ES2259458T3 - Persefina humana. - Google Patents

Persefina humana.

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ES2259458T3 ES98948217T ES98948217T ES2259458T3 ES 2259458 T3 ES2259458 T3 ES 2259458T3 ES 98948217 T ES98948217 T ES 98948217T ES 98948217 T ES98948217 T ES 98948217T ES 2259458 T3 ES2259458 T3 ES 2259458T3
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Jeffrey D. Milbrandt
Paul T. Kotzbauer
Patricia A. Lampe
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Abstract

Un factor de crecimiento aislado y purificado que comprende la secuencia de polipéptidos de ID SEC Nº: 217 o ID SEC Nº: 223, en el que dicho factor de crecimiento promueve la supervivencia en células mesencefálicas.

Description

Persefina humana.
Referencia a la concesión del gobierno
Esta invención se hizo con apoyo del gobierno con los números de concesión NS24679 y CA53524. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de número de serie 08/881.172 presentada el 23 de junio de 1997, que es una continuación en parte de la solicitud de número de serie 08/615.944 presentada el 14 de marzo de 1996 y una continuación en parte de la solicitud PCT/US97/03461 presentada el 14 de marzo de 1997.
Antecedentes de la invención (1) Campo de la invención
Esta invención se refiere generalmente a factores tróficos o de crecimiento y, más particularmente, a factores de crecimiento novedosos de la familia neurturina-GDNF de factores de crecimiento.
(2) Descripción de la técnica relacionada
El desarrollo y el mantenimiento de tejidos en organismos complejos requiere un control preciso mediante los procesos de proliferación celular, diferenciación, supervivencia y función. Un mecanismo muy importante por el que estos procesos están controlados es por las acciones de polipéptidos conocidos como "factores de crecimiento". Estas moléculas estructuralmente variadas actúan mediante receptores superficiales de células específicas para producir estas acciones.
Los factores de crecimiento, denominados "factores neurotróficos", promueven la diferenciación, crecimiento y supervivencia de neuronas y residen en el sistema nervioso o en tejidos inervados. El factor de crecimiento nervioso (NGF) fue el primer factor neurotrófico que se identificó y caracterizó (Levi-Montalcini y col., J. Exp. Zool. 116:321, 1951 que se incorpora como referencia). El NGF existe como un homodímero unido no covalentemente que promueve la supervivencia y el crecimiento de neuronas simpáticas, sensoriales derivadas de crestas neurales y colinérgicas del cerebro basal anterior. En las neuronas simpáticas, esta sustancia produce excrecencia de neuritas in vitro y crecimiento axonal y dendrítico aumentado in vivo. (véase Levi-Montalcini y Booker, Proc Nat'l Acad Sci 46:384-391, 1960; Johnson y col. Science 210: 916-918, 1980; Crowley y col., Cell 76:1001-12, 1994, que se incorporan como referencia). El NGF tiene efectos en la cognición y en la plasticidad neuronal y puede promover la supervivencia de neuronas que han experimentado un daño debido a una variedad de agresiones mecánicas, químicas, víricas e inmunológicas (Snider y Johnson, Ann Neurol 26:489-506, 1989; Hefti, J Neurobiol 25:1418-35, 1994, que se incorporan como referencia). El NGF también es conocido para interactuar extensamente con el sistema endocrino y en procesos inmunitarios e inflamatorios (se revisa en Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Otten y Gadient, Int. J. Devl Neurosci 13:147-151, 1995 que se incorporan como referencia). Por ejemplo, el NGF promueve la supervivencia de mastocitos. (Horigome y col. J Biol Chem 269:2695-2707, 1994, que se incorpora como referencia).
En los últimos años ha llegado a ser obvio que los factores de crecimiento forman clases, es decir, familias o superfamilias basadas en las similitudes en sus secuencias de aminoácidos. Estas familias incluyen, por ejemplo, la familia del factor de crecimiento fibroblasto, la familia de neurotrofina y la familia del factor transformante de crecimiento beta (TGF-\beta). Como un ejemplo de similitudes de secuencias de miembros de familias, los miembros de la familia TGF-\beta tienen 7 residuos de cisteína de estructura canónica que identifican miembros de esta superfamilia.
El NGF es el prototipo de una familia de factores de crecimiento de este tipo. El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el segundo miembro de esta familia en ser descubierto, se mostró que estaba relacionado con el NGF en virtud de la conservación de las seis cisteínas que forman los tres disulfuros internos del monómero del NGF (Barde, Prog Growth Factor Res 2:237-248, 1990 y Liebrock y col. Nature 341:149-152, 1989 que se incorporan como referencia). Utilizando la información proporcionada por el BDNF de las partes sumamente conservadas de dos factores, varios grupos encontraron rápidamente miembros adicionales (NT-3, NT-4/5) de esta familia de neurotrofina (Klein, FASEB J 8:738-44, 1994, que se incorpora como referencia).
Recientemente se han identificado factores neurotróficos estructuralmente no relacionados al NGF. Éstos incluyen factores originalmente aislados basados en una "acción neurotrófica" tal como el factor neurotrófico ciliar (CNTF) (Lin y col., Science 246:1023-5, 1989, que se incorpora como referencia) junto con otros originalmente aislados como resultado de actividades no neuronales (por ejemplo factores de crecimiento fibroblasto (Cheng y Mattson Neuron 1:1031-41,1991, que se incorpora como referencia), IGF-I (Kanje y col., Brain Res 486:396-398, 1989, que se incorpora como referencia), factor inhibidor de la leucemia (Kotzbauer y col., Neuron 12:763-773, 1994, que se incorpora como referencia).
El factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF) es un factor neurotrófico tal que no está relacionado estructuralmente al NGF. Por tanto, el GDNF era un factor único que, hasta ahora, no se sabía que fuera un miembro de alguna subfamilia de factores. El descubrimiento, purificación y clonación del GDNF resultó de una investigación de factores crucial para la supervivencia de neuronas dopaminérgicas mesencefálicas, que degeneran en enfermedad de Parkinson. El GDNF se purificó de medios condicionados de células gliales B49 de rata (Lin y col., Science 260:1130-2, 1993, que se incorpora como referencia). El análisis de secuencias desveló que era un miembro lejano de la superfamilia TGF-\beta de factores de crecimiento que tenía aproximadamente el 20% de identidad basado primariamente en la alineación característica de los 7 residuos de cisteína de estructura canónica (Lin y col., Science 260:1130-2, 1993, que se incorpora como referencia). Por tanto, el GDNF podría haber representado posiblemente una nueva subfamilia dentro de la superfamilia TGF-\beta.
El GDNF recombinante producido en bacterias promueve específicamente la supervivencia y la diferenciación morfológica de neuronas dopaminérgicas (Lin y col., Science 260:1130-2, 1993); Tomac y col., Nature 373:335-9, 1995; Beck y col., Nature 373:339-41, 1995, y Ebendal y col., J Neurosci Res 40:276-84, 1995, que se incorporan como referencia) y neuronas motoras (Henderson y col., Science 266:1062-4, 1994; Yan y col., Nature 373:341-4, 1995; y Oppenheim y col., Nature 373:344-6, 1995, que se incorporan como referencia). En total, el GDNF era un factor más potente para promover la supervivencia de neuronas motoras que los otros factores y era el único factor que previno atrofia neuronal en respuesta a estas lesiones, posicionándolo de ese modo como un agente terapéutico prometedor para enfermedades de neuronas motoras.
Ahora se ha creído generalmente que los factores neurotróficos regulan muchos aspectos de la función neuronal, incluyendo la supervivencia y el desarrollo en la vida fetal e integridad y plasticidad estructural en la edad adulta. Puesto que tanto las lesiones agudas del sistema nervioso como las enfermedades neurodegenerativas crónicas se caracterizan por daño estructural y, posiblemente, por apoptosis inducida por enfermedades, es probable que los factores neurotróficos desempeñen algún papel en estas dolencias. De hecho, un cuerpo considerable de evidencia sugiere que los factores neurotróficos pueden ser valiosos agentes terapéuticos para el tratamiento de estos estados neurodegenerativos que quizás son las enfermedades más destructivas social y económicamente que están afectando ahora a nuestra sociedad. Sin embargo, debido a que los diferentes factores neurotróficos pueden actuar potencialmente de manera preferente mediante diferentes receptores y en diferentes tipos de células neuronales o no neuronales, permanece una necesidad continua de identificación de nuevos miembros de familias de factores neurotróficos para uso en el diagnóstico y tratamiento de una variedad de enfermedades agudas y crónicas del sistema
nervioso.
Resumen de la invención
Brevemente, la presente invención está dirigida por tanto a la identificación y aislamiento de factores sustancialmente purificados que promueven la supervivencia y el crecimiento de neuronas, además de células no neuronales. Por consiguiente, los inventores en este documento han logrado descubrir factores de crecimiento de proteínas novedosos que pertenecen a la familia de factores de crecimiento para los que el GDNF era el primer miembro conocido. El primer miembro de tal familia descubierta recientemente era la neurturina. Basado en la secuencia del GDNF y neurturina, los inventores han descubierto en este documento otro miembro de la familia de GDNF-neurturina de factores crecimiento referenciado en este documento como persefina (PSP). Se cree que este factor de crecimiento muestra al menos el 75% de identidad de secuencia entre secuencias homólogas de diferentes especies de mamíferos, aunque homología de secuencias puede ser tan sólo el 65% en especies de no mamíferos tales como especies de aviares. De hecho, las secuencias de persefina madura de ratón, rata y ser humano muestran de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 94% de identidad de secuencia. Las proteínas de persefina maduras identificadas en este documento comprenden secuencias de ratón como se exponen en ID SEC N°: 79 y 187 (figura 1B, aminoácidos 66 a 154 y 61 a 156, respectivamente), secuencias de rata como se exponen en ID SEC N°: 82 y 196 (figura 2B, aminoácidos 6 a 94 y 1 a 96, respectivamente) y secuencias humanas como se exponen en ID SEC N°: 221
y 223.
La persefina se ha identificado y obtenido mediante un procedimiento basado en las regiones conservadas de la familia de GDNF-neurturina descubiertas por los inventores en este documento. Por consiguiente, se ha ideado un nuevo procedimiento que utiliza cebadores degenerados construidos de las secuencias de estas regiones conservadas para uso en el proceso de la reacción en cadena de la polimerasa. Utilizando este procedimiento se han identificado y obtenido ortólogos de ratón, rata y de ser humano del nuevo miembro de familia, persefina.
Por tanto, la presente invención proporciona tanto secuencias de aminoácidos como secuencias de nucleótidos que codifican persefina humana, incluyendo secuencias de aminoácidos de ID SEC N°: 221 y 223 y secuencias de nucleótidos de ID SEC N°: 183, 193 y 199 y 201, además de los complementos de tales secuencias de nucleótidos (ID SEC N°: 184, 194, 200 y 202). Además, la presente invención incluye pre-, pro- y pre-pro regiones, además de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de pre-pro persefina.
Por tanto, según la invención se proporciona un factor de crecimiento aislado y purificado que comprende la secuencia de polipéptidos de ID SEC N°: 217 o ID SEC N°: 223, en la que dicho factor de crecimiento promueve la supervivencia en células mesencefálicas.
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La invención también proporciona:
- un factor de crecimiento aislado y purificado que comprende una secuencia de persefina como se expone en ID SEC N°: 217, ID SEC N°: 221 o ID SEC N°: 223; y
- un polipéptido aislado y purificado que comprende:
(a)
una pre-pro región de persefina como se expone en ID SEC N°: 218;
(b)
una pre-región de persefina como se expone en ID SEC N°: 219; o
(c)
una pro-región de persefina como se expone en ID SEC N°: 220.
La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada y purificada o molécula de ácido nucleico complementaria a ella que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de crecimiento de la invención o un fragmento de dicha secuencia de nucleótidos que está constituida por al menos 15 nucleótidos contiguos.
Además, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos de pre-pro persefina como se expone en ID SEC N°: 203 o el complemento de la misma;
(b) una pre-pro región de un polinucleótido de persefina como se expone en ID SEC N°: 213, ID SEC N°: 215 o el complemento de cualquiera de ellas;
(c) una pre-región de un polinucleótido de persefina como se expone en ID SEC N°: 208, ID SEC N°: 209 o el complemento de cualquiera de ellas;
(d) una pro-región de un polinucleótido de persefina como se expone en ID SEC N°: 211 o el complemento de la misma; o
(e) un fragmento de una secuencia explicada en cualquiera de (a) a (d) que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos, en la que dicho fragmento no se produce en ID SEC N°:179, ID SEC N°:190 o el complemento de cualquiera de ellas.
Los vectores de expresión y las células establemente transformadas que comprenden polinucleótidos de persefina también están dentro del alcance de esta invención. Las células transformadas pueden usarse en un procedimiento para producir persefina.
Por tanto, la invención proporciona un procedimiento recombinante que comprende:
(a) subclonar un polinucleótido que codifica el factor de crecimiento de la reivindicación 1 ó 2 en un vector de expresión que comprende elementos reguladores unidos de manera factible al polinucleótido;
(b) transformar una célula huésped con el vector de expresión;
(c) hacer crecer la célula huésped en un cultivo de célula huésped; y
(d) cosechar el factor de crecimiento y/o el polinucleótido del cultivo de célula huésped.
En otra realización puede usarse una cantidad terapéuticamente eficaz de una persefina de la invención para prevenir o tratar degeneración celular. También puede tratarse un paciente implantando células transformadas que expresan persefina o una secuencia de ADN que codifica persefina en un paciente, o células cultivadas y expandidas mediante crecimiento en persefina.
Por tanto, la invención proporciona:
- un factor de crecimiento de la invención o un polinucleótido que codifica un factor de crecimiento tal para uso en la prevención o tratamiento de degeneración o insuficiencia celular en un individuo;
- uso de un factor de crecimiento de la invención en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una degeneración o insuficiencia celular que es (a) degeneración neuronal resultante de neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral aguda, lesión medular aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple o infección; (b) degeneración o insuficiencia de células hematopoyéticas resultante de eosinopenia, basopenia, linfopenia, monocitopenia, neutropenia, anemia, trombocitopenia o insuficiencias de células madre para éstas; o (c) degeneración o insuficiencia de músculo cardiaco resultante de cardiomiopatía o insuficiencia cardiaca congestiva;
- una célula transformada con un vector de la invención y que expresa el factor de crecimiento de la invención para uso en la prevención o tratamiento de degeneración o insuficiencia celular en un individuo;
- un procedimiento para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente que comprende detectar y/o cuantificar la presencia en la muestra de ARNm que codifica un factor de crecimiento de la invención;
- un procedimiento in vitro para detectar alteraciones de genes de persefina que comprende detectar la presencia de un gen de persefina no intacto en una célula en la que la presencia del gen no intacto indica la presencia de alteraciones de genes;
- un procedimiento para promover el crecimiento y/o diferenciación de una célula en un medio de cultivo que comprende añadir al medio de cultivo el factor de crecimiento de la invención;
- un polinucleótido antisentido aislado y purificado que comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos de la invención y que puede hibridar a una secuencia de polinucleótidos de ADN o ARNm que se produce de manera natural que codifica persefina para prevenir la transcripción y/o traducción de un polipéptido de persefina codificado; y
- un polinucleótido antisentido como se explica anteriormente para uso en el tratamiento de un estado de enfermedad mediado por la expresión de persefina por una población de células.
La presente invención también proporciona composiciones y procedimientos para detectar persefina. Un procedimiento está basado en anticuerpos de persefina y otros procedimientos están basados en detectar ARNm o ADNc o ADN genómico que codifica persefina usando técnicas de ADN recombinante.
Por tanto, la invención proporciona:
- anticuerpos aislados y purificados que pueden reaccionar específicamente con un factor de crecimiento de la invención o un epítopo del mismo;
- un procedimiento para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente que comprende hacer reaccionar anticuerpos como se describe anteriormente con un factor de crecimiento presente en la muestra y detectar la unión de los anticuerpos con el factor de crecimiento; y
- un kit para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente que comprende anticuerpos como se describe anteriormente que pueden reaccionar de manera detectable con dicho factor de crecimiento, envasado en un recipiente.
Por tanto, entre las distintas ventajas encontradas que se alcanzan mediante la presente invención puede observarse la provisión de un nuevo factor de crecimiento, persefina, para uso en la prevención de atrofia, degeneración o muerte de ciertas células, en particular neuronas, es decir, para prevenir o tratar enfermedades que producen degeneración celular y, particularmente, degeneración neuronal; la provisión de persefina humana; la provisión de procedimientos para obtener persefina mediante técnicas recombinantes; la provisión de procedimientos que pueden detectar y monitorizar niveles de persefina en una muestra de un paciente; y la provisión de procedimientos in vitro que pueden detectar alteraciones en el gen de persefina.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra (A) la longitud total del gen de persefina murina (ID SEC N°:177) con flechas que indican un intrón de 88 nt de posiciones 155-242 y (B) la secuencia de nucleótidos de pre-pro persefina murina (ID SEC N°:179) con secuencia de aminoácidos codificada (ID SEC N°:185);
la figura 2 ilustra (A) la longitud total del gen de persefina de rata (ID SEC N°:188) con flechas que indican un intrón de 88 nt de posiciones 155-242 y (B) la secuencia de nucleótidos de pre-pro persefina de rata (ID SEC N°:190) con secuencia de aminoácidos codificada (ID SEC N°:196);
la figura 3 ilustra las moléculas quiméricas murinas (A) PSP/NTN que contienen el fragmento de persefina (residuos 1-63) y el fragmento de neurturina (residuos 68-100) y (B) NTN/PSP que contiene el fragmento de neurturina (residuos 1-67) y el fragmento de persefina (residuos 64-96) con la flecha que indica el punto de entrecruzamiento en cada una:
la figura 4 ilustra el efecto promotor de la supervivencia de persefina en células mesencefálicas de 14 días embriónicas murinas cultivadas durante tres días (a) en ausencia de persefina, en la que casi todas las células están muertas y (b) en presencia de persefina (100 ng/ml), en la que es evidente la supervivencia de células neuronales sustancial.
la figura 5 ilustra el estudio de RT/PCT para la expresión de persefina en tejidos de ratón adulto que muestran expresión de persefina mediante células renales; y
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención se basa en la identificación, aislamiento y secuenciación de una molécula de ADN que codifica un nuevo factor de crecimiento, persefina. La persefina promueve la supervivencia celular y, en particular, la supervivencia de células neuronales. Antes de esta invención, la persefina era desconocida y no había sido identificada como una sustancia biológica diferenciada ni había sido aislada en forma pura.
El factor de crecimiento neurturina (NTN) se identificó y aisló como se expone en la solicitud pendiente de tramitación de número de serie 08/519.777, presentada el 28 de agosto de 1995. De la secuencia de neurturina y la secuencia del factor de crecimiento estrechamente relacionado, factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), los inventores en este documento han ideado y buscado estrategias para encontrar factores relacionados adicionales. La neurturina es aproximadamente el 40% de idéntica al GDNF, pero menos del 20% de idéntica a cualquier otro miembro de la superfamilia TGF-\beta. Estas dos proteínas definen juntas una nueva subfamilia dentro de la superfamilia TGF-\beta. Se identificaron varias regiones de secuencias dentro de neurturina y GDNF que estaban sumamente conservadas, tal que probablemente están presentes en cualquier miembro adicional de esta subfamilia. Por tanto, esta información de secuencia puede usarse para aislar previamente miembros desconocidos de esta subfamilia mediante el diseño de oligonucleótidos degenerados que van a usarse o bien como cebadores en reacciones de PCR o como sondas en estudios de hibridación.
Usando la nueva estrategia de PCR de cebadores degenerados descrita en el ejemplo 11 de la solicitud pendiente de tramitación de número de serie 08/519.777, los inventores en este documento han logrado identificar un tercer factor, persefina, que es aproximadamente el 40-50% de idéntico a GDNF y neurturina. Se usaron cebadores correspondientes a la secuencia de aminoácidos de regiones conservadas de neurturina y GDNF (ID SEC N°:42 y ID SEC N°:44) para amplificar un fragmento de 77 nt de ADN genómico de rata. Los productos resultantes se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron. La secuencia de uno de los productos amplificados predijo datos internos de la secuencia de aminoácidos para los cebadores de PCR que eran diferentes de los del GDNF o neurturina, pero que tenían más del 20% de identidad con GDNF y neurturina, mientras que las secuencias de otros productos amplificados que se obtuvieron correspondían a GDNF o neurturina, como sería de esperar. Entonces, la secuencia de 22 nucleótidos (ID SEC N°:90) estaba alineada con las secuencias de rata de GDNF y neurturina y se encontró que era única. Por tanto, esta secuencia novedosa sugirió que se había identificado un nuevo miembro de familia referenciado en este documento como persefina.
Para obtener información adicional de la secuencia de persefina se usaron cebadores que contenían la única secuencia de 22 nucleótidos del fragmento amplificado en la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) usando ADNc obtenido de cerebro de rata neonatal. De esta reacción de PCR se obtuvo un fragmento de aproximadamente 350 nt que constituía una secuencia parcial de ADNc de persefina de rata de aproximadamente 350 nucleótidos (ID SEC N°:106). Se comparó la secuencia de aminoácidos predicha de este ADNc con la del GDNF y neurturina y se encontró que tenían aproximadamente el 40% de identidad con cada una de estas proteínas. El espaciado característico de los residuos de cisteína de estructura canónica estaba presente en gran medida en miembros de la superfamilia TGF-\beta. Adicionalmente, además de la región de similitud codificada por los cebadores degenerados usados para aislar persefina, también estaba presente en persefina otra región de homología alta compartida entre GDNF y neurturina, pero ausente en otros miembros de la superfamilia TGF-\beta
GDNF ACCRPVAFDDDLSFLDD (aa 60-76) (ID SEC N°:98)
NTN PCCRPTAYEDEVSFKDV (aa 61-77 ) (ID SEC N°:99)
PSP PCCQPTSYAD-V'TFLDD (aa 57-72) (ID SEC N°:100)
(la numeración de aminoácidos usa el primer residuo de Cys como aminoácido 1).
Con la confirmación de que la persefina era de hecho un nuevo miembro de la subfamilia GDNF/NTN, se aislaron clones genómicos murinos de persefina para obtener información adicional de la secuencia. Se usaron los cebadores correspondientes a la secuencia de ADNc de rata en una reacción de PCR para amplificar un fragmento de 155 nucleótidos (nt) de ADN genómico de ratón que era homólogo a la secuencia de ADNc de persefina de rata. Entonces, estos cebadores se usaron para obtener clones genómicos de persefina murina de una biblioteca de 129/Sv de ratón en un vector bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).
Los fragmentos de restricción (3,4 kb de Nco I y 3,3 kb de Bam H1) de este clon de P1 que contiene el gen de persefina se identificaron mediante hibridación con un fragmento de 210 nt de persefina obtenido mediante PCR usando ADN genómico de ratón y cebadores específicos para persefina. Se secuenciaron los fragmentos Nco I y Bam H1 y se encontró que codificaban un estiramiento de aminoácidos correspondiente al presente en el producto de RACE de persefina de rata, además de ser homólogos a las regiones maduras de neurturina y GDNF (figura 11).
La persefina humana se obtuvo de una manera similar a la de la persefina de ratón. Se usaron cebadores de PCR degenerados para amplificar ADN genómico humano y se determinó que un clon tenía una secuencia homóloga a la persefina de ratón. Los cebadores basados en la secuencia identificada se usaron entonces para rastrear bibliotecas de ADNc. Los clones positivos se identificaron mediante hibridación con una sonda de ADN derivada de la secuencia identificada y entonces se secuenciaron estos clones.
Cuando las secuencias de aminoácidos de GDNF, NTN y PSP murinos maduras se alinean usando la primera cisteína de estructura canónica como punto de partida, que se hace debido a alteraciones en los sitios de escisión entre miembros de familias, se crea variabilidad en los segmentos secuencia arriba de la primera cisteína, la persefina (91 aminoácidos) es algo más pequeña que cualquier neurturina (95 aminoácidos) o GDNF (94 aminoácidos). La identidad global dentro de esta región es aproximadamente el 50% con neurturina y aproximadamente el 40% con GDNF.
Otra secuenciación de nucleótidos del fragmento Nco I de persefina murina desveló la secuencia de nucleótidos del gen total de persefina murina como se muestra en la figura 1. Además, el gen total de persefina de rata se ha determinado mediante secuenciación de un fragmento amplificado por PCR de ADN genómico de rata como se muestra en la figura 2. En ambos, el gen de persefina murina y de rata, se extiende un marco de lectura abierto desde la secuencia que codifica para un iniciador de metionina hasta un codón de terminación en las posiciones 244-246. Sin embargo, en algún sitio de esta secuencia se encontró que se producía una anomalía aparente tal que la secuencia que codifica el sitio de escisión RXXR (posiciones 257-268) y la secuencia correspondiente a la proteína de persefina madura (posiciones 269-556) no son colineales con este marco de lectura abierto. En su lugar, un segundo marco de lectura codifica el sitio de escisión y la persefina madura. Independientemente de esta anomalía aparente se encontró que las células de mamíferos expresan persefina de o bien la secuencia genómica de longitud total murina o bien de rata (véase más adelante el ejemplo 14).
Para buscar la génesis de esta anomalía se prepararon vectores de expresión de mamíferos para ambas, persefina murina y de rata. Para construir el plásmido murino se usó un clon de P1 que contenía el gen de persefina murina como un molde en un ensayo de PCR. Los cebadores se diseñaron tal que el fragmento resultante contuviera el gen de persefina que se extendía desde el iniciador de metionina hasta el codón de terminación. La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA] y cebador inverso M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC]. Para construir el plásmido de rata análogo se usó ADN genómico de rata como un molde en un ensayo de PCR. La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA] y cebador inverso M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAG
CCACCACAGCCACAAGC]. Los productos amplificados se donaron en BSKS y se secuenciaron para verificar que se había obtenido el clon correcto. Se suprimieron los fragmentos de persefina de rata y murina usando Sma I y Hind III y se donaron en una Asp718 (roma) y sitios Hind III del vector de expresión pCB6 de mamíferos.
Se transfectaron células COS de mono con o bien los vectores de expresión de persefina de rata o murina o bien el propio vector no recombinante (pCB6). Cuarenta y ocho horas después, las células se lisaron, las muestras se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 15% y las proteínas se separaron mediante electroforesis. Entonces, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa mediante electrotransferencia. Esta membrana de nitrocelulosa se incubó con anticuerpos anti-persefina (que se obtuvieron para persefina madura producida en bacterias a partir de un plásmido pET) para detectar la presencia de persefina en los lisados. Los lisados de células transfectadas con o bien los vectores de expresión de persefina de rata o bien murina, pero no el lisado de células transfectadas con pCB6, contienen altas cantidades de persefina. El tamaño de la persefina detectada era de 10-15 kD, que concuerda con el tamaño predicho para la procesada (es decir, forma madura de persefina). Los medios condicionados cosechados de estas células también contenían persefina madura. Estos resultados demuestran que ambos, los genes de persefina murina y de rata, pueden dirigir la síntesis de una molécula de persefina apropiadamente procesada.
Para buscar el mecanismo mediante el que esto se produce se aisló ARN de células transfectadas con o bien vector de expresión de persefina de rata o bien murina. Los análisis de RT/PCR se realizaron usando cebadores correspondientes al iniciador Met y el codón de terminación. Se detectaron dos fragmentos: uno correspondiente al tamaño predicho del gen de persefina y el otro algo más pequeño, sugiriendo que se ha producido el corte y empalme de ARN. Esto se confirmó con varios otros pares de cebadores. Ambos, los fragmentos de persefinas grandes y pequeños, se clonaron y se secuenciaron. Como se esperaba, el fragmento mayor correspondía al gen de persefina. El fragmento pequeño correspondía a una versión cortada y empalmada de persefina. Se había cortado y empalmado un pequeño intrón de 88 nt dentro del prodominio (situado 154 nt secuencia abajo del codón de iniciación). Después de este acontecimiento de corte y empalme, el "marco de lectura" ya no estaba presente (es decir, el iniciador Met y la región madura están en marco) en, o bien persefina de rata o bien de ratón.
El extremo N de persefina se predijo como referencia a las regiones N-terminales de neurturina o GDNF. Usando homología de secuencias de neurturina y señales de escisión está presente un motivo de escisión RXXR característico que empieza 9 residuos secuencia arriba de la primera cisteína de estructura canónica de persefina que sugeriría que la persefina murina madura contendría 5 aminoácidos (ALAGS) (ID SEC N°:103) secuencia arriba de esta cisteína (como la neurturina). Los 5 aminoácidos correspondientes en la persefina de rata son ALPGL (ID SEC N°:112) y aquellos en la persefina humana son ALSGP (ID SEC N°:224). Usando estos parámetros, la persefina madura estaría constituida por 96 aminoácidos y tendría una masa molecular predicha de 10,4 kD.
Mediante factor de crecimiento "maduro" se hace referencia a la forma secretada del factor de crecimiento en el que se ha escindido cualquier pre- o pro-región y que puede existir como un monómero o, mediante analogía con otros miembros de la superfamilia TGF-\beta, en forma de un homodímero unido por enlaces disulfuro.
El descubrimiento del nuevo factor de crecimiento, persefina, como se describe anteriormente, es un resultado del descubrimiento anterior de neurturina por los inventores en este documento. Por tanto, los experimentos que conducen al descubrimiento de neurturina son relevantes para el descubrimiento actual de persefina, además de para la actividad biológica de la persefina. El aislamiento, identificación y caracterización de neurturina se describe en detalle en los ejemplos 1-5 de más adelante. Los factores de crecimiento sustancialmente homólogos pueden ser originarios de cualquier tejido o especie y, similarmente, la actividad biológica puede caracterizarse por cualquiera de varios sistemas de ensayos biológicos. Con referencia a la pre-pro persefina, se pretende que se interprete para incluir pre-pro factores de crecimiento que contienen una pre-región de secuencia o región líder o región de secuencia señal, una pro-región de secuencia y persefina como se define en este documento.
Se pretende que los términos "biológicamente equivalente" signifiquen que las composiciones de la presente invención pueden demostrar alguna o todas las mismas propiedades promotoras del crecimiento de un modo similar, aunque no necesariamente al mismo grado que la persefina humana, de ratón o de rata recombinantemente producida como se identifica en este documento.
