NO179676B

NO179676B - Fremgangsmåte for fremstilling av simian transformerende vekstfaktor-1, eukaryotisk vertscelle og nukleotidsekvens som koder for transformerende vekstfaktor-

Info

Publication number: NO179676B
Application number: NO894759A
Authority: NO
Inventors: Anthony F Purchio; Larry Gentry; Daniel Twardzik; Amy M Brunner
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-11-29
Publication date: 1996-08-19
Also published as: DK638989D0; NO894759D0; DE68921167T2; JPH03130089A; FI895730A0; AU638952B2; AU4588289A; IE893779L; EP0373994A1; DK638989A; PT92454A; CA2003886A1; ES2070924T3; NO894759L; EP0373994B1; ATE118546T1; PT92454B; NO179676C; IE67811B1; NZ231581A

Description

1. Introduks. i on

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av simian transformerende vekstfaktor-ei (rTGF-Bl). Produktet fra oppfinnelsen har en bioaktivitet som er ekvivalent til den fra autentisk moden human TGF-ei.

2. Bakgrunn for oppfinnelsen

Den transformerende vekstfaktor (TGF) familien med vekst-modulerende peptider består av to strukturelt og funksjonelt forskjellige molekyler, TGF-alfa og TGF-beta. TGF-alfa, syntetisert og frigjort av retrovirale transformerte gnager-cellelinjer (DeLarco et al., 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:4001-4005; Twardzik et al., 1982, Science 216:894-897), og noen humane tumor-cellelinjer (Todaro et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:5258-5262), konkurrerer med epidermisk vekstfaktor (EGF) om binding til EGF-reseptoren (Todaro et al., 1976, Nature 264, 26-29) og stimulerer tyrosin spesifikk fosforylering av EGF-reseptoren (Reynolds et al., 1981, Nature 292:259-262). Et potent mitogen for celler av mesenchymal opprinnelse, deler den modne formen av TGF-alfa som omfatter 50 aminosyreresidier, sekvenshomologi med både gnager- og human EGF, (Marquardt et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:4684-4688) og blir kløyvet fra en 159 aminosyre-forløper (Derynck et al., 1984, Cell 38:287-297; Lee et al., 1985, Nature 313:489-491).

Nylig har et protein som er isolert fra bovin demineralisert ben blitt identifisert som å være relatert til TGF-e (Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949). Proteinet er også blitt isolert fra porcin-blodplater (Cheifetz et al., 1987, Cell 48:409-415), en prostatisk adenocarcinoma-cellelinje PC-3 (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410), og en human glioblastoma cellelinje (Wrann et al., 1987, EMBO 6:1633-1636). Delvis aminosyre-sekvens av dette proteinet indikerer at det var homologt til TGF-e og har fått betegnelsen TGF-P2. Human (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705), mus (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379) og simian (ape) (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) TGF—Bl som nylig er blitt beskrevet har "-blitt og blir heretter kalt TGF-Bl.

TGF-Bl, en disulfid-bundet homodimer (9 cysteinresidier pr. kjede) inneholder to identiske subenheter (112 aminosyre-residier pr. subenhet) og utnytter en reseptor som er forskjellig fra både TGF-alfa eller EGF (Frolik et al., 1984, J. Biol. Chem. 260:10995-11000; Tucker et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6757-6761). Denne potente modulatoren på celleoppførsel blir syntetisert i en lang rekke normale og transformerte celler i kultur (Roberts et al., 1981, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:5339-5343) og er blitt renset fra forskjellige kilder inkludert placenta (Frolik et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:3676-3680), nyrer (Roberts et al., 1983, Biochemistry 22:5692-5698), urin (Twardzik et al., 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297) og blodplater (Childs et al., 1982, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:5312-5316). TGF-Bl krever enten TGF-alfa eller EGF for å fremme forankrings-uavhengig vekst i normale rottenyre-fibroblaster (NRK); derimot er kravet for TGF-alfa eller EGF mindre strengt for å fremme forankrings-uavhengig vekst i AKR-2, en murin indikatorcelle (Tucker et al., 1983, Cancer Res. 43:1581-1586). I motsetning til stimulering av cellevekst, har TGF—Bl fra humane blodplater og et funksjonelt relatert polypeptid med nesten identiske biokjemiske egenskaper blitt isolert fra African Green apeceller (BSC-1) også vist å utvise vekst-hemmende effekter på noen celler i kultur (Tucker et al., 1984, Science 226:705-707). Både bifunksjonaliteten til TGF—Bl (hemming/stimulering) og dens tilsynelatende alle-stedsværende fordeling antyder at den kan spille en nøkkel-rolle i regulering av vekst og oppførsel hos pattedyrceller.

Aminosyre-sekvensen avledet fra cDNA som koder for TGF-Bl forløper hos menneske (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705) og mus (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379) opprinnelse antyder en høy grad av homologi ikke bare i området med moden TGF-Bl sekvens men også i aminoterminal forløperregionen.

Selv om genet for human TGF-Bl er blitt identifisert og sekvensert, har kloning og ekspresjon av store mengder av aktivt TGF-Bl inntil nå ikke blitt rapportert. Et antall faktorer kan være ansvarlige for vanskeligheten i å uttrykke et aktivt TGF-Bl, en av disse kan involvere kompleksiteten til den tertiære strukturen av molekylet. Moden TGF-Bl har et antall interkjedede og intrakjedede disulfidbindinger, og dannelsen av disse krever korrekt prosessering under ekspresjon av genproduktet. Den modne formen av TGF-Bl er videre avledet fra et glykosylert større forløpermolekyl. Korrekt glykosylerings-mønster av forløperen kan være nødvendig for korrekt prosessering, sekresjon og kløyving av den modne formen av TGF-Bl. Således kan kloning og ekspresjon av et gen som har den korrekt kodende sekvensen i en uhensiktsmessig ekspresjonsvektor/vertscellesystem resultere i ekspresjon av et produkt som har riktig primærstruktur (dvs. aminosyresekvens) men ikke korrekt sekundær og tertiær struktur (dvs. folding og konformasjon) og dette resulterer i et inaktivt molekyl. Således har fremstilling av store mengder TGF-Bl blitt vanskeliggjort.

3. Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av store mengder av simian TGF-Bl ved eukaryotiske vertsceller transfektert med rekombinante DNA-vektorer som inneholder siman TGF-Bl kodende sekvens kontrollert ved ekspresjons-regulatoriske elementer. En cDNA-klon som koder for simian TGF-Bl forløper ble oppnådd fra et cDNA-bibliotek laget fra en Afrikan Green apecellelinje, BSC-40. Den avledede aminosyresekvensen til den modne simian TGF-Bl viser 10056 homologi med den til det modne humane TGF-Bl. Sterk sekvens-homologi ble funnet mellom forløperregionene i human og simian proteiner med bare fem aminosyre-endringer av 278 residier. Simian (og murin) forløpersekvensen ble funnet å kode for en mindre aminosyreresidie enn den humane. <: >Ekspresjonsvektorer ble konstruert som inneholder den hele kodende sekvensen for simian TGF-Bl plassert under kontroll av SV40 ekspresjonselementer. De ble anvendt til å transfektere kinesisk hamsterovarie-celler (CEO-celler). De resulterende CHO-transfektantene produserer og sekrerer både moden rTGF-Bl som har en biologisk aktivitet som kan sammenlignes med autentisk TGF-Bl såvel som forløperformen til rTGF—Bl som også har en biologisk aktivitet.

