ES2237793T3 - Persefina y factores de crecimiento relacionados. - Google Patents

Abstract

SE EXPONE UN NUEVO FACTOR DE CRECIMIENTO, LA PERSEFINA, QUE PERTENECE A LA FAMILIA DE FACTORES DEL CRECIMIENTO DE LA GDNF/NEURTURINA. SE HAN IDENTIFICADO LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DEL RATON Y LA RATA. SE HAN CLONADO LAS SECUENCIAS DE DNA GENOMICO DE LA PERSEFINA DE RATON Y RATA, IDENTIFICANDOSE LAS RESPECTIVAS SECUENCIAS EN DNAC. ADEMAS, SE EXPONEN PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR CONDICIONES DEGENERATIVAS QUE USAN PERSEFINA, PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR LAS ALTERACIONES GENETICAS DE LA PERSEFINA Y PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR Y MONITORIZAR LOS NIVELES DE PERSEFINA EN LOS PACIENTES. SE EXPONEN IGUALMENTE PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR MIEMBROS ADICIONALES DE LA FAMILIA DE FACTORES DE CRECIMIENTO DE LA PERSEFINA-NEURTURINA-GDNF.

Description

Persefina y factores de crecimiento relacionados.

Antecedentes de la invención (1) Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a factores tróficos o de crecimiento y, más particularmente, a factores de crecimientonovedosos de la familia de neurturina-GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales) de los factores de crecimiento.

(2) Descripción de la técnica relacionada

El desarrollo y mantenimiento de los tejidos en organismos complejos requiere un control preciso sobre los procesos de proliferación, diferenciación, supervivencia y función celulares. Un mecanismo principal mediante el que se controlan estos procesos es a través de las acciones de polipéptidos conocidos como "factores de crecimiento". Estas moléculas estructuralmente diversas actúan a través de receptores específicos de la superficie celular para producir estas acciones.

Los factores de crecimiento, denominados "factores neurotróficos" estimulan la diferenciación, crecimiento y supervivencia de las neuronas y residen en el sistema nervioso o en tejidos inervados. El factor de crecimiento nervioso (NGF) fue el primer factor neurotrófico que se identificó y caracterizó (Levi-Montalcini et al., J. Exp. Zool. 116:321, 1951). NGF existe como un homodímero unido no covalentemente que estimula la supervivencia y crecimiento de las neuronas simpáticas, sensitivas derivadas de la cresta neural y las colinérgicas del prosencéfalo basal. En las neuronas simpáticas, esta sustancia produce el crecimiento del axón in vitro y un aumento del crecimiento axonal y dendrítico in vivo. (Véase Levi-Montalcini y Booker, Proc Nat'l Acad Sci 46:384-391, 1960; Johnson et al. Science 210: 916-918, 1980; Crowley et al., Cell 76:1001-12, 1994). NGF tiene efectos sobre la cognición y la plasticidad neuronal y puede estimular la supervivencia de las neuronas que han sufrido daño debido a una variedad de agresiones mecánicas, químicas, víricas e inmunológicas (Snider y Johnson, Ann Neurol 26:489-506, 1989; Hefti, J Neurobiol 25:1418-35, 1994). También se sabe que NGF interacciona ampliamente con el sistema endocrino y en procesos inmunitarios e inflamatorios. (Revisado en Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Otten y Gadient, Int J. Devl Neurosci. 13:147-151, 1995). Por ejemplo, NGF estimula la supervivencia de los mastocitos. (Horigome et al. J Biol Chem 269:2695-2707, 1994).

En los últimos años, ha resultado evidente que los factores de crecimiento se clasifican en clases, es decir familias o superfamilias basadas en las similitudes en sus secuencias de aminoácidos. Estas familias incluyen, por ejemplo, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, la familia de la neurotrofina y la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta). Como ejemplo de las similitudes de secuencia de los miembros de una familia, los miembros de la familia de TGF-\beta tienen 7 residuos de cisteína de estructura canónica que identifican a los miembros de esta superfamilia.

NGF es el prototipo de una familia tal de factores de crecimiento. El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el segundo miembro de esta familia que se descubrió, demostró estar relacionado con NGF en virtud de la conservación de las seis cisteínas que forman los tres disulfuros internos del monómero de NGF (Barde, Prog Growth Factor Res 2:237-248, 1990 y Liebrock et al. Nature 341:149-152, 1989). Utilizando la información proporcionada por BDNF de las partes sumamente conservadas de los dos factores, se hallaron rápidamente miembros adicionales (NT-3, NT-4/5) de esta familia de la neurotrofina por varios grupos (Klein, FASEB J 8:738-44, 1994).

Recientemente, se han identificado factores neurotróficos no relacionados estructuralmente con NGF. Éstos incluyen factores aislados originalmente basándose en una "acción neurotrófica" tal como un factor neurotrófico ciliar (CNTF) (Lin et al., Science 246:1023-5, 1989) junto con otros aislados originalmente como resultado de actividades no neuronales (por ejemplo, factores de crecimiento de fibroblastos (Cheng y Mattson Neuron 1:1031-41, 1991), IGF-I (Kanje et al, Brain Res 486:396-398, 1989), factor inhibidor de la leucemia (Kotzbauer et al, Neuron 12:763-773, 1994).

El factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), es uno de tales factores neurotróficos no relacionados estructuralmente con NGF. GDNF era, por tanto, un factor único que, hasta ahora, no se sabía que era un miembro de alguna subfamilia de factores. El descubrimiento, purificación y clonación de GDNF resultó de una investigación de factores cruciales para la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, que degeneran en la enfermedad de Parkinson. GDNF se purificó de medios condicionados de células gliales de rata B49 (Lin et al., Science 260:1130-2, 1993). El análisis de la secuencia reveló que era un miembro lejano de la superfamilia de TGF-\beta de los factores de crecimiento, que tenía aproximadamente una identidad del 20% basado principalmente en la alineación característica de los 7 residuos de cisteína de estructura canónica (Lin et al., Science 260:1130-2, 1993). Por tanto, GDNF podría haber representado posiblemente una nueva subfamilia dentro de la superfamilia de
TGF-\beta.

GDNF recombinante producido en bacterias estimula específicamente la supervivencia y diferenciación morfológica de las neuronas dopaminérgicas (Lin et al., Science 260:1130-2, 1993; Tomac et al., Nature 373:335-9, 1995; Beck et al., Nature 373:339-41, 1995 y Ebendal et al., J. Neurosci Res 40:276-84, 1995) y las neuronas motoras (Henderson et al., Science 266:1062-4, 1994; Yan et al., Nature 373:341-4, 1995; y Oppenheim et al., Nature 373:344-6, 1995). En general, GDNF era un factor más potente para estimular la supervivencia de las neuronas motoras que los demás factores, y era el único factor que evitaba la atrofia neuronal en respuesta a estas lesiones, colocándolo así como un agente terapéutico prometedor para las enfermedades de las neuronas motoras.

Ahora se cree generalmente que los factores neurotróficos regulan muchos aspectos de la función neuronal, incluyendo la supervivencia y el desarrollo en la vida fetal y la integridad estructural y la plasticidad en la edad adulta. Puesto que tanto las lesiones agudas del sistema nervioso así como las enfermedades neurodegenerativas crónicas se caracterizan por un daño estructural y, posiblemente, por apoptosis inducida por la enfermedad, es probable que los factores neurotróficos desempeñen algún papel en estas dolencias. En efecto, un conjunto de pruebas considerable sugiere que los factores neurotróficos pueden ser agentes terapéuticos valiosos para el tratamiento de estos estados neurodegenerativos, que son quizás las enfermedades más destructivas social y económicamente de las que adolece ahora nuestra sociedad. No obstante, dado que diferentes factores neurotróficos pueden actuar potencial y preferentemente a través de diferentes receptores y sobre distintos tipos de células neuronales o no neuronales, sigue habiendo la necesidad continua de la identificación de nuevos miembros de las familias de factores neurotróficos para su uso en el diagnóstico y tratamiento de una variedad de enfermedades agudas y crónicas del sistema nervioso.

Sumario de la invención

Brevemente, por tanto, la presente invención se refiere a la identificación y el aislamiento de factores purificados sustancialmente que estimulan la supervivencia y el crecimiento de las neuronas así como de células no neuronales. En consecuencia, los inventores del presente documento han tenido éxito en el descubrimiento de factores de crecimiento proteicos novedosos que pertenecen a una familia de los factores de crecimiento para la que GDNF fue el primer miembro conocido. Ese primer miembro de la familia recién descubierto fue la neurturina y ésta es el objeto de la publicación de patente europea EP0787142. Basándose en la secuencia de GDNF y neurturina, los inventores del presente documento han descubierto otro miembro de la familia de GDNF-neurturina de factores de crecimiento al que se hace referencia en el presente documento como persefina (PSP). Se cree que este factor de crecimiento muestra una identidad de secuencia de al menos el 85% entre secuencias homólogas de diferentes especies de mamíferos, aunque la homología de secuencia puede ser de tan sólo el 65% en especies que no son mamíferos tales como las especies de aves. Las proteínas de persefina identificadas en el presente documento incluyen secuencias de ratón expuestas en las SEQ ID NOS: 79, 80 y 81 (figura 11; residuos de aminoácidos del 52 al 140, 47 a 142 y 9 a 142, respectivamente) y secuencias de rata expuestas en las SEQ ID NOS: 82 y 83 (figura 14; residuos de aminoácidos del 1 al 89 y 1 a 91, respectivamente). Además, se identifica la persefina humana en virtud de que tiene una homología de secuencia de al menos el 85% con su ortólogo, persefina de ratón madura, junto con la identificación de ciertos residuos de aminoácidos conservados contenidos en la persefina humana, tal como se muestra en la figura 15. Por tanto, se cree que la persefina humana tendrá 28 aminoácidos en la secuencia alineada entre los residuos de cisteína de estructura canónica primero y séptimo, tal como se expone en la figura 15 siendo los residuos numerados desde el extremo N-terminal de la secuencia alineada del miembro de la familia (1) Cys, (3) Leu, (10) Val, (13) Leu, (14) Gly, (15) Leu, (16) Gly, (17) Tyr, (21) Glu, (25) Phe, (26) Arg, (27) Tyr, (28) Cys, (30) Gly, (32) Cys, (44) Leu, (47) Leu, (58) Cys, (59) Cys, (61) Pro, (66) Asp, (69) Phe, (70) Leu, (71) Asp, (83) Ser, (84) Ala, (87) Cys y (89) Cys.

La persefina se ha identificado y obtenido mediante un método basado en las regiones conservadas de la familia de GDNF-neurturina descubierta por los inventores del presente documento. En consecuencia, se ha concebido un nuevo método que utiliza cebadores degenerados construidos a partir de las secuencias de estas regiones conservadas para su uso en el procedimiento de lareacción en cadena de la polimerasa. Utilizando este método, se han identificado y obtenido los ortólogos de ratón y rata del nuevo miembro de la familia, la persefina.

La presente solicitud describe, por tanto, tanto las secuencias de aminoácidos como las secuencias de nucleótidos que codifican para la persefina de ratón y rata expuestas en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 79-83 y las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NOS: 84 y 85. Debido a la estrecha homología entre las secuencias de ratón y rata (identidad de secuencia del 95%), se cree que la secuencia de la persefina humana mostrará una elevada homología de secuencia con las secuencias de ratón y rata.

Según la invención, se proporciona así un polipéptido aislado y purificado que comprende una secuencia de 89 aminoácidos contiguos, teniendo dicha secuencia como aminoácidos en las posiciones indicadas entre paréntesis:

Cys (1), Leu (3), Val (10), Leu (13), Gly (14), Leu (15), Gly (16), Tyr (17), Glu (21), Phe (25), Arg (26), Tyr (27), Cys (28), Gly (30), Cys (32), Leu (44), Leu (47), Cys (58), Cys (59), Pro (61), Asp (66), Phe (69), Leu (70), Asp (71), Ser (83), Ala (84), Cys (87) y Cys (89).

Identificándose dichas posiciones por alineación con la SEQ ID NO: 79 o SEQ ID NO: 82; en la que dicha secuencia tiene una identidad de al menos el 85% con la SEQ ID NO: 79, o SEQ ID NO: 82.

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la invención.

Los vectores de expresión y las células transformadas establemente también están dentro del alcance de esta invención. Las células transformadas pueden utilizarse en un método para producir persefina.

La invención proporciona así:

- un vector que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende elementos reguladores de la expresión unidos operativamente a un ácido nucleico de la invención;

- una célula huésped transformada con un vector de la invención; y

- un método de ADN recombinante que comprende:

(a) subclonar un polinucleótido, que comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido de la invención, en un vector de expresión que comprende elementos reguladores necesarios para expresar la secuencia de ADN;

(b) transformar una célula huésped con dicho vector de expresión;

(c) hacer crecer la célula huésped en un cultivo de células huésped; y

(d) recoger el polipéptido y/o el ADN del polinucleótido procedente del cultivo de células huésped;

En otra realización, la presente solicitud describe un método para prevenir o tratar la degeneración neuronal que comprende administrar a un paciente que necesite la misma, una cantidad terapéuticamente eficaz de persefina. Un paciente también puede tratarse implantando células transformadas que expresan persefina o una secuencia de ADN que codifica para la persefina a un paciente, o células cultivadas y expandidas por crecimiento en persefina.

La invención proporciona así:

- el uso de un polipéptido de la invención o un ácido nucleico que codifica para tal polipéptido en la fabricación de un medicamento para su uso en un método para prevenir o tratar la degeneración o déficit celular, en el que la degeneración o déficit celular es la degeneración neuronal que resulta de un estado seleccionado del grupo que consiste en neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral aguda, lesión de la médula espinal aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple e infección.

La presente invención también proporciona composiciones y métodos para detectar persefina. Un método se basa en anticuerpos contra persefina y otros métodos se basan en la detección de ARNm o ADNc o ADN genómico que codifica para persefina utilizando técnicas de ADN recombinante.

La invención también proporciona así anticuerpos aislados y purificados que puede reaccionar específicamente con un polipéptido de la invención o un epítopo del mismo.

Por tanto, entre las diversas ventajas que se encontró que se lograban con la presente invención, puede indicarse la provisión de un nuevo factor de crecimiento, persefina, para su uso en prevenir la atrofia, degeneración o muerte de ciertas células, en particular las neuronas; la provisión de persefina humana poniendo a disposición las secuencias específicas de la persefina murina y de rata, a partir de las cuales puede identificarse y obtenerse la secuencia humana; la provisión de otros miembros de la familia de neurturina-persefina-GNDF de factores de crecimiento poniendo a disposición nuevos métodos que pueden obtener otros miembros de la familia; la provisión de métodos para obtener persefina mediante técnicas recombinantes; la provisión de métodos para prevenir o tratar enfermedades que producen degeneración celular y, en particular, degeneración neuronal; la provisión de métodos que pueden detectar y monitorizar los niveles de persefina en un paciente; y la provisión de métodos que pueden detectar alteraciones en el gen de la persefina.

La invención proporciona así además:

- un método para detectar la presencia de un factor decrecimiento en una muestra procedente de un paciente, que comprende hacer reaccionar anticuerpos de la invención con un factor de crecimiento presente en la muestra y detectar la unión de los anticuerpos con el factor de crecimiento;

- un método para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra procedente de un paciente, que comprende detectar y/o cuantificar la presencia en la muestra de ARNm que codifica para un polipéptido de la invención; y

- un método para estimular el crecimiento y/o la diferenciación de una célula en un medio de cultivo que comprende añadir al medio de cultivo el polipéptido de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el esquema de purificación de la preparación de neurturina a partir de células CHO;

La figura 2 muestra la caracterización de las fracciones eluidas de una columna Mono S en la purificación de neurturina que muestra (a) electroforesis de cada fracción sobre un gel de poliacrilamida-SDS y visualización de las proteínas mediante tinción de plata y (b) la actividad neurotrófica presente en cada fracción en el ensayo de supervivencia del ganglio cervical superior;

La figura 3 muestra la capacidad de la neurturina para mantener la supervivencia de las células del ganglio cervical superior en cultivo, que muestra (a) células control positivas mantenidas con factor de crecimiento nervioso (NGF) (b) células control negativas tratadas con anticuerpos anti-NGF que muestran una disminución de la supervivencia y (c) células tratadas con anti-NGF y neurturina (aproximadamente 3 ng/ml) que muestran supervivencia de las neuronas;

La figura 4 ilustra el efecto concentración-respuesta de la neurturina en el ensayo de supervivencia del ganglio cervical superior;

La figura 5 muestra la homología de las secuencias de aminoácidos para los factores de crecimiento maduros, neurturina humana (hNTN), neurturina de ratón (mNTN), GDNF de rata (rGDNF), GDNF de ratón (mGDNF) y GDNF humano (hGDNF) con los residuos de aminoácidos idénticos encerrados en recuadros;

La figura 6 ilustra la distribución tisular del ARNm para neurturina y el ARNm para GDNF utilizando análisis de RT-PCR (transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa) en muestras de ARN obtenidas a partir de ratas en el día embrionario 21 (E21) y adultas;

La figura 7 ilustra el ADNc y la secuencia de aminoácidos para la que codifica de la pre-pro-neurturina humana (SEQ ID NO: 11) que muestra la región pre desde el ácido nucleico 1 hasta el 57 (SEQ ID NO: 17), la región pro desde el ácido nucleico 58 hasta el 285 (SEQ ID NO: 20), la neurturina humana desde el ácido nucleico 286 hasta el 591 (SEQ ID NO: 9) y el sitio de corte y empalme entre los aminoácidos 169 y 170, que define la parte de la secuencia codificante de dos exones desde el ácido nucleico 1 hasta el 169 (SEQ ID NO: 27) y del 170 al 594 (SEQ ID NO: 28);

La figura 8 ilustra el ADNc y la secuencia de aminoácidos para la que codifica de la pre-pro-neurturina de ratón (SEQ ID NO: 12) que muestra la región pre desde el ácido nucleico 1 hasta el 57 (SEQ ID NO: 18), la región pro desde el ácido nucleico 58 hasta el 285 (SEQ ID NO: 21), la neurturina de ratón desde el ácido nucleico 286 hasta el 585 (SEQ ID NO: 10) y el sitio de corte y empalme entre los aminoácidos 169 y 170, que define la parte de la secuencia codificante de dos exones desde el ácido nucleico 1 hasta el 169 (SEQ ID NO: 29) y del 170 al 588 (SEQ ID NO: 30);

La figura 9 ilustra la secuencia de ADNc de ratón que contiene una región no codificante en 5' (SEQ ID NO: 13) y una región no codificante en 3' (SEQ ID NO: 14), cada una de las cuales es contigua a la región codificante de la pre-pro-neurturina;

La figura 10 ilustra la supervivencia neuronal en porcentaje en neuronas de los ganglios inferiores del nervio vago de rata E18 tratadas 24 horas después del cultivo en placa para determinar NTN, GDNF, BDNF, NGF y AMO;

La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de la persefina murina (SEQ ID NOS: 79, 80 y 81; residuos de aminoácidos del 52 al 140, 47 a 142 y 9 a 142, respectivamente);

La figura 12 ilustra la identidad de secuencia de los miembros de la familia en la región entre los residuos de cisteína de estructura canónica primero y séptimo alineados, que empieza con la primera cisteína de estructura canónica para GDNF murino (SEQ ID NO: 87), neurturina (NTN) murina (SEQ ID NO: 88) y persefina (PSP) murina (SEQ ID NO: 89);

La figura 13 ilustra la secuencia parcial del ADNc para persefina de rata (SEQ ID NO: 97) obtenido mediante la técnica de la amplificación rápida de extremos de ADNc;

La figura 14 ilustra la secuencia parcial que empieza con la primera cisteína de estructura canónica para persefina de rata (SEQ ID NO: 83) y la correspondiente secuencia del polinucleótido (SEQ ID NO: 86);

La figura 15 muestra las secuencias de aminoácidos parciales alineadas de los miembros de la familia desde el primer hasta el séptimo residuo de cisteína de estructura canónica que ilustran la homología de secuencia de los miembros de la familia de los factores de crecimiento maduros, GDNF humano, GDNF de rata, GDNF de ratón, neurturina (NTN) humana, neurturina de ratón, persefina (PSP) de rata y persefina de ratón, en las que los recuadros encierran los 28 residuos de aminoácidos conservados presentes en todas;

La figura 16 ilustra las secuencias de los miembros de la superfamilia de TGF-\beta alineadas utilizando el método Clustal, desde la primera cisteína de estructura canónica hasta el extremo de la secuencia para el factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF\beta1), el factor de crecimiento transformante \beta2 (TGF\beta2), el factor de crecimiento transformante \beta3 (TGF\beta3), la inhibina \beta A (INH\betaA), la inhibina \beta B (INH\betaB), el gen nodal (NODAL), las proteínas morfogenéticas óseas 2 y 4 (BMP2 y BMP4), el gen de Drosophila decapentaplegic (dpp), las proteínas morfogenéticas óseas 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 y BMP8), la familia del gen de Drosophila 60A (60A), la proteínas morfogenética ósea 3 (BMP3), el gen Vg1, los factores de crecimiento y diferenciación 1 y 3 (GDF1 y GDF3), dorsalina (drsln), inhibina \alpha (INH\alpha), el gen MIS (MIS), el factor de crecimiento 9 (GDF-9), el factor de crecimiento neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) y neurturina (NTN);

La figura 17 ilustra el gen de la persefina murina de longitud completa (SEQ ID NO: 131), la secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la región pre-pro codificada por la secuencia de nucleótidos en el primer marco de lectura desde el codón de iniciación de metionina hasta el codón de terminación en las posiciones nucleotídicas 244-246 (SEQ ID NO: 132) y la secuencia de aminoácidos que incluye persefina madura en el segundo marco de lectura desde la posición nucleotídica 2 hasta el codón de terminación en las posiciones 557-559 (SEQ ID NO: 133);

La figura 18 ilustra el gen de la persefina de rata de longitud completa (SEQ ID NO: 134), la secuencia de aminoácidos que incluye al menos una parte de la región pre-pro codificada por la secuencia de nucleótidos en el primer marco de lectura desde el codón de iniciación de metionina hasta el codón de terminación en las posiciones nucleotídicas 244-246 (SEQ ID NO: 135) y la secuencia de aminoácidos que incluye persefina madura en el segundo marco de lectura desde la posición nucleotídica 2 hasta el codón de terminación en las posiciones 557-559 (SEQ ID NO: 136);

La figura 19 ilustra un análisis de inmunotransferencia ("Western blot") que utiliza anticuerpos anti-persefina para detectar la proteína persefina en lisados celulares procedentes de células de mono COS transfectadas con el gen de la persefina murina (carril 2) o el gen de la persefina de rata (carril 3) comparado con células transfectadas con el vector no recombinante solo (pCB6, carril 4) y la proteína madura producida por E. coli (carril 1);

La figura 20 ilustra las moléculas quiméricas murinas (A) PSP/NTN que contiene el fragmento de la persefina (residuos 1-63) y el fragmento de la neurturina (residuos 68-100) y (B) NTN/PSP que contiene el fragmento de la neurturina (residuos 1-67) y el fragmento de la persefina (residuos 64-96) indicando la flecha el punto de cruce en cada una;

La figura 21 ilustra el efecto de estimulación de la supervivencia de la persefina en células mesencefálicas del día embrionario 14, murinas cultivadas durante tres días (a) en ausencia de persefina, en la que casi todas las células se mueren y (b) en presencia de persefina (100 ng/ml) en la que es evidente una supervivencia neuronal sustancial; y

La figura 22 ilustra el estudio mediante RT-PCR para determinar la expresión de persefina en tejidos de ratón adulto que muestran expresión de persefina por las células renales.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se basa en la identificación, el aislamiento y la secuenciación de una molécula de ADN que codifica para un nuevo factor de crecimiento, la persefina. Debido a la similitud de secuencia con neurturina y GDNF, se cree que la persefina puede estimular la supervivencia celular y, en particular, la supervivencia de las neuronas. Antes de esta invención, se desconocía la persefina y no se había identificado como una sustancia biológica diferenciada ni se había aislado en forma pura.

El factor de crecimiento neurturina (NTN) se identificó y aisló tal como se expone en la publicación de patente europea EP0787142. A partir de la secuencia de neurturina y la secuencia del factor de crecimiento estrechamente relacionado, factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), los inventores del presente documento han concebido y buscado estrategias para encontrar factores relacionados adicionales. La neurturina es idéntica en aproximadamente un 40% a GDNF, pero es idéntica en menos de un 20% con respecto a cualquier otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta. Juntas, estas dos proteínas definen una nueva subfamilia dentro de la superfamilia de TGF-\beta. Se identificaron varias regiones de la secuencia de neurturina y GDNF que estaban sumamente conservadas, de tal manera que era probable que estuviesen presentes en cualquier miembro adicional de esta subfamilia. Por tanto, esta información sobre la secuencia puede utilizarse para aislar miembros desconocidos previamente de esta subfamilia, diseñando oligonucleótidos degenerados que van a utilizarse en reacciones de PCR o como sondas en estudios de hibridación.