"Sustancialmente homólogo" significa que el grado de identidad de secuencia de ortólogos de persefina, incluyendo persefina humana, de ratón y de rata, además de persefina de cualquier otra especie, sea superior al de entre parálogos tales como persefina y neurturina o persefina y GDNF, y superior al informado previamente para miembros de la superfamilia TGF-\beta (véase Kingsley, Genes and Dev 8:133-46, 1994, para tratar de homología de miembros de la superfamilia TGF-\beta).
Se pretende que la identidad de secuencia o identidad en tanto por ciento signifique el porcentaje de los mismos residuos entre dos secuencias. La secuencia de referencia es persefina humana cuando se determina la identidad en tanto por ciento con persefina de ratón o de rata y con factores de crecimiento de no persefina, neurturina humana o GDNF humano. La secuencia de referencia es persefina de ratón cuando se determina la identidad en tanto por ciento con GDNF de ratón y neurturina de ratón y persefina de rata cuando se determina la identidad en tanto por ciento con GDNF de rata y neurturina de rata. Se referencia a neurturina humana cuando se determina la identidad en tanto por ciento con neurturina no humana y para GDNF humana. En todas las comparaciones anteriores, las dos secuencias que se comparan se alinean usando el procedimiento de Clustal (Higgins y col., Cabios 8:189-191, 1992) de alineamiento de múltiples secuencias en el software Lasergene biocomputing (ADNSTAR, INC, Madison, WI). En este procedimiento, los alineamientos múltiples se llevan a cabo de una manera progresiva, en el que los grupos de alineamiento más y más grandes se ensamblan usando puntuaciones de similitud calculadas a partir de una serie de alineamientos por emparejamiento. Los alineamientos óptimos de secuencias se obtienen encontrando la máxima puntuación de alineamiento, que es la media de todas las puntuaciones entre los residuos separados en el alineamiento, determinados a partir de una tabla de pesos de residuos que representa la probabilidad de un cambio de un aminoácido dado que se produce en dos proteínas relacionadas durante un intervalo evolutivo dado. Las penalizaciones para abrir y alargar huecos en el alineamiento contribuyen a la puntuación. Los parámetros por defecto usados con este programa son del siguiente modo: penalización de hueco para alineamiento múltiple = 10; penalización de longitud de hueco para alineamiento múltiple = 10; valor k-tuple en alineamiento por emparejamiento = 1; penalización de hueco en alineamiento por emparejamiento = 3; valor de ventana en alineamiento por emparejamiento = 5; diagonales guardadas en alineamiento por emparejamiento = 5. La tabla de pesos de residuos usada para el programa de alineamiento es PAM250 (Dayhoff y col., en Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Ed., NBRF, Washington, volumen 5, suplemento 3, página 345, 1978).
La conservación en tanto por ciento se calcula a partir del alineamiento anterior añadiendo el porcentaje de residuos idénticos al porcentaje de posiciones en las que los dos residuos representan una sustitución conservadora (definida como que tiene un valor de logaritmo de las probabilidades superior a o igual a 0,3 en la tabla PAM250 de pesos de residuos). Usando este criterio, los cambios de aminoácidos conservadores son: R-K; E-D, Y-F, L-M; V-I, Q-H. La conservación se referencia a persefina humana cuando se determina la conservación en tanto por ciento con factores de crecimiento de persefina de otras especies o con de no persefina; se referencia a neurturina humana cuando se determina la conservación en tanto por ciento con factores de crecimiento de neurturina no humana o con de no persefina, no neurturina.
La tabla 1 muestra los cálculos de identidad (I) y conservación (C) para comparaciones de persefina madura, neurturina madura y GDNF maduro de diversas especies. Las comparaciones se hicieron entre persefina humana madura (PSPh) y persefina madura de ratón y de rata (PSPm y PSPr, respectivamente) y entre persefina humana madura y GDNF humano maduro o neurturina (GDNFh y NTNh respectivamente). Las comparaciones de neurturina fueron entre neurturina humana madura y de ratón madura (NTNh y NTNm, respectivamente) y entre cada una de estos y GDNF humano, de rata y de ratón maduro (GDNFh, GDNFr y GDNFm, respectivamente) como se muestra en la tabla.
TABLA 1
Comparación Identidad en % Conservación en %
PSPh frente a PSPm 81 81
PSPh frente a PSPr 80 81
PSPm frente a PSPr 94 96
PSPh frente a NTNh 49 50
PSPh frente a GDNFh 40 43
NTNh frente a NTNm 90 93
NTNh frente a GDNFr 44 53
NTNh frente a GDNFm 43 52
NTNh frente a GDNFh 43 53
NTNm frente a GDNFr 42 52
NTNm frente a GDNFm 41 51
NTNm frente a GDNFh 41 52
El grado de homología entre la persefina humana y la persefina de ratón o rata es aproximadamente el 80%, mientras que el grado de homología entre la persefina de ratón y de rata es aproximadamente el 94%. Las comparaciones de neurturina como se muestra en la tabla 1 indican que las proteínas de neurturina de ratón y humanas maduras tienen aproximadamente el 90% de identidad de secuencia. Además, se cree que todos los homólogos de persefina y neurturina de especies de mamíferos no humanos tienen similarmente al menos aproximadamente el 75% de identidad de secuencia con persefina humana, neurturina humana o GDNF humano. Para especies de no mamíferos, tales como especies aviares, se cree que el grado de homología con persefina es al menos aproximadamente el 65% de identidad con persefina humana, o neurturina humana de neurturina o GDNF humano. A modo de comparación, las variaciones entre miembros de familias de la familia de neurturina-persefina-GDNF de factores de crecimiento pueden observarse mediante la comparación de persefina y GDNF o neurturina y GDNF. La persefina humana tiene aproximadamente el 40% de identidad de secuencia y aproximadamente el 43% de conservación de secuencia con GDNF humano; y aproximadamente el 49% de identidad de secuencia y aproximadamente el 50% de conservación de secuencia con neurturina humana. Similarmente, la neurturina humana tiene aproximadamente el 40% de identidad de secuencia y aproximadamente el 50% de conservación de secuencia con GDNF humano. Se cree que los diferentes miembros de familias también tienen una identidad de secuencia similar de aproximadamente el 40% de la de la neurturina, aproximadamente el 40% de la de la persefina o aproximadamente el 40% de la del GDNF y dentro de un intervalo de aproximadamente del 30% a aproximadamente el 75% de identidad con neurturina, dentro de un intervalo de aproximadamente del 30% a aproximadamente el 75% de identidad con persefina o dentro de un intervalo de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 75% de identidad de secuencia con GDNF.
Por tanto, sería de esperar que un miembro dado de la familia GDNF-neurturina-persefina tuviera menor identidad de secuencia con cualquier otro miembro de familia de la misma especie que está presente en ortólogos de ese miembro de familia en otras especies, así como el GDNF humano y la neurturina humana están más estrechamente relacionadas al GDNF de ratón y neurturina de ratón, respectivamente, que entre sí o a GDNF y sería de esperar que cualquier miembro de familia dado tuviera una identidad de secuencia mayor con otro miembro de familia que con cualquier otro miembro conocido de la superfamilia TGF-\beta (Kingsley, antes mencionado).
Los homólogos de pre-pro persefina en especies de mamíferos no humanos pueden identificarse en virtud de la parte de persefina de la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75% de identidad de secuencia con persefina humana y los homólogos de pre-pro persefina en especies de no mamíferos pueden identificarse en virtud de la parte de persefina de la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 65% de identidad con persefina humana.
La persefina, como se usa en este documento, también puede incluir formas híbridas y modificadas de persefina, respectivamente, incluyendo proteínas de fusión y fragmentos de persefina y formas híbridas y modificadas en las que se han eliminado o reemplazado ciertos aminoácidos y modificaciones tales como en las que se han cambiado uno o más aminoácidos por un aminoácido modificado o aminoácido inusual y modificaciones tales como glicosilaciones, con tal de que la forma híbrida o modificada retenga la actividad biológica de persefina. La retención de la actividad biológica significa que se promueva la supervivencia neuronal, aunque no necesariamente al mismo nivel de potencia que el de la persefina humana, de ratón o de rata identificada en este documento.
Dentro del significado de sustancialmente homólogo también está incluido cualquier persefina que pueda aislarse en virtud de reactividad cruzada con anticuerpos para la persefina o cuyas secuencias de nucleótidos codificantes, incluyendo ADN genómico, ARNm o ADNc, puedan aislarse mediante hibridación con la secuencia complementaria de secuencias de nucleótidos genómicos o subgenómicos o ADNc de la persefina o fragmentos de la misma. Un experto en la materia también apreciará que las secuencias de ADN degenerado pueden codificar persefina humana y también se pretende incluir éstas dentro de la presente invención ya que son variantes alélicas de persefina.
Las proteínas de persefina sustituidas de manera conservadora también están dentro del alcance de la presente invención. Sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales similares. Los aminoácidos sustituidos de manera conservadora pueden agruparse según las propiedades químicas de sus cadenas laterales. Por ejemplo, un agrupamiento de aminoácidos incluye aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales neutras e hidrófobas (A, V, L, 1, P, W, F y M); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales neutras y polares (G, S, T, Y, C, N y Q); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas (K, R y H); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (D y E); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas (G, A, V, L y 1); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxílicas alifáticas (S y T); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amina (N, Q, K, R y H); otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (F, Y y W); y otro agrupamiento son aquellos aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre (C y M). Los grupos de sustitución preferidos de aminoácidos conservadores son: R-K; E-D, Y-F, L-M; V-I y Q-H. Además, se cree que Q-R-H y A-V son sustituciones preferidas para persefina ya que se producen entre los parálogos humanos, de ratón y de rata de persefina.
En el caso de pre-pro neurturina, alternativamente productos de proteínas cortados y empalmados, puede existir resultante de un intrón localizado en la secuencia codificante de la pro región. Se cree que el intrón existe en la secuencia genómica en una posición correspondiente a la de entre los ácidos nucleicos 169 y 170 del ADNc que, a su vez, corresponde a una posición dentro del aminoácido 57 en ambas, las secuencias de ratón y de neurturina pre-pro humana. Por tanto, el corte y empalme alternativo en esta posición puede producir una secuencia que se diferencia de la identificada en este documento para pre-pro neurturina humana y de ratón (ID SEC N°:11 y ID SEC N°:12, respectivamente) en el sitio del aminoácido identificado mediante adición y/o deleción de uno o más aminoácidos. Se pretenden incluir todas y cada una de las proteínas de pre-pro neurturina alternativamente cortadas y empalmadas dentro de los términos pre-pro neurturina y, similarmente, también se pretenden incluir todas y cada una de las proteínas de pre-pro persefina alternativamente cortadas y empalmadas dentro de los términos pre-pro persefina como se usan en este documento.
Aunque en este documento no se pretende que los inventores se ciñan a ninguna teoría, se piensa que las proteínas de persefina humana, de ratón y de rata identificadas en este documento, además de los homólogos de otros tejidos y especies, pueden existir como dímeros en su forma biológicamente activa de un modo que concuerda con lo que se conoce para otros factores de la superfamilia TGF-\beta.
Además de los homodímeros, las unidades monoméricas de los dímeros de persefina pueden usarse para construir heterodímeros o heteromultímeros estables de factores de crecimiento que comprenden al menos una unidad de monómero derivada de persefina. Esto puede hacerse mediante disociación de un homodímero de persefina en sus unidades monoméricas de componentes y reasociación en presencia de una unidad monomérica de un segundo factor de crecimiento homodímerico o posterior. Esta segundo factor de crecimiento homodímerico o posterior puede seleccionarse de una variedad de factores de crecimiento que incluyen neurturina, GDNF, un miembro de la familia NGF tal como NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5, un miembro de la superfamilia TGF-\beta, un factor de crecimiento endotelial vascular, un miembro de la familia CNTF/LIF y similares.
Se piensa que los factores de crecimiento actúan en receptores específicos. Por ejemplo, se han identificado los receptores para TGF-\beta y activinas y forman una familia de proteínas transmembrana de Ser/Thr cinasa (Kingsley, Genes and Dev 8:133-146, 1994; Bexk y col. Nature 373:339-341, 1995). En la familia NGF, el NGF se une al receptor de TrkA en las neuronas sensoriales periféricas y simpáticas y en neuronas del cerebro basal anterior; BDNF y NT-4/5 se unen a receptores de trkB; y NT-3 se une primariamente a receptores de trkC que poseen una distribución definida dentro del SNC (Tuszynski y col., Ann Neurol 35:S9-S12, 1994). Parece que los miembros de la familia persefina-neurturina-GDNF también actúan mediante receptores específicos que tienen distribuciones definidas como se ha mostrado para otras familias de factores de crecimiento. Recientemente se mostró que el GDNF actúa mediante un complejo de receptor multicomponente en el que un componente transductor de señal transmembrana, la proteína de tirosina cinasa Ret (Ret PTK), se activa con la unión del GDNF con otra proteína, llamada receptor \alpha de GDNF (GDNFR-\alpha) que no tiene dominio transmembrana y está unida a la superficie celular por medio de un enlace de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Durbec y col., Nature 381:789-793, 1996; Jing y col., Cell 85:1113-1124, 1996; Treanor y col., Nature 382:80-83, 1996; Trupp y col., Nature 381:785-789, 1996). Además, se ha mostrado que la señalización de neurturina y GDNF mediante el receptor de tirosina cinasa Ret está mediada por una familia de correceptores, incluyendo la proteína correceptora GDNFR-\alpha, también denominada en lo sucesivo TrnR1, y la proteína correceptora TrnR2, cualquiera de las cuales puede formar un complejo receptor funcional con Ret para ambos, neurturina y GDNF (Baloh y col., Neuron 18:793-802, 1997). Mediante la formación de heterodímeros o heteromultímeros de persefina y uno o más de otros factores de crecimiento sería de esperar que el factor de crecimiento resultante pudiera unirse a al menos dos tipos de receptores definidos que tuvieran preferentemente una distribución diferente de tejidos. Sería de esperar que los heterodímeros o heteromultímeros resultantes mostraran un espectro diferente y, posiblemente, alargado de células con el que podría actuar o proporcionar mayor potencia. También es posible que el heterodímero o heteromultímero pueda proporcionar efectos sinérgicos no observados con homodímeros o homomultímeros. Por ejemplo, se ha mostrado que la combinación de factores de diferentes clases promueve la supervivencia a largo plazo de oligodendrocitos, mientras que los factores individuales o las combinaciones de factores dentro de la misma clase promueven la supervivencia a corto plazo (Barres y col., Development 118:283-295, 1993).
Los heterodímeros pueden formarse mediante varios procedimientos. Por ejemplo, los homodímeros pueden mezclarse y someterse a condiciones en las que se produzca la disociación/desdoblamiento, tales como en presencia de un agente de disociación/desdoblamiento, seguido por sometimiento a condiciones que permiten la reasociación del monómero y la formación de heterodímeros. Los agentes de disociación/desdoblamiento incluyen cualquier agente conocido para promover la disociación de proteínas. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de guanidina, urea, tiocianato de potasio, agentes reductores del pH tales como disoluciones de HCl tamponadas, y disolventes orgánicos polares miscibles en agua tales como acetonitrilo o alcoholes tales como propano) o isopropanol. Además, para homodímeros unidos covalentemente mediante enlaces disulfuro, como es el caso con miembros de la familia TGF-\beta, pueden usarse agentes reductores tales como ditiotreitol y \beta-mercaptoetanol para la disociación/desdoblamiento y para la reasociación/redoblamiento.
Los heterodímeros también pueden hacerse transfectando una célula con dos o más factores tales que la célula transformada produzca heterodímeros como se ha hecho con las neurotrofinas. (Heymach y Schooter, J Biol Chem 270:12297-12304, 1995).
Otro procedimiento para formar heterodímeros es mediante combinación de homodímeros de persefina y un homodímero de un segundo factor de crecimiento e incubación de la mezcla a 37°C.
Cuando los heterodímeros se producen a partir de homodímeros, los heterodímeros pueden separarse entonces de los homodímeros usando procedimientos disponibles para aquellos expertos en la materia tales como, por ejemplo, mediante elución de geles de poliacrilamida preparativos, no desnaturalizantes. Alternativamente, los heterodímeros pueden purificarse usando cromatografía de intercambio catiónico a alta presión, tal como con una columna de intercambio catiónico de Mono S o mediante columnas de inmunoafinidad secuencial.
Es bien conocido en la técnica que muchas proteínas se sintetizan dentro de una célula con una secuencia señal en el extremo N de la secuencia de proteínas madura y la proteína que lleva una secuencia líder tal se denomina en lo sucesivo una preproteína. La parte previa de la proteína se escinde durante el procesamiento celular de la proteína. Además de una secuencia pre-líder, muchas proteínas contienen una pro secuencia definida que describe una región en una proteína que es un precursor estable de la proteína madura. Las proteínas sintetizadas con ambas pre- y pro-regiones se denominan en lo sucesivo preproproteínas. En vista de los acontecimientos de procesamiento conocidos para producir con otros miembros de la familia TGF-\beta, además de las secuencias determinadas en este documento, los inventores creen que la forma de la proteína de persefina es la pre-pro persefina cuando se sintetiza dentro de una célula. Se cree que la pre-pro persefina human contiene una secuencia señal N-terminal de 23 aminoácidos (pre-secuencia señal humana, ID SEC N°:219, codificada por ID SEC N°:208 y 209). Se sabe que la secuencia no requiere necesariamente la longitud total de una secuencia líder para actuar como una secuencia señal y, por tanto, dentro de la definición de pre-región de persefina se incluyen fragmentos de la misma, normalmente fragmentos N-terminales que retienen la propiedad de poder actuar como una secuencia señal, que es para facilitar la inserción cotraduccional en las membranas de uno o más orgánulos celulares, tales como retículo endoplásmico, mitocondria, aparato de golgi, membrana plasmática y similares.
La secuencia señal de persefina está seguida por un prodominio que contiene un sitio de procesamiento proteolítico RXXR inmediatamente antes de la secuencia de aminoácidos N-terminal para la persefina madura. (secuencia de pro-región humana, ID SEC N°:220, codificada por la secuencia de ácidos nucleicos ID SEC N°:211).
Las pre- y pro-regiones de persefina comprenden juntas una pre-pro secuencia identificada como la secuencia pre-pro región humana (ID SEC N°:219 codificada por ID SEC N°:213 y 215, ácidos nucleicos 1 a 285). Las secuencias de pre-región y las secuencias de pro-región, además de las secuencias de pre-pro región, pueden identificarse y obtenerse para especies de mamíferos no humanos y para especies de no mamíferos en virtud de las secuencias que están contenidas dentro de la pre-pro persefina como se define en este documento.
Usando las marcas anteriores, el ADNc de persefina humana tiene un marco de lectura abierto de 471 bp que codifica una proteína de 156 aminoácidos de longitud (Mr predicho 16,6 kDA). La escisión del péptido señal predicho de 23 aminoácidos de longitud conducirá a una molécula de pro-persefina de 133 aminoácidos (Mr 14,2 kDa), la escisión proteolítica de la pro-persefina en una secuencia consenso RXXR debería dar una proteína madura de 96 aminoácidos con un peso molecular de 10,3 kDa. Es probable que la molécula de persefina madura secretada forme un homodímero unido por disulfuro mediante analogía con otros miembros de la familia TGF-\beta.
Las secuencias de nucleótidos de pre- y/o pro-regiones de persefina o regiones similares que se creen están asociadas con ADN de persefina pueden usarse para construir genes quiméricos con las secuencias codificantes de otros factores de crecimiento o proteínas. (Booth y col., Gene 146:303-8, 1994; Ibanez, Gene 146:303-8, 1994; Storici y col., FEBS Letters 337:303-7, 1994; Sha y col. J Cell Biol 114:827-839, 1991). Tales proteínas quiméricas pueden presentar producción o expresión alterada de las especies de proteínas activas.
Una persefina preferida según la presente invención se prepara mediante tecnología de ADN recombinante, aunque se cree que la persefina puede aislarse en forma purificada de medio condicionado con células como se hizo para neurturina.
"Forma pura" o "forma purificada" o "forma sustancialmente purificada" significa que una composición de persefina está sustancialmente libre de otras proteínas que no son persefina. Preferentemente, una composición de persefina sustancialmente purificada comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento de persefina en una base molar comparada con proteínas totales u otras especies macromoleculares presentes. Más preferentemente, una composición de persefina sustancialmente purificada comprenderá al menos aproximadamente del 80 a aproximadamente el 90 por ciento en moles de la proteína total u otras especies macromoleculares presentes y todavía más preferentemente, al menos aproximadamente el 95 por ciento en moles o más.
La persefina recombinante puede hacerse mediante expresión de las secuencias de ADN que codifican persefina en una célula huésped transformada adecuada. Usando procedimientos bien conocidos en la técnica, la persefina que codifica ADN puede unirse a un vector de expresión, transformarse en una célula huésped y se establecen condiciones que son adecuadas para la expresión de persefina por la célula transformada.
Cualquier vector de expresión adecuado puede emplearse para producir persefina humana recombinante tal como, por ejemplo, el vector de expresión de mamíferos pCB6 (Brewer, Meth Cell Biol 43:233-245, 1994) o los vectores de expresión pET de E. coli, específicamente, pET-30a (Studier y col., Methods Enzymol 185:60-89, 1990), usándose ambos en este documento. En la técnica se conocen otros vectores de expresión adecuados para la expresión en mamíferos y células bacterianas, ya que son vectores de expresión para uso en levadura o células de insectos. También pueden emplearse sistemas de expresión de baculovirus.
La persefina puede expresarse en las unidades monoméricas o tal forma monomérica puede producirse mediante preparación en condiciones reductoras. En tales ejemplos, el redoblamiento y renaturalización pueden efectuarse usando uno de los agentes observados anteriormente que se sabe promueve la disociación/asociación de proteínas. Por ejemplo, la forma monomérica puede incubarse con ditiotreitol seguido por incubación con sal disódica de glutatión oxidado seguido por incubación con un tampón que contiene un agente de redoblamiento tal como urea.
La persefina puede existir como un dímero u otro multímero y puede estar glicosilada o químicamente modificada de otras maneras. La persefina humana madura no contiene sitios de glicosilación unidos a N (ID SEC N°:221). Los sitios de glicosilación potenciales unidos a O se producen en persefina humana madura en las posiciones 3, 10, 12, 14, 24, 36, 43, 67, 70 y 88 en ID SEC N°:221.
Como se observa anteriormente, la secuencia de ácidos nucleicos humana sugiere que la persefina se traduce inicialmente como un pre= pro polipéptido y que el procesamiento proteolítico de la secuencia señal y la parte "pro" de esta molécula da como resultado la secuencia madura, referenciada en este documento como "persefina madura", existe en especies humanas y en no humanas en forma homóloga. Por tanto, la persefina incluye todas y cada una de las secuencias de "persefina madura" de especies humanas y no humanas y todos y cada uno de los polipéptidos de pre-pro persefina que puedan traducirse a partir del gen de persefina.
Mediante analogía con la proteína de neurturina es posible que puedan existir isoformas de persefina. Por ejemplo, los diferentes sitios de posible escisión (tales como sitios RXXR) pueden estar presentes en la secuencia de pre-pro neurturina de manera que pueda existir más de una isoforma posible de pre-pro neurturina. Por tanto, la proteína de neurturina madura puede tener un número variable de aminoácidos precediendo a la primera cisteína canónica. Tales sitios de escisión alternante podrían utilizarse de distinto modo entre diferentes organismos y entre diferentes tejidos del mismo organismo. Los aminoácidos N-terminales que preceden la primera de las siete cisteínas conservadas en las formas maduras de miembros de la familia TGF-\beta varían enormemente tanto en longitud como en secuencia. Además, la inserción de dos residuos en la secuencia de diez aminoácidos secuencia arriba de la primera cisteína conservada no afecta las actividades biológicas conocidas de un miembro de familia, dorsalina (Basler y col., Cell 73:687-702, 1993). Mediante analogía también es posible que puedan existir o pudieran hacerse proteínas de persefina que contienen secuencias de diferentes longitudes que preceden la primera cisteína canónica y que éstas retuvieran su actividad biológica.
Los inventores en este documento creen que la secuencia de un factor de crecimiento de persefina-neurturina-GDNF que mostrará actividad biológica contendrá en un mínimo la secuencia de la primera a la séptima cisteína canónica. Esta secuencia de persefina humana es de cisteína 66 a cisteína 154 como se muestra en ID SEC N°:223. La secuencia comparable para persefina murina es de cisteína 1 a cisteína 87 (ID SEC N°:79) y la de persefina de rata de cisteína 1 a cisteína 87 (identificada como ID SEC N°:82). Por tanto, dentro del alcance de las proteínas de persefina de la presente invención están secuencias de aminoácidos que contienen ID SEC N°:217 a ID SEC N°:221 o ID SEC N°:223 y moléculas de ácidos nucleicos que contienen secuencias que codifican estas secuencias de aminoácidos.
La presente invención también engloba moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias que codifican persefina de ratón, de rata y humana (figura 8). Dentro del alcance de esta invención también están incluidas las secuencias que son sustancialmente las mismas que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican persefina. Tales secuencias sustancialmente las mismas pueden estar sustituidas, por ejemplo con codones más fácilmente expresados en un célula huésped dada tal como E. coli según procesos bien conocidos y habituales. Tales secuencias de ácidos nucleicos modificadas están incluidas dentro del alcance de esta invención.
Las secuencias de ácidos nucleicos específicas pueden modificarse por aquellos expertos en la materia y, por tanto, todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos de pre-pro persefina o la pre-región o la pro-región de persefina pueden modificarse así de la misma manera. La presente invención también incluye secuencia de ácidos nucleicos que tiene una o más sustituciones, deleciones o adiciones, en la que la secuencia de ácidos nucleicos se hibridará con secuencias de ácidos nucleicos de persefina -o complemento de la misma, cuando corresponda.
La hibridación específica se define en este documento como la formación de híbridos entre un polinucleótido (por ejemplo un polinucleótido de persefina que puede incluir una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones) y un polinucleótido de referencia específico (por ejemplo polinucleótidos que codifican persefina madura y que tienen las secuencias de ID SEC N°:183, 184, 194, 195, 199, 200, 201 ó 202), en las que el polinucleótido hibrida de manera preferente al polinucleótido de referencia específico. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una persefina madura hibridará específicamente a un polinucleótido de persefina de referencia (por ejemplo ID SEC N°:183, 184, 194, 195, 199, 200, 201 ó 202) y no a un polinucleótido de neurturina de referencia (por ejemplo ID SEC N°:9 ó 10 o secuencias complementarias a ella). La hibridación específica se hace preferentemente bajo altas condiciones de astringencia, que es bien entendido por aquellos expertos en la materia, para determinarse mediante varios factores durante la hibridación y durante el proceso de lavado, incluyendo temperatura, fuerza iónica, extensión del tiempo y concentración de formamida (véase por ejemplo, Sambrook y col., 1989, antes mencionado).
La presente invención también incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen actividad promotora de la supervivencia o el crecimiento y que se reconocen mediante anticuerpos que se unen a persefina.
La presente invención también engloba vectores que comprenden un elemento regulador de la expresión unido de manera factible a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance de la invención. Esta invención también incluye células huésped - de cualquier variedad- que se han transformado con tales vectores.
En este documento también se proporcionan procedimientos para producir persefina. La preparación puede ser mediante aislamiento de medio condicionado de una variedad de tipos de células mientras que el tipo de célula produzca persefina. Un segundo procedimiento y preferido implica la utilización de procedimientos recombinantes mediante aislamiento de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica persefina, clonación de la secuencia junto con secuencias reguladoras apropiadas en vectores y tipos de células adecuados y expresión de la secuencia para producir persefina.
Se ha identificado una familia de genes de mamíferos comprendida por cuatro factores neurotróficos, incluyendo factor de crecimiento nervioso (NGF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDGF), neurotrofina-3 (NT-3), y neurotrofina-4/5 (NT-4/5). Estos factores comparten aproximadamente el 60 por ciento de homología de secuencias de ácidos nucleicos (Tuszynski y Gage, Ann Neurol 35:S9-S12, 1994). La proteína de persefina y la proteína de neurturina no exhiben homología significativa a la familia NGF de factores neurotróficos. Bien la persefina o bien la neurturina comparten menos de aproximadamente el 20% de homología con la superfamilia TGF-\beta de factores de crecimiento. Sin embargo, ambos persefina y neurturina muestran aproximadamente el 40% de identidad de secuencia con GDNF y aproximadamente el 50% de identidad de secuencia con cada una. En particular, las posiciones de los siete residuos de cisteína presentes en persefina, neurturina y GDNF están casi exactamente conservadas. Los inventores en este documento creen que pueden existir otros genes no identificados que codifican proteínas que tienen homología de secuencias de aminoácidos sustancial a persefina, neurturina y GDNF y que funcionan como factores de crecimiento selectivos para los mismos tejidos o diferentes y las mismas actividades biológicas o diferentes y pueden actuar en los mismos receptores o diferentes. De la activación preferencial de diferentes receptores mediante diferentes miembros de familias podría resultar un espectro diferente de actividad con respecto a tejidos afectados y/o obtenidos de respuesta, como se conoce que se produce con miembros de la familia NGF de factores neurotróficos (Tuszynski y Gage, 1994, antes mencionado).
Como consecuencia de miembros de una familia de genes particular que muestra conservación sustancial de secuencia de aminoácidos entre los productos de proteínas de los miembros de familias, hay una conservación considerable de secuencias en el nivel de ADN. Esto forma la base de una nueva aproximación para identificar otros miembros de la familia de genes a la que pertenece GDNF, neurturina y persefina. El procedimiento usado para tal identificación es la hibridación cruzada usando sondas de ácidos nucleicos derivadas de un miembro de familia para formar una molécula dúplex de híbrido estable con secuencia de ácidos nucleicos de diferentes miembros de la familia de genes o para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos de diferentes miembros de familias. (Véase por ejemplo, Kaisho y col. FEBS Letters 266:187-191, 1990). La secuencia del miembro de familia diferente puede no ser idéntica a la sonda, pero sin embargo estará suficientemente relacionada con la secuencia de sonda para hibridar con la sonda. Alternativamente puede usarse PCR que usa cebadores de un miembro de familia para identificar miembros de familias adicionales.