4. Beskrivelse av figurene

Fig. 1. Nukleotidsekvensen til simian TGF-Bl cDNA og avledet aminosyresekvens. Den 1600 bp innføringen av pTGF-Bl-2 ble subklonet inn i M13mpl8 og M13mpl9 klonevektorer (Yanisch-Perron et al. , 1985 Gene 33:103-119 ) og begge trådene ble sekvensert ved å anvende dideoksy-kjedeavslutningsmetoden (Sanger et al., 1977 Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74 :5463-5467). Den avledede aminosyresekvensen fra simian TGF-Bl er presentert direkte over cDNA-sekvensen. Den humane TGF-Bl nukleotidsekvensen er på linje med og presentert direkte under siman cDNA-sekvensen; prikker indikerer homologe nukleotid-residier i sekvensene. Aminosyre-forskjeller mellom human og simian proteiner er indikert på topplinjen. Den modne TGF-Bl sekvensen er innrammet og signalpeptidet er det satt strek over . Fig. 2. Northern blot analyse av RNA fra en human (MCF-7) og simian (BSC-40) cellelinje ved å anvende en simian TGF-Bl cDNA gensøker ("probe"). Polyadenylert RNA ble isolert fra MCF-7 celler og BSC-40 celler som beskrevet (Purchio et al., 1979, J. Virol. 29:763-769), fraksjonert på en 1% agarose-formaldehydgel (12), overført til en nylonmembran (Hybond, Amersham) og hybridisert til [<32>P]-merket pTGF-Bl-2 gensøker. Brønn 1, human MCF-7 RNA (5 pg); brønn 2, simian BSC-40 RNA (5 >Jg). 28S og 18S indikerer posisjonene til vandring av 28S-og 18S-ri"bosomal RNA. Fig. 3. Konstruksjon av amplifiserbart ekspresjonsplasmid pSV2 (TGF-ei-dhfr). Detaljene fra konstruksjonen er skissert i Seksjon 7 nedenfor. Det endelige rekombinante plasmidet som inneholder TGF-el cDNA som koder for hele forløperformen av TGF-el og muse dhfr cDNA i tandem. Begynnelse på transkripsjon av TGF-el og dhfr mRNA blir drevet med SV40 tidlig promoter. Polyadenylerings-signaler og andre sekvenser som er ansvarlige for korrekt RNA-prosessering blir tilført ved 3' SV40 sekvenser. Restriksjonsseter i parentes blir tapt under konstruering av det ampiifiserbare ekspresjonsplasmidet. Fig. 4. Påvisning av TGF-el nukleinsyre-sekvenser i CHO-cellene i forskjellige trinn av MTX-seleksjon. Panel A: Northern blot analyse for påvisning av TGF-el mRNA sekvenser. Poly (A)+ som inneholder mRNA (5 pg) ble fraksjonert i en 1% agarose-formaldehydgel, blottet på Hybond N membraner (Amersham) og gensøkt med radioaktivt TGF-el DNA som beskrevet i Materialer og metoder. Brønnen som inneholder ikke-transfektert CHO mRNA ble eksponert i 48 timer for å vise endogene nivåer av 2,5 Kb TGF-el meldingen. Brønnene som inneholder mRNA fra TGF-ei-3 celler ble eksponert i 5 minutter. Ribosomale markører er vist til høyre. Panel B: Southern blot analyse av genomisk DNA fra TGF-el-3 CHO-celletransfektanter ved forskjellige trinn av MTX-seleksjon. Høymolekylær vekt DNA fra TGF-el-3 transfektanter ble spaltet med BamHI eller EcoRI og 20 pg ble fraksjonert på en 19o agarosegel. DNA ble overført til Hybond N (Amersham) membraner og gensøkt med den nick-translaterte TGF-el DNA. Eksponeringstiden var 30 timer for TGF-el-3-0 celler og 10 timer for TGF-Pl-3-200 og 2000 celler. DNA størrelses-markørene er indikert til venstre for figuren. Piler betegner størrelsene på DNA som er antatt å hybridisere til TGF-el gensøkeren. Fig. 5. Veksthemmings-analyse av CCL-64 minklunge-epitelceller med rekombinant- eller naturlig Bl-TGF. Panel A: Veksthemmingsanalyse som benytter naturlig TGF-Bl renset fra bovin milt; 50% hemming er typisk oppnådd ved å anvende 8-12 picogram TGF-Bl. Panel B: Serumfrie supernatanter ble oppsamlet fra sammenflytende monolag av TGF-Bl-3 transfektanter i forskjellige trinn av amplifikasjonen. Mediet ble dialysert grundig mot 0,2 M eddiksyre og analysert for veksthemming som beskrevet i Seksjon 7.1.6 nedenfor. Resultatene som vises er normalisert for 1 x 10<7> celler pr. 5 ml oppsamling. , ikke-amplifiserte TGF-Bl-3 celler; * • TGF-Bl-3 celler tilpasset til 2 jjM metotreksat; o o TGF-Bl-3 celler tilpasset til 20 pM metotreksat. Fig. 6. Syreaktivering av rekombinant TGF-Bl. En 24 timers oppsamling av serumfrie supernatanter fra TGF-Bl-3/2.000 celler ble laget. Like porsjoner ble deretter dialysert mot 0,2 M eddiksyre eller 50 mM NE4HCO3 (pH 7,0). Som en kontroll ble først en supernatant dialysert mot 50 mM NH4ECO3 og deretter dialysert mot 0,2 M eddiksyre. En dose-respons bioaktivitetskurve av det differensierte bearbeidede materialet er vist. ▲ supernatant dialysert mot NH4HCO3. «—supernatant dialysert mot 0,2 M eddiksyre. o o, NH4HCO3 behandlet materiale ytterligere dialysert mot 0,2 eddiksyre. Fig. 7. Linjediagram som illustrerer de strukturelle trekkene til rTGF-Bl proteinet og indikerer peptidregioner som ble anvendt til generering av setespesifikk anti-peptid antisera. En-bokstav koden for aminosyrene blir anvendt: A (alanin), C (cystein), D (asparagin), E (glutaminsyre), F (fenylalanin), G (glycin), H (histidin), I (isoleucin), K (lysin), L (leucin), M ( metionin), N (asparagin), P (prolin), Q (glutamin), R (arginin), S (serin), T (treonin), V (valin), W (tryptofan), Y (tyrosin). Funksjonelt viktige domener på TGF-Bl er identifisert: ledersekvens, forløpersekvenser og moden TGF-Bl. Fig. 8. Identifikasjon av rekombinant TGF-el i media med TGF-el-3 celler immunoblotting. Serumfrie supernatanter ble oppsamlet fra sammenflytende kulturer av celler og omfattende dialysert mot 0,2 M eddiksyre. Etter lyofilisering ble materialet oppløst i SDS-prøvebuffer, ekvivalenten til 2 x IO<5> celler fraksjonert på SDS-polyakrylamid-geler, og immunoreaktive TGF-el proteiner ble påvist ved immunoblotting. Anti-TGF-el-3fc<g_>3gi ble utnyttet til immuno-blottene. Til peptid-blokkeringseksperimentet ble 50 pg/ml av pepti<d>369_3gi tilsatt til antistoffet forut for immunoblottet. Panel A: Immunoblot av materiale oppsamlet i supernatanter fra TGF-el-3 tilpasset 0, 2 eller 20 pM metotreksat og fraksjonert på SDS-polyakrylamid-geler under reduserende betingelser. Naturlig bovin milt TGF-el (100 ng) ble inkludert for sammenligning. Panel B: Supernatanter ble fraksjonert under ikke-reduserende betingelser. Bovin milt TGF-el (250 ng) ble inkludert. Fig. 9. Immunoblot av sekrert rekombinant TGF-el fremstilt av TGF-el-3 celler gensøkt med anti-TGF-ei<g>i-94 og anti-TGF-ei225-236- Supernatanter ble oppsamlet, prosessert som beskrevet i Fig. 8 og fraksjonert på gradient SDS-polyakrylamid-geler. (A) Immunoblot av supernatanter fraksjonert på reduserende SDS-polyakrylamid-geler. Et immunoblot utført med en blanding av forløper-spesifikk- og TGF-ei-spesifikke antistoffer er vist i siste panel for å vise de tre adskilte formene med rekombinant materiale.'(B) Immunoblot av supernatanter fraksjonert på SDS-polyakrylamid-geler under ikke-reduserende betingelser. En blanding av forløper-spesifikke og TGF-el spesifikke antistoffer er vist i siste panel. Fig. 10. Påvisning av moden og forløperformer av rTGF-ei i samlet sekrerte proteiner fra TGF-el-3/0 og TGF-el-3/2.000 celler. Cellene som er dyrket til samflyting på 60 mm runde vevskultur-skåler ble merket i 3 ml DMEM som manglet metionin, cystein og fetalt bovint serum og som inneholder 100 pCi/ml 3E)S-metionin Qg 35s_CyS-tein# Etter 18 timer ble den serum-frie merkede supernatanten oppsamlet, klargjort og fraksjonert på reduserende 7,5-17,5$ SDS-polyakrylamid-geler. Etterfulgt av elektroforese ble gelene prosessert med En<3>Hance og autoradiografert. Resultatene viser en 8 timers eksponering ved å anvende 3 pl av den merkede supernatanten. Fig. 11. Påvisning av TGF-el relaterte proteiner sekrert av TGFe3-2.000 celler. A) Linjediagram av TGF-ei-forløper. Se teksten for diskusjon. B) TGFe3-2.000 celler ble dyrket til sammenflyting i 100 mm skåler som beskrevet tidligere (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418:3427). Serum-frie supernatanter (5 mL) ble oppsamlet, dialysert mot 0,2 M eddiksyre og 0,5 mL prøver ble lyofilisert og immunoblottet som beskrevet (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427 ) ved å anvende en pool med antipeptid-antistof f er mot aminosyreresidier 369-381 (Anti-TGFe35<g_>3<g>i) og 81-94 (anti-TGBegi_94): brønn 1, ikke-redusert prøve; brønn 2, redusert prøve. Antallet til venstre (brønn 1) og til høyre (brønn 2) indikerer posisjonen til molekylvekt-standarder i kilodalton. C) TGFe3-2.000 celler ble dyrket til sammenflyting i 60 mm vevkultur-skåler og pulset i serum-fritt medium (3 mL) som mangler metionin og cystein og inneholder 100-200 p Ci/mL [<35>S]-cystein og [<35>S]-metionin i 15 min. Celler ble deretter forfulgt i 4 timer i serum-fritt medium som inneholder metionin og cystein og en 10 pl prøve ble analysert på en 7,5#-15# polyakrylamid-SDS gradientgel som beskrevet (Laemmli 1970, Nature 227:680-685) under ikke-reduserende betingelser (brønn l). En annen skål med celler ble merket i 24 timer i serum-fritt medium som inneholder 20 p Ci/mL [<3>H]-glukosamin og den cellefrie supernatanten ble dialysert i 48 timer mot 0,2 M eddiksyre. To hundre mikroliter av dette materialet ble lyofilisert og analysert på en 7,5#-15# polyakrylamid-SDS gradientgel under ikke-reduserende betingelser. Gelen ble fluorografert og eksponert for autoradiografi ved å anvende Cronx-4 røntgenfilm (DuPont). D) Samme som C) med unntakelse av at prøver ble kjørt under reduserende betingelser. E) TGFe3-2.000 celler ble merket med 1 m Ci/mL [<32>P]-ortofosfat i serum og fosfatfritt medium. Cellefrie supernatanter ble behandlet som beskrevet over, fraksjonert på en 15$ polyakrylamid-SDS gel under reduserende betingelser og gelen ble autoradiografert. F) [<32>P]-merket forløper ble renset i to sykler med polyakrylamid-SDS gelelektroforese og hydrolysert i 1 time ved 95 ° C i 6M HC1 (Cooper et al., 1983, Meth. Enzymol. 99:387-402). Spaltningsproduktene ble separert ved elektroforese ved pH 1,9 og ved pE 3,5, og påvist i autoradiografi. Interne standarder (P-ser, P-thr, p-tyr) ble påvist med ninhydrin. Fig. 12. Spalting av serum-frie supernatanter fra TGF33-2.000 celler med forskjellige glykolytiske enzymer. A) TGFP3-2.000 celler ble dyrket til sammenflyting og inkubert i 24 timer i serum-fritt medium. Mediet ble dialysert mot 0,2 M eddiksyre, lyofilisert og prøver ble behandlet med neuraminidase (0,25 enheter/mL, brønn 3), N-glykanase (20 enheter/mL, brønn 2) eller endoglykosidase E (0,2 enheter/mL, brønn 4). De spaltede ble fraksjonert med SDS-polyakrylamid gelelektroforese under reduserende betingelser og analysert med immunoblotting som beskrevet i teksten til Figur 11. Brønn 1 inneholder en ubehandlet prøve. B) Serum-frie supernatanter fra TGF33-2.000 celler ble merket med [<35>S]-metionin og [<35>S]-cystein som beskrevet i teksten til Figur 1 og spaltet som over med endoglykosidase E (brønn 2), neuraminidase (brønn 3) og N-glykanase (brønn 4). Brønn 1 inneholder en ubehandlet prøve. De spaltede ble fraksjonert ved SDS-polyakrylamid gelelektroforese under reduserende betingelser og gelene ble autoradiografert. N-glykanase ble innkjøpt fra Genzyme (Boston, Mass.) og endoglykosidase E og neuraminidase var fra Calbiochem (La Jolla, CA): bufferbetingelsene var som anbefalt av forhandleren. Fig. 13. Celle-fri translasjon av TGF-gl spesifikke transkripter. A) Et 1.350 basepar Pst I-Eco R fragment som inneholder den fullstendige kodende regionen av TGF-el (3) ble subklonet inn i pSP64 (Pharmacia) og 5 jig av linearisert plasmid ble transkribert med SP6 polymerase (Kreig og Melton, 1984, Nucleic Acids Res. 18:7057-7070) innkjøpt fra Bethesda Research Labs (Baltimore, MD) ved å anvende ioniske betingelser som beskrevet over (Pelham og Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67:247-251). Reaksjonen ble spaltet med DNase, ekstrahert to ganger med fenol: kloroform: isoamylalkohol (24:24:1 ) og etanol utfelt. RNA ble oppløst i 50 pl H20 og 10 pl (brønn 2) ble fraksjonert med en 1$ agarose-urea gel som beskrevet (Purchio et al., 1980, J. Virol. 35:629-639). Brønn 1 inneholder retikulocytt-ribosomale RNA-markører. Gelen ble farget med etidiumbromid, illuminert med UV-lys og fotografert. B) RNA beskrevet over ble behandlet i 10 minutter ved 22°C med 10 mM metylkvikksølv, justert til 20 mM 2-merkaptoetanol og 1 pg ble translatert i et meldings-avhengig retikulocytt celle-fritt translasjonssystem (Purchio et al., 1983, J. Virol. 48:320-324) i et samlet volum på 50 pl ved å anvende [<35>S]-metionin og ioniske betingelser som nylig beskrevet (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244). Reaksjonene ble fraksjonert på en 10$ polyakrylamid-SDS gel (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685); gelen ble fluorografert og eksponert til Cronex-4 røntgenfilm. Brønn 1, ikke tilsatt RNA; brønn 2, 1 pg TGF-Bl RNA. Fig. 14. Gelgjennomtrengings-kromatografi på en Bio-Sil TSK-250 kolonne (21,5 x 600 mm) med 20 mg protein etter ammoniumsulfat-utfelling av 500 mL serum-fri supernatant fra TGF-P-3-2.000 celler. Kolonnen ble ekvilibrert med 0,1$ TFA i vann som inneholder 40$ (v/v) acetonitril ved 2 mL/min., ved 22"C; 4 mL fraksjoner ble oppsamlet. Prøver av de indikerte fraksjonene ble analysert for vekst-hemmende aktivitet på minklunge-epitelceller (-o-). Den heltrukne linjen gir proteinabsorbansen ved 254 nm. De følgende proteinene ble anvendt som markører: a-chymotrypsinogen (Mr 25,700), bovin bukspytt ribomiklease A (Mr 13,700) og insulin (Mr 5,700). Fig. 15. Rensing av rTGF-Bl ved revers-fase HPLC. Eluerings-mønstre av 0,65 mg protein fra gelgjennomtrengnings-kromatograf i renset TGF-el (Figur 2, pool B) på en pBondpak C^g kolonne (10 pm partikkelstørrelse, 3,9 x 300 mm). Eluering ble oppnådd med en lineær 10-min. gradient av 0,05$ TFA i vann til 30$ acetonitril i 0,045$ TFA, og en 10-min. gradient på 36-60$ acetonitril i 0,045$ TFA. Kolonnen ble operert ved en strømningshastighet på 0,2 mL/min. ved 22°C. Prøver av de indikerte fraksjonene ble analysert for vekst-hemmende aktivitet på minklunge-epitelceller (-o-). Den horisontale staven indikerer lagret rTGF-el. UV-absorberende materiale ble kontinuerlig målt ved 214 nm ( ); den stiplede linjen ( ) betegner konsentrasjonen til acetonitril. Fig. 16. SDS-polyakrylamid gelanalyse av rensede rTGF-el proteiner. Forløper- og modne former av TGF-el ble fraksjonert ved SDS-PAGE under ikke-reduserende (A) eller reduserende (B) betingelser og farget med Coomassie blue R—250. nTGF-ei ble isolert fra bovin milt og anvendt som sammenligning. Markørproteiner i KDal er indikert til venstre og høyre for figuren. Fig. 17. Coomassie blue fargingsmønster av proteiner fra betingelsesmediet og amplifiserte CEO-celler som uttrykker TGF-el. Betingelsesmediet ble dialysert, fraksjonert på 15$ SDS-polyakrylamid-geler under reduserende betingelser, farget med Coomassie blue R-250. Som referanse er bokstavene a, b og c notert til venstre for figuren for å angi rTGF-el molekyler. Brønn 1, 0,25 ml av betingelsesmedium; Brønn 2 viser markørproteiner med de angitte molekylvektene i KDal. Fig. 18. Gelgjennomtrengnings-kromatografi på en Bio-Sil TSK-250 kolonne (7,5 x 600 mm) med CNBr peptider av rTGF-ei-forløper. Elueringsmønstre av 800 pmol rTGF-el-forløper kløyvet med CNBr. Kolonnen ble ekvilibrert med 0,1$ TFA i vann som inneholder 40$ acetonitril ved 0,25 mL/min. ved 22°C. UV-absorberende materiale ble målt ved 214 nm. Toppene med betegnelse M refererer til CNBr-peptider utsatt for Edman degradering; tallene refererer til posisjonen av det spesielle fragment eller fragmenter knyttet til ved disulfid-bindinger i den fullstendige sekvensen (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244). Fig. 19. Veksthemmings-kurver av renset TGF-el proteiner ved å anvende minklunge-indikatorceller. Veksthemming ble vurdert og fastslått som beskrevet i teksten. Konsentrasjon av TGF-el polypeptider ble bestemt med aminosyre-analyse. -A-, rekombinant forløperprotein; nTGF-ei fra bovin milt; -o-, rTGF-el. Fig. 20. (A) Foreslått struktur på TGF-el forløper ved å fremheve dens disulfid tverr-bindende natur. (B) Oppsummering av prosesserings-hendelser av pre-pro-TGF-el i transfekterte CHO-celler. Proteolytiske prosesseringsseter er blitt frem-hevet. Stjerner betegner glykosyleringsseter. Mørk, signalpeptid; åpen, pro-region; skravert, moden TGF-el. Fig. 21. Effekt av TGF-el og TGF-e2 på vekst av A549 human lungetumor i nakne mus. Hannlige nakne mus (Balb/c-nu+/nu+) ved 12 ukers alder ble injisert i dorsal nakkeregion subkutant med 1,3 x 10^ humane lungecarcinoma-celler (A549) i et volum på 0,2 mL med fosfatbufferet saltoppløsning. Tydelige tumorer (, 10 mm<3> - 3x3x1 mm) utviklet i løpet av 20 dager i tilnærmet 80$ av dyrene. Tumorbærende dyr ble vilkårlig tilegnet forskjellige bur. Dag 1 med behandling korresponderer til den første dagen dyrene ble behandlet etter at målbar tumor var utviklet. Hver gruppe med 5 dyr ble injisert som angitt subkutant tilgrensende til tumoren (peritumoralt) i et bærevolum på 0,10 mL. Kontrollgruppe(r) ble injisert med enten høytrykksvæske-kromatografi renset bovint serum-albumin (2 pg) eller et syntetisk peptid (200 ng) som korresponderer til en løkkeregion av epidermisk vekstfaktor (residier 11-21). Tumorstørrelsen ble målt med passere i tre dimensjoner før etterfølgende injeksjon på dagene som er angitt på absissen. Verdiene av hvert punkt representerer gjennomsnittlig tumorvolum. TGF-el og TGF-e2 ble renset til homogenitet fra bovint ben som nylig beskrevet (Massaque et al., 1986, Proe. Nat. Acad. Sei., 83:8206-8210; : Sporn et al., 1983, Science 219:1329) og stabilisert med et ti-gangers overskudd av bovint serumalbumin. Totalmengde av hver faktur administrert under varigheten av dette spesielle eksperimentet var 1,4 pg pr. dyr. Fig. 22. Doserespons av TGF-el hemming av A549 human carcinoma-tumor i nakne mus. Protokollen er identisk med den som er beskrevet i beskrivelsen av Fig. 21 med unntakelse av at den begynnende tumorstørrelsen i dag 1 av behandlingen (dag 25 etter tumorcelle-innpoding) var større (20 mm<3>). Kontroll-dyr-grupper ble injisert med BSA; behandlede dyregrupper mottok 5 injeksjoner hver tredje dag av enten 12,5, 50 eller 200 ng av TGF-el peritumoralt administrert i løpet av en 15-dagers periode. Verdiene representerer gjennomsnittlig tumorvolum fra hver gruppe dyr ved dag 15. Fig. 23. Fotografi av ikke-behandlet og TGF-el behandlet A549 lungecarcinoma-bærende nakne mus. På toppen av fotografiet er kontrolldyret som bærer stor subkutan tumor ved dag 20 (virkelig foto av mus fra eksperiment beskrevet i Fig. 21); det nedre av fotografiet er dyret som er representativt for TGF-el-behandlet gruppe (samme eksperiment). Innsatt (oppe til høyre) viser utskårede tumorer fra kontroll (venstre) og behandlet (høyre) dyr. (Størrelsesforskjellene i foto mellom tumorer i dyr og etter utskjæring reflekterer forskjell i kamera-rekkevidde).' Fig. 24. Histologisk eksaminasjon av tumor utskåret fra kunstig- og TGF-ei-behandlede dyr. Nylig utskårede tumorer (dag 20 i behandling, Fig. 21) ble fiksert i bufferet formalin i parafin, snittet og farget med Gamori's trikrom. Snitt med tumor avledet fra kunstig-behandlede dyr, Panel A (20x), Panel C (100x). Snitt av tumor avledet fra TGF-el behandlede dyr. Panel B (20x), Panel D (100x). Panel D innsatt; væskevegg fra snitt av tumor avledet fra TGF-Bl behandlede dyr (100x). Fig. 25. Fargingsmønstre av fikserte lungetumor-snitt fra kunstig-behandlede og TGF-Bl-behandlede dyr. Snitt fra tumorer avledet fra kunstig-behandlede dyr farget med PAS (Panel A) 100x; med Alcian Blue (Panel C) 100x; snitt fra tumor avledet fra TGF-Bl-behandlede dyr farget med PAS, (Panel B) 100x; Alcian Blue (Panel D) 100x. Fig. 26. SDS-polyakrylamid gelelektroforese av TGF-Bl forløperproteiner frigitt ved klon 17 celler. (A) Linjediagram av TGF-Bl protein; f indikerer glykosyleringsseter som er fosforylert; 0 indikerer ikke-fosforylerte glykosyleringsseter. Cellefrie supernatanter fra klon 17 celler ble merket med [<3>5S]-metionin og [35S]-cystein (B), [3H]-glykosamin (C), [<3>H]-mannose (D) og [<32>P]-fosfat (E) i serum-fritt medium; prøver ble prosessert og analysert på en 7,5—15$ gradient SDS-polyakrylamidgel (B og C), eller på en 15$ SDS-polyakrylamidgel (D og E). Fig. 27. N-glykanase-spalting av TGF-Bl forløperproteiner fremstilt av klon 17 celler. (A) [<35>S]-merkede cellefrie supernatanter ble prosessert, behandlet med N-glykanase og analysert på en 7,5-15$ gradient SDS-polyakryladmidgel: brønn 1, ikke enzym; brønn 2, pluss N-glykanase. (B) Samme som i A, med unntakelse av at merkingen var [<32p>]-fosfat. Fig. 28. Aminosyresekvenser av TGF-Bl forløper-glykopeptider. Peptider oppnådd ved kløyving med S. aureus V8 protease (E), og trypsin (T) er angitt, f indikerer glykosyleringsseter som er fosforylert; 9 indikerer ikke-fosforylerte glykosyleringsseter. Nummereringen refererer til posisjonen av det spesielle glykopeptidet i den fullstendige sekvensen til TGF-Bl forløperen, x, uidentifisert residie. Fig. 29. Gelgjennomtrengnings-kromatografi av CNBr-peptider av [<32>P]-merket TGF-øl forløper. Kromatografi på en Bio-sil TSK-250 kolonne (7,5 x 600 mm). Elueringsmønstre av 650 pmol S-pyridyletylert TGF-øl forløper og av 165.000 cpm S-pyridyletylert [<32>P]-TGF-Bl forløper kløyvet med CNBr. De indikerte fraksjonene ble målt for [<32>P]-radioaktivitet (-o-). Den heltrukne tykke linjen gir proteinabsorbans ved 214 nm. De følgende proteinene ble anvendt som markører: a-laktoglobulin (Mr 18,400), cytokrom C (Mr 12,300) og insulin (Mr 5,700). Toppene som ble betegnet med M refererer til CNBr peptider; tallene refererer til posisjonen av det spesielle fragment i den fullstendige sekvensen av TGF-Bl forløperen (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244). Fig. 30. Revers-fase høyeffekts-væskekromatografi av S. aureus V8 proteasepeptider fra CNBr-peptid M (39-113). Kromatografi på en RP-300 kolonne (2,1 x 30 mm). Eluerings-mønstre av 370 pmol M (39-113) som inneholder 12.500 cpm [<32>P]-M(39-113) spaltet med S. aureus V8 protease. Elueringen av peptidene ble oppnådd med en to-timers 1ineærgradient med 0,1$ trifluor-eddiksyre i vann til 60$ acetonitril som inneholder 0,08$ trifluor-eddiksyre ved en strømnings-hastighet på 100 pl/min. ved 35"C. UV-absorberende materiale ble målt ved 215 nm ( ). [<32>P]-radioaktivitet (-o-) ble bestemt i en LS 6.800 væskescintillasjonsteller (Beckman). Topper betegnet med en E refererer til V8 proteasepeptider som er utsatt for Edman-degradering. Fig. 31. Reversfase høyeffekts-væskekromatografi av S. aureus V8 proteasepeptider og trypsinpeptider av CNBr peptid M(134-253). Kromatograf i på en RP-300 kolonne (2,1 x 30 mm). (A) Elueringsmønster av 400 pmol M(134-253) som inneholder 44.000 cpm [<32>P]-M(134-253) spaltet med S. aureus V8 protease. (B) Elueringsmønster av trypsinpeptider avledet fra pool A (Fig. 31A) som inneholder 3.100 cpm [32P]-E(170-194 ). Kromatograferingsforholdene er beskrevet i teksten til Fig. 30. Toppene som er betegnet med en E refererer til V8-proteasepeptider, og topper som er betegnet med en T refererer til trypsinpeptider som er utsatt for Edman-degradering. Fig. 32. Identifisering av mannose-6-fosfat. (A) [<32>P]-merket TGF-Bl forløperproteiner ble hydrolysert med syre i 2 timer. Hydrolyseproduktene ble blandet med ikke-radioaktive fosfo-aminosyrer og mannose-6-fosfat og separert ved elektroforese ved pH 1,9, og ortogonalt ved pH 3,5. Et autoradiogram er vist. Prøven er satt på flekk nede til høyre (pilspiss). Mannose-6-fosfat (M6P), fosfoserin (PS) fosfotreonin (PT), fosfotyrosin (PY) og uorganisk fosfat (Pi) er markert. [<32>P]-ble påvist at det gikk sammen med mannose-6-fosfat og Pi, og i posisjoner som var forventet for fosfo-oligosakkarider (små pilspisser). (B) Tilsvarende analyser av produkter med 1 times hydrolyse av (B) E(76-91) og (C) E(134-139). (D) [<32>P]-merket TGF-Bl forløperproteiner ble hydrolysert og separert ved elektroforese ved pH 8,9 etterfulgt av kromatografi. Fig. 33A. SDS-polyakrylamid-gelanalyse av renset cyanogen-bromidpeptid M(134-253). M(134-253) ble fraksjonert på en 15$ SDS-polyakrylamidgel under (1) ikke-reduserende eller, (2) reduserende betingelser, og farget med Coomassie brilliant blue R-250. Molekylvekt-markørene er angitt i kilodalton. Fig. 33B. Linjediagram av pre-pro-TGF-Bl. Pro-TGF-Bl pro-regionen av forløperen, og moden TGF-Bl er angitt henholdsvis ved brønnene a, b og c. CYS (C) residiene i pro-regionen er angitt. Mannose-6-fosfat inneholdende seter (f) og ikke-fosforylerte seter (?) av N-linket glykosylering er vist. Fig. 33C. TGF-Bl forløpermutanter. Nedskrivningene angir aminosyre-posisjonen i SER-substitusjonene. Ikke-passende nukleotider er i fete typer og nye SER-kodon er streket under. Fig. 33D,E. Immublot av TGF-el mutantproteiner sekrert av transfekterte COS-celler. Serum-frie supernatanter ble oppsamlet, dialysert mot 0,2 M eddiksyre, fraksjonert på 7,5-17,5$ SDS-polyakrylamidgeler og analysert ved immunoblotting under reduserende (D) eller ikke-reduserende (E) betingelser. Blot ble gensøkt med en blanding av pro-region (anti-TGF-£181-94 ) °S moden (anti-TGF-e<i>36<g_>3<g>;L) spesifikke anti-peptidantistoffer. COS-celler ble transfektert med vektor (ttH3M) bare (brønn 2), eller med vektor som koder TGF-el (brønn 3), TGF-elS33 (brønn 4), TGF-elS223 (brønn 5), TGF-f3lS22<5> (brønn 6) og TGF-elS223/225 (brønn 7). Brønn 1 inneholder supernatant fra ikke-transfekterte COS-celler. Molekylvekt-standarder er angitt i kilodalton. Fig. 33F,G. Identifikasjon av mutant TGF-el forløper og modne proteiner. Supernatanter fra COS-celler transfektert med ttH3M (brønn 2), pTGF-ei (brønn 3), pTGF-ei<S33> (brønn 4), pTGF-elS223 (brønn 5), pTGF-(3lS225 (brønn 6) eller pTGF-eiS223/225 (brønn 7), ble oppsamlet og prosessert som beskrevet i beskrivelsen til Fig. 33D,E. Immunoblot ble utført under ikke-reduserende betingelser med antistoffer som var spesifikke for (F) moden sekvens (anti-TGF-ei36<g_>3gi), eller (G) pro-region (anti-TGF-ei<g>i_<g>4). Brønn 1 inneholder ikke-transf ektert COS-celle supernatant. Molekylvekt-standardene er angitt i kilodalton. Fig. 34. Binding av <125>I-merket TGF-el forløper til renset mannose-6-fosfat reseptor. Renset human mannose-6-fosfat/IGF-II reseptor (Roth et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:600-606) ble adsorbert til mikrotiterbrønner dekket med antistoffer til denne reseptor. <12>^I-merket TGF—el forløper (100.000 cpm pr. brønn) ble tilsatt i nærvær av de angitte konsentrasjonene med umerkede konkurrenter. Etter 3 timer ved 4°C ble brønnene vasket, kuttet ut og talt. Resultatene er gjennomsnitt av doble brønner som adskilte seg med mindre enn 10$ og er representative for tre eksperimenter. I brønner som ikke inneholder noen konkurrent (0$ hemming), var 5,2$ av den merkede ligand bundet. TGF, TGF-el forløper; M1P, mannose 1-fosfat, M6P, mannose :6-fosfat. Fig. 35. Insulin-stimulert økning i IGF-II og rekombinant TGF-el forløper som bindes til rotte-adipocytter. Rotte-adipocytter forhåndsbehandlet eller ikke med insulin ble inkubert med enten rekombinant <125>I-TGF-ei forløper (4,9 x IO<4> cpm) eller 12<5>I-IGF-II (4,2 x IO<4> cpm). For å vurdere ikke-spesifikk binding, ble 100 nM IGF-II eller 3 mM man6P inkludert som angitt. Resultatene er gjennomsnitt av tredoble bestemmelser. Fig. 36. Binding av IGF-II og rekombinant TGF-el forløper til CHO-celler og CHO-celler som overuttrykker den humane IGF-II/man6P reseptor (CHO-IGF-IIR). Celler ble inkubert med enten <125>I-IGF-II (8,0 x IO4 cpm) eller rekombinant 12<5>I-TGF-el forløper (1,3 x IO<5> cpm) og ble angitt enten 5 mM man6P eller 100 nM IGF-II ble inkludert for å fastslå ikke-spesif ikk binding. Resultatene er gjennomsnitt av tredoble bestemmelser. Fig. 37. Spesifisiteten til rekombinant TGF-el forløper-binding til CHO-celler som overuttrykker den humane IGF-II/man6P reseptoren. Cellene ble inkubert med rekombinant <125>I-TGF-el forløper (6,7 x IO<4> cpm) og den angitte konsentrasjon av konkurrerende umerket ligand. Resultatene er gjennomsnitt av tredoble bestemmelser. Fig. 38. Internalisering av rekombinant TGF-el forløper. CHO-celler som overuttrykker IGF-II/man6P reseptor ble inkubert ved 37°C med rekombinant 12<5>I-TGF-el forløper (5 x IO<4> cpm) i nærvær eller fravær av 5 mM man6P. Ved de angitte tidene ble enten total eller de syre-resistente (dvs. internaliserte) cellene som var assosiert bestemt. Resultatene er gjennomsnitt av tredoble bestemmelser. Fig. 39. Binding av plate TGF-el forløper til den isolerte IGF-II/man6P reseptoren. Renset IGF-Il/man6P reseptor adsorbert til mikrotiter-brønner ble inkubert med et <125>j_ merket rekombinant TGF-el forløper i nærvær av de angitte konsentrasjonene av enten renset latent TGF-el fra plater ( ) eller rekombinant TGF-el (■). Etter 3 timer ved 4<C>C ble mengden av reseptorbundet radioaktivitet bestemt. Fig. 40. Binding av IGF-II/man6P reseptoren til rekombinant TGF-el forløper men ikke plate TGF-el: Western blot analyse. Rekombinant (R) (0,5 pg) og plate (P) TGF-el forløper (2,5 pg) ble elektroforese-behandlet på en redusert, SDS-polyakrylamingel, overført til et nitrocellulose-filter og reagert med enten anti-peptid antistoffer spesifikke for en sekvens i forløperen (venstre) eller med IGF-II/man6P reseptoren og antistoffer til reseptoren (høyre). Nærvær av bundet kanin-antistoffer ble påvist med alkalisk fosfatase konjugert til anti-kanin lg og en histokjemisk farge for alkalisk fosfatase. Posisjonen til molekylvekt-markørene (i kilodalton) er angitt med piler. Posisjonene til rekombinant ukløyvet forløper (a), rekombinant forløperrest (b) og plateforløper-rest (c) er også angitt. Fig. 41. Identifisering av immunoreaktiv TGF-el fra tunika-mycin (TU) behandlede CHO-celler og fra ubehandlede CHO-celler. Celler dyrket til sammenflyting i fullstendig kulturmedium ble behandlet med 2,5 pg/ml TU ved en slutt dimetylsulfoksid-konsentrasjon på 0,1$ (v/v) i 4 timer. Serum-fritt medium som inneholder TU ble deretter tilsatt og oppsamlet etter 24 timer. Kontrollceller mottok bare 0,1$ ;(v/v) dimetylsulfoksid. For sekrerte proteiner ble mediet dialysert mot 0,1 M eddiksyre, tørket og analysert ved immunoblott ing. Bokstavene a, b og c som er i senter av immunoblottet angir de tre formene for TGF-el. Dette immunoblottet representerer proteiner som er sekrert fra 2 x 10<5 >celler i 1 ml medium. For cellulær assosiert form av TGF-el, ble 5 x IO<5> celler oppsamlet og analysert ved immunoblotting. ;Antistoffene som ble utnyttet var en blanding av forløper- og moden-spesifikke antipeptid-antistoffer (Seksjon 7.1.8, nedenfor). Fig. 42. Tidsforløpet for sekresjon av TGF-el av transfektert CEO-cellelinje TGF-e3-2.000 klon 17. (A) SDS-PAGE av betingelsesmediet oppsamlet i forskjellig tid fra pulsmerkede CHO-celler. Cellene ble pulsmerket i 0,5 timer med en kombinasjon av [35-C]-cystein og [35-S]-metionin. Mediet ble fraksjonert på en 7,5-20$ gradient SDS-polyakrylamidgel under reduserende betingelser. Markørproteiner (kDal) er lokalisert til høyre for figuren. (B) Kvantitering av TGF-el sekrert fra CHO-cellene i forskjellige tider. Siden forholdet mellom moden TGF-el til mengden av TGF-el forløper ikke varierte under sekresjonen, ble relativt nivå av rekombinant vekst-faktor sekrert målt ved densitometrisk scan av 12 kDal TGF—el observert i fluorogrammet. Hvert punkt representerer middel-verdien av tredoble eksperimenter og inkluderer standardavvik. Relative mengden av moden TGF-el sekrert ved 20 timer var vurdert som 1,0. Fig. 43. Effekt av glykosyleringshemmere på sekresjon av TGF-el i CHO-celler. (A) Sammenflytende kulturer -med celler ble inkubert i medium som manglet serum, metionin og cystein i 1 time til en 0,5 timers pulsmerking med [35-S]-cystein og -metionin. Hemmere ble utnyttet i følgende konsentrasjoner; 0,23 mM SV, 0,52 mM CA, 4 mM dN, 4 mM dMM og 6 pM TU. Etter 6 timers behandling ble betingelsesmediet fraksjonert på SDS-polyakrylamidgeler og fluorografert. Markører er identiske med de som er beskrevet i Fig. 41. (B) Kvantitering av rekombinant vekstfaktor sekrert av CHO-celler etterfulgt av behandling med hemmerne. Den relative mengden vekstfaktor ble bestemt med densiometisk scan av fluorogrammet. Resultatene er fra 3 uavhengige eksperimenter med standardavvik illustrert. Den relative mengden av moden TGF-el i kontroll CHO-celler ble betraktet som 1,0. ;Fig. 44. Spalting av sekrerte TGF-el proteiner fra hemmings-behandlede celler med glykosyleringstrimmende enzymer. Betingelses-kulturmedium fra de transfekterte CHO-cellene merket med [35-S]-metionin og -cystein ble oppsamlet etter en 6 timers behandling og spaltet med endo H, neuraminidase eller N-glykanase. De spaltede produktene ble fraksjonert på reduserende 7,5-20$ gradient polyakrylamidgeler og fluorografert. Markører som er tegnet til venstre og til høyre for fluorogrammene er identiske til de som er beskrevet i Fig. 41. Fig. 45. Fosforylering av TGF-el forløpere fra CHO-celler behandlet med glykosyleringshemmere. Sammenflytende kulturer av TGF-e3-2.000 klon 17 CHO-celler ble merket med [32-P]-ortofosfat og prosessert som beskrevet i Seksjon 12.1 og følgende. Det merkede kulturmediet ble oppsamlet og overskudd [32-P]-ortofosfat fjernet med en Sephadex G-25 avsaltings-kolonne. 32-P-merkede proteiner ble fraksjonert ved reduserende SDS-PÅGE og autoradiografert. Markørproteiner (KDal) er lokalisert til høyre for autoradiogrammet og bokstavene "a" og "b", som er vist til venstre representerer TGF-el forløper-polypeptidene. Fig. 46. Delesjonsmutant som mangler tre glykosylerings-signaler blir ikke sekrert fra celler. (A) Diagram for konstruksjon av en delesjonsmutant av TGF-el som mangler glykosylerings-signalsekvensene og dens innføring inn i det transiente ekspresjonsplasmidet CDM8. Sac II ble utnyttet for å fjerne DNA som koder for de tre glykosyleringssekvensene til TGF-el. Denne delesjonen resulterer i rammefjerning av 160 aminosyrer; mutantproteinet blir sammensmeltet mellom Arg—50 og Gly-211 ved å anvende nummererings-nomenklaturen til Sharples et al. og vil bli referert til som A51-210 TGF-el. (B) Transient ekspresjon av A51-210 TGF-el i Cos-1 celler. Cos-1 celler ble dyrket til halvsammensmelting og transfektert med CDM8 som inneholder A51-210 TGF-el cDNA-innføring. Transfeksjonsforholdene var som beskrevet i ;Seksjon 12.1.7. nedenfor. 48 timer etter transfeksjon ble cellene inkubert i medium som mangler serum bg oppsamlet 48 timer senere. Betingelsesmediet ble dialysert mot 0,1 M eddiksyre, tørket og analysert ved immunoblotting ved å anvende forløper- og modne-spesifikke antipeptid-antistoffer til TGF-el. Fig. 47. Ionoforer eller svake baser, som påvirker intra-lysosomal pH, hemmer den proteolytiske prosesseringen av TGF-ei-molekylet i CHO-celler. (A) SDS-PAGE analyse av betingelsesmedie oppsamlet etter 6 timers behandling. Cellene ble behandlet ved konsentrasjonene som er angitt. Markører til venstre og høyre av figuren er identiske med de vist i Fig. 41. (B) Kvantitativ fastsettelse av proteolytisk prosessering av de sekrerte TGF-el molekylene. Til disse eksperimentene ble celler behandlet med 200 pM kloroquin, 1 jjM monensin eller 10 mM ammoniumklorid. De relative mengdene rekombinant vekstfaktor ble beregnet fra densitometer-scan av fluorogram ved å summere den totale mengden TGF-el som var sekrert og normalisere nivåene til rekombinant vekstfaktor. Etter normalisering ble mengden av moden TGF-el som var tilstede bestemt ved densitometri og dette angav nivået av proteolytisk prosessering. Hvert punkt representerer tre uavhengige eksperimenter og inkluderer standard avvik. Den relative prosessering av rekombinant TGF-el fra kontrollceller er behandlet som 1,0. Fig. 48. Glykosidase-behandling av rekombinante TGF-el polypeptider sekrert fra CHO-celler som var blitt behandlet med kloroquin, monensin og ammoniumklorid. Betingelsesmedium fra TGF-e3-2.000 klon 17 celler pulsmerket og inkubert med ammoniumklorid (10 mM), kloroquin (200 jjM) eller monensin (1 jjM) ble behandlet med Endo H, neuraminidase eller N-glykosidase. De spaltede produktene ble analysert med SDS-PAGE og fluorografi. Markører var som beskrevet i Fig. 41. Fig. 49. Gamma interferon-indusert aktivering av LnTGF-ei ved monocytter er doseavhengig. Monocytter (2 x<:>10^ celler/ml) ble dyrket i Costar 96-brønns mikrotiter-plater med 5 jig/ml av renset latent rTGF-el (LnTGF-ei), i fravær (kontroll) eller nærvær av økende konsentrasjoner av r-ylNF fra 10 til 1.000 U/ml. Cytokin ble tilsatt til kulturbrønnene samtidig med Ln TGF-el og supernatanter ble høstet 24 timer senere og analysert for TGF-e aktivitet behandlende den veksthemmende analysen beskrevet i Seksjon 7.1.6. nedenfor. Fig. 50. Funksjonell identitet til -YlNF-mediert, monocytt-aktivert TGF-el med plate-avledet TGF-e. Serum-frie 24 timers supernatanter ble høstet fra monocytter kulturert i nærvær av 100 U/ml av r-ylNF og 5 jig/ml LnTGF-e aktivitet ble kvantitert i samlede prøver ved testing i tredoble seriefortynninger i veksthemmings-analysen beskrevet i Seksjon 7.1.6. nedenfor, ved å anvende en kjent TFG-e platestandard. Log-fortynninger av monocytt-aktivert TFG-e (1, 10, 100 ng) ble deretter testet i normale rottenyrer (NRK) celleforankret uavhengig vekstanal.yse (Twardzik et al., 1982, Science 216: 894-897) i nærvær eller fravær av 30 pg/ml av et nøytraliserende monoklonalt antistoff, ID 11.16, laget mot bovin TFG-ei som nylig beskrevet (Dasch et al., 1989, J. Immunol. 142:1536-1541). Kolonier som var større enn 20 celler ble vurdert i 8 tilfeldige lavstyrke-felt. Fig. 51. SDS-PAGE analyse av "YlNF-indusert, monocytt-aktivert TGF-el. Celler avledet fra den parenterale TGF-e3-2.000 cellelinjen ble inkubert over natten i serum-fritt DMEM som inneholder <3>H-leucin (Amersham L-C4,5-3H); 45-70 Ci/mM, 0,5 mCi/ml. Supernatanter ble høstet og <3>H-leucinmerket LnTFG-el kompleks ble renset som beskrevet i Seksjon 13.1.1. nedenfor. Monocytter (1 x IO<7> celler/ml) ble inkubert i DMEM som inneholder 0,5$ humant serum med 1,6 x 10^ cpm <3>H-leucinmerket TFG-eip kompleks i nærvær eller fravær av 100 U/ml r^-INF i 12 timer, supernatanter ble klargjort og analysert ved SDS-PAGE (12,5$) under ikke-reduserende ;betingelser. Markører inkluderer bovint serumalbumin, 68 kd; ovalbumin, 45 kd; karbonanhydrase, 30 kd; cytokrom C, 14 kd og TGF-e, 24 Kd, og ble synliggjort ved sølvfarging (Dasch et al., 1989, J. Immunol. 