Utilizando la nueva estrategia de PCR con cebadores degenerados descrita en el ejemplo 11 de la publicación de patente europea EP0787142, los inventores del presente documento han tenido éxito en la identificación de un tercer factor, persefina, que es idéntica en aproximadamente un 40-50% tanto a GDNF como a neurturina. Los cebadores correspondientes a la secuencia de aminoácidos de las regiones conservadas de neurturina y GDNF (SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44) se utilizaron para amplificar un fragmento de 77 nucleótidos procedente de ADN genómico de rata. Los productos resultantes se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron. La secuencia de uno de los productos amplificados pronosticó que los datos de la secuencia de aminoácidos interna para los cebadores de PCR era diferente de la de GDNF o neurturina pero tenía una identidad de más del 20% con GDNF y neurturina, mientras que las secuencias de los demás productos amplificados que se obtuvieron correspondían a GDNF o neurturina, tal como se esperaba. La secuencia de 22 nucleótidos (SEQ ID NO: 90) se alineó entonces con las secuencias de rata de GDNF y neurturina y se encontró que eran únicas. Por tanto, esta secuencia novedosa sugirió que se había identificado un nuevo miembro de la familia, denominado en el presente documento como persefina.

Para obtener información adicional sobre la secuencia de persefina, se utilizaron cebadores que contenían la secuencia única de 22 nucleótidos del fragmento amplificado en la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman, M. A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) utilizando ADNc obtenido a partir de cerebro de rata neonatal. Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 350 nucleótidos a partir de esta reacción de PCR que constituía una secuencia parcial de ADNc para persefina de rata de aproximadamente 350 nucleótidos (SEQ ID NO: 106). La secuencia de aminoácidos prevista de este ADNc se comparó con la de GDNF y neurturina y se encontró que tenía una identidad de aproximadamente el 40% con cada una de estas proteínas. De manera importante, está presente la separación característica de los residuos de cisteína de estructura canónica en los miembros de la superfamilia de TGF-\beta. Adicionalmente, además de la región de similitud codificada por los cebadores degenerados utilizados para aislar la persefina, también estaba presente en la persefina otra región de alta homología compartida entre GDNF y neurturina, pero ausente en otros miembros de la superfamilia de TGF-\beta.

GDNF	ACCRPVAFDDDLSFLDD	(aa 60-76)	(SEQ ID NO:98)
NTN	PCCRPTAYEDEVSFKDV	(aa 61-77)	(SEQ ID NO:99)
PSP	PCCQPTSYAD-VTFLDD	(aa 57-72)	(SEQ ID NO:100)

(La numeración de los aminoácidos utiliza el primer residuo de Cys como aminoácido 1).

Con la confirmación de que la persefina era en efecto un nuevo miembro de la subfamilia de GDNF/NTN, se aislaron clones genómicos murinos de persefina para obtener información adicional sobre la secuencia. Se utilizaron los cebadores correspondientes a la secuencia de ADNc de rata en una reacción de PCR para amplificar un fragmento de 155 nucleótidos (nt) procedente de ADN genómico de ratón que era homólogo a la secuencia de ADNc para persefina de rata. Estos cebadores se utilizaron entonces para obtener clones genómicos de la persefina murina a partir de una biblioteca de ratón 129/Sv en un vector de bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., San Luis, MO).

Se identificaron los fragmentos de restricción (Nco I de 3,4 kb y un Bam HI de 3,3 kb) procedentes de este clon de P1 que contenía el gen de la persefina mediante hibridación con un fragmento de 210 nt de persefina obtenido mediante PCR utilizando ADN genómico de ratón y cebadores específicos para persefina. Los fragmentos Nco I y Bam HI se secuenciaron y se encontró que codifican para un tramo de aminoácidos correspondiente al presente en el producto de RACE de persefina de rata, además de ser homólogo a las regiones maduras de neurturina y GDNF (figura 11).

Cuando se alinearon las secuencias de aminoácidos de GDNF, NTN y PSP maduros murinos, utilizando la primera cisteína de estructura canónica como punto de partida, lo que se realiza debido a que las alteraciones en los sitios de escisión entre miembros de la familia producen variabilidad en los segmentos en el sentido de 5' de la primera cisteína, la persefina (91 aminoácidos) es algo menor que la neurturina (95 aminoácidos) o GDNF (94 aminoácidos). La identidad global dentro de esta región es de aproximadamente el 50% con neurturina y de aproximadamente el 40% con GDNF (figura 12).

La secuenciación adicional de los nucleótidos del fragmento Nco I de la persefina murina reveló la secuencia de nucleótidos del gen de la persefina murina completo, tal como se muestra en la figura 17. Además, el gen de la persefina de rata completo se había determinado secuenciando un fragmento amplificado por PCR de ADN genómico de rata, tal como se muestra en la figura 18. Tanto en el gen de la persefina murina como de rata, se extiende un marco de lectura abierto desde la secuencia que codifica para una metionina iniciadora hasta un codón de terminación en las posiciones 244-246. Sin embargo, en alguna parte de esta secuencia se produce una anomalía aparente, de tal manera que la secuencia que codifica para el sitio de escisión RXXR (posiciones 257-268) y la secuencia correspondiente a la proteína madura (posiciones 269-556) no son colineales con este marco de lectura abierto. En su lugar, un segundo marco de lectura codifica para el sitio de escisión y la persefina madura. Los dos marcos de lectura contundentes se muestran en las figuras 17 y 18. Independientemente de esta anomalía aparente, las células de mamífero expresan persefina a partir de la secuencia genómica de longitud completa murina o de rata (véase el ejemplo 14, más adelante).

El extremo N-terminal de la persefina se pronosticó haciendo referencia a las regiones N-terminales de neurturina o GDNF. Utilizando señales de escisión y homología de secuencia de neurturina, está presente un motivo de escisión RXXR característico que comienza 9 residuos en el sentido de 5' de la primera cisteína de estructura canónica, lo que podría sugerir que la persefina madura murina contendría 5 aminoácidos (ALAGS) (SEQ ID NO: 103) en el sentido de 5' de esta cisteína (como sucede en la neurturina).

Los 5 aminoácidos correspondientes en la persefina de rata son ALPGL (SEQ ID NO: 112). Utilizando estos parámetros, la persefina madura consistiría en 96 aminoácidos y tendría un peso molecular previsto de 10,4 kD. La utilización de señales de escisión y homología de secuencia de GDNF, por otro lado, sugiere que el extremo N-terminal en el sentido de 5' desde la primera cisteína de la persefina podría ser más largo, de acuerdo con el observado para GDNF que es de 40 residuos. Por tanto, se localiza un motivo de escisión RXXR característico a 47 residuos en el sentido de 5' de la primera cisteína y esto sugeriría que la persefina madura contendría 43 aminoácidos (VRIPGGLPTPQFLLSKPSLCLTILLYLALGNNHVRLPRALAGS) (SEQ ID NO: 104) en el sentido de 5' de esta cisteína. Utilizando estos parámetros, la persefina madura consistiría en 134 aminoácidos y tendría un peso molecular previsto de 14,5 kD. Por tanto, la persefina madura puede existir en una o ambas de las formas de 10,4 kD prevista de 96 aminoácidos o de 14,5 kD prevista de 134 aminoácidos.

Por factor de crecimiento "maduro" se hace referencia a la forma secretada del factor de crecimiento en la que se ha escindido cualquier región pre o pro y que puede existir como un monómero o, por analogía con otros miembros de la superfamilia de TGF-\beta, en la forma de un homodímero unido por enlaces disulfuro.

El descubrimiento del nuevo factor de crecimiento, la persefina, tal como se describió anteriormente, es el resultado del descubrimiento anterior por los inventores del presente documento de la neurturina, tal como se expone en la publicación de patente europea EP0787142. Por tanto, los experimentos que condujeron al descubrimiento de la neurturina son relevantes para el descubrimiento actual de la persefina y para la forma humana prevista de la persefina así como para la actividad biológica de la persefina.

La neurturina se identificó y aisló por los inventores del presente documento a partir de un medio condicionado para células CHO. Se identificó la actividad de estimulación de la supervivencia neuronal inicial por los inventores en una preparación parcialmente purificada de este medio condicionado para CHO. La preparación de un medio condicionado para una línea celular dada se conoce bien en la técnica (por ejemplo, véase Reid, en Methods in Enzymology Vol. LVIII, Cell Culture, Jakoby y Pastan, Eds., Academic Press, San Diego, págs. 161-164, 1979; Freshney, Culture of Animal Cells en A manual of Basic Technique, 2d Ed., Wiley-Liss, NY, pág. 84, 1987). Por tanto, aunque en el presente trabajo se cultivaron células CHO y se utilizó el medio condicionado para identificar y obtener neurturina en forma pura, un experto en la técnica apreciará rápidamente que puede utilizarse como fuente cualquier célula que exprese neurturina. Algunas de las células que expresan neurturina se identifican más adelante en el ejemplo 9 y los inventores del presente documento creen que puede utilizarse cualquiera de las células identificadas como que expresan neurturina, para obtener el medio de cultivo a partir del cual puede aislarse la neurturina.

En el aislamiento de la neurturina a partir del medio condicionado de células CHO, puede obtenerse un medio condicionadobruto inicial mediante centrifugación y/o filtración para eliminar los restos celulares. Para la purificación adicional, un experto en la técnica apreciará rápidamente que puede utilizarse cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica, para aislar y purificar la neurturina de una muestra biológica, tales como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis preparativa o similares, en la que los métodos se utilizan o bien individualmente o bien en combinación.

El efecto de estimulación de la supervivencia celular de neurturina puede evaluarse en cualquier sistema adecuado para evaluar la supervivencia celular. Los inventores del presente documento creen que la neurturina puede estimular la supervivencia en una variedad de tejidos diferentes basándose en lo que se sabe para otros factores de crecimiento y en la observación de que la neurturina se expresa en varios tejidos en los que se cree que tiene un efecto de estimulación de la supervivencia.

En virtud del grado de identidad de secuencia de la persefina con sus parálogos, neurturina y GDNF y las acciones conocidas de estas sustancias en la estimulación de la supervivencia y el crecimiento de tejidos neuronales y no neuronales, también se cree que la persefina estimulará la supervivencia y el crecimiento de tejidos neuronales así como de una variedad de tejidos no neuronales. En efecto, los inventores del presente documento han identificado los tejidos cerebral, renal y cardiaco como tejidos que expresan persefina, lo que apoya adicionalmente la conclusión de que la persefina puede actuar para promover el crecimiento y la supervivencia en células neuronales y no
neuronales.

En el trabajo notificado en el presente documento, se evaluó la actividad neuronal de la neurturina utilizando un ensayo de supervivencia de neuronas simpáticas (ganglios simpáticos cervicales, SCG) que se ha caracterizado ampliamente (Martin et al, J Cell Biol 106:829-844, 1989; Deckwerth y Johnson, J Cell Biol 123:1207-1222, 1993) (véase la figura 3). También se muestra los efectos de estimulación de la supervivencia de neurturina sobre las neuronas sensitivas (véase la figura 10). En los mismos ensayos de supervivencia de neuronas simpáticas y sensitivas, la persefina mostró poca actividad de potenciación de la supervivencia. Sin embargo, en una preparación de células neuronales del SNC de origen mesencefálico, la persefina mostró actividad de potenciación de la supervivencia neuronal. Esto sugiere que la persefina será aplicable en el tratamiento o la prevención de enfermedades que suponen una degeneración neuronal en el SNC, tales como por ejemplo, la enfermedad de Parkinson.

A modo de ilustración de los métodos utilizados en los ensayos de supervivencia anteriores, el ensayo de SCG supuso el cultivo de células obtenidas a partir de los ganglios cervicales superiores de embrión de rata, durante 5 días a 37ºC en un medio que contenía factor de crecimiento nervioso (NGF). El medio se intercambió entonces por un medio que no contenía NGF y que contenía antisuero anti-NGF. La eliminación de NGF normalmente da como resultado la muerte de las neuronas en 24-72 horas. La supervivencia neuronal se evaluó visualmente bajo un microscopio en los días 7-8. Los criterios de supervivencia neuronal máxima incluían la falta de degeneración tanto de los somas como de los axones de las células neuronales. Se indicó degeneración del soma cuando se redujo el tamaño del soma neuronal, mostró hinchamientos irregulares de la membrana, contenía vacuolas o había perdido refringencia. Se puntuó un campo de axones como que mostraba signos de disgregación cuando aparecieron hinchamientos y ampollas a lo largo de los haces del axón. Se determinó la supervivencia por comparación con neuronas que se hicieron crecer en presencia de NGF (control positivo) o en ausencia de NGF con antisueros contra NGF (control negativo).

Se cuantificó la actividad mediante el cálculo de una "unidad de supervivencia". Las unidades de supervivencia totales en una muestra se definieron como el volumen mínimo de una alícuota de la muestra que producía la supervivencia máxima dividido entre el volumen total de esa muestra. Por ejemplo, se eluyó un volumen de 600 ml de la columna de heparina-agarosa y procedente de este eluato, 12,5 \mul fue el volumen mínimo que estimuló el volumen máximo. Por tanto, las unidades de supervivencia en el eluato procedente de la columna de heparina-agarosa fueron de 48.000. Se calculó la actividad específica como las unidades de supervivencia divididas entre los mg de proteína total. La actividad intrínseca de neurturina se expresa en el presente documento en unidades de concentración de pg/ml o pM que estimulan la supervivencia máxima o la mitad de la máxima. Tal como se muestra en la figura 5, una curva de concentración-respuesta de proteína neurturina purificada indica que la actividad intrínseca de neurturina expresada como una CE_{50} es de aproximadamente 1,5 ng/ml o de aproximadamente 50 pM y como una CE_{100} es de aproximadamente 3 ng/ml o de aproximadamente 100 pM.

Se determinaron las unidades de supervivencia en un ensayo que utilizó aproximadamente 1200 neuronas en un ensayo con 0,5 ml de cultivo y un periodo de cultivo de 48 horas tras la adición de la fracción. Se evaluó la supervivencia visualmente tras las 48 horas. Se determinó la actividad intrínseca, tal como se muestra en la figura 4, en un ensayo que utilizó 2700 neuronas y un periodo de cultivo de 72 horas. Se evaluó la supervivencia fijando las neuronas y contando el número de neuronas supervivientes. Debido a la estabilidad, evaluada mediante la semivida de la actividad, para disminuciones de neurturina según aumenta el número de neuronas, se esperaba que la medición de la actividad intrínseca fuese inferior que la prevista mediante las determinaciones de la actividad específica. También se esperaba que la medición de la actividad específica fuese inferior que la prevista mediante la actividad específica ya que la supervivencia se midió después de 72 horas en vez de 48 horas.

La purificación de la neurturina se describe en detalle en el ejemplo 1 de más adelante. El material de partida del medio condicionado se preparó a partir de un derivado de células de ovario de hámster chino DG44, DG44CHO-pHSP-NGFI-B (Day et al, J Biol Chem 265:15253-15260, 1990). Los inventores del presente documento también han aislado neurturina en forma parcialmente purificada a partir del medio condicionado de otros derivados de células de ovario de hámster chino DG44 y podrían utilizarse estas otras células igualmente, además de las células DG44CHO-pHSP-NGFI-B, como podría hacerse con las células de ovario de hámster chino DG44 originales, células de ovario de otras especies y células procedentes de otros tejidos tales como los que se sabe que expresan neurturina (véase el ejemplo 9). Al preparar el medio condicionado, las células se sitúan en un medio sin suero durante 2 días, momento en el que se recoge el medio condicionado y se repone el medio. Este ciclo se repitió para producir 5 recogidas de medio condicionado a partir de cada lote de células CHO. Los medios recogidos se centrifugaron para eliminar los restos celulares.

La primera etapa en la purificación de la neurturina procedente del medio condicionado de células CHO supuso la introducción del medio condicionado en una columna de heparina-agarosa y la elución de la misma de la neurturina parcialmente purificada. Esta etapa dio como resultado un aumento de 111 veces en la actividad específica y la purificación de la proteína. El tampón utilizado para aplicar el medio a la columna contiene NaCl 0,5 M. A esta concentración de NaCl, la neurturina se une a la matriz de heparina-agarosa. Los inventores del presente documento creen que basándose en sus puntos isoeléctricos, LIF y CNTF o bien no se unirían a la matriz de heparina-agarosa o bien no se eliminarían de la matriz con el tampón que contiene NaCl 0,5 M. Por tanto, se esperaba que esta etapa aislase la neurturina de factores de crecimiento tales como LIF y CTNF. Tras el lavado de la columna, la neurturina se eluyó de la columna utilizando NaCl 1,0 M.

Para la purificación adicional, el material eluido se diluyó luego y se introdujo en una columna que contenía resina de intercambio iónico de alta resolución SP SEPHAROSE® (Pharmacia, Piscataway, NJ). El material eluido de esta columna se purificó adicionalmente utilizando una cromatografía líquida para la separación rápida de proteínas (FPLC) en una columna Chelating Superose HR 10/2 cargada con Cu^{++} (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las fracciones eluidas de la columna de Cu^{++}-Superose se introdujeron en una columna de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), para una purificación adicional por FPLC. Se analizó la composición de las proteínas en las fracciones de Mono S utilizando una SDS-PAGE no reductora y tinción de plata.

Las fracciones recogidas de las columnas en cada fase de la purificación se sometieron a ensayo para determinar la actividad biológica, utilizando el ensayo de supervivencia neuronal, y para determinar el contenido de proteína, utilizando el método de unión de colorante de Bradford (Anal Biochem 72:248-254, 1976) con un reactivo colorante del ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). La purificación progresiva utilizando las etapas anteriores se muestra en la tabla 1.

TABLA 1

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 a. \+  \begin{minipage}[t]{140mm} Se determinaron los mg de
proteína utilizando el método de unión de colorante de Bradford
( Anal Biochem 72 :248, 1976).\end{minipage} \cr  b. \+
 \begin{minipage}[t]{140mm}  Se definieron las unidades de
actividad total o unidades de supervivencia como el volumen mínimo
de una alícuota de la muestra que producía la supervivencia máxima
dividido entre el volumen total de esa
muestra.\end{minipage} \cr  c. \+
 \begin{minipage}[t]{140mm}  La actividad para el medio
condicionado se obtuvo a partir de la suposición de que se recuperó
el 100% de la actividad en la fracción de
heparina-agarosa porque la actividad del medio era
demasiado baja para someterse a ensayo
directamente.\end{minipage} \cr  d. \+ La actividad específica
eran las unidades de actividad divididas entre los mg de proteína
total.\cr}

Los resultados de este análisis junto con los resultados del ensayo de supervivencia neuronal de las fracciones revelaron que se copurificó una proteína que tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 25 kD, con la actividad de supervivencia de las neuronas simpáticas.

El material purificado aislado del medio condicionado de células CHO se utilizó para determinar las secuencias de aminoácidos parciales de la proteína en el medio condicionado de células CHO y posteriormente como una base para determinar las secuencias en diferentes especies. Se determinó la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal utilizando un secuenciador automático de proteínas / péptidos y se consideró que los primeros 16 aminoácidos eran, con incertidumbre en cuanto a la posición 6, Ser-Gly-Ala-Arg-Pro-Xaa-Gly-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Val-Ser-Val-Ser, donde Xaa era un aminoácido desconocido (SEQ ID NO: 3). Los fragmentos de aminoácidos internos se obtuvieron a partir del material purificado tras digestión con enzimas proteasas y se determinaron las secuencias. Así los tres segmentos internos obtenidos fueron (1) con incertidumbre en cuanto a las posiciones 1, 2 y 6, Xaa_{1}-Cys-Ala-Gly-Ala-Xaa_{2}-Glu-Ala-Ala-Val, donde Xaa_{1} era un aminoácido desconocido, Xaa_{2} era Ser o Cys (SEQ ID NO: 4); (2) con incertidumbre en cuanto a las posiciones 1, 2, 4, 10, 17 y 22, Xaa_{1}-Xaa_{2}-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa_{3}-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val, donde Xaa_{1} y Xaa_{2} eran desconocidos, Xaa_{3} era Gln o Glu (SEQ ID NO: 5) y (3) Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg (SEQ ID NO: 6). Basándose en estas secuencias parciales de aminoácidos, pueden prepararse sondas y cebadores de ADN y utilizarse para obtener clones de ADNc de diferentes especies basado en la alta conservación de la secuencia entre las especies de mamíferos. El ADNc humano y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la figura 7 y el ADNc de ratón y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la figura 8.

El clon de ADNc del ratón era de 1,0 kb, teniendo un marco de lectura abierto de 585 nucleótidos (SEQ ID NO: 12) que codificaba para la proteína pre-pro-neurturina (SEQ ID NO: 8, figura 8). Además, se han identificado regiones no codificantes en ambos extremos 5' y 3' de la región codificante, tal como se muestra en la figura 9. (SEQ ID NO: 13, región no codificante en 5', ácidos nucleicos -348 a -1; SEQ ID NO: 14, región no codificante en 3', ácidos nucleicos 589 a 675). La secuencia de neurturina de ratón puede utilizarse para obtener cebadores de PCR para su uso en la identificación de homólogos de otras especies. Se amplificó un fragmento humano de 192 nucleótidos procedente de ADN genómico humano mediante este método y se utilizó después para rastrear una biblioteca genómica humana, para obtener clones que contienen el locus genómico de la neurturina humana. La secuencia de ADNc humano se dedujo a partir de la secuenciación de estos clones. (Figura 7, secuencia de ADNc de pre-pro-neurturina humana).

Se pretende que se interprete que la referencia que se hace en el presente documento a persefina o neurturina incluye factores de crecimiento de cualquier origen, que sean sustancialmente homólogos y que sean biológicamente equivalentes, respectivamente, a la persefina caracterizada y descrita en el presente documento o a la neurturina caracterizada y descrita en el presente documento. Tales factores de crecimiento sustancialmente homólogos pueden ser nativos para cualquier tejido o especie y, de manera similar, la actividad biológica puede caracterizarse en cualquiera de varios sistemas de ensayo biológico. Se pretende que se interprete que la referencia que se hace en el presente documento a pre-pro-neurturina incluye factores de crecimiento pre-pro que contienen una región de secuencia pre o líder o señal, una región de secuencia pro y neurturina, tal como se define en el presente documento.

Se pretende que los términos "biológicamente equivalente" signifiquen que las composiciones de la presente invención puedan demostrar algunas o todas de las mismas propiedades de crecimiento de una manera similar, no necesariamente en el mismo grado, que la neurturina aislada a partir del medio condicionado de células CHO del presente documento o neurturina o persefina, humanas o de ratón o de rata, producidas de manera recombinante, según sea el caso.

Por "sustancialmente homólogo" se quiere decir que el grado de identidad de secuencia de los ortólogos de neurturina, incluyendo la neurturina humana y de ratón así como la neurturina procedente de otras especies, o el grado de identidad de secuencia de los ortólogos de persefina, incluyendo la persefina humana, de ratón y rata así como la persefina procedente de otras especies, es mayor que el que hay entre parálogos tales como persefina y neurturina o persefina y GDNF, y superior que el notificado anteriormente para los miembros de la superfamilia de TGF-\beta (para ver la discusión sobre la homología de los miembros de la superfamilia de TGF-\beta, véase Kingsley, Genes and Dev 8:133-46, 1994).

