为了在甲硫酰氨基处进行CNBr裂解，将650pmol s-吡啶乙基化的TGF-β1前体和160，000cpm[³²P]标记的S-吡啶乙基化的TGF-β1前体溶解于30 μl 70%的甲酸中，并加入41在100 μl 70%的甲酸中含60mgCNBr的溶液（Gross和Witkop，1962，J.Biol.Chem.237：1856-1860）。反应在30℃下，在氮缓冲环境下进行4小时，然后在黑暗中，在22℃下再进行18小时反应。

采用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶进行的裂解在含有3M脲的40        μl        0，1        M        Tris-乙酸缓冲液（pH8.0）中进行，在37℃下反应10小时。酶/底物之比为1∶10（wt/wt）。库A和库B的胰蛋白酶消化（图31-A）在含30%乙腈的40        μl        0.1        M        Tris-乙酸缓冲液（pH8.0）中，在酶与底物比为1∶20的条件下，于37℃进行15小时。用20%        TFA将酶消化物酸化至pH2.0并通过rpHPLC分离。

9.1.8.肽纯化

HPLC是在包含两只M6000A泵、一个系统控制器，一个U6K注射器、一个441型固定波长检测器（214nm）的Waters        HPLC系统中，或在130        A型分离系统（Applied        Biosystems）中，和有一个图表记录器而进行的。凝胶渗透色谱在一个Bio-sil        T        SK-250柱（7.5×600mm，Bio-Rad        Laboratories）上，含40%乙腈的0.1%TFA中以0.25ml/分的流速进行。采用rpHPLC的肽纯化在35℃，RP-300柱（2.1×30mm;Applied        Biosystems）上进行。由此0.1%TFA水溶液为起始缓冲液，含0.08%        TFA的乙腈为终止缓冲液组成的线性乙腈梯度被用来进行洗脱。人工收集多肽，V8蛋白酶肽以E表示，胰蛋白酶肽以T表示，这两种肽均无需再纯化而用作顺序分析。

9.1.9.氨基酸顺序分析

自动顺序分析是采用RUN470-1程序在一个475        A型氨基酸测序器（Applied        biosystems）上进行。

总共采用1.5mg        BioBrene        Plus（Applied        Biosystems），在样品加入前，先进行两次Edman降解预循环。噻唑啉酮衍生物向苯基海硫因氨基酸的转化是与25%的TFA一起进行的。苯基海硫因氨基酸衍生物通过在线rpHPLC，在120        A型P        TH分析器（Applied        Biosystems）中分离，如已描述的（Marquardt等人，1987.J.Biol.Chem.262：12127-12131）。

9.1.10.结合研究

TGF-β1前体通过在Biol-Sil T SK-250柱中凝胶渗透色谱和在Vydac C4柱中rpHPLC而纯化。用1mCi[¹²⁵I]对约6 μg的纯化前体进行碘化处理，如已描述的（Frolik等人，1984，J.Biol.Chem.259：10995-11000）。用固相受体分析测定[¹²⁵I]-TGF-β1前体和甘露糖-6-磷酸/IGF-Ⅱ受体的连接（Roth等人，1987.Biochem.Biophys，Res.Commun，149：600-606）。对聚氯乙烯微量滴定井中相继包被40 μl蛋白A（20 μl在20 mMNa HCO₃中，pH9.6）、抗IGF-Ⅱ受体的兔抗体（50 μg/ml）和500ng纯化的人胎脑受体（id.）。用于全部洗涤的缓冲液含50mM        HEPES（pH7.8）、50m        MNa        Cl、0.1%Triton-X-100、0.1%Tween        20和0.1%牛血清白蛋白。然后用5%不含脂肪（脱脂）的干牛奶在包被井中，在4℃下孵育20分钟，往每一个井中加入放射标记的TGF-β1前体。在4℃下3小时后，将井洗涤四次，切下并计数。非特异性的连接可在不存在受体时测定，并在计算抑制百分数之前减去。

9.2.结果

由克隆17细胞分泌的三种结构形式的rTGF-β1通过图26A中的线图来列举。在图26A中还列出了从猴TGF-β1前体的DNA顺序预测的三个潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点：Asn-82、-136和-176（图1和sharples等人，1987，DNA        6：239-244）。

图26B显示了可用SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析的由克隆17细胞分泌的[³⁵S]-标记蛋白放射自显影图。蛋白质a、b和c可以容易地看见。前体蛋白质a和b可以用[³H]-葡糖胺、[³H]-甘露糖和[³²P]-磷酸盐标记（图26C、26D和26E），表明rTGF-β1前体蛋白质a和b，不包括rTGF-β1（蛋白质c），均是磷酸化和糖基化的。用N-聚糖酶酶切[³⁵S]-标记的前体蛋白质，可引起电泳带a和b的迁移发生变化，成为更细和更快的电泳带，最大的带的分子量接近39，000（图27A，2道），这与对TGF-β1前体蛋白质a所计算的分子量为41，200是一致的。用N-聚糖酶消化[³²P]-标记的蛋白质，然后通过SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离消化产物，发现酶已经从rTGF-β1前体蛋白质中移去了全部的标记（图27B，2道），这表明[³²P]标记被掺入天冬酰胺连接的低聚糖中。

将经糖基化和磷酸化的rTGF-β1前体蛋白质a和b进行氢溴酸裂解，然后进行酶消化以进一步确定磷酸化位点的特性。经标记的糖肽通过凝胶渗透色谱和rpHPLC纯化。图28中列出的三个片段的顺序分析表明Asn-82、Asn-136和Asn-176被糖基化了。95%以上的标记在肽E（77-91）和E（134-139）中被（11）帧k模（174-180）中含有的标记小于总掺入的[³²P]-标记的5%。

用CNBr在蛋氨酸残基处裂解S-吡啶乙基化的rTGF-β1前体。CNBr片段在Bio-Sil T SK-250柱上凝胶渗透色谱分离使[³²P]-M（134-253）和[³²P]-M（39-113）分解。典型的色谱图示于图29中。

用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶使M（39-113）进一步分解为小片段。酸化酶消化产物并通过rpHPLC分离肽。典型的色谱图示于图30中。已确定了[³²P]-E（76-91）和[³²P]-E（76-94）的完整顺序。两个肽中都含有一个羧基末端谷氨酸，这与蛋白酶的特异性一致。两种肽在82号位均含有未确定的残基（表Ⅸ）。DNA顺序预示在TGF-β1前体转译产物的82号位存在天冬酰胺残基，是一个N-连接糖基化作用的潜在位点。在实验7中所预计的P TH-Asn的产量，是要使其足以进行未修饰天冬酰胺的鉴定。82号位的P TH-Asn的产量约是以邻近的残基的产量作标准而预计的产量的0.5%。低产量的P TH-Asn-82可能是由于与其它噻唑啉酮氨基酸相比较，经修饰的噻唑啉酮衍生物在抽提溶剂丁基氯中的溶解度降低了。酸解和随后的[³²P]-E（76-91）双向电泳检测到甘露糖-6-[³²P]-磷酸，图31。

用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶将M（134-253）进一步分解成小片段，产生两种主要的[³²P]-标记的肽，如图31A中所示。检测所列出的肽的顺序，两者均含有一个羧基末端谷氨酸，这与蛋白酶的特异性一致。肽[³²P]-E（134-139）在136号位有一个未确定的残基（表Ⅸ）预计的P TH-Asn的产量约是以邻近残基的产量作基准所期望的产量的2%，由此可推断它是糖基化的Asn。酸解和随后的[P]-E（134-139）双向电泳检测得甘露糖-6-[³²P]-磷酸（图32）

收集含有E（170-194）的峰A，干燥，然后用胰蛋白酶使之分解成小片段。消化产物酸化并通过rpHPLC分离肽。典型的色谱图示于图31B中。T（174-180）的顺序被确定（表Ⅸ）。肽T（174-180）又在176号位含有一个未确定的残基。预计的P TH-Asn的产量约为以邻近的残基Asn-177的产量作基准所期望的产量的1%，这表明Asn-176糖基化了。T（174-180）的色谱异质性也是明显的。该肽含有不到5%的[³²P]-掺入的前体蛋白质。酸解和随后的2次电泳检测得甘露糖-6-[³²P]-磷酸（未显示）。

峰B（图31A）被干燥，并先用金黄色葡萄球菌V8蛋白酶，接着用胰蛋白酶再消化，肽通过rpHPLC分离。类似的肽图，如图31A和图31B中所示，表明用V8蛋白酶未完全裂解M（134-253）。

总前体蛋白质（a和b）以及纯化的糖肽的薄层电泳分析显示[³²P]-磷酸盐被掺入甘露糖-6-磷酸;无[³²P]-磷酸盐掺入Ser、Thr、Tyr（图32A-C）。在pH1.9、pH3.5和pH8.9的缓冲液，和两种不同的色谱缓冲液中电泳，可观察到掺入了[³²P]-标记的肽和甘露糖-6-磷酸标准物的共同迁移（图32D，数据未显示）。酸水解也可以从用糖基磷脂酰肌醇修饰的蛋白质中产生甘露糖-6-磷酸（Lon和Saltiel，1988，Science 239：268-295），但这仅在蛋白质的羧基末端发现，因而它与rTGF-β1前体中的甘露糖-6-磷酸无关。