142:1536-1541). <3>E-leucinmerket protein ble påvist ved autoradiografi på Kodak X-omat AR-film med lys og intensiverende skjerm. Brønn A, monocytter pluss ;-y—INF, brønn B, monocytter uten -y-INF. ;5. Beskrivelse av oppfinnelsen ;Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av transformerende vekstfaktor-el analoger der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) dyrking av en eukaryot vertcelle som inneholder en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens som koder for nevnte protein som angitt i Fig. 1 med unntak av at kodene for minst en av cystein i posisjon 33,223 eller 225 er endret til serinkodon, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, samt seleksjonsmarkør, som koder for simian transformerende vekstfaktor-ei under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer genekspresjon slik at et peptid eller protein som har transformerende vekstfaktor-el aktivitet blir fremstilt av den ;eukaryote cellen; og ;(b) utvinning av den transformerende vekstfaktor-ei fra ;kulturen. ;Oppfinnelsen omfatter også eukaryotisk vertscelle som er kjennetegnet ved at den inneholder en nukleotidsekvens som koder for simian transformerende vekstfaktor-el ifølge krav 1. ;Oppfinnelsen angår også en nukleotidsekvens for koder for transformerende vekstfaktor-ei forløpermutein. ;Metoden i oppfinnelsen kan bli inndelt i følgende trinn: ;(a) isolering eller generering av den kodende sekvensen til forløperformen av simian TGF-el; (b) konstruksjon av en ekspresjonsvektor som vil styre ekspresjonen av den simian TGF-el kodende sekvensen; (c) transfeksjon av hensiktsmessige vertsceller som har evne til replikering og ekspresjon av genet og prosessering av genproduktet for å fremstille den modne biologisk aktive formen av TGF-el og/eller TGF-el forløperne; og (d) identifisering og rensing av TGF-el forløperne og den modne, biologisk aktive TGF-el- ;Med en gang en transfektant er identifisert som uttrykker høye nivåer av TGF-el forløpere og/eller bioaktive, modne TGF—el, innbefatter praktisering av oppfinnelsen ekspansjon av det klonet og isolering av genproduktet som blir uttrykt. ;Fremgangsmåten i oppfinnelsen blir her demonstrert ved hjelp av eksempler der cDNA fra simian TGF-el forløper-kodende region blir fremstilt, klonet og sekvensert. Den kodende regionen blir deretter plassert under regulering av SV40 ekspresjons-reguleringselementer og anvendt til å transfektere CHO-celler. CHO-transfektantene fremstilt på moden rTGF—el med biologisk aktivitet som ikke kunne skilles fra den til naturlig TGF-el såvel som større biologisk aktive forløperformer. ;De forskjellige trekkene av metoden i oppfinnelsen er beskrevet i detalj i avsnittene under og i eksemplene som følger. ;5.1. Isolering eller generering av den simian TGF- el kodende ;region ;Den nukleotidkodende sekvensen for simian TGF-el er tegnet i ;Fig. 1. I den praktiske gjennomføringen av fremgangsmåten i oppfinnelsen kan denne nukleotidsekvensen, eller dens funksjonelle ekvivalent bli anvendt til å skape rekombinante molekyler som vil dirigere ekspresjon av TGF-el produktet. På grunn av degenereringen av de nukleotid-kodende sekvensene, kan andre DNA-sekvenser som koder vesent-lig for samme aminosyresekvens som vist i Fig. 1 bli anvendt i praktisering av foreliggende oppfinnelse til kloning av TGF-el. Slike endringer i nukleotidsekvensen i Fig. 1 inkluderer delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av forskjellige nukleotidresidier som resulterer i en sekvens som koder for det samme eller et funksjonelt ekvivalent genprodukt. Genproduktet kan inneholde delesjoner, addisjoner eller substitusjoner av aminosyre-residier innenfor sekvensen, som resulterer i en stille endring som like fullt fremstiller et bioaktivt produkt. Slike aminosyre-substitusj oner kan bli gjort på basis av likhet i polaritet, ladning, løselighet, hydrofobisitet, hydrofilisitet og/eller den amfipatiske naturen til residiene som er involvert. For eksempel kan negativt ladede aminosyrer inkludere asparaginsyre og glutaminsyre; positivt ladede aminosyrer inkluderer lysin og arginin; aminosyrer med uladede polare hodegrupper eller upolare hodegrupper som har tilsvarende hydrofilisitets-verdier inkluderer de følgende: leucin, isoleucin, valin; glycin, alanin; asparagin, glutamin; serin, treonin; fenylalanin, tyrosin. ;Den nukleotidkodende sekvensen for TGF-el kan bli oppnådd fra simian cellekilder som produserer høye nivåer av TGF-ei-lignende aktivitet. Den kodende sekvensen kan bli oppnådd ved cDNA-kloning av RNA isolert og renset fra slike cellulære kilder eller ved genomisk kloning. Enten cDNA eller genomiske bibliotek med kloner kan bli fremstilt fra DNA-fragmenter som blir skapt ved å anvende godt kjente teknikker innenfor fagområdet og inkluderer, men er ikke begrenset til, anvendelse av restriksjonsenzymer. Fragmentene som koder TGF-el kan bli identifisert ved screening av slike bibliotek med en nukleotid-gensøker som i det vesentlige er komplementær til en hvilken som helst del av sekvensen som er tegnet i Fig. 1. Full-lengde kloner, dvs. de som inneholder den hele kodende sekvensen for TGF-el forløperen kan bli selektert for ekspresjon. ;I en alternativ utførelsesform av oppfinnelsen, kan den kodende sekvensen fra Fig. 1 bli syntetisert som et hele eller delvis, ved å anvende kjemiske metoder som er kjent innenfor fagområdet. ;I eksemplene som her er beskrevet, ble simian TGF-el kodende sekvens oppnådd ved cDNA kloning av TGF-el forløper kodende sekvens avledet fra polyadenylert RNA isolert fra African green monkey cellelinje, BSC-40, som har vist seg å produsere høye nivåer av en veksthemmer som er funksjonelt relatert til TGF-el. Hele den kodende regionen ble sekvensert og sammenlignet med de publiserte sekvensene fra human og murin TGF—el (se Fig. 1). Den utledede aminosyresekvensen til moden simian TGF-el demonstrerer 100$ homologi med den til moden human TGF—el. Forløpersekvensene demonstrerer også sterk sekvens-homologi med bare fem aminosyre-forskjeller mellom human og simian forløpersekvenser. Det er interessant at simian (og murin) forløpersekvens koder for en aminosyre-residie mindre enn sekvensen rapportert for human TGF-el (se Fig. 1, aminosyre-residienummere 158-159). ;Den bemerkelsesverdige bevaringen i sekvensen til TGF-el mellom simian-, gnager- og humane arter antyder at sterkt evolusjonært press var nødvendig, for å bevare viktig funksjonalitet. Dette anvendes ikke bare til moden form av TGF-el, som har en viktig bifunksjonell rolle som en vekstregulator, men også til polypeptid-regionen til forløper-oppstrøm av moden TGF-el sekvensen som også utviser vekst-modulatoriske aktiviteter. ;Hovedarten av TGF-el mRNA i BSC-40 celler er 2,5 kb, i overensstemmelse med resultatene oppnådd fra murine- og humane TGF-el spesifikke meldinger (Fig. 2). De mindre båndene som kan sees ved 4 kb og 1,4 5 kb kan representere enten avvikende prosesserte transkripter eller kan kode for et TGF-el lignende molekyl (CIF-B) som nylig «r beskrevet av Seyedin (1987, J. Biol. Chem. 262:1946-1949) som inneholder stor grad av homologi til TGF-el. ;Den utledede polypeptid-sekvensen til simian-, human- og muse-kloner inneholder en nesten identisk kontinuerlig streng av 14 hydrofobiske residier i posisjon 8-21 som kan utgjøre et aminoterminal-signalpeptid. I tillegg går et Arg-Arg dipeptid umiddelbart foran den aminoterminalen til moden TGF—el og dette antyder lignende proteolytiske kløyvings-seter. Simian TGF-el forløper inneholder også tre potensielle N-glykosyleringsseter som ikke er funnet i det modne molekylet. Således har ikke bare den primære strukturen til det modne og forløper-polypeptidet til TGF-el blitt konservert blant arter, men også bestemt post-translasjonale modifika-sj onsseter. ;BSC-40 celler som syntetiserer og frigjør høye nivåer av TGF-el relativt til andre cellelinjer er blitt undersøkt. Medie-betingelser ved BSC-celler inneholder en aktivitet som i nærvær av nanogram-nivå av EGF og TGF-alfa stimulerer en forankringsuavhengig vekst av NRK-celler og utviser biokjemiske karaktertrekk som er identiske til TGF-el renset fra humane plater (Frolik et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:3676-3680; Roberts et al., 1983, Biochemistry 22:5692-5698). I tillegg har isolering av en veksthemmer fra BSC-1 celler som er funksjonelt tilsvarende til TGF-el som konkurrerer med plate avledet fra TGF-el om binding til TGF-el membran-reseptorene blitt beskrevet (Tucker et al., 1984, Science 226:705-707). Den store mengden av TGF-el spesifikk mRNA syntetisert av BSC-40 celler, en cellelinje avledet fra BSC-1 celler, antyder at den bifunksjonelle vekstmodulatoren som er identifisert av Tucker et al. i BSC-1 betingelsesmedium er virkelig TGF-el. Dette er også støttet av senere data som bekrefter Tucker et al.'s observasjoner at TGF-el fra andre kilder også hemmer vekst av noen tumorceller i kultur (Roberts et al., 1985, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:119-123). Derimot har formelle bevis at: BSC-1 avledet hemmer virkelig er produktet fra genet som er beskrevet her og vil kreve sekvensanalyse av TGF-el lik aktivitet frigjort ved BSC-1 celler i kultur. ;5.2. Konstruksjon av eks<p>resjonsvektorer som inneholder ;TGF— el kodende sekvens ;For å uttrykke en biologisk aktiv, moden form av TGF-el, bør en ekspresjonsvektor/vertssystem bli valgt som frembringer ikke bare høye nivåer av transkripsjon og translasjon men også korrekt prosessering av genproduktet. Dette er særlig viktig når man benytter hele den kodende sekvensen til simian TGF-el forløper i ekspresjonskonstruksjonen på grunn av at den modne formen av TGF-el synes å være avledet fra forløper-produktet via cellulære prosesseringshendelser. Det foreslåtte prosesserings-skjema er presentert i Fig. 20. I tillegg kan ekspresjons/vertscellesystem som frembringer sekresjon av produktet bli selektert. ;Særlig synes det at moden TGF-el, en disulfid-linket homodimer med 112 aminosyrer pr. subenhet blir formet ved cellulær prosessering som involverer proteolytisk kløyving av full-lengde forløper ved Arg-Arg aminosyre (residienummer 277 og 278 i Fig. 1). I tillegg inneholder simian TGF-el forløper tre potensielle N-glykosyleringsseter som ikke er funnet i moden form og analyse av [<3>E] glykosaminmerket serum-frie supernatanter fra en linje med kinesiske hamsterovarie-celler som sekrerer store nivåer av rekombinant TGF-el indikerer at TGF-el forløper, men ikke den modne formen, er glykosylert. Således kan riktig glykosylering av forløperen være viktig for cellulær syntese og frigjøring eller sekresjon av det modne molekylet. TGF-el forløperen, men ikke den modne formen, er også fosforylert, og dette antyder ytterligere funksjonell viktighet hos forløperen. Videre omfatter den modne formen av TGF-Bl en disulfidlinket dimer som involverer ni cysteinresidier pr. subenhet. Noen av disse er involvert i interkjede og andre intrakjede disulfidbindinger som påvirker den tertiære strukturen og konfigurasjonen- av det modne molekylet, og som resultat dens biologiske aktivitet. Således er evnen til en vertscelle, som blir anvendt i ekspresjonssystemet, å korrekt uttrykke og prosessere simian TGF-Bl genproduktet viktig for fremstillingen av et biologisk aktivt, modent TGF-Bl. ;I de beskrevne eksemplene ble den modne, bioaktive formen av TGF-Bl produsert med hell ved å anvende simian virus 40 (SV40) ekspresjons-kontrollelementer i et kinesisk hamsterovarie (CHO) vertscellesystem. Derimot kan en lang rekke andre dyre-vert/ekspresjonsvektor systemer (dvs. vektorer som inneholder de nødvendige elementene for dirigering av replikasjon, transkripsjon og translasjon av den TGF-Bl kodende sekvensen i en hensiktsmessig vertscelle) bli utnyttet på samme heldige måte for en fagperson. Dette inkluderer, men er ikke begrenset til, virusekspresjons-vektor/pattedyrvertscellesystemer (dvs. cytomegalovirus, vaccinia virus, adenovirus og lignende); insektvirus ekspresjonsvektor/insektscellesystemer (f.eks. baculovirus); eller ikke-virale promoter ekspresjonssystemer avledet fra genomene til pattedyrceller (f.eks. muse-metallotion promoter ). ;Ekspresjonselementene til disse vektorene varierer i deres styrke og spesifisiteter. Avhengig av verten/vektor-systemet som ble utnyttet, kan en hvilken som helst av en lang rekke hensiktsmessige transkripsjons- og translasjonselementer bli anvendt. For eksempel når man kloner i pattedyr-celle-systemer, kan promotere isolert fra genomet til pattedyrceller (f.eks. muse-metallotionien promoter) eller fra virus som vokser i disse cellene, (f.eks. vaccinia virus 7,5 K promoter) bli anvendt. Promotere fremstilt ved rekombinant DNA eller syntetiske teknikker kan også bli anvendt for å frembringe transkripsjon av disse innsatte sekvensene. Spesifikke initieringssignaler er også nødvendige for tilstrekkelig translasjon av innsatte : proteinkodende sekvenser. Disse signalene inkluderer ATG-initieringskodon og tilgrensende sekvenser. I tilfelle der hele TGF-el genet inkluderer sitt eget initieringskodon og tilgrensende sekvenser blir innsatt i hensiktsmessige ekspresjonsvektorer, er det ikke nødvendig med ytterligere translasjons-kontrollsignaler. Derimot i de tilfellene der bare en del av den kodende sekvensen blir innsatt, er det nødvendig med eksogene translasjons-kontrollsignaler, inkludert ATG-initieringskodon. Videre må initieringskodonet være i fase med leserammen til den TGF-el kodende sekvensen for å forsikre translasjon av hele innsettingen. Disse eksogene translasjons-kontrollsignalene og initieringskodon kan være av forskjellig opprinnelse, både naturlig og syntetisk. Effektiviteten til ekspresjonen kan bli forøket ved å omfatte transkripsjons-attenueringssekvenser, forøkningselementer etc. ;Enhver av metodene som nylig er beskrevet for innsetting av DNA-fragmenter inn i en vektor kan bli anvendt til å konstruere ekspresjonsvektorer som inneholder TGF-pl genet og hensiktsmessige transkripsjons/traslasjons kontrollsignaler. Disse metodene kan inkludere in vitro rekombinante DNA-teknikker, syntetiske teknikker og in vivo rekombinasjoner (genetisk rekombinasjon). ;I det tilfelle der et adenovirus blir anvendt som en ekspresjonsvektor, kan den TGF-pl kodende sekvensen bli ligert til et adenovirus transkripsjons/translasjons-kontrollkompleks, f.eks. den sene promoteren og den tredelte ledersekvensen. Dette chimeriske genet kan deretter bli innsatt i adenovirus-genomet ved in vitro eller in vivo rekombinasjon. Innsetting i en ikke-essensiell region i det virale genomet (f.eks. region El eller E3) vil resultere i et rekombinant virus som er levedyktig og har evne til å uttrykke TGF-el i infiserte verter. På tilsvarende måte kan vaccinia 7,5 K promoter bli anvendt. ;Et alternativt ekspresjonssystem som kan bli anvendt for å utvikle TGF-el er et insektssystem. I et slikt system blir Autographa californica nukleær polyhedrosis-virus (AcNPV) anvendt som en vektor til å uttrykke fremmede gener. Viruset vokser i Spodoptera frugiperda-celler. Den TGF-el kodende sekvensen kan bli klonet inn i ikke-essensielle regioner (for eksempel polyhedrin-genet) til viruset og plassert under kontroll av en AcNPV-promoter (for eksempel polyhedrin-promoteren). Vellykket innsetting av den TGF-el kodende sekvensen vil resultere i inaktivering av polyhedrin-genet og fremstilling av ikke-okkludert rekombinant virus (dvs. virus som mangler den proteinaktige kappen som er kodet av polyhedrin-genet). Disse rekombinante virusene blir deretter anvendt til å infisere Spodoptera frugiperda-celler der det innsatte genet blir uttrykt. ;I tillegg kan en vertscelle-stamme bli valgt som modulerer ekspresjon av de innsatte sekvensene, eller modifiserer og prosesserer genproduktet på den spesielle ønskede måten. Ekspresjon fra visse promotere kan bli hevet i nærvær av visse induserere (f.eks. zink- og kadmium-ioner for metallo-tionein-promotere). Derfor kan den genetisk fremstilte TGF-el bli kontrollert. Dette er viktig hvis proteinproduktet av det klonede fremmede genet er letalt for verten. Videre er modifikasjoner (f.eks. glykosylering) og prossessering (f.eks. kløyving) av proteinproduktene viktig for funksjonen av proteinet. Forskjellige vertsceller har karakteristiske og spesifikke mekanismer for etter-translasjons prosessering og modifisering av proteiner. Hensiktsmessige cellelinjer og vertssystemer kan bli valgt slik at man forsikrer at det blir korrekt modifikasjon og prosessering av det fremmede proteinet som blir uttrykt. ;5.3. Identifikas. ion av transfektanter eller tranformanter som ;uttrykker TGF- el genproduktet ;Vertscellene som inneholder den simian TGF-el kodende sekvensen og som uttrykker det biologisk aktive, modne produktet kan bli identifisert med minst fire generelle fremgangsmåter: (a) DNA-DNA hybridisering; (b) tilstedeværelse eller fravær av "markør"-genfunksjoner; (c) fast-setting av transkripsjonsnivå målt ved ekspresjon av TGF-el mRNA-transkripter i vertscellen; og (d) påvisning av det modne genproduktet målt ved immunoanalyse og, endelig, ved dets biologiske aktivitet. ;I den første fremgangsmåten, kan nærvær av den simian TGF-el kodende sekvensen som er innsatt i ekspresjonsvektoren bli påvist ved DNA-DNA hybridisering ved å anvende gensøkere som omfatter nukleotidsekvenser som er homologe til den simian TGF-el kodende sekvensen som i det vesentlige er vist i Fig. 1, eller deler eller derivater derav. ;I den andre fremgangsmåten kan rekombinant ekspresjonsvektor/vertssystem bli identifisert og selektert basert på nærvær eller fravær av visse "markører"-genfunksjoner (f.eks. tymidin-kinaseaktivitet, resistens til antibiotika, resistens til metotreksat, transformasjons-fenotype, okklusjonslegeme-dannelse i baculovirus, etc). For eksempel hvis den TGF-el kodende sekvensen blir innsatt i en markør-gensekvens til vektoren, kan rekombinanter som inneholder den TGF-el kodende sekvensen bli identifisert ved fravær av markørgenfunksjonen. Alternativt kan et markørgen bli plassert i tandem med TGF-el sekvensen under kontroll av den samme eller forskjellige promotere som ble anvendt til å kontrollere ekspresjon av den TGF-el kodende sekvensen. Ekspresjon av markøren som svar på induksjon eller seleksjon indikerer ekspresjon av den TGF-el kodende sekvensen. ;I den tredje fremgangsmåten kan transkripsjonen aktivitet av den TGF-el kodende regionen bli fastslått ved hybridiserings-analyser. For eksempel kan polyadenylert RNA bli isolert og analysert ved Northern blot ved å anvende en gensøker som er homolog til den TGF-el kodende sekvensen eller særlige deler av den. Alternativt kan totale nukleinsyrer av vertscellen bli ekstrahert og analysert for hybridisering til slike gensøkere. ;I den fjerde fremgangsmåten kan ekspresjon av modne protein-produkter bli fastslått immunologisk, for eksempel ved Western blot, immunoanalyser slik som radioimmuno-utfelling, enzym-1inkede immunoanalyser og lignende. Den endelige undersøkelsen på hvor heldig ekspresjonssystemet er, involverer derimot påvisning av det biologisk aktive TGF-el genproduktet. Der vertscellen sekrerer genproduktet kan det cellefrie mediet som er oppnådd fra den dyrkede transfektant-vertscellen bli analysert for TGF-el aktivitet. Der genproduktet ikke blir sekrert, kan cellelysatene bli analysert for slik aktivitet. I begge tilfellene kan biologiske analyser slik som veksthemmings-analyse beskrevet her, eller stimulering av forankrings-uavhengig vekst i målceller, også beskrevet her eller lignende bli anvendt. ;Med en gang et klon som produserer høye nivåer av biologisk aktiv, moden TGF-el er identifisert, kan klonet bli oppfor-mert og TGF-el kan bli renset ved å anvende teknikker som er kjent innenfor fagområdet. Slike metoder omfatter immunoaffi-nitetsrensing, kromatografiske metoder inkluderer høyeffekts-væskekromatografi og lignende. ;Til tross for det faktum at aminosyre-sekvensen til simian TGF-el forløper adskiller seg noe fra den til foreslåtte humanforløper, er aminosyresekvensen til den biologisk aktive modne formen av simian TGF-el fremstilt ifølge oppfinnelsen identisk med den i human moden form. I tillegg har simian TGF-el fra oppfinnelsen en biologisk aktivitet som ikke kan adskilles fra den i naturlig TGF-el. Dette antyder at ekspresjon/vertscelle-systemene til oppfinnelsen har evne til prosessering av ekspresjonsproduktet slik at et molekyl som har biologisk aktivitet som er identisk med de-t som autentisk naturlig TGF-el blir fremstilt. Som et resultat kan simian TGF-el fremstilt ifølge denne oppfinnelsen bli benyttet i alle anvendelser der TGF-el vil bli anvendt. ;5.4. Initiell karakterisering av TGF- el genproduktet Aminosyredelen av forløperregionen til TGF-el fra menneske-, gnager- og simian-kilder viser en høy grad av homologi (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705; Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379; Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244), og dette antyder at en viktig biologisk funksjon kan være tilknyttet med denne delen av molekylet. Data som er presentert i Seksjon 8 nedenfor demonstrerer at denne delen av TGF-el forløperen blir glykosylert og fosforylert og støtter dette konflikten siden man må anta at en celle ikke vil gjennomgå anstrengelsen med å gjennomføre disse sekundære modifikasjonene dersom det ikke var for en spesifikk funksjon. Disse modifikasjonene kan være viktige for dimerisering av forløperen eller for å styre dens bevegelse ut av cellen: kanskje dette fosfo-glykoproteinet er fritt til å utføre andre intra- eller ekstracellulære funksjoner. Det er bevis som antyder at glykosylering av forløperen er involvert i transport av moden TGF-el ut av cellen. ;5.5. TGF- el forløperen: Cellulær prosessering, strukturell ;natur og mulig funks. ion ;cDNA-kloning av TGF-el beskrevet i Seksjon 6 nedenfor, antyder at molekylet undergår en lang rekke etter-transla-sjonsprosesseringshendelser før sekretorisk utgang (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705; Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379; Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244). Proteinrensing og aminoterminale sekvenseringsteknikker ble anvendt til å karakterisere rekombinante TGF-el proteiner fremstilt og frigjort av CHO-TGF-el-3-2.000 celler (Seksjon 8 nedenfor ). ;Aminoterminal-sekvensanalyse av isolert forløper og moden TGF—el polypeptider som er beskrevet i Seksjon 8.3 og 8.4 nedenfor, frembringer informasjon om disse proteolytiske prosesseringshendelsene. Forløper polypeptider isolert fra reduserte polyakrylamid-geler genererte en hoved proteinsekvens som i henhold til det som er foreslått fra simian cDNA (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) begynner ved Leu—30 i TGF-el forløperen. Ingen heterogenitet i den aminoterminale sekvensen ble observert og dette indikerer en spesifisitet i proteolytisk prosessering. Dette resultatet medfører at Gly-29/Leu-30 peptidbindingen som signalpeptid-kløyvingssete med et som er forutsagt i signalpeptid-forut-sigelsesmetoden til von Heijne (von Eeijne, 1986, Nucleic Acids. Res. 14:4683-4690). I tillegg til signalpeptid-kløyving, viste rensing og undersøkelse av den modne TGF—el (Seksjon 8.2 og 8.4 nedenfor) at rTGF-el blir proteolytisk prosessert på det foreslåtte dibasiske proteasesetet (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) og dette resulterer i et modent polypeptid. Videre antyder proteinsekvens-analyse av karboksy-terminal CNBr-fragmentet av moden TGF-el et intakt molekyl. Således innehar CHO-celler de hensiktsmessige proteasene som er nødvendige for korrekt prosessering av pre-pro-TGF-ei. ;Den hovedbiologiske aktiviteten som er sekrert av transfekterte CHO-celler er den modne dimeriske vekstfaktoren. Resultatene som er presentert i Seksjon 8.2 nedenfor, indikerer at mer enn 95$ av aktiviteten som er tilstede i CHO-betingelsesmediet renses sammen med moden rTGF-el, mens mindre enn 5$ renses sammen med den større rTGF-el for-løperen. I tillegg oppfører rekombinant TGF-el seg identisk med nTGF-ei og innehar en identisk spesifikk biologisk aktivitet (Seksjon 8.5 nedenfor). I motsetning var rTGF-el forløperen 50 ganger mindre aktiv enn den modne vekstfaktoren. En sammenligning av minklunge-hemmingsprofiler viser en svakt endret dose-responskurve og det antyder en forskjellig reseptoraffinitet for forløperen sammenlignet med den modne TGF-el. : Selv om resultatene presentert i Seksjon 8.5 nedenfor og diskusjonen ovenfor antyder at rTGF-el forløperen er biologisk aktiv, har en dyptgående strukturell analyse lagt for dagen noen vriene uregelmessigheter som kompliserer defini-tive forklaringer. Proteinsekvens-analyse og SDS-PAGE viste at den isolerte forløperen bestod av pro-TGF-ei, moden TGF—el og pro-regionen av forløperen interlinket med disulfid-bindinger. Kjemisk kløyving av denne disulfid-linkede blandingen med CNBr og adskillelser av CNBr-peptider viste klart at CYS-33 i forløperen danner en disulfid-binding med et cysteinresidie av moden TGF-el (Fig. 20A). Eksistensen av den monomeriske kjeden i TGF-el tilknyttet forløpersekvensene begrenser enhver avgjørende konklusjon som kan bli gjort som vedrører den biologiske aktiviteten til den intakte for-løperen. Dannelsen av dette disulfid-linkede komplekset i CHO-celler reiser et spørsmål om betydeligheten i vev og celler som sekrerer TGF-el naturlig. Det meget høye sekresjonsnivået av rTGF-ei-polypeptider av CHO-celler kan føre til en unaturlig tverrbinding som skyldes upassende foldet rTGF-el og dette resulterer i en kunstig ekspresjon. Alternativt kan det disulfid-knyttede forløperkomplekset representere et viktig mellomprodukt i TGF-el prosessering. Studier som viser at disulfid-bindingen dannet ved CYS-33 i for-løperen ikke er nødvendig for produksjon av moden, bioaktiv TGF-el og dette antyder at slike komplekser ikke trenger å være nødvendige mellomprodukter (Seksjon 5.7. og 10 nedenfor). Disulfid-bundne forløperkomplekser har blitt observert i latente isolerte former av TGF-el (Miyazono et al. 1988, J. Cell Biochem. Suppl. 12A:200; Wakefield et al., 1987, J. Biol. Chem. Suppl. 11A:46). ;Basert på resultatene som er presentert i Seksjon 8.2-8.5 nedenfor, blir prosessering av pre-pro-TGF-ei i transfekterte CHO-celler foreslått (Fig. 20B). Selv om det foreslåtte prosesserings-skjerna ikke er fullstendig, legger det vekt på flere av trinnene som har blitt i det minste delvis definert. Selv om rekkefølgen av de forskjellige bearbeidingstrinnene ikke er blitt karakterisert fullstendig, blir de beskrevet som at de foregår etter hverandre for å forenkle forståelsen. Det første trinnet involverer signalpeptid-kløyving ved Gly—29/Leu-30 peptidbindingen. Denne kløyvingshendelsen foregår for det meste co-translasjonelt under passering av forløperen gjennom den grove endoplasmatiske retikulum-membranen (Blobel og Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol. 67:835-851; Walter et al., 1984, Cell. 38:5-8). Etterfulgt av kløyving av signalpeptidet, blir kjerne-glykosyleringsenheter (Rothman et al., 1978, Cell 15:1447-1454) tilsatt til pro-TGF—<p>l på hver av de foreslåtte N-glykosyleringssetene lokalisert på Asn-82, Asn-136 og Asn-176 (Seksjonene 8.1 og 9). Kjerne-glykosylert pro-TGF-ei blir deretter sekvensielt prosessert under passering gjennom golgi for å gi et fosforylert glykoprotein, som inneholder komplekse, sialerte oligosakkarider. Ved et trinn i syntesen eller passeringen, foregår proteolytisk kløyving ved det dibasiske residiet og disulfid-isomerering, og frigjøring av moden TGF-el. ;Resultatene er presentert i Seksjon 12. og etterfølgende og antyder at riktig karbohydrat-prosessering er nødvendig for sekresjon av TGF-el polypeptidet fra den transfekterte CHO-linje TGF-e3-2.000 klon 17. Glykosylerings-hemmere som påvirker tidlige trinn av karbohydrat-prosessering endrer drastisk effektiviteten til sekresjonsprosessen. Videre studier med en delesjonsmutant av TGF-el som manglet tre glykosyleringsseter la også for dagen defekter i sekresjon, og er mest sannsynlig defekt i intracellulær dirigering og akkumulerer sannsynlig i det endoplasmatiske retikulum. I motsatt fall fører hemmere som påvirker senere trinn i prosessering ved inhibering av tilstedeværelse av manno-sidaser innenfor golgi, til økning i TGF-el sekresjonen. Selv om signalene som er involvert i intracellulær dirigering ikke er helt forstått, antyder disse resultatene at karbohydrat-prosessering er nødvendig for korrekt sekretorisk utgang av TGF-el og at tidlige trinn med omforming er mest kritisk for dens intracellulære dirigering. Karbohydratet i seg selv kan spille en direkte rolle i sekresjonen hvorved spesifikke reseptorer for oligosakkarid-sidekjedene direkte kan hjelpe proteinet gjennom den sekretoriske prosessen. Alternativt kan karbohydratet funksjonere på en mer indirekte måte ved å bestemme en spesifikk og nødvendig konfirmasjon for TGF-el transporten. ;Det er to typer veier som fører til sekresjon av proteiner, regulert og ikke-regulert (konstitutiv). Regulerte veier er i hovedsak funnet i sekretoriske celletyper og krever en ytre stimuli for å frigjøre materiale innenfor de sekretoriske vesiklene. Transfekterte CHO-celler beskrevet her er for det meste av ikke-regulert type. Resultatene viser lave nivå av proteolytisk prosessert TGF-el innenfor CHO-cellene og indikerer ingen oppsamling av moden vekstfaktor, og dette er i overensstemmelse med en ikke-regulert type frigjøring. TGF—el kan også bli sekrert og frigjort på en regulert vei. Denne polypeptid-vekstfaktoren er en hovedkomponent i plater og blir frigjort fra plater ved trombin-behandling. ;TGF-el polypeptidet blir kløyvet ved karboksy-terminalsiden av fire basiske residier som frigjør moden TGF-el som begynner ved Ala-279. Studier som er presentert i Seksjon 12 og etterfølgende anvender reagenser som påvirker intravesikulær pH, demonstrerer at kløyving foregår innenfor sure vesikulære avdelinger på mye av samme måten som prosessering av insulin og neuropeptid-forløpere. Egenskaper til disse prosesserings-proteasene er generelt ikke helt forstått. Eksistensen av parede baseresidier ved kløyvingssetet kan være nødvendig for effektiv proteolyse. Det er interessant å bemerke at i alle TGF-e familiemedlemmene som er nylig identifisert, er aminoterminal-residiet til det modne TGF-e polypeptidet forutgått av flere basiske aminosyre-residier. Hemmere av glykosylerings-prosessering som kan endre den tertiære strukturen av TGF-el polypeptidet hadde liten eller ingen effekt på proteolytisk prosessering og dette antyder at denne regionen kan være tilstrekkelig eksponert■i forløperen uavhengig av karbohydrat-prosessering. De mange basiske residiene som kommer foran de amino-terminale gruppene hos modne TGF-e familiemedlemmer kan fremheve denne regionen til spesifikk proteolyse. ;5.6. Interaksjoner av TGF- el forløper med insulin- 1ignende ;vekstfaktor- II/ mannose- 6- fosfat reseptor ;Resultatene. beskrevet i Seksjon 9 nedenfor viser tilstedeværelse av mannose-6-fosfat i TGF-el forløper og reiser den mulighet at forløperen innehar en uavhengig funksjon. De ytterligere studiene som er beskrevet i Seksjon 11 og senere, demonstrerer at TGF-el forløper bindes til den insulin-lignende vekstfaktor-II/mannose 6-fosfat-celleoverflate-reseptoren. Disse studiene presenterer også bevis for at bundet TGF-el forløper er internalisert. ;Mannose-6-fosfat, en fosforylert sukkeranalog, synes å spille en fundamental rolle i den målrettede transporten og inter-cellulær utveksling av lysosomale enzymer (von Figura, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:167-193). Spesifikke reseptorer som gjenkjenner mannose-6-fosfat residiene til lysosomale enzymer er blitt identifisert og er vesentlige bestanddeler i transportsystemet. Sekrerte lysosomale proteiner som inneholder mannose-6-fosfat har blitt identifisert i betingelsesmediet med vevskultur-celler (Gal og Gottesman, 1986, J. Biol. Chem. 261:1760-1765; Capony et al., 1981, J. Cell. Biol. 104:253-262; Baumbach et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:2985-2989; Sahagian og Gottesman, 1982, J. Biol. Chem. 257:11145-11150). Alle disse proteinene utviser derimot sur hydrolyse-aktivitet. Mannose-6-fosfat residiene til TGF-el forløper kan dirigere pro-TGF-el til lysosomer for proteolytisk prosessering for å gi moden TGF-el. Alternativt kan mannose-6-fosfat residiene fungere som mål for den kløyvede TGF-el forløperen til lysosymer for degradering. ;Det er nylig blitt rapportert at kation-avhengig mannose-6-fosfat reseptorer er identiske til den insulin-lignende vekstfaktor II (IGF-II) reseptoren (Morgan et al., 1987, Nature 329:301-307; Roth et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm. 149:600-606; MacDonald, 1988, Science 239:1134-1137). Denne reseptor synes å være bifunksjonell og inneholder adskilte bindingsseter for IGF-II og mannose-6-fosfat. Selv om den biologiske viktigheten til en enkel reseptor som binder IGF-II og proteiner som inneholder mannose-6-fosfat er uklar, kan denne bifunksjonelle reseptoren spille en viktig rolle i signalomsetting og/eller til målrettet sortering av reseptorbundne proteiner. Proliferin, et prolaktin-relatert glykoprotein, er antatt å være en autokrin vekstregulator (Lee og Nathens, 1987, Endocrinology 120:208-213), har vært vist å inneholde mannose-6-fosfat og binder tett til IGF-II /mannose-6-fosfat reseptorer l(Lee og Nathens, 1988, J. Biol. Chem. 263:3521-3527). Det er mulig at TGF-el forløperen reagerer spesifikt med denne bifunksjonelle eller andre mannose-6-fosfat celleoverflate-reseptorer. ;Det er fastslått at rekombinant TGF-el forløper har evne til å binde til IGF-II/man6P-reseptor på plasmamembranen til celler basert på resultatene av in vitro-studier. slik som de beskrevet i Seksjon 11. og etterfølgende, og demonstrerer at: (1) rTGF-el forløper-binding til rotte-adipocytter blir forøket ved insulin-indusert translokasjon av IGF-II/man6P reseptor til plasmamembranen; (2) rTGF-el forløperbindingen til CHO-celler overuttrykker IGF-II/man6P reseptoren og er større enn binding til parenterale CHO-celler; og (3) rTGF-el forløperens binding til både rotte-adipocytter og CHO-celler blir spesifikt hemmet av mannose-6-fosfat. ;Mannose-6-fosfat hemmer halvveis i forhold til maksimalt bindingen av rTGF-el til CHO-celler som overuttrykker IF-II/man6P reseptoren (transfekterte CHO-celler) i en konsentrasjon på 10 pM, en verdi som er i nærheten av den som nylig er funnet (8 pM) til halvveis av maksimal hemming av binding til den isolerte reseptoren (Seksjon 9.2. ovenfor). I tillegg var mannose-l-fosfat mye mindre effektiv i hemmende binding enn man6P, og disse resultatene er i overensstemmelse med kjente spesifisiteter til IGF-II/man6P reseptoren for disse to sukkere (Von Figuro og Hasilik, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:167-193). ;Det antas at rTGF-el forløperen blir raskt internalisert etter binding til IGF-II/man6P reseptoren på transfekterte CHO-celler basert på resultatene beskrevet i Seksjon 11.2.1. nedenfor. Etter binding ved 37"C til IGF-II/man6P reseptoren på transfekterte CHO-celler, kan rTGF-el forløper raskt bli resistent mot fjerning ved en sur vask av disse cellene. For eksempel etter bare 10 minutter ved 37'C ble mer enn 75$ av spesifikk bundet radiomerket ligand resistent til syrevask, og dette antyder at den store hoveddelen av bundet rTGF-el forløper har blitt internalisert under denne tidsperioden (Haigler, 1980, J. Biol. Chem. 255:1239-1241). Etter lenger inkubering ved 37°C ble ytterligere økning i cellulært opptak av radioaktivt merket materiale observert, og siden ytterligere økning ikke ble blokkert av mannose-6-fosfat, kan dette skyldes opptak av nedbrutte produkter fra degraderte TGF-el forløper. ;Ytterligere studier ble gjennomført for å bestemme om latente TGF-e komplekser isolert fra plater også kunne binde til IGF-II /man6P reseptor. Resultatene fra disse eksperimentene er presentert i Seksjon 11.2.2. nedenfor, og indikerer at plate-avledede TGF-el kompleks konkurrerte sterkt med rTGF-el forløper om binding til reseptoren, og dette antyder at latent TGF-e kompleks også inneholder mannose-6-fosfat. Forsøk på å påvise binding av IGF-II/man6P reseptor til plate-avledede TGF-el forløperrester etterfulgt av elektroforese og overføring til nitrocellulose-filtre var ikke heldige og kan skyldes nærvær av mindre man6P-residier på plate TGF-el forløper enn på rTGF-el forløperen. En slik forklaring er i overensstemmelse med de observerte forskjellene mellom plater og rekombinante TGF-el forløpere i deres evne til å konkurrere med rTGF-el forløper om binding til isolert man6P-reseptorer: plate-avledede forløpere er omtrent en tredjedel så aktive som rTGF-el når det gjelder dette. Alternativt er det mulig at noe fosfat blir fjernet av fosfataser under den langvarige rensnings-prosedyren som blir anvendt for å oppnå plate-avledede TGF-el forløpere. ;Senere studier av plate TGF-el forløper antyder at dens karbohydrat-struktur kan være viktig for å opprettholde dens kompleks i inaktiv tilstand (Miyazono og Heldin, 1989, Nature); spalting av endoglykosidase eller sialidase var funnet å aktivere det latente plate TGF-el komplekset. Videre var også inkubering av komplekset med man6P og sialinsyre, men ingen andre sukkere, også funnet å aktivere latent TGF-el, og dette støtter en rolle for karbohydratet i å opprettholde plate TGF-el forløperen i sin latente tilstand. Resultatene beskrevet i Seksjon 11.2. og etterfølgende, antyder at man6P på TGF-el forløperen kan styre dette molekylet til celler via dets interaksjon med IGF-II/man6P reseptoren. Denne interaksjonen kan føre til enten aktivering eller degradering av TGF-el forløperen via dens internalisering og avlevering til et endo-rom. ;5.7. Biologisk aktivitet av TGF- el ;Det modne TGF-el produktet som blir fremstilt i oppfinnelsen er en aktiv hemmer av tumor-cellevekst in vitro og in vivo. Eksperimenter som måler anti-proliferativ effekt av TGF-el på minklunge-epitelceller demonstrerer at rekombinant TGF-el fra oppfinnelsen (rTGF-el) og naturlig TGF-el (nTGF-ei) har identiske spesifikke aktiviteter (Seksjon 8.5 nedenfor). I tillegg kan dose responskurvene av rTGF-el og nTGF-el i virkeligheten ikke skilles fra hverandre. ;Resultatene i Seksjon 8.6. nedenfor demonstrerer at både naturlig TGF-el og rTGF-el fra oppfinnelsen hemmer tumorvekst in vivo. Tumorstasis observert i TGF-e behandlet human lungetumor er også ledsaget av induksjon av en mer differensiert-lignende fenotype. Mucous-sekrerende celler, en mindre populasjon i kunstig-behandlet, svakt differensiert tumor, dominerer TGF-e behandlet tumor. I overensstemmelse med sekretorisk rolle til slimceller i normalt vev (Robbins og Ångell, 1971 Basic Pathology, W.B. Sander G. , Philadelphia, PA), og således en mer differensiert tilstand, er øket ekspresjon av mucin-lignende og hyaluronsyre-produkter funnet i TGF-e behandlet tumor. En lang rekke andre histologiske indisier antyder også at TGF-e mediert induksjon av differensiert fenotype, inkludert den fremhevede visning av kolonne-epitelcelleorganisering som omgir væskeveggen og øker avsetning av ekstracellulær matriks, dvs. collagen. ;Den kraftfulle hemmende effekten av rTGF-el på vekst og differensiering i human lunge-adenocarcinoma i athymiske nakne mus frembringer ytterligere bevis for at rTGF-el fra oppfinnelsen kan finne anvendelse i utvikling av nye, kanskje mindre cytotoksiske, cancerterapi-behandlingskurer. ;5.8. Forbedret metode for fremstilling av moden TGF- el I en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen, ble TGF-el forløper modifisert ved eliminering av aminosyre-cystein i posisjon 33 (CYS-33) i Fig. 1 og erstattet med serin. Modifiseringen ble introdusert på DNA-nivå ved å anvende seterettet mutagenese. COS-celler transfektert med plasmid som koder for det modifiserte forløpergenet sekrerte etter hvert mellom tre og fem ganger mer moden TGF-el enn CHO-celler som uttrykker det umodifiserte forløpergenet. Det er antatt at denne modifikasjonen hindrer dannelse av visse disulfid-bundne forløperkomplekser i transfekterte COS-celler og derfor tillater sekresjon av mer moden TGF-el. Foreløpige analyser antyder at moden TGF-el fremstilt ved denne metoden blir korrekt prosessert og biologisk identisk til naturlig TGF-el. ;Modifikasjoner av TGF-el forløper i to andre cysteiner, CYS-223 og CYS-225, resulterte i sekresjon av moden TGF-el men resulterte ikke i sekresjon av høyere nivåer. Detaljer fra konstruksjon og ekspresjon av modifisert TGF-el gener er gitt i Seksjon 10 nedenfor. ;Selv om tre cysteiner lokalisert i pro-regionen til TGF-el forløperen ikke er essensielle for fremstilling av moden rTGF-el, kan de være viktige i regulering av TGF-el. Med denne betraktning synes dimerisering av forløperen unødvendig for proteolytisk kløyving av moden TGF-el, men det kan være nødvendig for latenthet. ;Celler transfektert med et plasmid som koder for pre-pro-TGF-el<S22>3/22<5> frigjort TGF-el i en aktiv form (Seksjon 10.2.4. nedenfor). Latent TGF-el har nylig blitt renset fra humane plater som høye molekylvekts-komplekser der den dimeriske prodelen av TGF-el forløperen er disulfid-knyttet til et ukjent protein og ikke-kovalent assosiert med moden TGF-el (Miyazono et al., 1988, J. Biol Chem. 263:6407-6415; Wakefield et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:7646-7654). I CH0-celle-ekspresjonssystemet, er det ikke noe bevis at andre proteiner er involvert i dannelse av komplekser med for-løperen og modne former av TGF-el. Dette synes også å være sant i COS-cellesystemet, siden rTGF-el forløperen og modne former som ble fremstilt av COS-celler synes tilsvarende hvis ikke identiske til de som er fremstilt av CHO-celler når de blir undersøkt ved immunoblotting. ;Resultatene her antyder at moden rTGF-el er ikke-kovalent assosiert med forløper pro-regionen og når pro-regionen ikke kan danne en dimer, blir latenthet ikke overdratt. Selv om dette mest sannsynlig skyldes bruddet av ikke-kovalent assosiering, kan det ikke utelukkes muligheten for at moden TGF-el er ikke-kovalent assosiert med monomerisk TGF-g2.<S22>3/225 pro-region (dannelse av et kompleks som ikke er latent fordi de modne sekvensene som er nødvendige for aktivitet er tilstrekkelig eksponert). ;Senere studier (Miyazono et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:6407-6415) antyder at karbohydrat-strukturene i pro-regionen er involvert i ikke-kovalent binding TGF-el til å danne et latent kompleks. Kanskje frembringer dimerisering av pro-regionen det riktige rammeverket og stabilitet for slike interaksjoner. Lite er kjent når det gjelder in__vivo-regulering av TGF-el. Siden de fleste celletypene frigjør TGF—el i en latent form (Lawrence et al., 1984, J. Cell. Physiol. 