Se pretende que la identidad de secuencia o la identidad en porcentaje signifiquen el porcentaje de los residuos iguales entre dos secuencias. La secuencia de referencia es persefina de ratón cuando se determina la identidad en porcentaje con GDNF de ratón y neurturina de ratón y persefina de rata cuando se determina la identidad en porcentaje con GDNF de rata y neurturina de rata. Se hace referencia a la neurturina humana cuando se determina la identidad en porcentaje con neurturina no humana, a neurturina humana cuando se determina la identidad en porcentaje con factores de crecimiento que no son neurturina y a GDNF humano cuando se determina la identidad en porcentaje de factores de crecimiento que no son neurturina con GDNF. En todas las comparaciones anteriores, se alinean las dos secuencias que se están comparando utilizando el método Clustal (Higgins et al, Cabios 8:189-191, 1992) de alineación de múltiples secuencias en el software de bioinformática Lasergene (DNASTAR, INC, Madison, WI). En este método, se llevan a cabo múltiples alineaciones de manera progresiva, en las que se ensamblan grupos de alineación cada vez mayores utilizando puntuaciones de similitud calculadas a partir de una serie de alineaciones por parejas. Las alineaciones de secuencias óptimas se obtienen hallando la máxima puntuación de alineación, que es la media de todas las puntuaciones entre los residuos separados en la alineación, determinados a partir de una tabla de pesos de los residuos que representa la probabilidad de que se produzca un cambio de un aminoácido dado en dos proteínas relacionadas en un intervalo evolutivo dado. Las penalizaciones por abrir o alargar los huecos en la alineación contribuyen a la puntuación. Los parámetros por defecto utilizados con este programa son los siguientes: penalización por hueco para una alineación múltiple = 10; penalización por longitud del hueco para una alineación múltiple = 10; valor k-tuple en la alineación por parejas = 1; penalización por hueco en la alineación por parejas = 3; valor de ventana en la alineación por parejas = 5; diagonales guardadas en la alineación por parejas = 5. La tabla de pesos de los residuos utilizada por el programa de alineación es PAM250 (Dayhoff et al., en Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Ed., NBRF, Washington, Vol. 5, supl. 3, pág. 345, 1978):

Se calcula la conservación en porcentaje a partir de la alineación anterior sumando el porcentaje de residuos idénticos al porcentaje de posiciones en las que los dos residuos representan una sustitución conservativa (definido como que tiene un valor logit ("log-odds", logaritmo de las posibilidades) superior o igual a 0,3 en la tabla de pesos de los residuos PAM250). La conservación se refiere a la persefina de ratón cuando se determina la conservación en porcentaje con persefina de otras especies o con factores de crecimiento que no son persefina; se refiere a neurturina humana cuando se determina la conservación en porcentaje con neurturina no humana o con factores de crecimiento que no son neurturina y se refiere a GDNF humano cuando se determina la conservación en porcentaje con respecto a factores de crecimiento que no son persefina, que no son neurturina, con GDNF. Los cambios de aminoácidos conservativos que satisfacen este requisito son: R-K; E-D, Y-F; L-M; V-I, Q-H.

La tabla 2 muestra los cálculos de identidad (I) y conservación (C) para comparaciones de persefina y neurturina y GDNF de diversas especies. Las comparaciones se hicieron entre persefina de ratón desde la primera cisteína de estructura canónica hasta el extremo (SEQ ID NO: 89) y persefina de rata desde la primera cisteína de estructura canónica hasta el extremo (SEQ ID NO: 83); entre persefina de ratón y GDNF de ratón desde la primera cisteína hasta el extremo (mGDNF/extremo C; SEQ ID NO: 87) o neurturina de ratón desde la primera cisteína hasta el extremo (mNTN/extremo C; SEQ ID NO: 88); y entre persefina de rata y GDNF de rata desde la primera cisteína hasta el extremo (rGDNF/extremo C). Las comparaciones con neurturina fueron entre neurturina humana madura y de ratón madura (hNTN y mNTN, respectivamente) y entre cada una de éstas y GDNF humano, de rata y de ratón maduros (hGDNF, rGDNF y mGDNF, respectivamente), tal como se muestra en la tabla.

TABLA 2

2

El grado de homología entre la persefina de ratón y la persefina de rata es de aproximadamente el 96% y se cree que el grado de homología entre la persefina de ratón o de rata y la persefina humana es de una identidad de al menos el 85%, basado en una comparación similar con neurturina. Las comparaciones con neurturina mostradas en la tabla 2 indican que las proteínas neurturina humana y de ratón maduras tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 90%. Además, se cree que todos los homólogos de la persefina y la neurturina de especies de mamíferos no humanos tienen de manera similar una identidad de secuencia de al menos el 85% con la persefina y neurturina humanas, respectivamente. Para especies que no son mamíferos, tales como las especies de aves, se cree que el grado de homología con persefina o neurturina es una identidad de al menos el 65% con persefina o neurturina humanas, respectivamente. A modo de comparación, pueden observarse las variaciones entre los miembros de una familia, de la familia neurturina-persefina-GDNF de factores de crecimiento mediante la comparación de persefina y GDNF o de neurturina y GDNF. Las persefina de ratón y la de rata tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 35 al 40% con GDNF de ratón y de rata, respectivamente. De manera similar, la neurturina humana y la de ratón tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 40% y una conservación de secuencia de aproximadamente el 50% con GDNF humano, de ratón y de rata. Se cree que los diferentes miembros de la familia también tienen una identidad de secuencia similar de aproximadamente el 40% de la de neurturina, el 40% de la de persefina y aproximadamente el 40% de la de GDNF y dentro de un intervalo de identidad de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 85% con neurturina, dentro de un intervalo de identidad de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 85% con persefina y dentro de un intervalo de identidad de secuencia de aproximadamente el 30% a aproximadamente el 85% con GDNF. Por tanto, se esperaría que un miembro dado de la familia de GDNF-neurturina-persefina tuviera una identidad de secuencia inferior con cualquier otro miembro de la familia de la misma especie que esté presente en ortólogos de ese miembro de la familia en otras especies ya que GDNF humano y neurturina humana están relacionados más estrechamente con GDNF de ratón y neurturina de ratón, respectivamente, que entre sí o con GDNF y se esperaría que un miembro dado de la familia tuviera una identidad de secuencia superior con otro miembro de la familia que con cualquier otro miembro conocido de la superfamilia de TGF-\beta (Kingsley, citado anteriormente).

En el caso de la pre-pro-neurturina, pueden identificarse los homólogos de pre-pro-neurturina en especies de mamíferos no humanos en virtud de la parte de neurturina de la secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% con la neurturina humana y pueden identificarse los homólogos de pre-pro-neurturina en especies que no son mamíferos en virtud de la parte de neurturina de la secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de secuencia de al menos el 65% con la neurturina humana. De manera similar, se cree que las proteínas de pre-pro-persefina de mamífero, incluyendo el ortólogo humano, tendrán una identidad de secuencia de al menos el 85% en la parte de persefina madura de la molécula y que las proteínas de pre-pro-persefina que no es de mamífero tendrán una identidad de secuencia de al menos el 65% con la pre-pro-persefina humana.

La persefina o la neurturina, tal como se utilizan los términos en el presente documento, pueden incluir también formas híbridas o modificadas de persefina o neurturina, respectivamente, incluyendo proteínas de fusión y fragmentos de persefina o neurturina y formas híbridas y modificadas en las que se han eliminado o sustituido ciertos aminoácidos, y modificaciones tales como en las que se han cambiado uno o más aminoácidos por un aminoácido modificado o aminoácido poco frecuente y modificaciones tales como glucosilaciones, siempre que la forma híbrida o modificada mantenga la actividad biológica de la persefina o neurturina. Por mantener la actividad biológica, se entiende que se estimula la supervivencia neuronal, aunque no necesariamente al mismo nivel de potencia que el de la neurturina aislada del medio condicionado de células CHO o el de la neurturina humana o de ratón o persefina humana o de ratón o de rata, producidas de manera recombinante.

También se incluye dentro del significado de sustancialmente homólogo cualquier persefina o neurturina que pueda aislarse en virtud de su reactividad cruzada con anticuerpos contra la persefina o neurturina, respectivamente, tal como se describe en el presente documento, o cuyas secuencias de nucleótidos codificantes que incluyen ADN genómico, ARNm o ADNc pueden aislarse mediante hibridación con la secuencia complementaria de las secuencias de nucleótidos genómicas o subgenómicas o ADNc de la persefina o neurturina, respectivamente, tal como se describe en el presente documento o fragmentos de las mismas. También apreciará un experto en la técnica que secuencias de ADN degeneradas también puede codificar para la neurturina humana o persefina humana y se pretende que éstas también se incluyan dentro de la presente invención como variantes alélicas de neurturina o persefina, respectivamente.

En el caso de pre-pro-neurturina, pueden existir alternativamente productos de corte y empalme de proteínas que resultan de un intrón localizado en la secuencia codificante de la región pro. Se cree que el intrón existe en la secuencia genómica en una posición correspondiente a la de entre los ácidos nucleicos 169 y 170 del ADNc que, a su vez, corresponde a una posición en el aminoácido 57 en las secuencias de pre-pro-neurturina de ratón y humana (véanse las figuras 7 y 8). Por tanto, el corte y empalme alternativo en esta posición podría producir una secuencia que difiere de la identificada en el presente documento para pre-pro-neurturina humana y de ratón (SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente) en el sitio de aminoácido identificado mediante adición y/o deleción de uno o más aminoácidos. Se pretende que todas y cada una de las proteínas de pre-pro-neurturina de corte y empalme alternativo estén incluidas dentro del término pre-pro-neurturina, tal como se utiliza en el presente documento.

Aunque los inventores del presente documento no pretenden restringirse a ninguna teoría, se cree que las proteínas humanas y de ratón identificadas en el presente documento, así como los homólogos de otros tejidos y especies, pueden existir como dímeros en su forma biológicamente activa de manera coherente con lo que se sabe para otros factores de la superfamilia de TGF-\beta.

Además de los homodímeros, las unidades monoméricas de los dímeros de neurturina o persefina pueden utilizarse para construir heterodímeros o heteromultímeros estables de factores de crecimiento que comprenden al menos una unidad monomérica derivada de persefina o al menos una unidad monomérica derivada de neurturina. Esto puede realizarse disociando un homodímero de neurturina o un homodímero de persefina en sus unidades monoméricas componentes y reasociándolas en presencia de una unidad monomérica de un segundo o posterior factor de crecimiento homodimérico. Este segundo o posterior factor de crecimiento homodimérico puede seleccionarse de una variedad de factores de crecimiento incluyendo neurturina, persefina, GDNF, un miembro de la familia de NGF tal como NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5, un miembro de la superfamilia de TGF-\beta, un factor de crecimiento endotelial vascular, un miembro de la familia CNTF/LIF y similares.

Se cree que los factores de crecimiento actúan en receptores específicos. Por ejemplo, se han identificado los receptores para TGF-\beta y las activinas y componen una familia de proteínas transmembrana Ser/Thr cinasas (Kingsley, Genes and Dev 8:133-46, 1994; Bexk et al Nature 373:339-341, 1995). En la familia de NGF, NGF se une al receptor TrkA en las neuronas simpáticas y sensitivas periféricas y en las neuronas del prosencéfalo basal; BDNF y NT-4/% se unen a los receptores trkB; y NT-3 se une principalmente a los receptores trkC que tienen una distribución diferenciada dentro del SNC (Tuszynski et al. Ann Neurol 35:S9-S12, 1994). Los inventores del presente documento creen que persefina, neurturina, GDNF y los miembros todavía desconocidos de esta familia de factores de crecimiento actúan a través de receptores específicos que tienen distribuciones diferenciadas, tal como se ha demostrado para otras familias de factores de crecimiento. Pueden ser receptores separados o también es posible que los miembros de la familia de GDNF-neurturina-persefina puedan actuar sobre el mismo receptor, como en el caso de BDNF y NT-4/5 que actúan sobre el receptor trkB. No obstante, formando heterodímeros o heteromultímeros de persefina o neurturina y uno o más de otros factores de crecimiento, se esperaría que el factor de crecimiento resultante fuese capaz de unirse a al menos dos tipos de receptor distintos, teniendo preferentemente una distribución tisular distinta. Se esperaría que los heterodímeros o heteromultímeros resultantes mostraran una gama ampliada de células sobre las que podrían actuar o proporcionar mayor potencia. También es posible que el heterodímero o heteromultímero pudiera proporcionar efectos sinérgicos no observados con homodímeros u homomultímeros. Por ejemplo, la combinación de factores de diferentes clases ha demostrado que estimula la supervivencia a largo plazo de los oligodendrocitos, mientras que los factores individuales o combinaciones de factores dentro de la misma clase estimuló la supervivencia a corto plazo (Barres et al., Development 118:283-295, 1993).

Los heterodímeros pueden formarse mediante varios métodos. Por ejemplo, pueden mezclarse homodímeros y someterse a condiciones en las que se produce la disociación / desplegamiento, tal como en presencia de un agente de disociación / desplegamiento, seguido por exposición a condiciones que permiten la reasociación de los monómeros y la formación de los heterodímeros. Los agentes de disociación / desplegamiento incluyen cualquier agente que se sepa que estimula la disociación de las proteínas. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, clorhidrato de guanidina, urea, tiocianato de potasio, agentes de disminución del pH tales como disoluciones tamponadas de HCl, y disolventes polares, miscibles con agua tales como acetonitrilo o alcoholes tales como propanol o isopropanol. Además, para los homodímeros unidos covalentemente mediante enlaces disulfuro, como es el caso de los miembros de la familia de TGF-\beta, pueden utilizarse agentes reductores tales como ditiotreitol y \beta-mercaptoetanol para la disociación /
desplegamiento y para la reasociación / replegamiento.

Los heterodímeros también pueden prepararse transfectando una célula con uno o más factores de tal manera que la célula transformada produzca heterodímeros, tal como se ha hecho con las neurotrofinas. (Heymach y Scooter, J Biol Chem 270:12297-12304, 1995).

Otro método de formación de heterodímeros es mediante la combinación de homodímeros de persefina o neurturina y un homodímero de un segundo factor de crecimiento e incubando la mezcla a 37ºC.

Cuando se producen los heterodímeros a partir de homodímeros, los heterodímeros pueden separarse entonces de los homodímeros utilizando los métodos disponibles para los expertos en la técnica, tales como por ejemplo, mediante elución de geles de poliacrilamida no desnaturalizantes, preparativos. Alternativamente, los heterodímeros pueden purificarse utilizando cromatografía de intercambio catiónico de alta resolución tal como con una columna de intercambio catiónico Mono S o mediante columnas de inmunoafinidad consecutivas.

Se conoce bien en la técnica que muchas proteínas se sintetizan dentro de una célula con una secuencia señal en el extremo N-terminal de la secuencia de la proteína madura y la proteína que porta tal secuencia líder se denomina como preproteína. La parte pre de la proteína se escinde durante el procesamiento celular de la proteína. Además de una secuencia líder pre, muchas proteínas contienen una secuencia pro diferenciada que describe una región en una proteína que es un precursor estable de la proteína madura. Las proteínas sintetizadas con ambas regiones pre y pro se denominan como preproproteínas. En vista de los acontecimientos de procesamiento que se sabe que se producen con otros miembros de la familia de TGF-\beta, así como las secuencias determinadas en el presente documento, los inventores creen que las formas de la proteína persefina o neurturina tal como se sintetizan dentro de una célula es la pre-pro-persefina o pre-pro-neurturina. En caso de la neurturina, se cree que la pre-pro-neurturina contiene una secuencia señal de 19 aminoácidos en el extremo N-terminal (secuencia señal pre humana, SEQ ID NO: 15, figura 7, aminoácidos 1 al 19, codificada por SEQ ID NO: 17, figura 7, ácidos nucleicos 1 al 57; secuencia señal pre de ratón, SEQ ID NO: 16, figura 8, aminoácidos 1 al 19, codificada por SEQ ID NO: 18, figura 8, aminoácidos 1 al 57). Se sabe que no se requiere necesariamente la longitud completa de una secuencia líder para actuar como secuencia señal y, por tanto, dentro de la definición de región pre de neurturina se incluyen fragmentos de la misma, normalmente fragmentos del extremo N-terminal, que mantienen la propiedad de poder actuar como secuencia señal, es decir, facilitar la inserción cotraduccional en las membranas de uno o más orgánulos celulares tales como retículo endoplasmático, mitocondria, aparato de Golgi, membrana plasmática y similares.

La secuencia señal de neurturina va seguida por un dominio pro que contiene un sitio de procesamiento proteolítico RXXR inmediatamente antes de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal para la neurturina madura (secuencia de la región pro humana, SEQ ID NO: 19, figura 7, aminoácidos 20 a 95, codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 20, figura 7, ácidos nucleicos 58 a 285; secuencia de la región pro de ratón, SEQ ID NO: 22, figura 8, aminoácidos 19 a 95 codificada por la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 21, figura 8, ácidos nucleicos 58 a 285).

Las regiones pre y pro de neurturina juntas comprenden una secuencia pre-pro identificada como la secuencia pre-pro humana (SEQ ID NO: 23, figura 7, aminoácidos 1 a 95, codificada por la SEQ ID NO: 25, ácidos nucleicos 1 a 285) y la secuencia pre-pro de ratón (SEQ ID NO: 24, figura 8, aminoácidos 1 a 95, codificada por la SEQ ID NO: 26, ácidos nucleicos 1 a 285). Las secuencias de la región pre y la región pro, así como las secuencias de la región pre-pro, pueden identificarse y obtenerse para especies de mamíferos no humanos y para especies que no son mamíferos, en virtud de las secuencias que están contenidas dentro de la pre-pro-neurturina, tal como se define en el presente documento. Se cree que la persefina se asocia de manera similar con regiones pre y pro para constituir una secuencia de pre-pro-persefina.

Utilizando los puntos de referencia anteriores, se pronostica que la molécula de neurturina secretada, madura, será de aproximadamente 11,5 kD, que es probable que forme un homodímero unido por disulfuros de aproximadamente 23 kD, por analogía con otros miembros de la familia de TGF-\beta. La proteína prevista de aproximadamente 23 kD coincide con la proteína neurturina de 25 kD purificada procedente de los medios condicionados de células CHO, que es un homodímero. Los inventores del presente documento han detectado una proteína neurturina de aproximadamente 11,5 kD procedente del medio condicionado de células de hámster chino transfectadas con el vector de expresión de neurturina (pCMV-NTN-3-1) utilizando SDS-PAGE en condiciones reductoras y se cree que esta proteína es el monómero.

Tal como se trató anteriormente, una molécula de persefina madura prevista basándose en la homología con neurturina contendría 5 aminoácidos en el sentido de 5' desde la primera cisteína de estructura canónica, teniendo así 96 aminoácidos y un peso molecular pronosticado de 10,4 kD. Una molécula de persefina madura, basándose en la homología con GDNF, contendría 43 aminoácidos en el sentido de 5' desde la primera cisteína de estructura canónica, teniendo así 134 aminoácidos y un peso molecular pronosticado de 14,5 kD.

Las secuencias de nucleótidos de las regiones pre y/o pro de neurturina o regiones similares que se cree que se asocian con ADN para persefina, pueden utilizarse para construir genes quiméricos con las secuencias codificantes de otros factores de crecimiento y, de manera similar, pueden construirse genes quiméricos a partir de la secuencia codificante de neurturina acoplada a las secuencias que codifican para las regiones pre y/o pro de genes para otros factores de crecimiento o proteínas. (Booth et al., Gene 146:303-8, 1994; Ibanez, Gene 146:303-8, 1994; Storici et al., FEBS Letters 337:303-7, 1994; Sha et al J Cell Biol 114:827-839, 1991). Tales proteínas quiméricas pueden mostrar una producción o expresión alterada de las especies proteicas activas.

Se ha identificado y aislado en forma purificada una neurturina preferida a partir del medio condicionado por células CHO. También se prefiere la neurturina preparada mediante la tecnología de ADN recombinante. De manera similar, se prepara una persefina preferida según la presente invención mediante la tecnología de ADN recombinante.

Por "forma pura" o "forma purificada" o "forma sustancialmente purificada" se entiende que una composición de persefina o neurturina está sustancialmente libre de otras proteínas que no sean persefina o neurturina, respectivamente.

Puede prepararse persefina o neurturina recombinantes expresando las secuencias de ADN que codifican para persefina o neurturina, respectivamente, en una célula huésped transformada adecuada. Utilizando métodos bien conocidos en la técnica, el ADN que codifica para persefina o neurturina puede unirse a un vector de expresión, transformarse en una célula huésped y establecerse las condiciones que sean adecuadas para la expresión de persefina o neurturina, respectivamente, por la célula transformada.

Puede emplearse cualquier vector de expresión adecuado para producir persefina humana recombinante o neurturina humana recombinante, tal como por ejemplo, el vector de expresión de mamíferos pCB6 (Brewer, Meth Cell Biol 43:233-245, 1994) o los vectores de expresión pET de E. coli, específicamente, pET-30a (Studier et al., Methods Enzymol 185:60-89, 1990) los cuales se utilizaron ambos en el presente documento. Se conocen en la técnica otros vectores de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos y bacterianas, como son los vectores de expresión para su uso en células de levaduras o insectos. También pueden emplearse los sistemas de expresión de baculovirus.

La persefina o neurturina pueden expresarse en las unidades monoméricas o puede producirse tal forma monomérica mediante su preparación en condiciones reductoras. En tales casos, pueden conseguirse el replegamiento y la renaturalización utilizando uno de los agentes indicados anteriormente que se sabe que estimulan la disociación /
asociación de las proteínas. Por ejemplo, la forma monomérica puede incubarse con ditiotreitol seguido por incubación con la sal disódica del glutatión oxidado, seguido por incubación con un tampón que contenga un agente de replegamiento tal como la urea.

En el caso de la neurturina, por analogía con la secuencia del extremo N-terminal y los segmentos internos de la neurturina purificada a partir del medio condicionado de células CHO, se dedujo la secuencia madura de ratón y a partir de ésta se pronosticó la forma humana madura utilizando la secuencia del gen humano. La secuencia de aminoácidos de la forma humana madura es tal como se muestra en a figura 5 (hNTN, SEQ ID NO: 1). El material purificado a partir del medio condicionado de células CHO se considera que es la neurturina madura y puede existir como un dímero u otro multímero y puede glucosilarse o modificarse químicamente de otras maneras.

La persefina, como la neurturina, puede existir también como un dímero u otro multímero y puede glucosilarse o modificarse químicamente de otras maneras.

Tal como se indicó anteriormente, las secuencias de ácidos nucleicos de ratón y humana sugieren que la neurturina se traduce inicialmente como un pre-pro-polipéptido y que el procesamiento proteolítico de la secuencia señal y la parte "pro" de esta molécula da como resultado la secuencia madura, denominada en el presente documento como "neurturina madura", como se obtiene del medio condicionado por células CHO y como existe en las especies humana y no humanas en forma homóloga. Por tanto, la neurturina incluye todas o cada una de las secuencias de "neurturina madura" de las especies humana y no humanas y todos o cada uno de los polipéptidos de pre-pro-neurturina que pueden traducirse a partir del gen de la neurturina.

Como con la neurturina, la persefina en la presente invención también incluye todas o cada una de las secuencias de persefina madura de las especies humana y no humanas y todos o cada uno de los polipéptidos de pre-pro-persefina que pueden traducirse a partir del gen de la persefina.

Se cree que la secuencia codificante para el polipéptido de pre-pro-neurturina comienza en el primer codón ATG que codifica para metionina en el extremo 5' del clon (posición 1 en la figura 9), que se sitúa en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica para las secuencias de aminoácidos obtenidas a partir de la neurturina purificada. En el sentido 3' desde el primer codón se encuentra el mayor marco de lectura abierto que contiene la secuencia codificante para las regiones pre y pro seguida por la secuencia codificante para la neurturina madura de ratón.

El análisis de la secuencia de los clones genómicos de neurturina murina identificó un intrón de 0,5 kb situado entre los nucleótidos 169 y 170 de la pre-pro-neurturina procedente de los clones de ADNc. Este intrón se localiza en la secuencia codificante de la región pro de la proteína pre-pro-neurturina. Así, se cree que el gen de la neurturina de ratón contiene al menos dos exones, uno de los cuales contiene las secuencias codificantes en el sentido de 5' del sitio de corte y empalme y el otro contiene la secuencia codificante en el sentido de 3' (figura 8, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30). Se sabe que el gen para GDNF contiene un intrón situado en una posición análoga y se ha detectado una forma de GDNF con corte y empalme alternativo mediante experimentos de RT-PCR (Suter-Crazzolara y Unsicker, Neuroreport 5: 2486-2488, 1994). Esta forma alternativa resulta del uso de un sitio de corte y empalme en el segundo exón codificante situado a 78 pb en 3' con respecto al sitio de corte y empalme original notificado. La forma de corte y empalme alternativo codifica para una proteína GDNF con un deleción de 26 aminoácidos con respecto a la forma notificada originalmente. Las dos formas se expresan en diferentes proporciones, en diferentes tejidos. No se han detectado formas de corte y empalme alternativo de neurturina en los experimentos de RT-PCR y RACE, utilizando ADNc de hígado de P1 y de cerebro de P1 de ratón. Sin embargo, existe la posibilidad de que puedan utilizarse sitios alternativos de corte y empalme en el gen de la neurturina en diferentes tejidos.

La secuencia codificante del ADNc para neurturina humana se ha deducido a partir de la secuencia de los clones genómicos de la neurturina humana. La secuencia codificante del ADNc humano, como la del ADNc de ratón, está interrumpida por un intrón entre los nucleótidos 169 y 170 de la secuencia codificante. Por tanto, se cree que el gen de la neurturina humana contiene al menos dos exones, uno de los cuales contiene la secuencia codificantes en el sentido de 5' del sitio de corte y empalme y el otro contiene la secuencia codificante en el sentido de 3' (figura 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 328). Se han conservado los sitios de corte y empalme en las uniones intrón-exón de los genes humano y de ratón.