表Ⅸ

得自S-吡啶乙基化的rTGF-β1前体的

糖肽的氨基酸顺序数据

肽        肽

（编号）        （编号）

位置        残基        产量（pmol）        位置        残基        产量（pmol）

E（76-91）        E（134-139）

76        Ala        （1）        87.0        134        Phe        （1）        99.4

77        Val        （2）        91.3        135        The        （2）        98.3

78        Leu        （3）        111.2        136        Asn        （3）        2.1

79        Ala        （4）        100.5        137        Thr        （4）        55.5

80        Leu        （5）        75.7        138        Ser        （5）        28.1

81        Tyr        （6）        71.4        139        Glu        （6）        52.8

82        Asn        （7）        0.2

83        Ser        （8）        28.5        T（174-180）

84        Thr        （9）        42.5

85        Arg        （10）        43.6        174        Tyr        （1）        10.0

86        Asp        （11）        45.8        175        Ser        （2）        3.8

87        Arg        （12）        47.6        176        Asn        （3）        0.1

88        Val        （13）        39.0        177        Asn        （4）        8.5

89        Ala        （14）        37.9        178        Ser        （5）        3.3

90        Gly        （15）        23.3        179        Trp        （6）        5.1

91        Glu        （16）        10.7        180        Arg        （7）        1.7

还进行了用来检定TGF-β1前体是否能与甘露糖-6-磷酸受体连接的实验。用纯化的甘露糖-6-磷酸受体与¹²⁵I-标记的TGF-β1前体一起孵育，图34中列出的结果表明该前体可以连到纯化受体上，因为与无受体的对照孵育产物相比，约有30倍的放射配体与受体相连接。该连接是特异性的，因为它几乎完全被100nM TGF-β1前体或50 μM甘露糖-6-磷酸所抑制（90%）。

10.实例：TGF-β1变异体在CO        S细胞中的表达

位点直接诱变被用于改变TGF-β1的初级结构，此改变发生在TGF-β1前体的pro区的三个半胱氨酸残基处，其方法是在33、223和225（图1）号氨基酸位置上将编码半胱氨酸残基的顺序改变为编码丝氨酸的顺序。突变体被用于转染CO        S细胞，并对由转染子产生的重组TGF-β1变异体蛋白进行分析。结果表明CYS-33可能参与成熟TGF-β1加工的调节。CYS-33修饰可产生一种前体，该前体最终可导致产生较高水平的成熟TGF-β1。

10.1.材料和方法

10.1.1 CNBr肽M（134-253）²的定性

由CHO细胞合成的rTGF-β1前体通过凝胶渗透色谱纯化，用CNBr裂解之，并如已描述的（第8部分等）纯化肽。在用三丁基膦还原和用7-氟苯并-2-氧代-1，3-重氮-4-磺酸铵偶合[Sueyoshi等人，1985，J.Biochem.（Tokyo）97：1811-1813）后，检定含半胱氨酸的肽，并通过反相HPLC在μ        Bondapak        C18柱中（Waters        Associates，Inc，Milford，Mass）纯化至均质。

在15%的SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上分离肽并用考马斯亮蓝R-250染色。用Applied        Biosystems        475        A型测序器分析二硫键连接的肽。在Applied        Biosystems        120        A型P        TH-分析器中测定苯基海硫因-氨基酸衍生物，如已描述的（Gentry等人，1988，Mol，Cell        Biol.8：4162-4168）。

10.1.2.编码TGF-β1变异体表达载体的构建和DNA转染

用Pst        I和Eco        R        I酶切pTGF-β-2（sbarples等人，1987，DNA        6：239-244），并将含有完整TGF-β1编码区的1400bp片段连接至事先用Pst        I和EcoR        I酶切的质粒pSP64中。用该构建物转化E.Coli        H        B101，分离出质粒pSP64/TGF-β1。从pSP64/TGF-β1中切下TGF-β1        cDNA的Pst        I和Eco        R        I片段并将该片段插入M13        mP18中，将Hind        Ⅲ限制位点5′放在Pst        I位点。分离出含有MP18链和TGF-β1非编码链的单链DNA，作为位点直接诱变的模板。采用商业化的体外寡核苷酸直接诱变系统（Amersham）将CYS-33、CYS-223和CYS-225分别转变为SER编码子。

下面的寡核苷酸被用于构建突变体：

5′－ACTATCCACC AGCAAGACTAT-3构建 ER-23;

5′-TAGCGCCCAC AGCTCCTGTGA-3′构建SER-223;

5′-CACTGCTCC TCTGACAGCAAA-3′构建 SER-225;和

5′－TAGCGCCCAC AGCTCCTCTGAC-

                                                                        -AGCAAA-3′构建        SER-223/225

在每一种情况下，核苷酸的改变伴随着CYS改为SER密码子。为了得到所需要的诱变，采用最终突变体的单个跟踪测序筛选出5        10个噬菌斑，所述最终突变体是用双脱氧链终止方法作进一步测序而确定的（Sanger等人，1977，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：8573-8577）。

分离含有突变cDNAs的复制形式，用EcoR I酶切，修复平头，并用Hind Ⅲ酶切。将所得到的cDNA片段连接到p πH3 M（Aruffo和Seed，1987，Proc，Natl，Acad，Sci，U.S.A.84：8573-8577;Seed和Aruffo，1986，Proc，Natl，Acad.Sci，U.S.A 84：3365-3369）的Hind Ⅲ和Xho Ⅰ（平头）位点以构建质粒p πH3 M/β1-SE R-33（编码pre-pro-TGF-β1^S33），p πH3 M/β1-SE R-223（编码pre-pro-TGF-β1^S223），p πH3 M/β1-SE R-225（编码pre-pro-TGF-β1^S225）和p πH3 M/β1-SE R-223/225（编码pre-pro-TGF-β1^S223/225）。用这些质粒以及质粒p πH3 M/β1（编码野生型TGF-β1），经过下列修饰转染CO S细胞，如已描述的（Aruffo和Seed，1987，Proc.Natl，Acad，Sci.U.S.A.84：8573-8577;Seed和Aruffo，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3365-3369）。转染在具有10⁶个细胞的100mm培养皿中进行，采用5ml转染物质在37℃下进行2.5小时。在转染后48小时时，将细胞置于无血清培养基中，收集72小时后的条件培养基，在0.2M乙酸中透析三次，用如前面的第7.1.7.部分中所描述的成熟和前体特异性肽抗体免疫印迹进行分析。通过前面第7.1.6.部分所描述的生长抑制试验来检测生物活性。

10.2.结果

10.2.1.由突变TGF-β1编码顺序所编码的＜p质的分析

在CO        S转染子生长的经透析的无血清培养基中所测得的生物活性概括于下面的表Ⅹ中。用编码TGF-β1变异前体的质粒p        πH3        M/β1-SE        R-33转染的细胞比用编码野生型TGF-β1的质粒p        πH3        M/β1转染的细胞分泌的生物活性蛋白质多3到5倍。与之相反，用编码SE        R-223和SE        R-225变异体的质粒转染的细胞与用野生型构建物转染的细胞相比，前者不能分泌高水平的生物活性蛋白质。

表Ⅹ

由用各种编码TGF-β1质粒转染的

CO        S细胞条件培养基的生物活性

CO        S转染体        质粒        生物活性（ng/ml）

A        B

CO        S-TGF-β1        p        πH3        M/β1        39        50

CO        S-TGF-β1/        p        πH3        M/β1        209        174

SE        R-33        SE        R-33

CO        S-TGF-β1/        p        πH3        M/β1        39        37

SE        R-223        SE        R-223

CO        S-TGF-β1/        p        πH3        M/β1        26        28

SE        R-225        SE        R-225

CO        S细胞用编码野生型TGF-β1的质粒（p        πH3        M/β1）、编码以SE        R代替CYS-33的TGF-β1的质粒（p        πH3        M/β1        SE        R-33）、编码以SER代替CYS-223的TGF-β1的质粒（p        πH3        M/β1        SE        R-223）或编码以SE        R代替CYS-225的TGF-β1的质粒（p        πH3        M/β1        SE        R225）转染。所列出的数据表示两种独立生物抑制试验（前面第7.1.6部分）的结果。

免疫印迹分析采用抗-TGF-β1_369-381+抗-TGR-β1_81-94进行，如前面章节7.1.8.中所描述的，以检测TGF-β1相关蛋白质。结果示于图33A-G中。在还原条件下（图33D），突变蛋白质表现出与野生型蛋白质相同。可用抗体检测12K Da成熟单体（图33β中以‘c’示之）以及44～56KDa和30-42KDa前体形式（图33β中以‘a’和‘b’示之）。此外，示于图33D中的免疫印迹表明所分泌的TGF-β1蛋白质的绝对量未受到突变体的显著影响。