121:184-188; Pircher et al., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 136:30-37; Wakefield et al., 1987, J. Cell. Biol. 105:965-975), synes aktivering av latent kompleks å være et kritisk regulatorisk trinn. En klarere forståelse av naturen til denne latentheten bør hjelpe til i bestemmelse av fysiologiske aktiveringsmekanismer. ;Det høye nivået av ekspresjon og sekresjon av rekombinant TGF—el kan føre til en unaturlig tverrbinding, ved å lage disulfid-bindingene mellom CYS-33 og cystein-residiene lokalisert i det modne polypeptidet som en kunstig del i ekspresjonssystemet. Alternativt kan CYS-33 spille en regulatorisk rolle gjennom interaksjon med andre proteiner. Dette virker særlig sannsynlig i lys av disulfid-bundne kompleks isolert fra plater. ;Således kan tre cysteiner lokalisert i pro-delen av for-løperen influere på modningen og aktiveringen av TGF-el på to måter. CYS-223 og CYS-225 kan tillate forløperen å danne en dimer og kan deretter reagere med moden TGF-el på en ikke-kovalent måte for å danne et latent kompleks, mens CYS-33 kan reagere ved disulfid-binding til moden TGF-el og/eller andre proteiner, og dermed modulere reaksjonen til TGF-el. ;6. Eksempel: cDNA kloning av TGF- el forløper ;Eksemplene som følger beskriver cDNA-kloniiigen av TGF-el forløper-kodende sekvensen fra en afrikansk grønn apecellelinje (BSC-40, en underlinje av BSC-1 celler) er nylig blitt vist å produsere høye nivåer av en veksthemmer som er funksjonelt relatert til TGF-el. Usedvanlig sterk sekvens-homologi mellom simian-forløper og genproduktet foreslått for både human- og mus TGF-el ble funnet. ;6.1. Materialer og metoder ;De følgende fremgangsmåtene ble anvendt for å klone cDNA som koder for TGF-el forløperen. ;6.1.1. Vekst av celler og RNA- ekstraksjon ;BSC-40 celler ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle-medium som inneholder 10$ fetalt kalveserum. MCF-7 celler ble dyrket i samme medium som inneholder 6 enheter/ml insulin. Polyadenylert RNA ble isolert fra disse cellene ved oligo-[dT]-cellulose-kromatografi som beskrevet (Purchio et al., 1979, J. Virol. 29:763-769). ;6.1.2. cDNA bibliotek- konstruksjon og screening Dobbelt-trådet cDNA ble syntetisert fra BSC-40 polyadenylert RNA som beskrevet (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372) og etter behandling med EcoRI ble metylase ligert til oligonukleotid-linkere som inneholder et EcoRI-r es triks j onsenzvm-gj enk.i enningssete (EcoRI-linkere ). cDNA ble spaltet med EcoRI og fraksjonert med kromatografi på Sephacryl S-1000. cDNA-fraksjoner større enn 750 basepar (bp) ble samlet og ligert inn i lambda gtlO som hadde blitt kuttet med EcoRI (Davis et al., 1980, A Manual for Genetic Engi-neering: Advanced Bacterial Genetics; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), pakket (Grosveld et al., 1981, Gene 13:227-237) og sådd ut på E. coli C60orK_mK+hf 1 • Biblioteket ble screenet med plaque-hybridisering (Bentonet al., 1977, Science 196:180-4.82) til en [<32>P]-merket oligo- ;nukleotid-gensøker [5'-CACGCAGCAGTTCTTCTCCGTGGAGCTGAAGCAATA-3'] som var komplementær til kodon 6 til 17 av det modne TGF-el molekylet (Derynck et al., 1985., Nature 316:701-705 ). Flere cDNA-kloner ble isolert etter tertiær screening og subklonet inn i pBR322. En klon (pTGF-ei-2) som inneholder en 1.600 bp innsetting var subklonet inn i M13mpl8 og M13mpl9 klon-vektorer (Yanisch-Perron et al. 1985, Gene 33:103-119) og begge trådene ble sekvensert ved å anvende dideoksy kjede-termineringsmetoden (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-5467). ;6.1.3. Northern blot analyse ;Polyadenylert RNA ble isolert fra MCF-7 celler og BSC-40 celler som beskrevet (Purchio et al., 1979, J. Virol. 29:763-769), fraksjonert på en 1$ agarose-formaldehydgel (Lehrach et al., 1977, Biochemistry 16:4743-4751), overført til en nylonmembran (Hybond, Amersham) og hybridisert til [<32>P]-merket pTGF-el-2 gensøker. Hybridisering ble gjennomført ved 42°C i 50$ formamid som inneholder 0,9 M NaCl, 50 mM natriumfosfat, 5 mM EDTA, 0,1$ SDS, 4xDenharts-oppløsning (Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372), 0,4 mg/ml gjær-tRNA og 0,25 mg/ml denaturert kalvetymus-DNA. Filtre ble vasket ved 65°C i 0,25xSSC (Maniatisk et al., 1982), 0,1$ SDS, tørket og eksponert til Cronex-4 røntgenfilm (DuPont) ved hjelp av lys- pluss intensiverende skjermer (DuPont). ;6.2. Resultater ;cDNA-biblioteket konstruert i lambda gtlO anvender polyadenylert RNA fra BSC-40 celler som beskrevet over, ble screenet med en 36-mer deoksyoligo-nukleotid komplementær til kodon 6 til 17 i det modne TGF-el molekylet (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705). På grunn av den nære likheten mellom bovin TGF-el (Roberts et al., 1983, Biochemistry 22:5692-5698) og human TGF-el (Derynck et al., 1985, Nature ;316:701-705) ble det valgt en gensøker avledet fra den humane sekvensen for å screene simian TGF-el cDNA-klonene. ;Et samlet antall på 13 positive kloner ble identifisert etter tre runder med plaque-rensing. Et 1.600 bp klon, pTGF-ei-2, som ved restriksjonsenzym-analyse synes å inneholde hele den TGF-el forløper-kodende regionen, ble valgt til sekvensering. DNA-sekvensen, sammen med utledet aminosyre-sekvens, er vist i Fig. 1. En enkel åpen leseramme ble funnet som kode for et 390 aminosyre-polypeptid. Det modne TGF-el polypeptidet består av de karboksy-terminale 112 residiene. Dette arrange-mentet er det samme som det beskrevet for human TGF-el (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705) og muse TGF-el (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379). Simian cDNA-klon er 98$ homolog til human cDNA-klon gjennom kodings-regionen som bare har 27 steder hvor den ikke passer (Fig. 1) og et brudd på tre baser. ;Innenfor den 5'-ikke-kodende regionen, er DNA-sekvensen fra human- og simian TGF-el 91$ homolog med 3 brudd mens 3'-ikke-kodende regioner er 94$ homologe uten brudd. Rett oppstrøms for 5' initieringskodon er en potensiell stammestruktur som også er tilstede i human cDNA-klon men ikke i museklon. En tidlig innsetning innenfor denne regionen i museklonen vil hemme dannelse av denne strukturen. I likhet med human- og museklonet, var simian cDNA-klonet ikke av full lengde ved at ingen 3'-polyadenylerte spor ble identifisert. Den G-C rike naturen av 3'-enden til TGF-el forløper mRNA kan ha resultert i en sekundær struktur som hindrer DNA-syntese gjennom denne regionen. Den 3'-ikke-kodende regionen utviser en bemerkel-sesverdig gjentakelse av purin-seksensen, CCCC, etterfulgt av termineringskodon. Denne sekvensen forekommer ni ganger i den humane sekvensen med en ytterligere gjentakelse som inneholder en baseforskjell. Både simian- og murinklonene inneholder 8 repetisjoner med ytterligere 2 som inneholder en enkel baseforskjell. ;Northern blot analyse som anvender TGF-el-2 gensøkeren viste hybridisering til en hoved 2,5 Kb polyadenylért RNA-art fra BSC-40 celler og fra human pattedyr carcinoma-cellelinje MCF-7 (Fig. 2). Dette er samme størrelse som hoved-tran-skriptet funnet i human-cellelinjer (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705) og muse-cellelinjer (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem 261:4377-4379). Mindre bånd ved 4 kb og 1,45 kb kan også bli sett i brønn 2 på Fig. 2. ;Aminosyre-homologien mellom human- og simian TGF-el forløper-proteiner er også vist i Fig. 1. Bare fem aminosyre-endringer forekommer, der alle er funnet innenfor den aminoterminale forløperregionen: det er fullstendig homologi mellom simian-og human moden TGF-el proteiner på aminosyre-nivå. I motsetning var bare 84$ homologi (på aminosyre-nivå) funnet å eksistere mellom simian- og muse-forløper TGF-el molekyler; forskjellene inkluderer de følgende: en aminosyre-endring, serin (mus) til en alanin (simian) ble funnet i moden TGF—el kodende region. Det humane genet koder for en ekstra aminosyre (arginin, posisjon 158) i forløperen er hverken tilstede i simian eller murin-klonen. Det er antatt at denne endring skyldes en innsetning i det humane genet som ble sekvensert (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705). Den nære identi-teten mellom forløperregionen av ape-, mus- og human TGF-el protein antyder at denne delen av molekylet kan også ha en viktig biologisk funksjon. ;Karboksy-terminalen til forløperen inneholder den 112 aminosyre-modne formen av simian TGF-el og er identifisert ved sin homologi til det korresponderende humane genproduktet. Denne cysteinrike regionen (9 residier) av forløperen representerer den sekrerte formen av TGF-el og inneholder ikke noen antatte glykosyleringsseter, mens tre potensielle N-glykosyleringsseter (Asn i posisjonene 82, 136 og 177) kan bli identifisert i andre regioner av forløperen. Det er kjent at TGF-el homodimeren, både av human og gnager-opprinnelse, krever intakte disulfid-bindinger for å opprettholde aktivitet (Messague, 1984 J. Biol. Chem. 259:9756-9761). Aminoterminalen til moden human TGF-el som er etablert ved primær sekvensanalyse (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705) blir forutgått av et Arg-Arg dipeptid. Dette tilsvarende kløyvingssete er også tilstede i en identisk posisjon i simian-homologen. Kløyving enten under eller etter trans-lasjonsprosessen, samtidig med enten den ene eller begge intrakjede og interkjede disulfidbinding-dannelse, vil resultere i skapelse av den aktive homodimer (dimerisering). Med denne betraktning inneholder TGF-el forløperen en leucin-rik region på 14 hydrofobiske aminosyrer (posisjonene 8-21, Fig. 1) som kan funksjonere som et signalpeptid og spille en rolle i sekresjons/prosesserings-kaskaden. ;7. Eksempel: Ekspresjon av TGF- el ;Eksemplene som følger beskriver ekspresjon av aktiv TGF-el i kinesisk hamsterovarie (CHO) celler transfektert med et rekombinant plasmid som inneholder den kodende sekvensen for TGF-el under regulering av simian virus 40 (SV40) ekspresjonselementer. Eksperimentene beskrevet her demonstrerer at et antall CHO-transfektanter fremstiller og sekrerer høye nivåer av TGF-el. TGF-el frigjort av transfekterte celler demonstrerer biologisk aktivitet som kan sammenlignes med den til autentisk naturlig TGF-el, som det er bestemt ved veksthemmings-analyser ved å anvende målceller som er sensitive til TGF-el. ;7.1. Materialer og metoder ;7.1.1. Cellekultur ;Dihydrofolat-reduktase (dhfr )-manglende kinesiske hamster-ovarieceller (CHO) (Urlaub og Chasin, 1980 Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216) ble formert i Ham's F-12 medium (Gibco Laboratories, NY) som var tilført 10% fetalt bovint serum (FBS) og 150 pg/ml L-prolin. Penicillin og streptomycin ble inkludert henholdsvis i 100 U/ml og 100 pg/ml. CHO-transfektanter ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle-medium som inneholder de samme tilsatsene som de listet over. CHO-celler og deres derivater ble rutinemessig passert ved trypsinering med et 1:5 splittingsforhold. ;Metotreksat (Sigma, MO) ble fremstilt i en lagerkonsentrasjon på 10 mg/ml i vann. Fortynnet NaOE (0,2 M) ble tilsatt for å løseliggjøre medikamentet (slutt-pE på 6). Lageret ble filter-sterilisert og lagret ved -20°C. Lagringsoppløsningene av metotreksat i medium (100 jjM) ble bevart ved 4°C i ikke lenger enn 1 måned. ;7.1.2. DNA- manipuleringer og plasmid- konstruks. ioner Restriksjonsenzymer, T4 DNA-ligase, kalvetarm-fosfatase, Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I og andre DNA-reagenser ble kjøpt fra Bethesda Research Laboratories, MD. Standard DNA-manipuleringer ble gjennomført som skissert i Maniatis, T., et al., 1982, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York. ;Plasmid pSV2 (el-TGF-dhfr), som inneholder simian TGF-el cDNA og mus-dhfr-genet i tandem såvel som intervenerende SV40-sekvenser, ble konstruert som skissert i Fig. 3. pSV2-ei—TGF plasmidet ble fremstilt til å begynne med. 1378 bp Pstl-EcoRI-fragmentet fra TGF-el cDNA som inneholder hele den kodende regionen for TGF-el proteinet ble innsatt inn i polylinker-regionen av pSP65 for å plassere et Eindlll-restriksjonssete 5' til PstI-gjenkjenningssekvensen. Det resulterende plasmidet ble deretter spaltet med EcoRI. reparert til stumpe ender med Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I, og Hindlll- EcoRI (stump) fragmentet som inneholder TGF-el kodende sekvens ble isolert. Plasma pSV2-el-TGF ble deretter konstruert ved innsetting av Hindlll-EcoRI (stump) fragmentet inn i pSV2-neo istedet for neomycin-resistensgenet (neo), ved ligering inn i Eindlll-Epal-fragmentet av vektoren. ;Konstruksjon av pSV2-(ei-TGF-dhfr), ved dette punkt krever to trinn. Det første trinnet som er nødvendig for isolering av Ndel-EcoRI (stump) fragmentet av pSV2-ei-TGF. Dette ble gjennomført ved spalting av pSV2-Pl-TGF plasmidet med EcoRI, stumpe endene med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, kutting av den stumpede vektor med Ndel og Pvul. og isolering av 2,6 kb Ndel-EcoRI (stump) fragmentet. Pvul-spalting var nødvendig slik at et kontaminerende plasmidfragment ikke ville bli renset sammen ved agarose-gelelektroforese. Det siste trinnet i konstruksjonen var innsetting av Ndel-EcoRI (stump) fragmentet som inneholder Pl-TGF cDNA og SV40-sekvenser inn i et Ndel- PvulI-fragment av pSV2-dhfr. Det resulterende pSV2-(ei-TGF-dhfr) plasmidet inneholder et entydig Ndel-sete som kan bli utnyttet for å- linearisere DNA. ;7.1.3. DNA- transfeks. ioner ;Tilnærmet 24 timer ett utsåing av 10^ dhfr-manglende CHO-celler på 100 mm skåler, ble kulturene transfektert med 20 pg Ndel linearisert pSV2-(ei-TGF-dhfr) plasmid som et kalsiumfosfat-presipitat (Wigler, M. , et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:1373-1376). I korthet ble 20 pg linearisert DNA tilsatt til 1 ml 250 mM steril CaCl2. En 1 ml del 2x HEPES-oppløsning (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM natriumfosfat, pH 7,1) ble deretter dråpevis tilsatt, og blandingen fikk anledning til å være på is i 30 minutter. Presipitatet ble deretter dispergert dråpevis over cellene som inneholder 10 ml F12-medium. Etter inkubering ved 37° C i 4 timer, ble mediet fjernet og erstattet med 10 ml F12-media som inneholder 25$ glycerol i 90 sekunder ved romtemperatur. Cellene ble renset en gang med 20 ml F12-media og inkubert i ikke-selektiv F12-media (20 ml) i ytterligere 48 timer. Seleksjon for dhfr-ekspresjonstransfektanter ble gjennomført ved å erstatte media med DMEM tilsatt 10$ dialysert FBS (Gibco, NY) og 150 pg/ml L-prolin. Kolonier ble observert etter dyrking av cellene i 10-14 dager i seleksjonsmedium. Ti kolonier ble suget opp med en pasteur-pipette og ekspandert. ;7.1.4. Seleksjon av metotreksat- resistente celler Dihydrofolat-reduktase (dhfr) amplifiserte celler ble avledet fra de primære transfektantene i det vesentlige som beskrevet ;(Gasser, C.S. og Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem. 261: 6938-6946 ). Etter ekspansjon "ble IO<5> celler utsådd på 100 mm plater og tilpasset til økende konsentrasjoner av metotreksat. Begynnerkonsentrasjonene av metotreksat var 50, 100 og 200 nM. Skålen som inneholder synlige kolonier ved høyeste metotreksat-konsentrasjon ble trypsinisert og tilpasset til den konsentrasjon av metotreksat til minst to ytterligere 1:5 cellepasseringer. Cellene (IO<5>) ble deretter sådd ut på 100 mm skåler i 2-, 5- og 10-ganger konsentrasjon av metotreksat. Skålene som inneholder synlige kolonier ble igjen trypsinisert og tilpasset til metotreksat som inneholder medie. Cellene ble frosset tilbake på forskjellige trinn av amplifisering i medium som inneholder 40$ FBS, 10$ dimetylsulfoksid og 50$ DMEM. Metotreksat ble ikke inkludert i frysingsmediet. ;7.1.5. Kvantitering av beta- TGF mRNA- nivåer ;TGF-el mRNA-nivåene ble fastsatt ved å anvende oppløsnings-hybridisering (Uhler, M.D., et al., 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:1300-1304). 600 bp Smal- Smal-fragmentet av el-TGF cDNA ble klonet inn i pSP65 og anvendt for å lage [<32>P]-merket komplementær RNA med SP6 RNA-polymerase som detaljert beskrevet av forhandleren (Promega Biotech, Madison WI). Enkelt-trådet M13 DNA som inneholder det hele el-TGF cDNA, på samme måte som mRNA, ble utnyttet som standarder. Total nukleinsyre ble isolert fra transfekterte celler ved proteinase K-spalting og fenol/kloroform-ekstrahering (McKnight, G.S., et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:144-147). DNA-innholdet av total nukleinsyreprøver ble målt med fargebindings-analysen (Labarca, C, og Paigen, K. , 1980, Anal. Biochem. 102:344-352). Antallet molekyler med mRNA pr. celle ble estimert ved sammenligning med M13 61-TGF standarder som antar at 7 pikogram DNA pr. celle. ;7.1.6. Veksthemmings- analyse ;Minklunge-epitelceller, Mv 1 Lu (Accession Number CCL-64, American Type Culture Collection), som er ekstremt sentitive til TGF-el ble utnyttet i veksthemmings-analysen. Analysen ble utført ved å anvende tymidin-analogen -5 ' -[125I]-iodo-2'deoksyuridin (<125>IdU) for å fastsette DNA-syntese. En aktivitetsenhet ble defiert som mengden som var nødvendig for å hemme 50$ inkorporering av <IZS>jdV sammenlignet med ubehandlede CCL-64 celler. Ved å anvende isolert TGF-el som en standard, korresponderer generelt en aktivitetsenhet til 80-100 pg/ml av TGF-el. ;For å analysere transfekterte celler for sekresjon av aktiv TGF-el, ble serumfrie supernatanter oppsamlet fra en 24 timers oppsamling på sammenflytende cellekulturer og omfattende dialysert mot 0,2 M eddiksyre. Eddiksyren ble fjernet med lyofilisering og prøven ble oppløst på nytt i sterilt fullstendig kulturmedium til analyser. ;7.1.7. Stimulering av forankret uavhengig vekst ;Supernatanter ble undersøkt for deres evne til å stimulere normal rottenyre-fibroblaster (NRK; klon 49) til å gro som kolonier i myk agar. Den myke agaranalysen ble gjennomført som beskrevet (Twardzik og Sherwin, 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297; Delarco og Todaro, 1978, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:4001-4005) ved å anvende syre-dialyserte supernatanter . ;7.1.8. Peptidsyntese og fremstilling av antistoffer ;Peptidene ble syntetisert i fastfase-teknikker på et Beckman 990 instrument, og kløyvet fra harpiksen som nylig beskrevet (Gentry, L.E., et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:11219-11228; Gentry, L.E. og Lawton, A., 1986, Virology 152:421-431). Rensingen ble gjennomført ved preparativ høyeffekts-væske-kromatograf i . Sammensetningen av peptidene ble bekreftet i aminosyre-analyse. ;Syntetiske peptider ble konjugert til bovin gamma-globulin ved cysteinresidie. Koblingsreaksjoner var i det vesentlige som beskrevet (Gentry og Lawton, 1986, over). Effektiviteten på peptidkonjugeringer strakk seg fra 8 til 26 molekyler av peptid kovalent knyttet pr. molekyl gamma-globailin. ;New Zealand hvite kaniner hie tilsatt på tre til seks steder med kombinert subkutan og intradermal innpoding med peptid-konjugatene (100 pg ekvivalenter peptid) emulgert i Freund's komplette adjuvant. Forsterkende innpodinger ble administrert i 2-3 ukers intervaller. Blodprøver ble tatt 7-14 dager etter forsterkingene. ;7.1.9. Immunoblotting ;Proteiner ble fraksjonert på 7,5$-17,5$ gradient SDS-polyakrylamidgeler og overført til umodifisert nitrocellulose (0,45 pm; Schleicher og Schuell) i 14-18 timer ved 200 mA ved 4°C (Burnette, W.N., 1981, Anal. Biochem. 112:195-203). Overskudd av bindingskapasitet av nitrocellulose ble blokkert ved inkubering med 2,5$ BL0TT0 (Johnson, D.A. , et al., 1984, Gene Anal. Techn. 1:3-8) i fosfat-bufferet saltoppløsning (PBS) som inneholder 0,2$ NP-40. Kanin anti-serum fortynnet 1:75 i 2,5$ BL0TT0 ble inkubert med de blokkerte nitrocellulosearkene i 2 timer ved romtemperatur. Etter bort-vasking av overskudd antistoff med fem 5-minutters vasker i 2,5$ BLOTTO, ble nitrocellulosearkene inkubert med alkalisk fosfat-konjugert protein A fortynnet 1:500 i 2,5$ BLOTTO. Etterfulgt av en times inkubering, ble nitrocellulosearkene vasket 5 ganger i PBS (5 minutters vask) som inneholdt 0,2$ NP-40 og fremkalt (Leary et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:4045-4049). ;7.1.10. Northern blot analyse ;Cytoplasmisk polyadenylert RNA ble fremstilt fra vevskultur-celler som beskrevet (Purchio og Fareed, 1979, J. Virol. 29:763) og fraksjonert på en 1$ agaroseformaldehydgel (Lehrach et al. 1977, Biochemistry 16:4743). RNA ble overført til en Hybond nylonmembran (Amersham) og hybridisert til radioaktivt merket pTGF-pl-2 gensøker. Hybridisering ble gjennomført i 0,9 M NaCl, 50 mM natriumfosfat (pH 7,0), 5 mM EDTA, 0,1$ SDS, 4x Denhardts, 0,4 mg/ml gjær tRNA, 0,25 mg/ml kalvetynrus-DNA og 50$ formamid i 20 timer ved 42° C. Filtere ble vasket fire ganger i 0,25 x SSC ved 65°C (30 minutter/- vask), tørket og eksponert for autoradiografi. ;7.1.11. Southern blot analyse ;Høymolekylvekts-DNA ble isolert fra pelleterte kjerner oppnådd etter RNA-ekstraksjon (Purchio og Fareed, ovenfor). Den nukleære pelleten ble dispergert i TE-buffer og deretter justert til 1$ natriumdodecyl-sulfat/10 mM Tris-HCl, pH 7,4/ 10 mM EDTA. Proteinase K ble tilsatt til 100 pg/ml og inkubert ved 37"C i 16-18 timer. Etter at DNA var fenol/- kloroform-ekstrahert og etanolutfelt, ble resterende RNA fjernet ved spalting med DNAse "fri" RNAse A i 2 timer i TE-buffer, etterfulgt av omfattende dialyse mot TE. ;Til Southern blot analyser, ble DNA spaltet med et hensiktsmessig restriksjonsenzym og blottet til Hybond nylonmembraner (Southern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517). Hybond nylonmembran-filtre ble hybridisert ved 65°C i 20 timer i hybridiseringsbuffer som inneholder 5 x 10^ cpm/ml med denaturert nick-translatert EcoRI- EcoRI-fragment av ei-TGF cDNA oppnådd fra pTGF-el-2 og vasket som detaljert beskrevet av forhandleren (Amersham). ;7.2. Ekspresjon av TGF- el i CHO- celler ;For å uttrykke høye nivåer av rekombinant bioaktiv TGF-el, ble pSV2-vektorer utnyttet som beskrevet originalt (Mulligan, R.C. og Berg, P., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:449-459; Subra-mani, S. , et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1:854-864 ) for å fremstille et ekspresjonsplasmid (pSV2-ei-TGF-dhfr) som plasserer simian TGF-el og mus dihydrofolat-reduktase cDNA i tandem med det samme plasmidet (Fig. 3). Ekspresjonsplasmidet bærer en stor del av TGF-el cDNA som koder for det fullstendige TGF-el forløpermolekylet. Den fysikalske bindingen av disse to genene innefor samme plasmid tillater amplifisering sammen av TGF-el sekvenser under dhfr-amplifikasjon. Signalene som er nødvendige for transkripsjonsinitiering, terminering, polyadenylering og spleising for hver cDNA er identisk og blir tilført med simian virus "40 (SV40) DNA-sekvenser. ;pSV2-ei-TGF-dhfr ble transfektert inn i dhfr-manglende CHO-celler som et kalsiumfosfat-presipitat. Ti CHO-transfektanter som uttrykker dhfr-fenotypen ble isolert ved formering i selektivt medium. Alle ti transfektantene viste TGF-el mRNA som analysert i oppløsnings-hybridisering. For å øke ekspre-sjonsnivået av TGF-el, ble celler avledet fra ti opprinnelige transfektanter selektert trinnvis i økende konsentrasjoner av metotreksat (MTX). I forskjellige trinn av ampiifikasjonen, ble cellene analysert for nivå av TGF-el mRNA ved oppløs-ningshybridisering. Fire av ti opprinnelige transfektanter viste økt nivå av TGF-el mRNA. Her beskrives en av disse klonene (TGF-el-3), som gjennom MTX-amplifikasjon viste meget høye nivåer av TGF-el mRNA. ;Tabell I viser antall TGF-el mRNA-kopier pr. TGF-el-3 celle i forskjellige trinn av amplifikasjonen. CHO-cellene i forskjellige amplifikasjonstr inn vil bli referert til som TGFei-3-0, TGFei-3-200, TGFei-3-2.000 og korresponderer til CHO-celler selektert i henholdsvis 0,2 jjM og 20 pM MTX. ;Som kontroller ble det inkludert ikke-transfekterte CHO-celler og en CHO-transfektant (CH0#7) som til å begynne med viste rekombinant TGF-el på lave nivåer. CHO #7 ble oppnådd ved samtransfeksjon med pSV2-ei-TGF (Fig. 3) og pSV2-neo, etterfulgt av seleksjon i Gentecidin (Gibco, NY). Den begynnende TGF-el-3-transfektanten viste mRNA-nivå av ei-TGF som tilsvarte de hos CHO #7 og tilnærmet 20 ganger større enn ikke-transfekterte CHO-celler. Etter MTX-seleksjon hadde derimot antallet el-TGF mRNA-kopier som var observert i TGF-ei-3-celler dramatisk øket og tilnærmet seg nesten 80.000 kopier pr. celle ved 20 pM MTX. Dette representerte mer enn 200-gangers amplifikasjon med hensyn på begynnende TGF-el-3 transfektanter og nesten 4.000-gangers amplifikasjon med hensyn på ikke-transfekterte CHO-celler. ;Et northern blot av poly (A)+ selektert mRNA fra TGF-el-3 celler i forskjellige ampiifikasjonstrinn er vist i Fig. 4A. Ikke-transfektert CHO-celle mRNA ble også inkludert for å legge for dagen lave nivåer av endogen 2,5 Kb TGF-el mRNA som er tilstede i disse cellene (stjerne, Fig. 4A). Dette lave ekspresjonsnivå av TGF-el mRNA har også blitt observert i flere andre cellelinjer. TGF-el-3-transfektanter viste store mengder av hybridiserbar RNA som beveget seg til antatt størrelse på 2 Kb. ;Den mest sannsynlige mekanismen for den dramatiske økning i TGF-el mRNA i TGF-ei-3-celler etter MTX-seleksjon er et resultat av amplifikasjon. For å undersøke genamplifikasjon, ble DNA isolert fra TGF-el-3-celler i forskjellige trinn av MTX-seleksjonen, spaltet med restriksjonsenzymer, overført til Hybond nylonmembraner og hybridisert til [<32>P]-merket TGF—el DNA. Begge restriksjonsenzymene EcoRI og BamHI kuttet i det introduserte plasmidet to ganger og skapte lineære kopier av plasmid DNA som manglet flankesekvenser. Siden en av BamHI-setene er innenfor simian TGF-el cDNA, skulle spalting med dette enzymet frigjøre to fragmenter som hybridiserte til den nick-translaterte gensøkeren. ;Resultatene av Southern blot er vist i Fig. 4B. I de MTX-selekterte cellene, var det observert sterk hybridisering til TGF-el gensøkeren. Størrelsen på disse fragmentene korresponderer nøyaktig til den antatte størrelsen av TGF-el-inneholdende fragmenter av pSV2-TGF-ei-dhfr (et 4,7 Kb fragment avledet fra EcoRI-spalting og 4,4 og 0,51 Kb fragmenter avledet fra BamHI-spalting). Tilsvarende spaltingsprodukter er også observert på lavere nivåer i den begynnende ikke-selekterte transfektanten (TGF-ei-3/0. Densitometriske scans som sammenligner forskjellige TGF-el-3 celler la for dagen minst en 15- og 35-gangers amplifikasjon av TGF-el sekvenser i henholdsvis TGF-ei-3/200 og TGF-el-3/2.000 celler. ;7.3. Påvisning av sekrert bioaktiv rekombinant TGF- el For å bestemme om TGF-el proteinet enten var laget og sekrert i transfekterte TGF-el-3 celler, ble kondisjonert medium oppsamlet fra disse cellene og undersøkt for bioaktivt materiale. En følsom og spesifikk bioanalyse basert på evnen til el-TGF å hemme vekst i minklunge-epitelceller (CCL-64) var den begynnende analysen som ble anvendt. En typisk standard dose-respons kurve som anvender høyrenset autentisk human TGF-el er vist i Fig. 5A. I denne analysen er 50$ hemming av vekst hos minklunge-celler typisk observert ved 8-12 picogram (80-120 pg/ml) med TGF-el. Kondisjonert medium oppsamlet fra TGF-el-3 celler ved alle trinn i amplifisering utviste evnen til å hemme vekst av CCL-64 celler. Dose-respons kurvene av disse supernatantene er vist i Fig. 5B. Disse viser tilsvarende hellning til hemmingskurvene observert for autentisk naturlig el-TGF. ;Tabell II viser nivåene av bioaktivt materiale som er tilstede i kultursupernatanter av TGF-el-3 celler beregnet fra kurvene vist i Fig. 5B. ;Lave nivåer av sekrert bioaktivt TGF-el ble observert i supernatanter av ikke-amplifiserte TGF-el-3 celler. Disse nivåene var tilsvarende til nivåene observert i CHO #7 transfektantene. MTX-selekterte TGF-el-3 celler uttrykte mye høyere nivå av rekombinant bioaktiv TGF-el. Ved 20 jjM MTX-seleksjon, sekrerte TGF-el-3 celler (TGF-ei-3/2.000) nesten 6 pg/ml aktiv TGF-el inn i de serum-frie kultursuper-natantene. ;Tabell III viser nivåene av bioaktivt materiale sekrert i kultursupernatanter av TGF-el-3 transfektant i forskjellige trinn med MTX-seleksjon. Bioaktivitet ble fastslått ved å anvende minklunge-cellehemmingsanalyse og de resulterende verdiene ble normalisert pr. celle pr. 24 timer. I kontrast til TGF-el-3 transfektantene, var lave nivåer av sekrert bioaktiv TGF-el observert i supernatantene til de ikke-ampl if i serte TGF-el transf ektantene. Den høye-ste produsenten av rekombinant TGF-el materiale var TGF-ei-3/2.000 cellene. Mengden av bioaktivt rekombinant materiale sekrert av IO<7> av disse cellene inn i 5 ml vevskultur-medium over en periode på 24 timer tilnærmet seg nesten 30 pg TGF-el. Mengden av bioaktivitet påvist i kondisjonerte supernatanter for hver av transfektantene ble korrelert med relativt nivå av TGF-el mRNA observert i disse cellelinjene. ;En annen bioanalyse ble også benyttet til ytterligere å karakterisere den sekrerte rekombinante TGF-el. Denne analysen er basert på evnen til TGF-el, i samband med EGF-lignende molekyler, å stimulere veksten av NRK-celler i myk agar. Resultatene av denne bioanalysen er vist i Tabell IV. Aktiviteten av rekombinant TGF-el kan ikke skilles fra den til human naturlig plate-TGF-ei som ble anvendt som kontroll. ;7.4. Svreaktivering optimaliserer bioaktivitet av sekrert ;rekombinant TGF- el ;Mange celletyper er blitt funnet å sekrere naturlig TGF-el i en latent form som krever surgjøring for optimal bioaktivitet. Bioanalysene som er presentert i de foregående figurene og tabellene ble utført ved å anvende syredialysert materiale. For å bestemme om de transfekterte CHO-cellene sekrerer en latent biologisk inaktiv form av TGF-el, ble serum-frie supernatanter oppsamlet fra TGF-el-3/2.000 celler og dialysert mot 0,2 M eddiksyre eller 50 mM NH4HCO3 (pH 7) og analysert for minklunge-cellehemmende aktivitet. Resultatene er vist i Fig. 6. Supernatantene som mottok sur dialyse var aktive i deres evne til å hemme CCL-64 minklunge-celler. I motsetning utviste NE4HCO3 dialyserte prøver mye lavere nivåer (mindre enn 1%) av hemmende aktivitet. Supernatanter som først ble dialysert mot NH4HCO3 og deretter behandlet i en annen dialyse mot 0,2 M eddiksyre gjenvant deres aktive hemmende aktivitet. Dose-respons kurven til dette materialet var så likt at det kunne legges over kurven som ble laget av prøver som bare mottok det sure dialyse-trinnet. ;7.5. Identifikasjon av moden- og forløperformer av TGF- el i ;kulturmedium med transfektant TGF- el- 3 CHO- celler Ånti-peptid antistoffer rettet mot peptidsekvenser idet foreslåtte TGF-el molekylet ble generert i kaniner ved å anvende syntetiske peptider som immunogener. Peptidsekvensene som ble utnyttet er vist i Fig. 7 som også angir deres relative lokaliseringer i TGF-el forløper-polypeptider: TGF-e<l>81_94, TGF-el225-236 °g TGF-el369_381. En av antistoffene (anti-TGF-el369_3gi) ble rettet mot epitoper som var tilstede i den modne formen av TGF-e vekstfaktoren. De andre to antistoffene (anti-TGF-elgi_g4 og anti-TGF-el225-236) er forløper-spesifikke og rettet mot peptidsekvenser som er tilstede bare innenfor forløpermolekylet til TGF-el. ;7.5.1. Identifikasjon av moden TGF- el ;Supernatanter fra TGF-e-3 transfektanter ble oppsamlet og undersøkt ved immunoblotting med anti-TGF-ei36g_3gi som raskt identifiserte autentisk moden TGF-el (Fig. 8). Spesifisiteten ble demonstrert i pre-absorbering av antistoffet med syntetisk peptid-immunogen forut for immunoblottet. ;Under reduserende betingelser (Fig. 8A), beveger autentisk TGF-el seg som et polypeptid på 12-13 kd i størrelse. I supernatantene til MTX-selekterte TGF-el-3 celler, ble et protein som beveget seg sammen med autentisk TGF-el raskt identifisert (Fig. 8A). Supernatanter oppsamlet fra ikke-amplifiserte TGF-el-3 celler utviste ikke-påvisbare nivåer av rekombinant el-TGF ved å anvende immunoblotting. 20 pM MTX-selekterte TGF-el-3 celler synes å fremstille de høyeste nivåene av moden TGF-el, og de tilnærmet seg 2-4 ganger høyere enn 2 pM MTX-selekterte celler. Disse økningene er i overensstemmelse med resultatene oppnådd for ekspresjon av mRNA-nivåer (Tabell I) og bioaktivitet (Tabell I IA og IIB). Under ikke-reduserende betingelser (Fig. 8B), oppfører rekombinant TGF-el proteinet seg som autentisk TGF-el, og beveger seg som en dimer på 24 kd. ;I tillegg til moden TGF-el ble også større former av immunoreaktivt materiale observert. På reduserende geler varierte disse formene i størrelse fra 44 kd til 56 kd (Fig. 8A). Den vide naturen til disse immunoreaktive formene kan antyde omfattende glykosylering. Det er interessant at i fravær av reduserende midler synes disse større formene også å bevege seg som en dimer 95 kd til 110 kd i størrelse (Fig. 8B). Identifiseringen av disse store formene som forløpermolekyler ble bekreftet ved å anvende forløper-spesifikke antistoffer som beskrevet i neste avsnitt. ;7.5.2. Identifikasjon av forløper TGF- el ;Supernatanter fra TGF-el-3 transfektanter ble oppsamlet og undersøkt ved immunoblotting med forløper-spesifikke antistoffer (Fig. 9). Etter reduksjon ble antistoffene rettet mot to regioner av forløpersekvensene (anti-TGF-eigi_g4 og anti-TGF-el225-236) som identifiserte 44 kd til 56 kd høyere molekylvektsformer og ikke reagerte med moden TGF-el som er tilstede i supernatantene (Fig. 9A). Disse forløper-spesifikke antistoffene i tillegg til å identifisere de større 44 kd til 56 kd formene, påviste også forløper-polypeptider som i molekylvekt strakk seg fra 30 kd til 42 kd (Fig. 9A). Disse mindre forløpermolekylene reagerte ikke med anti-TGF-P<3->369-381 og kan være tilstede bare i forløpersekvenser. Således inneholder supernatanter kondisjonert ved TGF-el-3 celler selektert i MTX, i tillegg til moden el-TGF, større forløperformer. Disse forløpersekvensene kan siden de er så høyt konservert mellom artene, utvise andre viktige biologiske egenskaper. For å illustrere alle tre TGF-el formene i transfektant-supernatantene etter reduksjon, ble et immunoblot gensøkt med en blanding av forløper-spesifikt antistoff (anti-TGF-<p>l225-236) °S moden TGF-el spesifikt antistoff (anti-TGF-el36g_3<g>i) og vist (Fig. 4a). ;Supernatanter fraksjonert på ikke-reduserende SDS-polyakrylamidgeler og gensøkt med forløper spesifikke peptid-antistoffer eller med blanding av forløper spesifikt antistoff og moden TGF-el spesifikt antistoff er vist i Fig. 9B. En høyere molekylvektsform som strakk seg i størrelse fra 95 Kd til 110 Kd ble raskt identifisert ved hver av antistoffene. En blanding av forløper-spesifikk (anti-TGF-ei225-236) °S moden TGF-el (anti-TGF-ei369_3gi) antistoffer påviste den dimeriske formen av TGF-el (24 Kd) i tillegg til 95-110 Kd-båndet. ;7.6. Rekombinant TGF- el som består av hoveddelen med sekrerte ;proteiner fra TGF- ei- 3- 2. 000 celler ;TGF-ei-3/0 og TGF-ei-3/2.000 celler ble dyrket til sammenflyting, merket i serum-fritt medium med [<35>S]-cystein og [<35>S]-metionin i 18 timer, og de radioaktivt merkede sekrerte proteinene ble fraksjonert på reduserende SDS-polyakrylamid-geler. Resultatene er vist i Fig. 10. Supernatanter oppsamlet fra radioaktivt merket TGF-ei-3/0 celler viste ikke påvisbare nivå av rekombinant TGF-el proteiner. I motsetning viste supernatanter fra TGF-ei-3/2.000 celler fire hovedsekrerte proteiner som ikke var funnet i den begynnende TGF-el-3/0 transfektanten. Tre av disse proteinene beveget seg identisk til de modne og forløperformene av TGF-el identifisert ved immunoblotting. Det andre proteinet var tungt merket med [<35>S]-aminosyrer og frigjort ved TGF-ei-3/2.000 celler som beveget seg med en molekylvekt på 22 Kd. Aminoterminal sekvensanalyse av dette proteinet frembragte dens identitet som dihydrofolat reduktase. ;8. Eksempel: Karakterisering av TGF- el genprodukt De følgende eksemplene presenterer data om rensing og omfattende karakterisering av rTGF-el produkter syntetisert av CHO-TGF-e-3-2.000 celler. Resultatene antyder at rTGF-el blir syntetisert i CHO-celler som pre-pro-TGF-ei som blir prosessert ved karboksy-terminal side av Gly-29 og Arg 278, at rTGF-el forløper er glykosylert og fosfory<:>lert men at det modne proteinet ikke er det, at rTGF-el utviser en spesifikk aktivitet som er ekvivalent til den hos naturlig TGF-el, og at moden rTGF-el er en aktiv hemmer av tumor celle-vekst in vitro og in vivo. ;8.1. Glvkosylering og fosforylering av rTGF- el forløper De strukturelle trekkene av rTGF-el forløper som er relevante til denne Seksjon er illustrert i linjediagrammet vist.i Fig. 11A. En hydrofobisk leder kløyvet fra proteinet ved aminosyre-residie 29 fremstiller et 361 aminosyre-polypeptid angitt som 'a' i Fig. 11A. Etterfølgende modifikasjon og kløyving vil resultere i moden rTGF-el monomer (merket 'c' i ;Fig. 11A) og et 249 aminosyre-protein som består helt av aminoterminale forløperresidier ('b' i Fig. 11A). ;Cellelinjen som ble anvendt i dette eksempel er TGFe3-2.000 og TGF-el relaterte proteiner sekrert av disse^ cellene, analysert ved immunoblotting, og vist i Fig. 11B. Som beskrevet i Seksjon 7.5. ovenfor, inneholder supernatantene avledet fra TGFe3-2.000 celler en stor 95 Kd-110 Kd form av rTGF-el såvel som den modne 24 Kd proteindimeren når den ble analysert i SDS-polyakrylamid-geler under ikke-reduserende betingelser; når den ble analysert under reduserende betingelser, er disse supernatantene funnet å inneholde et 44 Kd-56 Kd bånd ('a ' i Fig. 11B, brønn 2), et 30 Kd - 42 Kd bånd ('b' i Fig. 11B, brønn 2) og et 12 Kd bånd ('c' i Fig. 11B, brønn 2) som er den modne TGF-el monomeren. Det er bevis for at båndene a, b og c vist i Fig. 11B inneholder regionene av rTGF-el forløperen vist i Fig. 11A og presentert i Seksjon 7.5. ovenfor. Disse båndene kan raskt bli visualisert når [35g]-metionin og [35S]-cystein-merkede supernatanter fra TGF-e3-2.000 celler blir analysert direkte i SDS-polyakrylamid-gelelektroforese etterfulgt av fluorografi (Fig. 11C, brønn 1 og Fig. 11D, brønn 1); disse båndene blir ikke påvist i supernatanter fra ikke-transfekterte CHO-celler. ;Den diffuse naturen til båndene 'a' og 'b' vist i Fig. 11 antyder at de kan være glykosylert. For å undersøke denne mulighet, ble TGFe3-2.000 celler merket med [<3>E]-glukosamin og celle-frie supernatanter analysert i SDS-polyakrylamid-gelelektroforese etterfulgt av fluorografi. Fig. 11C (brønn 2) viser at 95-110 Kd-formen var merket; ingen merking ble påvist i moden 24 Kd proteindimer. Når det ble analysert under reduserende betingelser (Fig. 11D, brønn 2), var 'a' og 'b' merket. Ingen merking var funnet i bånd 'c'. Således er rTGF-el forløperen glykosylert mens den modne 12 Kd monomeren ikke er det. ;Naturen til denne glykosyleringen ble videre undersøkt ved å behandle supernatanter fra TGFe3-2.000 celler med forskjellige glykolytiske enzymer etterfulgt av fraksjonering av de spaltede produktene på SDS-polyakrylamid-geler. Fig. 12A viser en immunoblot-analyse av disse spaltingene. Neuraminidase-behandling forårsaket at båndene 'a' og 'b' beveget seg raskere men det var fremdeles uklare bånd (Fig. 12A, brønn 3) og dette antyder tilstedeværelse av sialinsyre-residier. Endoglykosidase H, som i hovedsak kløyver høy-mannose oligosakkarid-kjeder, hadde ingen påvisbar effekt (Fig. 12A, brønn 4). Spalting med N-glykanase, som fjerner N-linket karbohydrat, forårsaket at båndene 'a' og 'b' beveget seg som to skarpe bånd, og det sterkeste av disse hadde en molekylvekt på tilnærmet 39 Kd (Fig. 12A, brønn 2). Som forventet ble det ikke notert noen endring i bevegelsen til moden 12 Kd-monomer. De samme resultatene ble oppnådd ved å anvende [<35>S]-cystein-merkede supernatanter fra TGFe3-2.000 celler (Fig. 12B). ;For å bestemme størrelsen til den umodifiserte TGF-el forløper, ble en 1.350 basepar Pst I-Eco RI-fragment som inneholder den fullstendige kodende regionen til TGF-el (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) subklonet inn i pSP64 og transkribert med SP6-polymerase (Kreig et al., 1984, Nucleic Acids Res. 18:7057-70). Analyse av disse tran-skriptene på agarose-ureageler indikerer at en enkelt RNA-art ble fremstilt (Fig. 13A) som programmerte syntese av et 42 Kd polypetid i et meldings-fritt retikulocytt celle-fritt translasjonssystem (Fig. 13B). Lenger eksponering av denne gelen viste tilstedeværelse av et mindre 40 Kd produkt. Størrelsen (42 Kd) av hoved celle-fri translasjonsproduk-sjonen er i god overensstemmelse med det som er forventet for et 390 aminosyreprotein og korresponderer mest sannsynlig til den umodifiserte TGF-el polypeptid-ryggraden. 