A partir de la secuencia de aminoácidos deducida de la neurturina humana, la primera secuencia del extremo N-terminal prevista se encuentra entre la posiciones 286 y 339 y las secuencias internas previstas se encuentran entre las posiciones 385 y 417, posiciones 474 y 533, posiciones 547 y 576. El codón de terminación TGA en las posiciones 592-594 termina el marco de lectura abierto.

La longitud prevista de la pre-pro-neurturina purificada es de 197 residuos de aminoácidos para la pre-pro-neurturina humana (SEQ ID NO: 7) y de 195 residuos de aminoácidos para la pre-pro-neurturina de ratón (SEQ ID NO: 8). El peso molecular pronosticado de este polipéptido es de 22,2 kD para el de ratón y de 22,4 kD para el humano. La longitud prevista de la neurturina purificada es de 100 residuos de aminoácidos y su peso molecular monomérico pronosticado es de 11,5 kD. No existen sitios de glucosilación de unión a N, sin embargo, se producen posibles sitios de glucosilación de unión a O en los residuos de aminoácidos en las posiciones 18, 26, 80, 86 y 95 en la neurturina humana. La glucosilación en uno cualquiera o una combinación de estos sitios aumentaría el peso molecular de la molécula.

En el caso de la persefina, no existen sitios de glucosilación de unión a N en la región entre la primera y la séptima cisteínas de estructura canónica (SEQ ID NO: 79) ni existen sitios de glucosilación de unión a N en una molécula de persefina madura, prevista basándose en la homología con neurturina (SEQ ID NO: 80). En una molécula de persefina madura, basándose en la homología con GDNF existen dos posibles sitios de glucosilación de unión a N en los 43 aminoácidos en el sentido de 5' desde la primera cisteína de estructura canónica, en las posiciones 31 y 32 en la SEQ ID NO: 81 (correspondiente a las posiciones 39 y 40 en la secuencia mostrada en la figura 11).

Se producen posibles de glucosilación de unión a O en la persefina, en la región entre la primera y la séptima cisteínas de estructura canónica, en las posiciones 5, 7, 19, 31, 38, 41, 62, 63, 68 y 83 en la SEQ ID NO: 79 (figura 12) y en una molécula de persefina madura, prevista basándose en la homología con neurturina SEQ ID NO: 80) existe un posible sitio de glucosilación de unión a O adicional un residuo en el sentido de 5' desde la primera cisteína de estructura canónica (posición 51 en la secuencia mostrada en la figura 11). En una molécula de persefina madura, basándose en la homología con GDNF existen cinco posibles sitios de glucosilación de unión a O en los 43 aminoácidos en el sentido de 5' desde la primera cisteína de estructura canónica, en las posiciones 9, 15, 18, 22 y 43 en la SEQ ID NO: 81 (correspondiente a las posiciones 17, 23, 26, 30 y 51 en la secuencia mostrada en la figura 11) junto con diez posibles sitios de glucosilación de unión a O indicados anteriormente en la región entre las cisteínas de estructura canónica (correspondientes a las posiciones 48, 50, 62, 74, 81, 84, 105, 106, 111 y 126 en la SEQ ID NO: 81 y las posiciones 56, 58, 70, 82, 89, 92, 113, 114, 119 y 134 en la secuencia mostrada en la figura 11).

Pueden estar presentes diferentes sitios de escisión posibles en la secuencia de la pre-pro-neurturina. La secuencia de aminoácidos de la neurturina madura de ratón (figura 5, SEQ ID NO: 2) se pronostica a partir de la alineación con la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la neurturina de hámster chino purificada. Se encuentra un sitio de escisión RRAR de 4 residuos (aminoácidos 92-95) inmediatamente antes de los aminoácidos pronosticados del extremo N-terminal de la neurturina madura de ratón. Esta secuencia RRAR coincide con la secuencia consenso RXXR en la que se escinden normalmente los miembros de la superfamilia de TGF-\beta. Esta supuesta secuencia de escisión RRAR se conserva en la neurturina humana. Sin embargo, se pronostica que la neurturina humana madura tiene una extensión del extremo N-terminal de dos aminoácidos con respecto a la neurturina madura de ratón, cuando se escinde en esta secuencia. Dado que la neurturina contiene otras secuencias que coinciden con la consenso RXXR (por ejemplo, la secuencia RRRR en los aminoácidos 90-93) y no se entienden completamente las especificidades de las proteasas implicadas en esta escisión, existe la posibilidad de que en algunas situaciones la neurturina se escinda en sitios distintos a la secuencia RRAR anterior, y la proteína de neurturina madura puede tener un número variable de aminoácidos precediendo al residuo de cisteína en la posición 101 en la secuencia de ratón (pre-pro-proteína) y la posición 103 en la secuencia humana. Tales sitios de escisión alternativos podrían utilizarse de diferente manera entre diferentes organismos y entre diferentes tejidos del mismo organismo. Los aminoácidos del extremo N-terminal que preceden a la primera de las siete cisteínas conservadas en las formas maduras de los miembros de la familia de TGF-\beta varían enormemente tanto en longitud como en secuencia. Además, la inserción de una secuencia de diez aminoácidos dos residuos en el sentido de 5' desde la primera cisteína conservada no afecta a las actividades biológicas conocidas de un miembro de la familia, la dorsalina (Basler, K., Edlund, T., Jesell, T. M. y Yamada, T., (1993) Cell 73:687-702). Por tanto, sería probable que las proteínas de neurturina que contienen secuencias de diferentes longitudes precediendo a la cisteína 101 en el ratón y la cisteína 103 en el ser humano conservaran su actividad biológica.

También se cree que sería probable que las proteínas de persefina que contienen secuencias de diferentes longitudes precediendo a la primera cisteína (residuo nº 1 de la persefina de ratón en la figura 12 y residuo nº 1 de la persefina de rata en la figura 14) conservaran su actividad biológica.

Los inventores del presente documento creen que la secuencia de neurturina que mostrará actividad biológica contendrá, como mínimo, la secuencia que comienza en la cisteína 103 y termina en la cisteína 196 para la neurturina humana (figura 7, SEQ ID NO: 31) y que comienza en la cisteína 101 y termina en la cisteína 194 para la neurturina de ratón (figura 7, SEQ ID NO: 32). Por tanto, dentro del alcance de los polipéptidos de neurturina se encuentran las secuencias de aminoácidos que contienen la SEQ ID NO: 31 y las secuencias de aminoácidos que contienen la SEQ ID NO: 32, y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para estas secuencias de aminoácidos.

De manera similar, los inventores del presente documento creen que la secuencia de persefina que mostrará actividad biológica contendrá, como mínimo, la secuencia que comienza en la cisteína 1 y termina en la cisteína 87 para la persefina de ratón (figura 12, SEQ ID NO: 79) y que comienza en la cisteína 1 y termina en la cisteína 87 para la persefina de rata (figura 14, SEQ ID NO: 82). Por tanto, dentro del alcance de la persefina de la presente invención se encuentran las secuencias de aminoácidos que contienen la SEQ ID NO: 79 y las secuencias de aminoácidos que contienen la SEQ ID NO: 82, y las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para estas secuencias de aminoácidos.

La presente invención también engloba las secuencias de ácidos nucleicos que incluyen secuencias que codifican para persefina de ratón y rata (figuras 11 y 14) así como persefina humana, de la misma manera que la neurturina incluye secuencias de ácidos nucleicos para neurturina humana y de ratón (figuras 7 y 8). También se incluyen dentro del alcance de esta invención, las secuencias que son sustancialmente iguales que las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para persefina o neurturina, respectivamente. Tales secuencias sustancialmente iguales pueden sustituirse, por ejemplo, por codones que se expresan más rápidamente en una célula huésped dada, tal como E. coli, según procedimientos habituales y bien conocidos. Tales secuencias de ácidos nucleicos modificadas se incluyen dentro del alcance de esta invención.

Pueden modificarse secuencias de ácidos nucleicos específicas por los expertos en la técnica y, por tanto, todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos de la pre-pro-neurturina o persefina, o la región pre o la región pro de neurturina o persefina, pueden igualmente modificarse así. Por tanto, la presente invención también incluye una secuencia de ácido nucleico que se hibridará con todas de tales secuencias de ácidos nucleicos (o complementos de las secuencias de ácidos nucleicos, cuando sea apropiado) y codifican para un polipéptido que tiene actividad de estimulación de la supervivencia o el crecimiento celular. La presente invención también incluye secuencias de ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos que tienen actividad de estimulación de la supervivencia o el crecimiento celular y que son reconocidos por anticuerpos que se unen a neurturina o por anticuerpos que se unen a persefina.

La presente invención también engloba vectores que comprenden elementos reguladores de la expresión, unidos operativamente a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance de la invención. Esta invención también incluye células huésped, de cualquier variedad, que se han transformado con vectores que comprenden elementos reguladores de la expresión, unidos operativamente a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos incluidas dentro del alcance de la invención.

En el presente documento, también se proporcionan métodos para producir neurturina o persefina. La preparación puede ser mediante el aislamiento a partir de un medio condicionado de una variedad de tipos celulares, siempre que el tipo celular produzca neurturina o persefina. Un segundo método preferido supone la utilización de métodos recombinantes, para aislar una secuencia de ácido nucleico que codifica para neurturina o persefina, clonar la secuencia junto con secuencias reguladoras apropiadas en vectores y tipos celulares adecuados y expresar la secuencia para producir neurturina o persefina.

Se ha identificado una familia de genes de mamífero compuesta por cuatro factores neurotróficos, que incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDGF), neurotrofina-3 (NT-3) y neurotrofina-4/5 (NT-4/5). Estos factores comparten una homología de la secuencia del ácido nucleico de aproximadamente el 60% (Tuszynski y Gage, Ann Neurol 35:S9-S12, 1994). La proteína persefina y la proteína neurturina no presentan una homología significativa con la familia de NGF de factores neurotróficos. La persefina o la neurturina comparten una homología inferior a aproximadamente el 20% con la superfamilia de TGF-\beta de factores de crecimiento. Sin embargo, tanto la persefina como la neurturina muestran una identidad de secuencia de aproximadamente el 40% con GDNF y una identidad de secuencia de aproximadamente el 50% entre sí. En particular, las posiciones de los siete residuos de cisteína presentes en persefina, neurturina y GDNF se conservan casi exactamente. Los inventores del presente documento creen que pueden existir otros genes sin identificar que codifiquen para proteínas que tienen una homología de la secuencia de aminoácidos sustancial con persefina, neurturina y GDNF y que funcionan como factores de crecimiento selectivos para los mismos tejidos o diferentes y las mismas actividad biológicas o diferentes, y pueden actuar en los mismos receptores o diferentes. Podría resultar un espectro diferente de actividad con respecto a los tejidos afectados y/o la respuesta provocada de la actividad preferente de receptores diferentes por diferentes miembros de la familia, tal como se sabe que sucede con los miembros de la familia de NGF de factores neurotróficos (Tuszynski y Gage, 1994, citado anteriormente).

Como consecuencia de los miembros de una familia particular de genes que muestran una conservación sustancial de la secuencia de aminoácidos entre los productos proteicos de los miembros de la familia, existe una conservación considerable de las secuencias al nivel del ADN. Esto constituye la base para un nuevo enfoque para identificar otros miembros de la familia de genes a la que pertenecen GDNF, neurturina y persefina. El método utilizado para tal identificación es la hibridación cruzada, utilizando sondas de ácidos nucleicos derivadas de un miembro de la familia, para formar una molécula bicatenaria, híbrida, estable con la secuencia de ácido nucleico de diferentes miembros de la familia de genes o para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos de diferentes miembros de la familia (véase, por ejemplo, Kaisho et al. FEBS Letters 266:187-191, 1990). La secuencia de los diferentes miembros de la familia puede no ser idéntica a la sonda, pero estará, no obstante, suficientemente relacionada con la secuencia de la sonda como para hibridarse con la sonda. Alternativamente, puede utilizarse PCR usando cebadores de un miembro de la familia para identificar miembros adicionales de la familia.

Los enfoques anteriores no han sido satisfactorios hasta ahora en la identificación de otros miembros de la familia de genes, ya que sólo se conocía un miembro de la familia, GDNF. Sin embargo, con la identificación de la neurturina en la publicación de patente europea EP0787142, pueden prepararse nuevas sondas y cebadores únicos que contienen secuencias procedentes de las regiones conservadas de esta familia de genes. Las mismas regiones conservadas se encuentran también en el tercer miembro de la familia, la persefina. En particular, se han identificado tres regiones conservadas en el presente documento que pueden utilizarse como una base para la construcción de nuevas sondas y cebadores. Las nuevas sondas y cebadores puestos a disposición a partir del trabajo con neurturina y persefina hicieron posible este nuevo potente enfoque que puede identificar ahora satisfactoriamente otros miembros de la familia de genes. Utilizando este nuevo enfoque, pueden detectarse genes relacionados con GDNF, neurturina y persefina en la homología de la secuencia, preparando sondas de ADN o ARN basadas en las regiones conservadas en las moléculas de GDNF y neurturina. Por tanto, una realización de la presente invención comprende sondas y cebadores que son únicos para o derivados de una secuencia de nucleótidos que codifica para tales regiones conservadas y un método para identificar miembros adicionales de la familia de genes de neurturina-persefina-GDNF.

Se han identificado en el presente documento secuencias de aminoácidos de regiones conservadas que incluyen Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, donde Xaa_{1} es Ser, Thr o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 108); Glu-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{4}-Gly-Xaa_{5}-Cys, donde Xaa_{1} es Tyr, Glu o Lys, Xaa_{2} es Val, Leu o Ile, Xaa_{3} es Leu o Ile, Xaa_{4} es Ala o Ser y Xaa_{5} es Ala o Ser, (SEQ ID NO: 113); y Cys-Cys-Xaa_{1}-Pro-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Asp-Xaa_{6}-Xaa_{7}-Xaa_{8}-Phe-Leu-Asp-Xaa_{9}, donde Xaa_{1} es Arg o Gln, Xaa_{2} es Thr o Val o Leu Ile, Xaa_{3} es Ala o Ser, Xaa_{4} es Tyr o Phe, Xaa_{5} es Glu, Asp o Ala, Xaa_{6} es Glu, Asp o ningún aminoácido, Xaa_{7} es Val o Leu, Xaa_{8} es Ser o Thr y Xaa_{9} es Asp o Val (SEQ ID NO: 114). Las secuencias de nucleótidos que contienen una secuencia codificante para las secuencias conservadas anteriores o fragmentos de las secuencias conservadas anteriores pueden utilizarse como sondas. Ejemplos de secuencias de sonda y cebador que codifican para las secuencias de aminoácidos y las SEQ ID NOS: 125-129; cebadores cuyas secuencias complementarias inversas codifican para las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 130; y en particular, las secuencias de nucleótidos SEQ ID NOS: 115-124. Cebadores adicionales basados en GDNF y neurturina incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41; cebadores cuyas secuencias complementarias inversas codifican para las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39; y en particular, las secuencias de ácidos nucleicos, SEQ ID NOS: 42-48.

La hibridación que utiliza nuevas sondas procedentes de las regiones conservadas de las secuencias de ácidos nucleicos se realizarán en condiciones de rigurosidad reducida. Se conocen bien en la técnica los factores implicados en la determinación de las condiciones de rigurosidad (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning, 2ª Ed., 1989). Las fuentes de bibliotecas de ADN de especies de mamíferos incluirían bibliotecas de ADN genómico de especies de mamíferos o bibliotecas de ADNc construidas utilizando el ARN obtenido a partir de las células de mamífero clonadas en cualquier vector adecuado.

Los cebadores para PCR se utilizarán en condiciones de PCR de temperatura de hibridación reducida, lo que permitiría la amplificación de las secuencias procedentes de los miembros de la familia de genes distintos a GDNF, neurturina y persefina. Las fuentes de ácido nucleico para la detección incluirían bibliotecas de ADN genómico de especies de mamíferos clonadas en cualquier vector adecuado, ADNc transcrito a partir del ARN obtenido de las células de mamífero y ADN genómico procedente de las especies de mamífero.

Las secuencias de ADN identificadas basándose en ensayos de hibridación o PCR se secuenciarán y compararán con GDNF, neurturina y persefina. Las secuencias de ADN que codifican para la secuencia completa del factor novedoso se obtendrán entonces de la misma manera que se ha descrito en el presente documento. También puede utilizarse ADN genómico o bibliotecas de clones genómicos como moldes, ya que se conservan las estructuras de intrón/exón de GDNF y neurturina, y las secuencias codificantes de las proteínas maduras no están interrumpidas por intrones.

Utilizando este enfoque descrito anteriormente, se han utilizado los cebadores diseñados a partir de las regiones conservadas de neurturina y GDNF para identificar y obtener la secuencia del nuevo miembro de la familia descrito en el presente documento, la persefina. Pueden utilizarse además los cebadores degenerados diseñados a partir de persefina, neurturina y GDNF para identificar y obtener miembros adicionales de la familia.

Se cree que todos los miembros de la familia GDNF-neurturina-persefina tendrán un alto grado de identidad de secuencia con una o más de las regiones consenso de los tres miembros identificados de la familia, en la parte de la secuencia entre la primera y la séptima cisteínas de estructura canónica (véase la figura 12). En particular, se prevé que un nuevo miembro de la familia tendrá una identidad de al menos el 62,5% con el octapéptido de la región consenso Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, donde Xaa_{1} es Ser, Thr o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 108) o una identidad de secuencia de al menos el 62,5% con el octapéptido de la región consenso Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys, donde Xaa_{1} y Xaa_{2} son alanina o serina (SEQ ID NO: 109) o una identidad de secuencia de al menos el 50% con el octapéptido de la región consenso Asp-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Asp-Xaa_{4}, donde Xaa_{1} es ácido aspártico o ácido glutámico o ningún aminoácido, Xaa_{2} es valina o leucina, Xaa_{3} es serina o treonina; y Xaa_{4} es valina o ácido aspártico (SEQ ID NO: 110). Los inventores del presente documento creen que cualquier nuevo miembro de la familia tendrá 28 aminoácido en la secuencia alineada entre los residuos de cisteína de estructura canónica primero y séptimo, tal como se expone en la figura 15, siendo los residuos numerados desde el extremo N-terminal de la secuencia alineada del miembro de la familia (1) Cys, (3) Leu, (10) Val, (13) Leu, (14) Gly, (15) Leu, (16) Gly, (17) Tyr, (21) Glu, (25) Phe, (26) Arg, (27) Tyr, (28) Cys, (30) Gly, (32) Cys, (44) Leu, (47) Leu, (58) Cys, (59) Cys, (61) Pro, (66) Asp, (69) Phe, (70) Leu, (71) Asp, (83) Ser, (84) Ala, (87) Cys y (89) Cys; sin embargo, es posible que puedan existir hasta tres apareamientos erróneos.

Aunque se ha purificado la neurturina basándose en su capacidad para estimular la supervivencia de un tipo neuronal particular, este factor actuará también sobre otros tipos de células neuronales. Por ejemplo, en el presente documento se demuestra que la neurturina estimula la supervivencia de las neuronas sensitivas de los ganglios inferiores del nervio vago (véase el ejemplo 3). También es probable que la neurturina estimule la supervivencia de células que no son neuronales. En efecto, todos los factores de crecimiento aislados hasta la fecha han demostrado actuar sobre muchos tipos celulares diferentes (por ejemplo, véase Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25:1418-1435, 1994). También se sabe que NGF actúa sobre las neuronas simpáticas, varios tipos de neuronas sensitivas y ciertas poblaciones de neuronas del SNC. GDNF, que se relaciona más estrechamente con neurturina, ha demostrado actuar sobre las neuronas dopaminérgicas, simpáticas, motoras y varias neuronas sensitivas (Henderson et al., citado anteriormente, 1994; Miles et al, J Cell Biol 130:137-148, 1995; Yan et al., Nature 373:341-344, 1995; Lin et al., Science 260:1130-1132, 1993; Trupp et al. J Cell Biol 130:137-148, 1995; Martin et al Brain Res 683:172-178, 1995; Bowenkamp et al J Composición Neurol 355:479-489, 1995). Por tanto, es probable que además de las neuronas sensitivas y simpáticas periféricas, neurturina pueda actuar sobre una amplia variedad de tipos de células neuronales centrales y periféricas.

Basándose en las similitudes estructurales de persefina con las secuencias de neurturina y GDNF, también se cree que persefina estimula la supervivencia y el crecimiento de las células neuronales así como no neuronales. En efecto, tal como se indicó anteriormente, todos los factores de crecimiento aislados hasta la fecha han demostrado actuar sobre muchos tipos celulares diferentes (Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25:1418-1435, 1994). Además, los inventores del presente documento han identificado los tejidos cerebral y cardiaco como tejidos que expresan persefina, lo que apoya adicionalmente la conclusión de que la persefina puede actuar para promover el crecimiento y la supervivencia en células neuronales y no neuronales.

Como ejemplo de las acciones de los factores neurotróficos sobre los tejidos no neuronales, el factor neurotrófico prototípico, NGF, también actúa sobre los mastocitos para aumentar su número cuando se inyectan en ratas recién nacidas (Aloe, J Neuroimmunol 18:1-12, 1988). Además, los mastocitos expresan el receptor trk y responden a NGF de tal manera que NGF es un secretagogo de mastocitos y un factor de estimulación de la supervivencia (Horigome et al. J Biol Chem 269:2695-2707, 1994). Además, los miembros de la superfamilia de TGF-\beta actúan sobre muchos tipos celulares de diferente función y origen embriológico.

Los inventores del presente documento han identificado varios tejidos no neuronales en los que se expresa neurturina incluyendo la sangre, médula ósea, hígado neonatal y mastocitos. Esto sugiere un papel de la neurturina en la hematopoyesis, inflamación, alergia y miocardiopatía.

De manera similar, los inventores del presente documento han identificado los tejidos cerebral y cardiaco como tejidos en los que se expresan persefina y se cree además que la persefina se expresa en otros diversos tejidos neuronales y no neuronales. Por tanto, la persefina puede tener un papel en la hematopoyesis, inflamación, alergia y miocardiopatía.

Se cree que los factores neurotróficos de la familia de NGF actúan a través de receptores de alta afinidad específicos del factor (Tuszynski y Gage, 1994, citado anteriormente). Sólo se requieren partes particulares de la proteína que actúa en un sitio del receptor para su unión al receptor. Tales partes particulares o fragmentos diferenciados pueden servir como un agonista, en el que la sustancia activa el receptor para provocar la acción estimuladora sobre la supervivencia y el crecimiento celular, y antagonistas para neurturina o persefina donde se unen a, pero no activan, el receptor o estimulan la supervivencia y el crecimiento. Tales partes o fragmentos que son agonistas y los que son antagonistas también están dentro del alcance de la presente invención.

También pueden construirse factores de crecimiento-pan, sintéticos combinando los dominios activos de persefina o neurturina con los dominio activos de uno o más de otros factores de crecimiento. (por ejemplo, véase Ilag et al., Proc Nat'l Acad Sci 92:607-611, 1995). Se esperaría que estos factores de crecimiento-pan tuviesen las actividades combinadas de neurturina o persefina y uno o más de otros factores de crecimiento. Como tal, se cree que son factores de crecimiento potentes y multiespecíficos, que son útiles en el tratamiento de una amplia gama de enfermedades y estado degenerativos incluyendo estados que pueden tratarse mediante todos y cada uno los factores originales, a partir de los que se obtienen los dominios activos. Tales factores de crecimiento-pan podrían proporcionar efectos sinérgicos superiores a las actividades de los factores originales (Barres et al., citado anteriormente).