当在非还原条件下检查时，突变和野生型TGF-β1蛋白质之间的差异是明显的（图33E）。成熟TGF-β1二聚体（24KDa）存在于所有的转染子上清液中。但是，用p        πH3        M/β1        SE        R-33转染的细胞与野生型转染子相比，产生24KDa二聚体的水平有所提高（图33E，3道和4道），而p        πH3        M/β1        SE        R-33、p        πH3        M/β1        SE        R-225和p        πH3        M/β1        SE        R223/225转染子则产生与野生型接近的水平。24KDa二聚体的增加不是蛋白质合成/分泌的增加或成熟TGF-β1从pro-TGF-β1中裂解增加的结果，因为在还原条件下的免疫印迹表明p        πH3        M/β1和p        πH3        M/β1        SE        R-33转染子可以分泌几乎相同量的成熟或前体形式（图33D）。

此外，TGF-β1^S33蛋白质不像野生型蛋白质那样形成99～110KDa前体复合物（图33E）。代之的是一个130～150KDa和一个75～85KDa的蛋白质（图33E，4道）如图33F和图33G中所示，TGF-β1^S3330～150KDa蛋白质可由前区域和成熟（TGF-β1）的特异性抗体所识别，很可能代表二聚体pro-TGF-β1^S33。75～85KDa多肽只能被前区域特异性抗体检测（图33G，4道），可能代表TGF-β1^S33前体的前区域二聚体。

与之相反，由p πH3 M/β1 SE R-223和p πH3 M/β1 SE R-225编码的突变蛋白质可形成90～110KDa的前体复合物（图33E、33F和33G中的5道和6道），尽管也存在一些单体形式的前体。对TGF-β1前体的前区域特异的抗体可检测44～56KDa和30～42KDa蛋白质（图33G，5道和6道），而对成熟顺序特异的抗体只能检测44～56KDa的蛋白质（图33F，5道和6道）。用p πH3 M/β1 SE R-223/225转染的细胞只产生单体形式的前体（图33E、33F和33G中7道），而成熟TGF-β1仍然可以以pro-TGF-β1^S223/225中经蛋白质水解而裂解，并形成24KDa二聚体。

申请人发现，从TGF-β1前体中除去CYS-33残基最终可提高TGF-β1分泌的产量，其机理可能是防止新生的TGF-β1单体的重要群体在胞内被限制于高分子量前体复合物中，这一发现可能构成了一种制备重组生物活性TGF-β1的改进的方法。此外，该方法可用于提高重组生物活性的TGF-β2、TGF-β3、其它形式的TGF-β、TGF-β类似物或其它有关蛋白质的产量。

10.2.2.TGF-β1前体残基CYS-223和CYS-225形成链内二硫键。

采用CN βr在蛋氨酸残基处裂解纯化的r TGF-β1前体，所得到的肽通过凝胶渗透色谱纯化。含有CYS的肽被检测，如已描述的（Sueyoshi等人，1985，J.βiochem.（Tokyo）97：1811-1813），并通过反相HPLC被纯化至均质。Edman降解结果表明了CN βr肽在TGF-β1前体顺序中的位置。肽M（134-253）₂含有2个半胱氨酸残基（由氨基酸分析测得），但缺少游离的巯基（在非还原条件下用荧光二硫醇特异性试剂测得）。M（134-253）中的二硫键是由该肽的二聚体特性所推得的。如图33A中所示，在非还原条件下，M（134-253）₃的大小估计是41KDa;在还原条件下，M（134-253）的分子量为24KDa。还原后M（134-253）₂的分子量发生变化可识别出二个连接相同的链的内部亚基二硫链，这与肽M（134-253）₂的单一氨基酸顺序以及通过氨基酸分析测出有2个半胱氨酸残基的结果是一致的。在SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳上观察到的M（134-253）₂的异质性可能反映了在Asn-136和Asn-176的糖基化作用。

10.2.3.变异TGF-β1前体产生生物活性的TGF-β1

生物活性与由免疫印迹测得的24KDa的成熟TGF-β1的量之间有很好的对应关系。在酸活化后，从用质粒p        πH3        M/β1        SE        R-223、p        πH3        M/β1        SE        R-225和p        πH3        M/β1        SE        R-223/225转染的细胞中收集的上清液可产生接近野生型水平的抑制活性（表Ⅺ）。与之相反，p        πH3        M/β1        SE        R-33转染子可产生比p        πH3        M/β1转染子约高3～5倍的活性。这些观察结果与在各别进行转染时，用p        πH3        M/β1        SE        R-33转染的CO        S细胞总是产生比用野生型质粒p        πH3        M/β1转染的细胞高3～5倍以上的抑制活性是相一致的。

表Ⅺ

通过CO        S细胞转染子筛选的生物

活性TGF-β1的量

ng/ml

质粒        +酸        -酸

p        πH3        M.β1        90.3        4.7

p        πH3        M/        β1        SE        R-33        304.8        12.5

p        πH3        M/        β1        SE        R-223        98.4        20.3

p        πH3        M/        β1        SE        R-225        77.9        11.2

p        πH3        M/        β1        SE        R-223/225        87.9        65.3

¹COS细胞用编码TGF-β1及其变异体的质粒转染;转染48小时后，用无血清的培养基取代上清液;72小时后，收集条件培养基并直接用于分析（-酸）或在0.2M乙酸中透析后再分析（+酸）其对于CCL64细胞的生长抑制。

10.2.4.不经酸化的条件下，TGF-β1^S223/225变异体产生生物活性的TGF-β1

由COS细胞合成的r        TGF-β1是以潜伏形式分泌的（表.Ⅺ.）。相似地，由血小板所释放的TGF-β1是一种潜伏型的高分子量复合物（Miyazono等人，1988，J.Biol.Chem.263：6407-6415;Wakefield等人，1988，J.Biol.Chem.263：7646-7654）。

rTGF-β1的活化可以通过酸化来达到。在酸化前，TGF-β1和TGF-β1^S33≥90%无生物活性，而TGF-β1^S223和TGF-β1^S225则为≥80%无生物活性。但是，TGF-β1^S223/225在未经酸处理时至少为70%有活性，在另外的试验中表明酸化前后的活性水平是相等的，这表明对于r TGF-β1的潜伏性来说，TGF-β1前体的前区域是必要的。最近发现，来自血小板的TGF-β1与包括二聚前体前区域和其它蛋白质的复合物是非共价连接的（Miyazono等人，1988，J.Biol.Chem.263：6707-6415;Wakefield等人，1988，J.Biol.Chem.263：7646-7654）。TGF-β1^S223/225前体仅以单体存在（图33E、33F和33G中通道7）;因此，由CYS-223和CYS-225两者的置换所引起的构象变化可能不允许在成熟TGF-β1和它的前体之间进行相互作用而导致潜伏物的产生。

11.实例：TGF-β1前体与类胰岛素生长因子/甘露糖-6-磷酸前体的相互作用

如下所描述的实验证明TGF-β1前体与类胰岛素生长因子（IGF）-Ⅱ/甘露糖G磷酸（man        6        p）受体结合。这些研究部分得到National        Institutes        of        Health        Grant        DK34926的支持并获Republic        Foundation        of        Science，SR        Srbia，Yugoslavia的一项资助。

11.1.材料和方法

11.1.1.材料

重组IGF-Ⅱ由Dr.M.Smith（Eli        Lilly        Co）提供并如已描述那般被碘化（Steele-Perkins等人，1988，J.Biol.Chem.263：11486-11492）。重组TGF-β1前体分别按前面的第8.3部分和9.1.3部分中所述的进行制备和碘化（190Ci/g）。将纯化的潜伏性TGF-β1从血小板中分离出来（Miyazono等人，1988，J.Biol.Chem.263：6407-6415）并在琼脂糖6柱上脱盐。IGF-Ⅱ/man        6P受体和该蛋白质的多克隆抗体如先前所述（Hari等人，1987，EMBO        J.6：3367-3371）。超表达人类IGF-Ⅱ/man6        P受体的CHO细胞如先前对于人IGF-Ⅰ受体所描述的那样制备（Steele-Perkins等人，1988，J.Biol.Chem.263：11486-11492）。抗IGF-Ⅱ/man        6P受体的单克隆抗体由Dr.A.Hasilik（Uni-versitat        Munster）提供。抗TGF-β1的前体顺序的多克隆抗肽抗体（抗81-94残基）如前面第7.1.8部分中所述的制得。

11.1.2受体结合和内在化研究

切下雄性Sprague-Dawley鼠的附睾脂垫，捣碎并用胶原酶消化，如已描述的（Rodberg，1964，J.Biol.Chem.239：375-380）。在具有3%牛血清白蛋白的0.7ml Krebs-Ringer缓冲液（107m M NaCl，5mM KCl、3mM Ca Cl₂、1mM Mg SO₄、7mM NaHCO₃、10 mM葡萄糖和20 mM Hepes，pH 7.8）中，于37℃下，用或不用1μM胰岛素将分离出来的脂肪细胞预孵育10分钟。加入指示标记的配体，培养物在37℃下继续孵育45分钟。用硅油通过离心将细胞从培养基中分离出来，计算细胞层的放射性。