39 Kd-båndet vist i Fig. 12A (brønn 2) og Fig. 12B (brønn 4) vil dermed representere den deglykosylerte proteinkjernen av rTGF-el minus den hydrofobiske ledersekvensen ('a' i Fig. 11A). Båndet under dette korresponderer til deglykosylert bånd 'b' i Fig. 11A. ;Inkubering av TGFe3-2.000 celler i nærvær av [<32>P]-ortofosfat og etterfølgende fraksjonering av cellefrie supernatanter på SDS-polyakrylamidgeler antyder at rTGF-el forløperen, men ikke den modne 12 Kd monomeren, var fosforylert (Fig. 11E). Tynnsjikt-kromatografi av sure hydrolysater viste at de fleste av fosfatene ikke var tilknyttet serin, treonin eller tyrosin (flekkene X, Y, Z, Fig. 11F). Data oppnådd i eksempel i Seksjon 9, nedenfor demonstrerer at fosfat blir inkorporert inn i asparagin-bundne komplekse karbohydrat-deler som mannose-6-fosfat. Følgene av dette funn blir også diskutert. ;8.2. Rensing av biologisk aktiv TGF- el ;CHO-celletransfektanter som uttrykker rTGF-el (TGF-e3-2.000 celler) ble formert og kassert som beskrevet i Seksjon 7 ovenfor. Rullef lasker (850 cm<2>) som inneholder 50 ml Dulbecco's modifiserte Eagles medium (DMEM) tilsatt fetalt bovint serum (10$ v/v), penicillin (100 U/ml) streptomycin (100 pg/ml), L-prolin (150 jjg/ml) og metotreksat (20 pM) ble utsådd med en sammenflytende 150 cm<2> rund vevskultur-plate med TGF-e3-2.000 celler og dyrket ved 37°C. Etter at cellene hadde oppnådd sammenflyting, ble de renset to ganger med 50 ml serum-fritt medium tilført som over og deretter inkubert i 24 timer i 50 ml serum-fritt medium tilsatt ytterligere askorbat og redusert glutation- i henholdsvis 100 jig/ml og 20 jag/ml. ;Serum-frie supernatanter ble oppsamlet fra rulleflaskene, sentrifugert ved 200 x g for å fjerne cellulært rest-materiale, og umiddelbart justert til 10 mg/liter fenylmetyl-sulfonyl-fluorid, 50 trypsin-hemmende enheter/liter av aprotinin (Sigma) og 0,2 M eddiksyre. Supernatanter ble konsentrert 40 ganger ved ultrafiltrering (YMIO-membran, 10.000 molekylvektsavkutting; Amicon) og det resulterende konsentratet ble omfattende dialysert mot 0,2 M eddiksyre. Det dialyserte materialet ble lyofilisert og lagret ved -20°C før rensing. ;Kondisjonert medium ble først fraksjonert i gelgjennomtrengnings-kromatografi. En representativ elueringsprofil er vist i Fig. 14. Mer enn 95$ av biologisk aktivitet ble eluert, basert på markørproteiner ved en molekylvekt på tilnærmet 15.000. Det samme elueringsmønsteret ble observert med nTGF-pl ved å anvende samme kolonnebetingelser. Den tilsynelatende lave molekylvekten til TGF-pl bestemt i gelgjennomtrengnings-kromatografi, kan skyldes den tette foldede strukturen til det dimeriske vekstfator-molekylet eller til uspesifikk adsorpsjon. Høy molekylvekts-aktivitet ble observert i det tomme volumet fra kolonnen og utgjorde for mindre enn 5$ av total tilført aktivitet. SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser av laget A og B viste at en hoveddel av den biologiske aktiviteten ble eluert som en 24 KDal polypeptid-art, mens den mindre aktiviteten ble eluert som en større 95-110 KDal molekylvekts-komponent (data ikke vist). ;For å beskrefte at den 24 KDal-komponenten representerte den riktige prosesserte rTGF-pl, ble denne arten renset til homogenitet ved å anvende revers-fase HPLC for ytterligere karakterisering. Pool B ble fraksjonert på en C18 pBondapak bærer (Fig. 15). Den biologisk aktive komponenten ble eluert på en grunn acetonitril-gradient som en homogen topp med samme retensjonstid som nTGF-Pl. Analyse på SDS-polyakrylamidgeler under ikke-reduserende og reduserende betingelser demonstrerte at denne aktive komponenten var homogen, og beveget seg sammen med nTGF-ei isolert fra bovin milt (Fig. ;16). rTGF-Pl ble ytterligere karakterisert ved protein-sekvensanalyse (Tabell V). ;Det rensede polypeptidet ble kjemisk kløyvet med cyanogen-bromid før sekvensering. Siden moden TGF-el inneholder bare ett metionin i residie 382, ble to sekvenser oppnådd samtidig; en som korresponderer til den amino-terminale sekvensen til vekstfaktoren (som begynner ved Ala-279) og en som representerer de karboksy-terminale 8 aminosyrene (som begynner ved Ile-383). Resultatene (Tabell V) demonstrerer at biologisk aktiv rTGF-el er riktig prosessert. ;En oppsummering av rensningstrinnene til rTGF-el er vist i Tabell VI. Vekstfaktoren ble renset mer enn 30 ganger i to rensningstrinn. I dette spesielle eksperimentet var det samlede utbyttet 54$ og resulterte i 0,65 mg rTGF-el pr. liter av kondisjonert kulturmedium. ;8.3. Rensing og naturen til rTGF- el forløper ;rTGF-el forløperen ble renset ved å benytte det faktum at den er glykosylert. Forløperen som ble eluert i det tomme volumet til en TSK-250 kolonne (Pool A) ble dialysert mot nøytralbuffer (50 mM NH4CHO3, pH 7,8) og sentrifugert ved 15.000 x g før fraksjonering på en konkonavalin A lectin-kolonne. En kolonne som inneholder en ml konkonavalin A kovalent bundet til Sepharose 4B (Pharmacia) ble omfattende vasket med fosfatbufferet saltoppløsning (PBS) og ekvilibrert med 50 mM NE4CHO3, pE 7,0. Prøver som skulle bli absorbert ble påsatt og resirkulert fire ganger gjennom kolonnen før vasking med ti volumer PBS. Spesifikt bundet materiale ble eluert med 100 mM metyl-a-D-mannopyranosid i PBS. ;Konkonavalin A-bundet forløper ble eluert spesifikt med a-metylmannosid. En SDS-polyakrylamid-gelprofil av renset forløper farget med Coomassie blue er vist i Fig. 16. Det eluerte proteinet beveget seg til en molekylvekt mellom 95-120 KDal. Denne store formen var reaktiv med antistoffet rettet mot forløpersekvensen og den modne vekstfaktoren. Det ble ikke påvist noen moden kontaminerende rTGF-el i denne fremstillingen, heller ikke på overladede SDS-polyakrylamid-geler . ;Selv om den modne, dimeriske vekstfaktoren var fraværende i fremstillingen, viste den rensede forløperen når den ble analysert på reduserende SDS-PAGE en 14 KDal-art som beveget seg sammen med monomerisk rTGF-el (Fig. 16). På gelene var det også tydelig to forløpertyper, pro-TGF-ei (30-390) og 30-42 KDal pro-regionen til forløperen (30-278; se også Fig. ;17). Ytterligere forsøk på å fraksjonere dette store komplekset til separate komponenter var ikke heldig. Amino-terminal sekvensanalyse av konkonavalin A renset materiale viste to aminoterminale sekvenser, en som begynte ved Leu-30 og den andre ved Ala-279. Disse resultatene antyder sterkt at den 95-120 KDal rTGF-el forløperen renset fra dette kondisjonerte medium av CEO-celler representerer en blanding av pro-TGF-ei (30-390), pro-regionen til forløperen (30-278), og den modne kjeden til rTGF-el (279-390) alle knyttet sammen i disulfid-bindinger. For å bekrefte denne observasjonen ble forløperen spaltet med CNBr og rensede CNBr-peptider for å fastslå den kjemiske naturen til dette komplekset. TGF-el-forløper (800 pmol) ble oppløst i 30 pl 70$ maursyre og 16 pl av en oppløsning som inneholder 15 mg CNBr i 100 ml 70$ maursyre ble tilsatt (Gross og Witkop, 1962, J. Biol. Chem. 237:1856-1860). Reaksjonen foregikk under nitrogen i 4 timer ved 30"C i mørke. Spaltingen ble kromatografert på en Bio-Sil TSK-250 gelgjennomtrengnings-kromatografikolonne ekvilibrert i 0,1$ triflureddiksyre (TFA) som inneholder 40$ acetonitril som beskrevet (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410). Revers-fase HPLC ble gjennomført på en p Bondpak C-18 kolonne (3,9 x 300 mm, 10 pm partikkelstørrelse; Waters) med en lineær gradient som bestod av 0,05$ TFA i vann som utgangsbuffer og 0,045$ TFA acetonitril som avslutningsbuffer. Fraksjonene ble oppsamlet i polypropylen-rør for å minimalisere tap fra uspesifikk adsorpsjon. En TSK-250 elueringsprofil av CNBr-kløyvet rTGF-el forløper er vist i ;Fig. 18. De forskjellige toppene ble identifisert ved aminosyresekvensering. Et hoved CNBr peptidfragment som inneholder en disulfid-bro mellom et forløper cystein-residie og cystein-residie til den modne vekstfaktoren er M(30-38/279-382/383-390) og dens amino-terminale sekvensanalyse vist i Tabell VII. Dette spesielle peptidfragmentet involverer Cys-33 til forløperen og en av cystein-residiene til moden vekstfaktor. Amino-terminal CNBr peptid M(30-38/262-382/383-390) representerer et disulfid-bundet peptid som involverer pro-TGF-ei. ;8.4. Aminoterminalsekvens av rTGF- el polypeptider Automatisk sekvensanalyse ble utført på en modell 475A aminosyre-sekvensator (Applied Biosystems). Fenyltiohydantoin-aminosyrederivatet ble adskilt i reversfase HPLC, on-line på en modell 120A PTE-analysator (Applied Biosystems) som beskrevet (Marquardt et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:12127-12136). ;Serum-fritt kondisjonert medium fra CHO-TGF-el-3/2.000 celler som uttrykker høye nivåer av simian rTGF-el ble elektroforese-behandlet på SDS-PAGE under reduserende betingelser. Coomassie blue-farging viste tre molekylformer av rTGF-el sekrert av disse cellene (Fig. 17). Den største formen, en vidt bevegende type som strekker seg i størrelse fra 44—56 KDal ("a" i Fig. 17) og som innehar immunologiske epitoper avledet fra TGF-el forløper og moden TGF-el (Seksjon 7.5 ovenfor), representerer mest sannsynlig uprosessert TGF-el forløper. Det 30-42 KDal polypeptidet ("b" i Fig. 17) inneholder bare forløper-avledede epitoper (Seksjon 7.5 ovenfor) og indikerer at denne typen har undergått proteolytisk kløyving og separert seg fra den modne TGF-el formen. ;14 KDal typene ("c" i Fig. 17) representerer moden, fullt prosessert TGF-el monomer. Rekombinante forløperproteiner ("a" og "b" i Fig. 17) ble elektroeluert fra akrylamid-skiver og karakterisert ved aminoterminal sekvensanalyse. Resultatene er vist i Tabell V over. Sekvensanalyse viste at to større forløperformer har identiske aminoterminale sekvenser. Sammenligning av denne sekvensen med den foreslåtte fra simian TGF-el cDNA (Sharples, et al., 1987, DNA 6:239-244) antyder at begge større proteiner har undergått spesifikk proteolytisk kløyving ved Gly-29/Leu-30 og fjernet de første 29-aminosyrene fra det intakte pre-pro-TGF-el molekylet. Kløyving av denne hydrofobiske 29-aminosyre ledersekvensen er mest sannsynlig resultatet av en signalpeptidase. Gly-29/ Leu-30 peptidbindingen er det forutsatte signalpeptid kløyvingssetet (Von Heijne, 1986, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690). Basert på disse resultatene representerer 44-56 KDal ;TGF-el polypeptidet ("a" i Fig. 17) pro-TGF-ei (30-390) mens 30-42 KDal-typene ("t>" i Fig. 17) korresponderer til pro-regionen av forløperen (30-278) som mangler signalpeptidet og modne TGF-el sekvenser. Sekvensanalyse av det 14 KDal polypeptidet (data ikke vist) viser en intakt aminoterminal som begynner ved Åla-279 til den modne vekstfaktoren og dette antyder at CEO-TGF-el-3/2.000 celler prosesserer riktig simian rTGF-el ved det dibasiske kløyvingssetet. En oppsummering av et foreslått prosesseringsskjerna for TGF-el er presentert i Fig. 20. ;8.5. Biologisk aktivitet in vitro ;Rensede modne- og forløperformer av rTGF-el ble undersøkt for biologisk aktivitet på minklunge-epitelceller som beskrevet i Seksjon 7.1.6. ovenfor. De biologiske aktivitetsprofilene til moden og forløper rTGF-el og naturlig TGF-el fra bovin milt er presentert i Fig. 19. Molaritetsberegninger var basert på forutsatte aminosyresammensetninger (for forløper rTGF-el, ble aminosyre-sammensetningen til pro-TGF-el anvendt). Resultatene antyder at moden rTGF-el er en aktiv hemmer av minklunge-celle proliferasjon (1-2 pM for halv-maksimal hemming) og har en aktivitetskurve som kan legges oppå den som ble oppnådd for naturlig TGF-el. I andre ord utviser rekombinant TGF-el fra oppfinnelsen og naturlig TGF-el identiske spesifikke aktiviteter. I motsetning var forløper-fremstilling 50 ganger mindre aktiv enn moden vekst-faktor (50-60 pM for halv-maksimal hemming) og en sammenligning av hemmingsprofilene i Fig. 19 viste en svak forskjell i dose-respons kurvene, og dette antyder reseptoraffinitets-forskjeller mellom de modne- og forløperformene. ;8.6. Biologisk aktivitet in vivo ;Effektene av TGF-el in vivo er for det meste ukjent selv om dens rolle i hemming av pattedyr-kjertelvekst (Silberstein og Daniel, 1987, Science 237:291), i skadeheling (Sporn et al., 1983, Science 219:1329), og i embryonisk utvikling (Weeks et al., 1987, Cell 51:861) har vært foreslått. Både naturlig avledet TGF-el og TGF-e2 fra ben (Seyedin et al, 1986, J. Biol. Chem. 261:5693; Seyedin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946) og rekombinant simian TGF-el klonet (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244 ) og uttrykt (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418) i CHO-TGF-ei-3-2.000 celler er aktive hemmere av DNA-syntese i en lang rekke etablerte tumor cellelinjer av human epitel opprinnelse (Eanchalis et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Comm. 148:783). I denne studien presenteres in vivo bevis for at TGF-e også er tumorstatisk for en human lungetumor-vekst i atymiske nakne mus. Særlig slående er innføring ved TGF-e av en differensiert-lignende cellulær fenotype i de hemmede tumorcellene. Human lungecarcinoma cellelinje med betegnelsen A549, etablert fra en mannlig Caucasier med en adenocarcinoma i lungen, er et responsivt mål ( in vitro) for hemming av picomolare konsentrasjoner av naturlig TGF-el eller TGF-e2 og rekombinant TGF—el fra oppfinnelsen. Nakne mus ble innpodet subkutant med A549-celler; tydelige tumorer utviklet seg i tilnærmet 80$ av dyrene i tre uker. Fig. 21 viser effekten av TGF-el og TGF—e2 behandling på den ytterligere veksten av A549-tumor i disse musene. Hver eksperimentelle gruppe inneholdt fem dyr og verdier på ordinataksen representerer gjennomsnittlig tumormåling i tre dimensjoner (volum). Dag 1 korresponderer til den første dagen da gruppen mottok behandling; test-forbindelsene ble subkutant injisert i nærheten av tumoren men ikke inn i tumoren selv. Dyr i kontrollgruppene mottok injeksjoner med bovin serumalbumin i en bæreroppløsning som var identisk med TGF-e behandlings tumor-bærende dyregrupper. Tumorvolumet i kontrollgruppene ble doblet tilnærmet hver 7—8 dag. Tilsvarende doblingstider ble også observert i separate eksperimenter i tumor-bærende dyr som mottok et biologisk inaktivt syntetisk peptid. I motsetning til gjentatte injeksjoner som korresponderte til de dagene som angitt på absisseaksen, med 200 ng TGF-el og TGF-e2 (1,4 pg totalt pr. behandling for hver) var tumorstatisk og retarderte videre vekst av tumorene. Som vist i Fig. 21, syntes TGF-el noe mer effektiv enn TGF-e2. I et adskilt eksperiment ble dose-responsen til TGF-el på A549 tumorhemming undersøkt (Fig. 21). Verdier representerer gjennomsnittlig tumorvolumer i TGF—e behandlede dyr relativt til tumorvolumer fra kunstig-behandlede dyr. Ca. 25$ hemming ble observert i laveste dose som ble undersøkt (12,5 ng pr. injeksjon) av TGF-el. Ved høyere doser, 50 og 200 ng pr. injeksjon, ble en korresponderende større hemming i tumorvekst observert (henholdsvis 37$ og 60$). I noen eksperimenter, dess større tumorvolumet var ved dag 1, dess lavere var prosentreduksjonen i hemmet tumorvolum relativt til tumorer avledet fra kontrollgrupper. Dyr som mottok til og med høyeste doser av TGF-e (1,4 pg samlet etter 20 dager) utviste ingen stor bekreftelse på TGF-e toksisitet. Som vist i Fig. 23 fremviste TGF-el behandlede dyr normale karakteristika; ingen tilsynelatende abnormaliteter ble funnet ved grov eksaminering av hoved-organene under biopsi. Innsettingen er representativ for størrelsen av tumorer fjernet fra hver gruppe på slutten av eksperimentet (dag 20) før den ble underkastet patologi. Tumorer fjernet fra forsøksdyrene (dag 21, Fig. 21) hadde mer enn 90$ reduksjon i gjennomsnittlige nettovekter. ;Rekombinant simian TGF-el renset til homogenitet fra serum-frie kultursupernatanter utviste en in vitro dose-respons hemmingskurve tilsvarende det naturlige molekylet (bovint ben) når det ble undersøkt på en lang rekke tumorceller inkludert A549 tumorceller som ble anvendt i disse studiene. En sammenligning av effekten med rekombinant og naturlig TGF—el på vekst av A549 human lungecarcinoma i atymisk mus er vist i Tabell VIII. Det rekombinante produktet var mer effektivt i hemming av tumorvekst enn ben-avledet TGF-el, 60$ hemming sammenlignet med 46$ hemming. ;Tumorer ble skåret ut fra kontroll- og behandlede dyregrupper, fiksert og underkastet histologisk patologisk undersøkelse. Som vist i Fig. 24, brønn A, under lav styrke, demonstrerer trikrom-fargede kontroll tumorsnitt i hovedsak store områder med nekrose dispergert gjennom et heterogent felt med forskjellige celletyper, for det meste kolonne-epiteliske. Et stort antall blodkar er også observert. I motsetning demonstrerte tilsvarende fremstilt snitt av TGF—el hemmede tumor-prøver "b" i Fig. 24 lite nekrose, tilsynelatende mer organisering og en forskjellig distribuering av celletyper. Særlig tydelig var økningen i bindevevs-binding (blåfarging) relativt til kontrolltumor-typene. I tillegg fremkom generell vaskularitet å avta relativt til kontroll-tumor. Når det ble undersøkt under høy forstørrelse, utviste ikke nekrotiske områder av kontroll-tumor ("c" i Fig. 24) en kombinasjon av epitel-lignende og svakt differensierte celletyper, tydelig var også den høye tetthet av fargede kjerner og dette indikerer en høy hastighet av tumorcelle-proliferering. I motsetning presenterte TGF-e-behandlede tumortypene ("d" i Fig. 25) et vesentlig annerledes bilde. Den dominerende celletypen som sees er stor og rund; kjernene er mer dispergert i feltet og fremviser den sigd-formede morfologien som er kjennetegnet av slimceller (en normal lungecelle-type som sekrerer slim). Selv om noen slimsekrerende celler ble observert i kontrol1tumor-typene, representerte de bare en mindre underpopulasjon av celler. Det var også mer fremherskende i snittene fra TGF-e hemmede tumorer ("d", innsatt, i Fig. 25) med spredte sentra av kolonne-epitelceller organisert rundt blodkar. ;Den slimsekrerende naturen til den slim-1ignende celletypen fra behandlede tumorer ble bekreftet av periodisk sur Schiff-basefarge (PAS). Kontrolltumor-snitt ("a" i Fig. 25) viste noen få spredte områder med høy glykoprotein-tetthet. Dramatisk forsterket PAS-fargingsintensitet ble sett i de TGF-e-behandlede tumorsnittene ("b" i Fig. 25). En mer differensiert og organisert fenotype er også tydelig. Både kontroll og TGF-e-behandlede tumorsnitt ble også undersøkt for glykosamin-glykaner (GAGer) målt ved farging med Alcian blue ved pH 2,5. Kontrollprøver ("c" i Fig. 25) utviste meget høy farging mens TGF-e-behandlede prøver ("d" i Fig. 25) viste betydelig mer, og dette antyder et høyt nivå av hyaluronsyre-syntese og avsetning. ;9. Eksempel: Identifikasjon av mannose- 6- fosfat i to ;asparagin- bundne sukker- kjeder med rTGF- el forløper ;Det følgende eksempel demonstrerer at alle tre potensielle glykosyleringssetene (Asn-82, -136 og -176) i simian rTGF-el blir anvendt til karbohydrat-tilsetning og at fosforylering foregår i oligosakkarid-sidekjedene. Resultatene antyder en uavhengig funksjonell rolle til rTGF-el forløperen. ;9.1. Materialer og metoder ;9.1.1. Materialer ;Sekvenseringsreagenser ble oppnådd fra Applied Biosystems. Oppløsningsmidler til HPLC var fra Burdick og Jackson. CNBr var fra Kodak; 4-vinylpyridin var fra Aldrich Chemicals Co.; alle andre kjemikalier var av reagensgrad. Staphylococcus aureus V8 protease var fra Miles Laboratories; L-(tosylamido-2-fenyl) etylklorometyl keton-behandlet trypsin ble oppnådd fra Worthington. ;9.1.2. Cellekultur ;TGF-e-3-2.000 cellelinjen ble formert som beskrevet i Seksjon 7.1.1. ovenfor. Individuelle kloner ble isolert ved begrenset fortynning i 96 brønns plater. En klon, TGF-P-3-2.000-17 (heretter referert til som klon 17) ble funnet å fremstille tilnærmet 2 pg/ml aktivt TGF-el og ble anvendt til ytterligere analyse. Disse cellene ble rutinemessig passert i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium som inneholder 10$ fetalt bovint serum, 150 pg/ml L-prolin, 100 U/ml penicillin, 100 jjg/ml streptomycin og 20 jjM metotreksat. ;9.1.3. Radioaktiv merking ;Klon 17-celler ble dyrket til sammenflyting, vasket tre ganger i fosfat-fritt medium minus serum og inkubert i det samme mediet i 30 minutter ved 37°C. Mediet ble deretter erstattet med friskt metionin, cystein og serum-fritt medium som inneholder 200 pCi/ml [<3>5S]-metionin og [35S]-cystein (NEN, Boston, MA) og cellene ble inkubert i 4 timer ved 37°C. Til merking med [<3>E]-sukker ble cellene dyrket til sammenflyting, vasket med serum-fritt medium og merket i 20 timer i serum-fritt medium som inneholder 100 pCI/ml [<3>H]-glukosamin eller [<3>H]-mannose (NEN, Boston, MA). Radioaktivt merkede serum-frie supernatanter ble oppsamlet, sentrifugert ved 4.000 x g i 10 minutter, dialysert omfattende mot 0,2 M eddiksyre og lyofilisert. ;9.1.4. Polvakrvlamid gelelektroforese ;Tørkede pelletter ble analysert under reduserende betingelser på en 15$ SDS-polyakrylamid eller på 7,5-15$ gradient SDS-polyakrylamidgeler som beskrevet (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685). Gelene ble farget med Coomassie blue, fluorografert for [<35>S]- og [<3>H]-merkede proteiner (Chamberlain, 1979, Anal. Biochem. 98:132-136) og eksponert til Cronex-4 røntgenfilm. Alternativt ble lyofiliserte prøver spaltet med N-glykanase (Genzyme, Boston, MA) i 16 timer ved 37°C, ved å anvende forhandlerens anbefalte betingelser, forut for polyakrylamid gelelektroforese. ;9.1.5. Sur hydrolyse ;[<32p>]-merket rTGF-el forløper, og [<32>P]-merkede glykopeptider ble hydrolysert i 6N HC1 i 2 timer ved 95° C. Produktene ble separert ved elektroforese ved pH 1,9 og 3,5 og påvist i autoradiografi som beskrevet (Cooper et al., 1983, Meth. Enzymol. 99:387-402). Alternativt ble elektroforese ved pH 8,9 (1$ ammoniumkarbonat) etterfulgt av kromatografi (65$ isosmørsyre), 5$ pyridin, 3$ eddiksyre, 2$ butanol, 25$ vann). Interne standarder (fosfoserin, fosfotreonin, fosfotyrosin) ble påvist ved ninhydrin-farging. Mannose-6-fosfat ble påvist ved spraying med 70$ perklorsyre: IM EC1: 4$ ammonium-molybdat: aceton (5:10:25:60), tørking og eksponering til utrafiolett lys. ;9.1.6. S- pyridyletylering ;Til reduksjon ble 50 pg TGF-el forløper og 225.000 cpm [<32>P]-merket rTGF-el forløper, avledet fra serum-fri supernatant klon 17 celler behandlet med ditiotreitol (20 mM) i 100 pl 0,4 M Tris-HCl-buffer, pH 8,5, inneholdende 6 M guanidin HC1, 0,1$ Na2EDTA, i 2 timer ved 50° C og etterfølgende S-pyridyletylert med 4-vinylpyridin (100 mM) i 4 timer ved 22° C. Reaksj onsblandingen ble surgjort til pH 2,0 med 20$ TFA og avsaltet på en RP-300 kolonne (2,1 x 30 mm; Applied Biosystems) ved å anvende en TFA/acetonitril-gradient for eluering. Konsentrasjonen av acetonitril ble øket lineært fra 0,1$ TFA i vann til 60$ acetonitril som inneholder 0,08$ TFA i løpet av 1,5 timer, med en strømningshastighet på 100 pl/min. ved 35°C. ;9.1.7. K. jemisk og enzymatisk kløyving ;For CNBr-kløyving ved metionyl-redisider, ble 650 pmol S-pyridyletylert TGF-el forløper og 160.000 cpm [<32>P]-merket S-pyridyletylert TGF-el forløper oppløst i 30 pl 70$ maursyre og 4 1 av en oppløsning som inneholder 60 mg CNBr i 100 pl 70$ maursyre som ble tilsatt (Gross og Witkop, 1962, J. Biol. Chem. 237:1856-1860). Reaksjonen foregikk under en nitrogen-pute i 4 timer ved 30" C og fortsatte i ytterligere 18 timer ved 22°C i mørke. ;Kløyving med S. aureus V8-protease ble utført i 40 p av 0,1 M Tris-eddiksyrebuffer, pH 8,0, som inneholder 3 M urea ved 37"C i 10 timer. Enzym/substrat-forholdet var 1 til 10 (vekt/vekt). Trypsinspalting av pool A og pool B (Fig. 31-A) ble gjort i 40 pl 0,1 M Tris-eddiksyrebuffer pH 8,0, som inneholder 30$ acetonitril, ved et enzymsubstrat-forhold på 1 til 20 ved 37°C i 15 timer. De enzymatiske spaltningene ble surgjort med 20$ TFA til pH 2,0 og adskilt ved rpHPLC. ;9.1.8. Peptidrensing ;HPLC ble utført på et Waters HPLC-system som bestod av to M 6.000 A-pumper, en systemregulator, en U6K-injektor, en modell 441 fiksert bølgelengde-detektor (214 nm) eller på et modell 130A separasjonssystem (Applied Biosystems), og en papirregistrerer. Gelgjennomtrengnings-kromatografi på en Bio-Sil TSK-250 kolonne (7,5 x 600 mm; Bio-Rad Laboratories) ble utført i 0,1$ TFA som inneholdt 40$ acetonitril ved en strømningshastighet på 0,25 ml/min. Peptid-rensing med rpHPLC ble utført ved 35°C på en RP-300 kolonne (2,1 x 30 mm; Applied Biosystems). Lineære acetonitrilgradienter bestod av 0,1$ TFA i vann som startbuffer og acetonitril som inneholdt 0,08$ TFA som avslutningsbuffer ble benyttet til eluering. Peptider ble oppsamlet manuelt. V8-proteasepeptider indikert ved E, og trypsinpeptider indikert ved T kunne bli anvendt for sekvensanalyser uten ytterligere rensing. ;9.1.9. Aminosyre sekvensanal<y>se ;Automatisert sekvensanalyse ble utført på en modell 475A aminosyresekvensator (Applied biosystems) ved å anvende RUN470-1 program. Totalt 1,5 mg BioBrene Plus (Applied Biosystems) ble anvendt og utsatt for to forsykler av Edman-degradering forut for prøveapplikasjon. Omdanning av tiazolinon-derivater til fenyltiohydantoin-aminosyrer ble utført med 25$ TFA. Fenyltiohydantoin-aminosyrederivater ble adskilt ved rpHPLC, on-line, på en modell 120A PTH-analysator (Applied Biosystems), som beskrevet (Marquardt et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:12127-12131). ;9.1.10. Bindingsstudier ;TGF-el forløper ble renset i gelgjennomtrengnings-kromatografi på en Bio-Sil TSK-250 kolonne og rpHPLC på en Vydac C4-kolonne. Tilnærmet 6 pg av renset forløper ble iodinert med 1 mCi [<125>I] som beskrevet (Frolik et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:10995-11000). En fastfase-reseptoranalyse ble anvendt for å måle binding av [<125>I]-TGF-el forløper til mannose-6-fosfat/IGF-II reseptoren (Rotn et al., 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:600-606). Polyvinylklorid mikrotiterbrønner ble sekvensielt dekket med 40 pl protein A (20 pl i 20 mM NaHC03, pH 9,6), kanin-antistof f er til IGF-II reseptor (50 pg/ml) og 500 ng renset human fetal hjerne-reseptor (id.). Bufferen som ble anvendt i alle vaskene inneholdt 50 mM HEPES, pH 7,8, 50 mM NaCl, 0,1$ Triton-X-100, 0,1$ Tween 20 og 0,1$ bovint serumalbumin. Brønnene ble deretter inkubert med 5$ ikke-fet tørrmelk i 20 min. ved 4°C og deretter ble radioaktivt merket TGF-el forløper tilsatt til hver brønn. Etter 3 timer ved 4°C, ble brønnene vasket fire ganger, skåret ut og talt. Ikke-spesifikke bundne tellinger ble bestemt i fravær av reseptor og trukket fra før beregning av prosent hemming. ;9-2. Resultater ;Tre strukturelle former av rTGF-el sekrert av klon 17 celler er illustrert i linjediagram i Fig. 26A. I Fig. 26A er det også indikert de tre potensielle asparagin-bundne glykosyleringssetene som er foreslått fra DNA-sekvensen av simian TGF-el forløper: Asn-82, -136 og -176 (Fig. 1 og Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244). ;Fig. 26B viser et antoradiogram av [<35>S]-merkede proteiner sekrert av klon 17 celler analysert i SDS-polyakrylamid-gelelektroforese. Proteinene a, b og c kan enkelt bli visualisert. Forløper-proteiner a og b kan bli merket med [<3>H]-glukosamin, [<3>H]-mannose og [<32>P]-fosfat (Fig. 26C, 26D og 26E) og dette antyder at rTGF-el forløperproteinene a og b, men ikke moden rTGF-el (protein c) er både fosforylert og glykosylert. Spalting av [3<5>S]-merkede forløperproteiner med N-glykanase resulterte i en endring i vandringen til båndene a og b til skarpere og hurtigere vandrende bånd, der det største av disse hadde en molekylvekt på tilnærmet 39.000 (Fig. 27A, brønn 2), i overensstemmelse med den beregnede molekylvekten til 41.200 for TGF-el forløperprotein a. Spalting av [<32>P]-merkede proteiner med N-glykanase og etterfølgende fraksjonering av spaltingene ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese antydet at enzymet hadde fjernet all merking fra rTGF-el forløperproteinene (Fig. 27B, brønn 2), og det antyder at [<32>P]-merking ble inkorporert inn i asparagin-bundne oligosakkarider. ;De glykosylerte og fosforylerte rTGF-el forløperproteinene a og b ble utsatt for cyanogenbromid-kløyving og etterfølgende enzymatisk spalting for ytterligere karakterisering av fosforyleringssetene. De merkede glykopeptidene ble renset i gelgjennomtrengnings-kromatografi og rpHPLC. Sekvensanalyse av tre fragmenter opplistet i Fig. 28 indikerer at Asn-82, Asn-136 og Asn-176 er glykosylert. Over 95$ av merkingen ble funnet i peptider E(77-91) og E(134-139). Peptid T(174-180) inneholdt mindre enn 5$ av total inkorporert [<32>P]-merking. ;S-pyridyletylert rTGF-el forløper ble kløyvet med CNBr ved metionin-residier. Gelgjennomtrengnings-kromatografi av CNBr-fragmentene på en Bio-Sil TSK-250 kolonne oppløste [<32>P]-M(134-253) og [<32>P]-M(39-113). Et representativt kromatogram er vist i Fig. 29. ;M(39-113) ble ytterligere subfragmentert med S. aureus V8-protease. Enzymspaltingen ble surgjort og peptidene separert i rpHPLC. Et representativt kromatogram er vist i Fig. 30. De fullstendige sekvensene av [<32>P]-E(76-91) og [<32>P]-E(76-94) ble bestemt. Begge peptidene inneholder en karboksy-terminal glutaminsyre, og dette er i overensstemmelse med spesifisiteten til proteasen. Begge peptidene inneholdt et uidentifisert residie i posisjon 82 (Tabell IX). DNA-sekvensen foreslår et asparagin-residie i posisjon 82 til TGF-el forløper-translasjonsproduktet, et potensielt sete for N-bundet glykosylering. Det forventede utbyttet av PTH-Asn i syklus 7 vil tillate identifisering av et umodifisert asparagin. Utbyttet av PTH-Asn i posisjon 82 var tilnærmet 0,5$ av det som var forventet basert på utbyttene av tilgrensende residier. Det lave utbyttet av PTH-Asn-82 kan være forårsaket av nedgangen i løselighet til det modifiserte tiazolinon-derivatet i det ekstraherende løsningsmiddelet, butylklorid, relativt til andre tiazolinon-aminosyrer. Sur hydrolyse og etterfølgende 2-dimensjonal elektroforese av [32P]-E(76-91) påviste mannose-6-[<32>P]-fosfat Fig. 31. ;M(134-253) ble ytterligere subfragmentert med S. aureus V8-protease, og gav to hoved [<32>P]-merkede peptider, som vist i ;Fig. 31A. Sekvensene til de opplistede peptidene ble bestemt, og begge inneholdt en karboksyterminal glutaminsyre, i overensstemmelse med spesifisiteten til proteasen. Peptid [<32>P]-E(134-139) inneholdt et uidentifisert residie i posisjon 136 (Tabell IX). Utbyttet av det antydede PTH-Asn var tilnærmet 2$ av det som var forventet, basert på utbyttene til tilgrensende residier, og ble dermed antatt å være glykosylert Asn. Sur hydrolyse og etterfølgende 2-dimensjonal elektroforese av [32P]-E(134-139 ) påviste mannose-6-[<32>P]-fosfat (Fig. 32). ;Topp A (Fig. 31A), som inneholdt E(170-194) ble lagret, tørket og subfragmentert med trypsin. Spaltingen ble surgjort og peptidene separert med rpHPLC. Et representativt kromatogram er vist i Fig. 31B. Sekvensen til T(174-180) ble bestemt (Tabell IX). Peptid T(174-180) inneholdt et uidentifisert residie i posisjon 176. Utbyttet av det forutsatte PTH-Asn var tilnærmet 1% av det som var forventet, basert på utbyttet av tilgrensende residie Asn-177 og dette antyder glykosylering av Asn-176. Den kromatografiske heterogeniteten til T(174-180) er tydelig. Dette peptidet inneholdt mindre enn 5% av total [<32>P]-inkorporert inn i forløperproteinet. Sur hydrolyse og etterfølgende 2-dimensjonal elektroforese påviste mannose-6-[<32>P]-fosfat (ikke vist). ;Topp B (Fig. 31A) ble tørket og spaltet på nytt med S. aureus V8 protease og etterfølgende med trypsin og peptidene ble separert i rpHPLC. Tilsvarende peptidmønstre ble oppnådd som vist i Fig. 31A og Fig. 31B, og dette antyder ufullstendig kløyving av M(134-253) med V8-protease. ;Tynnsjikt-elektroforeseanalyse av sure hydrolysater av totale forløperproteiner (a og b) såvel som rensede glykopeptider viste at [<32>P]-fosfat ble inkorporert inn i mannose-6-fosfat; ikke noe [<32>P]-fosfat ble inkorporert inn i Ser, Thr, Tyr (Fig. 32A-C). Det ble observert samvanding av peptid-inkorporert [<32>P]-merket og standarder med mannose-6-fosfat ved elektroforese i buffere ved pH 1,9, pH 3,5 og pH 8,9, og i to forskjellige kromatograferingsbuffere (Fig. 32D og data ikke vist). Sur hydrolyse kan også skape mannose-6-fosfat fra proteiner modifisert med glykosylfosfatidylinositol (Lon og Saltiel, 1988, Science 239:268-295), men dette har bare vært funnet i karboksyterminalene til proteiner og det er derfor usannsynlig at de står for mannose-6-fosfat i rTGF-Pl forløperen. ;Eksperimenter som var rettet mot bestemmelse av om TGF-el forløperen har evne til binding til mannose-6-fosfat reseptoren ble også gjennomført. <125>I-merket TGF-el forløper ble inkubert med renset mannose-6-fosfat reseptor. Resultatene presentert i Fig. 34 demonstrerer at forløperen kan binde til renset reseptor siden tilnærmet 30 ganger så mye er radio-ligand-bundet til reseptoren som i kontrollinkuberingene uten reseptor. Denne binding var spesifikk siden den var fullstendig hemmet (90$) ved enten 100 nM TGF-el forløper 50 pM mannose-6-fosfat. ;10. Eksempel: Ekspresjon av TGF- el varianter i COS- celler Seterettet mutagenese ble anvendt for å endre den primære strukturen til TGF-el ved tre cysteinresidier lokalisert i pro-regionen til TGF-el forløperen ved å endre den kodende sekvensen for cysteinresidiene i aminosyre-posisjonene 33, 223 og 225 (Fig. 1) til kodende sekvenser for serin. Mutant-konstruksjonene ble anvendt for å transfektere COS-celler og rekombinant TGF-el variant-proteiner fremstilt av transfektantene ble analysert. Resultatene indikerer at CYS-33 kan være involvert i regulering og prosessering av moden TGF-el. CYS-33 modifikasjonen gir som utbytte en forløper som til slutt resulterer i fremstillingen av høyere nivåer med moden TGF-el. ;10.1. Materialer og metoder ;10.1.1. Karakterisering av CNBr peptid M( 134- 253 )£ ;rTGF-el forløper syntetisert av CHO-celler ble renset i gelgjennomtrengnings-kromatografi, kløyvet med CNBr og peptidene renset som beskrevet (Seksjon 8., og følgende). Cystein-inneholdende peptider ble påvist etter reduksjon med tributylfosfin og kobling med ammonium 7-fluorobenzo-2-okso-1,3-diazol-4-sulfonat (Sueyoshi et al., 1985, J. Biochem. ;(Tokyo) 97:1811-1813) og renset til homogenitet i revers-fase HPLC på en pBondapak C^g-kolonne (Waters Associates Inc., Milford, Mass . ). ;Peptider ble separert på 15$ SDS-polyakrylamidgeler og farget med Coomassie brilliant blue R-250. Disulfid-bundne peptider ble analysert med en Applied Biosystems 475A sekvensator. Fenyltiohydantoin-aminosyrederivater ble evaluert på en Applied Biosystems 120A PTH-analysator som beskrevet (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol 8:4162-4168). ;10.1.2. Konstruksjon av ekspresjonsvektorer som koder for ;TGF- el varianter og DNA- transfeksjoner ;pTGF-e-2 (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) ble spaltet med Pstl og EcoRI og 1.400 bp fragmentet som inneholder hele TGF-el kodende region ligert til plasmid pSP64 som nylig hadde blitt spaltet med Pstl og EcoRI. Konstruksjonen ble anvendt til å transformere E. coli HB101 og plasmid pSP64/ TGF-el ble isolert. Pstl- EcoRI-fragmentet fra TGF-el cDNA ble skåret ut fra pSP64/TGF-ei og satt inn i M13mpl8, og plassering av et Hindlll restriksjonssete 5' til Pstl-setet. Enkelt-trådet DNA, som inneholder Mpl8-tråden og den ikke-kodende tråden til TGF-el, ble isolert og anvendt som et ;<y>t- ;templat for seterettet mutagenese. CYS-33, CYS-223 og CYS-225 ble individuelt endret til SER-kodons ved å anvende et kommersielt tilgjengelig oligonukleotid-rettet in vitro mutogenese-system (Amersham). ;De følgende oligonukleotidene ble anvendt til å konstruere mutantene: ;I hvert tilfelle fullførte en nukleotidendring CYS til SER kodonendringen. Fem til ti plaque ble screenet for ønsket mutasjon ved enkelt-spor sekvensering ved å anvende den sisten mutanten karakterisert ved ytterligere sekvensering ved å anvende dideoksy kjede-termineringsmetoden (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 84:8573-8577). ;Replikative former som inneholder mutant cDNA ble isolert, spaltet med EcoRI, reparert til butte ender og spaltet med Eindlll. De resulterende cDNA-fragmentene ble ligert inn i pnH3M (Aruffo og Seed, 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:8573-8577; Seed og Aruffo, 1986, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3365-3369) ved Hindlll og Xhol (butt) setene for å konstruere plasmidene prtH3M/pl SER-33 (som koder pre-pro-TGF-eiS3<3>), pnH3M/3l SER-223 (som koder pre-pro-TGF-<g>l<S223>), pnH3M/el SER-225 (som koder pre-pro-TGF-eiS225) og pnH3M/pl SER-223/225 (som koder pre-pro-TGF-elS223/225). COS-celler ble transfektert med disse plasmidene såvel som plasmid pnH3M/<g>l (som koder vill-type TGF-el) som beskrevet (Aruffo og Seed, 1987, Proe. 1. Acad. Sei. USA 84:8573-8577; Seed og Aruffo, 1986, Proe. Nati. Adac. Sei. USA 84:3365-3369) med følgende modifikasjoner. Transfeksjon ble utført i 100 mm skåler med 10^ celler ved å anvende 5 ml transfeksjons-materiale i 2,5 timer ved 37°C. Ved 48 timers etter-transfeksjon, ble celler plassert i serum-fritt medium og 72 timer senere ble kondisjonert medium oppsamlet, dialysert mot tre endringer av 0,2 M eddiksyre og analysert ved immunoblotting med moden- og forløper-spesifikke peptid-antistoffer som beskrevet i Seksjon 7.1.7., ovenfor. Bioaktivitet ble bestemt ved veksthemmings-analysen beskrevet i Seksjon 7.1.6. ovenfor. ;10.2. Resultater ;10.2.1. Analyse av proteiner som er kodet med TGF- gl kodende ;sekvenser ;Bioaktiviteten påvist i dialysert serum-fritt medium kondisjonert med COS-transfektanter er oppsummert i Tabell X under. Celler transfektert med plasmid p:nH3M/<g>l SER-33, som koder for en TGF-gl variantforløper, sekrerer mellom tre og fem ganger mer biologisk aktivt protein enn de cellene transfektert med plasmid pnH3M/ei, som koder for vill-type TGF-el. Celler transfektert med plasmid som koder for SER-223 og SER-225 varianter sekrerte ikke høyere nivåer av bioaktivt protein sammenlignet med celler transfektert med vill-type konstruksj onen. ;Immunoblot-analyse ble gjennomført ved å anvende anti-TGF-el369-381 + anti-TGF-3lg^_g4 som beskrevet i Seksjon 7.1.8. ovenfor, for å påvise TGF-Bl relaterte proteiner. Resultatene er presentert i Fig. 33A-G. Under reduserende betingelser (Fig. 33D) synes mutantproteinene å være identiske med vill-type proteinet. Antistoffer påviste 12 kDa moden monomer ('c' i Fig. 33B) såvel som 44 til 56 kDa og 30 til 42 kDa for-løperformer ('a' og 'b' i Fig. 33B). I tillegg viser immuno-blottene i Fig. 33D at absolutt mengde av sekrert TGF-el proteiner i det vesentlige ikke var påvirket av mutasjonene. ;Forskjeller mellom mutant- og vill-type TGF-el proteiner var tydelig når de ble undersøkt under ikke-reduserende betingelser (Fig. 33E). Modent TGF-el dimer (24 kDa) ble presentert i alle transfektant-supernatanter. Cellene transfektert med pnH3M/el SER-33 gav derimot som utbytte økede nivåer av 24 kDa dimeren sammenlignet med vill-type transfektantene (Fig. 33E, brønn 3 og 4), mens pnE3M/el SER-33, pnE3M/ei SER-225 og pnE3M/ei SER-223/225 transfektantene produserte nærmest vill-type nivåer. Denne økning i 24 kDa dimer synes ikke å resultere i øket proteinsyntese/sekresjon, eller øket kløyving av moden TGF-el fra pro-TGF-el, siden immunoblotting under reduserende betingelser indikerer at pnH3M/ei og pnE3M/ el SER-33 transfektantene sekrerte tilnærmet like mengder av modne- og forløperformer (Fig. 33D). ;I tillegg dannet TGF-ei<S33> proteinene ikke 90 til 110 kDa forløperkompleks som vill-type proteinene gjorde (Fig. 33E). Isteden kan 130 til 150 kDa og 75 til 85 kDa typer bli sett (Fig. 33E, brønn 4). Som vist i Fig. 33F og Fig. 33G, ble TGF-ei<S33> 130 til 150 kDa proteinene gjenkjent ved både proregion- og moden- spesifikke antistoffer, og representerer mest sannsynlig dimerisk pro-TGF-ei<S33>. 