Las aproximaciones anteriores no han tenido éxito hasta el momento en identificar otros miembros de familias de genes debido a que sólo se conocía un miembro de familia, GDNF. Sin embargo, con la identificación de neurturina en la solicitud pendiente de tramitación de número de serie 08/519.777, se hicieron nuevas sondas y cebadores únicos que contenían secuencias de las regiones conservadas de esta familia de genes. También se encontraron las mismas regiones conservadas en el tercer miembro de familia, persefina. En particular se han identificado tres regiones conservadas en este documento que pueden usarse como una base para construir nuevas sondas y cebadores. Las nuevas sondas y cebadores puestas a disposición del trabajo con neurturina y persefina hacen posible esta nueva aproximación poderosa que ahora puede identificar con éxito otros miembros de familias de genes. Usando esta nueva aproximación se pueden rastrear genes relacionados a GDNF, neurturina y persefina en homología de secuencias mediante preparación de sondas de ADN o ARN basadas en las regiones conservadas en las moléculas de GDNF y neurturina. Por tanto, una realización de la presente invención comprende sondas y cebadores que son únicos para o derivados de una secuencia de nucleótidos que codifican tales regiones conservadas y un procedimiento para identificar más miembros de la familia de genes de neurturina-persefina-GDNF.
Las secuencias de aminoácidos de regiones conservadas se han identificado en este documento para incluir Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, en la que Xaa_{1} es Ser, Thr o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:108); Glu-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{4}-Gly-Xaa_{5}-Cys en la que Xaa^{1} es Thr, Glu o Lys, Xaa_{2} es Val, Leu o Ile, Xaa_{3} es Leu o Ile, Xaa_{4} es Ala o Ser, y Xaa_{5} es Ala o Ser, (ID SEC N°:113); y Cys-Cys-Xaa_{1}-Pro-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Asp-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Phe-Leu-Asp-Xaa_{9} en la que Xaa_{1} es Arg o Gln, Xaa_{2} es Thr o Val o Ile, Xaa_{3} es Ala o Ser, Xaa_{4} es Tyr o Phe, Xaa_{5} es Glu, Asp o Ala, Xaa_{6} es Glu, Asp o no aminoácido, Xaa_{7} es Val o Leu, Xaa_{8} es Ser o Thr, y Xaa_{9} es Asp o Val (ID SEC N°:114). Las secuencias de nucleótidos que contienen una secuencia codificante para las secuencias anteriormente conservadas o fragmentos de las secuencias anteriormente conservadas pueden usarse como sondas. A modo de ejemplo, secuencias de sondas y cebadores que codifican secuencias de aminoácidos y ID SEC N°:125-129; cebadores cuyas secuencias complementarias inversas codifican secuencias de aminoácidos ID SEC N°:126, ID SEC N°:127, ID SEC N°:130; y, en particular, secuencias de nucleótidos, ID SEC N°:115-124. Cebadores adicionales basados en GDNF y neurturina incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos, ID SEC N°:33, ID SEC N°:36, ID SEC N°:40 y ID SEC N°:41; cebadores cuyas secuencias complementarias inversas codifican ID SEC N°:37, ID SEC N°:38 y ID SEC N° 39; y, en particular, secuencias de ácidos nucleicos, ID SEC N°:42-48.
La hibridación usando las nuevas sondas de regiones conservadas de las secuencias de ácidos nucleicos se realizaría bajo condiciones de astringencia reducidas. Los factores implicados en determinar las condiciones de astringencia son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook y col., Molecular Cloning. 2ª edición, 1989). Las fuentes de ácido nucleico para el rastreo incluirían bibliotecas de ADN genómico de especies de mamíferos o bibliotecas de ADNc construidas usando ARN obtenido de células de mamíferos donadas en cualquier vector adecuado.
Los cebadores de PCR se utilizarían bajo condiciones de PCR de temperatura de hibridación reducida que permitiría la amplificación de secuencias de miembros de familias de genes distintos de GDNF, neurturina y persefina. Las fuentes de ácido nucleico para el rastreo incluirían bibliotecas de ADN genómico de especies de mamíferos donados en cualquier vector adecuado, ADNc transcrito de ARN obtenido de células de mamíferos y ADN genómico de especies de mamíferos.
Las secuencias de ADN identificadas partiendo de la base de que la hibridación o ensayos de PCR se secuenciarían y se compararían con GDNF, neurturina y persefina. Las secuencias de ADN que codifican toda la secuencia del factor novedoso se obtendrían entonces del mismo modo que se describe en este documento. El ADN genómico o las bibliotecas de clones genómicos también pueden usarse como moldes debido a que las estructuras de intrón/exón de GDNF y neurturina se conservan y las secuencias codificantes de las proteínas maduras no se interrumpen por intrones.
Usando esta aproximación como se describe anteriormente, se han usado los cebadores diseñados de las regiones conservadas de neurturina y GDNF para identificar y obtener la secuencia del nuevo miembro de familia descrito en este documento, persefina. Los cebadores degenerados diseñados persefina, neurturina y GDNF pueden usarse además para identificar y obtener miembros de familias adicionales.
Se cree que todos los miembros de familia de GDNF-neurturina-persefina tendrán un alto grado de identidad de secuencia con una o más de las tres regiones consenso de miembros de familia identificadas en la parte de la secuencia entre la primera y la séptima cisteína de estructura canónica. En particular, se anticipa un nuevo miembro de familia que tiene al menos un 62,5% de identidad con el octapéptido de región consenso, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr en el que Xaa_{1} es Ser, Thr o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:108) o al menos un 62,5 de identidad de secuencia en tanto por ciento con el octapéptido de región consenso, Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys en el que Xaa_{1} y Xaa_{2} son alanina o serina (ID SEC N°:109) o al menos un 50 de identidad de secuencia en tanto por ciento con el octapéptido de región consenso, Asp-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Asp-Xaa_{4} en el que Xaa_{1} es ácido aspártico o ácido glutámico o ho-aminoácido, Xaa_{2} es valina o leucina, Xaa_{3} es serina o treonina; y Xaa_{4} es valina o ácido aspártico (ID SEC N°:110). Los inventores en este documento creyeron que cualquier nuevo miembro de familia tendría 28 aminoácidos en la secuencia alineada entre el primer y el séptimo residuo de cisteína de estructura canónica como se expone en figura la 15, siendo los residuos numerados desde el extremo N-terminal de la secuencia alineada del miembro de familia (1) Cys, (3) Leu, (10) Val, (13) Leu, (14) Gly, (15) Leu, (16) Gly, (17) Tyr, (21) Glu, (25) Phe, (26) Arg, (27) Tyr, (28) Cys, (30) Gly, (32) Cys, (44) Leu, (47) Leu, (58) Cys, (59) Cys (61) Pro, (66) Asp, (69) Phe, (70) Leu, (71) Asp, (83) Ser, (84) Ala, (87) Cys, y (89) Cys, sin embargo, es posible que pueda haber tantos como tres desapareamientos.
Partiendo de la base de que las similitudes estructurales de persefina respecto a secuencias thp de neurturina y GDNF, sería de esperar que la persefina promoviera la supervivencia y el crecimiento de células neuronales, además de no neuronales. Por ejemplo, se ha mostrado que la neurturina promueve la supervivencia de las células del ganglio cervical superior, además de neuronas de los ganglios sensoriales nodosos (véanse ejemplos 1-3). Además, se ha mostrado que el GDNF actúa en neuronas dopaminérgicas, simpáticas, motoras y varias sensoriales (Henderson y col., antes mencionado, 1994; Miles y col., J Cell Biol 130:137-148, 1995; Yan y col., Nature 373:341-344, 1995; Lin y col., Science 260:1130-1132, 1993; Trupp y col., J Cell Biol 130:137-148, 1995; Martin y col. Brain Res 683:172-178, 1995; Bowenkamp y col. J Comp Neurol 355:479-489, 1995). Además, todos los otros factores de crecimiento aislados hasta la fecha han mostrado que actúan en muchos tipos diferentes de células (por ejemplo véase Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1005; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25:1418-1435, 1994). Por tanto, es probable que la persefina mostrará actividad en una variedad de diferentes células neurona!, tanto periféricas como centrales, además de en células no neuronales. Con respecto a las células neuronales periféricas, el perfil de células para las que la persefina mostrará una actividad promotora de la supervivencia parece ser diferente del de la neurturina o GDNF. A diferencia de la actividad promotora de la supervivencia producida mediante neurturina y GDNF en neuronas simpáticas y sensoriales, la persefina no mostró actividad en estos tejidos a las concentraciones probadas. Sin embargo, la persefina mostró actividad promotora de la supervivencia en células mesencefálicas obtenidas de cerebros de embriones de rata. Además, la actividad de persefina en cualquier tipo de célula diana particular puede determinarse mediante experimentación rutinaria usando modelos de referencia habituales. Además, los inventores en este documento han identificado tejidos cerebrales y cardiacos como tejidos que expresan persefina, que además apoya la conclusión de que la persefina puede actuar para promover la supervivencia y el crecimiento en una variedad de células neuronales y no neuronales.
Como un ejemplo de las acciones de factores neurotróficos en tejidos no neuronales, el factor neurotrófico prototípico, NGF, también actúa en mastocitos para aumentar su número cuando se inyecta en ratas recién nacidas (Aloe, J Neuroinmunol 18:1-12, 1988). Además, los mastocitos expresan el receptor trk y responden al NGF tal que el NGF es un secretagodo de mastocitos y factor promotor de la supervivencia (Horigome y col., J Biol Chem 269:2695-2707, 1994). Además, los miembros de la superfamilia TGF-\beta actúan en muchos tipos de células de diferente función y origen embriológico.
Los inventores en este documento han identificado el cerebro y el corazón como tejidos en los que se expresa la persefina y además se cree que la persefina se expresa en varios otros tejidos neuronales y no neuronales. El miembro de familia relacionado, neurturina, se expresa en varios tejidos no neuronales incluyendo sangre, médula ósea, hígado neonatal y mastocitos. Esto sugiere un papel para la neurturina en hematopoyesis, inflamación, alergia y cardiopatía. Similarmente, la persefina también puede tener un perfil similar de actividad.
Se piensa que los factores neurotróficos de la familia NGF actúan mediante receptores de alta afinidad específicos para factores (Tuszynski y Gage, 1994, antes mencionado). Sólo se requieren las partes particulares de la proteína que actúa en un sitio receptor para unirse al receptor. Tales partes particulares o fragmentos diferenciados pueden servir como un agonista, en el que la sustancia activa un receptor de persefina para obtener la acción promotora en la supervivencia y el crecimiento celular y los antagonistas para persefina a los que se unen, pero no activan el receptor o promueven la supervivencia y el crecimiento. Tales partes o fragmentos que son agonistas y aquellos que son antagonistas también están dentro del alcance de la presente invención.
Los factores de crecimiento pan sintéticos también pueden construirse combinando los dominios activos de persefina con los dominios activos de uno o más de otros factores de crecimiento de no persefina. (Por ejemplo, véase llag y col., Proc Nat'l Acad Sci 92:607-611, 1995). Sería de esperar que estos factores de crecimiento pan tuvieran las actividades combinadas u otras propiedades ventajosas de persefina y una o más de otros factores de crecimiento. Como tales, se cree que estos factores de crecimiento pan son potentes factores de crecimiento y multiespecíficos que son útiles en el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades y estados degenerativos, incluyendo estados que pueden tratarse mediante cualquier factor principal o todos de los que se obtuvieron los dominios activos. Tales factores de crecimiento pan también podrían proporcionan efectos sinérgicos más allá de las actividades de los factores principales (Barres y col., antes mencionado).
Los factores de crecimiento pan pueden incluir polipéptidos quiméricos o híbridos que están construidos de partes de fragmentos de al menos dos factores de crecimiento. Los factores de crecimiento de la superfamilia TGF-\beta están estructuralmente relacionados, teniendo marcas de secuencias sumamente conservadas por las que se identifican los miembros de familias. En particular, siete residuos de cisteína de estructura canónica son casi invariables en miembros de la superfamilia (Kingsley, Genes & Dev 8:133-146, 1994) (véase la figura 1B). Por tanto, las moléculas de polipéptidos quiméricos pueden construirse de una secuencia que es sustancialmente idéntica a una parte de la molécula de persefina, hasta uno o más puntos de entrecruzamiento, y una o más secuencias, cada una de las cuales es sustancialmente idéntica con una parte de otro miembro de la superfamilia TGF-\beta que se extiende en la otra parte de uno o más puntos de entrecruzamiento correspondientes. Por ejemplo, una parte del extremo terminal amino del polipéptido de persefina puede combinarse con una parte del extremo terminal carboxi de un polipéptido de neurturina o alternativamente una parte del extremo terminal amino de un polipéptido de neurturina puede combinarse con una parte del extremo terminal carboxi de un polipéptido de persefina. Tales partes de polipéptidos de persefina o neurturina son preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 95, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 90, todavía más preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 y lo más preferentemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 aminoácidos contiguos y tales partes de otro, no persefina o, como puede ser el caso, miembro de la superfamilia TGF-\beta de no neurturina están preferentemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 95, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 90, todavía más preferentemente de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 y los más preferentemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 aminoácidos contiguos. Por ejemplo, un punto de entrecruzamiento particular puede estar entre el tercer y el cuarto residuo de cisteína de estructura canónica. Una construcción tal a modo de ejemplo contendría en el extremo 5' una secuencia comprendida por una secuencia de persefina del residuo 1 al tercer residuo de cisteína de estructura canónica 37 y hasta un punto de entrecruzamiento en algún lugar entre el residuo 37 y el residuo 63, pero no incluyendo el cuarto residuo de cisteína de estructura canónica 64 (para referencia, véase persefina madura, ID SEC N°:80). El extremo 3' de la construcción híbrida constituiría una secuencia derivada de otro miembro de la superfamilia TGF-\beta tal como, por ejemplo, neurturina que es otro miembro de la superfamilia TGF-\beta que está estrechamente relacionada con persefina. Usando neurturina como el otro miembro de la familia TGF-\beta, la construcción híbrida estaría comprendida más allá del punto de entrecruzamiento por una secuencia que empieza en el punto de entrecruzamiento deseado en la secuencia de neurturina entre el tercer residuo de cisteína de estructura canónica 37 y el cuarto residuo de cisteína de estructura canónica 67 de neurturina y que continua por el residuo 100 en el extremo 3' de neurturina. Una segunda construcción híbrida a modo de ejemplo estaría comprendida por el residuo 1 por un punto de entrecruzamiento entre los residuos 37 y 67 de neurturina contiguamente unidos con residuos del punto de entrecruzamiento entre residuos 37 y 64 por el residuo 96 de persefina. Las construcciones anteriores con persefina y neurturina sólo se pretenden como ejemplos con el miembro particular de la familia TGF-\beta que se selecciona de miembros de familias que incluyen, pero no se limitan al, factor de crecimiento \beta1 transformante (TGF\beta1), factor de crecimiento \beta2 transformante (TGF\beta2), factor de crecimiento \beta3 transformante (TGF\beta3), inhibina \betaA (INH\betaA), inhibina B B (INHBB), el gen nodal (NODAL), proteínas morfogenéticas óseas 2 y 4 (BMP2 y BMP4), el gen de la Drosophila decapentaplegic (dpp), proteínas morfogenéticas óseas 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 y BMP8), la familia de genes de la Drosophila 60A (60A), proteína morfogenética ósea 3 (BMP3), el gen vg1, factores de diferenciación en el crecimiento 1 y 3 (GDF1 y GDF3), dorsalina (drsln), inhibina a (INHa), el gen MIS (MIS), factor de crecimiento 9 (GDF-9), factor de crecimiento neurotrófico derivado de la glía (GDNF), neurturina (NTN) y persefina. Además, el punto de entrecruzamiento puede ser cualquier residuo entre la primera y la séptima molécula de cisteína de estructura canónica de neurturina y el otro miembro particular de familia. Además, pueden usarse puntos de entrecruzamiento adicionales para incorporar cualquier número de partes de persefina deseada o fragmentos con partes o fragmentos de uno cualquiera o más de otros miembros de familias.
En la construcción de una molécula quimérica particular, las partes de persefina y las partes del otro factor de crecimiento de no persefina se amplifican usando PCR, se mezclan y se usan como molde para una reacción de PCR usando el cebador directo de una y el cebador inverso de las otras dos partes de componentes de la molécula quimérica. Por tanto, por ejemplo, un cebador directo e inverso se selecciona para amplificar la parte de persefina desde el principio hasta el punto de entrecruzamiento seleccionado entre el tercer y el cuarto residuo de cisteína canónico usando un plásmido de persefina como molde. Entonces, un cebador directo con una parte en 5' que solapa con la secuencia de persefina y un cebador inverso se usan para amplificar la parte del otro miembro del factor de crecimiento de no persefina de la superfamilia TGF-\beta desde el punto de entrecruzamiento correspondiente al extremo 3' usando un molde de plásmido que contiene la secuencia codificante para el miembro de la familia TGF-\beta de no persefina. Los productos de las dos reacciones PCR se purifican en gel y se mezclan juntos y se realiza una reacción de PCR. Usando una alícuota de esta reacción como molde se realiza una reacción de PCR usando el cebador directo y el cebador inverso de persefina para el factor de crecimiento de no persefina. Entonces, el producto se clona en un vector de expresión para la producción de la molécula quimérica.
Sería de esperar que los factores de crecimiento quiméricos fueran eficaces en la promoción del crecimiento y el desarrollo de células y para uso en evitar atrofia, degeneración o muerte de células, particular en neuronas. Los polipéptidos quiméricos también pueden actúan como antagonistas receptores de uno o ambos de los factores de crecimiento de longitud total de los que se construyó el polipéptido quimérico o como un antagonista de cualquier otro factor de crecimiento que actúa en el mismo receptor o receptores.
La presente invención también incluye composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden persefina en una cantidad eficaz para tratar pacientes con degeneración celular o disfunción y persefina para uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal. Pueden tratarse varias enfermedades degenerativas usando persefina y las composiciones expuestas anteriormente. Cuando la degeneración celular implica degeneración neuronal, las enfermedades incluyen, pero no se limitan a, neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral aguda, lesión medular aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple, traumatismo o lesión nerviosa periférica, exposición a neurotoxinas, enfermedades metabólicas tales como diabetes o disfunciones renales y lesión causada por agentes infecciosos. En particular, la capacidad de la persefina para promover la supervivencia en células mesencefálicas sugiere una aplicabilidad de este factor de crecimiento en el tratamiento de enfermedades degenerativas neuronales del SNC tales como la enfermedad de Parkinson.
Cuando la degeneración celular implica degeneración de las células de la médula ósea, las enfermedades incluyen, pero no se limitan a, trastornos de células sanguíneas insuficientes tales como, por ejemplo, leucopenias incluyendo eosinopenia y/o basopenia, linfopenia, monocitopenia, neutropenia, anemia, trombocitopenia, además de una insuficiencia de células madre para cualquiera de las anteriores. La degeneración celular también puede implicar células del músculo miocárdico en enfermedades tales como cardiomiopatía e insuficiencia cardiaca congestiva. Las células y tejidos anteriores también pueden tratarse para función deprimida.
La persefina y las composiciones en este documento también pueden ser útiles para evitar degeneración y/o también promover la supervivencia en otros tejidos no neuronales. Usando una variedad de ensayos conocidos en la técnica para identificar, un experto en la materia puede determinar fácilmente si la persefina sería útil en la promoción de la supervivencia o funcionamiento en un tipo de célula particular.
En ciertas circunstancias puede ser deseable modular o reducir la cantidad de persefina expresada. Por tanto, en otro aspecto de la presente invención se proporcionan oligonucleótidos antisentido de persefina para uso en la disminución del nivel de expresión de persefina por una célula mediante la administración de uno o más oligonucleótidos antisentido de persefina. Mediante los oligonucleótidos antisentido de persefina se hace referencia a oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que interactúa mediante apareamiento de bases con una secuencia de ácidos nucleicos complementaria específica implicada en la expresión de persefina tal que se reduce la expresión de persefina. Preferentemente, la secuencia de ácidos nucleicos específica implicada en la expresión de persefina es una molécula de ADN genómico o molécula de ARNm que contiene secuencias del gen de persefina. Esta molécula de ADN genómico puede comprender regiones flanqueantes del gen de persefina, regiones no traducidas de ARNm de persefina, las partes pre- o pro del gen de persefina o la secuencia codificante para la proteína de persefina madura. El término complementario a una secuencia de nucleótidos en el contexto de oligonucleótidos antisentido de persefina y procedimientos para los mismos significa suficientemente complementario a tales como para permitir la hibridación a esa secuencia en una célula, es decir, bajo estados fisiológicos. Los oligonucleótidos antisentido de persefina comprenden preferentemente una secuencia que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 100 nucleótidos y más preferentemente los oligonucleótidos antisentido de persefina comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido de persefina también pueden contener una variedad de modificaciones que confieren resistencia a la degradación nucleolítica, tales como, por ejemplo, enlaces internucleosídicos modificados (Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543-548, 1990; Schneider y Banner, Tetrahedron Lett 31:335, 1990), bases de ácidos nucleicos y/o azúcares modificados y similares.
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier vía adecuada conocida en la técnica, incluyendo por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intratecal o intracerebral. La administración puede ser o bien rápida, como por inyección, o bien durante un periodo de tiempo, como mediante infusión lenta o administración de formulación de liberación controlada. Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administración puede ser mediante inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo (CSF). Si se pretende que la persefina se administre a células en el sistema nervioso central, la administración puede ser con uno o más agentes que puedan promover la penetración de persefina a través de la barrera hematoencefálica.
La persefina también puede estar unida o conjugada con agentes que proporcionan propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Por ejemplo, la persefina puede estar acoplada a cualquier sustancia conocida en la técnica que promueva la penetración o el transporte a través de la barrera hematoencefálica, tal como un anticuerpo para el receptor de transferrina, y administrarse mediante inyección intravenosa. (véase por ejemplo, Friden y col., Science 259:373-377, 1993). Además, la persefina puede estar establemente unida a un polímero, tal como polietilenglicol, para obtener propiedades deseables de solubilidad, estabilidad, semivida y otras propiedades farmacéuticamente ventajosas. (véase por ejemplo Davis y col. Enzyme Eng 4:169-73, 1978; Burnham, Am J Hosp Pharm 51:210-218, 1994).
Las composiciones se emplean normalmente en forma de preparaciones farmacéuticas. Tales preparaciones están hechas de un modo bien conocido en la técnica farmacéutica. Una preparación preferida utiliza un vehículo de solución salina fisiológica, pero se contempla que también pueden usarse otros vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como concentraciones fisiológicas de otras sales no tóxicas, cinco por ciento de disolución acuosa de glucosa, agua estéril o similares. También puede ser deseable que un tampón adecuado esté presente en la composición. Si se desea, tales disoluciones pueden liofilizarse y almacenarse en una ampolla estéril lista para reconstitución mediante la adición de agua estéril lista para inyección. El disolvente primario puede ser acuoso o alternativamente no acuoso. La persefina también puede incorporarse en una matriz sólida o semisólida biológicamente compatible que puede implantarse en tejidos que necesitan tratamiento.
El vehículo también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución u olor de la formulación. Similarmente, el vehículo todavía puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la liberación o absorción o penetración a través de la barrera hematoencefálica. Tales excipientes son aquellas sustancias normalmente y habitualmente empleadas para formular dosificaciones para administración parenteral en o bien formas de dosis unitaria o bien de multi dosis o bien para infusión directa en el líquido cefalorraquídeo mediante infusión continua o periódica.
La administración de dosis puede repetirse dependiendo de los parámetros farmacocinéticos de la formulación de dosificación y la vía de administración usada.
También se contempla que ciertas formulaciones que contienen persefina se administren oralmente. Tales formulaciones están preferentemente encapsuladas y formuladas con vehículos adecuados en formas farmacéuticas sólidas. Algunos ejemplos de vehículos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, gelatina, jarabe, metilcelulosa, metil- y propilhidroxibenzoatos, talco, magnesio, estearato, agua, aceite mineral y similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes aromatizantes. Las composiciones pueden formularse de manera que proporcionen una liberación rápida, sostenida o retardada de los principios activos después de la administración al paciente mediante empleo de procesos bien conocidos en la técnica. Las formulaciones también pueden contener sustancias que disminuyen la degradación proteolítica y promueven la absorción, tales como por ejemplo, agentes tensioactivos.
La dosis específica se calcula según el peso corporal aproximado o área superficial corporal del paciente o el volumen del espacio del cuerpo que va a ocupar. La dosis también se calculará dependiendo de la vía particular de administración seleccionada. Otra mejora de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento se realiza rutinariamente mediante aquellos expertos habituales en la materia. Un experto en la materia puede hacer tales cálculos sin demasiada experimentación en vista de la actividad de la persefina. En este documento se describe la actividad de neurturina en datos de células diana y en la solicitud pendiente de tramitación de número de serie 08/519.777 y se cree que la concentración de persefina requerida para la actividad en el nivel celular es similar a la de neurturina. En el ejemplo 17 de más adelante se informa de la actividad de persefina en células mesencefálicas. La actividad de persefina en un tipo de célula diana particular puede determinarse mediante experimentación rutinaria. Las dosificaciones exactas se determinan conjuntamente con estudios habituales de dosis-respuesta. Se entenderá que la cantidad de la composición actualmente administrada será determinada por un profesional en vista de las circunstancias relevantes, incluyendo el estado o estados que van a tratarse, la elección de la composición que va a administrarse, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y la vía de administración elegida.
La persefina de esta invención pueden administrarse terapéuticamente mediante la implantación en pacientes de vectores o células transformadas que pueden producir una forma biológicamente activa de persefina o un precursor de persefina, es decir, una molécula que puede convertirse fácilmente en una forma biológica activa de persefina por el cuerpo. En una aproximación, las células que secretan persefina pueden encapsularse en membranas semipermeables para la implantación en un paciente. Las células puede ser células que normalmente expresan persefina o un precursor de persefina o las células pueden transformarse para expresar persefina o un precursor de la misma. Se prefiere que la célula sea de origen humano y que la persefina sea persefina humana cuando el paciente es un ser humano. Sin embargo, las formulaciones y procedimientos en este documento pueden usarse para aplicaciones veterinarias, además de humanas, y se pretende que el término "paciente" tal como se usa en este documento incluya pacientes humanos y veterinarios.
Las células pueden hacerse crecer ex vivo para uso en transplante o injerto en pacientes (Muench y col., Leuk & Mentemph 16:1-11, 1994). En otra realización de la presente invención, la persefina puede usarse para promover la expansión ex vivo de células para transplante o injerto. Los procedimientos actuales han usado sistemas de cultivo en biorreactor que contienen factores tales como eritropoyetina, factores estimuladores de colonias, factor de células madre e interleucinas para expandir células progenitoras hematopoyéticas para eritrocitos, monocitos, neutrófilos y linfocitos (Verfaillie, Stem Cells 12:466-476, 1994). Estas células madre pueden aislarse de la médula de donantes humanos, de sangre periférica humana o de células sanguíneas del cordón umbilical. Las células sanguíneas expandidas se usan para tratar pacientes que carecen de estas células como resultado de estados específicos de enfermedad o como resultado de altas dosis de quimioterapia para el tratamiento de tumores malignos (George, Stem Cells 12(suplemento 1):249-255, 1994). En el caso de transplante de células después de la quimioterapia, los trasplantes autólogos puede realizarse mediante eliminación de células de médula ósea antes de la quimioterapia, expansión de las células ex vivo usando procedimientos que también funcionan para purgar células malignas y trasplante de nuevo de las células expandidas en el paciente tras la quimioterapia (para revisión véase Rummel y Van Zant, J Hematotherapy 3:213-218, 1994). Desde que la persefina y el factor de crecimiento relacionado, neurturina, pueden expresarse en el animal en desarrollo en tejidos particulares en los que se produce la proliferación y la diferenciación de células progenitoras, se cree que la persefina puede funcionar para regular la proliferación de células madre hematopoyéticas y la diferenciación de células hematopoyéticas maduras. Por tanto, la adición de persefina a sistemas de cultivo usados para la expansión ex vivo de células podría estimular la velocidad a la que se multiplican o diferencian ciertas poblaciones de células y mejorar la eficacia de estos sistemas de expansión para generar células necesarias para el trasplante.
También se cree que la persefina puede usarse en el sistema nervioso para la expansión ex vivo de células precursoras. Actualmente se está examinando el trasplante o injerto de células como un tratamiento para enfermedades en las que se pierden ciertas poblaciones de neuronas debido a degeneración tales como, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson (Bjorklund, Curr Opin Neurobiol 2:683-689, 1992). Las células precursoras neuronales pueden obtenerse de donantes animales o humanos o de tejido fetal humano y entonces expandirse en cultivo usando persefina. Entonces, estas células pueden injertarse en pacientes en los que funcionarían para reemplazar algunas de las células perdidas debido a degeneración. Debido a que las neurotrofinas han mostrado que pueden estimular la supervivencia y proliferación de células de precursores neuronales tales como, por ejemplo, estimulación de NT-3 de células de neuroblastos simpáticos (Birren y col., Develop 119:597-610, 1993), la persefina también podría funcionar de manera similar durante el desarrollo del sistema nervioso y podría ser útil en la expansión ex vivo de células
neuronales.
En varias circunstancias sería deseable determinar los niveles de persefina en un paciente. La identificación de persefina, junto con la presente notificación de que la persefina se expresa mediante ciertos tejidos, proporciona la base para la conclusión de que la presencia de persefina sirve a una función fisiológica normal relacionada con el crecimiento y la supervivencia celular. De hecho, se sabe que otros factores neurotróficos desempeñan un papel en la función de tejidos neuronales y no neuronales. (para revisión véase Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Otten y Gadient, Int J Devl Neurosciences 13:147-151, 1995). La persefina producida endógenamente también puede desempeñar un papel en ciertos estados de enfermedad, particularmente en los que hay degeneración celular, tales como en estados o enfermedades neurodegenerativas. Se sabe que otros factores neurotróficos cambian durante los estados de enfermedad. Por ejemplo, en la esclerosis múltiple, los niveles de proteína de NGF en el líquido cefalorraquídeo aumentan durante fases agudas de la enfermedad (Bracci-Laudiero y col., Neuroscience Lett 147:9-12, 1992) y en lupus eritematoso sistemático hay una correlación entre los episodios inflamatorios y los niveles de NGF en suero (Bracci-Laudiero y col. NeuroReport 4:563-565, 1993).