采用经转染的和对照CHO细胞进行的结合和内在化研究是在24号培养板中进行的。洗涤融合的细胞并与在0.3ml结合缓冲液（100mM Hepes，pH 7.6、120mM Na Cl、1.2mM Mg SO₄15mM乙酸钠、5mM葡萄糖）中的标记配体一起在4℃下孵育5小时。然后，将细胞洗涤两次，用0.1%十二烷基磺酸钠溶解之并计数。为了进行内在化研究，将标记配体加入在含有0.1%牛血清白蛋白20 mM Hepes（PH 7.6）的无血清Ham′s F-12培养基中的细胞中。在37℃下，经过指定的一段时间后，将细胞置于冰块上并用含有0.3mMCa Cl₂的预冷Hepes缓冲盐洗涤。为了测定耐酸分部（即内在化的配体），将细胞在4℃下，与0.2MCH₃COOH、0.5MNa Cl，pH3.0孵育5分钟（Haigler等人，1980，J.Biol.Chem.255：1239-1240）。然后如上所述洗涤细胞，溶解并计数。

结合研究也可以用经分离的IGF-Ⅱ/man        6P受体进行（Purchio等人，1988，J.Biol.Chem.263：14211-14215）。为了进行这些研究，经纯化的受体吸附在已用100nM特异性抗人IGF-Ⅱ/man        6P受体的单克隆抗体（2        C2）包被的微量滴定井中（Braukle等人，1987，J.Cell.Biol        104：1735-1742）。然后，在已知浓度的竞争配体存在下，在4℃，经标记的重组TGF-β1前体与受体一起孵育3小时。然后洗涤井，切下并计数。

11.1.3.Western        Blot分析

将纯化的重组和来自血小板的TGF-β1前体在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（12.5%）还原凝胶上电泳。将样品转移到硝基纤维素滤纸（Schleicher和Schuell）上，然后，滤纸在阻断溶液中（3%牛血清白蛋白和0.1%Triton        X-100在Tris-缓冲盐水中，PH7.5），在24℃下孵育30分钟。然后滤纸与1）抗TGF-β1前体顺序的兔抗肽抗体（1∶100稀释）（10）;或2）先与纯化的IGF-Ⅱ/man        6P受体，然后用抗该受体的多克隆抗体，在4℃下孵育过夜（Hari等人，1987，EMBO        J        6：3367-3371）。洗涤四次后，在4℃下，滤纸与结合碱性磷酸酶的抗兔Ig（1∶5000，Promega）一起孵育1小时，洗涤，然后用磷酸酶底物显色（Promega）。

11.2.结果

11.2.1.重组TGF-β1前体与脂肪细胞上的IGF-Ⅱ/man        6P受体结合并且是内在化的。

¹²⁵Ⅰ-IGF-Ⅱ和重组TGF-β1前体与初级大鼠脂肪细胞的结合可采用加或不加用胰岛素预处理来进行。如先前所报道的（OKa等人，1985，J Biol.Chem.260：9435-9442;Appell等人，1988，J.Biol.Chem.263：10824-10829），胰岛素会引起IGF-Ⅱ与脂肪细胞的特异性结合增加2～3倍（平均＝2.4±0.3，n＝4）（图35A）。如图35B中所示，胰岛素也会引起重组TGF-β1与脂肪细胞的结合类似地增加（平均＝2.7±0.3，n-4）。采用3mM man6 P，TGF-β1前体与对照的结合以及与经胰岛素处理的脂肪细胞的结合分别被抑制65%和81%（图35B）。这些结果表明重组TGF-β1前体与在脂肪细胞上的IGF-Ⅱ/man        6P受体结合。

另外的结合研究采用CHO细胞系进行，所述的CHO细胞用编码IGF-Ⅱ/man        6P受体（Morgan等人，1987，Nature        329：301-307）的c        DNA转染，并被选出超表达受体蛋白。这些经转染的细胞比亲代CHO细胞特异性地结合IGF-Ⅱ多10倍以上（图36A）和结合重组TGF-β1前体多15倍以上;TGF-β1前体的结合基本上被man        6        P抑制（图36B）。man        6        P的抑制是剂量依赖性的，在10        μM时可观察到最大抑制作用的一半。（图37A）。甘露糖-1-磷酸在抑制TGF-β1前体的结合上的效果至少要低1，000倍（图37A）。前体与转染的细胞的结合也可以被未标记的TGF-β1前体所抑制，但不被成熟的TGF-β1抑制（图37B）。100nMIGF-Ⅱ对前体TGF-β1结合的抑制率为34%。

对结合后的TGF-β1前体在经转染的细胞中内在化的能力也进行了试验。在37℃放置不同的时间，通过酸洗细胞除去细胞表面的TGF-β1前体并测定耐酸的（即内在化的）TGF-β1前体（Hagler等人，1980，J，Biol        Chem.255：1239-1241）。15分钟后，在耐酸区发现75%以上的特异性结合TGF-β1前体（图38）。20分钟后，观察到总结合量和内在化的量进一步增加，这似乎是由非特异性结合引起的，因为man        6P不能阻碍这个增加（图38）。

11.2.2.甘露糖-6-磷酸存在于潜伏性TGF-β1中

为了测定从血小板中分离出来的潜伏性TGF-β1是否也会有man        6P，对高度纯化的血小板TGF-β1前体进行了测试，测试其抑制标记重组TGF-β1前体和分离的IGF-Ⅱ/man        6P受体结合的能力。发现潜伏性血小板TGF-β1复合物是这种结合的有效抑制剂，在约0.2nM的剂量下，可达到最大值抑制的一半（图39）。

为了进一步检查血小板TGF-β1复合物中存在的man        6        P，将这些材料在SD        S-聚丙烯酰胺还原凝胶上电泳，并将其转移至硝酸纤维素膜上，相继与纯化的IGF-Ⅱ/man        6P受体、抗受体的兔抗体、结合碱性磷酸盐的抗兔Ig和碱性磷酸酶的组织化学染色剂一起孵育。尽管用该技术可以检测在未裂解的重组TGF-β1前体中的man        6        P（图40，带a）和前体残余物中的man        6        P（图40，带b），但对血小板TGF-β1，未检测到合适的分子量带。在对照实验中，一个特异性抗TGF-β1前体顺序的抗体可检测血小板TGF-β1前体残余物（图40，带c）。

12.TGF-β1前体上糖的功能的实例分析

下面的研究旨在检查在成熟TGF-β加工中pre-pro-TGF-β1的糖表位的重要性。结果证明低聚糖加入和重新组合在TGF-β1分泌过程中起必不可少的作用，但是，它对于pre-pro-TGF-β1的特异性蛋白质水解则不起作用，结果还证明，TGF-β1前体的蛋白质水解过程是在胞内酸性泡囊中发生的。

12.1.材料和方法

12.1.1.材料

糖基化作用的抑制剂八氢吲嗪三醇（SW），衣霉素（TU），栗精胺（CA）、脱氧人野尻霉素（deoxymannojirimycin）（dMM）和脱氧野尻霉素（dN）以及糖基化修饰酶内糖苷酶H（endo        H）和唾液酸苷酶是从Boehringer-Ma        nheim        Biochemicals，Indianapolis，I.N.购得的。N-聚糖酶是从Genzyme，Bosten，MA得到的。二磷酸氯喹、莫能菌素和二乙基氨基乙基葡聚糖（DEAE-dextran;500，000        MW）是从Sigma        Chemical        Company，St.Louis，MO购得的。N-血清（Nuserum）是从Collaborative        Research，Lexington，MA得到的。所有其它细胞培养剂均购自GIBCO        Laboratories，Grand        Island，NY.（35-s）-L-半胱氨酸和（35-S）-L-蛋氨酸是由NEN        Research        Products，Boston，MA生产的，并分别具有＞600和＞800ci/mM的比活性。（32-P）-正磷酸盐（无载体）得自ICN        Biomedicals，Costa，Mesa，CA。限制酶和其它DNA修饰酶是从Bethesda        Research        Laboratories，Bethesda，MD得到的。

12.1.2.细胞培养

CHO-TGF-β3-2000细胞（克隆17）如前面第7.1.1.部分所述的生长和传代。CO        S-1细胞（ATCC        CRL        1650）在添加了10%胎牛血清、100        U/ml青霉素和100        μg/ml链霉素的Dulbe-cco改良Eagles培养基（DMEM）中生长并通过胰酶消化而传代。

12.1.3.分泌的TGF-β1的代谢标记和分析

TGF-β3-2000细胞在含有2ml完全培养基的35mm培养皿中生长至融合。然后用缺乏蛋氨酸、半胱氨酸和血清的培养基代替完全培养基培养1小时。然后用浓度各为100        μci/ml的（35-S）-蛋氨酸和（35-S）-半胱氨酸标记细胞0.5小时。标记后，细胞用Hanks平衡盐溶液洗涤三次，然后置于无血清的完全培养基DMEM中追加。在上述的全部培养过程中，在组织培养基中存在糖基化作用抑制剂、弱碱或离子载体。上清液在SD        S-PAGE样品制备缓冲液中煮沸后，通过SD        S-PAGE直接分析。采用梯度为7.5-20%的丙烯酰胺凝胶。