75 til 85 kDa polypeptidet ble bare påvist i pro-region-spesifikt antistoff (Fig. 33G, brønn 4), representerer sannsynligvis en dimer av pro-regionen i TGF-eiS3<3> forløperen. ;I motsetning dannet mutantproteinene kodet av p:nE3M/ei SER-223 og pnE3M/Bl SER-225 og 90 til 110 kDa forløperkomplekser (brønnene 5 og 6 i Fig. 33E, Fig. 33F og Fig. 33G), selv om noen monomeriske forløperformer også var tilstede. Antistoffer som var spesifikke for pro-regionen av TGF-Bl forløperen påviste 44 til 56 kDa og 30 til 42 kDa proteiner (Fig. 33G, brønnene 5 og 6), mens antistoffer som var spesifikke til modne sekvenser påviste bare 44 til 56 kDa typene (Fig. 33F, brønnene 5 og 6). Celler transfektert med pnH3M/el SEE-223/225 gav som utbytte bare monomeriske forløperformer (brønn 7 i Fig. 33E, Fig. 33F og Fig. 33G), ennå moden TGF-Bl ble ennå proteolytisk kløyvet fra pro-TGF-<g>lS223/225 Cg dannet 24 kDa dimeren. ;Oppdagelsen av at eliminering av CYS-33 residie fra TGF-Bl forløperen forbedrer endelig utbytte av sekrert TGF-Bl, kanskje ved å hindre en betydelig populasjon av begynnende TGF-Bl monomerer fra å bli intracellulært begrenset innenfor høymolekylvekts-forløperkomplekser, kan utgjøre en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant bioaktiv TGF—Bl. Videre kan en slik metode ha anvendelse i økning av produksjonen av rekombinant bioaktiv TGF-B2, TGF-B3, andre former for TGF-e, TGF-B analoger eller andre relaterte proteiner. ;10.2.2. TGF- Bl forløper- residier CYS- 223 og CYS- 225 danner ;interk. jede disulfidbindinger ;Renset rTGF-el forløper ble kløyvet ved metionin-residiene med CNBr og de resulterende peptidene ble renset i gelgjennomtrengnings-kromatografi. CYS-inneholdende peptider ble påvist som beskrevet (Sueyoshi et al., 1985, J. Biochem. ;(Tokyo) 97:1811-1813) og renset til homogenitet i revers-fase HPLC. Edman-degraderingsdata lokaliserte delene av CNBr-peptidene i sekvensen til TGF-el forløperen. Peptid M(134-253)2 inneholdt 2 halve cysteinresidier (bestemt ved aminosyre-analyse), men manglet frie sulfhydryl-grupper (bestemt med en fluorescent tiol-spesifikk reagens under ikke-redu- ;serende betingelser). Disulfid-broer i M(134-253)2 ble peket ut ved å demonstrere den dimeriske karakteren til dette peptidet. Som vist i Fig. 33Å ble størrelsen på M(134-253)2 bestemt til 41 kDa under ikke-reduserende betingelser; under reduserende betingelser hadde M(134-253) en molekylvekt på 24 kDa. Endringen i molekylvekten til M(134-253)2 etterfulgt av reduksjon identifiserer to intersubenhet-disulfidbindings-knyttede identiske kjeder, og dette er i overensstemmelse med en enkelt aminosyresekvens for peptid M(134-253)2 og bestem-melsen av 2 halv-cysteinresidier ved aminosyreanalyse. Den observerete heterogeniteten til M(134-253)2 på SDS-polyakryl-amidgelelektroforese (Fig. 33A) kan reflektere glykosylering ved Asn-136 og Asn-176. ;10.2.3. Variant TGF- Bl forløper genererer biologisk aktiv ;TGF- el ;Biologisk aktivitet korresponderer godt med mengden av 24 kDa moden TGF-el påvist ved immunoblotting (Fig. 33E og Fig. 33F). Etterfulgt av syre-aktivering ble supernatanter fra celler transfektert med plasmidene pnH3M/el SER-223, prrH3M/Bl SER-225 og pnH3M/el SER-223/225 og gav som utbytte nær vill-type nivåer av hemmende aktivitet (Tabell XI). I motsetning gav pnH3M/el SER-33 transfektanter tilnærmet 3- til 5-ganger mer aktivitet enn pnE3M/el transfektanter. Disse observa-sjonene var i overensstemmelse blant separat utførte transfeksjoner, med prrH3M/ei SER-33 transfekterte COS-celler som alltid skaper 3- til 5-ganger mer hemmingsaktivitet enn celler transfektert med vill-type plasmid prrH3M/ei. ;10.2.4. TGF- elS223/225 variant gir som utbytte biologisk ;aktiv TGF- el uten forutgående surg. iøring ;rTGF-el syntetisert av COS-celler blir sekrert i en latent form (Tabell XI). På tilsvarende måte blir TGF-el frigjort av plater som et latent høymolekyl-vekts kompleks (Miyazono et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Vakefield et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:7646-7654). ;Aktivering av rTGF-el kan bli oppnådd ved surgjøring. Både TGF-el og TGF-el<S33> var > 90$ biologisk inaktivt forut for surgjøring, mens TGF-el S223 og TGF-el S225 var > 80$ inaktivt. TG-eiS2<23>/225 var derimot minst 70$ aktiv uten syrebehandling og i adskilte eksperimenter, var nivåene med aktivitet før og etter surgjøring ekvivalente, og dette antyder at pro-regionen til TGF-el forløperen er nødvendig for rTGF-el latenthet. Plateavledet TGF-el er nylig vist å være ikke-kovalent assosiert med et kompleks som involverer den andre dimeriske forløper pro-regionen og annen protein (Miyazono et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:6707-6415; Wakefield et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:7646-7654). TGF-31^<223>/225 forløperen eksisterer bare som en monomer (brønn 7 i Fig. 33E, Fig. 33F og Fig. 33G); konformasjonsendringer som resulterer fra substitusjon av både CYS-223 og CYS-225 gjør det ikke mulig for interaksjon mellom moden TGF-el og dens forløper som resulterer i latenthet. 11. Eksempel: Interaksjon av TGF- el forløper med insulin- lignende vekstfaktor/ mannose- 6- fosfat reseptor Eksperimentene beskrevet under demonstrerer at TGF-el forløperen bindes til den insulin-lignende vekstfaktor (IGF)-II/mannose-6-fosfat (man6P) reseptoren. Disse undersøkelsene er støttet delvis av National Institutes of Health Grant DK34926 og bidrag fra Republic Foundation of Science, SR Srbia, Yugoslavia. ;11.1. Materialer og metoder ;11.1.1. Materialer ;Rekombinant IGF-II var en gave fra Dr. M. Smith (Eli Lilly Co.) og ble iodinert (160 Ci/g) som beskrevet (Steele-Perkins et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:11486-11492). Rekombinant TGF-el forløper ble fremstilt og iodinert (190 Ci/g) som beskrevet i henholdsvis Seksjon 8.3. og Seksjon 9.1.3. ovenfor. Renset latent TGF-el ble isolert fra plater (Miyazono et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:6407-6415) og avsaltet på en Superose 6-kolonne. IGF-II/man6P reseptoren og polyklonale antistoffer til dette proteinet var som tidligere beskrevet (Hari et al., 1987, EMBO J. 6:3367-3371). CHO-celler som overuttrykker den humane IGF-II/man6P reseptoren ble fremstilt som beskrevet tidligere for human IGF-I reseptor (Steele-Perkins et al., 1988, J. Biol Chem. 263: 11486-11492). Monoklonale antistoffer til IGF-II/man6P reseptoren (Braukle et al., 1987, J. Cell. Biol. 104:1735-1742) var en gave fra Dr. A. Hasilik (Lniversitat Munster). Et polyklonalt anti-peptid antistoff (til residier 81-94) til forløpersekvensen av TGF-el ble fremstilt som beskrevet i Seksjon 7.1.8. ovenfor. ;11.1.2. Reseptorbinding og internale studier ;Epididymale fettputer fra hannlige Sprague-Dawley rotter (180-220 g) ble skåret ut, kuttet opp og collagenase-spaltet som beskrevet (Rodberg, 1964, J. Biol. Chem. 239:375-380). De isolerte adipocyttene ble forhånds-inkubert med eller uten 1 jjM insulin i 10 min. ved 37°C i 0,7 ml Krebs-Ringer buffer (107 mM NaCl, 5 mM KC1, 3 mM CaCl2, 1 mM MgS04, 7 mM NaHC03, 10 mM glukose og 20 mM Hepes, pH 7,8) med 3$ bovint serum-albumin. Den indikerte merkede liganden ble tilsatt og inkuberingen fortsatt i 45 minutter ved 37°C. Celler ble separert fra mediet ved sentrifugering gjennom silikonolje og radioaktiviteten i cellelaget ble talt. ;Binding og internaliserings-studier med transfekterte og kontroll CHO-celler ble gjennomført i 24-brønners kultur-plater. Sammenflytende celler ble vasket og inkubert i 5 timer ved 4°C med den merkede liganden i 0,3 ml bindings-buffer (100 mM Hepes, pH 7,6, 120 mM NaCl, 1,2 mM MgS04, 15 mM natriumacetat, 5 mM glukose). Cellene ble deretter vasket to ganger, lysert med 0,1$ natriumdocecyl-sulfat og opptalt. For internaliseringsstudiene, ble merket ligand tilsatt til cellene i det serum-frie Ham's F-12 mediet som inneholder 0,1$ bovint serum-albumin og 20 mM Hepes, pH 7,6. Etter de angitte tidsperiodene ved 37° C ble cellene satt på is og vasket med forhåndsavkjølt Hepes-buffer saltoppløsning som inneholder 0,3 mM CaC^- For å bestemme syreresistens-fraksjonen (det vil si den internaliserte liganden), ble cellene inkubert i 5 minutter ved 4°C med 0,2 M CH3COOH, 0,5 M NaCl, pH 3,0 (Haigler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:1239-1240). Cellene ble deretter vasket, oppløst og talt som over. ;Bindingsstudier ble også utført med isolert IGF-II/man6P reseptor (Purchio et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:14211-14215). Til disse studiene ble renset reseptor absorbert til mikrotiter-brønner dekket med 100 nM av et monoklonalt antistoff (2C2) som var spesifikt for human IGF-II/man6P reseptoren (Braukle et al., 1987, J. Cell. Biol. 104:1735-1742). Den merkede rekombinante TGF-Bl forløperen ble deretter inkubert med reseptoren i nærvær av de angitte konsentrasjonene av konkurrerende ligand i 3 timer ved 4"C. Brønnene ble deretter vasket, skåret ut og talt opp. ;11.1.3. Western blot- analvse ;Rekombinant- og platerenset TGF-Bl forløper ble elektro-foresebehandlet på reduserte, natriumdodecylsulfat, polyakrylamid-geler (12,5$). Prøvene ble overført til nitrocellulose-filtre (Schleicher og Schuell) som deretter ble inkubert i en blokkerende oppløsning (3$ bovint serumalbumin og 0,1$ Troton X-100 i Tris-bufferet saltoppløsning, pH 7,5) i 30 minutter ved 24°C. Filtrene ble deretter inkubert over natten ved 4°C med enten: 1) et kanin anti-peptid antistoff til forløpersekvensen av TGF-Bl (fortynnet 1:100) (10); eller 2) renset IGF-II/man6P reseptor, etterfulgt av et polyklonalt antistoff til denne reseptor (Hari et al., 1987, EMBO J. 6:3367:3371). Etter vasking fire ganger ble filtrene inkubert med anti-kanin IgG konjugert til alkalisk fosfatase (1:5.000, Promega) i 1 time ved 4°C, vasket og deretter fremkalt med fosfatase-substratet (Promega). ;11.2. Resultater ;11.2.1. Rekombinant TGF- Bl forløper bindes til IGF- II/ man6p ;reseptorer på adipocvtter og er internalisert Binding av <125>I-IGF-II og rekombinant TGF-Bl forløper til primære rotte-adipocytter ble målt med og uten insulin forbehandling. Som tidligere rapportert (Oka et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:9435-9442; Appell et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:10824-10829), forårsaket insulin en 2- til 3-gangers økning (gjennomsnitt =2,4 ± 0,3, n=4) i spesifikk binding av IGF-II til adipocytter (Fig. 35A). Som vist i Fig. 35B, forårsaket insulin en tilsvarende økning i binding av rekombinant TGF-Bl forløper til adipocyttene (gjennomsnitt = 2,7 ± 0,3, n = 4). Binding av TGF-Bl forløper til kontroll og insulin-behandlede adipocytter ble hemmet henholdsvis 65$ og ;81$, ved 3 mM man6P (Fig. 35B). Disse resultatene indikerer at den rekombinante TGF-el forløperen var binding til IGF-II /man6P reseptoren på adipocytter. ;Ytterligere bindingsstudier ble gjennomført med en linje av CHO-celler som ble transfektert med en cDNA som koder for IGF-II/man6P reseptoren (Morgan et al., 1987, Nature 329:301-307) og selektert for overuttrykking av reseptor-proteinet. Disse transfekterte cellene binder spesifikt ca. 10 ganger mer IGF-II (Fig. 36A) såvel som ca. 15 ganger mer rekombinant TGF-el forløper enn de parenterale CHO-cellene; TGF-el forløper-binding var i det vesentlige hemmet av man6P (Fig. 36B). Hemming av man6P var dose-avhengig og halv-maksimal hemming ble observert ved 10 jjM (Fig. 37A). Mannose-l-fosfat var minst 1.000 ganger mindre effektiv ved hemmings-binding av TGF-el forløperen (Fig. 37A). Bindingen av forløperen til transfekterte celler ble også hemmet av umerket TGF-el forløper men ikke av moden TGF-el (Fig. 37B). Ett hundre nM IGF-II hemmet binding av forløper TGF-el med 34$. ;Bundet TGF-el forløper ble også undersøkt for sin evne til å bli internalisert i de transfekterte cellene. Etter forskjellige tidsperioder ved 37°C, ble celleoverflaten til TGF-ei forløper fjernet med en syrevask og cellene og den syre-resistente (dvs. internaliserte) (Hagler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:1239-1241) TGF-el forløperen målt. Etter 15 min. ble > 75$ av den spesifikt bundne TGF-el forløperen funnet å være i en syreresistent avdeling (Fig. 38). En ytterligere økning i totale og internaliserte tellinger ble observert etter 20 minutter, og fremkommer som et resultat av en uspesifikk bindingsvei siden man6P ikke blokkerte økningen (Fig. 38). ;11.2.2. Tilstedeværelse av mannose- 6- fosfat på lantent TGF- el For å bestemme om latent TGF-el isolert fra plater også inneholder man6P, ble høyt renset plate TGF-el forløper undersøkt for sin evne til å hemme binding av merket re- ;kombinant TGF-el forløper til isolert IGF-II/man6P reseptor. Det latente plate TGFel komplekset ble funnet å være en aktiv hemmer av denne binding, med halv-maksimal hemming som forekommer ved tilnærmet 0,2 nM (Fig. 39). ;For ytterligere å undersøke plate TGF-el komplekset for tilstedeværelse av man6P, ble dette materiale elektroforese-behandlet på en redusert polyakrylamid SDS-gel, overført til en nitrocellulose-membran, og etterfølgende inkubert med renset IGF-II/man6P reseptor, kanin-antistoffer til reseptoren, alkalisk fosfat-konjugert anti-kanin lg og en histokjemisk farge for alkalisk fosfatase. Selv om denne teknikken kan påvise man6P på ukløyvet rekombinant TGF-el forløper (Fig. 40, bånd a) og forløperrest (Fig. 40, bånd b), ble bånd med hensiktsmessig molekylvekt ikke påvist med plate TGF-el. I kontrollforsøkene, kunne et antistoff spesifikt til sekvensen av TGF-el forløperen påvise plate TGF-el forløper-rest (Fig. 40, bånd c). ;12. Eksempel: Analyser av funksjonell rolle til karbohydrat på TGF- el forløper ;Studiene undersøker viktigheten av karbohydrat-epitopene til pre-pro-TGF-el i prosessering av moden TGF-el. Resultatene demonstrerer at oligosakkarid-tilsetting og remodelering spiller en vesentlig rolle i prosessen med TGF-el sekresjon men spiller ingen rolle i spesifikk proteolyse av pre-pro-TGF-el, og videre at proteolytisk prosessering av TGF-el forløper foregår intracellulært i sure vesikler. ;12.1. Materialer og metoder ;12.1.1. Materialer ;Glykosylerings-hemmere swainsonin (SW), tunicamycin (TU), castanospermin (CA), 1-deoksymannojirimycin (dMM) og 1-deoksynojirimycin (dN) såvel som glykosyleringstrimmings-enzymene endoglykosidase H (endo H) og neuraminidase ble kjøpt fra Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN. N-glykanase ble kjøpt gjennom Genzyme, Boston, MA. Kloroquin-difosfat, monensin og dietylaminoetyl-dekstran (DEAE-dekstran, 500.000 MW) ble kjøpt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Nuserum ble oppnådd fra Collaborative Research, Lexington, MA. Alle andre cellekultur-reagenser ble kjøpt fra Gibco Laboratories, Grand Island, NY. [35-S]-L-cystein og [35-S]-L-metionin ble skaffet fra NEN Research Products, Boston, MA og utviste spesifikke aktiviteter henholdsvis > 600 og > 800 Ci/mM. [32-P]-ortof osf at (baerer-fri) ble oppnådd fra ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA. Restriksjons- og andre DNA-modifiserende enzymer ble oppnådd fra Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD. ;12.1.2. Cellekultur ;CE0-TGF-B3-2.000 celler (klon 17) ble dyrket og passert som beskrevet i Seksjon 7.1.1. ovenfor. Cos-1 celler (ATCC CRL 1650) ble dyrket i Dulbecco modifisert eagle's medium (DMEM) tilsatt 10$ fetalt bovint serum, 100 U/ml penicillin og 100 pg/ml streptomycin og passert ved trypsinering. ;12.1.3. Metabolsk merking og analyse av sekrert TGF- el TGF-e3-2.000 celler ble dyrket til sammenflytning på 35 mm skåler som inneholdt 2 ml fullstendig medium. Mediet ble erstattet med medie som mangler metionin, cystein og serum og inkubert i 1 time. Cellene ble deretter merket i 0,5 time med [35-S]-metionin og [35-S]-cystein, hver ved 100 pCi/ml. Etter merking ble cellene vasket tre ganger i Hanks balanserte saltoppløsning og behandlet i fullstendig, serum-fritt DMEM. Glykosylerings-hemmere, svake baser eller ionoforer var tilstede i vevskultur-mediet i alle de ovenfornevnte inkuberingene. Supernatanter ble direkte analysert i SDS-PAGE etter koking i SDS-PAGE prøvefremstillings-buffer. Gradient-geler fra 7,5-20$ akrylamid ble utnyttet. ;Til [32-P]-fosfat-merking, ble celler inkubert i 35 mm skåler som inneholder 1 ml fosfat og serum-fri DMEM i 1 time. Cellene ble merket med 1 mCi pr. ml [32-P]-ortof osf at i 6 timer. Det celle-frie mediet ble oppsamlet og overskudd [32-P]-fosfat ble fjernet ved avsalting på en 10 ml kolonne Sephadex G-25 ekvilibrert med 50 mM ammonium-bikarbonat. De første tre 0,75 ml fraksjonene som inneholder radioaktivitet ble samlet sammen og lyofilisert, og den lyofiliserte pelletten ble oppløst i 100 pl prøvefremstillings-buffer og 10 pl analysert i SDS-PAGE og autoradiografi. ;12.1.4. Kvantitering av TGF- el med SDS- PAGE ;Mengden TGF-el i kultur-supernatantene ble målt fra SDS-polyakrylamidgeler ved densiometri etter at gelene var flurografert. I de fleste tilfellene var forholdet mellom moden TGF-el til mengden forløperformer uforanderlig. Således var mengden av moden 12 kDal TGF-el som ble observert utnyttet som et mål på den totale vekstfaktoren som ble sekrert. ;For å måle variasjoner i mengden prosessering, ble det totale nivå av TGF-el sekrert bestemt etter densitometri med oppsummering av alle tre formene med rekombinant vekstfaktor og normalisering av nivået av sekresjon mellom de forskjellige behandlede cellene. Den relative mengden av moden, 12 kDal TGF-el ble deretter beregnet for å indikere nivået med proteolytisk prosessering. ;12.1.5. Spalting med glykosylerings- trimroende enzymer Kondisjonert kulturmedium merket med [35-S]-cystein og ;—metionin ble behandlet med glykosyleringstrimmende enzymer. Kulturmedie (23 pl) ble behandlet med 5 m"U av endo H eller 25 mU av neurominidase ved 37°C over natten. Spalting med N-glykanase ble utført ved 30° C over natten ved å anvende 1,25 TJ av enzym. I alle tilfellene var det samlede reaksjons-volum 35 pl. Reaks j onsbuf f ere for endo H og neuraminidase bestod av 25 mM Tris-ECl, 0,2$ SDS (v/v) ved pH 5,7 og 50 mM natriumacetat, 2 mM kalsiumklorid og 0,2 mM EDTA ved pH 4,6, henholdsvis. N-glykanase-spalting ble utført i en slutt-buffer-sammensetning på 10 mM EDTA, 0,2$ SDS (v/v), 0,1 M 2-merkaptoetanol og 1$ nonidet-P40 (v/v) ved pH 7,5. Etter ;spalting ble prøvene blandet med et likt volum 2x-SDS prøvefremstillings-buffer og en 16 pl prøve analysert på SDS-PAGE. ;12.1.6. Spalting av SacII- deles. ionsmutant av TGF- el og ;innsetting i CDM8 vektor ;TGF-el cDNA subklonet inn i pUC19 ble utnyttet til delesjons-mutagenese. Plasmid DNA ble spaltet med SacII og ligert på nytt og dette muliggjorde fjerning av 480 nukleotider fra den kodende regionen av TGF-el cDNA og frembragte en delesjon i den åpne leserammen. Det resulterende plasmidet ble spaltet med EcoRI reparert til butte ender med Klenow-fragment av DNA-polymerase I og etterfølgende spaltet med Hindlll. Dette fragment ble innsatt i CDM8-ekspresjonsplasmidet. ;CDM8-ekspresjonsplasmid DNA (Seed, 1987, Nature 329:840-842) ble spaltet med Noti og reparert til butte ender med Klenow-enzym. DNA ble etterfølgende spaltet med Hindlll og isolert fra en agarosegel ved å anvende Geneclean. HindiII-EcoRI (butt)-fragmentet av vill-type TGF-el cDNA og av SacII-delesjonsmutant ble deretter ligert inn i HindiII- NotI (butt) CDM8-vektoren. CsCl-renset DNA ble anvendt for ekspresjons-studier . ;12.1.7. Transient ekspresjon i COS- celler ;Forbigående ekspresjon i Cos-1 celler ble utført med en DEAE-dekstran-kloroquin transfeksjonsprotokoll som beskrevet (Cullen, 1987, Meth. Enzymol. 152:684-704). I korthet ^blir semi-sammenflytende kulturer med Cos-1 celler dyrket på 35 mm skåler og inkubert i DMEM som inneholder 10$ Nuserum 1-2 timer før tilsetning av DNA. Tranfeksjons-blandingen ble fremstilt ved langsom tilsetning av CsCl-renset DNA til en steril oppløsning med 10 mg/ml DEAE-dekstran for å gi en sluttkonsentrasjon på 0,2 mg/ml DNA. DEAE-dekstran/DNA-blanding (100 pl) ble deretter tilsatt til cellene til sluttkonsentrasjon på 10 pg/ml DNA. Kloroquin til slutt-konsentras j on på 100 pg/ml ble deretter tilsatt og fikk anledning til å inkubere med cellene ved 37° C i 3 timer. DNA/DEAE-dekstran/kloroquin som inneholdt medium ble deretter fjernet og cellene behandlet med 2 ml 10$ dimetylsulfoksid (v/v) i fosfat-bufferet saltoppløsning. Etter 2 minutter ved romtemperatur, ble cellene vasket to ganger i fosfat-bufferet saltoppløsning og dyrket i fullstendig DMEM i 48 timer. ;Til immunoblot-analyse av uttrykt TGF-el, ble serum-fritt kulturmedium deretter tilsatt til cellene, oppsamlet i 48 timer og dialysert mot 0,4$ eddiksyre. Det dialyserte medium ble lyofilisert, oppløst i 30 pl prøvefremstillings-buffer og 5 pl analysert ved immunoblot-analyse. De transfekterte cellene ble også analysert ved immunoblotting. Etterfulgt av oppsamling av det serum-frie medium, ble cellene høstet med avskrapning og et volum SDS-prøve fremstillingsbuffer ble tilsatt pr. volum av pakkede celler. Etter koking i 5 minutter, ble 2 pl av cellulært lysat analysert ved immunoblotting. ;12.2. Resultater ;12.2.1. Tunicamycin hemmer " sekresjon av rekombinant TGF- el ;fra transfekterte CHO- celler ;I foreløpige eksperimenter som var beregnet for å finne den funksjonelle rollen til glykosylerings-prosessering for transport og sekresjon av pre-pro-TGF-el, ble transfekterte CHO-celler behandlet med tunicamycin (TU), et nukleosid-antibiotika som forhindrer oligosakkarid-tilsetning av den begynnende polypeptid-kjeden (Tacz og Lampen, 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 65:248-257), og analyserte det kondisjonerte medium og celler for uttrykt TGF-el. Fig. 41 viser resultatene som ble oppnådd ved å anvende immunoblotting for å påvise TGF-el proteiner i kulturmediet eller cellene. Medie fra kontrollceller fraksjonert på SDS-geler under reduserende betingelser viste eksistens av tre former rekombinant TGF-el (se Seksjon 7, og følgende). 44-56 Kdal polypeptidet representerer pro-TGF-ei ("a" i Fig. 41 ), 30-42 Kdal proteinene korresponderer til pro-regionen av forløperen ("b" i Fig. 41) og 12 kDal-formen representerer moden, riktig prosessert TGF-el ("c" i Fig. 41). CHO-celler "behandlet med tunicamycin over en 24 timers periode, synes derimot ikke å frigjøre påvisbare nivåer av immunoreaktiv TGF-el. ;Den hoved-intracellulaere formen av TGF-el i reguleringsceller synes å bevege seg til en posisjon som tilsvarer delvis glykosylert vekstfaktor. Meget lave nivåer av prosessert TGF—31 polypeptider var også påvisbare innenfor cellene bare når økte mengder av celle-lysat ble anvendt til immuno-blottene. Etter TU-behandling var den hoved-intracellulære formen av ' TGF-el polypeptid som ble observert korresponderende i størrelse til ikke-glykosylert forløper. Dette nivå av denne TGF-el forløperen var i høyere overensstemmelse i TU-behandlede celler sammenlignet med kontrollceller, og mest sannsynlig indikerer det en oppsamling av denne form innenfor behandlede celler. Disse resultatene antyder sterkt at glykosylering er viktig for sekretorisk utgang, og uten den kan det føre til oppbygning av rekombinant TGF-el innenfor cellene. ;12.2.2. Tidsforløp for CHO- transfektant- sekres. ion av TGF- el Hastigheten og graden av sekresjon av rekombinant TGF-el ble målt fra transfekterte CHO-cellekulturer ved puls-merking med [35-S]-metionin og -cystein og ble fulgt over variable tidsperioder. Kulturmediet ble oppsamlet og fraksjonert med SDS-PAGE etterfulgt av fluorografi. Resultatene er vist i ;Fig. 42A. De tre rekombinante formene av TGF-el fremkom gradvis i det kondisjonerte medium og sekresjonshastigheten avtok deretter i løpet av eksperimentet. Forholdet mellom mengden moden TGF-el og den til forløperformene synes ikke å variere og dette antyder at proteolytisk prosessering er fullstendig ved sekresjon og foregår mest sannsynlig intracellulært . Fig. 42B viser en kvantitativ bestemmelse av sekresjon av TGF-el som korresponderer til tre uavhengige puls-følge eksperimenter bestemt ved scanning fluorografi. Etter en forsinkelsestid for sekresjon på tilnærmet 1,5 time, ble TGF-el polypeptidene sekrert raskt av CHO-cellene og etter 6 timer ble mer enn 50$ av det sekrerte rekombinante proteinet påvisbart. Forsinkelsestiden på 1,5 time er noe lenger enn det som rapportert for forsinkelsestiden til sekresjon av andre polypeptider, en forskjell som kan reflektere variasjoner i prosesserings-hastighetene til glykoproteinene eller en celletype-avhengighet (Bauer et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 128:368-275; Leford og Davis, 1982, J. Biol. Chem. 258:3304-3308; Lodish et al., 1984, J. Cell. Biol. 98:1720-1729). Etter 20 timers følge begynte sekresjonsnivået av rekombinant materiale som påvist i CHO-kondisjonert medium å flate ut. Et 6 timers tidspunkt ble valgt for ytterligere studier på grunn av at større enn 50$ av det rekombinante materialet hadde blitt sekrert ved den tiden (Fig. 42). 12.2.3. Hemmere av glykosylering eller glykosylerings- prosessering som påvirker nivået med sekrert rTGF- el For ytterligere å klargjøre rollen med glykosylering på prosessering og sekresjon av TGF-el ved CHO-celler, ble transfekterte celler behandlet med flere glykosylerings-hemmere og deres effekt på sekresjon av rekombinant vekst-faktor undersøkt. I tillegg til tunicamycin, ble fire hemmere som påvirker terminal prosessering av vekst-oligosakkarid-sidekjedene utnyttet. Castanospermin (CA) og deoksynojiri-mycin (dN) forstyrrer med begynnende trimming av glukose-residiene inne i det endoplasmatiske retikulum etter tilsetning av kjerne-oligosakkarid (Heltkamp et al., 1982, Biosci. Rep. 2:899-906; Saunier et al., J. Biol. Chem. 257:14155-14161; Schwartz og Datema, 1984, Trends Biochem. Sei. 9:32-34). Swainsonin (SW) og deoksymannojirimycin (dMM) på den annen side hemmer henholdsvis mannosidase I og II i golgi (Elbein et al., 1984, Arch. Biochem. Biophys. 235:579-588; Tulsiani et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:7936-7939). Et fluorogram av kondisjonert medium fra TGF-el som uttrykker CHO-celler behandlet med hemmere er vist i Fig. 43A. CHO-cellene ble forbehandlet med hemmere i 1 time og deretter pulsmerket og forfulgt. I overensstemmelse med resultatene i Fig. 41, reduserte TU drastisk sekresjon av TGF-el. Hemming av glukosidase-aktivitet i det endoplasmatiske retikulum ved CA og dN reduserte også sekresjonen markert. Celler behandlet med dMM eller SW, hemmere av mannosidase-aktivitet i golgi, økte svakt sekresjonen. Fig. 43B viser en oppsummering av disse resultatene fra tre uavhengige eksperiment. Sekresjonsnivået i nærvær av TU, CA og dN var mellom 5-15$ av nivåene observert i kontroll-cellene. SW og dMM resulterte i økede nivåer av sekrerte, rekombinante proteiner med økning på nesten 30$. Tidsforløps-eksperimenter antyder en tilsvarende sekresjonshastighet sammenlignet med kontrollceller og dette indikerer en generell økning eller nedgang i sekresjon heller enn en endring i hastighet. I tillegg synes spesifikk proteolytisk prosessering av TGF-el ikke å bli endret etter hemmingsbehandling. I alle tilfellene var et tilsvarende forhold med pro-TGF-el ("a" i Fig. 43A) til prosesserte former av TGF-el ("b" og "c" i Fig. 43A) tydelig til og med i fravær av karbohydrat ("TU" i Fig. 43A). Disse resultatene indikerer at fullstendig remodelering av TGF-el oligosakkarid-sidekjedene ikke er nødvendige for sekretorisk utgang så lenge som begynnende trimming av glukose-residier er opprettholdt og at oligosakkarid-integriteten ikke er viktig for proteolytisk prosessering av pre-pro-TGF-el. ;12.2.4. Struktur av TGF- el oligosakkarid- sidek. ieder Naturen av karbohydrat-gruppene som er tilstede på TGF-el polypeptider sekrert av hemmings-behandlede CHO-celler ble undersøkt. Kondisjonert medium fra pulsmerkede CHO-celler med og uten hemmere ble oppsamlet og behandlet med N-glykanase, endo H og neuraminidase. Resultatene er vist i Fig. 44. N-glykanase som fjerner alle N-knyttede sukkere, resulterte i ;TGF-Bl forløper-polypeptider "a" og "b" som beveget seg sammen på reduserende SDS-geler uavhengig av hemmingsbehandling. Som forventet var kontrollbehandlede celler i det vesentlige usensitive til endo E, en glykosidase som fjerner høy mannose-type oligosakkarid-kjeder, og det bekrefter den foreslåtte komplekse karbohydrat-strukturen. Endo E-behandling av supernatanter fra hemmingsbehandlede CEO-celler, indikerte derimot fullstendig fjerning av TGF-Bl forløper-sidekjeder i det tilfellet med dMM og bare delvis følsomhet til denne glykosidase som resulterer fra behandling med CA, dN og SW. Neuraminidase-behandling la for dagen at dMM, CA og dN inneholdt tilsynelatende ingen sialylerte residier. Behandling med SW antyder derimot at TGF-Bl forløper-polypeptider frigjort under disse betingelsene inneholdt en vesentlig sialinsyre-komponent i deres oligosakkarid-side-kjeder. ;12.2.5. Mannose- 6- fosforylering av TGF- Bl forløper polypeptider frig. iort fra hemmingsbehandlede CEO- celler TGF-Bl forløper blir raskt merket med [32-P]-ortofosfat og denne inkorporering skyldes fosforylering av mannose-residiene og gav mannose-6-fosfat; fosforylering foregår i de første to karbohydrat-sidekjedene av vekstfaktor-forløperen (Seksjon 9., ovenfor). Siden modifikasjon av glykosylerings-veien ved hemmingsbehandling kan påvirke mannose-6-fosforylering av forløperen, ble celler merket med [32-P]-ortofosfat og evnen til TGF-Bl forløper-polypeptider til å bli merket ble undersøkt (Fig. 45). Betydelig fosforylering var tydelig i TGF-Bl forløpere fra SW og dMM behandlede celler. Effektene av CA og dN var mye mindre tydelig på grunn av redusert sekresjon av TGF-Bl polypeptider. Lengre eksponering viser derimot at [32-P]-merking hadde foregått i proteinene som beveget seg sammen med forløperne. Således syntes hemmingsbehandling av CEO-celler ikke å påvirke fosforylering av TGF-Bl polypeptider på mannose-6-fosfat. ;12.2.6. Deles. ions- mutagenese studier ;For å frembringe ytterligere bevis vedrørende rollen til glykosylering på sekresjon av rekombinant TGF-el proteiner, ble en stor del av et f orløpermolekyl utelatt, og dette resulterte i en i-leseramme delesjonsmutant som mangler alle tre glykosyleringssetene. Fig. 46A illustrerer fremgangsmåten som ble utnyttet for å lage delesjonen. Spalting av DNA med SacII og ligering på nytt muliggjorde fjerning av 160 aminosyrer innenfor pro-regionen til TGF-el. Ligering på nytt foregikk mellom Arg-50 og Gly-211 og er referert til som A51-210 TGF-el. Delesjonsmutanten ble deretter plassert på ekspresjonsplasmidet CDM8 (Seed, 1987, Nature 329:840-842) nedstrøms til CMV-promoteren som illustrert (Fig. 46A). ;Mutant-DNA ble transfektert inn i COS-1 celler ved å anvende et forbigående ekspresjonssystem, og nivået med TGF-el sekresjon undersøkt i immunoblotting (Fig. 46B). Ekspresjonsvektoren som inneholder vill-type TGF-el ble uttrykt i COS-1 celler og ledet til sekresjonen av alle tre former med rekombinant vekstfaktor polypeptider (brønn 2 i Fig. 46B). En kontroll som viste at disse formene også er inkludert på immunoblottet (brønn 3 i Fig. 46B). I motsetning var ingen påvisbare nivåer av TGF-el observert i supernatantene til COS—1 celler transfektert med delesjonsmutanten. I kontrollceller, var en liten mengde TGF-el forløper observert intracellulært; disse resultatene var tilsvarende de oppnådd fra et tidligere eksperiment (Fig. 41). For A51-210 TGF-el transfektanter ble et immunoreaktivt protein på ca. 20 kDal som korresponderer i størrelse til det foreslått for delesjonsmutanten, uttrykt intracellulært i disse transfekterte COS-1 cellene. Resultatene over indikerer at A51-210 TGF-el ikke ble effektivt sekrert av cellene og akkumulerte intracellulært. Selv om en heller større porsjon av TGF-el forløperen ble fjernet ved delesjon, er mangel på TGF-el sekresjon i overensstemmelse med hemmingsresultåtene og medfører en viktig intracellulær målrettings-rolle for karbohydrat-epitopene til TGF-el forløperen. ;12.2.7. Intracellulær proteolytisk prosessering innenfor sure ;vesikler ;Proteolytisk prosessering av TGF-el forløperen ved basiske residier for å gi moden TGF-el foregår mest sannsynlig innenfor cellene. For å undersøke naturen til proteasen som er involvert i TGF-el prosessering, ble transfekterte CHO-celler behandlet med svake baser eller en monovalent ionosfor. Begge reagensene økte den intra-vesikulære pH fra sitt sure miljø til et nærmere nøytralitet og enten påvirket transportprosessen eller proteolytisk prosessering (Devault, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:5146-5151; Mellman, et al., 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:663-700; Poole, et al., 1981, J. Cell. Biol. 90:665-690; Tartakoff og Vassalli, 1977, J. Exp. Med. 146:1332-1345; Tartakoff og Vassalli, 1978, J. Cell. Biol. 79:284-299). Transfekterte CEO-celler ble behandlet med disse reagensene i 1 time før pulsmerking og fulgt i fullstendig serum-fritt medium som inneholder disse reagensene i 6 timer. Kondisjonert medium ble deretter analysert på SDS-PAGE; de korresponderende fluorogrammene er vist i Fig. 47A. De svake basene ammoniumklorid og kloroquin såvel som ionosfor-monensin reduserte stort graden av proteolytisk prosessering som ble observert for TGF-el forløper. Det samlede sekresjonsnivået til TGF-el molekylene, var på den andre side enten upåvirket eller svakt påvirket av disse reagensene. Det er interessant at karboksyl-ionosformonensin har vist å stoppe sekresjon av immuno-globuliner ved plasma-celler. (Tartakoff og Vassalli, 1977, J. Exp. Med. 146:1332-1345; Tarkokoff og Vassalli, 1978, J. Cell. Biol. 79:284-299 ). ;En oppsummering av tre uavhengige eksperimenter for å mengdebestemme disse effektene er illustrert i Fig. 47B. Siden en svak effekt på sekresjon ble notert, ble total-nivåene normalisert av rekombinant TGF-el frigjort fra CEO-celler ved summering av samlet TGF-el observert i pulsfølge-eksperimentene ved å anvende densitometer-scan av SDS-gelfluorogram. Etter normalisering, ble mengden av moden TGF—el sekrert bestemt, og det indikerer nivået av proteolytisk prosessering. Ammoniumklorid frembragte den svakeste effekten på konsentrasjonen som ble anvendt i disse eksperimentene, og viser en kløyvingseffektivitet på ca. 70$ av kontrollverdiene. Kloroquin og monensin på den annen side, reduserte drastisk prosessering til nivåer som nærmet seg 20$ av kontroller. Disse resultatene indikerer sterkt at proteolytisk kløyving av forløper for å gi moden TGF-el foregår med en protease som har et surt pH-optimum. ;Andre rapporter har indikert at reagensene over kan påvirke glykosylering (Mellman, et al., 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:663-700; Tartakoff og Vassalli, 1977, J. Exp. Med. 146:1332-1345; Tartakoff og Vassalli, J. Cell. Biol. 79:284-299; Thorens, et al., 1986, Nature 321:618-620). Fig. 47A indikerer faktisk at monensin og kloroquin kan endre strukturen av oligosakkarid-sidekjedene siden proteinene vandrer forskjellig på SDS-gelene. For å undersøke dette ytterligere ble glykosidaser benyttet for å analysere karbohydrat-strukturen til de sekrerte TGF-el forløperne (Fig. 48). I alle tilfellene var resultatene tilsvarende; de behandlede prøvene viste samme sensitivitet til N-glykanase, endo E og neuraminidase som det kontrollbehandlede materiale. Etter neuraminidase-spalting, vandret TGF-el forløperproteinene identisk. Således var de elektroforetiske vandingsendringene indusert av monensin og kloroquin på TGF-el forløperen, mest sannsynlig forårsaket av endringer i graden med sialylering. Dette resultatet er i overensstemmelse med andre rapporter som har notert endringer i terminal glykosylering etter behandling med disse midlene (Tartakoff og Vassalli, 1977, J. Exp. Med. 146:1332-1345; Tartakoff og Vassalli, 1978, J. Cell. Biol. 79:284-299; Thorens, et al., 1986, Nature 321:618-620). I tillegg inkorporerte monensin-behandlede kulturer fremdeles [32-P]-ortofosfat inn i forløpermolekylet, og det indikerer at intravesikulær pB ikke påvirker fosforylering ved mannose-residier. Det er usannsynlig at den lette endringen i karbohydrat-strukturen som var observert etter monensin- og kloroquin-behandling kan påvirke proteolytisk prosessering siden glykosidase-trimmingshemmere, som drastisk endrer karbohydrat-sidekjedestrukturen, ikke resulterte i noen noterbar effekt på proteolytisk prosessert TGF-el proteiner. ;13. Eksempel: Gamma interferon- indusert aktivering av ;latent TGF- e med humane makrofager ;13.1. Materialer og Metoder ;13.1.1. Rensing av latent TGF- e ;CHO-cellekulturer som uttrykker latent rTGF-el (LnTGF-ei) ;(1,4 mg/l) ble dyrket i lav serum (0,2$) og supernatanter ble høstet 24 timer etter utsåing. Supernatanter ble klargjort i lavhastighets-sentrifugering og proteiner utfelt med ammoniumsulfat (80$ metting ved pB 7,2). Presipitatet ble suspendert på nytt i kald fosfatbufferet saltoppløsning (PBS) og omfattende dialysert ved 4°C i 2 dager. En prøve som inneholder 6,2 mg protein ble påsatt en P-100 kolonne ekvilibrert i PBS 100-200 MESH (BioRad). Inaktivt LnTGF-el ble oppløst på nytt fra restaktiv TGF-e på denne kolonnen og ble lokalisert ved visualisering av sølvfarget SDS-PAGE geler (Blobel og Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol. 67:835-851; Morrissey, 1981, Analyt. Biochem. 117:307-310) og etterfølgende syre-aktivering som påvist i CCL-64 minklunge-epitelcellevekst hemmingsanalyse (GIA) (Seksjon 7.1.6. ovenfor). ;I korthet ble celler dyrket på 96-brønners vevkultur-plater (Falcon 3072) ved en konsentrasjon på 3 x IO<3> celler pr. pl av DMEM som inneholder 10$ fetalt kalveserum. TGF-e standard-tester var i 0,2 M eddiksyre og ble lyofilisert i sterile 12 x 75 mm rør (Falcon 2063). Lyofiliserte prøver ble suspendert på nytt i DMEM med 10$ fetalt kalveserum, og ble tilsatt i 50 pl for å teste brønnene i tre paralleller 5 timer etter plettering (ikke-surgjorte prøver ble undersøkt uten forutgående behandling). Etter inkubering ved 37"C i en fuktig 5$ C02-95$ luftatmosfære i 72 timer, ble [125I]IdL"dr (Amersham IM 355 ) tilsatt i 50 pl av mediet (1 pCi/ml). Cellene ble inkubert ytterligere 24 timer og ble deretter vasket 1 x med PBS, fiksert i 10 min. i 200 pl metanol, og lufttørket i 15 min. Cellene ble oppløst i 200 pl med 1 M NaOH i 20 min. ved 65° C og merket materiale oppsamlet ved å anvende Titertek Supernatant Collection System (Flow Laboratories, 78-210-05). Hemmings-stimulering av vekst ble uttrykt som prosent nedgang eller økning av [^<25>I]IdUdr inkorporert av behandlede celler når de var sammenlignet med inkorporering av ubehandlede celler. ;13.1.2. Aktivering av latent TGF- el analyse ;Monocytter ble fremstilt fra fraksjonert friskt humant blod, aktivert og utsådd (2 x IO<6> celler/ml) i Dulbecco's Modified Eagles medium (DMEM). Kulturer ble inkubert ved 37° C i 24 timer i nærvær eller fravær av renset 5 pg/ml LnTGF-ei og/eller rekombinant gamma interferon (r^INF), 100 U/ml (AMGEN). Supernatanter ble høstet, klargjort med lavhastighets-sentrifugering og frosset på tørris før testing av seriefortynninger i tre paralleller i veksthemmings-analysen (GIA). Verdiene for TGF-e ble bestemt ved å utnytte en standard GIA-kurve som ble laget med renset plate TGF-e. ;13.2. Resultater ;Tabell XII viser at TGF-e forløper renset ved nøytral pH utviser minimal bioaktivitet (til og med ved konsentrasjoner på 1 pg/ml). Forbigående forbehandling med eddiksyre, gjorde det derimot mulig å aktivere tilnærmet 7,5$ av forløperen på vektbasis, dvs. 250 ng av surgjort forløper som gav 18,7 ng med aktiv TGF-e. På molar basis korresponderer dette til en 40$ aktivering. SDS-PAGE analyse demonstrerer at det syre-aktiverte molekylet har en masse som er identisk med nativt TGF-e (24 kd) og primærsekvens-studier indikerer at resterende ikke-aktivert TGF-e forløperkompleks er et resultat av uekte disulfidbindings-dannelse mellom cystein-residiene i forløperen og den modne TGF-e homodimeren (Marquardt et al.). Ved å anvende dette rensede polyproteinet som en kilde for moden eksogen TGF-el forløper, ble evnen undersøkt hos forskjellige dyrkede celler til å aktivere og frigjøre TGF-e i kultursupernatanter. Ingen aktivering hie observert med flere etablerte lymfocyttiske cellelinjer inkludert HUT-78, CEM og den monocytt-avledede linjen U937. På tilsvarende måte viste friskt dyrkede humane B- og T-celler minimal aktivering, hvis noen. ;Resultatene presentert i Tabell XIII indikerer at humane monocytter dyrket i nærvær av 100 jj/ml r*y-INF og 5 pg LnTGF-ei har evne til å aktivere latent TGF-el. Humane perifere blodmonocytter frigjør minimale mengder av aktiv TGF—e (< 0,1 pM/ml av kultursupernatanter). Inkubering av monocytter med 5 pg LnTGF-el i 24 timer, resulterte i noe basal aktivering (tilnærmet 0,1 pM/ml pr. lx IO<7> celler). Monocytter dyrket i nærvær av 100 V/ ml med r^-INF og 5 pg LnTGF-el resulterte derimot i en markert økning i mengden aktivt TGF-e påvist i supernatanter. Graden av aktivering var i det vesentlige 2,1-2,5 pM TGF-el/ml, som er ekvivalent med ca. halvparten av det som ble oppnådd med syrebehandling alene (cytokin/syreaktive-ringsforhold på 0,42 og 0,50, henholdsvis eksperiment 1 og 2). Kontrollkulturer av monocytter behandlet med r-y-INF alene resulterte ikke i noen betydelig aktivering (0,2-0,4 pM/ml) av endogen latent TGF—e som betyr at den er frigitt fra noen dyrkede monocytter (Assoian et al., 1987, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:6020-6024). Mengden av aktivering var proporsjonal til mengden av LnTGF-el substrat tilsatt og metting ble oppnådd ved 10 pg/ml substrat ved å anvende IO<7> monocytter og 100 p/ml r^-INF. Aktiverings-kinetikk demonstrerte maksimal prosessering og frigjøring av TGF-e 7-8 timer etter inkubering av LnTGF-e med r-y-INF, og dette indikerer at prosessering kan kreve "y-INF-indusert gentranskripsjon, kanskje involvering av transkripsjon av et prosesserings-enzym-gen(er).