Dado que la persefina se expresa en ciertos tejidos, por tanto es probable que el nivel de persefina pueda alterarse en una variedad de estados y que la cuantificación de niveles de persefina proporcionaría información clínicamente útil. Además, las composiciones que contienen persefina pueden administrarse en el tratamiento de estados degenerativos y posiblemente sería deseable conseguir ciertos niveles diana de persefina en suero, en líquido cefalorraquídeo o en cualquier compartimento de tejido deseado. Por tanto, sería ventajoso poder monitorizar los niveles de persefina en un paciente. Por consiguiente, la presente invención también proporciona procedimientos para detectar la presencia de persefina en una muestra de un paciente.
El término "detección", como se usa en este documento en el contexto de detectar la presencia de persefina en un paciente, pretende incluir la determinación de la cantidad de persefina o la capacidad para expresar una cantidad de persefina en un paciente, la distinción de persefina de otros factores de crecimiento, la estimación de pronósticos en términos de consecuencias probables de una enfermedad degenerativa y perspectiva de recuperación, la monitorización de los niveles de persefina durante un periodo de tiempo como una medida de la situación del estado y la monitorización de niveles de persefina para determinar una pauta posológica terapéutica preferida para el paciente.
Para detectar la presencia de persefina en un paciente se obtiene una muestra del paciente. La muestra puede ser una muestra de biopsia de tejido o una muestra de sangre, plasma, suero, CSF o similares. La persefina se expresa en tejidos renales y cerebrales como se muestra en el ejemplo 18 y se cree que la persefina también se expresa en otros tejidos no probados. Las muestras para detectar la persefina pueden tomarse de cualquier tejido que exprese persefina. Cuando se calculan los niveles periféricos de persefina, se prefiere que la muestra sea una muestra de sangre, plasma o suero o alternativamente de una muestra de biopsia de tejido. Cuando se calculan los niveles de persefina en el sistema nervioso central, una muestra preferida es una muestra obtenida de líquido cefalorraquídeo.
En algunos ejemplos es deseable determinar si el gen de persefina está intacto en el paciente o en un tejido o línea celular dentro del paciente. Mediante un gen de persefina intacto se pretende que no haya alteraciones en el gen tales como mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, rotura cromosómica, redisposiciones cromosómicas y similares, en el que tal alteración pueda alterar la producción de persefina o alterar su actividad biológica, estabilidad o similares para conducir a procesos de enfermedades o susceptibilidad a estados degenerativos celulares. A la inversa, mediante un gen de persefina no intacto se pretende que estén presentes tales alteraciones. Por tanto, en una realización de la presente invención se proporciona un procedimiento para detectar y caracterizar cualquier alteración en el gen de persefina. El procedimiento comprende proporcionar un oligonucleótido que contiene el ADNc, ADN genómico de persefina o un fragmento del mismo o un derivado del mismo. Mediante un derivado de un oligonucleótido se pretende que el oligonucleótido derivado sea sustancialmente el mismo que la secuencia de la que deriva ya que la secuencia derivada tiene suficiente complementariedad de secuencia a la secuencia de la que se deriva para hibridar al gen de persefina. La secuencia de nucleótidos derivada no está necesariamente derivada físicamente de la secuencia de nucleótidos, pero de cualquier modo pueden generarse incluyendo, por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o transcripción inversa o transcripción.
Normalmente, el ADN genómico del paciente se aisla de una muestra de células del paciente y se digiere con una o más endonucleasas de restricción tales como, por ejemplo, Taql y Alul. Usando el protocolo de transferencia Southern, que es bien conocido en la técnica, este ensayo determina si un paciente o un tejido particular en un paciente tiene un gen de persefina intacto o una anomalía del gen de persefina.
La hibridación al gen de persefina implicaría desnaturalizar el ADN cromosómico para obtener un ADN de cadena sencilla; poner en contacto el ADN de cadena sencilla con una sonda génica asociada con la secuencia del gen de persefina; e identificar la sonda de ADN hibridada para detectar ADN cromosómico que contiene al menos una parte del gen de persefina humana.
El término "sonda", como se usa en este documento, se refiere a una estructura comprendida por un polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia diana debido a la complementariedad de la secuencia de sonda con una secuencia en la región diana. Las sondas no necesitan reflejar la secuencia exacta de la secuencia diana, pero deben ser suficientemente complementarias para hibridar selectivamente con la cadena que está amplificándose. Mediante hibridación selectiva o hibridación específica se pretende hibridar de manera preferente un polinucleótido a un polinucleótido diana. Oligómeros adecuados para uso como sondas pueden contener un mínimo de aproximadamente 8-12 nucleótidos contiguos que son complementarios a la secuencia elegida como diana y preferentemente un mínimo de aproximadamente 15 nucleótidos, aunque las sondas de polinucleótidos de hasta aproximadamente 20 nucleótidos y hasta aproximadamente 100 nucleótidos o incluso superiores están dentro del alcance de esta invención.
Las sondas del gen de persefina de la presente invención pueden ser oligonucleótidos de ADN o ARN y pueden estar hechas mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica tal como, por ejemplo, excisión, transcripción o síntesis química. Las sondas pueden estar marcadas con cualquier etiqueta detectable conocida en la técnica tal como, por ejemplo, etiquetas radioactivas o fluorescentes o marcador enzimático. La marcación de la sonda puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, tal como mediante PCR, cebado al azar, marcaje del extremo, translación de mellas o similares. Un experto en la materia también reconocerá que pueden usarse otros procedimientos que no emplean una sonda marcada para determinar la hibridación. Ejemplos de procedimientos que pueden usarse para detectar la hibridación incluyen transferencia Southern, hibridación fluorescente in situ y polimorfismo conformacional de cadena sencilla con amplificación de PCR.
La hibridación se lleva a cabo normalmente a 25-45°C, más preferentemente a 32-40°C y más preferentemente a 37-38°C. El tiempo requerido para la hibridación es de aproximadamente de 0,25 a aproximadamente 96 horas, más preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente 72 horas y los más preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 24 horas.
Las anomalías del gen de persefina también pueden detectarse usando el procedimiento de PCR y cebadores que flanquean o están al alcance del gen de persefina. El procedimiento de PCR es bien conocido en la técnica. Brevemente, este procedimiento se realiza usando dos cebadores de oligonucleótidos que pueden hibridar a las secuencias de ácidos nucleicos que flanquean una secuencia diana que está al alcance de un gen de persefina y amplifican la secuencia diana. Los términos "cebador de oligonucleótidos", como se usa en este documento, se refieren a un ADN o ARN de cadena corta que normalmente oscila en longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 bases. Los cebadores de secuencia arriba y secuencia abajo son preferentemente un mínimo de desde aproximadamente 15 nucleótidos hasta aproximadamente 20 nucleótidos y hasta aproximadamente 30 nucleótidos o incluso superior en longitud. Los cebadores pueden hibridar a las regiones flanqueantes para la replicación de la secuencia de nucleótidos. La polimerización está catalizada por una polimerasa de ADN en presencia de desoxinucleótidos trifosfatos o análogos de nucleótidos para producir moléculas de ADN de doble cadena. Entonces, las dobles cadenas se separan mediante cualquier procedimiento de desnaturalización, incluyendo físicos, químicos o enzimáticos. Comúnmente, el procedimiento de desnaturalización físico se usa implicando el calentamiento del ácido nucleico, normalmente hasta temperaturas de aproximadamente 80°C a 105°C durante tiempos que oscilan de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 minutos. El proceso se repite durante el número de ciclos deseados.
Los cebadores se seleccionan para ser sustancialmente complementarios a la cadena de ADN que está amplificándose. Por tanto, los cebadores no necesitan reflejar la secuencia exacta del molde, pero debe ser suficientemente complementaria para hibridar selectivamente o hibridar específicamente con la cadena que está amplificándose. Mediante la hibridación selectiva o hibridación específica se pretende hibridar un polinucleótido de manera preferente a un polinucleótido diana.
Después de la amplificación por PCR, la secuencia de ADN que comprende persefina o pre-pro persefina o un fragmento de la misma se secuencia entonces directamente y se analiza mediante comparación de la secuencia con las secuencias descritas en este documento para identificar alteraciones que puedan cambiar la actividad o los niveles de expresión o similares.
En otra realización se proporciona un procedimiento para detectar persefina basado en el análisis de tejido que expresa el gen de persefina. Se ha encontrado que ciertos tejidos, tales como aquellos identificados más adelante en el ejemplo 18, expresan el gen de persefina. El procedimiento comprende hibridar una sonda de polinucleótidos a ARNm de una muestra de tejidos que normalmente expresan el gen de persefina o de un ADNc producido del ARNm de la muestra. La muestra se obtiene de un paciente del que se sospecha que tiene una anomalía en el gen de persefina o de un tejido del paciente o tipo de célula particular de la que se sospecha que tiene una anomalía en el gen de persefina. La sonda de polinucleótidos de persefina de referencia puede comprender ID SEC N°:179, ID SEC N°:180, ID SEC N°:190, ID SEC N°:191, ID SEC N°:203-206 o derivados de la misma o fragmentos de la misma mientras que tales derivados o fragmentos hibriden específicamente a ARNm de persefina o de un ADNc producido de un ARNm de persefina.
Para detectar la presencia de ARNm que codifica a proteína de persefina se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser de sangre o de una muestra de biopsia de tejido. La muestra puede tratarse para extraer los ácidos nucleicos contenidos en la misma. El ácido nucleico resultante de la muestra se somete a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaño.
El ARNm de la muestra se pone en contacto con un ácido nucleico que sirve como una sonda para formar dúplex híbridos. El uso de una sonda marcada como se trata anteriormente permite la detección del dúplex resultante.
Cuando se usa la proteína de persefina que codifica ADNc o un derivado del ADNc como una sonda pueden usarse altas condiciones de astringencia con el fin de evitar positivos falsos, que es la hibridación y aparente detección de secuencias de nucleótidos de persefina cuando en realidad no está presente un gen de persefina intacto y que funciona. Cuando se usan secuencias derivadas del ADNc de persefina podrían usarse condiciones menos astringentes, sin embargo, esto sería una aproximación menos preferida debida a la posibilidad de positivos falsos. La astringencia de hibridación se determina mediante varios factores durante la hibridación y durante el proceso de lavado, incluyendo temperatura, fuerza fónica, extensión del tiempo y concentración de formamida. Estos factores se resumen en, por ejemplo, Sambrook y col. (Sambrook y col., 1989, antes mencionado).
Con el fin de aumentar la sensibilidad de la detección en una muestra de ARNm que codifica proteína de persefina puede usarse la técnica de transcripción inversa/reacción de polimerización en cadena (RT/PCR) para amplificar ADNc transcrito de ARNm que codifica la proteína de persefina. El procedimiento de RT/PCR es bien conocido en la técnica (véase ejemplo 9).
El procedimiento de RT/PCR puede realizarse del siguiente modo. Se aisla ARN celular total mediante, por ejemplo, el procedimiento habitual del isotiocianato de guanidinio y el ARN total se transcribe inversamente. El procedimiento de transcripción inversa implica la síntesis de ADN en un molde de ARN usando una enzima de transcriptasa inversa y un cebador en el extremo 3'. Normalmente, el cebador contiene una secuencia oligo(dT). Por tanto, el ADNc producido se amplifica entonces usando el procedimiento de PCR y cebadores específicos de persefina. (Bementeavsky y col., Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug y Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., volumen,152, páginas 316-325, 1987).
El procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa se realiza como se describe anteriormente usando dos cebadores de oligonucleótidos que son sustancialmente complementarios a las dos regiones flanqueantes del segmento de ADN que va a amplificarse.
Tras la amplificación, el producto de PCR se somete entonces a electroforesis y se detecta mediante tinción de bromuro de etidio o mediante obtención de imágenes con fósforo.
La presente invención proporciona además procedimientos para detectar la presencia de la proteína de persefina en una muestra obtenida de un paciente. Puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica para detectar proteínas. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, procedimientos inmunoquímicos, ensayos de aglutinante-ligando, técnicas inmunohistoquímicas, ensayos de aglutinación y de complemento. (por ejemplo, véase Basic and Clinical Immunology, Sites y Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. páginas 217-262, 1991). Se prefieren los procedimientos de inmunoensayo de aglutinante-ligando que incluyen hacer reaccionar anticuerpos con un epítopo o epítopos de la proteína de persefina o derivado de la misma y desplazando competitivamente la proteína de persefina marcada o derivado de la misma.
Como se usa en este documento, se pretende que un derivado de proteína de persefina incluya un polipéptido en el que ciertos aminoácidos se han suprimido o reemplazado con otros aminoácidos o cambiados por aminoácidos modificados o inusuales, en el que el derivado de persefina es biológicamente equivalente a persefina y/o en el que el derivado de polipéptido reacciona de manera cruzada con anticuerpos obtenidos frente a la proteína de persefina. Reacción cruzada significa que un anticuerpo reacciona con un antígeno distinto del que indujo su formación.
En la técnica son bien conocidos numerosos inmunoensayos competitivos y no competitivos de unión a proteína. Los anticuerpos empleados en tales ensayos pueden estar no marcados, por ejemplo como se usan en pruebas de aglutinación, o marcados para uso en una amplia variedad de procedimientos de ensayo. Las etiquetas que pueden usarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes que fluorescen, sustancias quimioluminiscentes, sustratos o cofactores de enzimas, inhibidores de enzimas, partículas, colorantes y similares para uso en radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos de enzimas, por ejemplo ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares.
Los anticuerpos policlonales o monoclonales a la proteína de persefina o a un epítopo de la misma pueden estar hechos para uso en inmunoensayos mediante cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica. Mediante epítopo se hace referencia a un determinante antigénico de un polipéptido. El término epítopo también puede incluir epítopos de células B específicos para persefina o epítopos de células auxiliares T. Un epítopo podría comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epítopo. Generalmente, un epítopo está constituido por al menos 5 aminoácidos tales. En la técnica se conocen los procedimientos de determinación de la conformación espacial de aminoácidos e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones.
Una aproximación para preparar anticuerpos para una proteína es la selección y preparación de una secuencia de aminoácidos de toda la proteína o una parte, sintetizar químicamente la secuencia e inyectarla en un animal apropiado, normalmente un conejo o un ratón (véase ejemplo 10).
Los oligopéptidos pueden seleccionarse como candidatos para la producción de un anticuerpo para la proteína de persefina basada en los oligopéptidos que están en regiones hidrófilas que, por tanto, probablemente están expuestos a la proteína madura.
Los anticuerpos para persefina también pueden obtenerse frente a oligopéptidos que incluyen una o más de las regiones conservadas identificadas en este documento tal que el anticuerpo puede reaccionar de manera cruzada con otros miembros de familias. Tales anticuerpos pueden usarse para identificar y aislar los otros miembros de familias.
Los procedimientos para la preparación de la proteína de persefina o un epítopo de la misma incluyen, pero no se limitan a, síntesis química, técnicas de ADN recombinante o aislamiento de muestras biológicas. La síntesis química de un péptido puede realizarse, por ejemplo, mediante el procedimiento de Merrifeld clásico de síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifeld, J Am Chem Soc 85:2149, 1963) o la estrategia de FMOC en un sistema de síntesis rápido automatizado de múltiples péptidos (DuPont Company, Wilmington, DE) (Caprino y Han, J Org Chem 37:3404, 1972).
Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante inmunización de conejos u otros animales mediante inyección del antígeno seguido por dosis de refuerzo posteriores a intervalos apropiados. Los animales se sangran y los sueros sanguíneos se ensayan frente a proteína de persefina purificada normalmente mediante ELISA o mediante bioensayo basado en la capacidad de bloquear la acción de persefina. Cuando se usan especies aviares, por ejemplo pollo, pavo y similares, el anticuerpo puede aislarse de la yema del huevo: los anticuerpos monoclonales pueden prepararse según el procedimiento de Milstein y Kohler mediante fusión de esplenocitos de ratones inmunizados con replicación continua de células tumorales tales como células de mieloma o linfoma. (Milstein y Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981). Entonces, las células de hibridoma así formadas se clonan mediante procedimientos de dilución limitante y los sobrenadantes se ensayan para la producción de anticuerpo mediante ELISA, RIA o bioensayo.
La capacidad única de los anticuerpos para reconocer y unirse específicamente a proteínas diana proporciona una aproximación para tratar una sobreexpresión de la proteína. Por tanto, pueden usarse anticuerpos específicos para la proteína de persefina para evitar o tratar enfermedades que implican sobreexpresión de la proteína de persefina mediante tratamiento de un paciente.
Los anticuerpos específicos, bien policlonales o monoclonal, para la proteína de persefina pueden producirse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica como se trata anteriormente. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales murinos o humanos pueden producirse mediante tecnología de hibridoma o, alternativamente, la proteína de persefina o un fragmento inmunológicamente activo de la misma, o un anticuerpo antiidiotípico o fragmento del mismo puede administrarse a un animal para obtener la producción de anticuerpos que pueden reconocer y unirse a la proteína de persefina. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE o, en el caso de especies aviares, IgY y de cualquier subclase de anticuerpos.
Las realizaciones preferidas de la invención se describen en los siguientes ejemplos. Otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones en este documento serán aparentes para un experto en la materia desde la consideración de la memoria descriptiva o práctica de la invención como se describe en este documento. Se pretende que la memoria descriptiva, junto con los ejemplos, sólo se consideren a modo de ejemplo.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra el aislamiento y la purificación de neurturina de medio condicionado con células CHO.
Preparación de medio condicionado con células CHO:
Se usó un derivado de células ováricas de hámster chino DG44, células de DG44CHO-pHSP-NGFI-B (CHO), (Day y col., J Biol Chem 265:15253-15260, 1990). Los inventores en este documento también han obtenido neurturina en forma parcialmente purificada de otros derivados de células ováricas de hámster chino DG44. Las células CHO se mantuvieron en 20 ml de medio que contenía medio esencial mínimo (MEM) alfa (Gibco-BRL, n° 12561, Gaithersburg, MD) que contenía suero bovino fetal al 10% (Hyclone Laboratories, Logan, UT), 1-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y metotrexato 25 nM usando matraces de 150 cm^{2} (Corning Inc., Corning NY). Para el paso y la expansión se aspiró medio de un matraz confluente; las células se lavaron con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía, en g/l, 0,144 de KH_{2}PO_{4}, 0,795 de Na_{2}HPO_{4} y 9,00 de NaCl; y entonces el matraz se incubó durante 2-3 minutos con 2 ml de tripsina al 0,25% en PBS. Entonces, las células se eliminaron de la superficie del matraz, se añadieron 8 ml de medio y las células se trituraron varias veces con una pipeta. Las células se dividieron 1:5 ó 1:10, se incubaron a 37°C bajo una atmósfera de 5% de CO_{2} en aire y crecieron durante 3-4 días hasta confluencia.
Entonces, el cultivo celular se expandió en frascos rotativos de 850 cm^{2} (Becton Dickinson, Bedford, MA). Un matraz confluente de 150 cm^{2} se trató con tripsina y se sembró en un frasco rotativo que contenía 240 ml del medio MEM anteriormente modificado sin metotrexato. El pH se mantuvo mediante cubrición del medio con 5% de CO_{2} en aire o mediante preparación del medio con HEPES 25 mM, pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO). Los frascos rotativos se rotaron a 0,8-1,0 revoluciones por minuto. Las células alcanzaron la confluencia en 4 días.
Para recoger el medio condicionado se usa medio de células CHO sin suero (SF-CHO). El SF-CHO se preparó usando 1:1 de medio básico DME/F12, que se preparó mezclando 1:1 (v/v) de DMEM (Gibco-BRL, n° de producto 11965, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) con Ham F12 (Gibco-BRL, n° de producto 11765). El medio de SF-CHO final contenía HEPES 15 mM, pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma, St. Louis MO), 25 \mug/ml de heparina, (Sigma, St. Louis, MO), 1 X suplemento de insulina-transferrina-selenito (insulina bovina, 5 \mug/ml; transferrina humana, 5 \mug/ml; selenito de sodio, 5 ng/ml; Sigma, St. Louis, MO), 1-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. El medio se eliminó de los frascos rotativos confluentes y las células se lavaron una vez con 30 ml de medio SF-CHO para eliminar las proteínas de suero. Entonces, las células se incubaron a 37°C durante 16-24 h en 80 ml de medio SF-CHO para eliminar adicionalmente proteínas de suero. Se eliminaron los 80 ml de medio y se desecharon. Se añadió un volumen de 120 ml de medio SF-CHO al matraz y las células se incubaron a 37°C. Después de cada 48 h se recogió 120 ml y se reemplazó con el mismo volumen de medio SF-CHO.
Los medios recogidos se reunieron y se centrifugaron a 4°C en tubos cónicos de polipropileno para eliminar el residuo celular y el sobrenadante se almacenó a -70°C. Los medios se recogieron 5 veces durante 10 días para dar un total de aproximadamente 600 ml de medio condicionado por frasco rotativo.
Las fracciones recogidas de las columnas en cada fase de purificación se ensayaron para la actividad biológica usando el ensayo de supervivencia neuronal y para el contenido de proteína mediante el ensayo de unión de colorante de Bradford (Anal Biochem 72:248 y siguientes, 1976). Se determinaron los mg totales de proteína en el volumen de partida, normalmente 50 litros, de medio condicionado.
Ensayo de supervivencia del ganglio cervical superior
Se calculó la actividad neurotrófica del material de partida del medio condicionado con CHO y, a diversas fases de purificación, usando el sistema de ensayo de supervivencia del ganglio cervical superior previamente informado (Martin, y col. J of Cell Biology 106:829-844; Deckwerth y Johnson, J Cell Bio 123:1207-1222, 1993, que se incorporan como referencia). Los cultivos primarios de neuronas simpáticas del ganglio cervical superior (SCG) se prepararon mediante disección de tejido de embrión de rata de 20-21 días (E20-E21). Los SCG se colocaron en medio Leibovitz L15 con 1-glutamina (n° de catálogo 11415-023 Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), se digirieron durante 30 minutos con 1 mg/ml de colagenasa (n° de catálogo 4188, Worthington Biochemical, Freehold, NJ) en medio Leibovitz L15 a 37°C, seguido por una digestión de 30 minutos en tripsina liofilizada e irradiada (tipo TRLVMF, n° de catálogo 4454, Worthington Biochemical, Freehold, NJ) que se resuspendió en una solución salina equilibrada de Hanks modificada (n° de catálogo H-8389, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La digestión se detuvo usando AM50 que contenía medio esencial mínimo con sales de Earle y sin 1-glutamina (n° de catálogo 11090-016, Gibco-BRL), suero bovino fetal al 10% (n° de catálogo 1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 1-glutamina 2 mM (n° de catálogo G5763, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), FuDr 20 pM (F-0503 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), uridina 20 \muM (n° de catálogo 3003 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 50 ng/ml de 2.5 S NGF. Las células se disociaron en una suspensión de células individuales usando una pipeta de Pasterur silanizada y limpiada a la llama. Después de la filtración de la suspensión mediante un filtro de nitex (tamaño 3-20/14, Tetko Inc., Elmsford, NY), las células se colocaron como antes en medio AM50 y se sembraron previamente en un Falcon o placa primaria de cultivo de 100 mm (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) para reducir el número de células no neuronales. Después de 2 horas se eliminó de estas placas el medio que contenía las células neuronales no unidas y se trituraron de nuevo mediante una pipeta de Pasteur silanizada y limpiada a la llama. La suspensión de células individuales se colocó en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (Costar, Wilmington, MA) que previamente se habían recubierto con una doble capa de colágeno, una capa de colágeno que se había tratado con amoniaco y una segunda capa de colágeno que se había secado al aire. Se permitió que se unieran durante de 30 minutos a 2 horas. En cada pocillo se colocó un número específico de células viables, normalmente aproximadamente de 1200 a aproximadamente 3000 células totales por pocillo, o un porcentaje específico del ganglio, normalmente el 25% de las células obtenidas por ganglio. Cuando tuvieron que realizarse los recuentos celulares se colocaron en las placas de 24 pocillos como se expone anteriormente o, alternativamente, en "portaobjetos de cámara" (Chamber Slide) de 2 pocillos (Nunc, Naperville, IL). Entonces, los cultivos se incubaron durante 5-6 días a 37° en medio AM50 en una atmósfera de 5% de CO_{2}/95% de aire. Se indujo la muerte de las neuronas cultivadas mediante cambio del medio con medio sin NGF y con anti-NGF de cabra al 0,05% (título final en los pocillos es 1:10). Esta privación de NGF da como resultado la muerte de las neuronas en un periodo de 24-72 horas. Se añadieron alícuotas de factor parcialmente purificado o purificado, o controles apropiados, a los cultivos en el momento de la eliminación de NGF para determinar la capacidad para evitar la muerte neuronal.
La evaluación de la capacidad de la fracción en columna, eluatos de gel o factor purificado para evitar la muerte neuronal fue mediante inspección visual de los cultivos bajo microscopía de contraste de fase. Las neuronas viables permanecieron brillantes en la fase con neuritas intactas, mientras que las neuronas muertas estaban escogidas, oscuras en la fase, tenían membranas irregulares y las neuritas estas fragmentadas. Cuando se requirió una precisa cuantificación de la supervivencia neuronal, los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% o formalina al 10% en PBS y se tiñeron con disolución de violeta cristal, (Huntooh Formula Harleco E.M. Diagnostics Systems, Gibbstown, NJ). Cuando se usaron placas de 24 pocillos se añadió 1 \mul de disolución de violeta cristal a cada pocillo que contenía formalina al 10% y las células se contaron usando un microscopio de contraste de fase. Si se usaron portaobjetos de cámara de 2 pocillos, los cultivos se fijaron, se tiñeron con violeta cristal, se destiñeron con agua, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol a tolueno y se prepararon en una disolución de preparación basada en tolueno. Las neuronas se puntuaron como viables si tenían un nucleolo y núcleos transparentes y se tiñeron claramente con violeta cristal.
La actividad se cuantificó mediante el cálculo de una "unidad de supervivencia". Las unidades de supervivencia totales en una muestra se definieron como el volumen mínimo de una alícuota de la muestra que produjo la máxima supervivencia dividida entre el volumen total de esa muestra. La actividad específica se calculó como las unidades de supervivencia divididas entre los mg de proteína total.
Las unidades de supervivencia se determinaron en un ensayo usando aproximadamente 1200 neuronas viables en un ensayo de cultivo de 0,5 ml y un periodo de cultivo de 48 horas tras adición de la fracción. La supervivencia se calculó visualmente después de las 48 horas. La actividad intrínseca se determinó en un ensayo usando aproximadamente 2700 neuronas y un periodo de cultivo de 72 horas. La supervivencia se calculó fijando las neuronas y contando el número de neuronas supervivientes. Debido a la estabilidad, que se calcula mediante la semivida de la actividad, para neurturina disminuye a medida que aumenta el número de neuronas, sería de esperar que la medición de la actividad intrínseca fuera inferior a la predicha mediante determinaciones de actividad específica. También sería de esperar que la medición de la actividad intrínseca fuera inferior a la predicha mediante la actividad específica debido a que la supervivencia se midió después de 72 horas en lugar de 48 horas.
Para garantizar la reproductibilidad de estos ensayos de unidades de actividad fue necesario sembrar en placa los cultivos neuronales primarios a densidades celulares reproducibles, ya que la estabilidad de la actividad disminuye significativamente con el aumento de la densidad neuronal. El intervalo de densidades celulares era de aproximadamente 1200 a aproximadamente 2700 células por pocillo. La presencia de heparina soluble en el medio de ensayo no tuvo efecto en la estabilidad a corto plazo (-3 días) de la actividad de la supervivencia.
Purificación de neurturina
El medio condicionado reunido se filtró mediante filtros para botella de 0,2 \mul de poro (membrana de acetato de celulosa, Corning Inc., Corning, NY). Normalmente se usaron 50 litros de medio condicionado y se procesaron en lotes de 25 litros. Cada lote de 25 litros se introdujo a una velocidad de 20 ml/min en una columna de 5 x 5 cm que contenía 100 ml de heparina-agarosa (Sigma, St. Louis, MO) equilibrada con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, con NaCl 150 mM. Entonces, la columna se lavó con aproximadamente 1000 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M a 20 ml/min y entonces se diluyó la actividad con tampón de HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 1,0 M. Después de cambiar al tampón de dilución de NaCl 1,0 M se desecharon los primeros 50 ml de tampón y, después de esto, se recogió una fracción de 300 ml.
Entonces, el material reunido eluido de la columna de heparina-agarosa se diluyó 1:1 (v/v) con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía TWEEN 20 al 0,04% a una concentración de NaCl de 0,5 M y se introdujo en una columna de 1,5 cm x 9 cm que contenía 16 ml de resina de intercambio iónico de alta resolución de SP SEPHAROSE® (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada en HEPES 25 mM, 7,4, que contenía NaCl 0,5 M y TWEEN 20 al 0,02%. Entonces, la columna se lavó con 160 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M y TWEEN 20 al 0,02% y la actividad se eluyó con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4,que contenía NaCl 1,0 M y TWEEN 20 al 0,02% a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Se recogió una fracción de 50 ml después de los primeros 7 ml de eluato de la columna.
El material eluido de la columna de SP SEPHAROSE® se fraccionó usando cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) en una columna de Superose HR 10/2 quelante cargada con Cu^{++} (Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna se había preparado mediante lavado con 10 ml agua, carga con 3 ml de 2,5 mg/ml de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, lavado con 10 ml de agua y equilibrado con 10 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 1,0 M y TWEEN 20 al 0,02%. El eluato se introdujo en la columna en tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 1,0 M a una velocidad de 1,0 ml/min. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de concentración creciente de glicina (0-300 mM) en tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 1,0 M a una velocidad de 1,0 ml/min. El gradiente se produjo mediante un sistema de FPLC de Pharmacia usando un controlador LCC-500 y bombas P-500 para establecer un gradiente de glicina de 0-300 mM en 40 ml a 1,0 ml/min, por tanto, aumentando el gradiente mediante glucina 7,5 mM por min. Se recogieron fracciones de un ml y se ensayaron para la promoción de supervivencia del SCG. La actividad máxima se observó en las fracciones 17-20, es decir a 17-20 min o ml del inicio del gradiente.
Las mediciones de absorbancia a 280 nM mediante un monitor UV en línea indicaron que la mayoría de las proteínas se eluyeron antes de la actividad de supervivencia en las fracciones 17-20. Por tanto, se consiguió la purificación significativa en etapa. Con la actividad de supervivencia se copurificó una banda de 25 kD.