为了进行（32-P）磷酸盐标记，将细胞在含有1ml磷酸盐和无血清DMEM的35mm培养皿中培养1小时。用1mci/ml的（32-P）-正磷酸盐标记细胞6小时。收集无细胞培养基，过量的（32-P）磷酸盐通过在用50        mM碳酸氢钠平衡的10ml        Sephadex        G-25柱中脱盐而除去。收集具有放射性的最前面的3个0.75ml分部，冻干，将冻干的沉淀溶解于100        μl样品制备缓冲液中，取出10        μl进行SD        S-PAGE和放射自显影分析。

12.1.4.用SD        S-PAGE对TGF-β1定量

在培养上清液中TGF-β1的量是在SD        S-聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶荧光X线照相后，通过光密度计来测定的。在大多数情况下，成熟TGF-β1与前体形式的量的比例是不变的。因此，所观察到的成熟的12KDal        TGF-β1的量可用于测量所分泌的全部生长因子。

为了测量加工过程中量的变化，在光密度计测量后，通过计算所有三种形式的重组生长因子的总和并对各种处理细胞的分泌水平进行标准化换算，来测定所分泌的TGF-β1的总水平。然后计算成熟的12KDal        TGF-β1的相对量以确定蛋白质水解加工的水平。

12.1.5.用糖基化修饰酶消化

用糖基化修饰酶处理以（35-S）-半胱氨酸和（35-S）-蛋氨酸标记的条件培养基。在37℃下，用5mU        endo        H或25mU唾液酸苷酶处理培养基（23        μl）过夜。在30℃下，用N-聚糖酶进行消化，采用1.25U的酶。在所有情况下，总的反应体积是35        μl。endo        H和唾液酸苷酶反应缓冲液分别是包括25mM        Tris-HCl、0.2%        SD        S（W/V）（pH5.7），以及50m        M乙酸钠、2mM氯化钙、0.2mMEDTA（pH4.6）。N-聚糖酶消化是在由10        mM        EDTA、0.2%        SD        S（W/V）、0.1        M2-巯基乙醇和1%诺乃洗涤剂-P40（V/V）（pH7.5）组成的最终缓冲液组合物中进行的。消化后，将样品与等体积的2X-SD        S样品制备缓冲液混合，用SD        S-PAGE分析16        μl等分试样。

12.1.6.TGF-β1的Sa（Ⅱ缺失突变体的制备和插入CDM8载体

亚克隆进pUC19的TGF-β1        c        DNA被用于缺失突变。用Sac        Ⅱ酶切质粒DNA并重新连接移去了TGF-β1        cDNA的编码区的480个核苷酸形成具有一个框架内缺失的质粒DNA。用Eco        RI酶切所得到的质粒，用DNA多聚酶I的Klenow片段修复平头，然后再用Hind        Ⅱ酶切之。将该片段插入CDM8表达质粒。

用Not        Ⅰ酶切CDM8表达质粒DNA（Seed，1987，Nature        329：840-842），并用Klenow酶修复纯化末端。然后用Hind        Ⅱ消化DNA并采用Geneclean将其在琼脂糖凝胶中分离。然后将野生型TGF-β1cDNA和Sac        Ⅱ缺失突变体的Hind        Ⅲ-EcoR        Ⅰ（平头）片段连接到Hind        Ⅲ-Not        Ⅰ（平头）CDM8载体中。经CsCl纯化的DNA被用于表达研究。

12.1.7.在COS细胞中的瞬时表达

在COS-1细胞中的瞬时表达是通过DEAE-葡聚糖-氯喹转染方式来完成的，如已描述的（Cullen，1987，Meth.Enzymol        152：684-704）。简单地说，在加入DNA之前，先将在35mm培养皿中生长的COS-1细胞的半融合培养物在含有10%        N-血清（Nuserum）的DMEM中孵育1-2小时。转染混合剂是通过在10mg/ml的DEAE-葡聚糖无菌溶液中缓慢加入经CsCl纯化的DNA而制备的，最后的浓度为0.2mg        DNA/ml。然后将DEAE-葡聚糖/DNA混合物（100        μl）加入细胞中至最终浓度为10        μg        DNA/ml。然后再加入氯喹至最终浓度为100        μg/ml，在37℃下与细胞一起孵育3小时。之后除去含有DNA/DEAE-葡聚糖/氯喹的培养基，用在磷酸缓冲盐水中的2ml10%的二甲基亚砜（V/V）处理细胞。室温下2分钟后，将细胞用磷酸缓冲盐水中洗涤2次，并在完全DMEM生长48小时。

为了对表达TGF-β1进行免疫印迹分析，将无血清培养基加入细胞中，收集48小时时的培养基并在0.4%乙酸中透析。将经透析的培养基冻干，溶解于30        μl样品制备缓冲液中，取出5        μl作免疫印迹分析。经转染的细胞也用免疫印迹分析。收集无血清培养基后，刮挖收集细胞，往每一个体积的SD        S-样品制备缓冲液中加入一个体积的细胞。煮沸5分钟后，用免疫印迹法分析2        μl溶胞产物。

12.2.结果

12.2.1.衣霉素抑制来自转染CHO细胞的重组TGF-β1的分泌

在设计来说明在pre-pro-TGF-β1的转运和分泌中糖基化加工的功能作用的初步实验中，用衣霉素（TU）处理转染CHO细胞，衣霉素是一种核苷抗生素，它可防止低聚糖进入新生的多肽链（Tacz和Lampen，1975，Biochem.Biophys.Res.Commun.65：248-257），并分析了条件培养基和用于表达TGF-β1的细胞。图41显示了采用免疫印迹法检测在培养基或细胞中的TGF-β1蛋白质所得到的结果。对照细胞的培养基在还原条件下，在SD        S凝胶上分级分离显示出有三种形式的重组TGF-β1（参见第7部分等）存在。44-56KDal多肽代表pro-TGF-β1（图41中以“a”示之），30-42KDal蛋白质与前体的前区域相对应（在图41中以“b”示之），12KDal形式则代表成熟的，经适当加工的TGF-β1（图41中以“c”示之）。但是，用衣霉素处理CHO细胞24小时，未显示出能释放可测定水平的免疫反应性TGF-β1。

在对照细胞中TGF-β1的主要胞内形式显示在与部分糖基化的生长因子相应的位置上迁移。只有当增加量用于免疫印迹的细胞溶胞产物量时，在细胞内可测得很低水平的经加工的TGF-β1多肽。在TU处理后，发现TGF-β1肽的主要胞内形式的大小与未糖基化的前体相应。与对照细胞相比较，在经TU处理的细胞中该TGF-β1前体的水平始终较高，这很可能表明这种形式的前体在经处理的细胞内积聚。这些结果有力表明糖基化对分泌是重要的，没有它，可能会导致在细胞内形成重组TGF-β1。

12.2.2        CHO转染子分泌TGF-β1的时间过程

重组TGF-β1从转染CHO细胞株中分泌的速率和程度是通过用（35-S）-蛋氨酸和（35-S）-半胱氨酸脉冲标记，并追加不同的时间而测定的。收集培养基，并通过SD        S-PAGE分级分离，然后荧光X线照相。结果示于图42A中。三种重组形式的TGF-β1在条件培养基中是逐渐出现的，因而在实验过程中分泌的速率是较平缓的。成熟TGF-β1的量与前体形式的量的比率不变，表明蛋白质水解加工完全依赖于分泌，并且很有可能是在胞内发生的。

图42B显示了扫描荧光X线照相所测定的对应于三个独立的脉冲追加实验的TGF-β1分泌定量评价。在约1.5小时的分泌时间滞差后，TGF-β1多肽由CHO细胞迅速地分泌，6小时后，可测得50%以上的分泌重组蛋白质。该1.5小时的时间滞差比所报导的其它多肽时间滞差要长一些，这个差异可能反映了糖基化加工速率或所依赖的细胞类型的不同（Bauer等人，1985，Biochem.Biophys        Res.Commun        128：308-375;Leford和Davis，1982，J.Biol.Chem.258：3304-3308;Lodish等人，1984，J.Cell.Biol.98：1720-1729）。追加20小时后，在CHO条件培养基中测得的重组物质的分泌水平开始平稳。6小时这一点被选作进一步的研究，因为在这个时间时，50%以上的重组物质已经分泌了（图42）。

12.2.3.糖基化或糖基化加工的抑制剂影响分泌r        TGF-β1的水平

为了进一步阐明糖基化对于由CHO细胞产生的TGF-β1的加工和分泌的作用，用几种糖基化作用的抑制剂处理转染细胞并测试它们对于重组生长因子分泌的影响。除衣霉素外，还使用了四种影响正在延长的低聚糖侧链的末端加工的抑制剂。在加入核心低聚糖后，栗精胺（CA）和脱氧野尻霉素、（dN）干扰在内质网中葡萄糖残基的起始修饰（Heltkamp等人，1982，Biosci.Rep.2：899-906;Saunier等人，J.Biol.Chem.257：14155-14161;Schwartz和Datema，1984，Trends        Biochem        Sci.9：32-34）。另一方面，八氢吲嗪三醇（SW）和脱氧人野尻霉素（dMM）可分别抑制高尔基体的甘露糖苷酶Ⅰ和Ⅱ（Elbein等人，1984，Arch.Biochem.Biophys.235：579-588）Tulsiani等人，1982，J.Biol.Chem.257：7936-7939）。