Los factores de crecimiento-pan dentro del alcance de la presente invención también pueden incluir polipéptidos quiméricos o híbridos que se construyen a partir de partes de fragmentos de al menos dos factores de crecimiento. Los factores de crecimiento de la superfamilia de TGF-\beta están relacionados estructuralmente, teniendo puntos de referencia de secuencia sumamente conservados, mediante los cuales se identifican los miembros de la familia. En particular, siete residuos de cisteína de estructura canónica son casi invariables en los miembros de la superfamilia (Kingsley, Genes and Dev 8:133-46, 1994) (véase la figura 17). Por tanto, las moléculas de polipéptido quimérico pueden construirse a partir de una secuencia que sea sustancialmente idéntica a una parte de la molécula de persefina o neurturina, hasta uno o más puntos de cruce, y de las cuales, una o más secuencias es sustancialmente idéntica a una parte de otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta que se extiende en el otro lado del correspondiente uno o más puntos de cruce. Por ejemplo, una parte del extremo amino-terminal del polipéptido de persefina puede combinarse con una parte del extremo carboxi-terminal de un polipéptido de neurturina o alternativamente una parte del extremo amino-terminal de un polipéptido de neurturina puede combinarse con una parte del extremo carboxi-terminal de un polipéptido de persefina. Tales partes de los polipéptidos de neurturina o persefina son preferiblemente de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 95, más preferiblemente de desde 10 hasta aproximadamente 90, aún más preferiblemente de desde 20 hasta aproximadamente 80 y lo más preferido de desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 aminoácidos contiguos y tales partes de otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta que no sea persefina, o como puede ser el caso, que no sea neurturina, y preferiblemente de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 95, más preferiblemente de desde 10 hasta aproximadamente 90, aún más preferiblemente de desde 20 hasta aproximadamente 80 y lo más preferido de desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 70 aminoácidos contiguos. Por ejemplo, un punto de cruce particular podría ser entre el tercer y el cuarto residuo de cisteína de estructura canónica. Uno de tales constructos a modo de ejemplo contendría en el extremo 5' una secuencia compuesta por una secuencia de persefina desde el residuo 1 hasta el residuo 37 de la tercera cisteína de estructura canónica y hasta un punto de cruce en algún lugar entre el residuo 37 y el residuo 63 pero sin incluir el residuo 64 de la cuarta cisteína de estructura canónica (para una referencia, véase la persefina madura, SEQ ID NO: 80). El extremo 3' del constructo híbrido constituiría una secuencia derivada de otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta tal como, por ejemplo, neurturina que es otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta que está estrechamente relacionado con la persefina. Utilizando neurturina como el otro miembro de la familia de TGF-\beta, el constructo híbrido estaría compuesto, más allá del punto de cruce, por una secuencia que comienza en el punto de cruce deseado en la secuencia de neurturina entre el residuo 37 de la tercera cisteína de estructura canónica y el residuo 67 de la cuarta cisteína de estructura canónica de neurturina y que continúa hasta el residuo 100 en el extremo 3' de neurturina (para la alineación, véase la figura 12). Un segundo constructo híbrido a modo de ejemplo estaría compuesto por el residuo 1 hasta un punto de cruce entre los residuos 37 y 67 de la neurturina unidos de manera contigua con residuos desde el punto de cruce entre los residuos 37 y 64 hasta el residuo 96 de persefina. Los constructos anteriores con persefina y neurturina se conciben como ejemplos, seleccionándose sólo el miembro particular de la familia de TGF-\beta de miembros de la familia que incluyen pero no se limitan al factor de crecimiento transformante \beta1 (TGF\beta1), factor de crecimiento transformante \beta2 (TGF\beta2), factor de crecimiento transformante \beta3 (TGF\beta3), inhibina \beta A (INH\betaA), inhibina \beta B (INH\betaB), el gen nodal (NODAL), las proteínas morfogenéticas óseas 2 y 4 (BMP2 y BMP4), el gen de Drosophila decapentaplegic (dpp), las proteínas morfogenéticas óseas 5-8 (BMP5, BMP6, BMP7 y BMP8), la familia del gen de Drosophila 60A (60A), la proteína morfogenética ósea 3 (BMP3), el gen Vg1, los factores de crecimiento y diferenciación 1 y 3 (GDF1 y GDF3), dorsalina (drsln), inhibina \alpha (INH\alpha), el gen MIS (MIS), el factor de crecimiento 9 (GDF-9), el factor de crecimiento neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), neurturina (NTN) y persefina (véase la figura 16). Además, el punto de cruce puede ser cualquier residuo entre las moléculas de cisteína primera y séptima de estructura canónica de neurturina y el otro miembro particular de la familia. Además, pueden utilizarse puntos de cruce adicionales para incorporar cualquier número deseado de partes o fragmentos de persefina con partes o fragmentos de uno cualquiera o más de otros miembros de la familia.

Al construir una molécula quimérica particular, las partes de persefina y las partes del otro factor de crecimiento, que no es persefina, se amplifican utilizando PCR, se mezclan y utilizan como molde para una reacción de PCR utilizando el cebador directo de una y el cebador inverso de la otra de las dos partes componentes de la molécula quimérica. Por tanto, se seleccionan por ejemplo cebadores directo e inverso para amplificar la parte de persefina desde el comienzo hasta el punto de cruce seleccionado entre los residuos tercero y cuarto de cisteína de estructura canónica, utilizando un plásmido de persefina como molde. Entonces, se utilizan un cebador directo con una parte 5' que solapa con la secuencia de persefina y un cebador inverso para amplificar la parte del otro factor de crecimiento que no es persefina, miembro de la superfamilia de TGF-\beta, desde el punto de cruce correspondiente hasta el extremo 3', utilizando un molde de plásmido que contiene la secuencia codificante para el miembro de la familia de TGF-\beta que no es persefina. Los productos de las dos reacciones de PCR se purifican en gel y se mezclan juntos y se realiza una reacción de PCR. Utilizando una alícuota de esta reacción como molde, se realiza una reacción de PCR utilizando el cebador directo de persefina y el cebador inverso para el factor de crecimiento que no es persefina. Luego, se clona el producto en un vector de expresión para la producción de la molécula quimérica.

Se esperaría que los factores de crecimiento quiméricos fuesen eficaces en la estimulación del crecimiento y el desarrollo de células y para su uso en la prevención de la atrofia, la degeneración o muerte de las células, en particular en las neuronas. Los polipéptidos quiméricos también pueden actuar como antagonistas de un receptor de uno o ambos de los factores de crecimiento de longitud completa a partir de los que se construyó el polipéptido quimérico o como antagonista de cualquier otro factor de crecimiento que actúe en el mismo receptor o receptores.

La presente invención también incluye composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden persefina o neurturina en una cantidad eficaz para tratar pacientes con degeneración o disfunción celular y un método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de neurturina o persefina. Estas composiciones y métodos son útiles para tratar varias enfermedades degenerativas. Cuando la degeneración celular supone degeneración neuronal, las enfermedades incluyen, pero no se limitan a neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral aguda, lesión de la médula espinal aguda, tumores del sistema nervioso, esclerosis múltiple, traumatismo o lesión de nervios periféricos, exposición a neurotoxinas, enfermedades metabólicas tales como diabetes o disfunciones renales y lesión producida por agentes infecciosos. En particular, la capacidad de la persefina para estimular la supervivencia en las células mesencefálicas sugiere una aplicabilidad de este factor de crecimiento en el tratamiento de enfermedades degenerativas neuronales del SNC tales como la enfermedad de Parkinson.

Cuando la degeneración celular supone degeneración celular de la médula ósea, las enfermedades incluyen, pero no se limitan a trastornos con células sanguíneas insuficientes tales como, por ejemplo, leucopenias incluyendo eosinopenia y/o basopenia, linfopenia, monocitopenia, neutropenia, anemias, trombocitopenia, así como un déficit de células madre para cualquiera de los anteriores. La degeneración celular también puede implicar a células musculares del miocardio en enfermedades tales como miocardiopatía e insuficiencia cardiaca congestiva. Las células y tejidos anteriores pueden tratarse también por una función disminuida.

Las composiciones y métodos del presente documento también pueden ser útiles para prevenir la degeneración y/o estimular lasupervivencia también en otros tejidos no neuronales. Un experto en la técnica determinará fácilmente el uso de una variedad de ensayos conocidos en la técnica para identificar si la neurturina o la persefina serían útiles en la estimulación de la supervivencia o el funcionamiento de un tipo celular particular.

En ciertas circunstancias, puede ser deseable modular o disminuir la cantidad de persefina o neurturina expresada. Por tanto, en otro aspecto de la presente invención, pueden prepararse oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina y utilizarse un método para disminuir el nivel de expresión de persefina o neurturina, respectivamente, por una célula que comprende administrar uno o más oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina. Por oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina se hace referencia a oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que interacciona con el apareamiento de bases con una secuencia de ácido nucleico complementaria implicada en la expresión de persefina o neurturina, respectivamente, de tal manera que la expresión de persefina o neurturina se reduzca. Preferiblemente la secuencia de ácido nucleico específica implicada en la expresión de persefina o neurturina es una molécula de ADN genómico o una molécula de ARNm que contiene secuencias del gen de la persefina o neurturina. Esta molécula de ADN genómico puede comprender regiones flanqueantes del gen de la persefina o neurturina, regiones no traducidas del ARNm de persefina o neurturina, las partes pre o pro del gen de la persefina o neurturina o la secuencia codificante para la proteína de persefina o neurturina madura. El término complementario a una secuencia de nucleótidos en el contexto de los oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina y los métodos para los mismos significa suficientemente complementario a tal secuencia, de modo que permita la hibridación a tal secuencia en una célula, es decir, en condiciones fisiológicas. Los oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina comprenden preferiblemente una secuencia que contiene desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 100 nucleótidos y más preferiblemente los oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina comprenden desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido de persefina o neurturina también pueden contener una variedad de modificaciones que confieren resistencia frente a la degradación nucleotídica tales como, por ejemplo, uniones entre nucleósidos modificadas (Ulhmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543-548, 1990; Schneider y Banner, Tetrahedron Lett 31:335, 1990), bases y/o azúcares del ácido nucleico modificadas y similares.

Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier vía adecuada, conocida en la técnica incluyendo por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, transdérmica, intratecal o intracerebral. La administración puede ser rápida como mediante inyección o durante un periodo de tiempo como mediante infusión lenta o administración de una formulación de liberación lenta. Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administración puede ser mediante inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo (LCR) cuando se pretende que la neurturina o persefina se administren a células en el sistema nervioso central, la administración puede ser con uno o más agentes que puedan estimular la penetración de neurturina o persefina a través de la barrera hematoencefálica.

La persefina o neurturina también pueden unirse o conjugarse con agentes que proporcionen propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Por ejemplo, la persefina o neurturina pueden acoplarse a cualquier sustancia que se sepa en la técnica que estimula la penetración o transporte a través de la barrera hematoencefálica, tal como un anticuerpo contra el receptor de la transferrina, y administrarse mediante inyección intravenosa. (Véase, por ejemplo, Friden et al., Science 259:373-377, 1993). Además, la persefina o neurturina pueden unirse de manera estable a un polímero, tal como polietilenglicol, para obtener propiedades deseables de solubilidad, estabilidad, semivida y otras propiedades ventajosas farmacéuticamente. (Véase, por ejemplo, Davis et al. Enzyme Eng 4:169-73, 1978; Burnham, Am J Hosp Pharm 51:210-218, 1994).

Las composiciones se emplean normalmente en la forma de preparaciones farmacéuticas. Tales preparaciones se preparan de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica. Una preparación preferida utiliza un vehículo de solución salina fisiológica, pero se contempla que también pueden utilizarse otros vehículos farmacéuticamente aceptables tales como concentraciones fisiológicas de otras sales no tóxicas, solución acuosa de glucosa al cinco por ciento, agua estéril o similares. También puede ser deseable que esté presente un tampón adecuado en la composición. Si se desea, tales disoluciones pueden liofilizarse y almacenarse en una ampolla estéril lista para su reconstitución mediante la adición de agua estéril para su rápida inyección. El disolvente primario puede ser acuoso o alternativamente no acuoso. También puede incorporarse persefina o neurturina en una matriz sólida o semisólida, biológicamente compatible, que puede implantarse en los tejidos que requieren tratamiento.

El vehículo también puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución u olor de la formulación. De manera similar, el vehículo puede contener aún otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la liberación o absorción o penetración a través de la barrera hematoencefálica. Tales excipientes son aquellas sustancias empleadas normalmente y habitualmente para formular dosificaciones para la administración parenteral, o bien en dosificaciones unitarias, o bien en forma de dosis múltiples, o bien para la infusión directa en el líquido cefalorraquídeo mediante infusión continua o periódica.

La administración de la dosis puede repetirse, dependiendo de los parámetros farmacocinéticos de la formulación de la dosis y la ruta de administración utilizadas.

También se contempla que ciertas formulaciones que contienen persefina o neurturina deben administrarse por vía oral. Tales formulaciones se encapsulan y se formulan preferiblemente con vehículos adecuados en formas farmacéuticas sólidas. Algunos ejemplos de vehículos, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, gelatina, jarabe, metilcelulosa, metil y propilhidroxibenzoatos, talco, magnesio, estearato, agua, aceite mineral y similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente agentes lubricantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes conservantes, agentes edulcorantes o agentes saborizantes. Las composiciones pueden formularse de manera que proporcionen liberación rápida, sostenida o retardada de los principios activos tras la administración al paciente, empleando procedimientos bien conocidos en la técnica. Las formulaciones también pueden contener sustancias que disminuyen la degradación proteolítica y estimulan la absorción tal como, por ejemplo, agentes tensioactivos.

La dosis específica se calcula según el peso corporal o el área de superficie corporal aproximados del paciente o el volumen de espacio corporal que ha de ocuparse. La dosis también se calculará dependiendo de la vía particular de administración seleccionada. Los expertos habituales en la técnica realizan de manera rutinaria el ajuste adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento. Tales cálculos puede hacerlos sin experimentación excesiva un experto en la técnica a la luz de la actividad de la neurturina o de GDNF. Con neurturina, la actividad en los datos de las células diana se describe en el presente documento y en la publicación de patente europea EP0787142, y en el caso de la persefina, se cree que la concentración requerida para la actividad a nivel celular es similar a la de neurturina. La actividad de la persefina sobre un tipo de célula diana particular puede determinarse mediante experimentación de rutina. Se determinan las dosis exactas, junto con estudios habituales de respuesta a la dosis. Se entenderá que un médico determinará la cantidad de composición administrada realmente, a la luz de las circunstancias relevantes, incluyendo el estado o los estados que van a tratarse, la elección de la composición que ha de administrarse, la edad, el peso y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y la vía de administración elegida.

En una realización de esta invención, la persefina o la neurturina pueden administrarse terapéuticamente mediante la implantación en los pacientes de vectores o células capaces de producir una forma biológicamente activa de persefina o de neurturina o un precursor de persefina o de neurturina, es decir, una molécula que el organismo puede convertir fácilmente en una forma biológica activa de neurturina. En un enfoque, las células que segregan persefina o neurturina pueden encapsularse en membranas semipermeables para su implantación en un paciente. Las células pueden ser células que expresan normalmente persefina o neurturina o un precursor de las mismas, o las células pueden transformarse para expresar persefina o neurturina o un precursor de las mismas. Se prefiere que la célula sea de origen humano y que la persefina o la neurturina sean persefina o neurturina humanas, cuando el paciente es humano. Sin embargo, las formulaciones y los métodos en el presente documento pueden utilizarse para aplicaciones veterinarias, así como humanas, y el término "paciente", tal como se usa en el presente documento, pretende incluir pacientes humanos y veterinarios.

Las células pueden hacerse crecer ex vivo para su uso en trasplantes o injertos en pacientes (Muench et al., Leuk & Lymph 16:1-11, 1994). En otra realización de la presente invención, la persefina o la neurturina se utiliza para estimular la expansión ex vivo de unas células para trasplante o injerto. Los métodos actuales han utilizando sistemas de cultivo en biorreactor que contienen factores tales como eritropoyetina, factores estimuladores de colonias, factores de células madre e interleucinas para someter a expansión a las células progenitoras hematopoyéticas den lugar a eritrocitos, monocitos, neutrófilos y linfocitos (Verfaillie, Stem Cells 12:466-476, 1994). Estas células madre pueden aislarse a partir de la médula ósea de donantes humanos, a partir de sangre periférica humana o a partir de células sanguíneas del cordón umbilical. Las células sanguíneas sometidas a expansión se utilizan para tratar pacientes que carecen de estas células como resultado de estados de enfermedad específicos o como resultado de quimioterapia de alta dosis para tratamiento del cáncer (George, Stem Cells 12 (Suppl 1): 249-255, 1994). En el caso de un trasplante de células tras quimioterapia, pueden realizarse trasplantes autólogos extrayendo células de la médula ósea antes de la quimioterapia, sometiendo a expansión a las células ex vivo utilizando métodos que también funcionan para purgar células cancerígenas, y trasplantando de nuevo las células sometidas a expansión en el paciente tras la quimioterapia (para revisión, véase Rummel y Van Zant, J Hematotherapy 3: 213-218, 1994). Puesto que se cree que persefina o neurturina se expresan en el animal en desarrollo en la sangre, la médula ósea y el hígado, tejidos donde se produce la proliferación y la diferenciación de las células progenitoras, se cree que persefina o neurturina pueden funcionar para regular la proliferación de las células madre hematopoyéticas y la diferenciación de las células hematopoyéticas maduras. Por tanto, la adición de persefina o neurturina a los sistemas de cultivo utilizados para la expansión ex vivo podría estimular la tasa a la que ciertas poblaciones de células se multiplican o diferencian, y mejorar la eficacia de estos sistemas de expansión para generar las células necesarias para el trasplante.

También se cree que persefina o neurturina pueden utilizarse para la expansión ex vivo de células precursoras en el sistema nervioso. El trasplante o el injerto de células se está estudiando en la actualidad como tratamiento para enfermedades en las que se pierden ciertas poblaciones de neuronas debido a la degeneración tal como, por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson (Bjorklund, Curr Opin Neurobiol 2:683-689, 1992). Las células precursoras neuronales pueden obtenerse de donantes animales o humanos o de tejido fetal humano y luego someterse a expansión en cultivo utilizando persefina o neurturina u otros factores de crecimiento. Estas células pueden injertarse entonces en pacientes en los que funcionarían para sustituir algunas de las células perdidas durante la degeneración. Dado que se ha demostrado que las neurotrofinas pueden estimular la supervivencia y la proliferación de las células precursoras neuronales, tal como, por ejemplo, la estimulación por NT-3 de neuroblastos simpáticos (Birren et al., Develop 119:597-610, 1993), persefina o neurturina también podrían funcionar de formas similares durante el desarrollo del sistema nervioso y podrían ser útiles en la expansión ex vivo de células neuronales.

En diversas circunstancias, sería deseable determinar los niveles de persefina o neurturina en un paciente. La identificación de persefina o neurturina, junto con el presente informe de que persefina y neurturina se expresan en varios tejidos, proporciona la base para la conclusión de que la presencia de persefina o neurturina sirve como una función fisiológica normal relacionada con el crecimiento y la supervivencia celular. De hecho, se sabe que otros factores neurotróficos desempeñan un papel en la función de los tejidos neuronales y no neuronales. (Para revisión, véase Scully y Otten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Otten y Gadient, Int J Devl Neurosciences 13:147-151, 1995). La persefina o la neurturina producidas de forma endógena también pueden desempeñar un papel en ciertos estados de enfermedad, particularmente cuando hay degeneración celular tal como en estados o enfermedades neurodegenerativas. Se sabe que otros factores neurotróficos cambian durante los estados de enfermedad. Por ejemplo, en la esclerosis múltiple, los niveles de proteína NGF en el líquido cefalorraquídeo aumentan durante las fases agudas de la enfermedad (Bracci-Laudiero et al., Neuroscience Lett 147:9-12, 1992) y en el lupus eritematoso sistémico, hay una correlación entre los episodios inflamatorios y los niveles de NGF en sueros (Bracci-Laudiero et al. NeuroReport 4:563-565,
1993).

Dado que la neurturina se expresa en las células sanguíneas, la médula ósea y los mastocitos, y se cree que la persefina se expresa de manera similar, es probable que el nivel de persefina o neurturina pueda alterarse en una variedad de estados y que la cuantificación de los niveles de persefina o neurturina proporcione información clínicamente útil. Además, en el tratamiento de los estados degenerativos, las composiciones que contienen persefina o neurturina o ambas pueden administrarse y probablemente sería deseable lograr ciertos niveles objetivo de persefina y/o neurturina, según sea el caso, en sueros, líquido cefalorraquídeo o en cualquier compartimento tisular deseado. Por tanto, sería ventajoso poder monitorizar los niveles del factor de crecimiento particular, persefina o neurturina, en un paciente. En consecuencia, la presente invención también proporciona métodos para detectar la presencia de persefina o para detectar la presencia de neurturina en muestra procedente de un paciente.

El término "detección", tal como se usa en el presente documento, en el contexto de detectar la presencia de persefina o neurturina en un paciente, pretende incluir la determinación de la cantidad de persefina o neurturina o la capacidad para expresar una cantidad de persefina o neurturina en un paciente, la distinción de persefina o neurturina de otros factores de crecimiento, la estimación del pronóstico en lo que se refiere a la evolución probable de una enfermedad degenerativa y a la posibilidad de recuperación, la monitorización de los niveles de persefina o neurturina durante un periodo de tiempo como una medida del estado de la enfermedad, y la monitorización de los niveles de persefina o neurturina para la determinación de una pauta terapéutica preferida para el paciente.

Para detectar la presencia de persefina o neurturina en un paciente, se obtiene una muestra del paciente. La muestra puede ser una muestra de biopsia de tejido o una muestra de sangre, plasma, suero, LCR o similares. La neurturina se expresa en una amplia variedad de tejidos tal como se muestra en el ejemplo 9 y se cree que la persefina también se secreta en varios tejidos. Por tanto, pueden tomarse muestras para la detección de persefina o neurturina de cualquier tejido que exprese el factor de crecimiento particular. Cuando se evalúan los niveles periféricos de persefina o neurturina, se prefiere que la muestra sea una muestra de sangre, plasma o suero. Cuando se evalúan los niveles de persefina o neurturina en el sistema nervioso central, una muestra preferida es una muestra obtenida del líquido
cefalorraquídeo.

En algunos casos, es deseable determinar si el gen de la persefina o la neurturina está intacto en el paciente o en un tejido o línea celular dentro del paciente.

Por un gen intacto de persefina o neurturina se quiere decir que no hay alteraciones en el gen, tales como mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, rotura cromosómica, reordenamientos cromosómicos y similares, en los que tal alteración podría alterar la producción de persefina o neurturina o alterar su actividad biológica, estabilidad o similares para conducir a enfermedades o propensión a estados degenerativos celulares. A la inversa, por un gen no intacto de persefina o neurturina se quiere decir que tales alteraciones están presentes. Por tanto, en una realización de la presente invención se proporciona un método para detectar y caracterizar cualquier alteración en el gen de la persefina o neurturina. El método comprende proporcionar un oligonucleótido que contiene ADNc de persefina o neurturina, ADN genómico o un fragmento de los mismos o un derivado de los mismos. Por un derivado de oligonucleótido se quiere decir que el oligonucleótido derivado es sustancialmente el mismo que la secuencia de la que se deriva porque la secuencia derivada tiene suficiente complementaridad de secuencia con la secuencia de la que se deriva como para hibridar con el gen de persefina o neurturina. No es necesario que la secuencia nucleotídica derivada se derive físicamente de la secuencia nucleotídica, sino que puede generarse de cualquier manera, incluyendo por ejemplo, síntesis química o replicación de ADN o transcripción inversa o transcripción.

Normalmente, el ADN genómico del paciente se aísla de una muestra celular del paciente y se digiere con una o más endonucleasas de restricción tal como, por ejemplo, TaqI y AluI. Utilizando el protocolo Southern blot, que es bien conocido en la técnica, este ensayo determina si un paciente o un tejido particular en un paciente tiene un gen intacto de persefina o neurturina o una anomalía en el gen de persefina o neurturina.

La hibridación con el gen de persefina o neurturina incluiría la desnaturalización del ADN cromosómico para obtener un ADN de cadena sencilla; poner en contacto el ADN de cadena sencilla con una sonda génica asociada con la secuencia génica de persefina o neurturina; e identificar la sonda de ADN hibridada para detectar el ADN cromosómico que contiene al menos una parte del gen humano de persefina o neurturina.

El término "sonda", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una estructura que comprende un polinucleótido que forma una estructura híbrida con una secuencia diana, debido a la complementaridad de la secuencia de la sonda con una secuencia en la región diana. Los oligómeros adecuados para su uso como sondas pueden contener un mínimo de aproximadamente 8-12 nucleótidos contiguos que son complementarios a la secuencia seleccionada como diana y preferiblemente, un mínimo de alrededor 20.

Las sondas génicas de persefina o neurturina de la presente invención pueden ser oligonucleótidos de ADN o ARN y pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica tal como, por ejemplo, excisión, transcripción o síntesis química. Las sondas pueden marcarse con cualquier marcador detectable conocido en la técnica tal como, por ejemplo, marcadores radiactivos o fluorescentes o un marcador enzimático. El marcaje de la sonda puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica tal como mediante PCR, cebado aleatorio, marcaje en extremo ("end labelling"), desplazamiento de mella ("nick translation") o similares. Un experto en la técnica también reconocerá que pueden utilizarse otros métodos sin emplear una sonda marcada para determinar la hibridación. Ejemplos de métodos que pueden utilizarse para detectar hibridación incluyen Southern blotting, hibridación in situ con fluorescencia y polimorfismo conformacional de cadena sencilla con amplificación por PCR.

La hibridación se lleva a cabo normalmente a 25-45ºC, más preferiblemente a 32-40ºC y más preferiblemente a 37-38ºC. El tiempo requerido para la hibridación es de aproximadamente 0,25 hasta aproximadamente 96 horas, más preferiblemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente 72 horas, y lo más preferido desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 24 horas.