Las fracciones eluidas combinadas de la columna de Superose de Cu^{++} se diluyeron hasta NaCl 0,45 M usando tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía TWEEN 20 al 0,02% y se introdujeron en una columna de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) para la purificación adicional por FPLC. La columna se había equilibrado con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,45 M que contenía TWEEN 20 al 0,02%. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de concentración creciente de NaCl (0,45-1,0 M). El gradiente se produjo como se describe anteriormente de NaCl 0,45 M - 1,0 M en 35 ml a 1,0 ml/min, por tanto aumentando la concentración a 0,0157 M por ml o min. Se recogieron trece fracciones de 1,0 ml (fracciones 1-13) seguidas por 44 fracciones de 0,5 ml (fracciones 14-53). La actividad máxima del ensayo del SCG estaba en las fracciones 26-29. Cada fracción se ensayó en el ensayo de supervivencia del SCG durante un intervalo de volúmenes de 0,1 a 1,0 \mu por 0,5 ml de medio de cultivo.
Se cargó un uno por ciento (5 \mul) de cada fracción en un gel de SDS-poliacrilamida al 14% no reductor, y se sometió a electroforesis a 750 V-h a 25°C. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con plata.
Apareció una banda de 25 kD en las fracciones 25-30, una proteína de 28 kD eluye antes en el gradiente y una de 18 kD eluye después en el gradiente.
Para demostrar que la banda de 25 kD era responsable de la actividad promotora, la proteína de 25 kD se eluyó del gel poliacrilamida después de la electroforesis y se ensayó para la actividad de supervivencia en el ensayo del SCG. Después de la electroforesis de 150 \mul de la fracción de NaCl 1,0 M de SP SEPHAROSE® en un carril de SDS-gel de poliacrilamida al 14, no reductor, como anteriormente, el carril se cortó en 12 trozos y cada trozo se trituró y se eluyó mediante difusión con balanceo en tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,02% durante 18 h a 25°C. Se añadió BSA al eluato hasta una concentración final de 200 \mug/ml y el eluato se filtró mediante un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar los fragmentos de gel de acrilamida. Entonces, el filtrado se añadió a una columna de SP SEPHAROSE® para concentrar y purificar la muestra. Antes de eluir la muestra, la columna se lavó una vez en 400 \mul de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M, Tween-20 al 0,02% y 200 \mug de BSA por ml y una vez en 400 \mul de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía Tween-20 al 0,02% y 200 \mug de BSA por ml. Entonces, la columna se lavó de nuevo en 400 \mul de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,5 M, TWEEN 20 al 0,02% y 200 \mug de BSA por ml. La muestra se eluyó con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 1,0 M, Tween-20 al 0,02% y 200 \mug de BSA por ml. Entonces, las muestras se analizaron para la actividad de supervivencia. Sólo el trozo correspondiente a la banda de 25 kD mostró evidencia de actividad de supervivencia. Se cree que la proteína de 25 kD purificada a partir de los medios condicionados con células CHO es un homodímero.
El rendimiento de la purificación anterior era de normalmente 1-1,5 \mug de 50 litros de medio condicionado con células CHO. La recuperación total se estima que es del 10-30%, resultando una purificación de aproximadamente 390.000 veces.
En la tabla 2 se muestra la purificación progresiva usando las etapas anteriores.
TABLA 2
Proteína^{a} Actividad^{b} Actividad Rendimiento (%) Purificación (veces)
(mg) (unidades) específica^{d}
(unidades/mg)
Medio condicionado 5000 4800^{c} 9,6 - -
Heparina Agarosa 45 48000 1068 100 111
SP Sepharose 5,3 48000 9058 100 43
Superose de Cu^{+++} 0,31 30000 96700 62 10070
Mono S 0,004 15000 3750000 31 390000
^{a} \begin{minipage}[t]{155mm} Los mg de proteína se determinaron usando el procedimiento de unión de colorante de Bradford (Anal Biochem 72:248, 1976). \end{minipage}
^{b} \begin{minipage}[t]{155mm} Las unidades de actividad total o unidades de supervivencia en una muestra se definieron como el volumen mínimo de una alícuota de la mezcla que produjo la supervivencia máxima dividida entre el volumen total de esa muestra. \end{minipage}
^{c} \begin{minipage}[t]{155mm} La actividad para el medio condicionado se derivó de la suposición de que el 100% de la actividad se recuperaba en la fracción de heparina-agarosa ya que la actividad del medio condicionado era demasiado baja para ensayarse directamente. \end{minipage}
^{d} \begin{minipage}[t]{155mm} La actividad específica eran las unidades de actividad divididas por los mg de proteína total. \end{minipage}
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra la caracterización de neurturina y varios miembros de la familia TGF-\beta de factores crecimiento en el ensayo del SCG y la carencia de reactividad cruzada de anticuerpos anti-GDNF con neurturina.
El ensayo del SCG de la proteína purificada indicó que el factor es máximamente activo a una concentración de aproximadamente 3 ng/ml o aproximadamente 100 pM y la CE_{50} era aproximadamente 1,5 ng/ml o aproximadamente 50 pM en el intervalo esperado para un factor de crecimiento de péptido difusible.
Varios miembros de la familia TGF-\beta influyen la expresión de genes de neuropéptidos en neuronas simpáticas, mientras que otros promueven la supervivencia de diferentes poblaciones neuronales. La neurturina, que es un miembro lejano de esta familia de proteínas, puede promover virtualmente la supervivencia completa de neuronas simpáticas durante 3 días. Además, un cultivo adicional de las células del SCG desveló que la neurturina podría continuar manteniendo estas neuronas durante al menos 10 días después de la retirada del NGF.
Se probaron otros varios miembros de la familia TGF-\beta para su capacidad para promover la supervivencia en el ensayo del SCG, incluyendo TGF-\beta1, activina, BMP-2, BMP-4, BMP-6 y GDNF. De estos factores, solamente GDNF tenía actividad promotora de la supervivencia, sin embargo, la actividad de GDNF era mucho menos potente que la neurturina en esta actividad que mostraba una CE_{50} de 2-4 nM en el día 3 de ensayo de supervivencia. El GDNF probado en este ensayo era GDNFrh producido en E. Coli obtenida de Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N.J. La duración de acción del GDNF también era inferior que la de la neurturina, ya que se disminuyó sustancialmente la capacidad del GDNF (50 ng/ml) para mantener la supervivencia más de 3 días. Estos experimentos sugieren la posibilidad de que el GDNF es un agonista débil para el receptor de neurturina. Además, la incapacidad de activina y BMP-2 para promover la supervivencia, a diferencia de su fuerte inducción de expresión de genes relacionados con transmisores en estas neuronas (Fann y Paterson, Int J Dev Neurosci 13:317-330, 1995; Fann y Patterson, J Neurochem 61:1349-1355, 1993), sugiere que señalizan mediante receptores alternantes o rutas de transducción de señales.
Para determinar la reactividad cruzada de anticuerpos anti-GDNF con neurturina parcialmente purificada, las neuronas del SCG, que se habían diseccionado y sembrado en placa como se describe en el ejemplo 1, se trataron en el día 6 con 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml o 30 ng/ml de GDNF (Prepro Tech, Inc, Rocky Hill, N.J.) en presencia de anti-NGF solo o en presencia de anti-NGF y anti-GDNF (anticuerpo IgG de cabra para GDNFrh derivado de E. coli, R & D Systems, Mineapolis, Minn). En el ensayo se usó una fracción de SP Sepharose 1,0 M parcialmente purificada de neurturina a las concentraciones aproximadas de 375 \mug/ml, 750 \mug/ml, 1,5 ng/ml y 3 ng/ml. Esta fracción se probó en presencia de anti-NGF solo y en presencia de anti-NGF y anti-GDNF. El anticuerpo anti-GDNF bloqueó la actividad promotora de la supervivencia de GDNF a una concentración de hasta 30 ng/ml, pero no bloqueó la actividad promotora de la supervivencia de neurturina.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra el efecto de neurturina en neuronas sensoriales en un ensayo de supervivencia de ganglios nodosos.
Se ensayó el medio condicionado con células CHO que se había purificado parcialmente en la columna de SP Sepharose para actividad neurotrófica en neuronas sensoriales usando ganglios nodosos. El ensayo de supervivencia es una modificación del previamente informado anteriormente para los ganglios cervicales superiores. Los cultivos disociados primarios de ganglios nodosos se prepararon mediante disección de tejido de crías de rata Sprague Dawley E18. Los ganglios nodosos se colocaron en Leibovitz L15 con 1-glutamina 2 mM (n° de catálogo 11415-023, GIBCO-BRL. Gaithersburg, MD) a la vez que los tejidos se diseccionaban, se colocaban durante 30 min con 1 mg/ml de colagenasa (n° de catálogo 4188, Worthington Biochemical, Freehoid, Nuevo Jersey) en medio Leibovitz L15 a 37°C, seguido por digestión de 30 min en tripsina (liofilizada e irradiada, tipo TRLVMF, n° de catálogo 4454 Worthington Biochemical, Freehoid, NJ) y resuspensión hasta una concentración final de 0,25% en solución salina equilibrada de Hanks modificada (n° de catálogo H8389, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). La digestión se detuvo usando AMO-BDNF100, un medio que contenía medio esencial mínimo con sales de Earle y sin 1-glutamina (n° 11090-016 GIBCO-BRL), suero bovino fetal al 10% (n° de catálogo 1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 1-glutamina 2 mM (n° de catálogo G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), FuDr 20 \muM (F-0503, Sigma Chemical Co.), uridina 20 \muM (n° de catálogo 3003, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 100 U/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina y 100 ng de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, Amgen, Thousand Oaks, CA). Las células se disociaron en una suspensión de células individuales usando una pipeta de Pasterur silanizada y limpiada a la llama en el medio AMO-BDNF100 y se sembraron previamente en un Falcon o placa primaria de cultivo de 100 mm (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) para eliminar células no neuronales. Después de 2 horas se eliminó de estas placas el medio que contenía las células neuronales no unidas y se trituraron de nuevo mediante una pipeta de Pasteur silanizada y limpiada a la llama. La suspensión de células individuales se colocó en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (Costar, Wilmington, MA) que previamente se habían recubierto con una doble capa de colágeno, una capa que se había tratado con amoniaco y una segunda capa que se había secado al aire. Los ganglios de diez embriones de rata E18 se disociaron en 2,5 ml de medios y se añadió 100 \mul de esta suspensión a cada pocillo. Se permitió que las células se unieran durante 30 min en un incubador a 37°C con 5% de CO_{2}/95% de aire. Los pocillos se alimentaron con medios AMO-BDNF100 durante la noche.
Al siguiente día, las células se lavaron 3 veces durante 20 min cada vez con medio AMO que no contenía BDNF. Los pocillos se alimentaron con 0,5 ml de estos medios solos o estos medios que contenían o bien 50 ng/ml de NGF, 100 ng/ml BDNF (Amgen, Thousand Oaks, CA), 100 ng/ml de GDNF (Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N.J) o bien 3 ng/ml de neurturina. Las células se incubaron a 37°C en un incubador de 5% de CO_{2}/95% de aire durante 3 días, se fijaron con formalina al 10%, se tiñeron con violeta cristal (1 \mul/ml de formalina al 10%) y se contaron. La supervivencia se determinó como se observó previamente.
Previamente se ha informado la supervivencia neuronal de neuronas nodosas cultivadas en BDNF (Thaler y col., Develop Biol 161:338-344, 1994). Ésta se usó como patrón para la supervivencia para estas neuronas y dio el valor del 100% de supervivencia. Los ganglios nodosos que no tenían refuerzo trófico (AMO) mostraron 20%-30% de supervivencia, como las neuronas que se cultivaron en presencia de 50 ng/ml de NGF. Las neuronas cultivadas en presencia de 3 ng/ml de neurturina y ausencia de BDNF mostraron supervivencia similar a aquellas neuronas cultivadas en presencia de BDNF (100 ng/ml). El GDNF a una concentración de 100 ng/ml promovió mayor supervivencia de neuronas nodosas que el BDNF (100 ng/ml). Recientemente se informaron hallazgos similares con GDNF para neuronas sensoriales de pollo (Ebendal, T. y col., J Neurosci Res 40:276-284 1995).
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra la determinación de secuencias parciales de aminoácidos de neurturina aislados de medio condicionado con células CHO.
Para obtener secuencia de aminoácidos N-terminales de una preparación purificada de aproximadamente 1 \mug de neurturina se concentraron las fracciones de Mono S 26-29 que contenían el máximo de actividad hasta 25 \mul mediante ultrafiltración centrífuga en 3 concentradores de microcon (Amicon, Inc., Beverley, MA) y se cargó en un gel de de poliacrilamida de SDS al 14% no reductor. Después de la separación electroforética, las proteínas se sometieron a electrotransferencia a una membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA) y se tiñeron con azul de Coomassie al 0,1%. Se suprimió la banda de 25 kD y se insertó en el cartucho de reacción de un secuenciador automatizado (modelo 476, Applied Biosystems (Foster City, CA). La recuperación de aminoácido de feniltiohidantoina (PTH-aa) en los primeros 2-3 ciclos de la secuenciación automática mediante degradación de Edman indicó un rendimiento de secuenciación de 4 pmoles, que era aproximadamente el 10% de la cantidad estimada de proteína cargada en el gel de SDS.
Se realizaron dos series de secuenciaciones N-terminales de dos preparaciones de purificación de 50 litros. En la primera serie se concentró 1 \mug de proteína en 3 fracciones reunidas de 1,5 ml de volumen total hasta 25 \mul y se sometieron a electrotransferencia a 100 V durante 2 h a 25°C usando un tampón de electrotransferencia de tampón CAPS 10 mM pH 11,0 (Sigma, St. Louis, MO) que contenía metanol al 5%. La secuencia de aminoácidos se obtuvo de 13 ciclos de degradación de Edman y el rendimiento de secuenciación era de 4 pmoles, como anterior-
mente.
En la segunda serie se concentraron 1,5 \mug de proteína en 4 fracciones reunidas de 2,0 ml de volumen total hasta 25 \mul y se sometieron a electrotransferencia a 36 V durante 12 horas a 4°C usando un tampón de electrotransferencia de Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,04% y MeOH al 17%. El rendimiento de secuenciación era de 15 pmoles y la secuencia después de 16 ciclos era SGARPXGLRELEVSVS (ID SEC N°:3). La secuencia obtenida después de 16 ciclos correspondía a la secuencia más corta obtenida en la primera serie. No pudieron hacerse asignaciones definitivas en 3 de los residuos de aminoácidos en la secuencia (residuos 1, 6 y 11 del N-terminal). Una investigación de bases de datos de proteínas no detectó ninguna secuencia significativamente homóloga, sugiriendo que el factor purificado era una proteína novedosa.
Estos datos de secuencias de aminoácidos N-terminales iniciales no hicieron posible el aislamiento de clones de ADNc usando oligonucleótidos degenerados como cebadores de PCR o sondas para el rastreo de bibliotecas. Para facilitar estas aproximaciones se purificó proteína adicional con el fin de obtener secuencia de aminoácidos interna de fragmentos proteolíticos. Para obtener secuencia de aminoácidos interna de neurturina se purificaron 50 litros adicionales de medio condicionado con células CHO usando sólo las 3 primeras etapas cromatográficas como se explicaron anteriormente, excepto que el gradiente usado para eluir la columna de Superose quelante de Cu^{++} era del siguiente modo: glicina 0-60 mM (4 ml), glicina 60 mM (10 ml), glicina 60-300 mM (32 ml). Las fracciones n° 20-23 que contenían neurturina se concentraron hasta 25 \mul mediante ultrafiltración (Amicon microcon 3, Amicon, Beverley, MA) y se cargaron en un gel de poliacrilamida de SDS no reductor. Después de la electroforesis, el gel se tiñó con azul de Coomassie y se suprimió la banda de neurturina de 25 kD. La neurturina se digirió en el trozo de gel con endoproteinasa Lys-C y los fragmentos proteolíticos eluidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Sólo se observó un máximo con la separación de HPLC de los péptidos eluidos, que dio información de la secuencia de aminoácidos durante 23 ciclos en el nivel de señal de 1 pmol usando el secuenciador automatizado, (fragmento interno P2, ID SEC N°:5).
El análisis de aminoácidos realizado sobre el 10% de la muestra anterior antes de someterla a digestión había indicado que estaban presentes 150 pmoles de proteína en el trozo de gel, estando constituida por 7,6% de lisina y 19,5% de arginina. El máximo nivel inferior individual de la digestión de Lys-C sugirió que la digestión y elución de péptidos era ineficiente. Se redigirió el mismo trozo de gel con tripsina y los péptidos eluidos se separaron mediante HPLC. Se observaron dos máximos en HPLC, dando como resultado la aclaración de dos secuencias adicionales de aminoácidos de 10 residuos (nivel de señal de 4-5 pmol, fragmento interno P1, ID SEC N°:4 y fragmento interno P3, ID SEC N°:6) que se distinguieron de las secuencias de aminoácidos internas N-terminales y previas. La digestión, elución y purificación de péptidos in situ y la secuenciación de péptidos fueron realizaron por el Laboratorio de Recursos Biotecnológicos de la Fundación W.M. Keck de la Universidad de Yale según protocolos habituales para este servicio.
Ejemplo 5
El siguiente ejemplo ilustra el aislamiento y el análisis de secuencias de clones de ADNc de neurturina de ratón y humana.
Se sintetizaron oligonucleótidos degenerados correspondientes a diversos estiramientos de datos de secuencias de aminoácidos de plena confianza y se usaron como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ADNc de ARNm transcrito inverso. Se usaron un cebador directo (M1676; 5'-CCNACNGCN
TAYGARGA, ID SEC N°:50) correspondiente a la secuencia de péptidos P2 Xaa_{1}-Xaa_{2}-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa_{3}-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val en la que Xaa_{1} y Xaa_{2} eran desconocidos, Xaa_{3} era Gln o Glu (ID SEC N°:5) en combinación con un cebador inverso (M1677; 5'-ARYTCYTGNARNGTRTGRTA (ID SEC N°:52) correspondiente a la secuencia de péptidos P3 (Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg) (ID SEC N°:6) para amplificar un producto de 69 nucleótidos de moldes de ADNc derivados de rata E21 y de cerebro de ratón adulto. Los parámetros de PCR eran: 94°C durante 30 s; 55°C durante 30 s; 72°C durante 1 min durante 35 ciclos. El producto se subclonó en el plásmido Bluescript KS y se secuenció. Toda la secuenciación de nucleótidos se realizó usando tecnología de terminación de colorantes fluorescentes siguiendo las instrucciones del fabricante en un secuenciador automatizado de Applied Biosystems, modelo n° 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ADN de plásmido para la secuenciación se preparó usando el kit Wizard Miniprep (Promega Corp., Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. La secuencia del producto amplificado predijo correctamente los datos internos de la secuencia de aminoácidos para los cebadores de PCR.
Los cebadores correspondientes a la secuencia amplificada se usaron en combinación con los cebadores degenerados en la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) usando el kit Marathon RACE (CLONTECH, Palo Alto, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante, excepto que la primera síntesis de ADNc de cadena se llevó a cabo a 50°C usando transcriptasa inversa Superscript II (Gibco-BRL). Brevemente, un oligonucleótido adaptador de doble cadena se ligó a los extremos de ADNc de doble cadena sintetizados de ARNm de cerebro de rata postnatal de 1 día. Usando cebadores de PCR de neurturina directa anidada (M1676; 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, ID SEC N°:50 y 1678; 5'-GACGAGGGTCCTTCCTG
GACGTACACA, ID SEC N°:53) en combinación con cebadores al adaptador ligado suministrado en el kit (AP1, AP2), el extremo 3' del ADNc de neurturina se amplificó mediante dos reacciones de PCR sucesivas (1ª M1676 y AP1, usando 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s y 72°C durante 2 min durante 35 ciclos; 2ª M1678 y AP2 usando 94°C durante 30 s y 68°C durante 2 min durante 35 ciclos). Se obtuvo una parte en 5' del ADNc de neurturina de rata mediante dos reacciones de PCR sucesivas usando el ADNc unido como molde. La 1ª reacción utilizó cebadores M1677 (ID SEC N°:52) y AP1; usando 94°C durante 30 s; 55°C durante 30 s; y 72°C durante 2 min durante 35 ciclos. La 2ª reacción usó M1679 5'-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (ID SEC N°:54) y AP2 a 94°C durante 30 s y 68°C durante 2 min durante 35 ciclos. Estas reacciones dieron como resultado una forma truncada del extremo 5' del ADNc de neurturina, aparentemente el resultado de la terminación prematura del ADNc durante la transcripción inversa. Los productos de RACE en 5' y 3' se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron. La secuencia de estos productos de RACE en 3' y 5' dio como resultado una secuencia parcial de ADNc de neurturina de rata de 220 nt. Los cebadores (n° 467921 5'-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG, ID SEC N°:55; y M1679 (ID SEC N°:54) correspondientes a la secuencia parcial de ADNc de rata se usaron (parámetros de PCR a 94°C durante 30 s y 68°C durante 1 min durante 35 ciclos) para amplificar un producto de PCR de 101 nucleótidos de ADN genómico de ratón que era homólogo a la secuencia de ADNc de neurturina de rata.
Entonces, estos cebadores se usaron para obtener clones genómicos de neurturina murina mediante amplificaciones de fragmentos de genes en una biblioteca 129/Sv de ratón en un vector bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., St. Louis, MO). Se identificó un fragmento de 1,6 kb de Nco I de este clon P1 que contenía el gen de neurturina mediante hibridación con cebador (n° 465782; 5'-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTG
GACGTACACAGCCGCTAYCAYAC, ID SEC N°:56). Este fragmento de Nco I se secuenció y se encontró que contenía un estiramiento de secuencia codificante correspondiente a las secuencias de aminoácidos N-terminales e internas obtenidas de la secuenciación de proteína activa aislada de medios condicionados con células CHO. Empezando en la secuencia de aminoácidos N-terminales de la proteína purificada, esta secuencia de nucleótidos codifica una proteína de 100 aminoácidos con una masa molecular predicha de 11,5 kD. Una investigación de bases de datos de proteínas y ácidos nucleicos identificó la neurturina como una proteína novedosa que es aproximadamente el 40% de idéntica al factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF). El GDNF se purificó y se clonó como un factor que promueve la supervivencia de neuronas dopaminérgicas mesencefálicas y es un miembro lejanamente relacionado de la superfamilia TGF-\beta, que ahora incluye más de 25 genes diferentes que poseen una amplia variedad de actividades proliferativas y diferenciadas. Aunque el GDNF es menos del 20% de idéntico que cualquier otro miembro de la familia TG-\beta, contiene los 7 residuos de cisteína que se conservan a lo largo de toda la familia y se cree son la base de una estructura nudo de cisteína conservada observada en la determinación de la estructura cristalina de TGF-B2. La neurturina también contiene estos 7 residuos de cisteína pero, al igual que el GDNF, es menos del 20% de homólogo que cualquier otro miembro de la familia TGF-\beta. Por tanto, la neurturina y el GDNF parece que representan una subfamilia de factores de crecimiento que se han separado significativamente del resto de la superfamilia TGF-\beta.
Para determinar la secuencia de la longitud total del ADNc de neurturina de ratón se realizaron PCR de RACE en 5' y 3' como anteriormente para la rata, usando cebadores anidados predichos de la secuencia genómica de ratón y ADNc de cerebro de ratón recién nacido. La 1ª reacción para el extremo 3' usó cebadores: M1777 5'-GCGGC
CATCCGCATCTACGACCGGG (ID SEC N°:57) y AP1 a 94°C durante 30 s; 65°C durante 15 s; y 68°C durante 2 min durante 35 ciclos. La 2ª reacción usó cebador n° 467921 (ID SEC N°:55) y AP2 a 94°C durante 30 s; 65°C durante 15 s; y 68°C durante 2 min durante 20 ciclos. El extremo 5' se obtuvo usando para la 1ª reacción el cebador M1759, 5'-CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGGT (ID SEC N°:58) y AP1 a 94°C durante 30 s; 65°C durante 15 s; y 68°C durante 2 min durante 35 ciclos. La 2ª reacción usó el cebador M1785, 5'-GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTA
GATGCG (ID SEC N°:59) y AP2 a 94°C durante 30 s; 65°C durante 15 s; y 68°C durante 2 min durante 20 ciclos. Ambos conjuntos de reacciones de PCR incluían DMSO al 5%. Los productos de RACE de ratón en 5' y 3' se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron. Usando la secuencia de productos de RACE puede ensamblarse una secuencia de ADNc de neurturina de ratón de 1,0 kb. Esta secuencia de ADNc contiene un marco de lectura abierto de 585 nucleótidos que codifica una proteína con una masa molecular de 24 kD. Esta secuencia de ADNc de ratón de longitud total se muestra en ID SEC N°:12. Concordando con los acontecimiento de procesamiento conocidos para producir miembros de la familia TGF-\beta, la proteína de neurturina de 24 kD contiene una secuencia señal de amino terminal de 19 aminoácidos seguida por un pro-dominio que contiene un sitio de procesamiento proteolítico RXXR inmediatamente antes de la secuencia de aminoácidos N-terminal obtenida cuando se secuencia la proteína purificada de medios condicionados con células CHO. Usando estas marcas se predice que la molécula de neurturina madura de 11,5 kD tiene 11,5 kD y, mediante analogía con otros miembros de la familia TGF-\beta, se predice que forma un homodímero unido por disulfuro de 23 kD, que concuerda con la masa de 25 kD de la proteína purificada de medios condicionados con células CHO como se estima mediante análisis de SDS-PAGE.
Para el aislamiento de clones genómicos humanos se usaron cebadores (n° 467524; 5'-CGCTACTGCGCAGGC
GCGTGCGARGCGGC, ID SEC N°:60 y n° 10005, 5'-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA, ID SEC N°:61) predichos de la secuencia de neurturina de ratón para amplificar (parámetros de PCR: desnaturalización inicial a 95°C durante 1 min 30 s seguida por 94°C durante 30 s; 60°C durante 15 s; y 68°C durante 60 s durante 35 ciclos) un fragmento de 192 nucleótidos de ADN genómico humano. La secuencia del producto de PCR demostró que era el homólogo humano de neurturina de ratón. Entonces, los cebadores se usaron para rastrear una biblioteca genómica humana construida en el vector P1 (servicio de rastreo de bibliotecas, Genome Systems, Inc.) y se obtuvieron dos clones que contenían el locus genómico de neurturina humana.
Se usó la misma estrategia para determinar la secuencia humana como se trató anteriormente para la secuencia de ratón. Se usó un oligo (n° 30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGACGAG, ID SEC N°:62) como una sonda en un análisis de transferencia Southern para identificar los fragmentos de restricción de los clones P1 que contenían la secuencia codificante de neurturina humana. Estos fragmentos de restricción (Eag I, Pvu II, Hind III, Kpn I) se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron.
Los resultados de subclonación y secuenciación de fragmentos genómicos humanos fueron del siguiente modo. Se encontró que el fragmento Eag I era aproximadamente de 6 kb de tamaño con el sitio de Eag I en 3' localizado 60 bp secuencia abajo del codón de terminación. El fragmento Pvu II era aproximadamente de 3,5 kb de tamaño con el sitio de Pvu II en 3' localizado 250 bp secuencia abajo del codón de terminación. El fragmento Hind III era aproximadamente de 4,8 kb de tamaño con el sitio de Hind III en 3' localizado 3 kb secuencia abajo del codón de terminación. El fragmento Kpn I era aproximadamente de 4,2 kb de tamaño con el sitio de Kpn I en 3' localizado 3,1 kb secuencia abajo del codón de terminación.
Se secuenció el segundo exón codificante usando estos fragmentos subclonados. Además, la secuencia se obtuvo a partir de 250 bp flanqueando la parte en 3' del segundo exón. La secuencia también se obtuvo a partir de 1000 bp flanqueando la parte en 5' del exón codificante. De estas secuencias flanqueantes se diseñaron el cebador directo 30341 (5'-CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3', ID SEC N°:71) y el cebador inverso 30331 (5'-GC
CAGTGGTGCCGTCGAGGCGGG-3', ID SEC N°:72) de manera que toda la secuencia codificante del segundo exón podría amplificarse mediante PCR.
El primer exón codificante no se cartografió respecto a los sitios de restricción anteriores, pero estaba contenido en el fragmento Eag I. La secuencia de este exón se obtuvo del fragmento Eag I subclonado usando el cebador de ratón 466215 (5'-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3', ID SEC N°:73) que contenía el codón de iniciación ATG. Se obtuvo otra secuencia del primer exón codificante con cebador inverso 20215 (5'-CCACTCCACTGCCTGAWATTCW
ACCCC- 3', ID SEC N°:74), diseñado a partir de la secuencia obtenida con cebador 466215. El cebador directo 20205 (5'-CCATGTGATTATCGACCATTCGGC- 3', ID SEC N°:75) se diseñó de la secuencia obtenida con cebador 20215. Los cebadores 20205 y 20215 flanquean la secuencia codificante del primer exón codificante y pueden usarse para amplificar esta secuencia codificante usando PCR.
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra la preparación de vectores de expresión que contienen ADNc de neurturina.
Para la expresión de neurturina recombinante en células de mamíferos se construyó el vector de neurturina pCMV-NTN-3-1. Se amplificó el marco de lectura abierto de 585 nucleótidos del ADNc de neurturina mediante PCR usando un cebador que contenía los 27 primeros nucleótidos de la secuencia de neurturina codificante (5'-GCGACGCGTAC
CATGAGGCGCTGGAAGGCAGCGGCCCTG, ID SEC N°:63) y un cebador que contenía los 5 últimos codones y el codón de terminación (5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC) (ID SEC N°:64) usando ARNm de cerebro de ratón postnatal de día 1 transcrito inverso como molde usando (parámetros de PCR: 94°C durante 30 s; 60°C durante 15 s; y 68°C durante 2 min durante 35 ciclos e incluyendo DMSO al 5% en la reacción). El producto de PCR se subclonó en el sitio Eco RV de BSKS y se secuenció para verificar que no contenía mutaciones generadas por PCR. Entonces, la secuencia codificante de neurturina se suprimió de su vector usando Mlu I (extremo 5') y Bam H1 (extremo 3') y se insertó secuencia abajo del promotor/potenciador de CMV IE en el vector de expresión de mamíferos pCB6 (Brewer, C.B. Methods in Cell Biology 43:233-245, 1994) para producir el vector pCMV-NTN-3-1 usando estos sitios.