用抑制剂处理来自表达TGF-β1的CHO细胞的条件培养基的荧光X线照相示于图43A中。用抑制剂预处理CHO细胞1小时，然后脉冲标记并追加。6小时追加后，收集上清液。TU可大量减少TGF-β1的分泌，与图41中所示的结果相一致。CA和dN对内质网中葡糖苷酶活性的抑制也会明显地减少分泌。与之相反，用高尔基体的甘露糖苷酶活性抑制剂dMM或SW所处理的细胞可略微增加分泌。

图43B显示了从三个分别的实验中得到的结果的概括。TU、CA和dN存在下，分泌水平是在对照细胞中观察的水平的5-15%。SW和dMM引起分泌水平的增加，重组蛋白质增加约30%。实验时间过程显示与对照细胞有相似的分泌速率，表明通常只是分泌的增加或减少，而不是速率的变化。此外，TGF-β1的特异性蛋白水解加工不会改变随后的抑制剂处理过程。在所有情况下，即使是缺乏糖类（图43A以“TU”示之）时，pro-TGF-β1（图43A中以“a”示之）与TGF-β1加工后形式（图43A中以“b”和“c”示之）的比率相似是明显的。这些结果表明只要维持葡萄糖残基的起始修整完全重新组合TGF-β1低聚糖侧链对分泌不是必需的，低聚糖的完整性对于pre-pro-TGF-β1的蛋白质水解加工是不重要的。

12.2.4.TGF-β1低聚糖侧链的结构

对存在于经抑制剂处理的CHO细胞分泌的TGF-β1多肽中的糖基的性质进行研究。收集来自具有或不具有抑制剂的脉冲标记CHO的条件培养基，并用N-聚糖酶、endo        H和唾液酸苷酶处理。结果示于图44中。能除去所有N-连接的糖的N-聚糖酶会引起TGF-β1前体多肽“a”和“b”在还原SD        S凝胶上共同迁移，而不论是否经抑制剂处理。如所期望的，对照处理细胞对endo        H（一种可除高甘露糖型低聚糖链的葡糖苷酶）基本不敏感，这就证实了所推侧的复合糖结构。但是用Endo处理得自抑制剂处理的CHO细胞的上清液发现在采用dMM的情况下，TGF-β1前体的侧链被完全除去，而采用CA、dN和SW处理时，酶只有部分敏感。唾液酸苷酶处理发现dMM、CA和dN不含明显的唾液酸化残基。但是，用SW处理发现在这些条件下所得到的TGF-β1前体多肽在其低聚糖侧链中含有大量的唾液酸组分。

12.2.5.从抑制剂处理的CHO细胞中释放的TGF-β1前体多肽的甘露糖-6-磷酸

TGF-β1前体可以容易地用（32-P）-正磷酸盐进行标记，这种掺入是由于甘露糖残基的磷酸化产生甘露糖-6-磷酸;磷酸化作用发生于生长因子前体的最前面两个糖的侧链中（前面，第9部分）。因为通过用抑制剂处理而进行的糖基化途径的修饰可能影响前体的甘露糖-6-磷酸化作用，用（32-P）-正磷酸盐标记细胞并检查TGF-β1前体多肽被标记的能力（图45）。来自用SW和dMM处理的细胞的TGF-β1前体中主要的磷酸化作用是明显的。而CA和dN的作用则不太明显，这是因为TGF-β1多肽的分泌减少了。但是，在较长一段时间曝光后发现（32-P）标记出现在与前体共同迁移的蛋白中。因此，用抑制剂处理CHO细胞不影响TGF-β1多肽甘露糖-6-磷酸的磷酸化作用。

12.2.6.缺失诱变研究

为了进一步提供有关糖基化作用对重组TGF-β1蛋白质分泌的作用的证据，删除前体的一个大的部分，产生了一个缺少所有三个糖基化位点的框架内突变体。图46A显示了用于＜＠缺失的方法。用Sac        Ⅱ酶切DNA并重新连接而去除TGF-β1的前区域内160个氨基酸。重新连接是在Arg-50和Gly-211之间进行的，被称为△51-210        TGF-β1。然后将缺失突变体置于表达载体CDM8（Seed，1987        Nature        329：840-842）中CMV启动子的下游，如所示的（图46A）。

采用一个瞬时表达系统将突变DNA转染进CO        S-1细胞，通过免疫印迹来检查TGF-β1分泌的水平（图46B）。含有野生型TGF-β1的表达载体在CO        S-1细胞中表达，并导致三种形式的重组生长因子多肽的分泌（图46B，2道）。免疫印迹也发现对照物呈现出这些形式（图46B，3道）。与之相反，在用缺失突变体转染的CO        S-1细胞的上清液中未观察到可测定水平的TGF-β1。在对照细胞中，少量TGF-β1前体在胞内被观察到;这些结果与前面实验（图41）中得到的结果是相似的。对于△51-210        TGF-β1转染子来说，一种大小与预计的该缺失突变体相应的约20KDal的免疫反应性蛋白质在这些转染子转染的CO        S-1细胞中胞内表达。上述结果表明△51-210        TGFβ1不能由细胞有效地分泌，在胞内积聚。尽管相当大部分的TGF-β1前体由于缺失而除去了，TGF-β1分泌的不足与抑制剂处理的结果是一致的，它暗示IGF-β1前体的糖类表位有重要的胞内靶子作用。

12.2.7.在酸性泡囊中的胞内蛋白质水解加工

为产生成熟TGF-β1而进行的TGF-β1前体在碱性残基上的蛋白质水解加工很可能是在细胞内发生的。为了检测参与TGF-β1加工的蛋白酶的性质，用弱碱或一价离子载体处理转染CHO细胞。两种试剂均能增加泡囊内的pH，使之从酸环境而变为接近中性的环境，每一个都会影响转运过程或蛋白质水解加工（Devault等人，1984，J.Biol.Chem.259：5146-5151;Mellman等人，1986，Ann.Rev.Biochem.55：663-700;Poole等人，1981，J.Cell        Biol.90：665-690;Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.146：1332-1345;Tartakoff和Vassalli，1978，J.Cell.Biol.79：284-299）。用这些试剂处理转染CHO细胞1小时，然后进行脉冲标记，并在含有这些试剂的无血清完全培养基中追加6小时。然后通过SD        S-PAGE分析条件培养基;相应的荧光X线照相示于图47A。弱碱性的氯化按、氯喹以及离子载体莫能菌素会大大降低TGF-β1前体中观察到的蛋白质水解加工的程度，另一方面，TGF-β1分子分泌的总水平不受或仅略微受到这些试剂的影响。令人感兴趣的是，羧酸离子载体莫能菌素显示出能阻止浆细胞分泌免疫球蛋白（Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.146：1332-1345;Tartakoff和Vassalli，1978，J.Cell.Biol.79：284-299）。

图47B显示了为了对这些效应定量而进行的三个分别的实验。因为仅观察到对于分泌有轻微影响，我们将用SD        S凝胶荧光X线照相的光密度扫描计在脉冲追加实验中观察到的总的TGF-β1相加，对从CHO细胞中释放的重组TGF-β1的总水平进行标准化换算。标准化以后，测定所分泌的成熟TGF-β1的量，它表明了蛋白质水解加工的水平。氯化铵在这些实验中所使用的浓度下产生的影响最弱，显示出对照值的约70%的裂解效率。另一方面，氯喹和莫能菌素能大大地降低加工的水平，降至约为对照物的20%。这些结果有力表明，产生成熟TGF-β1的前体的蛋白质裂解是由一个具有酸性最佳pH的蛋白酶完成的。

其它的报导也已指出上述试剂可能影响糖基化作用（Mellman等人，1986，Ann.Rev.Biochem.55：663-700;Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.146：1332-1345;Tartakoff和Vassalli，J.Cell.Biol.79：284-299;Thorens等人，1986，Nature        321：618-620）。事实上，图47A表示了莫能菌素和氯喹可能会改变低聚糖侧链的结构，因为蛋白质在SD        S凝胶上的迁移有所不同。为了对此进行进一步的研究，我们采用葡糖苷酶来分析分泌的TGF-β1前体的糖结构（图48）。在所有情况下结果是相似的;经处理的样品对N-聚糖酶、endo        H和唾液酸苷酶呈现出相同的敏感性，如经处理的对照物一样。用唾液酸苷酶消化后，TGF-β1前体蛋白质的迁移不变。因此，由莫能菌素和氯喹引起的TGF-β1前体的电泳迁移的变化很有可能是由于唾液酸化程度的变化所引起的。该结果与其它一些已注意到用这些作用剂处理后，末端糖基化作用发生改变的报导是一致的（Tartakoff和Vassalli，1977，J.Exp.Med.146：1332-1345;Tartakoff和Vassalli，1978，J.Cell.Biol.79：284-299：Thorens等人，1986，Nature        321：618-620）。此外，莫能菌素处理的培养株仍能将（32）-P-正磷酸掺入前体分子中表明泡囊内的pH不影响甘露糖残基的磷酸化作用。用莫能菌素和氯喹处理后所观察到的糖结构的微小变化不可能影响蛋白质水解加工，因为能大大地改变糖类侧链结构的葡糖苷酶修饰抑制剂对TGF-β1蛋白的水解加工尚不会有显著的作用。