Las anomalías en el gen de persefina o neurturina también pueden detectarse utilizando el método de PCR y cebadores que flanquean o se encuentran dentro del gen de persefina o neurturina. El método de PCR es bien conocido en la técnica. En resumen, este método se lleva a cabo utilizando dos cebadores olinucleotídicos que pueden hibridar con las secuencias de ácido nucleico que flanquean una secuencia diana que se encuentra dentro de un gen de persefina o neurturina y amplificando la secuencia diana. El término "cebador oligonucleotídico", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cadena corta de ADN o ARN que oscila en longitud desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 30 bases. Los cebadores en el sentido 5' y 3' normalmente tienen desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 30 pares de bases en longitud e hibridan con las regiones flanqueantes para la replicación de la secuencia nucleotídica. La polimerización se cataliza por una ADN polimerasa en presencia de desoxinucleótidos trifosfato o análogos de nucleótidos para producir la molécula de ADN de cadena doble. Las cadenas dobles se separan entonces por cualquier método de desnaturalización, incluyendo los físicos, químicos o enzimáticos. Comúnmente, se utiliza el método de desnaturalización física, y supone calentar el ácido nucleico, normalmente a temperaturas de aproximadamente 80ºC hasta 105ºC durante tiempos que oscilan desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 minutos. El proceso se repite para el número de ciclos deseado.

Los cebadores se seleccionan para que sean sustancialmente complementarios a la cadena del ADN que se está amplificando. Por tanto, no es necesario que los cebadores reflejen la secuencia exacta del molde, pero deben ser suficientemente complementarios para hibridar selectivamente con la cadena que se está amplificando.

Tras la amplificación por PCR, la secuencia de ADN que comprende persefina o neurturina o pre-pro-persefina o neurturina o un fragmento de los mismos, se secuencia directamente y se analiza entonces por comparación de la secuencia con las secuencias descritas en el presente documento para identificar las alteraciones que podrían cambiar la actividad o los niveles de expresión o similares.

En otra realización, se proporciona un método para detectar persefina o neurturina basado en un análisis del tejido que expresa el gen de persefina o el gen de neurturina. Se han encontrado que ciertos tejidos, tales como los identificados más adelante en el ejemplo 9, expresan el gen de neurturina. También se cree que varios tejidos expresarán el gen de persefina basándose en las observaciones para la neurturina y la identificación en el presente documento de cerebro y corazón como tejidos que expresan persefina. El método comprende hibridar un polinucleótido con ARNm procedente de una muestra de tejidos que normalmente expresan el gen de persefina o el gen de neurturina. La muestra se obtiene de un paciente en el que se sospecha que tiene una anomalía en el gen de persefina o en el gen de neurturina o en el gel de persefina o en el gen de neurturina de células particulares. En el caso de la neurturina, el polinucleótido comprende la SEQ ID NO: 11 o un derivado de la misma o un fragmento de la misma. En el caso de la persefina, el polinucleótido comprende la SEQ ID NO: 105 o la SEQ ID NO: 107 o el ortólogo humano de persefina o derivados de los mismos o fragmentos de los mismos.

Para detectar la presencia de ARNm que codifica para la proteína persefina o para la proteína neurturina, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser de sangre o de una muestra de biopsia de tejido. La muestra puede tratarse para extraer los ácidos nucleicos contenidos en el mismo. El ácido nucleico resultante de la muestra se somete a electroforesis en gel u otras técnicas de separación por tamaños.

El ARNm de la muestra se pone en contacto con una secuencia de ADN que sirve como sonda para formar dobles cadenas híbridas. El uso de una sonda marcada tal como se trató anteriormente permite la detección de las dobles cadenas resultantes.

Cuando se utiliza el ADNc que codifica para la proteína persefina o la proteína neurturina o un derivado del ADNc como una sonda, pueden utilizarse condiciones de rigurosidad con el fin de evitar falsos positivos, es decir, la hibridación y la aparente detección de secuencias nucleotídicas de persefina o neurturina cuando en realidad no está presente un gen de persefina o un gen de neurturina intacto y funcional. Cuando se utilizan secuencias derivadas del ADNc de persefina o neurturina, podrían utilizarse condiciones menos rigurosas, sin embargo, esto sería un enfoque menos preferido debido a la posibilidad de falsos positivos. La rigurosidad de la hibridación se determina por varios factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, incluyendo la temperatura, la fuerza iónica, la longitud de tiempo y la concentración de formamida. Estos factores se explican, por ejemplo, en Sambrook et al. (Sambrook, et al., 1989, citado anteriormente).

Con el fin de aumentar la sensibilidad de la detección en una muestra de ARNm que codifica para la proteína persefina o para la proteína neurturina, puede utilizarse la técnica de transcripción inversa / reacción en cadena de la polimerasa (polimerización) (RT/PCR) para amplificar el ADNc transcrito a partir de ARNm que codifica para la proteína persefina o para la proteína neurturina. El método de RT/PCR es bien conocido en la técnica (véanse el ejemplo 9 y la figura 6 más adelante).

El método RT/PCR puede llevarse a cabo tal como sigue. Se aísla el ARN celular total, por ejemplo, mediante el método habitual del isotiocianato de guanidinio y se realiza la transcripción inversa del ARN total. El método de transcripción inversa supone la síntesis del ADN a partir de un molde de ARN utilizando una enzima transcriptasa inversa y un cebador en el extremo 3'. Normalmente, el cebador contiene una secuencia de oligo(dT). El ADNc así producido se amplifica después utilizando el método de PCR y cebadores específicos para persefina o cebadores específicos para neurturina. (Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug y Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 152, págs. 316-325, 1987).

El método de la reacción en cadena de la polimerasa se lleva a cabo tal como se describió anteriormente utilizando dos cebadores oligonucleotídicos que son sustancialmente complementarios a las dos regiones flanqueantes del segmento de ADN que va a amplificarse.

Tras la amplificación, el producto de la PCR se somete entonces a electroforesis y se detecta mediante tinción con bromuro de etidio o mediante sistema de detección y cuantificación de la reactividad ("phosphoimaging").

La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia de la proteína persefina o de la proteína neurturina en una muestra obtenida de un paciente. Puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica para detectar proteínas. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, inmunodifusión, inmunoelectroforesis, métodos inmunoquímicos, ensayos de receptor - ligando, técnicas inmunohistoquímicas, ensayos de aglutinación y de complemento. (por ejemplo, véase Basic and Clinical Immunology, Sites y Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. págs. 217-262, 1991). Se prefieren los métodos de inmunoensayo receptor - ligando, que incluyen hacer reaccionar anticuerpos con un epítopo o epítopos de la proteína persefina o hacer reaccionar anticuerpos con un epítopo o epítopos de la proteína neurturina y desplazar competitivamente una proteína de persefina marcada o una proteína de neurturina marcada o derivado de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, un derivado de la proteína persefina o un derivado de la proteína neurturina pretende incluir un polipéptido en el que ciertos aminoácidos se han delecionado o reemplazado, o se han cambiado por aminoácidos modificados o inusuales, en los que el derivado de persefina o el derivado de neurturina es biológicamente equivalente a persefina o neurturina, respectivamente, y en los que el derivado experimenta una reacción cruzada con anticuerpos obtenidos contra la proteína persefina o la proteína neurturina, respectivamente. Mediante reacción cruzada se quiere decir que un anticuerpo reacciona con un antígeno distinto del que induce su formación.

Numerosos inmunoensayos de unión a proteínas, competitivos y no competitivos, son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos empleados en tales ensayos pueden estar no marcados, por ejemplo, tal como se utiliza en la prueba de aglutinación, o pueden estar marcados para su uso en una amplia variedad de métodos de ensayo. Los marcadores que pueden utilizarse incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, sustratos o cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y similares para su uso en radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimáticos, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares.

Pueden obtenerse anticuerpos policlonales o monoclonales para la proteína persefina y para la proteína neurturina o un epítopo de las mismas para su uso en inmunoensayos mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Por epítopo se hace referencia a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítopo podría comprender 3 aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epítopo. En general, un epítopo consiste al menos en 5 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial de los aminoácidos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional.

Un enfoque para preparar anticuerpos para una proteína es la selección y la preparación de una secuencia de aminoácidos de toda o una parte de la proteína, sintetizando químicamente la secuencia e inyectándola en un animal apropiado, normalmente un conejo o un ratón (Véase el ejemplo 10).

Pueden seleccionarse oligopéptidos como candidatos para la producción de un anticuerpo para la proteína persefina o para la producción de un anticuerpo para la proteína neurturina, basándose en oligopétidos que se encuentran en las regiones hidrófilas que, por tanto, es probable que estén expuestas en la proteína madura.

Los anticuerpos para persefina o para neurturina también pueden obtenerse contra oligopéptidos que incluyen una o más de las regiones conservadas identificadas en el presente documento, de manera que el anticuerpo pueda establecer una reacción cruzada con otros miembros de la familia. Tales anticuerpos pueden utilizarse para identificar y aislar los otros miembros de la familia.

Los métodos para la preparación de la proteína persefina o la proteína neurturina o un epítopo de las mismas, incluyen, pero no se limitan a, síntesis química, técnicas de ADN recombinante o aislamiento de muestras biológicas. La síntesis química de un péptido puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el método clásico de Merrifield de síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, J Am Chem Soc 85:2149, 1963) o la estrategia FMOC en un sistema de Síntesis de péptidos Múltiples Automatizada y Rápida (DuPont Company, Wilmington, DE) (Caprino y Han, J Org Chem 37:3404, 1972).

Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante la inmunización de conejos u otros animales inyectándoles un antígeno seguido por inmunizaciones de recuerdo posteriores a intervalos apropiados. Se extrae sangre de los animales y el suero se somete a ensayo frente a la proteína persefina purificada o a la proteína neurturina purificada, normalmente mediante ELISA o mediante bioensayo basado en la capacidad para bloquear la acción de persefina o neurturina, como pueda ser el caso. Cuando se utilizan especies de aves, por ejemplo pollo, pavo y similares, el anticuerpo puede aislarse de la yema del huevo. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse según el método de Milstein y Kohler uniendo esplenocitos de ratones inmunizados con células tumorales que se replican continuamente, tal como las células de mieloma o de linfoma. (Milstein y Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre y Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone y Banatis eds., Academic Press, 1981). Las células de hibridoma así formadas se clonan entonces mediante métodos de dilución limitante y los líquidos sobrenadantes se someten a ensayo para la producción de anticuerpos por ELISA, RIA o bioensayo.

La capacidad única de los anticuerpos para reconocer y unirse específicamente a proteínas diana proporciona un enfoque para tratar una sobreexpresión de la proteína. Por tanto, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para evitar o tratar enfermedades que incluyen la sobreexpresión de la proteína persefina o la proteína neurturina tratando al paciente con anticuerpos específicos para la proteína persefina o para la proteína neurturina, respectivamente.

Los anticuerpos específicos, ya sean policlonales o monoclonales, para la proteína persefina o para la proteína neurturina pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como se trató anteriormente. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales humanos o murinos mediante tecnología de hibridoma o, alternativamente, la proteína persefina o la proteína neurturina, o un fragmento inmunológicamente activo de las mismas, o un anticuerpo anti-idiotípico, o puede administrarse un fragmento del mismo a un animal para provocar la producción de anticuerpos capaces de reconocer y unirse a la proteína persefina o a la proteína neurturina. Tales anticuerpos pueden proceder de cualquier clase de anticuerpos, incluyendo, pero sin limitarse a IgG, IgA, IgM, IgD, e IgE, o en el caso de las especies de aves, IgY y de cualquier subclase de anticuerpos.

En los siguientes ejemplos se describen realizaciones preferidas de la invención. Otras realizaciones dentro del alcance de la las reivindicaciones en el presente documento serán evidentes para un experto en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva o de la práctica de la invención tal como se describe en el presente documento. Se pretende que la memoria descriptiva, junto con los ejemplos, sea únicamente a modo de ejemplo, indicándose el alcance y el espíritu de la invención en las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.

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Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra el aislamiento y la purificación de neurturina de medio condicionado de células CHO.

Preparación de medio condicionado de células CHO

Se utilizó un derivado de células DG44 de ovario de hámster chino, las células DG44CHO-pHSP-NGFI-B (CHO), (Day et al, J Biol Chem 265:15253-15260, 1990). Tal como se observó anteriormente, los inventores también han obtenido neurturina parcialmente purificada a partir de otros derivados de células DG44 de ovario de hámster chino. Las células CHO se mantuvieron en 20 ml de medio que contenía medio esencial mínimo (MEM) alfa (Gibco-BRL Nº 12561, Gaithersburg, MD) que contenía el 10% de suero bovino fetal (Hyclone Laboratories, Logan, UT), l-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y metotrexato 25 nM, utilizando matraces de 150 cm^{2} (Corning Inc., Corning NY). Para los pases y la expansión, se aspiró medio de un matraz confluente; las células se lavaron con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía en g/l, KH_{2}PO_{4} 0,144, Na_{2}HPO_{4} 0,795 y NaCl 9,00; y el matraz se incubó entonces durante 2-3 minutos con 2 ml de tripsina al 0,25% en PBS. Las células se recogieron entonces de la superficie del matraz, se añadieron 8 ml de medio y las células se trituraron varias veces con una pipeta. Las células se dividieron a 1:5 ó 1:10, se incubaron a 37ºC bajo una atmósfera del 5% de CO_{2} en aire y se dejaron crecer hasta confluencia durante 3-4 días.

El cultivo celular se expandió entonces en frascos rotativos de 850 cm^{2} (Becton Dickinson, Bedford, MA). Un matraz confluente de 150 cm^{2} se sometió a tripsinación y se sembró en un frasco rotativo que contenía 240 ml del medio MEM modificado anteriormente sin metotrexato. El pH se mantuvo, o bien cubriendo el medio con el 5% de CO_{2} en aire o preparando el medio con HEPES 25 mM, pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO). Los frascos rotativos se hicieron girar a 0,8-1,0 revoluciones por minuto. Las células alcanzaron la confluencia en 4 días.

Para recoger el medio condicionado, se utilizó medio de células CHO sin suero (SF-CHO). SF-CHO se preparó utilizando medio base de DME/F12 1:1 que se preparó mezclando a 1:1 (v/v) DMEM (Gibco-BRL número de producto 11965, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) con medio F12 de Ham (Gibco-BRL número de producto 11765). El medio SF-CHO final contenía HEPES 15 mM, pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO), albúmina sérica bovina 0,5 mg/ml (BSA, Sigma, St. Louis MO), heparina 25 \mug/ml (Sigma, St. Louis, MO), 1X de aporte complementario de insulina - transferrina - selenita (insulina bovina, 5 \mug/ml; transferrina humana, 5 \mug/ml; selenita de sodio, 5 ng/ml; Sigma, St. Louis, MO), 1-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 \mug/ml. Se eliminó el medio de los frascos rotativos confluentes y las células se lavaron una vez con 30 ml de medio SF-CHO para eliminar las proteínas séricas. Las células se incubaron entonces a 37ºC durante 16-24 horas en 80 ml de medio SF-CHO para eliminar adicionalmente las proteínas séricas. Los 80 ml de medio se eliminaron y se desecharon. Se añadió un volumen de 120 ml de medio SF-CHO al matraz y las células se incubaron a 37ºC. Cada 48 horas después, se recogieron 120 ml y se sustituyeron con el mismo volumen de medio SF-CHO.

El medio recogido se reunió y se centrífugo a 4ºC en tubos cónicos de polipropileno para eliminar los desechos y el sobrenadante se almacenó a -70ºC. El medio se recogió 5 veces durante 10 días para dar un total de aproximadamente 600 ml de medio condicionado por frasco rotativo.

Las fracciones recogidas de las columnas en cada fase de purificación se sometieron a ensayo para determinar la actividad biológica utilizando el ensayo de supervivencia neuronal y el contenido en proteínas mediante el ensayo de fijación de colorante de Bradford (Anal Biochem 72:248 et seq., 1976). Se determinaron los mg totales de proteína en el volumen de partida, normalmente 50 litros, de medio condicionado.

Ensayo de supervivencia del ganglio cervical superior

La actividad neurotrófica del material de partida de medio condicionado de CHO y en diversas fases de la purificación se evaluó utilizando el sistema del ensayo de la supervivencia del ganglio cervical superior, notificado anteriormente (Martin, et al J de Cell Biology 106:829-844; Deckwerth y Johnson, J Cell Bio 123:1207-1222, 1993). Se prepararon cultivos primarios de neuronas simpáticas a partir del ganglio cervical superior (SCG) mediante la disección de tejido de embrión de rata de 20-21 días (E20-E21). Los SCG se colocaron en medio L15 de Leibovitz con l-glutamina (Cat nº 11415-023 Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), se digirieron durante 30 minutos con colagenasa 1 mg/ml (Cat nº 4188 Worthington Biochemical, Freehold, NJ) en medio L15 de Leibovitz a 37ºC, seguido por una digestión de 30 minutos en tripsina liofilizada e irradiada (Tipo TRLVMF Cat nº 4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ) que se resuspendió en solución salina equilibrada de Hank modificada (Cat nº H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La digestión se paró utilizando AM50 que contiene medio esencial mínimo con sales de Earle y sin l-glutamina (Cat nº 11090-016 Gibco-BRL), 10% de suero bovino fetal (Cat nº 1115 Hyclone Laboratories, Logan, UT), 1-glutamina 2 mM (Cat nº G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), FuDr (fluorodesoxiuridina) 20 \muM (F-0503 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), uridina 20 \muM (Cat nº 3003 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y NGF 2,5 S 50 ng/ml. Las células se disociaron en una suspensión de células individuales utilizando una pipeta Pasteur tratada con silano y pulida a la llama. Tras la filtración de la suspensión a través de un filtro de nitex (tamaño 3-20/14, Tetko Inc., Elmsford, NY), las células se colocaron en medio AM50 tal como anteriormente y se pre-sembraron en placa en una placa de cultivo Falcon o Primaria de 100 mm (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) para reducir el número de células no neuronales. Tras 2 horas, el medio que contenía células neuronales no unidas se eliminó de estas placas y se trituró de nuevo mediante la pipeta Pasteur tratada con silano y pulida a la llama. La suspensión de células individuales se sembró en placa en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (Costar, Wilmington, MA) que se habían recubierto previamente con una doble capa de colágeno, una capa de colágeno que se había tratado con amoniaco y una segunda capa de colágeno que se había secado al aire. Se dejó que se unieran durante de 30 minutos a 2 horas. Se sembró en cada pocillo un número específico de células viables, normalmente desde aproximadamente 1200 hasta aproximadamente 3000 células totales por pocillo, o un porcentaje específico del ganglio, normalmente el 25% de las células obtenidas por ganglio. Cuando hubo que realizar los recuentos de células, se colocaron en las placas de 24 pocillos tal como se explicó anteriormente, o alternativamente, en cámaras de recuento de 2 pocillos (Nunc, Naperville, IL). Los cultivos se incubaron entonces durante 5-6 días a 37ºC en medio AM50 en una atmósfera del 5% de CO_{2}/ 95% de aire. Se indujo la muerte de las neuronas en cultivo intercambiando el medio con medio sin NGF y con el 0,05% de anti-NGF de cabra (el título final en los pocillos es de 1:10). Esta privación de NGF da como resultado la muerte de las neuronas durante un periodo de 24-72 horas. En el momento de la eliminación del NGF se añadieron a los cultivos alícuotas de factor purificado o parcialmente purificado, o controles apropiados, para determinar la capacidad para evitar la muerte
neuronal.

La evaluación de la capacidad de la fracción de columna, los eluatos de gel o el factor purificado para evitar la muerte neuronal se realizó mediante la inspección visual de los cultivos bajo microscopía de contraste de fases. Las neuronas viables siguieron siendo de fase brillante con axones intactos, mientras que las neuronas muertas estaban encogidas, eran de fase oscura, tenían membranas irregulares y los axones estaban fragmentados (figura 3). Cuando se requirió la cuantificación precisa de la supervivencia neuronal, los cultivos se fijaron en paraformaldehído al 4% o formalina al 10% en PBS, y se tiñeron con disolución de cristal violeta, (Huntoon Formula Harleco E.M. Diagnostics Systems, Gibbstown, NJ). Cuando se usaron placas de 24 pocillos, se añadió 1 \mul de disolución de cristal violeta a cada pocillo que contenía formalina al 10% y las células se contaron utilizando un microscopio de contraste de fases. Si se utilizaban las cámaras de recuento de 2 pocillos, los cultivos se fijaban, se teñían con cristal violeta, se eliminaba la tinción con agua, se deshidrataban en concentraciones crecientes de etanol con respecto a tolueno y se montaban en una disolución de preparación basada en tolueno. Las neuronas se clasificaron como viables si tenían nucleolos y núcleos claros y si se teñían claramente con cristal violeta.

La muerte neuronal a las 72 horas se muestra en la figura 3B. También se muestran (A) las células control positivas mantenidas con el factor de crecimiento nervioso y (C) las células tratadas con anti-NGF y neurturina (aproximadamente 3 ng/ml) que muestran la supervivencia de las neuronas.

La actividad se cuantificó mediante el cálculo de una "unidad de supervivencia". Las unidades de supervivencia totales en una muestra se definieron como el volumen mínimo de una alícuota de la muestra que producía la supervivencia máxima dividido por el volumen total de esa muestra. La actividad específica se calculó como las unidades de supervivencia divididas por los mg totales de proteína.

Las unidades de supervivencia se determinaron en un ensayo que utilizó aproximadamente 1200 neuronas viables en un ensayo de cultivo de 0,5 ml y un periodo de cultivo de 48 horas tras la adición de la fracción. La supervivencia se evaluó visualmente tras 48 horas. La actividad intrínseca tal como se muestra en la figura 4 se determinó en un ensayo que utilizó aproximadamente 2700 neuronas y un periodo de cultivo de 72 horas. La supervivencia se evaluó fijando las neuronas y contando el número de neuronas que sobrevivieron. Dado que la estabilidad para la neurturina, evaluada por la semivida de la actividad, disminuye a medida que aumenta el número de neuronas, se esperaría que la medida de la actividad intrínseca fuera inferior a la prevista por las determinaciones de la actividad específica. También se esperaría que la medida de la actividad intrínseca fuera inferior a la prevista por la actividad específica, dado que la supervivencia se midió tras 72 horas en lugar de 48 horas.

Para garantizar la reproducibilidad de estos ensayos de unidad de actividad, fue necesario sembrar en placa los cultivos neuronales primarios en densidades celulares reproducibles, ya que la estabilidad de la actividad disminuye significativamente con el aumento de la densidad neuronal. El intervalo de densidades celulares fue desde aproximadamente 1200 hasta aproximadamente 2700 células por pocillo. La presencia de heparina soluble en el medio de ensayo no tuvo efecto en la estabilidad a corto plazo (-3 días) de la actividad de supervivencia.

Purificación de neurturina

El medio condicionado reunido se filtró a través de filtros en cuello de botella de poro de 0,2 \mul (membrana de acetato de celulosa, Corning Inc., Corning, NY). Normalmente se utilizaron 50 litros de medio condicionado y se procesaron en lotes de 25 litros. Cada lote de 25 litros se introdujo a una velocidad de 20 ml/min en una columna de 5 x 5 cm que contenía 100 ml heparina-agarosa (Sigma, St. Louis, MO) equilibrada con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 con NaCl 150 mM. La columna se lavó entonces con aproximadamente 1000 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,5 M a 20 ml/min y después se eluyó la actividad con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1,0 M. Tras cambiar al tampón de elución NaCl 1,0 M, se desecharon los primeros 50 ml de tampón y, a continuación, se recogió una fracción de 300 ml.

El material reunido eluido de la columna de heparina-agarosa se diluyó entonces 1:1 (v/v) con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía el 0,04% de TWEEN 20 hasta una concentración de NaCl de 0,5 M y se introdujo en una columna de 1,5 cm x 9 cm que contenía 16 ml de resina de intercambio iónico de alta resolución SP SEPHAROSE® (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada con HEPES 25 mM 7,4 que contenía NaCl 0,5 M y el 0,02% de TWEEN 20. La columna se lavó entonces con 160 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,5 M y el 0,02% de TWEEN 20 y la actividad se eluyó con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1,0 M y el 0,02% de TWEEN 20 a una velocidad de flujo de 2 ml/min. Se recogió una fracción de 50 ml tras los primeros 7 ml de eluato de la columna.