Para la expresión de proteína recombinante en E. Coli se amplificó la región codificante madura de neurturina de ratón mediante PCR usando un cebador que contenía los 7 primeros codones de la secuencia codificante madura (5'-GACCATATGCCGGGGGCTCGGCCTTGTGG) (ID SEC N°:65) y un cebador que contenía los 5 últimos codones y el codón de terminación 5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC (ID SEC N°:66) usando un fragmento que contenía el gen de neurturina murina como molde usando (parámetros de PCR: 94°C durante 30 s; 60°C durante 15 s y 68°C durante 90 s durante 25 ciclos con 5%= DMSO añadido en la reacción). El producto amplificado se subclonó en el sitio Eco RV de BSKS, se verificó la secuencia de nucleótidos y entonces este fragmento se transfirió al vector de expresión pET-30a (Novagen, Madison, WI) usando un sitio Nde 1 (extremo 5') y un sitio Eco R1 (extremo 3'). El vector de pET-neurturina (pET-NTN) codifica para un iniciador de metionina delante del primer aminoácido de la proteína de neurturina de ratón madura predicha de la secuencia de aminoácidos N-terminales de neurturina purificada de medios condicionados con células CHO.
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Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra la transfección transitoria de células NIH3T3 con el vector de expresión de neurturina pCMV-NTN-3-1 y que el producto de la secuencia genómica en el ejemplo 5 es biológicamente activo.
Para demostrar que el ADNc de neurturina donado era suficiente para dirigir la síntesis de neurturina biológicamente activa se introdujo transitoriamente el plásmido pCMV-NTN-3-1 en células NIH3T3 usando el procedimiento de lipofectamina de transfección. Las células NIH3T3 se sembraron en placa a una densidad de 400.000 células por pocillo (34,6 mm de diámetro) en placas de 6 pocillos (Corning, Corning, NY) 24 horas antes de la transfección. Se prepararon complejos de liposoma-ADN y se añadieron a las células según el protocolo del fabricante usando 1,5 \mug de ADN de plásmido de CMV-neurturina (aislado y purificado usando una columna tip-500 Qiagen (Chatsworth, CA) según el protocolo del fabricante) y 10 \mul de reactivo de lipofectamina (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) en 1:1 de medio DME/F12 que contenía 5 \mug/ml de insulina, 5 \mug/ml de transferrina y 5 ng/ml de selenito de sodio (Sigma, St. Louis, MO). Cinco horas después de la adición del complejo de ADN-liposoma en 1 ml de medio por pocillo, se añadió 1 ml de medio DME que contenía suero bovino al 20% a cada una pocillo. Veinticuatro horas después de la adición de complejos de ADN-liposoma, los 2 ml del medio anterior se reemplazaron con 1 ml de medio DME que contenía suero bovino al 10%, glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 \mu/ml de estreptomicina y 25 ug/ml de heparina. Las células se incubaron durante 24 horas adicionales antes de que el medio condicionado se cosechara, se centrifugara para eliminar los residuos celulares y se congelara.
Como control se transfectaron células NIH3T3 como antes usando 1,5 \mug de plásmido de expresión de CMV-neo (que no contenía inserto de ADNc) en lugar de los 1,5 \mug de plásmido de CMV-neurturina. El medio condicionado de células NIH3T3 transfectadas con, o bien el plásmido de control o bien el plásmido de CMV-neurturina, se ensayó mediante adición directa al medio de cultivo de SCG en el momento de la privación de NGF. La adición de 0,25 ml de medio condicionado de células transfectadas de CMV-neurturina promovió el 70% de supervivencia de neuronas simpáticas y podría obtenerse >90% de supervivencia con 0,45 ml de este medio condicionado. No se detectó actividad promotora de la supervivencia significativa en el medio condicionado de células NIH3T3 transfectadas de
control.
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra la preparación de células ováricas de hámster chino establemente transformadas con ADNc de neurturina.
Las células DG44, un derivado de células ováricas de hámster chino que carece de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub y col. Cell 3:405-412, 1983), se cotransfectaron establemente con plásmido de expresión (pCMV-NTN-3-1) y un plásmido de expresión de DHFR (HLD) (McArthur, y Stanners J. Biol Chem. 266:6000-6005, 1991).
En el día 1, las células de DG44 se sembraron en placa a 1x10^{6} células por 10 cm de placa en medio Ham F12 con suero bovino fetal al 10% (SBF). Esta densidad no debe superarse o las células crecerán en exceso antes de que se añada el medio de selección en el día 5.
En el día 2, las células se transfectaron con una razón 9:1 de plásmido de expresión pCMV-NTN respecto a DHFR usando el procedimiento de fosfato de calcio (10 ug de ADN /10 cm de placa) (Chen y Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-2752, 1987).
En el día 3, las células transfectadas se lavaron con medio Ham F12 y se alimentó Ham F12 con SBF al 10%.
En el día 5, las células se lavaron con medio MEM alfa y se alimentó el medio de selección, que es MEM alfa con SBF al 10% y 400 ug/ml de G418. Las células se mantuvieron en medio de selección, alimentándose cada 4 días. Las colonias empezaron a aparecer aproximadamente 14 días después de la transfección. Entonces, las colonias que crecían en el medio de selección se transfirieron a una placa de 24 pocillos y al siguiente día se trataron con tripsina para dispersar las células. Las células crecieron hasta confluencia en o bien placas de 24 pocillos o bien de 6 pocillos con el fin de rastrear las células para la expresión de la proteína recombinante. La expresión de neurturina se examinó en 10 líneas clonales y se detectaron dos líneas de alta expresión usando el ensayo de supervivencia SCG. Estas líneas clonales se expandieron y la expresión en estas líneas celulares seleccionadas se amplificó mediante selección en metotrexato 50 nM (MTX). Para la selección en MTX, las células se hicieron crecer hasta el 50% de confluencia en un matraz de 150 cm^{2} en medio de selección. El medio se cambió a MEM alfa que contenía concentración de MTX 50 nM (no era necesario usar G418 durante la amplificación de MTX). Después de la colocación en MTX 50 nM, la mayoría de las células murieron y las colonias de células resistentes reaparecieron en 1-2 semanas. En este momento, las células se trataron con tripsina para dispersar las colonias y se escienden cuando las células alcanzan la confluencia. Las células alcanzaron eventualmente la misma velocidad de crecimiento que antes. Las células seleccionadas se rastrearon para la expresión de proteína recombinante. Se observó un aumento de 2-3 veces en la expresión después de la selección en MTX 50 nM. Las reservas congeladas se mantuvieron para líneas celulares obtenidas a partir de la selección original y la selección de MTX 50 nM. Podría continuarse otra selección aumentando el MTX hasta que se obtengan niveles deseados de expresión.
\newpage
Usando el procedimiento anterior se aislaron células identificadas como DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1) y DG44CHO5-3(50nMMTX)(pCMV-NTN-3-1). Las células de la cepa DG44CHO5-3(50nMMTX)(pCMV-NTN-3-1) expresaron niveles de aproximadamente 100 \mug de proteína biológicamente activa por litro de medio condicionado determinado mediante ensayo directo de medios condicionados en ensayo del SCG según los procedimientos en el ejemplo 1.
Ejemplo 9
Este ejemplo ilustra la expresión de neurturina en diversos tejidos.
Se realizó un estudio de expresión de neurturina y GDNF en tejidos embrionarios de rata (E10, día 10 después de la concepción), tejidos recién nacidos (P1, día 1 postnatal), y tejidos adultos (> 3 meses) usando RT/PCR semicuantitativa (Estus y col., J Cell Biol 127:1717-1727, 1994). Se obtuvieron muestras de ARN de diversos tejidos y se detectaron productos de PCR bien mediante autorradiografía después de la incorporación de \alpha-^{32}P-dCTP en el PCR y electroforesis en un gel de poliacrilamida o bien mediante tinción de bromuro de etidio de ADN después de la electroforesis en geles de agarosa (tablas 3 y 4). El fragmento de neurturina de 101 pares de bases se obtuvo usando el cebador directo CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG (ID SEC N°:67) y el cebador inverso TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (ID SEC N°:68) y el fragmento de GDNF de 194 pares de bases se obtuvo usando el cebador directo AAAAATCGGGGGTGYGTCTTA (ID SEC N°:69) y el cebador inverso CATGCCTGGCCTACYTTGTCA (ID SEC N°:70).
No se detectó ARNm de neurturina o GDNF en la edad embriónica más temprana (día embriónico 10, E10) estudiada.
En neonatos (día postnatal 1, P1), ambos transcritos se expresaron en muchos tejidos, aunque la neurturina tendía a mostrar una mayor expresión en la mayoría de los tejidos que el GDNF. (véase tabla 3).
TABLA 3
Neurturina GDNF
Hígado +++ -
Sangre +++ +
Timo + -
Cerebro ++ +
Nervio ciático - +
Riñón ++ ++
Bazo ++ +
Cerebelo ++ +
Corazón ++ +
Hueso + +
Como se muestra en la tabla 3, se observaron las diferencias en las distribuciones de tejidos de neurturina y GDNF. En particular, no se detectó GDNF en el hígado y el timo, en los que se detectó expresión de neurturina y no se detectó neurturina en el nervio ciático, en el que se detectó GDNF.
El ARNm de neurturina y GDNF se detectaron en muchos tejidos en el animal adulto, pero el modelo específico para tejido de expresión para estos dos genes era muy diferente. (tabla 4).
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TABLA 4
Neurturina GDNF
Hígado - -
Sangre + -
Timo + ++
Cerebro + -
Nervio ciático - -
Riñón ++ +
Bazo - +
Cerebelo - -
Útero ++ -
TABLA 4 (continuación)
Neurturina GDNF
Médula ósea ++ -
Testículos ++ ++
Ovario + +
Placenta + -
Músculo esquelético + -
Médula espinal + -
Glándula suprarrenal ++ ++
Intestino + ++
Como se muestra en la tabla 4, se encontró que la neurturina se expresaba en el cerebro y la médula espinal, además de en la sangre y la médula ósea, en las que no se detectó GDNF. Sin embargo, el nivel de expresión de neurturina en el cerebro y la sangre era inferior al detectado en el tejido recién nacido.
La neurturina también estaba sumamente expresada en mastocitos peritoneales recién aislados, mientras que el GDNF mostró poca o ninguna expresión.
Ejemplo 10
Este ejemplo ilustra la preparación de antisueros para neurturina mediante inmunización de conejos con un péptido de neurturina.
Se sintetizó la secuencia de péptidos correspondiente a los aminoácidos 73-87 de la proteína de neurturina murina y se acopló a hemocianina de lapa californiana (KLH) como se describe antes (Harlow y Lane, Antibodies: a laboratory manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, NY. página 72-81). El péptido acoplado a KLH fue presentado a Caltag, Inc. y se inmunizaron cada uno de dos conejos. La inmunización fue mediante inyección subcutánea en 7-10 sitios. La primera inyección fue con 150 \mug de péptido acoplado a KLH que se resuspendió en 0,5 ml de solución salina y se emulsionó con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund. Las inyecciones de refuerzo comenzaron 4 semanas después de la inyección inicial y se realizaron una vez cada 7 días como anteriormente durante un total de 5 inyecciones, excepto que se usaron 100 \mug de péptido acoplado a KLH y adyuvante incompleto de Freund. Las muestras de suero se recogieron 1 semana después de la quinta dosis de refuerzo.
Se purificó un volumen reunido de veinte ml de suero que se había recogido de ambos conejos una semana después de la 5ª inyección. Para la purificación se preparó una columna de afinidad por péptidos mediante acoplamiento del péptido anterior a Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno según el protocolo del fabricante (Pharmacia Biotech). El suero se diluyó 10 veces en tampón Tris 10 mM de pH 7,5 y se mezcló mediante balanceo suave durante 16 horas a 4°C con 0,5 ml de matriz de agarosa-péptido que contenía 5 mg de péptido acoplado. La matriz se colocó en una columna, se lavó con 5 ml de Tris 10 mM de pH 7,5, NaCl 150 mM, se lavó con 5 ml de Tris 10 mM de pH 7,5 tampón que contenía NaCl 0,4 M y se eluyó con 5,5 ml de tampón glicina 100 mM de pH 2,5. Inmediatamente después de la elución se añadió un décimo del volumen de tampón Tris 1,0 M de pH 8,0 al eluato para neutralizar el pH. El eluato de glicina se dializó durante la noche frente a Tris 10 mM de pH 7,5, NaCl 150 mM.
Los anticuerpos purificados por afinidad se usaron en una transferencia Western para demostrar el reconocimiento específico de proteína recombinante de neurturina. Se purificaron diez ml de medio condicionado recogido de células DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1) sobre SP Sepharose como se describe en el ejemplo 1 y las proteínas se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE reductor en el sistema de tampón tricina (Schagger y von Jagow Analytical Biochemistry 166:368-379, 1987). Las proteínas se sometieron a electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa en Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,04%, metanol al 17% a 4°C durante 16 h. La membrana se incubó con los anticuerpos de péptido anti-neurturina purificados por afinidad y luego con IgG de cabra anti-conejo acoplada a peroxidasa de rábano (Harlow y Lane, antes mencionado, páginas 498-510). Los anticuerpos unidos se detectaron con quimioluminiscencia potenciada (kit ECL, Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra). Los anticuerpos anti-neurturina reconocieron una banda de proteína individual de aproximadamente 11,5 kD en el medio condicionado de las células DG49CHO5-3(G418)(pCMV- NTN-3-1). Usando estos anticuerpos anti-neurturina podría detectarse la proteína de neurturina en 10 ml de medio condicionado de células DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1), pero no podría detectarse en 10 ml de medio condicionado con células DG44 que no se habían transformado con el vector de expresión de neurturina.
Ejemplo 11
El siguiente ejemplo ilustra la identificación de miembros adicionales de la subfamilia de genes de GDNF/neurtu-
rina/persefina.
La superfamilia TGF-\beta contiene actualmente más de 25 miembros de genes diferentes (para revisión véase Kingsley, Genes and Development 8: 133-146, 1994). Los miembros individuales de la familia manifiestan grados variables de homología entre sí y pueden definirse varios subgrupos dentro de la superfamilia mediante análisis filogenético usando el programa Clustal V (Higgins y col., Comput Appl Biosci 8: 189-191, 1992) y mediante análisis de secuencias iniciales de instrucciones de árboles filogenéticos (Felsenstein, Evolution 39:783-791, 1985). La neurturina o persefina es aproximadamente el 40% de idéntica a GDNF pero inferior al 20% de idéntica a cualquier otro miembro de la superfamilia TGF-\beta. En la neurturina (figura 5) pueden identificarse varias regiones de secuencias que están sumamente conservadas dentro de la subfamilia GDNF/neurturina/persefina pero no dentro de la superfamilia TGF-\beta. Estas regiones conservadas son probablemente para caracterizar una subfamilia que previamente contenía genes no aislados, que ahora pueden aislarse usando las regiones de secuencias conservadas identificadas mediante el descubrimiento y la secuenciación de los genes de neurturina y persefina. Las regiones de alta conservación de secuencia entre neurturina, persefina y GDNF permiten el diseño de oligonucleótidos degenerados que pueden usarse como sondas o cebadores. Las secuencias de aminoácidos de regiones conservadas se han identificado en este documento para incluir Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr en las que Xaa_{1} es Ser, Thr o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:108); Glu-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{4}-Gly-Xaa_{5}-Cys en que Xaa_{1} es Thr, Glu o Iys, Xaa_{2} es Val, Leu o Ile, Xaa_{3} es Leu o Ile; Xaa_{4} es Ala o Ser, y Xaa_{5} es Ala o Ser, (ID SEC N°:113); y Cys-Cys-Xaa_{1}-Pro-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Asp-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Phe-Leu-Asp-Xaa_{9} en la que Xaa_{1} es Arg o Gln, Xaa_{2} es Thr o Val o Ile, Xaa_{3} es Ala o Ser, Xaa_{4} es Tyr o Phe, Xaa_{5} es Glu, Asp o Ala, Xaa_{6} es Glu, Asp o no aminoácido, Xaa_{7} es val o Ieu, Xaa_{8} es Ser o Thr, y Xaa_{9} es Asp o Val (ID SEC N°:114). Las secuencias de nucleótidos que contienen una secuencia codificante para las secuencias o fragmentos anteriormente conservados de las secuencias anteriormente conservadas pueden usarse como sondas. A modo de ejemplo, las secuencias de sonda y cebador que puede diseñarse de estas regiones son del siguiente modo.
Cebadores directos
cebador A (M3119): 5'-GTNDGNGCUALQUIERTGGGNYTGGGNTA (ID SEC N°:115) de 23 nt que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr en la que Xaa_{1} es Thr, Ser o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:125);
cebador B (M3123): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANG (ID SEC N°:116) de 19 nt que codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} en la que Xaa_{1} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (ID SEC N°:126);
cebador C (M3126): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANGW (ID SEC N°:117) de 20 nt que codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-xaa_{2}-xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} en la que Xaa_{1} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (ID SEC.N°:126);
cebador D (M3121): 5'-TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTG (ID SECN°:118) de 23 nt que codifica para la secuencia de aminoácidos, Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa,-Gly-Xaa_{2}-Cys en la que Xaa_{1} es Ser o Ala y Xaa_{2} es Ser o Ala (ID SEC N°:127);
cebador E (M3122): 5'-GTNDGNGCUALQUIERTGGGNYTNGG (ID SEC N°:119) de 20 nt que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly en la que Xaa_{1} es Thr, Ser o Ala y Xaa_{2} es Asp o Glu (ID SEC N°:128); y
cebador F (M3176): 5'-GTNDGNGCUALQUIERTGGGNYTGGGNTT (ID SEC N°:120) de 23 nt que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Phe en la que Xaa_{1} es Thr, Ser o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:129).
Cebadores inversos
cebador G (M3125): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNTC (ID SEC N°:121) de 20 nt cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} en la que Xaa, es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (ID SEC N°:126);
cebador H (M3124): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNT (ID SEC N°:122) de 19 nt cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} en la que Xaa_{1} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (ID SEC N°:126);
cebador I (M3120): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAA (ID SEC N0:123) de 23 nt cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys en la que Xaa_{1} es Ser o Ala y Xaa_{2} es Ser o Ala (ID SEC N0:127); y
cebador J (M3118): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAANA (ID SEC N°:124) de 25 nt cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{2}-Gly-Xaa_{3}-Cys en la que Xaa_{1} es Ile o Leu, Xaa_{2} es Ser o Ala y Xaa_{3} es Ser o Ala (ID SEC N°:130).
Además de lo anterior, los cebadores siguientes están basados en regiones conservadas en GDNF y neurturina (ID SEC N°:33-35).
Cebador 1, GTNWSNGCUALQUIERTNGGNYTNGGNTA (ID SEC N°:42) que codifican la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr en la que Xaa_{1} es Ser o Thr y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:33);
cebador 2, TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC (ID SEC N°:43) que codifican la secuencia de aminoácidos Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ala en la que Xaa_{1} es Ala o Ser, Xaa_{2} es Ala o Ser, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Ser o Ala (ID SEC N°:36);
cebador 3 inverso GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA (ID SEC N°:44) cuya secuencia complementaria inversa codifica la secuencia de aminoácidos Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ala en la que Xaa_{1} es Ala o Ser, Xaa_{2} es Ala o Ser, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Ser o Ala (ID SEC N°:37);
cebador 4 inverso TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA (ID SEC N°:45) cuya secuencia complementaria inversa codifica la secuencia de aminoácidos Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa_{1}-Ala-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Asp-Xaa_{4} en la que Xaa_{1} es Ile o Thr o Val, Xaa_{2} Try o Phe, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Glu o Asp (ID SEC N°:38);
cebador 5 inverso TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC (ID SEC N°:46) cuya secuencia complementaria inversa codifica la secuencia de aminoácidos Ala-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Asp-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ser-Phe-Leu-Asp en la que Xaa_{1} es Tyr o Phe, Xaa_{2} Glu o Asp, Xaa_{3} es Glu o Asp, y Xaa_{4} es Val o Leu (ID SEC N°:39);
cebador 6 GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG (ID SEC N°:47) que codifica la secuencia de aminoácidos Glu-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys en la que Xaa_{1} es Glu o Thr, Xaa_{2} es Leu o Val y Xaa_{3} es Ile o Leu (ID SEC N°:40);
cebador 7 GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA (ID SEC N°:48) que codifica la secuencia de aminoácidos Glu-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{4}-Gly-Xaa_{5}-Cys-Xaa_{6} en la que Xaa_{1} es Glu o Thr, Xaa_{2} es Leu o Val, Xaa_{3} es Ile o Leu, Xaa_{4} es Ser o Ala, Xaa_{5} es Ser o Ala y Xaa_{6} es Glu o Asp (ID SEC N°:41).
Las secuencias anteriores pueden usarse como sondas para rastrear bibliotecas de clones genómicos o como cebadores para amplificar fragmentos de genes de ADN genómico o bibliotecas de clones genómicos o de ADNc transcrito inverso usando moldes de ARN de una variedad de tejidos. El ADN genómico o las bibliotecas de clones genómicos pueden usarse como moldes debido a que las secuencias codificantes de neurturina, persefina y GDNF para las proteínas maduras no están interrumpidas por intrones.
Un oligonucleótido degenerado puede sintetizarse como una mezcla de oligonucleótidos que contiene todas las secuencias de nucleótidos posibles para codificar para la secuencia conservada de aminoácidos. Para reducir el número de diferentes oligonucleótidos en una mezcla degenerada puede incorporarse una inosina o base universal (Loakes y col., Nucleic Acids Res 22:4039-43, 1994) en la síntesis en las posiciones en las que son posibles los cuatro nucleótidos. La inosina o base universal forma pares de bases con cada una de las cuatro bases de ADN normales que son menos estabilizantes que los pares de bases AT y GC, pero que también son menos estabilizantes que los desapareamientos entre las bases normales (es decir, AG, AC, TG, TC).
Para aislar miembros de familias, un cebador anterior puede marcarse en un extremo con ^{32}P usando polinucleótido cinasa de T4 e hibridarse a bibliotecas de clones genómicos humanos según procesos habituales.
Un procedimiento preferido para el aislamiento de genes de miembros de familias sería usar diversas combinaciones de los cebadores degenerados anteriores como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa usando ADN genómico como un molde. Las diversas combinaciones de cebadores pueden incluir reacciones de PCR secuenciales que utilizan cebadores anidados o el uso de un cebador directo apareado con un cebador oligo dT. Además, uno de los cebadores degenerados puede usarse con un cebador de vector, un cebador individual puede usarse en ensayo inverso de PCR o puede realizarse PCR con un cebador degenerado y un cebador al azar. Como un ejemplo usando el conjunto de cebadores anteriores, el cebador 2 (ID SEC N°:43) puede usarse con el cebador 4 (ID SEC N°:45) en PCR con 1 ug de ADN genómico humano y parámetros de ciclado de 94°C durante 30 s, 50°C durante 30 s y 72°C durante 60 s. Las condiciones de PCR anteriores sólo son a modo de ejemplo y un experto en la materia apreciará fácilmente que un intervalo de condiciones adecuadas y combinaciones de cebadores podrían usarse u optimizarse, tales como temperaturas diferentes y variando las concentraciones de sal en el medio de tampón y similares. Se prefiere que se añada DMSO a la reacción de PCR a una concentración final de 5% ya que se encontró que ésta era necesaria para la amplificación de esta región del gen de neurturina. La reacción de PCR, cuando corre en un gel de agarosa, debería contener productos en el intervalo de tamaño de 100-150 pares de bases ya que se introduce un hueco de aminoácidos en la secuencia de neurturina y se introduce un hueco de cinco aminoácidos en la secuencia de persefina cuando cualquier secuencia está alineada con GDNF, y por tanto los genes de miembros de familias también podrían contener un espaciado ligeramente variable entre las secuencias conservadas de cebadores 2 y 4. Los productos de PCR en el intervalo de 100-150 pares de bases deberían contener múltiples productos de genes amplificados incluyendo GDNF, neurturina y persefina, además de los miembros de familias previamente no aislados. Para identificar secuencias de estos productos pueden purificarse en gel y ligarse al plásmido Bluescript (Stratagen) y entonces transformarse en la cepa huésped de E. Coli XL1-blue (Stratagene). Las colonias bacterianas que contienen subclones individuales pueden escogerse para aislamiento y sembrarse en placa en filtros de nitrocelulosa en dos réplicas. Cada uno de los filtros réplica puede rastrearse con un sonda de oligonucleótidos para o bien GDNF único o bien neurturina única o secuencia de persefina única en la región amplificada. Los subclones que no hibridan o bien GDNF o bien neurturina o persefina pueden secuenciarse y si se encuentra que codifican miembros de familias previamente no aislados, la secuencia puede usarse para aislar clones de ADNc de longitud total y clones genómicos como se hizo para neurturina (ejemplo 5). Se usó un procedimiento similar para aislar nuevos miembros de genes (GDF-3 y GDF-9) de la superfamilia TGF-\beta a base de homología entre genes previamente identificados (McPherron J Biol Chem 268: 3444-3449, 1993).
Los inventores en este documento creen que el camino más preferido para aislar genes de miembros de familias puede ser aplicar el proceso de PCR anterior como un procedimiento de rastreo para aislar clones genómicos de miembros de familias individuales de una biblioteca. Esto es debido a que sólo hay un exón para la región codificante de ambas neurturina y GDNF maduros. Si, por ejemplo, la reacción de PCR anterior con los cebadores 2 y 4 genera productos del tamaño apropiado usando ADN genómico humano como molde, la misma reacción puede realizarse usando, como molde, acervos de clones genómicos en el vector PI según procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo que se usaron para el aislamiento clones genómicos humanos de neurturina (ejemplo 5). Se han identificado previamente los acervos que contienen el gen de neurturina en esta biblioteca y los acervos que contienen persefina y GDNF puede identificarse fácilmente mediante rastreo con cebadores específicos de GDNF y PSP. Por tanto, los acervos de no neurturina, no persefina, no GDNF que generan un producto de tamaño correcto usando los cebadores degenerados serán fácilmente reconocidos como miembros de familias previamente no aislados. Los productos de PCR generados de estos acervos pueden secuenciarse directamente usando el secuenciador automatizado y los clones genómicos pueden aislarse mediante subdivisión adicional y rastreo de los clones acervados como un servicio habitual ofrecido por Genome Sistemas, Inc.
Ejemplo 12
El siguiente ejemplo ilustra el aislamiento y la identificación de persefina utilizando los procesos y cebadores descritos en el ejemplo 11.
La estrategia de PCR degenerada ideada por los inventores en este documento se ha utilizado ahora con éxito para identificar un tercer factor, persefina, que es aproximadamente 35-50% de idéntica a ambos GDNF y neurturina. Anteriormente se describió la aproximación experimental y se proporciona en mayor detalle del siguiente modo. Se usaron los cebadores correspondientes a la secuencia de aminoácidos Val-Xaa-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Cly-Tyr en la que Xaa_{1} es Ser o Thr y Xaa_{2} es Glu o Asp (ID SEC N°:33) [M1996; 5'-GTNWSNGCUALQUIERTNGGNYTNGGNTA (ID SEC N°:42)] y Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ala en la que Xaa_{1} es Ala o Ser, Xaa_{2} es Ala o Ser, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Ser o Ala (ID SEC N°:37) [M1999; 5'-GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRCARTANCKRAA (ID SEC N°:44)] para amplificar un fragmento de 77 nt de ADN genómico de rata usando la enzima Klentaq y tampón en las siguientes condiciones: 94°C durante 30 s; 44°C durante 30 s; 72°C durante 30 s durante 40 ciclos. El producto resultante se subclonó en el plásmido Bluescript KS y se secuenció. Toda la secuenciación de nucleótidos se realizó usando tecnología de terminación de colorantes fluorescentes por las instrucciones del fabricante en una secuenciador automatizado de Applied Biosystems, modelo n° 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ADN de plásmido para la secuenciación se preparó usando el kit Wizard Miniprep (Promega Corp., Madison, WI) según las instrucciones del fabricante.
La secuencia de uno de los productos amplificados predijo los datos internos de la secuencia de aminoácidos para los cebadores de PCR que era diferente de la de GDNF o neurturina, pero tenía un 20% superior de identidad con GDNF y neurturina, mientras que las secuencias de otros que se obtuvieron correspondían a GDNF o neurturina, como sería de esperar. Se pensó en la secuencia novedosa para identificar un nuevo miembro de esta familia que se llamó persefina.
La secuencia de este fragmento interno para los cebadores era 5'-TGCCTCAGAGGAGAAGATTATC (ID SEC N°:90). Ésta codifica el último nucleótido del codón de Tyr, y entonces codifica los aminoácidos: Ala-Ser-Glu-Glu-Lys-Ile-Ile (ID SEC N°:91). Entonces, esta secuencia estaba alineada con las secuencias de rata de GDNF y neurturina. Este análisis confirmó que la persefina era única.
LGLGYETKEELIFRYC GDNF (rat) (ID SEC N°:92)
LGLGYTSDBTVLFRYC NTN (rat) (ID SEC N°:93)
LGLGYASEEKIIFRYC PSP (rat) (ID SEC N°:94)
Para obtener secuencia de persefina adicional se usaron cebadores que contenían partes de la única de 22 nt del fragmento anterior en la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) usando el kit RACE Marathon (CLONTECH, Palo Alto, CA) por instrucciones del fabricante excepto que la primera síntesis de ADNc de cadena se llevó a cabo a 50°C usando transcriptasa inversa Superscript II (Gibco-BRL). Brevemente, un oligonucleótido adaptador de doble cadena se ligó a los extremos de ADNc de doble cadena sintetizados de ARNm de cerebro de rata postnatal de 1 día. Usando cebadores de PCR de persefina directa anidada, (10135; 5'-AGTCGGGGTTGGGGTATGCCTCA, ID SEC N°:95 y M2026; 5'-TATGCCT
CAGAGGAGAAGATTATCTT ID SEC N°:96) en combinación con cebadores al adaptador ligado suministrado en el kit (AP1, AP2), el extremo 3' del ADNc de persefina se amplificó mediante dos reacciones de PCR sucesivas (1ª: 10135 y AP1, usando 94°C durante 30 s, 60°C durante 15 s y 68°C durante 2 min durante 35 ciclos; 2a: M2026 y AP2 usando 94°C durante 30 s, 60 durante 15 s y 68°C durante 2 min durante 21 ciclos). De esta reacción de PCR se obtuvo un fragmento de aproximadamente 350 nt y este fragmento se secuenció directamente usando cebador M2026. La secuencia de este producto de RACE en 3' dio como resultado una secuencia parcial de ADNc de persefina de rata de aproximadamente 350 nt (ID SEC N°:97). La secuencia de aminoácidos predicha de este ADNc se comparó con la de GDNF y neurturina, y se encontró que era aproximadamente el 40% de homóloga a cada una de estas proteínas. El espaciado característico de los residuos de cisteína de estructura canónica estaba presente en gran medida en miembros de la superfamilia TGF-\beta. Adicionalmente, además de la región de similitud codificada por los cebadores degenerados usados para aislar persefina, también estaba presente en persefina otra región de homología alta compartida entre GDNF y neurturina, pero ausente en otros miembros de la superfamilia TGF-\beta.