13.实例：人类巨噬细胞分泌的潜伏性TGF-β1的r干扰素诱导活化作用

13.1.材料和方法

13.1.1.潜伏性TGF-β1的纯化

表达潜伏性r        TGF-β1（Ln        TGF-β1）的CHO细胞株（1.4mg/l）在低浓度血清（0.2%）中生长，接种24小时后收集上清液。上清液通过低速离心使之澄清，蛋白质用硫酸铵沉淀（80%饱和，pH7.2）。将沉淀物重新悬浮于冷的磷酸缓冲液（PB        S）中，在4℃下充分透析2天。将含有6.2mg蛋白质的样品装入在PB        S        100-200        ME        SH中平衡的P-100柱（Bio        Rad）中。在这个柱中，无活性的Ln        TGF-β1从残余的活性TGF-β1中分解出来，通过观察染成银色的SD        S-PAGE凝胶而定位（Blobel和Dobberstein，1975.J.Cell.Biol.67：835-851;Morrissey，1981，Analyt.Biochem.117：307-310），然后如在CCL-64水貂肺上皮细胞生长抑制试验（QIA）（前面第7.1.6部分）中所述的检测酸活化。

简单地说，将细胞在96井组织培养板（Falcon 3072）中，在每μl含有10%胎牛血清的DMEM中有3×10³个细胞的浓度下进行培养。TGF-β标准物试验在0.2M乙酸中进行，且在12×75mm的无菌试管（Falcon 2063）中冻干。将冻干的样品重新悬浮于含有10%胎牛血清的DMEM中，在平板培养5小时后，将50 μl样品加入测试井中一式三份（未经酸化的样品不需处理即可测试）。在37℃下，在湿润的5%CO₂-95%空气的环境下培养72小时后，往50μl培养基中加入[¹²⁵I]Id Udr（Amersham IM 355）（1μCi/ml）。再将细胞培养24小时，然后用PB S洗涤一次，在200 μl甲醇中固定10分钟，空气干燥15分钟。在65℃下将细胞溶解于200 μl1M NaOH中，历经20分钟，采用Titertek Supernatant Collection System（Flow Laboratories，78-210-05）收集标记物质。生长的抑制-刺激以经处理细胞中[¹²⁵I]Id Udr掺入的减少或增加的百分数来表示，以未经处理的细胞的掺入情况作对照。

13.1.2.潜伏性TGF-β1活化试验

从分级分离的新鲜人血中制得单核细胞，活化之，并将其接种至Dulbecco′s改良Eagle′s培养基（DMEM）中（2×10⁶个细胞/ml）。在纯化的浓度为5 μg/ml的Ln TGF-β1和/或重组r干扰素（rr INF），100U/ml（AMGEN）存在或不存在下，将培养物在37℃下培养24小时。收集上清液，通过低速离心使之澄清，在干冰中冰冻，然后连续稀释，一式三份用于生长抑制试验。（GIA）。采用由纯化的血小板TGF-β所产生的标准GIA曲线来测定TGF-β的GIA值。

13.2.结果

表Ⅻ显示了在中性PH下纯化的TGF-β前体呈现出最小的生物活性（即使在浓度为1        μg/ml时）。但是，用乙酸进行瞬时预处理能活化约7.5%（以重量计）的前体，即250ng酸化前体可产生18.7ng活性TGF-β以摩尔为基准的话，则相当于40%活化。SD        S-PAGE分析证实经酸活化的分子的质量与天然TGF-β（24        Kd）相同，初步顺序研究表明残余的未活化的TGF-β前体复合物是在前体和成熟TGF-β等二聚体中的半胱氨酸残基之间的假二硫键形成的结果（Marquardt等人，正在印刷中）。将这种纯化的多聚蛋白作为成熟外源TGF-β前体，我们检测了各种培养细胞活化和将TGF-β释放入培养上清液中的能力。采用几个已建立的淋巴细胞系，包括HUT-78、CEM和单核细胞衍生的系，U937，未观察到活化。类似地，新鲜培养的人体B和T细胞则显示了很小的（如果有的活）活化作用。

表Ⅻ

潜伏性TGF-β1的酸活化

重组潜伏性TGF-β        TGF活性

（生长抑制）、

ng/ml        ng/ml

预处理

无        酸

10        0        0.6

100        0        9.2

250        ＜0.5        18.7

1000        6.0        80.14

表Ⅻ中所示的结果表明在100 U/mlr γINF和5 μg Ln TGF-β1存在时，培养的人体单核细胞能活化潜伏性TGF-β1。人体外周血单核细胞释放很少量的活化TGF-β1＜0.1 pM/ml培养上清液）。用5 μg Ln TGF-β1与单核细胞培养24小时可引起一些基本的活化（约0.1pM/ml，每1×10⁷个细胞）。但是，在100 U/mlr γ-INF和5 μg Ln TGF-β1存在下培养的单核细胞会大量地增加上清液中可测得的活性TGF-β的量。活化的程度很大，为2.1-2.5pM TGF-β/ml，它等于单独用酸处理时所得到的量的一半（实验1和2中，细胞素/酸的活化比率分别为0.42和0.50）。单独用r γ-INF处理的单核细胞的对照培养不会引起主要由一些培养的单核细胞所释放的内源潜伏性TGF-β的任何明显的活化（0.2-0.4 pM/ml）（Assoian等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：6020-6024）。活化量与加入的底物Ln TGF-β1的量是成正比的，在10 μg/ml底物浓度时，用10⁷个单核细胞和100 μ/mlr γ-INF达到饱和。活化作用的动力学证明用带有r        γ-INF的Ln        TGF-β培养7～8小时后，TGF-β1的加工和释放达到最大，这表明加工过程可能需要γ-INF诱导的基因转录，可能包括加工过程酶基因（一个或多个）的转录。

表ⅩⅢ

由人体单核细胞释放的Ln        TGF-β1的

γ-干扰素诱导的活化作用

活化的TGF-β        活化率

Pmole/ml        细胞素/酸＊

实验        实验

Ⅰ        Ⅱ        Ⅰ        Ⅱ

单独的单核细胞        ＜0.1        0.4        -        -

单核细胞⁺γINF 0.2 0.4 - -

单核细胞⁺γINF

单核细胞⁺γINF 2.1 2.5 0.42 0.50

⁺Ln TGF-β1

单核细胞⁺Ln

TGF-β1        0.1        ＜0.1        -        -

＊在22℃下，在1M乙酸中2小时

如图49中所示，单核细胞对Ln TGF-β1的活化作用取决于所用的γ-INF的剂量。采用小至10单位/ml的r γ-INF就可观察到可测定的反应（由GIA测得为10ng/mlrTGF-β）。前面的实验（表ⅩⅢ）是在100 U/mlr γ-INF（释放20ng/ml TGF-β）的剂量下进行的，它能达到最大的饱和值，即1000U/mlr γ-INF。在一个另外的实验中，重组IL-2能刺激新鲜的人体T细胞来加工Ln TGF-β1，但是，与用r γ-INF处理的单核细胞所观察到的结果相比，反应是弱的（0.5pmoles/TGF-β/2×10⁶个细胞/单位γIL-2）。

进行了几个实验以确定从经r        γ-INF处理的单核细胞培养物中得到的Ln        TGF-β1依赖型TGF-β的抑制生长的活性是否真的是TGF-β活性。TGF-β最先被分离，因为它会刺激正常的大鼠肾细胞（NRK）在存在少量EGF或TGF-α的软琼脂上长成菌落。如图50中所示，酸纯化的天然TGF-β1和EGF两者对于刺激NRK细胞菌落的生长均是需要的（120个菌落/8个随机低倍镜视野）。收集经r        γ-INF处理的单核细胞的培养上清液（未经酸化）与TGF-β1一起培养也能有效地诱导NRK细胞菌落形成;1和100ng单核细胞激活的γTGF-β1分别刺激90和190个NRK菌落的生长。当在抗牛骨衍生的TGF-β1的中性的单克隆抗体存在下进行试验时，发现NRK菌落的形成被抑制了（当TGF-β浓度为100ng/ml时，有90%抑制）。菌落生长受mAb抑制的程度取决于进行分析时加入的TGF-β1起始浓度。