Som vist i Fig. 49 var aktivering av LnTGF-el med monocytter avhengig av dosen med 7-INF som ble anvendt. En målbar respons ble sett med så lite som 10 enheter/ml med r-y-INF (10 ng/ml TGF-e påvist med GIA). Tidligere eksperimenter (Tabell XIII) ble utført på en dosering med 100 U/ml 7-INF (20 ng/ml TGF-e frigitt) med en maksimal mettingsverdi som oppnådde 1.000 U/ml r-y-INF. I separate eksperimenter hadde rekombinant IL-2 evne til å stimulere friske humane T-celler til å prosessere LnTGF-el, men responsen var svak relativt til den som ble observert med r-y-INF-behandlede monocytter (0,5 p mol/TGF-e/2 x IO<6> celler/enhet med rIL-2).

Flere eksperimenter ble utført for å bestemme om LnTGF-ei-avhengig TGF-e veksthemmings-aktivitet målt fra r^-INF-behandlede monocytt-kulturer var virkelig TGF-e aktivitet. TGF-e ble opprinnelig isolert fordi den stimulerte normale rottenyre-celler (NRK) til vekst som kolonier i myk agar i nærvær av lave mengder med EGF eller TGF-a. Som vist i Fig. 50, er både syre-renset naturlig TGF-el og EGF nødvendige for å stimulere vekst av NRK-cellekolonier (120 kolonier pr. åtte tilfeldige lav-styrke felt). Supernatanter (ingen forutgående surgjøring) som ble høstet fra r"Y-INF-behandlede monocytter inkubert med TGF-el induserte også effektivt NRK-cellekoloni-dannelse; 1 og 100 ng monocytt-aktivert rTGF-el stimulerte veksten av henholdsvis 90 og 190 NRK-kolonier. Når analysene ble utført i nærvær av et nøytraliserende monoklonalt antistoff til bovint ben-avledet TGF-el, var NRK-kolonidannelse undertrykket (90$ hemming ved en TGF-e konsentrasjon på 100 ng/ml). En proporsjonal mAb-hemming av kolonivekst ble avhengig av den opprinnelige konsentrasjonen av TGF-el tilsatt til analysen.