GDNF ACCRPVAFDDDLSFLDD (aa 60-76) (SEC ID N°:98)
NTN PCCRPTAYEDEVSFKDV (aa 61-77) (SEC ID N°:99)
PSP PCCQPTSYAD-VTFLDD (aa 57-72) (SEC ID N°:100)
(la numeración de aminoácidos usa el primer residuo de Cys como aminoácido 1).
Con la confirmación de que la persefina era de hecho un nuevo miembro de la subfamilia GDNF/NTN, se aislaron clones genómicos murinos de persefina para obtener información adicional de la secuencia. Se usaron los cebadores (directo, M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT, ID SEC N°:96 e inverso, M3028; 5'-TCATCAAG
GAAGGTCACATCAGCATA, ID SEC N°:101) correspondientes a la secuencia de ADNc de rata en una reacción de PCR (parámetros de PCR: 94°C durante 30 s, 55°C durante 15 s y 72°C durante 30 s durante 35 ciclos) para amplificar un fragmento de 155 nt de ADN genómico de ratón que era homólogo a la secuencia de ADNc de persefina de rata. Entonces, estos cebadores se usaron para obtener clones genómicos de persefina murina de una biblioteca 129/Sv de ratón en un vector bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).
Los fragmentos de restricción (3,4 kb de Nco I y 3,3 kb de Bam H1) de este clon de P1 que contiene el gen de persefina se identificaron mediante hibridación con un fragmento de 210 nt obtenido mediante PCR usando ADN genómico de ratón con cebadores (directo, M2026; ID SEC N°:96 e inverso, M3159; 5'-CCACCACAGCCACAAGCTGCGGST
GAGAGCTG, ID SEC N°:102) y parámetros de PCR: 94°C durante 30 s, 55°C durante 15 s y 72°C durante 30 s durante 35 ciclos. Se secuenciaron los fragmentos de Nco I y Bam H1 y se encontró que codificaban un estiramiento de aminoácidos correspondiente al presente en el producto de RACE de persefina de rata, además de ser homólogos a las regiones maduras de ambas neurturina y GDNF.
Cuando las secuencias de aminoácidos de GDNF, neurturina y persefina murina se alinean usando la primera cisteína como el punto de partida (que se hace debido a que las alteraciones en los sitios de escisión entre miembros de familias crea variabilidad en los segmentos secuencia arriba de la primera cisteína), la persefina (91 aminoácidos) es algo más pequeña que cualquier neurturina (95 aminoácidos) o GDNF (94 aminoácidos). La identidad global dentro de esta región es aproximadamente el 50% con neurturina y aproximadamente el 40% con GDNF.
Otra secuenciación de nucleótidos del fragmento de Nco I de persefina murina desveló la secuencia de nucleótidos del gen total de persefina murina (ID SEC N°:131; figura 1A). Se extiende un marco de lectura abierto desde la secuencia que codifica para un iniciador de metionina hasta un codón de terminación en las posiciones 244-246. Sin embargo, en algún sitio de esta secuencia se encontró que se producía una anomalía aparente tal que la secuencia que codifica el sitio de escisión RXXR (nucleótidos en las posiciones 257-268) y la secuencia correspondiente a la proteína de persefina madura (posiciones 269-556) no eran colineales con este marco de lectura abierto. En su lugar, un segundo marco de lectura codifica el sitio de escisión y la persefina madura.
También se ha realizado la secuenciación adicional de la persefina de rata. Se amplificaron los fragmentos genómicos de rata mediante PCR usando Klentaq y ADN genómico de rata como un molde. Se usaron el cebador directo n° 40266 (5'-AATCCCCAGGACAGGCAGGGAAT; ID SEC N°:137) correspondiente a una región secuencia arriba del gen de persefina de ratón y un cebador inverso M3156 (5'- CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, ID SEC N°:138) correspondiente a una región dentro de la secuencia de persefina de rata madura con los siguientes parámetros (95°C durante 15 s, 55°C durante 15 s, 68°C durante 45 s x 30 ciclos). El producto amplificado se trató con cinasa con polinucleótido cinasa de T4, los extremos se hicieron romos con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) de E. coli y se donaron en plásmido BSKS.
La secuenciación de nucleótidos se realizó para establecer la secuencia del gen total de persefina de rata (ID SEC N°:134; figura 1A). Se encontró que un marco de lectura abierto extendía la secuencia codificando para un iniciador de metionina hasta un codón de terminación en las posiciones 244-246 como se observó con persefina murina. Como también se observó con persefina murina, se encontró que se producía una anomalía entre la secuencia que codifica el iniciador de metionina y la que codifica el sitio de escisión para la persefina de rata madura tal que existen dos marcos de lecturas convincentes. Independientemente de esta anomalía, se encontró que las células de mamíferos expresan persefina de o bien la secuencia genómica de longitud completa murina o bien de rata como se ilustra más adelante (véase ejemplo 14).
Para buscar la génesis de esta anomalía se prepararon vectores de expresión de mamíferos para ambas, persefina murina y de rata. Para construir el plásmido murino se usó un clon P1 que contenía el gen de persefina murina como un molde en un ensayo de PCR. Los cebadores se diseñaron tal que el fragmento resultante contuviera el gen de persefina que se extendía desde el iniciador de metionina hasta el codón de terminación. La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA] y cebador inverso M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC]. Para construir el plásmido de rata análogo se usó ADN genómico de rata como un molde en un ensayo de PCR. La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 [5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA] y cebador inverso M3156 [5'-CGGTACCCAGATCTTCAG
CCACCACAGCCACAAGC]. Los productos amplificados se clonaron en BSKS y se secuenciaron para verificar que se había obtenido el clon correcto. Se suprimieron los fragmentos de persefina de rata y murina usando Sma I y Hind III y se clonaron en una Asp718 (roma) y sitios de Hind III del vector de expresión pCB6 de mamíferos.
Se transfectaron células COS de mono con o bien los vectores de expresión de persefina de rata o murina o bien el propio vector no recombinante (pCB6). Cuarenta y ocho horas después, las células se lisaron, las muestras se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 15% y las proteínas se separaron mediante electroforesis. Entonces, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa mediante electrotransferencia. Esta membrana de nitrocelulosa se incubó con anticuerpos anti-persefina (que se obtuvieron para persefina madura producida en bacterias a partir de un plásmido pET) para detectar la presencia de persefina en los lisados. Los lisados de células transfectadas con o bien los vectores de expresión de persefina de rata o bien murina, pero no el lisado de células transfectadas con pCB6, contiene altas cantidades de persefina. El tamaño de la persefina detectada era de 10-15 kD, que concuerda con el tamaño predicho para la procesada (es decir, forma madura de persefina). Los medios condicionados cosechados de estas células también contenían persefina madura. Estos resultados demuestran que ambos, los genes de persefina murina y de rata, pueden dirigir la síntesis de una molécula de persefina apropiadamente procesada.
Para buscar el mecanismo mediante el que esto se produce se aisló ARN de células transfectadas con o bien vector de expresión de persefina de rata o bien murina. Los análisis de RT/PCR se realizaron usando cebadores correspondientes al iniciador Met y el codón de terminación. Se detectaron dos fragmentos: uno correspondiente al tamaño predicho del gen de persefina y el otro algo más pequeño, sugiriendo que se ha producido el corte y empalme de ARN. Esto se confirmó con varios otros pares de cebadores. Ambos, los fragmentos de persefinas grandes y pequeños, se clonaron y se secuenciaron. Como se esperaba, el fragmento mayor correspondía al gen de persefina. El fragmento pequeño correspondía a una versión cortada y empalmada de persefina. Se había cortado y empalmado un pequeño intrón de 88 nt dentro del prodominio (situado 154 nt secuencia abajo del codón de iniciación). Después de este acontecimiento de corte y empalme, el "marco de lectura" ya no estaba presente (es decir, el iniciador Met y la región madura están en marco) en, o bien persefina de rata o bien de ratón. (véanse las figuras 1B y 2B).
Ejemplo 13
Este ejemplo ilustra la preparación de un vector de expresión bacteriano para persefina murina y su introducción en una E. Coli para expresión de persefina madura recombinante.
Se clonó el polinucleótido de persefina que codifica la proteína de persefina murina madura que empieza 5 aminoácidos secuencia arriba del primer residuo de Cys de estructura (ID SEC N°:80) en el pET del vector de expresión pET-30a en los sitios Nde I y Bgl II. Este polinucleótido de persefina se degeneró mediante PCR usando el clon genómico P1 de persefina murina como un molde. Se usaron un cebador directo M3157 (5'-GGACTATCATATGGCCCAC
CACCACCACCACCACCACCACGACGACGA CGACAAGGC CTTGGCTGGTTCATGCCGA, ID SEC N°:139) que codifica un sitio Nde I, 8 residuos de histidina y un sitio de eriterocinasa, y un cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, ID SEC N°:138), que corresponde a la secuencia que codifica los 6 últimos residuos de aminoácidos de la secuencia de persefina madura, el codón de terminación y un sitio Bgl II. Las condiciones de la reacción de PCR fueron 95°C durante 15 s, 55°C durante 15 s, 68°C durante 60 s x 25 ciclos. Este producto de PCR se subclonó en el sitio EcoRV de plásmido BSKS y se secuenció para verificar que no contenía mutaciones. Entonces, se suprimió la secuencia de persefina de este vector usando Nde I y Bgl II y se clonó en los sitios Nde I (5') y Bgl II (3') del vector de expresión bacteriano pET30a (Novagen, Madison, WI). Por tanto, este vector de expresión produciría la forma madura de la proteína de persefina que posee una etiqueta terminal en amino que está constituida por los 8 residuos de histidina seguidos directamente por un sitio de enterocinasa.
El plásmido se introdujo en la cepa BL21 (DE3) de E.coli. Para producir persefina, las bacterias que albergan este plásmido se hicieron crecer durante 16 h, se cosecharon y se lisaron usando guanidina-HCl 6 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M a pH 8,0 y la proteína de persefina recombinante se purificó de estos lisados por medio de cromatografía sobre una resina Ni-NTA (Qiagen). La proteína se eluyó usando 3 volúmenes de columna de tampón E que contenía urea 8 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M, a pH 4,5. Entonces la persefina se renaturalizó mediante diálisis en tampón de renaturalización que estaba constituido por NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M a pH 8,3, NaCl 0,15 M, cisterna 3 mM, Tween-20 al 0,02%, glicerol al 10% y que contenía concentraciones decrecientes de urea empezando con 4 M durante 16 h, seguido por 2 M durante 16 h, 1 M durante 72 h y 0,5 M durante 16 h. Entonces, la concentración de persefina se determinó usando un ensayo de Dot Metric (Geno Technology, St. Louis, MO) y se almacenó a 4°C.
Esta persefina recombinante producida bacterianamente se usó como un inmunogen en conejos para producir anticuerpos para persefina madura. Todas las inyecciones de inmunogen y la extracción de sangre se realizaron en Cal Tag Inc. (Healdsburg, CA). Se demostró que el antisuero anti-persefina reconocía específicamente persefina, pero no neurturina o GDNF, usando análisis de transferencia de proteínas. Entonces, este antisuero específico para persefina se usó para detectar persefina en lisados preparados de células COS transfectadas.
Ejemplo 14
Este ejemplo ilustra la preparación de vectores de expresión de mamíferos que contienen los genes de persefina murina o de rata y su incorporación en líneas celulares de mamíferos para la producción de persefina madura. Para construir el plásmido murino se usó un clon P1 que contenía el gen de persefina murina como un molde en un ensayo de PCR. Los cebadores se diseñaron tal que el polinucleótido resultante contuviera el gen de persefina que se extendía desde el codón iniciador de metionina hasta el codón de terminación 3' para la secuencia codificante de persefina madura (ID SEC N°:131). La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAG
GAAGACTTCGGA, ID SEC N°:140) y cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGC
CACAAGC, ID SEC N°:138). Para construir el plásmido de rata análogo se usó ADN genómico de rata como un molde en un ensayo de PCR. La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTG
CAGGAAGACTTCGGA, ID SEC N°:140) y cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACBCA
BCAGCCACAAGC, ID SEC N°:138). Ambas reacciones de PCR se llevaron a cabo usando Klentaq y los siguientes parámetros: 95°C durante 15 s, 55°C durante 15 s, 68°C durante 45 s x 25 ciclos. Los productos amplificados se trataron con cinasa con polinucleótido cinasa de T4, los extremos se hicieron romos con ADN polimerasa 1 (fragmento de Klenow) de E. coli y se clonaron en plásmido BSKS. Se realizó la secuenciación de nucleótidos para verificar que se había obtenido el clon correcto. Se suprimieron los polinucleótidos de persefina de rata y murina usando Sma I y Hind III y cada uno se clonó en una Asp718 (romo) y sitios de Hind III del vector de expresión pCB6 de
mamíferos.
Se transfectaron células COS de mono con o bien los vectores de expresión de persefina de rata o murina (16 \mug por 5 x 10^{5} células) o bien el propio vector no recombinante (pCB6) usando el procedimiento de precipitación del fosfato de calcio (Chen y Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-2752, 1987). ). Cuarenta y ocho horas después, las células se lisaron en tampón IP que contenía Tris 50 mM a pH 7,5, NaCl 300 mM, Triton X-100 al 1%, desoxicolato 1%, EDTA 10 mM, SDS al 0,1%, 5 \mug/ml de leupeptina, 7 \mug/ml de pepstatina y PMSF 250 \muM. Las muestras se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 15% y las proteínas se separaron mediante electroforesis. Entonces, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa mediante electrotransferencia. Esta membrana de nitrocelulosa se incubó con anticuerpos anti-persefina para detectar la presencia de persefina en los lisados.
Los lisados de células transfectadas con o bien los vectores de expresión de persefina de rata o bien murina, pero no el lisado de células transfectadas con pCB6, contiene altas cantidades de persefina. El tamaño de la persefina detectada era de aproximadamente 14 kD, que concuerda con el tamaño predicho para la procesada, es decir, forma madura de persefina. Esto demuestra que ambos, los genes de persefina murina y de rata, pueden dirigir la síntesis de una molécula de persefina apropiadamente procesada.
Ejemplo 15
El siguiente ejemplo ilustra el aislamiento y la identificación de persefina humana.
Con el fin de identificar el homólogo humano de persefina o miembros adicionales de la familia GDNF se diseñaron cebadores de PCR degenerados a base de las secuencias de neurturina humana y GONF y se usaron para amplificar ADN genómico humano. Se usaron los siguientes cebadores (ID SEC N°:225-228):
DhNeurturin1 (DN1) GTSASYGASYTGGGYCTGGGCTAY REF:B-46Z
DhNeurturin2 (DN2) TTYMGSTACTGCRSMGGCKCYTGC REF:B-46X
DhNeurturin3r (DN3) RWAGGCSRTSGGKCKGCARCAKGS REF:B-46V
DhNeurturin4r (DN4) MKCRTCYARRAASGACASSTC REF:B-46W
Se amplificó ADN genómico humano (Clontech 6550-1 0,1 \mug/\mul) con las 4 combinaciones posibles de cebador (DN1-DN3r, DN1-DN4r, DN2-DN3r, DN2-DN4r). Las mezclas de reacción contenían 5 \mul de 10 x tampón Klentaq, 0,5 \mul de dNTP (20 mM); 1 \mul de ADN genómico humano, 0,6 \mul de Klentaq (Clontech) y 1,5 \mul de cada uno de los cebadores (0,1 OD/\mul) en un volumen total de 50 \mul. El ADN se amplificó mediante ensayo de PCR en Gene AMP 9600 de Perkin Elmer en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 98°C durante 2 min, luego 5 ciclos [98°C 30 s, 72°C 1,5 min], 5 ciclos [98°C 30 s, 70°C 1,5 min] y 25 ciclos [98°C 30 min, 68°C 1,5 s] seguido por una última etapa de extensión a 68°C durante 5 min.
Los productos de PCR de aproximadamente 130 a 200 bp se identificaron según electroforesis en gel de agarosa, se purificaron y se donaron en vector pCR 2.1 usando el kit de donación In Vitrogen TA (n° de catálogo K2000-01). Los clones que contenían un inserto de 130-200 bp (después de la digestión en EcoRI) se secuenciaron y uno de ellos (clon A3), obtenido con el par de cebadores DN1-DN3r, tenía una secuencia homóloga a persefina de ratón y correspondía a persefina humana.
\newpage
A continuación se muestra la secuencia parcial del ADN genómico de persefina humana en el clon A3 (ID SEC N°:229):
200 
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de identificar una fuente de la que aislar un clon de ADNc de longitud total de persefina humana se rastrearon bibliotecas de ADNc mediante PCR usando cebadores de apareamiento exacto diseñados a base de la secuencia genómica de ADN descrita anteriormente. Se prepararon dos conjuntos de cebadores específicos de persefina humana (ID SEC N°S:230-233),
hPSP-5'.1 GAGGAGAAGGTCATCTTCCG REF:B-95K
hPSP-3'.1 GCCGTGGGCTCGGCCCTGGC REF:B-95L
y
hPSP-5'.3 AGAGGAGAAGGTCATCTTCCGCTA REF:C-62Y
hPSP-3'.4 CTCGGCCCTGGCCCTGCAGC REF:C-62X
se detectó el tamaño esperado (108 bp para PSPh-5'1 con PSPh-3',1 y 101 bp para PSPh-5',3 con PSPh-3',4) en pulmón fetal, hígado fetal, riñón fetal, intestino delgado, retina, cerebelo y linfoplasto hT+13.
Para aislar clones de ADNc que codifican persefina humana, las bibliotecas de pRK5 de tejidos humanos se enriquecieron para clones de ADNc de persefina mediante extensión de ADN de cadena sencilla de bibliotecas de plásmidos crecidos en un huésped dut^{-}/ung^{-} usando cualquiera de los siguientes cebadores (ID SEC N°S:233-234):
hPSP-3'.2 TGCAGCCGGGCCAGCGCCAG REF:D-68T
hPSP-3'.4 CTCGGCCCTGGCCCTGCAGC REF:C-62X
en una reacción que contenía 10 \mul de 10 x tampón de PCR (Perkin Elmer), 1 \mul de dNTP (20 mM), 1 \mul de biblioteca de ADN (200 ng), 0,5 \mul de cebador, 86,5 \mul de H_{2}O y 1 \mul de Amplitaq (Perkin Elmer) añadido después de un inicio en caliente. La reacción se desnaturalizó durante 1 min a 95°C, se hidridó durante 1 min a 50, 60 ó 68°C, luego se extendió durante 20 min a 72°C. El ADN se extrajo con fenol/cloroformo, se precipitó en etanol y luego se transformó mediante electroporación en bacterias huésped de DH10B.
Aproximadamente 40.000 colonias de cada transformación se situaron en membranas de náilon y se rastrearon con una sonda de ADN derivada de la secuencia del clon A3 (descrita anteriormente). El fragmento se marcó mediante el procedimiento del oligonucleótido al azar usando [^{32}P]-dCTP. Los filtros se hibridaron durante la noche a 42°C en formamida al 50%, 5 x SSC, 10 x Denhardt, fosfato de sodio 0,05 M (pH 6,5), pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado. Entonces, los filtros se aclararon en 2 x SSC y se lavaron en 0,1 x SSC, SDS al 0,1%, entonces se expusieron durante la noche a películas de rayos X de Kodak. Los clones positivos puros se obtuvieron después de rastreo secundario y entonces se secuenciaron los clones aislados. Los clones de persefina humana se aislaron de bibliotecas de pulmón fetal, riñón fetal e hígado fetal. Tales clones de persefina aislados pertenecen a dos categorías: no cortados y empalmados (10 clones) o quiméricos (6 clones). Los clones no cortados y empalmados eran de -900 bp de longitud y contenían una región que codificaba un fragmento correspondiente a persefina humana. Sin embargo, no hay metionina de iniciación y péptido señal presente en ese marco de lectura (marco +2). Un codón de iniciación potencial secuencia arriba (ATG) está presente en otro marco de lectura (+1) y está seguido por una secuencia hidrófoba correspondiente a una señal potencial de péptido señal. Esto sugiere que tales ADNc están incompletamente cortados y empalmados y que un intrón permanece entre los exones que codifican el péptido señal y la proteína de persefina. Las secuencias consenso de donantes y receptores cortados y empalmados pueden identificarse actualmente en la posición 340 y 425, respectivamente. El corte y empalme de un intrón localizado entre estas posiciones conduciría a un ADNc en el que la secuencia codificante de persefina está "en marco" con la metionina de iniciación. De manera interesante, los clones quiméricos aberrantes se identificaron resultantes de la unión de un ADNc que codifica el exón 2 predicho de persefina exactamente en el sitio receptor de corte y empalme presente en la posición 425. El transcrito correspondiente se generó probablemente mediante corte y empalme aberrante, pero confirma la presencia de un sitio receptor de corte y empalme en la posición 425.
Como una aproximación alternativa para aislar un clon de ADNc de persefina humana se rastrearon 3 millones de clones de una biblioteca de ADNc de cerebelo humano en lambda ZAP (Stratagene, n° de catálogo 935201) con una sonda de ADN correspondiente al clon A3 marcado mediante el procedimiento del oligonucleótido al azar usando [^{32}P]-dCTP. La biblioteca se rastreó bajo altas condiciones de hibridación de astringencia. Los filtros se hibridaron previamente durante 2 h y luego se hibridaron durante la noche a 42°C en formamida al 50%, 5 x SSC, 10 x Denhardt, fosfato de sodio 0,05 M (pH 6,5), pirofosfato de sodio al 0,1%, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado. Entonces, los filtros se aclararon en 2 x SSC y se lavaron una vez en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 60°C. Los filtros se expusieron durante la noche a películas de rayos X de Kodak. Se escogieron cuatro clones positivos (Cere 1.1, 1.2, 6.1, 6.2) y se purificaron en placa. Se rescató el plásmido que contenía brazos dentro del fago lambda ZAP como se describe por las instrucciones del fabricante usando un fago auxiliar Ex Assist. La secuenciación de los cuatro clones indicó que estos clones eran hermanos y contenían 2 mutaciones silenciosas cuando se compararon con los clones de persefina humana aislados de la biblioteca de pRK5 descrita anteriormente. Estas mutaciones silenciosas se producen en las posiciones 30 (T\rightarrowC) y 360 (T\rightarrowC) de la secuencia mostrada en la figura 24. La secuenciación directa del gen de persefina humana desveló que estas mutaciones silenciosas son variaciones alélicas actuales en el gen.
Con el fin de determinar si podría expresarse la proteína correcta del ADNc no cortado y empalmado identificado anteriormente, se generaron construcciones en las que se insertó la secuencia que codifica una etiqueta Flag justo antes del codón de terminación presente en la posición 685 (marco + 1) o en la posición 746 (marco +2) que parte de un codón de ATG presente en la posición 46 o 193. Se generaron las cuatro posibles construcciones mediante PCR usando los siguientes cebadores (ID SEC N°S:235-238):
201
En las cuatro reacciones de PCR, el clon Cere 1.2 se usó como molde y se amplificó con Pfu polimerasa en un ciclador de gradiente Stratagene Robocycler 96. Las condiciones de PCR fueron 95°C durante 2 min, 30 ciclos de [95°C 30 s, 1 min a 52, 56, 60 ó 63°C, 72°C durante 2 min] seguido por una última extensión de 5 min a 72°C.
Los cebadores directos tienen un sitio Bam Hl y los cebadores inversos tienen un sitio de restricción Hind III. Los productos de PCR se digirieron con Bam Hl y Hind III y se subclonaron en estos sitios en pRK5. El ADN de cada una de las construcciones se transfectó durante la noche en 293 células usando el procedimiento de CaPO4. Se condicionó suero que contenía medio durante 24 h, luego se cosechó. Las células también se cosecharon y se dividieron en dos; 1/4 de cada placa para RT-PCR y los 3/4 restantes de cada placa para inmunoprecipitación.
Los análisis de proteínas expresadas se realizaron mediante inmunoprecipitación. El sedimento celular se lisó en 1 ml de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP40 al 1%, aprotinina, leupeptina, PMSF, NaF 1 mM y vanadato de sodio 1 mM) durante 20 min a 4°C. El extracto se centrifugó durante 10 min a 10K rpm y entonces se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se aclaró previamente con 20 \mul de proteína-A Sepharose durante 1 h. De aquí se procesó en paralelo 1 ml del medio condicionado. La proteína-A sepharose se centrífugo y a cada tubo se añadió 1 \mul de anticuerpo anti-Flag (3,6 \mug). Después de la incubación durante la noche a 4°C, se añadieron 30 \mul de proteína-G Sepharose y los tubos se incubaron a 4°C durante 1 hora. Entonces se centrifugaron las perlas de proteína G durante 1 min, se lavaron 3 veces con tampón de lisis, se resuspendieron en 20 \mul de tampón Laemli en presencia de \beta-mercapto-etanol. Las muestras se desnaturalizaron durante 5 min a 100°C, luego se cargaron en un gel de poliacrilamida al 16%. Entonces, las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa y se analizaron mediante transferencia Western usando el mismo anticuerpo anti-Flag durante la noche a 1 \mug/ml en tampón de bloqueo (PBS + tween al 0,5% + 5% leche en polvo desnatada + suero de cabra al 3%). Tras esto se usó una HRP de anti-ratón. Se usó ECL para la detección y la membrana se expuso durante 90 s a película de rayos X.
Se detectó una banda específica de 16 kDa en el sedimento celular de células transfectadas con la construcción de partida en el ATG 193 de marco +1 y con la Flag insertada en el marco +2 y podría detectarse una banda específica de aproximadamente 10 kDa en el sobrenadante correspondiente. No pudo detectarse proteína etiquetada con Flag en ninguna otra transfección o en células transfectadas de imitación.
El ARNm correctamente cortado y empalmado se identificó mediante RT-PCR del siguiente modo. El ARN total se extrajo de las células transfectadas (1/4 de cada sedimento) usando RNAzoI B (Tel-Test Inc.) y se trató durante 40 min a 37°C con ADNasa. Entonces, el ADN se purificó en una columna de ADNasa (Promega) y se recogió en un volumen final de 50 \mul. El primer ADNc de cadena se sintetizó en 4 \mul de ARN usando superscript RT (GIBCO-BRL) durante 1 h a 37°C, luego 5 min a 95° para inactivar.
Se usaron dos \mul de cada reacción de RT como molde para la amplificación mediante PCR en presencia de los 2 siguientes cebadores (ID SEC N°S:236 y 239):
202
en un ciclador de gradiente Stratagene Robocycler 96. Las condiciones de PCR fueron 98°C durante 1,5 min, 28 ciclos de [98°C durante 30 s, hibridación 1 min entre 60°C y 76°C, 72°C durante 1,5'] seguido por una última extensión de 5 min a 72°C.
El análisis del producto de PCR en gel de agarosa indica que la PCR usando el plásmido pRK5.PSPh-FLAG.2 como molde dio el producto esperado de aproximadamente 570 bp, mientras que el producto de RT PCR, usando ARN de células transfectadas con esta construcción como molde, era inferior a 500 bp. El producto de PCR de esta última reacción se subclonó en el vector pCR 2.1 usando el kit de clonación In Vitrogen TA (n° de catálogo K2000-01) y se secuenció. El análisis de la secuencia desveló que el intrón de 84 bp predicho ha sido cortada y empalmado del transcrito.
En resumen, el ADNc de persefina humana tiene un marco de lectura abierto de 471 bp que codifica una proteína de 156 aminoácidos de longitud (Mr predicho 16,6 kDA). La escisión del péptido señal predicho de 23 aminoácidos de longitud conducirá a una molécula de pro-persefina de 133 aminoácidos (Mr 14,2 kDa); la escisión proteolítica de la pro-persefina en una secuencia consenso RXXR debería dar una proteína madura de 96 aminoácidos con un peso molecular de 10,3 kDa. Este tamaño predicho corresponde al tamaño de la proteína etiquetada con Flag inmunoprecipitada de los medios condicionados de 293 células transfectadas. Además, la secuenciación del amino terminal de persefina etiquetada con Flag purificada a partir de medios condicionados de 293 células de transfectadas confirmó que el primer residuo de la forma madura es Ala 61. El alineamiento entre la persefina humana y la neurturina humana indica el 38% de similitud entre las dos moléculas (50% para la región madura) y que la persefina humana es el 30% de similar a GDNF humano (40% en la región madura).
Ejemplo 16
Este ejemplo ilustra la preparación de moléculas de polipéptidos quiméricos o híbridos que contienen partes derivadas de persefina (PSP) y partes derivadas de neurturina (NTN).
Como miembros estrechamente relacionados de la familia TGF-R, se predice que la persefina y neurturina tengan una estructura global muy similar, sin embargo, mientras que la neurturina promueve la supervivencia de neuronas simpáticas, la persefina estrechamente relacionada no. Se produjeron dos quimeras reemplazando esencialmente partes de persefina con neurturina, con el punto de entrecruzamiento localizado entre los 2 residuos de cisteína tercero y cuarto contiguos sumamente conservados: la primera quimera, llamada PSP/NTN (ID SEC N°:141, figura 3), contiene los 63 primeros residuos de persefina murina madura combinados con los residuos 68 a 100 de neurturina murina madura (usando codones preferidos de E. coli). Para construir esta molécula se realizaron dos reacciones de PCR: 1) usando el cebador directo M2012 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAA, ID SEC N°:142) y el cebador inverso M2188 (5'-TCGTCTTCGTAAGCAGTCGGACGGCAGCAGGGTCGGCCATGGGCTCG AC, ID SEC N°:143) y el plásmido de persefina murina pET30a como molde (véanse los ejemplo 13); y 2) usando el cebador directo M2190 (5'-TGCTGCCGTCCGACTGCTTACGAAGACGA, ID SEC N°:144) y el cebador inverso M2186 (5'-GTTATGC
TAGTTATTGCTCAGCGGT, ID SEC N°:145) y el plásmido de neurturina murina pET30a (codones preferidos de E. coli) como molde (véase ejemplo 6). Ambas reacciones de PCR se llevaron a cabo usando los siguientes parámetros: 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, 72°C durante 30 s x 25 ciclos. Los productos de estas dos reacciones de PCR se purificaron en gel, se mezclaron juntos y se realizó una reacción de PCR bajo las siguientes condiciones: 94°C durante 30 s, 60°C durante 20 min, 68°C durante 5 min. Después de 8 ciclos se usó una alícuota de esta reacción como molde en una tercera reacción de PCR usando el cebador directo M2012 y el cebador inverso M2186 bajo las siguientes condiciones: 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, 72°C durante 30 s x 25 ciclos. El producto resultante se trató con cinasa con polinucleótido cinasa de T4, los extremos se hicieron romos con ADN polimerasa I (fragmento de Klenow) de E. Coli y se clonaron en plásmido BSKS. Se realizó la secuenciación de nucleótidos para verificar que se había obtenido el clon correcto. Se suprimió el fragmento de PSP/NTN usando Nde I y Bam H1 y se clonó en los sitios correspondientes del vector de expresión bacteriano pET30a.