用³H-亮氨酸与表达Ln TGF-β1的CHO细胞孵育过夜，标记后的TGF-β1前体复合物如材料和方法中所述的纯化。在无血清条件下，用r γ-INF处理的和未经处理的单核细胞与³H-亮氨酸标记的Ln TGF-β1一起培养，收集上清液并在非还原条件下，通过SD S-PAGE进行分析。结果示于图51中。除110 Kd TGF-β1前体外，还看到一条与存在于经r γ-INF处理的培养物的上清液中的24Kd TGF-β标准物共同迁移的带（A道）。该带不如用³H-亮氨酸Ln TGF-β1单独与单核细胞培养的上清液中的带（B道）明显。

这些结果表明γINF能有效地诱导人体单核细胞来介导活性TGF-β从潜伏性重组TGF-β复合物中释放。释放到外源性加入Ln        TGF-β1（的培养物）的上清液中的TGF-β与TGF-β1的功能是相同的（mAb可中和NRK菌落形成），并且其质量（SD        S-PAGE）也与在酸性PH下纯化后，从血小板和骨中分离的天然TGF-β相同。

14.微生物保藏

下面的转化子已保藏至American        Type        Culture        Collection，Rockville，Md，并已得到保藏号

转染体        质粒        保藏号

CHO-TGF-β-3/2000        p        SV2-β-TGF        CRL9434

本发明并不局限于所保藏的细胞系范围，因为保藏的具体例子只是列举了本发明的一个方面，任何功能相当的微生物均在本发明的范围内。事实上，除这里所示的和描述的以外，本发明的各种修饰对于该领域的技术人员来说，从前面的描述和附图中都将变得十分明显。但这些修饰均将落入附加的权项的范围。

也应该看到，所给出的碱基对和氨基酸数以及核苷酸和肽的大小均是大约的，只是用于说明的目的。

Claims (51)

1、一种制备转化的生长因子-β1的方法，其特征在于它包括：

a)培养含有编码猴转化生长因子-β1的核苷酸顺序的真核细胞，此顺序在调整基因表达的第二个核苷酸顺序的控制下，由此由真核细胞生产一种具有转化生长因子-β1活性的肽或蛋白质；和

b)从培养物中回收转化生长因子-β1。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于编码猴转化生长因子-β1的核苷酸顺序基本上包括图1中所示的1-1173号核苷酸的核苷酸顺序。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于编码猴转化生长因子＝β1的核苷酸顺序基本上包括图1中所示的1-1173号核苷酸，但其中编码33号氨基酸残基密码子被改变为“AGC”。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于真核细胞包括中国仓鼠卵巢（Chinese        Hamster        Ovary）细胞。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于控制基因表达的第二个核苷酸顺序包括一个SV40启动子。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于第二个核苷酸顺序包括一个启动子和一个编码真核细胞中缺乏的可选择标记的顺序，这样，含有猴转化生长因子-β1编码顺序的真核细胞可以被识别。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于可选择的标记包括二氢叶酸还原酶。

8、如权利要求7所述的方法，其特征在于它还包括将真核细胞暴露至氨甲蝶呤中，这样可选择出含有放大水平的编码二氢叶酸还原酶和猴转化生长因子-β1的编码顺序的抗性菌落。

9、如权利要求8所述的方法，其特征在于真核细胞包括二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞。

10、一种制备转化生长因子-β1的方法，其特征在于它包括：

a）培养保藏于ATCC中并获得保藏号CRL9434的转染子CHO-TGF-β1-3/2000;和

b）从培养物中回收转化生长因子-β1。

11、如权利要求10所述的方法，其特征在于转染子是在氨甲蝶呤存在下培养的。

12、一种真核细胞，其特征在于它包括在调节基因表达的第二个核苷酸顺序控制下的编码猴转化生长因子-β1的核苷酸顺序，这样，真核细胞可产生活性转化生长因子-β1。

13、如权利要求12所述的真核细胞，其特征在于编码猴转化生长因子-β1的核苷酸顺序包括基本上如图1中所示的1-1173号核苷酸的核苷酸顺序。

14、如权利要求12所述的真核细胞，其特征在于编码33号氨基酸残基的密码子被改变为“AGC”。

15、如权利要求12所述的真核细胞，其特征在于它包括中国仓鼠卵巢细胞。

16、如权利要求12所述的真核细胞，其特征在于控制基因表达的第二个核苷酸顺序包括一个SV40启动子。

17、如权利要求12所述的真核细胞，其特征在于第二个核苷酸顺序包括一个启动子和一个编码真核细胞中缺乏的可选择标记的顺序，这样，含有编码猴转化生长因子-β1的顺序可以被识别。

18、如权利要求17所述的真核细胞，其特征在于可选择的标记包括二氢叶酸还原酶。

19、如权利要求18所述的真核细胞，其特征在于它包括二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞。

20、一种细胞系，其特征在于它包括保藏于ATCC并获保藏号CRL9434的CHO-TGF-β1-3/2000。

21、一种基本纯的多肽，其特征在于它包括基本上如图1所示的氨基酸顺序。

22、如权利要求21所述的基本纯的多肽，其特征在于它包括1-390号氨基酸残基。

23、如权利要求21所述的基本纯的多肽，其特征在于它包括30-390号氨基酸残基。

24、如权利要求21所述的基本纯的多肽，其特征在于它包括30-278号氨基酸残基。

25、如权利要求21、22、23或24所述的基本纯的多肽，其特征在于它被糖基化。

26、如权利要求21、22、23或24所述的基本纯的多肽，其特征在于它被磷酸化。

27、如权利要求26所述的基本纯的多肽，其特征在于它至少包括一个甘露糖＝6＝磷酸。

28、如权利要求27所述的基本纯的多肽，其特征在于甘露糖＝6＝磷酸被连接到rTGF-β1前体的天冬酰胺连接的糖链中。

29、如权利要求28所述的基本纯的多肽，其特征在于天冬酰胺的位置是氨基酸残基82号。

30、如权利要求28所述的基本纯的多肽，其特征在于天冬酰胺的位置是氨基酸残基136号。

31、如权利要求28所述的基本纯的多肽，其特征在于天冬酰胺的位置是氨基酸残基176号。

32、一种基本纯的多肽，其特征在于它包括基本上如图1中所示的氨基酸顺序，其中33号氨基酸残基是丝氨酸。

33、一种基本纯的多肽，其特征在于它包括基本上如图1中所示的氨基酸顺序，其中223号氨基酸残基是丝氨酸。

34、一种基本纯的多肽，其特征在于它包括基本上如图1中所示的氨基酸顺序，且其中225号氨基酸残基是丝氨酸。

35、一种基本纯的多肽，其特征在于它包括基本上如图1中所示的氨基酸顺序，且其中223和225号氨基酸残基是丝氨酸。

36、如权利要求32、33、34或35所述的基本纯的多肽，其特征在于它包括1-390号氨基酸残基。

37、如权利要求32、33、34或35所述的基本纯的多肽，其特征在于它包括30-390号氨基酸残基。

38、如权利要求32、33、34或35所述的基本纯的多肽，其特征在于它包括30-278号氨基酸残基。

39、如权利要求32、33、34、35、36、37或38所述的基本纯的多肽，其特征在于它被糖基化。

40、如权利要求32、33、34、35、36、37或38所述的基本纯的多肽，其特征在于它被磷酸化。

41、如权利要求40所述的基本纯的多肽，其特征在于它至少包括一个甘露糖-6-磷酸。

42、如权利要求41所述的基本纯的多肽，其特征在于甘露糖-6-磷酸被连接到rTGF-β1前体的天冬酰胺连接的糖链中。

43、如权利要求42所述的基本纯的多肽，其特征在于天冬酰胺的位置是氨基酸残基82号。

44、如权利要求42所述的基本纯的多肽，其特征在于天冬酰胺的位置是氨基酸残基136号。

45、如权利要求42所述的基本纯的多肽，其特征在于天冬酰胺的位置是氨基酸残基176号。

46、一种编码转化生长因子-β1前体的核苷酸顺序，其特征在于它包括编码基本上如图1所示的1-1173号核苷酸顺序的核苷酸。

47、一种编码转化生长因子-β1前体的核苷酸顺序，其特征在于它包括编码基本上如图1所示的1-1173号核苷酸顺序的核苷酸，其中编码33号氨基酸残基的密码子被改变为“AGC”。

48、一种编码转化生长因子-β1前体的核苷酸顺序，其特征在于它包括编码基本上如图1所示的1-1173号核苷酸顺序的核苷酸，其中编码223号氨基酸残基的密码子被改变为“AGC”。

49、一种编码转化生长因子-β1前体的核苷酸顺序，其特征在于它包括编码基本上如图1所示的1-1173号核苷酸顺序的核苷酸，其中编码225号氨基酸残基的密码子被改变为“TCT”。

50、一种编码转化生长因子-β1前体的核苷酸顺序，其特征在于它包括编码基本上如图1所示的1-1173号核苷酸顺序的核苷酸，其中编码223和225号氨基酸残基的密码子分别被改变为“AGC”和“TCT”。

51、一种在体内治疗肿瘤的方法，其特征在于它包括施用有效的杀肿瘤细胞剂量的转化生长因子-β1。

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