Kulturer med CHO-celler som uttrykker LnTGF-el ble inkubert over natten med 3H- leucin og merket TGF-el forløperkompleks ble renset som beskrevet i Materialer og Metoder. <3>H-leucin-merket LnTGF-el ble inkubert med r-y-INF-behandlede og ikke-behandlede monocytter ved å anvende serum-frie betingelser og supernatanter ble høstet og analysert med SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser. Resultatene er presentert i Fig. 51. I tillegg til 110 kd TGF-el forløper, kan man se et bånd som vandrer med 24 kd TGF-e standarden i supernatantene høstet fra r"yINF-behandlede kulturer (brønn A). Dette båndet var ikke så markert i supernatanter høstet fra monocytt-kul turer inkubert med <3>H-leucin LnTGF-el alene (brønn B).

Disse resultatene indikerer at -ylNF effektivt induserer humane monocytter til å formidle frigjøringen av aktiv TGF—e fra et latent rekombinant TGF-e kompleks. TGF-e frigjort i supernatanter, avledet fra eksogent tilsatt LnTGF-el, synes å være både funksjonelt identisk med TGF-el (mAb-nøytralisering av NRK-kolonidannelse) og utviser en masse (SDS-PAGE) som er identisk med naturlig TGF-e isolert etter rensing ved syre-pH fra plater og ben.

14. Deponering av mikroorganismer

De følgende transformanter har blitt deponentert i American Type Culture Collection, Rockville, MD og har blitt tilegnet de opplyste aksesjonsnummere:

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av transformerende vekst-faktor-ei-analoger der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, karakterisert ved at den omfatter: (a) dyrking av en eukaryot verteelle som inneholder en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens som koder for nevnte protein som angitt i Fig. 1 med unntak av at kodene for minst en av cystein i posisjon 33,223 eller 225 er endret til serinkodon, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjonsregulerende sekvenser, samt seleksjonsmarkør, som koder for simian transformerende vekstfaktor-el under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer genekspresjon slik at et peptid eller protein som har transformerende vekstfaktor-el aktivitet blir fremstilt av den eukaryote cellen; og (b) utvinning av den transformerende vekstfaktor-pl fra kulturen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleotidsekvensen som koder for simian transformerende vekstfaktor-pl omfatter nukleotidsekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra nukleotidnummer 1 til 1.173 der kodonet for aminosyreresidie nummer 33 er endret til "AGC".

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den eukaryote cellen omfatter en kinesisk hamsterovariecelle.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den andre nukleotidsekvensen som kontrollerer genekspresjon omfatter en SV40-promoter.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at den selekterbare markøren omfatter dihydrofolat reduktase.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den ytterligere omfatter eksponering av den eukaryote cellen til metotreksat, slik at resistente kolonier blir selektert som inneholder amplifiserte nivåer av de kodende sekvensene for dihydrofolat reduktase og simian transformerende vekstfaktor-el.

7. Eukaryotisk vertscelle, karakterisert ved at den inneholder en nukleotidsekvens som koder for simian transformerende vekstfaktor-el ifølge Fig. 1 der minst en av kodon for aminosyreresidier 33, 223 og 225 er endret til å kode for serin, samt seleksjonsmarkørkodende sekvens, under kontroll av en annen nukleotidsekvens som regulerer genekspresjon slik at den eukaryote cellen produserer aktiv transformerende vekstfaktor-el.

8. Eukaryotisk celle ifølge krav 7, karakterisert ved at nukleotidsekvensen som koder for simian transformerende vekstfaktor-ei omfatter nukleotidsekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra nukleotidnummer 1 til 1.173, med unntagelse for at kodon for aminosyreresidie 33 er endret til AGC.

9 . Eukaryotisk celle ifølge krav 8, karakterisert ved at den omfatter en kinesisk hamsterovariecelle.

10. Eukaryotisk celle ifølge krav 7, karakterisert ved at den andre nukleotidsekvensen som kontrollerer genekspresjon omfatter en SV40-promoter.

11. Eukaryotisk celle ifølge krav 7, karakterisert ved at den selekterbare markøren omfatter dihydrofolat reduktase.

12. Nukleotidsekvens som koder for transformerende vekstfaktor-el forløpermutein, der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, karakterisert ved at den omfatter den nukleotid-kodende sekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra ca. nukleotidnummer 1 til 1.173, med unntagelse for at minst en av kodon for aminosyreresidiet 33, 223 og 225 er endret til å kode for serin.

13. Nukleotidsekvens som koder for transformerende vekstfaktor-el forløpermutein, der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, karakterisert ved at den omfatter den nukleotid-kodende sekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra ca. nukleotidnummer 1 til 1.173 der kodonet for aminosyre-residienummer 33 er endret til "ÅGC".

14. Nukleotidsekvens som koder for transformerende vekstfaktor-el forløpermutein, der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, karakterisert ved at den omfatter den nukleotid-kodende sekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra ca. nukleotidnummer 1 til 1.173 der kodonet for aminosyre-residie 223 er endret til "AGC".

15 . Nukleotidsekvens som koder for transformerende vekstfaktor-el forløpermutein, der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, karakterisert ved at den omfatter den nukleotid-kodende sekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra ca. nukleotidnummer 1 til 1.173 der kodonet for aminosyre-residie 225 er endret til "TCT".

16. Nukleotidsekvens som koder for transformerende vekstfaktor-el forløpermutein, der en eller flere av aminosyreposisjonene 33, 223 og 225 er substituert fra cystein til serin, karakterisert ved at den omfatter den nukleotid-kodende sekvensen vesentlig som avbildet i Fig. 1 fra ca. nukleotidnummer 1 til 1.173 der kodonene for aminosyre-residiene 223 og 225 er endret til henholdsvis "AGC" og "TCT".