La segunda quimera, llamada NTN/PSP (ID SEC N°:146, figura 3), codifica la molécula contraria. Contiene los 67 primeros residuos de neurturina murina madura (usando codones preferidos de E. coli) combinados con los residuos 64 a 96 de persefina murina madura. Para construir esta molécula se realizaron dos reacciones de PCR: 1) usando el cebador directo M2012 y el cebador inverso M2183 (5'-CACATCAGCATAGCTGGTGGGCTGGCAGC
ACGGGTGAGCACGAGCAC GTT, ID SEC N°:147) y el plásmido de neurturina murina pET30a (codones preferidos de E. coli) como molde; y 2) usando el cebador directo M2187 (5'-TGCTGCCAGCCCACCAGCTATGCTG, ID SEC N°:148) y el cebador inverso M2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT, ID SEC N°:145) y el plásmido de neurturina murina pET30a. Ambas reacciones de PCR se llevaron a cabo usando los siguientes parámetros: 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, 72°C durante 30 s x 25 ciclos. Los productos de estas dos reacciones de PCR se usaron para construir el plásmido final NTN/PSP pET30a como se detalla anteriormente para PSP/NTN, excepto que se usó Bgl II en lugar de Bam H1. Estas proteínas quiméricas se produjeron en E.coli y se purificaron mediante cromatografía de Ni-NTA como se describe anteriormente (ejemplo 13).
Las proteínas purificadas se ensayaron para su capacidad para promover la supervivencia en el ensayo de neuronas simpáticas del SCG. La proteína NTN/PSP no promovió supervivencia, mientras que la proteína PSP/NTN promovió la supervivencia de neuronas simpáticas de manera similar a la que se observó para la propia neurturina. Estos resultados indican que los residuos de neurturina situados secuencia abajo de los 2 residuos de cisteína contiguos sumamente conservados son críticos para la actividad en la promoción de la supervivencia en neuronas simpáticas del SCG. A diferencia, los residuos correspondientes de persefina son suficientes para promover la supervivencia en neuronas simpáticas.
Ejemplo 17
Este ejemplo ilustra la actividad promotora de la supervivencia neuronal de persefina en células mesencefálicas.
El perfil de actividad promotora de la supervivencia de persefina es diferente que el de neurturina y GDNF. A diferencia de la actividad promotora de la supervivencia producida mediante neurturina y GDNF en neuronas simpáticas y sensoriales, la persefina no mostró actividad promotora de la supervivencia en estos tejidos. Se evalúa adicionalmente la actividad promotora de la supervivencia neuronal de persefina en células mesencefálicas.
Se compraron ratas Sprague-Dawley gestantes de Harlan Sprague-Dawley. Se tomó el mesencéfalo de ratas que medían 1,2 a 1,4 cm en longitud y a tiempo fechado en el día 14 embriónico. Se eliminó el cráneo y todo el mesencéfalo se colocó en L15 frío. El tejido mesencefálico reunido se resuspendió en un medio libre de suero que estaba constituido por DME/Hams F12 (n° 11330-032, Life Technologies) 1 mg/ml de BSA, fracción V (A-6793, Sigma Chemical Co.,), insulina 5 \muM (1-5500, Sigma), progesterona 10 nM (PO130, Sigma), putrescina 100 \muM, (p7505, Sigma), selenio 30 nM (S07150, Pflatz & Bauer), 10 ng/ml de transferrina de rata (012-000-050, Jackson Chrompure), 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Los tejidos mesencefálicos reunidos se trituraron aproximadamente 80 veces usando una pipeta de tipo curvo y las células se sembraron en una placa de 24 pocillos (CoStar) a una densidad de 15.000 células en una gota de 100 \mul. Las placas se recubrieron con 125 ng/ml de poli-d-lisina (p-7280, Sigma) y 25 ng/ml de laminina (n° 40232, Collaborative Biomedical Products). Se permitió que estas células disociadas se unieran durante 2 horas a 37°C en 5% de CO_{2} y entonces se alimentaron con otros 500 \mul del medio libre de suero anterior con o sin aproximadamente 100 ng/ml de persefina recombinante. Estas células se fotografiaron después de 3 días de cultivo.
La inspección de las células durante el transcurso de los 3 días en cultivo mostró una disminución gradual en el número de células. En ausencia de cualquier factor de crecimiento, casi todas las células murieron (figura 4A). En presencia de persefina era evidente un gran aumento de la supervivencia de células neuronales mesencefálicas (figura 4B).
Se repitió este estudio para obtener efectos comparativos en célula mesencefálica para persefina y los factores de crecimiento relacionados, neurturina y GDNF. Se eliminó el tejido mesencefálico de E14 par pps, se reunió y se disoció en dispasa durante 30 min. Entonces, las células se trituraron y se sembraron en placa en medio N2 complementado y sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo en un portaobjetos de cámara de 8 pocillos. Las células en un pocillo dado o bien se trataron o bien no se trataron con un factor de crecimiento a 50 ng/ml durante cuatro días. Las células se lavaron una vez con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 minutos y se tiñeron con anticuerpo tirosina hidroxilasa (TOH) (Chemicon, kit ABC-Vectastain) y se contaron. La tinción con TOH sirvió como un marcador para las células dopaminérgicas ya que la TOH es una enzima sintética para la dopamina. La figura 5 muestra los recuentos celulares medios para células tratadas y no tratadas. La persefina (PSP), neurturina (NTN) y GDNF promovieron la supervivencia de células neuronales mesencefálicas hasta un grado
comparable.
Ejemplo 18
Este ejemplo ilustra la expresión de persefina en diversos tejidos.
Se realizó un estudio de expresión persefina en tejidos de ratón adulto usando RT/PCR semicuantitativa (véase ejemplo 9). Se aisló ARN de Poli A de cerebro, cerebelo, riñón, pulmón, corazón, ovario, nervio ciático, ganglios de la raíz dorsal, sangre y bazo. Entonces, esto se transcribió de manera inversa para producir ADNc (véase Kotzbauer y col. Nature 384:467-470, 1996 que se incorpora como referencia). Los cebadores de PCR usados fueron del siguiente modo: cebador directo: 5'-CCTCGGAGGAGAAGGTCATCTTC (ID SEC N°:149) y cebador inverso: 5'TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA (ID SEC N°:101). Se hizo PCR durante 26 ciclos con una temperatura de hibridación de 60°C. Para controlar la presencia de ADN genómico, las muestras de ARN que no se transcribieron de manera inversa se usaron para PCR (por ejemplo, el control de tejido mostrado en la figura 22 está marcado "Riñón no RT"). Se encontró que todas las muestras estaban sin contaminación de ADN genómico.
Como se muestra en la figura 5, en la muestra de riñón se observa una banda del tamaño correcto (160 bp). A número de ciclos superior también se observó una banda de persefina en el cerebro. Por tanto, la distribución de la expresión de persefina en diversos tejidos de ratón se diferencia que la de neurturina en rata (ejemplo 8).
Depósito de cepa. La siguiente cepa está depositada bajo los términos del Tratado de Budapest con la Colección americana de cultivos tipo, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. El número de acceso indicado se asignó después del éxito de la prueba de viabilidad y se abonaron las tasas requeridas. Toda restricción en la disponibilidad de dichos cultivos al público será irrevocablemente suprimida con la concesión de una patente basada en la solicitud. Además, los depósitos designados se mantendrán durante un periodo de treinta (30) años desde la fecha de depósito, o durante cinco (5) años después de la última solicitud para el depósito, o durante la vida ejecutiva de la patente de los EE.UU., la cual es más larga. Si un cultivo llega a ser no viable o se destruye inadvertidamente o, en el caso de las cepas que contienen el plásmido, pierden su plásmido, se reemplazará con un cultivo viable. Los materiales depositados mencionados en este documento sólo van dirigidos por conveniencia y no se requiere practicar la presente invención en vista a la descripción en este documento, y además, estos materiales se incorporan en este documento como referencia.
Cepa Fecha de depósito N° ATTC
DG44CHO-Phsp-NGFI-B 25 de agosto de 1995 CRL 11977
En vista de lo anterior se observará que se alcanzan las diversas ventajas de la invención y se consiguen otros resultados ventajosos.
Se pretende que toda la materia contenida en la descripción anterior y mostrada en los dibujos adjuntos sea interpretada como ilustrativa y no en un sentido limitante.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: JOHNSON, EUGENE M
\hskip3.9cm
MILBRANDT, JEFFREY D 
\hskip3.9cm
KOTZBAUER, PAUL T 
\hskip3.9cm
LAMPE, PATRICIA A 
\hskip3.9cm
KLEIN, ROBERT 
\hskip3.9cm
DESAUVAGE, FRED 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PERSEFINA Y FACTOR DE CRECIMIENTO RELACIONADO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 242
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: HOWELL & HAFERKAMP, L.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 7733 FORSYTH BOULEVARD, SUITE 1400
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ST. LOUIS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: MO
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 63105
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release n° 1.0, Versión n° 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: HOLLAND, DONALD R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35,197
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 971486
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE COMUNICACIÓN A DISTANCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 314-727-5188
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 314-727-6092
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:1:
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 100 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:2:
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "CUALQUIER AMINOÁCIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ala Arg Pro Xaa Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Ser Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "CUALQUIER AMINOÁCIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O CISTEÍNA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Cys Ala Gly Ala Xaa Glu Ala Ala Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMATION FOR ID SEC NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "CUALQUIER AMINOÁCIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "CUALQUIER AMINOÁCIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 17
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "GLUTAMINA O ÁCIDO GLUTÁMICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Val Glu Ala Lys Pro Cys Cys Gly Pro Thr Ala Tyr Glu Asp}
\sac{Xaa Val Ser Phe Leu Ser Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr His Thr Leu Gln Glu Leu Ser Ala Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 197 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:7:
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 195 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:8:
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 306 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:9:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 300 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:10:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 591 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:11:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 585 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:12:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 348 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:13:
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 87 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:14:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser}
\sac{Val Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Arg Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Ile Cys Ser Ser}
\sac{Leu Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCAGCGCT GGAAGGCGGC GGCCTTGGCC TCAGTGCTCT GCAGCTCCGT GCTGTCC 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGAGGCGCT GGAAGGCAGC GGCCCTGGTG TCGCTCATCT GCAGCTCCCT GCTATCT 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 76 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:19:
\vskip1.000000\baselineskip
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 228 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:20:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 228 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:21:
\vskip1.000000\baselineskip
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 76 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:22:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:23:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:24:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 285 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:25:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 285 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:26:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 169 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:27:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 425 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:28:
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 169 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:29:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 419 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:30:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 94 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:31:
\vskip1.000000\baselineskip
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:32:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 94 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:32:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:33:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O TREONINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Len Gly Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:34:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA O ÁCIDO GLUTÁMICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "LEUCINA O ISOLEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 14
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:35:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA O VALINA O ISOLEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TIROSINA O FENILALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Arg Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Ser Phe Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:36:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:37:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:38:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ISOLEUCINA O TREONINA O VALINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TIROSINA O FENILALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Arg Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:39:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TIROSINA O FENILALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Ser Phe Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:40:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O TREONINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "LEUCINA O VALINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ISOLEUCINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:41:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O TREONINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "LEUCINA O VALINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ISOLEUCINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:42:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTNWSNGANY TNGGNYTNGG NTA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:43:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTYMGNTAYT GYDSNGGNDS NTGYGANKCN GC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:44:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCNGMNTCRC ANSHNCCNSH RCARTANCKR AA 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:45:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCRTCNTCRW ANGCNRYNGG NCKRCARCA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:46:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCNARRAANS WNAVNTCRTC NTCRWANGC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:47:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GARRMNBTNH TNTTYMGNTA YTG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:48:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GARRMNBTNH TNTTYMGNTA YTGYDSNGGN DSNTGHGA 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:49:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:49:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Ala Arg Pro Xaa Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Ser Val Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:50:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCNACNGCNT AYGARGA 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:51:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:51:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Ala His Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val}
\sac{Ser Phe Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:52:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ARYTCYTGNA RNGTRTGRTA 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:53:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGAGGTGT CCTTCCTGGA CGTACACA 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:54:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGCGGCTGT GTACGTCCAG GAAGGACACC TCGT 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:55:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCGACGAC GCGTGCGCAA AGAGCG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:56:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAYGARGACG AGGTGTCCTT CCTGGACGTA CACAGCCGCT AYCAYAC 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:57:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGGCCATCC GCATCTACGA CCTGGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:58:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CRTAGGCCGT CGGGCGRCAR CACGGGT 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:59:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCCGAAGG CCCAGGTCGT AGATGCG 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:60:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCTACTGCG CAGGCGCGTG CGARGCGGC 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:61:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:61:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCCGACAGC TCTTGCAGCG TRTGGTA 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:62:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:62:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGCTGGGCC TGGGCTACGC GTCCGACGAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:63:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:63:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGACGCGTA CCATGAGGCG CTGGAAGGCA GCGGCCCTG 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:64:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:64:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGGATCCG CATCACACGC ACGCGCACTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:65:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:65:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACCATATGC CGGGGGCTCG GCCTTGTGG 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:66:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:66:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGGATCCG CATCACACGC ACGCGCACTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:67:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:67:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCGACGAC GCGTGCGCAA AGAGCG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:68:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:68:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGCGGCTGT GTACGTCCAG GAAGGACACC TCGT 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:69:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:69:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAAATCGGG GGTGYGTCTT A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:70:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:70:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGCCTGGC CTACYTTGTC A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:71:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:71:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGCGTCCC AMCAAGGGTC TTCG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:72:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:72:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCAGTGGTG CCGTCGAGGC GGG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:73:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:73:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGCCCAGGAT GAGGCGCTGG AAGG 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:74:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:74:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACTCCACT GCCTGAWATT CWACCCC 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:75:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:75:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATGTGATT ATCGACCATT CGGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:76:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 134 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:76:
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:77:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 134 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:77:
\vskip1.000000\baselineskip
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:78:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 134 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:78:
\vskip1.000000\baselineskip
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:79:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 89 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:79:
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:80:
\vskip0.800000\baselineskip
i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:80:
\vskip1.000000\baselineskip
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:81:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 134 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:81:
30
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:82:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 89 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:82:
\vskip1.000000\baselineskip
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:83:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 91 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:83:
\vskip1.000000\baselineskip
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:84:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 267 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:84:
\vskip1.000000\baselineskip
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:85:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 267 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:85:
\vskip1.000000\baselineskip
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:86:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 273 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:86:
\vskip1.000000\baselineskip
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:87:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 94 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:87:
\vskip1.000000\baselineskip
37 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:88:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:88:
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:89:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 91 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:89:
\vskip1.000000\baselineskip
39 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:90:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:90:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCCTCAGAG GAGAAGATTA TC 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:91:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:91:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Glu Glu Lys Ile Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:92:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:92:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:93:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:93:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:94:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:94:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys Ile Ile Phe Arg Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:95:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 23 pares de bases
(B) TIPO: ácido nucleico
(C) TIPO DE CADENA: sencilla
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:95:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTCGGGGTT GGGGTATGCC TCA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:96:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:96:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATGCCTCAG AGGAGAAGAT TATCTT 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:97:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 336 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:97:
\vskip1.000000\baselineskip
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:98:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:98:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp}
\sac{Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:99:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:99:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Lys Asp}
\sac{Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:100:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:100:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Cys Cys Gln Pro Thr Ser Tyr Ala Asp Val Thr Phe Leu Asp Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:101:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:101:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCATCAAGGA AGGTCACATC AGCATA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:102:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:102:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACCACAGC CACAAGCTGC GGSTGAGAGC TG 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:103:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:103:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Ala Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:104:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:104:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Arg Ile Pro Gly Gly Leu Pro Thr Pro Gln Phe Leu Leu Ser Lys}
\sac{Pro Ser Leu Cys Leu Thr Ile Leu Leu Tyr Leu Ala Leu Gly Asn Asn}
\sac{His Val Arg Leu Pro Arg Ala Leu Ala Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:105:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 544 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:105:
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:106:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 336 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:106:
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:107:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 391 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:107:
\vskip1.000000\baselineskip
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:108:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA, TREONINA, O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:108:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:109:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA" (ix) CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:109:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:110:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO ASPÁRTICO, ÁCIDO GLUTÁMICO O NO AMINOÁCIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O TREONINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:110:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Xaa Xaa Xaa Phe Leu Asp Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:111:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 142 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°-111:
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:112: F
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:112:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Pro Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:113:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA, ÁCIDO GLUTÁMICO O LISINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA, LEUCINA O ISOLEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 4
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "LEUCINA O ISOLEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 9
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:113:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:114:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ARGININA O GLUTAMINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA, VALINA O ISOLEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ALANINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TIROSINA O FENILALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO, ÁCIDO ASPÁRTICO O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 10
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO, ÁCIDO ASPÁRTICO O NO AMINOÁCIDO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 11
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 12
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O TREONINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 16
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO ASPÁRTICO O VALINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:114:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Cys Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Phe Leu Asp Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:115:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:115:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTNDGNGANY TGGGNYTGGG NTA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:116:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:116:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GANBTNWCNT TYYTNGANG 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:117:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:117:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GANBTNWCNT TYYTNGANGW 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:118:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:118:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTYMGNTAYT GYDSNGGNDS NTG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:119:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:119:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTNDGNGANY TGGGNYTNGG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:120:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:120:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTNDGNGANY TGGGNYTGGG NTT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:121:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:121:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
WCNTCNARRA ANGWNAVNTC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:122:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:122:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
WCNTCNARRA ANGWNAVNT 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:123:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:123:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CANSHNCCNS HRCARTANCK RAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:124:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:124:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CANSHNCCNS HRCARTANCK RAANA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:125:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA, SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:125:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:126:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO ASPÁRTICO O ÁCIDO GLUTÁMICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "VALINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA O SERINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO ASPÁRTICO O ÁCIDO GLUTÁMICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO ASPÁRTICO O VALINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:126:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:127:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 5
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 7
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:127:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:128:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA, SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO ASPÁRTICO O ÁCIDO GLUTÁMICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:128:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:129:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 2
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "TREONINA, SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 3
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ÁCIDO GLUTÁMICO O ÁCIDO ASPÁRTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:129:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:130:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "ISOLEUCINA O LEUCINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 6
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sitio modificado
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 8
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRA INFORMACIÓN: /note= "SERINA O ALANINA"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:130:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:131:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 559 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:131:
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:132:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 81 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:132:
46 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:133:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 185 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:133:
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:134:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 559 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:134:
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:135:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 81 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:135:
\vskip1.000000\baselineskip
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:136:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 185 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:136:
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:137:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:137:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATCCCCAGG ACAGGCAGGG AAT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:138:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:138:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGTACCCAG ATCTTCAGCC ACCACAGCCA CAAGC 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:139:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 76 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:139:
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:140:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:140:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGTACCCAG ATCTTCAGCC ACCACAGCCA CAAGC 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:141:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:141:
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:142:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:142:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATACGACT CACTATAGGG GAA 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:143:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:143:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCGTCTTCGT AAGCAGTCGG ACGGCAGCAG GGTCGGCCAT GGGCTCGAC 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:144:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:144:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTGCCGTC CGACTGCTTA CGAAGACGA 
\hfill
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:145:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:145:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTATGCTAG TTATTGCTCA GCGGT 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:146:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 100 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:146:°~
\vskip1.000000\baselineskip
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:147:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:147:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACATCAGCA TAGCTGGTGG GCTGGCAGCA CGGGTGAGCA CGAGCACGTT 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:148:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:148:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTGCCAGC CCACCAGCTA TGCTG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:149:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:149:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCTCGGAGGA GAAGGTCATC TTC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:150:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 98 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:150:
\vskip1.000000\baselineskip
54 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:151:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 98 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:151:
55 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:152:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 98 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:152:
\vskip1.000000\baselineskip
56 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:153:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 106 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:153:
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:154:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 105 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:154:
\vskip1.000000\baselineskip
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:155:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:155:
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:156:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:156:
\vskip1.000000\baselineskip
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:157:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:157:
\vskip1.000000\baselineskip
61 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:158:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:158:
\vskip1.000000\baselineskip
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:159:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:159:
63 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:160:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:160:
\vskip1.000000\baselineskip
64 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:161:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:161:
65 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:162:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:162:
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:163:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:163:
67 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:164:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 103 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:164:
\vskip1.000000\baselineskip
68 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:165:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:165:
69 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:166:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 106 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:166:
\vskip1.000000\baselineskip
70 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:167:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 101 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:167:
71 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:168:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 103 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:168:
\vskip1.000000\baselineskip
72 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:169:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 105 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:169:
73 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:170:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 99 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:170:
\vskip1.000000\baselineskip
74 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:171:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:171:
75 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:172:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 94 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:172:
76 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:173:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:173:
77 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:174:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:174:
\vskip1.000000\baselineskip
78 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°: 175;
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 405 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:175:
\vskip1.000000\baselineskip
79 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:176:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:176:
\vskip1.000000\baselineskip
80 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:177:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 723 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:177:
\vskip1.000000\baselineskip
81 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:178:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 723 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:178:
\vskip1.000000\baselineskip
82 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:179:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:179:
\vskip1.000000\baselineskip
83 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:180:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:180:
\vskip1.000000\baselineskip
84 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:181:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:181:
\vskip1.000000\baselineskip
85 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:182:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:182:
\vskip1.000000\baselineskip
86 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:183:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:183:
\vskip1.000000\baselineskip
87 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:184:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:184:
\vskip1.000000\baselineskip
88 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:185:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 156 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:185:
89 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:186:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:186:
\vskip1.000000\baselineskip
90 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:187:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:187:
91 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:188:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 559 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:188:
\vskip1.000000\baselineskip
92 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:189:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 559 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:189:
\vskip1.000000\baselineskip
93 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:190:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:190:
\vskip1.000000\baselineskip
94 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:191:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:191:
\vskip1.000000\baselineskip
95 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:192:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:192:
\vskip1.000000\baselineskip
96 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:193:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:193:
\vskip1.000000\baselineskip
97 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:194:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:194:
\vskip1.000000\baselineskip
98 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:195:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:195:
\vskip1.000000\baselineskip
99 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:196:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 156 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:196:
100 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:197:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:197:
\vskip1.000000\baselineskip
101 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:198:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:198:
102 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:199:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:199:
\vskip1.000000\baselineskip
103 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:200:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:200:
\vskip1.000000\baselineskip
104 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:201:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:201:
\vskip1.000000\baselineskip
105 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:202:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 291 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:202:
\vskip1.000000\baselineskip
106 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:203:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:203:
\vskip1.000000\baselineskip
107 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:204:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:204:
\vskip1.000000\baselineskip
108 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:205:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:205:
\vskip1.000000\baselineskip
109 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:206:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 471 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:206:
\vskip1.000000\baselineskip
110 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:207:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:207:
\vskip1.000000\baselineskip
111 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:208:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:208:
\vskip1.000000\baselineskip
112 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:209:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:209:
\vskip1.000000\baselineskip
113 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:210:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:210:
\vskip1.000000\baselineskip
114 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:211:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 111 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:211:
\vskip1.000000\baselineskip
115 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:212:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 111 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:212:
\vskip1.000000\baselineskip
116 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:213:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:213:
\vskip1.000000\baselineskip
117 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:214:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:214:
\vskip1.000000\baselineskip
118 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:215:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:215:
\vskip1.000000\baselineskip
119 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:216:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 180 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:216:
\vskip1.000000\baselineskip
120 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:217:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 156 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:217:
121 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:218:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:218:
\vskip1.000000\baselineskip
122 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:219:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:219:
123 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:220:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 37 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:220:
\vskip1.000000\baselineskip
124 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:221:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:221:
\vskip1.000000\baselineskip
125
126 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:222:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 91 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:222:
\vskip1.000000\baselineskip
127 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:223:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 89 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:223:
\vskip1.000000\baselineskip
128 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:224:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:224:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Leu Ser Gly Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:225:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:225:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTSASYGASY TGGGYCTGGG CTAY 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:226:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:226:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTYMGSTACT GCRSMGGCKC YTGC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:227:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:227:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
RWAGGCSRTS GGKCKGCARC AKGS 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:228:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:228:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
MKCRTCYARR AASGACASST C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:229:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 168 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:229:
\vskip1.000000\baselineskip
129 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:230:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:230:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGGAGAAGG TCATCTTCCG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:231:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:231:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGTGGGCT CGGCCCTGGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:232:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:232:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGGAGAAG GTCATCTTCC GCTA 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:233:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:233:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCGGCCCTG GCCCTGCAGC 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:234:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:234:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCAGCCGGG CCAGCGCCAG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:235:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:235:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGATCCA TGCCTGGATT CGAGGGTGCA G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:236:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:236:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGCGGATCCA TGGCCGTAGG GAAGTTCCTG C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:237:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:237:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCCAAGCT TTTACTTGTC ATCGTCGTCC TTGTAGTCGC CACCACAGCC GCAGGCAGCC 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:238:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:238:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCCAAGCT TTTACTTGTC ATCGTCGTCC TTGTAGTCTC GAGGAAGGCC ACGTCGGTG 
\hfill
59 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:239:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:239:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGCCACCA CAGCCGCAGG CAGCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:240:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 70 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:240:
\vskip1.000000\baselineskip
130 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:241:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:241:
\vskip1.000000\baselineskip
131 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC N°:242:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC N°:242:
\vskip1.000000\baselineskip
132

Claims (15)

1. Un factor de crecimiento aislado y purificado que comprende la secuencia de polipéptidos de ID SEC N°: 217 o ID SEC N°: 223, en el que dicho factor de crecimiento promueve la supervivencia en células mesencefálicas.
2. Un factor de crecimiento aislado y purificado que comprende una secuencia de persefina como se expone en ID SEC N°: 217, ID SEC N°: 221 o ID SEC N°: 223.
3. Un polipéptido aislado y purificado que comprende:
(a) una pre-pro región de persefina como se expone en ID SEC N°: 218;
(b) una pre-región de persefina como se expone en ID SEC N°: 219;
o
(c) una pro-región de persefina como se expone en ID SEC N°: 220.
4. Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada o molécula de ácido nucleico complementaria a la misma que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un factor de crecimiento de la reivindicación 1 ó 2 o un fragmento de dicha secuencia de nucleótidos que está constituida por al menos 15 nucleótidos contiguos.
5. Un vector que comprende elementos reguladores de la expresión unidos de manera factible a una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.
6. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 5.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos de pre-pro persefina como se expone en ID SEC N°: 203 o el complemento de la misma;
(b) una pre-pro región de un polinucleótido de persefina como se expone en ID SEC N°: 213, ID SEC N°: 215 o el complemento de cualquiera de ellas;
(c) una pre-región de un polinucleótido de persefina como se expone en ID SEC N°: 208, ID SEC N°: 209 o el complemento de cualquiera de ellas;
(d) una pro-región de un polinucleótido de persefina como se expone en ID SEC N°: 211 o el complemento de la misma; o
(e) un fragmento de una secuencia explicada en cualquiera de (a) a (d) que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos, en la que dicho fragmento no se produce en ID SEC N°:179, ID SEC N°:190 o el complemento de cualquiera de ellas.
8. Un procedimiento recombinante que comprende:
(a) subclonar un polinucleótido que codifica el factor de crecimiento de la reivindicación 1 ó 2 en un vector de expresión que comprende elementos reguladores unidos de manera factible al polinucleótido;
(b) transformar una célula huésped con el vector de expresión;
(c) hacer crecer la célula huésped en un cultivo de célula huésped; y
(d) cosechar el factor de crecimiento y/o el polinucleótido del cultivo de célula huésped.
9. Anticuerpos aislados y purificados que pueden reaccionar específicamente con un factor de crecimiento como se define en la reivindicación 1 ó 2 o un epítopo del mismo.
10. Un procedimiento para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente que comprende hacer reaccionar anticuerpos según la reivindicación 9 con un factor de crecimiento presente en la muestra y detectar la unión de los anticuerpos con el factor de crecimiento.
11. Un kit para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente que comprende anticuerpos de la reivindicación 9 que pueden reaccionar de manera detectable con dicho factor de crecimiento, envasado en un recipiente.
12. Un factor de crecimiento según la reivindicación 1 ó 2 o un polinucleótido que codifica un factor de crecimiento como se define en la reivindicación 1 ó 2 para uso en la prevención o tratamiento de degeneración o insuficiencia celular en un individuo.
13. Uso de un factor de crecimiento según la reivindicación 1 ó 2 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una degeneración o insuficiencia celular que es (a) degeneración neuronal resultante de neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral aguda, lesión medular aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple o infección; (b) degeneración o insuficiencia de células hematopoyéticas resultante de eosinopenia, basopenia, linfopenia, monocitopenia, neutropenia, anemia, trombocitopenia o insuficiencias de células madre para éstas; o (c) degeneración o insuficiencia de músculo cardiaco resultante de cardiomiopatía o insuficiencia cardiaca congestiva.
14. Una célula transformada con un vector según la reivindicación 5 y que expresa un factor de crecimiento de la reivindicación 1 ó 2 para usar en la prevención o tratamiento de degeneración o insuficiencia celular en un individuo.
15. Un procedimiento para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente que comprende detectar y/o cuantificar la presencia en la muestra de ARNm que codifica un factor de crecimiento de la reivindicación 1 ó 2.
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