El material eluido de la columna de SP SEPHAROSE® se fraccionó utilizando cromatografía líquida para la separación rápida de proteínas (FPLC) en una columna Chelating Superose HR 10/2 cargada con Cu^{++} (Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna se había preparado lavando con 10 ml de agua, cargando con 3 ml de CuSO_{4}\cdot5H_{2}0 2,5 mg/ml, lavando con 10 ml de agua y equilibrando con 10 ml de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1,0 M y el 0,02% de TWEEN 20. El eluato se introdujo en la columna en tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1,0 M a una velocidad de 1,0 ml/min. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de concentración creciente de glicina (0-300 mM) en tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1,0 M a una velocidad de 1,0 ml/min.

El gradiente se produjo por un sistema FPLC de Pharmacia usando un controlador LCC-500 y bombas P-500 para establecer un gradiente de glicina de 0-300 mM en 40 ml a 1,0 ml/min, aumentando así el gradiente en 7,5 mM de glicina por minuto. Se recogieron fracciones de un ml y se sometieron a ensayo para determinar el aumento de la supervivencia de SCG. La actividad máxima se observó en las fracciones 17-20, es decir, 17-20 min o ml del comienzo del gradiente.

Las medidas de la absorbancia a 280 nm mediante un monitor UV en línea indicaron que la mayoría de las proteínas eluía antes de la actividad de supervivencia en las fracciones 17-20. Por tanto, se logró una purificación significativa en esta etapa. Se copurificó una banda de 25 kD con la actividad de supervivencia.

Las fracciones eluidas combinadas de la columna de Superose con Cu^{++} se diluyeron hasta NaCl 0,45 M utilizando tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía el 0,02% de TWEEN 20 y se introdujeron en una columna de intercambio catiónico Mono S HR 5/5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) para una purificación adicional en FPLC. La columna se había equilibrado con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,45 M y el 0,02% de TWEEN 20. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de concentración creciente de NaCl (0,45-1,0 M). El gradiente se produjo tal como se describió anteriormente desde 0,45 M-1,0 M de NaCl en 35 ml a 1,0 ml/min, aumentando así la concentración a 0,0157 M por ml o min. Se recogieron trece fracciones de 1,0 ml (fracciones 1-13), seguido por 44 fracciones de 0,5 ml (fracciones 14-53). La actividad máxima en el ensayo de SCG fue en las fracciones 26-29. Cada fracción se sometió a ensayo en el ensayo de supervivencia de SCG durante un intervalo de volúmenes de desde 0,1 hasta 1,0 \mul por 0,5 ml de medio de cultivo.

Se cargó un porcentaje (5 \mul) de cada fracción en un gel de SDS-poliacrilamida al 14%, no reductor, y se sometió a electroforesis durante 750 V-h a 25ºC. Las proteínas se visualizaron mediante tinción con plata. Los resultados se muestran en la figura 2. Los marcadores mostrados en el carril M en el gel representan 20 ng de albúmina sérica bovina, anhidrasa carbónica, B-lactoglobulina y lisozima en el orden de peso molecular descendente.

Apareció una banda de 25 kD en las fracciones 25-30, una proteína de 28 kD eluye antes en el gradiente y una de 18 kD eluye después en el gradiente. La figura 2 ilustra la actividad de supervivencia en cada una de las fracciones. Se observa que la actividad de supervivencia se corresponde con la presencia y la intensidad aparente de la proteína de 25 kD en las fracciones 25-30.

Para demostrar que la banda de 25 kD era responsable de la actividad de estimulación de la supervivencia, la proteína de 25 kD se eluyó del gel de poliacrilamida tras la electroforesis y se sometió a ensayo para determinar la actividad de supervivencia en el ensayo de SCG. Tras la electroforesis de 150 \mul de la fracción de NaCl 0,1 M en SP SEPHAROSE® en un carril de un gel de SDS-poliacrilamida al 14%, no reductor, como anteriormente, el carril se cortó en 12 segmentos y cada segmento se aplastó y se eluyó por difusión con balanceo en el tampón que contenía HEPES 25 mM, pH 7,4, NaCl 0,5 M, el 0,02% de Tween-20 durante 18 h a 25ºC. Se añadió BSA al eluato hasta una concentración final de 200 \mug/ml y el eluato se filtró a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar los fragmentos del gel de acrilamida. El filtrado se añadió entonces a una columna de SP SEPHAROSE® para concentrar y purificar la muestra. Antes de eluir la muestra, la columna se lavó una vez en 400 \mul de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,5 M, el 0,02% de Tween-20 y 200 \mug de BSA por ml y una vez en 400 \mul de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía el 0,02% de Tween-20 y 200 \mug de BSA por ml. La columna se lavó entonces de nuevo en 400 \mul de tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 0,5 M, el 0,02% de TWEEN 20 y 200 \mug de BSA por ml. La muestra se eluyó con tampón HEPES 25 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1,0 M, el 0,02% de Tween-20 y 200 \mug de BSA por ml. Las muestras se analizaron entonces para determinar la actividad de supervivencia. Sólo el segmento correspondiente a la banda de 25 kD mostró evidencia de actividad de supervivencia. Se cree que la proteína de 25 kD purificada a partir de medio condicionado de células CHO es un homodímero.

El rendimiento de la purificación anterior fue normalmente de 1-1,5 \mug a partir de 50 litros de medio condicionado de células CHO. Se calcula que la recuperación global es del 10-30%, lo que da como resultado una purificación de aproximadamente 390.000 veces.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la caracterización de neurturina y varios miembros de la familia de TGF-\beta de factores de crecimiento en el ensayo de SCG y la falta de reactividad cruzada de los anticuerpos anti-GDNF con neurturina.

El ensayo de SCG de la proteína purificada indicó que el factor tiene una actividad máxima a una concentración de aproximadamente 3 ng/ml o aproximadamente 100 pM y la CE_{50} fue de aproximadamente 1,5 ng/ml o de aproximadamente 50 pM en el intervalo esperado para un factor de crecimiento peptídico que puede difundir

\hbox{(figura 4).}

Varios miembros de la familia de TGF-\beta influyen en la expresión génica de neuropéptidos en las neuronas simpáticas, mientras que otros estimulan la supervivencia de diferentes poblaciones neuronales. La neurturina, que es un miembro lejano de esta familia de proteínas, puede estimular la supervivencia prácticamente completa de las neuronas simpáticas durante 3 días. Además, el cultivo adicional de células SCG reveló que la neurturina podía continuar manteniendo estas neuronas durante al menos 10 días tras la retirada del NGF.

Se probaron varios otros miembros de la familia de TGF-\beta para determinar su capacidad para estimular la supervivencia en el ensayo de SCG, incluyendo TGF-\beta1, activina, BMP-2, BMP-4, BMP-6 y GDNF. De estos factores, sólo GDNF tenía una actividad de estimulación de la supervivencia; sin embargo, la actividad de GDNF fue mucho menos potente que la neurturina en esta actividad, mostrando una CE_{50} de 2-4 nM en el ensayo de supervivencia de 3 días. El GDNF probado en este ensayo fue rhGDNF producido en E. coli obtenido de Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N.J. La duración de la acción de GDNF también fue menor que la de neurturina, puesto que la capacidad del GDNF (50 ng/ml) para mantener la supervivencia durante más de 3 días estaba sustancialmente disminuida. Estos experimentos sugieren la posibilidad de que GDNF sea un agonista débil del receptor de neurturina. Además, la incapacidad de la activina y de BMP-2 para estimular la supervivencia, en comparación con su fuerte inducción de la expresión del gen relacionado con el transmisor en estas neuronas (Fann y Patterson, Int J Dev Neurosci 13:317-330, 1995; Fann y Patterson, J Neurochem 61:1349-1355, 1993) sugiere que señalan a través de receptores alternos o rutas de transducción de señal.

Para determinar la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-GDNF con neurturina parcialmente purificada, se trataron neuronas de SCG, que se habían diseccionado y sembrado en placa tal como se describe en el ejemplo 1, en el día 6 con 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml, o 30 ng/ml de GDNF (Prepro Tech, Inc, Rocky Hill, N.J.) en presencia de anti-NGF solo, o en presencia de anti-NGF y anti-GDNF (anticuerpo IgG de cabra para rhGDNF derivado de E. coli, R & D Systems, Minneapolis, Minn). Se utilizó en el ensayo una fracción parcialmente purificada 1,0 M en SP Sepharose de neurturina a las concentraciones aproximadas de 375 pg/ml, 750 pg/ml, 1,5 ng/ml y 3 ng/ml. Esta fracción se probó en presencia de anti-NGF solo y en presencia de anti-NGF y anti-GDNF. El anticuerpo anti-GDNF bloqueó la actividad de estimulación de la supervivencia de GDNF a una concentración de hasta 30 ng/ml, pero no bloqueó la actividad de estimulación de la supervivencia de la neurturina.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra el efecto de la neurturina en las neuronas sensitivas y en un ensayo de supervivencia del ganglio inferior del nervio vago.

El medio condicionado de células CHO que se había purificado parcialmente en la columna de SP Sepharose se sometió a ensayo para determinar la actividad neurotrófica en las neuronas sensitivas utilizando ganglios inferiores del nervio vago. El ensayo de supervivencia es una modificación del notificado anteriormente para los ganglios cervicales superiores. Se prepararon cultivos disociados primarios de ganglios inferiores del nervio vago diseccionando tejido de crías de rata Sprague Dawley E18. Los ganglios inferiores del nervio vago se colocaron en medio L15 de Leibovitz con l-glutamina 2 mM (Cat nº 11415-023, GIBCO-BRL. Gaithersburg, MD) a medida que los tejidos se diseccionaban, se digerían durante 30 min con colagenasa 1 mg/ml (Cat nº 4188, Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey) en medio L15 de Leibovitz a 37ºC, seguido por una digestión de 30 min en tripsina (liofilizada e irradiada, tipo TRLVMF, Cat nº 4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), y resuspensión hasta una concentración final del 0,25% en solución salina equilibrada de Hank modificada (Cat nº H8389, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo). La digestión se paró utilizando AMO-BDNF100, un medio que contenía Medio Esencial Mínimo con sales de Earle sin l-glutamina (nº 11090 016 GIBCO-BRL), el 10% de suero bovino fetal (Cat nº 1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT), l-glutamina 2 mM (Cat nº G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), FuDr 20 \muM (F-0503, Sigma Chemical Co.), uridina 20 \muM (Cat nº 3003, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y 100 ng de factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF, Amgen, Thousand Oaks, CA). Las células se disociaron en una suspensión de células individuales utilizando una pipeta Pasteur tratada con silano y pulida a la llama en el medio AMO-BDNF100, y se volvieron a sembrar en una placa de cultivo Falcon o Primaria de 100 mm (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) para eliminar las células no neuronales. Tras 2 horas, el medio que contenía las células neuronales no unidas se eliminó de estas placas y se trituró de nuevo mediante una pipeta Pasteur tratada con silano y pulida a la llama. La suspensión de células individuales se sembró en placa en placas de cultivo tisular de 24 pocillos (Costar, Wilmington, MA) que se habían recubierto previamente con una doble capa de colágeno, una de cuyas capas se había tratado con amoniaco y una segunda capa que se había secado al aire. Se disociaron los ganglios de diez embriones de rata E18 en 2,5 ml de medio y 100 \mul de esta suspensión se añadió a cada pocillo. Se dejó que las células se unieran durante 30 minutos en una incubadora a 37ºC con el 5% de CO_{2} / 95% de aire. Los pocillos se alimentaron con medio AMO-BDNF100 durante la noche.

Al día siguiente, las células se lavaron 3 veces durante 20 min cada vez con medio AMO que no contenía BDNF. Los pocillos se alimentaron con 0,5 ml de este medio solo o este medio que contenía NGF 50 ng/ml, BDNF 100 ng/ml (Amgen, Thousand Oaks, CA), GDNF 100 ng/ml (Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N.J) o neurturina 3 ng/ml. Las células se incubaron a 37ºC en una incubadora con el 5% de CO_{2} / 95% de aire durante 3 días, se fijaron con formalina al 10%, se tiñeron con cristal violeta (1 \mul/ml de formalina al 10%) y se contaron. La supervivencia se determinó tal como se observó anteriormente.

En la figura 10 se muestra la muerte neuronal a las 72 horas. La supervivencia neuronal de las neuronas del ganglio inferior del nervio vago cultivadas en BDNF se ha notificado previamente (Thaler et al, Develop Biol 161:338-344, 1994). Esto se utilizó como patrón para la supervivencia de estas neuronas y se le dio el valor de 100% de supervivencia. Los ganglios inferiores del nervio vago que no tienen soporte trófico (AMO) mostraron una supervivencia del 20%-30%, como lo hicieron las neuronas que se cultivaron en presencia de 50 ng/ml de NGF. Las neuronas cultivadas en presencia de 3 ng/ml de neurturina y en ausencia de BDNF mostraron una supervivencia similar a la de las neuronas cultivadas en presencia de BDNF (100 ng/ml). GDNF a una concentración de 100 ng/ml estimuló una supervivencia mayor de las neuronas del ganglio inferior del nervio vago que BDNF (100 ng/ml). Recientemente se ha informado de hallazgos similares con GDNF para las neuronas sensitivas de pollo (Ebendal, T. et al, J Neurosci Res 40:276-284, 1995).

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la determinación de secuencias de aminoácidos parciales de neurturina aislada de medio condicionado de células CHO.

Para obtener la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de una preparación purificada de aproximadamente 1 \mug de neurturina, las fracciones 26-29 de Mono S que contenían el máximo de actividad se concentraron hasta 25 \mul mediante ultrafiltración en centrífuga en un concentrador Microcon-3 (Amicon, Inc., Beverley, MA) y se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 14%, no reductor. Tras la separación electroforética, las proteínas se sometieron a electrotransferencia ("electroblot") en una membrana de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA) y se tiñeron con azul de Coomassie al 0,1%. La banda de 25 kD se extrajo y se insertó en el cartucho de reacción de un secuenciador automático (Modelo 476, Applied Biosystems (Foster City, CA). La recuperación de feniltiohidantoína - aminoácido (PTH-aa) en los primeros 2-3 ciclos de la secuenciación automática por degradación de Edman indicó un rendimiento de secuenciación de 4 pmoles, lo que constituyó aproximadamente el 10% de la cantidad estimada de proteína cargada en el gel de SDS.

Se realizaron dos series de secuenciación del extremo N-terminal a partir de dos preparaciones de purificación de 50 litros. En la primera serie, 1 \mug de proteína en las 3 fracciones reunidas de un volumen total de 1,5 ml se concentró hasta 25 \mul y se sometió a electrotransferencia a 100 V durante 2 horas a 25ºC utilizando un tampón de electrotransferencia de CAPS 10 mM, pH 11,0 (Sigma, St. Louis, MO) que contenía metanol al 5%. La secuencia de aminoácidos se obtuvo a partir de 13 ciclos de degradación de Edman y el rendimiento de la secuenciación fue de 4 pmoles como anteriormente.

En la segunda serie, 1,5 \mug de proteína en 4 fracciones reunidas de un volumen total de 2,0 ml se concentraron hasta 25 \mul y se sometieron a electrotransferencia a 36 V durante 12 horas a 4ºC utilizando un tampón de electrotransferencia de Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,04% y MeOH al 17%. El rendimiento de la secuenciación fue de 15 pmoles y la secuencia tras 16 ciclos fue SGARPXGLRELEVSVS (SEQ ID NO: 3). La secuencia obtenida tras 16 ciclos correspondió a la secuencia más corta obtenida en la primera serie. No se pudieron realizar asignaciones definitivas en 3 de los residuos de aminoácidos en la secuencia (residuos 1, 6 y 11 del extremo N-terminal). Una búsqueda en bases de datos de proteínas no detectó ninguna secuencia significativamente homóloga, lo que sugiere que el factor purificado era una proteína novedosa.

Estos datos iniciales de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal no permitieron el aislamiento de clones de ADNc utilizando oligonucleótidos degenerados como sondas o cebadores de PCR para seleccionar bibliotecas. Para facilitar estos enfoques, se purificó proteína adicional con el fin de obtener la secuencia de aminoácidos interna de fragmentos proteolíticos. Para obtener la secuencia de aminoácidos interna de la neurturina, se purificaron 50 litros adicionales de medio condicionado de células CHO utilizando sólo las 3 primeras etapas cromatográficas, tal como se explicó anteriormente, excepto que el gradiente utilizado para eluir la columna Chelating Superose con Cu^{++} fue el siguiente: glicina 0-60 mM (4 ml), glicina 60 mM (10 ml), glicina 60 -300 mM (32 ml). Las fracciones número 20-23 que contenían neurturina se concentraron hasta 25 \mul por ultrafiltración (Amicon microcon 3, Amicon, Beverley, MA) y se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida no reductor. Tras la electroforesis, el gel se tiñó con azul de Coomassie y se extrajo la banda de 25 kD de neurturina. La neurturina se digirió en el segmento de gel con endoproteinasa Lys-C, y los fragmentos proteolíticos eluidos se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Sólo se observó un pico en la separación de HPLC de los péptidos eluidos, lo que dio información de la secuencia de aminoácidos para 23 ciclos en el nivel de señal de 1 pmol utilizando el secuenciador automático (fragmento interno P2, SEQ ID NO: 5).

El análisis de los aminoácidos realizado en el 10% de la muestra anterior, antes de someterla a digestión, había indicado que 150 pmoles de proteína estaban presentes en el segmento de gel, que consistían en el 7,6% de lisina y el 19,5% de arginina. El único pico de nivel inferior de la digestión con Lys-C sugirió que la digestión y la elución de los péptidos eran ineficaces. El mismo segmento del gel se volvió a digerir con tripsina y los péptidos eluidos se separaron por HPLC. Se observaron dos picos en HPLC, lo que dio como resultado el esclarecimiento de dos residuos adicionales de 10 secuencias de aminoácidos (nivel de señal de 4 - 5 pmoles, fragmento interno P1, SEQ ID NO: 4 y fragmento interno P3, SEQ ID NO: 6) que fueron distintas de las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal e interna anterior. La digestión, elución y purificación in situ de péptidos y la secuenciación de péptidos se realizó por el W.M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory en la Universidad de Yale según protocolos habituales para este servicio.

Ejemplo 5

El siguiente ejemplo ilustra el aislamiento y el análisis de la secuencia de clones de ADNc de neurturina humana y de ratón.

Se sintetizaron oligonucleótidos degenerados correspondientes a varios tramos de datos fidedignos de secuencias de aminoácidos y se utilizaron como sondas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ADNc a partir ARNm por transcripción inversa. Se utilizó un cebador directo (M1676; 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, SEQ ID NO: 50) que correspondía a la secuencia peptídica P2 Xaa_{1}-Xaa_{2}-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro- Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa_{3}-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val en la que Xaa_{l} y Xaa_{2} eran desconocidos, Xaa_{3} era Gln o Glu (SEQ ID NO: 5) en combinación con un cebador inverso (M1677; 5'-ARYTCYTGNARNGTRTGRTA (SEQ ID NO: 52) que correspondía a la secuencia peptídica P3 (Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg) (SEQ ID NO: 6) para amplificar un producto de 69 nucleótidos a partir de moldes de ADNc derivados del cerebro de rata E21 y ratón adulto. Los parámetros de PCR fueron: 94ºC durante 30 s; 55ºC durante 30 s; 72ºC durante 1 min durante 35 ciclos. El producto se subclonó en el plásmido Bluescript KS y se secuenció. Toda la secuenciación de nucleótidos se realizó utilizando tecnología de terminador con colorante fluorescente según las instrucciones del fabricante en un secuenciador automático de Applied Biosystems Modelo nº 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ADN de plásmido para la secuenciación se preparó utilizando el kit Wizard Miniprep (Promega Corp., Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. La secuencia del producto amplificado predijo correctamente los datos de la secuencia de aminoácidos interna para los cebadores de PCR.

Los cebadores correspondientes a la secuencia amplificada se utilizaron en combinación con los cebadores degenerados en la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) utilizando el kit Marathon de RACE (CLONTECH, Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante, excepto que la síntesis de la primera cadena de ADNc se llevó a cabo a 50ºC utilizando la transcriptasa inversa Superscript II (Gibco-BRL). En resumen, un oligonucleótido adaptador de doble cadena se ligó a los extremos del ADNc de doble cadena sintetizado a partir de ARNm de cerebro de rata de 1 día tras el nacimiento. Utilizando cebadores de PCR de neurturina, directos, anidados (M1676; 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, SEQ ID NO: 50 y 1678; 5'-GACGAGGGTCCTTCCTGGACGTACACA, SEQ ID NO: 53) en combinación con cebadores para el adaptador ligado suministrado en el kit (AP1, AP2), el extremo 3' del ADN de neurturina se amplificó mediante dos reacciones de PCR sucesivas (primera: M1676 y AP1, utilizando 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min durante 35 ciclos; segunda: M1678 y AP2 utilizando 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 2 min durante 35 ciclos). Se obtuvo un segmento 5' del ADNc de neurturina de rata mediante dos reacciones de PCR sucesivas utilizando el ADNc unido como molde. La 1ª reacción utilizó los cebadores M1677 (SEQ ID NO: 52) y AP1; utilizando 94ºC durante 30 s; 55ºC durante 30 s; y 72ºC durante 2 min durante 35 ciclos. La 2ª reacción utilizó M1679 5'-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 54) y AP2 a 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 2 min durante 35 ciclos. Estas reacciones dieron como resultado una forma truncada del extremo 5' del ADNc de neurturina, aparentemente como resultado de la terminación prematura del ADNc durante la transcripción inversa. Los productos en 5' y 3' de RACE se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron. La secuencia de esos productos en 3' y 5' de RACE dieron como resultado una secuencia parcial de ADNc de neurturina de rata de 220 nt. Se usaron cebadores (nº 467921 5'-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG, SEQ ID NO: 55; y M1679 (SEQ ID NO: 54) correspondientes a la secuencia parcial de ADNc de rata (parámetros de PCR: 94ºC durante 30 s y 68ºC durante 1 min durante 35 ciclos) para amplificar un producto de PCR de 101 nucleótidos del ADN genómico de ratón que era homólogo a la secuencia de ADNc de neurturina de rata.

Estos cebadores se utilizaron entonces para obtener clones genómicos murinos de neurturina mediante la amplificación de fragmentos génicos en una biblioteca 129/Sv de ratón en un vector de bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., St. Louis, MO). Se identificó un fragmento NcoI de 1,6 kb a partir de este clon de P1 que contenía el gen de neurturina mediante hibridación con el cebador (nº 465782; 5'-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTGGACGTACACAGCCGCTAYCAYAC, SEQ ID NO: 56). Este fragmento Nco I se secuenció y se encontró que contenía un tramo de secuencia codificante correspondiente a las secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal e interna obtenidas a partir de la secuenciación de la proteína activa aislada del medio condicionado de células CHO. Comenzando en la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína purificada, esta secuencia nucleotídica codifica para una proteína de 100 aminoácidos con un peso molecular previsto de 11,5 kD. Una búsqueda de las bases de datos de proteínas y ácidos nucleicos identificó la neurturina como una proteína novedosa que es idéntica en aproximadamente el 40% al factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF). El GDNF se purificó y se clonó como un factor que estimula la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo y es un miembro lejanamente relacionado de la superfamilia de TGF-\beta, que ahora incluye más de 25 genes diferentes que poseen una amplia variedad de actividades proliferativas y de diferenciación. Aunque GDNF es idéntico en menos del 20% a cualquier otro miembro de la familia de TGF-B, contiene los 7 residuos de cisteína que se conservan a través de la totalidad de la familia y se cree que es la base de una estructura conservada de nudo de cisteína observada en la determinación de la estructura cristalina de TGF-\beta2. La neurturina también contiene esos 7 residuos de cisteína, pero al igual que GDNF es homóloga en menos del 20% a cualquier otro miembro de la familia de TGF-\beta. Por tanto, la neurturina y GDNF parecen representar una subfamilia de factores de crecimiento que han divergido significativamente del resto de la superfamilia de TGF-\beta.

Para determinar la secuencia del ADNc de neurturina de ratón de longitud completa, se realizó una PCR RACE en 5' y 3' igual que anteriormente para la rata, utilizando cebadores anidados previstos a partir de secuencias genómicas de ratón y ADNc de cerebro de ratón neonatal. La 1ª reacción para el extremo 3' utilizó los cebadores: M1777 5'-GCGGCCATCCGCATCTACGACCGGG (SEQ ID NO: 57) y AP1 a 94ºC durante 30 s; 65ºC durante 15 s; y 68ºC durante 2 min durante 35 ciclos. La 2ª reacción utilizó el cebador nº 467921 (SEQ ID NO: 55) y AP2 a 94ºC durante 30 s; 65ºC durante 15 s; y 68ºC durante 2 min durante 20 ciclos. El extremo 5' se obtuvo utilizando, para la 1ª reacción, el cebador M1759, 5'-CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGGT (SEQ ID NO: 58) y AP1 a 94ºC durante 30 s; 65ºC durante 15 s; y 68ºC durante 2 min durante 35 ciclos. La 2ª reacción utilizó los cebadores M1785, 5'-GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTAGATGCG (SEQ ID NO: 59) y AP2 a 94ºC durante 30 s; 65ºC durante 15 s; y 68ºC durante 2 min durante 20 ciclos. Ambos conjuntos de reacciones de PCR incluyeron un 5% de DMSO. Los productos de RACE en 5' y 3' de ratón se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron. Utilizando la secuencia de los productos de RACE, puede reunirse una secuencia de ADNc de neurturina de ratón de 1,0 kb. Esta secuencia de ADNc contiene un marco de lectura abierto de 585 nucleótidos que codifica para una proteína con un peso molecular de 24 kD. Esta secuencia de ADNc de ratón de longitud completa se muestra en la figura 7 (SEQ ID NO: 12). En concordancia con los acontecimientos de procesamiento que se sabe que se producen para los miembros de la familia de TGF-\beta, la proteína neurturina de 24 kD contiene una secuencia señal de 19 aminoácidos en el extremo amino terminal, seguida por un pro-dominio que contiene un sitio de procesamiento proteolítico RXXR inmediatamente antes de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal obtenida cuando se secuenció la proteína purificada a partir del medio condicionado de células CHO. Utilizando estos puntos de referencia, se predijo que la molécula de neurturina madura de 11,5 kD sería de 11,5 kD y, por analogía con otros miembros de la familia de TGF-\beta, se prevé una forma de homodímero unido por un puente disulfuro de 23 kD, coherente con la masa de 25 kD de la proteína purificada a partir del medio condicionado de células CHO, tal como se estimó por el análisis de SDS-PAGE.

Para el aislamiento de clones genómicos humanos, se utilizaron cebadores (nº 467524; 5'-CGCTACTGCGCAGG-
CGCGTGCGARGCGGC, SEQ ID NO: 60 y nº 10005, 5'-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA, SEQ ID NO: 61) previstos a partir de la secuencia de neurturina de ratón para amplificar (parámetros de PCR: desnaturalización inicial a 95ºC durante 1 min 30 s, seguido por 94ºC durante 30 s; 60ºC durante 15 s; y 68ºC durante 60 s durante 35 ciclos) un fragmento de 192 nucleótidos de ADN genómico humano. La secuencia del producto de PCR demostró que era el homólogo humano de la neurturina de ratón. Los cebadores se utilizaron entonces para seleccionar una biblioteca genómica humana construida en el vector P1 (servicio de rastreo de bibliotecas, Genome Systems, Inc.) y se obtuvieron dos clones que contenían el locus genómico de la neurturina humana.

Se utilizó la misma estrategia para determinar la secuencia humana, tal como se trató anteriormente para la secuencia de ratón. Se utilizó un oligonucleótido (nº 30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGACGAG, SEQ ID NO: 62) como una sonda en un análisis de Southern blot para identificar los fragmentos de restricción de los clones de P1 que contenían la secuencia codificante de la neurturina humana. Estos fragmentos de restricción (Eag I, Pvu II, Hind III, Kpn I) se subclonaron en el plásmido Bluescript KS y se secuenciaron.

Los resultados de la subclonación y la secuenciación de los fragmentos genómicos humanos fueron los siguientes. Se encontró que el fragmento Eag I tenía un tamaño de aproximadamente 6 kb, localizándose el sitio 3' Eag I 60 pb en sentido 3' desde el codón de terminación. El fragmento Pvu II tenía un tamaño de aproximadamente 3,5 kb, localizándose el sitio 3' Pvu II 250 pb en sentido 3' desde el codón de terminación. El fragmento Hind III tenía un tamaño de aproximadamente 4,8 kb, localizándose el sitio 3' Hind III 3 kb en sentido 3' desde el codón de terminación. El fragmento Kpn I tenía un tamaño de aproximadamente 4,2 kb, localizándose el sitio 3' Kpn I 3,1 kb en sentido 3' desde el codón de terminación.

El segundo exón codificante se secuenció utilizando estos fragmentos subclonados. Además, se obtuvo la secuencia de 250 pb que flanqueaban el lado 3' del segundo exón. También se obtuvo la secuencia de 1000 pb que flanqueaban el lado 5' del exón codificante. A partir de estas secuencias flanqueantes, se diseñó un cebador directo 30341 (5'-CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3', SEQ ID NO: 71) y un cebador inverso 30331 (5'-GCCAGTGGTGCCGTCGAGGCGGG-3', SEQ ID NO: 72), de manera que la totalidad de la secuencia codificante del segundo exón pudiera amplificarse por PCR.

El primer exón codificante no se mapeó con relación a los sitios de restricción anteriores, sino que estaba contenido en el fragmento Eag I. La secuencia de este exón se obtuvo a partir del fragmento Eag I subclonado utilizando el cebador de ratón 466215 (5'-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3', SEQ ID NO: 73), que contenía el codón de iniciación ATG. Se obtuvo una secuencia adicional para el primer exón codificante con el cebador inverso 20215 (5'- CCACTCCACTGCCTGAWATTCWACCCC-3', SEQ ID NO: 74), diseñado a partir de la secuencia obtenida con el cebador 466215. El cebador directo 20205 (5'- CCATGTGATTATCGACCATTCGGC-3', SEQ ID NO: 75) se diseñó a partir de la secuencia obtenida con el cebador 20215. Los cebadores 20205 y 20215 flanquean la secuencia codificante del primer exón codificante y pueden utilizarse para amplificar esta secuencia codificante utilizando PCR.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la preparación de vectores de expresión que contenían ADNc de neurturina.

Para la expresión de neurturina recombinante en células de mamífero, se construyó el vector pCMV-NTN-3-1 de neurturina. El marco de lectura abierto de 585 nucleótidos del ADNc de neurturina se amplificó por PCR utilizando un cebador que contenía los primeros 27 nucleótidos de la secuencia codificante de neurturina (5'-GCGACGCGTACCATGAGGCGCTGGAAGGCAGCGGCCCTG, SEQ ID NO: 63) y un cebador que contenía los últimos 5 codones y el codón de terminación (5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC) (SEQ ID NO: 64) utilizando como molde ARNm de cerebro de ratón de día 1 tras el nacimiento, obtenido mediante transcripción inversa (parámetros de PCR: 94ºC durante 30 s; 60ºC durante 15 s; y 68ºC durante 2 min durante 35 ciclos e incluyendo un 5% de DMSO en la reacción). El producto de la PCR se subclonó en el sitio Eco RV de BSKS y se secuenció para verificar que no contenía mutaciones generadas en la PCR. La secuencia codificante de neurturina se extrajo entonces de este vector utilizando Mlu I (extremo 5') y Bam H1 (extremo 3') y se insertó en el sentido 3' del promotor / enhancer (potenciador) de IE de CMV (citomegalovirus) en el vector de expresión de mamíferos pCB6 (Brewer, C.B. Methods in Cell Biology 43:233-245, 1994) para producir el vector pCMV-NTN-3-1 utilizando estos sitios.

Para la expresión de la proteína recombinante en E. coli, se amplificó por PCR la región codificante madura de la neurturina de ratón, utilizando un cebador que contenía los primeros 7 codones de la secuencia codificante madura (5'-GACCATATGCCGGGGGCTCGGCCTTGTGG) (SEQ ID NO: 65) y un cebador que contenía los últimos 5 codones y el codón de terminación 5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC (SEQ ID NO: 66) utilizando un fragmento que contenía el gen de neurturina murina como molde (parámetros de PCR: 94ºC durante 30 s; 60ºC durante 15 s; y 68ºC durante 90 s durante 25 ciclos, añadiéndose un 5% de DMSO a la reacción). El producto amplificado se subclonó en el sitio Eco RV de BSKS, se verificó la secuencia nucleotídica y este fragmento se transfirió entonces al vector de expresión pET-30a (Novagen, Madison, WI), utilizando un sitio N de 1 (extremo 5') y un sitio Eco R1 (extremo 3'). El vector pET-neurturina (pET-NTN) codifica para una metionina iniciadora delante del primer aminoácido de la proteína neurturina de ratón prevista a partir de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de la neurturina purificada a partir de medio condicionado de células CHO.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la transfección transitoria de células NIH3T3 con el vector de expresión de neurturina pCMV-NTN-3-1 y que el producto de la secuencia genómica en el ejemplo 5 es biológicamente activo.

Para demostrar que el ADNc de neurturina clonado era suficiente para dirigir la síntesis de neurturina biológicamente activa, se introdujo de manera transitoria el plásmido pCMV-NTN-3-1 en células NIH3T3 utilizando el método de lipofectamina para transfección. Las células NIH3T3 se sembraron en placa a una densidad de 400.000 células por pocillo (34,6 mm de diámetro) en placas de 6 pocillos (Corning, Corning, NY) 24 horas antes de la transfección. Se prepararon complejos de ADN-liposoma y se añadieron a las células según el protocolo del fabricante utilizando 1,5 \mug de ADN de plásmido CMV-neurturina (aislado y purificado utilizando una columna de purificación de flujo por gravedad ("tip-500") Qiagen (Chatsworth, CA) según el protocolo del fabricante) y 10 \mu1 del reactivo lipofectamina (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) en medio DME/F12 1:1 que contenía insulina 5 \mug/ml, transferrina 5 \mug/ml y selenita de sodio 5 ng/ml (Sigma, St. Louis, MO). Cinco horas después de la adición de los complejos ADN-liposoma en 1 ml de medio por pocillo, se añadió 1 ml de medio DME que contenía un 20% de suero bovino a cada pocillo. Veinticuatro horas después de la adición de los complejos ADN-liposoma, los 2 ml de medio anteriores se sustituyeron por 1 ml de medio DME que contenía el 10% de suero bovino, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mu/ml, y heparina 25 \mug/ml. Las células se incubaron durante 24 horas adicionales antes de que se recogiera el medio condicionado, se centrifugara para eliminar los desechos celulares y se congelara.

Como control, se transfectaron células NIH3T3 igual que anteriormente, utilizando 1,5 \mug del plásmido de expresión CMV-neo (que no contenía un inserto de ADNc) en lugar de 1,5 \mug del plásmido CMV-neurturina. Se sometió a ensayo medio condicionado de células NIH3T3 transfectadas, o bien con el plásmido control o bien con el plásmido CMV-neurturina, mediante la adición directa al medio de cultivo de SCG en el momento de la privación de NGF. La adición de 0,25 ml de medio condicionado de células transfectadas con CMV-neurturina estimuló en un 70% la supervivencia de las neuronas simpáticas y pudo obtenerse una supervivencia > 90% con 0,45 ml de este medio condicionado. No se detectó actividad significativa de estimulación de la supervivencia en el medio condicionado de las células NIH3T3 transfectadas control.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la preparación de células de ovario de hámster chino transformadas de manera estable con ADNc de neurturina.

Las células DG44, un derivado de las células de ovario del hámster chino que es deficiente en dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub et al Cell 3:405-412, 1983), se co-transfectaron de manera estable con el plásmido de expresión (pCMV-NTN-3-1) y un plásmido de expresión de DHFR (HLD) (McArthur y Stanners J. Biol. Chem. 266:6000-6005, 1991).

En el día 1, las células DG44 se sembraron en placa a 1 x 10^{6} células por placa de 10 cm en medio F12 de Ham con un 10% de suero bovino fetal (FCS). Esta densidad no debe superarse o las células crecerán en exceso antes de que se añada el medio de selección el día 5.

En el día 2, las células se transfectaron con una razón 9:1 del plásmido de expresión pCMV-NTN con respecto a DHFR, utilizando el método del fosfato de calcio (10 ug de ADN /10 cm de placa) (Chen y Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-2752, 1987, que se incorpora al presente documento como referencia).

En el día 3, las células transfectadas se lavaron con medio F12 de Ham y se alimentaron con medio F12 de Ham con un 10% de FCS.

En el día 5, las células se lavaron con el medio MEM alfa y se alimentaron con medio de selección, que es MEM alfa con el 10% de FCS y G418 400 ug/ml. Las células se mantuvieron en el medio de selección, alimentándose cada 4 días. Las colonias comenzaron a aparecer aproximadamente 14 días tras la transfección. Las colonias que crecieron en el medio de selección se transfectaron entonces a una placa de 24 pocillos y se sometieron a tripsinación al día siguiente para dispersar las células. Las células se hicieron crecer hasta la confluencia, o bien en placas de 24 pocillos o bien de 6 pocillos, con el fin de seleccionar las células para la expresión de la proteína recombinante. Se examinó la expresión de neurturina en 10 líneas de clones y se detectaron dos líneas de alta expresión utilizando el ensayo de supervivencia de SCG. Estas líneas de clones se sometieron a expansión y se amplificó la expresión en estas líneas de células seleccionadas mediante la selección en metotrexato(MTX) 50 nM. Para la selección en MTX, las células se hicieron crecer hasta el 50% de confluencia en un matraz de 150 cm^{2} en el medio de selección. El medio se cambió a medio MEM alfa que contenía una concentración de MTX de 50 nM (no fue necesario utilizar G418 durante la amplificación en MTX). Tras la colocación en MTX 50 nM, la mayoría de las células murieron y las colonias de células resistentes reaparecieron en 1-2 semanas. En este momento, las células se sometieron a tripsinización para dispersar las colonias y se dividieron cuando las células alcanzaron la confluencia. Las células alcanzaron finalmente la misma tasa de crecimiento que antes. Las células escogidas se seleccionaron para la expresión de la proteína recombinante. Se observó un aumento de 2-3 veces en la expresión tras la selección en MTX 50 nM. Se mantuvieron reservas congeladas para las líneas celulares obtenidas de la selección original y de la selección con MTX 50 nM. Podía continuarse con una selección adicional aumentando el MTX hasta que se obtuvieran los niveles deseados de expresión.

Utilizando el método anterior, se aislaron células identificadas como DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1) y DG44CH05-3(50nMMTX)(pCMV-NTN-3-1). Las células de la cepa DG44CHO5-3(50nMMTX)(pCMV-NTN-3-1) expresaron niveles de aproximadamente 100 \mug de proteína biológicamente activa por litro de medio condicionado, determinado mediante el ensayo directo del medio condicionado en el ensayo de SCG, según los métodos del ejemplo 1.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra la expresión de neurturina en diversos tejidos.

Se realizó un estudio de expresión de neurturina y GDNF en tejidos embrionarios de rata (E10, día 10 tras la concepción), tejidos neonatales (P1, día 1 tras el nacimiento), y tejidos adultos (> 3 mos) utilizando RT/PCR semi-cuantitativa (Estus et al., J Cell Biol 127:1717-1727, 1994). Las muestras de ARN se obtuvieron de diversos tejidos y los productos de la PCR se detectaron o bien mediante autorradiografía tras la incorporación de \alpha-^{32}P-dCTP en la PCR y electroforesis en un gel de poliacrilamida (figura 6), o mediante tinción con bromuro de etidio del ADN tras la electroforesis en geles de agarosa (tablas 3 y 4). El fragmento de neurturina de 101 pares de bases se obtuvo utilizando el cebador directo CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG (SEQ ID NO: 67) y el cebador inverso TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 68) y el fragmento GDNF de 194 pares de bases se obtuvo utilizando el cebador directo AAAAATCGGGGGTGYGTCTTA (SEQ ID NO: 69) y el cebador inverso CATGCCTGGCCTACYTTGTCA (SEQ ID NO: 70).

No se detectó ARNm de neurturina o GDNF en la edad embrionaria más temprana (día embrionario 10, E10) estudiada.

En los recién nacidos (día 1 tras el nacimiento, P1) se expresaron ambos transcritos en muchos tejidos, aunque la neurturina tendió a mostrar una mayor expresión en la mayoría de los tejidos que GDNF (véase la tabla 3).

TABLA 3

3

Tal como se muestra en la tabla 3, se observaron diferencias en las distribuciones en los tejidos de neurturina y GDNF. En particular, no se detectó GDNF en el hígado ni en el timo, donde se detectó expresión de neurturina, y no se detectó neurturina en el nervio ciático, donde se detectó GDNF.

El ARNm de neurturina y GDNF se detectó en muchos tejidos en el animal adulto, pero el patrón específico de tejido de la expresión para estos dos genes fue muy diferente. (tabla 4, figura 5).

TABLA 4

4

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Tal como se observa en la tabla 4, se encontró que la neurturina se expresaba en el cerebro y en la médula espinal, así como en la sangre y en la médula ósea, donde no se detectó GDNF. El nivel de expresión de neurturina en el cerebro y en la sangre fue, sin embargo, inferior al detectado en el tejido neonatal.

La neurturina también se expresó altamente en los mastocitos peritoneales de rata recién aislados, mientras que GDNF mostró poca o ninguna expresión.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra la preparación de antisueros para neurturina mediante la inmunización de conejos con un péptido de neurturina.

La secuencia peptídica correspondiente a los aminoácidos 73-87 de la proteína neurturina murina madura se sintetizó y se acopló a la hemocianina de la lapa californiana ("keyhole limpet") (KLH) tal como se describió anteriormente (Harlow y Lane, Antibodies: a laboratory manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, NY. págs. 72-81). El péptido acoplado a la KLH se envió a Caltag, Inc. y se inmunizaron dos conejos. La inmunización fue mediante inyección subcutánea en los sitios 7-10. La primera inyección fue con 150 \mug de péptido acoplado a KLH, que se resuspendió en 0,5 ml de solución salina y se emulsionó con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund. Las inyecciones de refuerzo comenzaron 4 semanas después de la inyección inicial y se realizaron una vez cada 7 días, tal como anteriormente, durante un total de 5 inyecciones, excepto que se utilizaron 100 \mug de péptido acoplado a KLH y adyuvante incompleto de Freund. Se recogieron muestras de suero 1 semana después de la quinta dosis de refuerzo.

Se purificó un volumen reunido de veinte ml de suero que se había recogido de ambos conejos una semana después de la 5ª inyección. Para la purificación se preparó una columna de afinidad a péptidos mediante el acoplamiento del péptido anterior a Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (Pharmacia Biotech). El suero se diluyó 10 veces en tampón Tris 10 mM, pH 7,5 y se mezcló mediante balanceo suave durante 16 horas a 4ºC con 0,5 ml de matriz péptido-agarosa que contenía 5 mg de péptido acoplado. La matriz se colocó en una columna, se lavó con 5 ml de Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, se lavó con 5 ml de tampón Tris 10 mM, pH 7,5 que contenía NaCl 0,4 M y se eluyó con 5,5 ml de tampón glicina 100 mM, pH 2,5. Se añadió una décima parte de volumen de tampón Tris 1,0 M, pH 8,0 al eluato inmediatamente después de la elución para neutralizar el pH. El eluato de glicina se dializó durante la noche frente a Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM.

Los anticuerpos purificados por afinidad se utilizaron en un Western blot para demostrar el reconocimiento específico de la proteína recombinante neurturina. Se purificaron diez ml de medio condicionado recogido a partir de células DG44CH05-3(G418)(pCMV-NTN-3-1) sobre SP Sepharose tal como se describió en el ejemplo 1 y las proteínas se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-PAGE reductor en el sistema tampón de tricina (Schagger y von Jagow Analytical Biochemistry 166:368-379, 1987). Las proteínas se sometieron a electrotransferencia en una membrana de nitrocelulosa en Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS al 0,04%, metanol al 17% a 4ºC durante 16 h. La membrana se incubó con los anticuerpos anti-péptido neurturina purificados por afinidad y después con IgG anti-conejo de oveja acoplada a peroxidasa de rábano picante (Harlow y Lane, citado anteriormente, págs. 498-510). Los anticuerpos unidos se detectaron con quimioluminiscencia intensificada (kit ECL, Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra). Los anticuerpos anti-neurturina reconocían una única banda de proteínas de aproximadamente 11,5 kD en el medio condicionado de las células DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1). Utilizando estos anticuerpos anti-neurturina, pudo detectarse la proteína neurturina en 10 ml de medio condicionado de células DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1), pero no pudo detectarse en 10 ml de medio condicionado con células DG44 que no se habían transformado con el vector de expresión de neurturina.

Ejemplo 11

El siguiente ejemplo ilustra la identificación de miembros adicionales de la superfamilia de genes GDNF / neurturina / persefina.

La superfamilia de TGF-\beta actualmente contiene más de 25 miembros de genes diferentes (para revisión, véase Kingsley, Genes and Development 8: 133-146, 1994). Los miembros individuales de la familia presentan diversos grados de homología entre sí y pueden definirse varios subgrupos dentro de la superfamilia mediante el análisis filogenético utilizando el programa Clustal V (Higgins et al, Comput Appl Biosci 8:189-191, 1992) y el análisis Bootstrap de árboles filogenéticos (Felsenstein, Evolution 39:783-791, 1985). La neurturina o la persefina son aproximadamente idénticas en un 40% a GDNF pero idénticas en menos del 20% a cualquier otro miembro de la superfamilia de TGF-\beta. Pueden identificarse varias regiones de secuencia en la neurturina (figura 5) que están altamente conservadas dentro de la subfamilia GDNF / neurturina / persefina, pero no dentro de la superfamilia de TGF-\beta. Es probable que estas regiones conservadas caractericen una subfamilia que contiene genes no aislados anteriormente, que ahora pueden aislarse utilizando las regiones de secuencia conservada identificadas por el descubrimiento y la secuenciación de los genes de neurturina y persefina. Las regiones de alta conservación de secuencia entre neurturina, persefina y GDNF permiten el diseño de oligonucleótidos degenerados que pueden utilizarse como sondas o como cebadores. En el presente documento se ha identificado que las secuencias de aminoácidos de la región conservada incluyen Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr donde Xaa_{1} es Ser, Thr o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 108); Glu-Xaa_{l}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{4}-Gly-Xaa_{5}-Cys en que Xaa_{1} es Thr, Glu o Lys, Xaa_{2} es Val, Leu o Ile, Xaa_{3} es Leu o Ile, Xaa_{4} es Ala o Ser, y Xaa_{5} es Ala o Ser, (SEQ ID NO: 113); y Cys-Cys-Xaa_{1}-Pro-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Xaa_{5}-Asp-Xaa_{6}- Xaa_{7}-Xaa_{8}-Phe-Leu-Asp-Xaa_{9} en que Xaa_{1} es Arg o Gln, Xaa_{2} es Thr o Val o Ile, Xaa_{3} es Ala o Ser, Xaa_{4} es Tyr o Phe, Xaa_{5} es Glu, Asp o Ala, Xaa_{6} es Glu, Asp o ningún aminoácido, Xaa_{7}, es Val o Leu, Xaa_{8} es Ser o Thr, y Xaa_{9} es Asp o Val (SEQ ID NO: 114). Como sondas pueden utilizarse secuencias de nucleótidos que contienen una secuencia codificante para las secuencias conservadas anteriores o fragmentos de las secuencias conservadas anteriores. Ejemplos de secuencias de sonda y cebador que pueden diseñarse a partir de estas regiones son las siguientes.

Cebadores directos

Cebador A (M3119): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTA (SEQ ID NO: 115) 23 nucleótidos, que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, donde Xaa_{1} es Thr, Ser o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 125);

Cebador B (M3123): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANG (SEQ ID NO: 116) 19 nucleótidos, que codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} donde Xaa_{1} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (SEQ ID NO: 126);

Cebador C (M3126):5'-GANBTNWCNTTYYTNGANGW (SEQ ID NO: 117) 20 nucleótidos, que codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} donde Xaa_{1} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (SEQ ID NO: 126);

Cebador D (M3121): 5'-TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTG (SEQ ID NO: 118) 23 nucleótidos, que codifica para la secuencia de aminoácidos, Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys donde Xaa_{1} es Ser o Ala y Xaa_{2} es Ser o Ala (SEQ ID NO: 127);

Cebador E (M3122): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTNGG (SEQ ID NO: 119) 20 nucleótidos, que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly donde Xaa_{1} es Thr, Ser o Ala y Xaa_{2} es Asp o Glu (SEQ ID NO: 128); y

Cebador F (M3176): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTT (SEQ ID NO: 120) 23 nucleótidos, que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Phe donde Xaa_{l} es Thr, Ser o Ala y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 129).

Cebadores inversos

Cebador G (M3125): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNTC (SEQ ID NO: 121) 20 nucleótidos, cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} donde Xaa_{1} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa4 es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (SEQ ID NO: 126);

Cebador H (M3124): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNT (SEQ ID NO: 122) 19 nucleótidos, cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{l}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Leu-Xaa_{4}-Xaa_{5} donde Xaa_{l} es Asp o Glu, Xaa_{2} es Val o Leu, Xaa_{3} es Thr o Ser, Xaa_{4} es Asp o Glu, y Xaa_{5} es Asp o Val (SEQ ID NO: 126);

Primer I (M3120): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAA (SEQ ID NO: 123) 23 nucleótidos, cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys donde Xaa_{l} es Ser o Ala y Xaa_{2} es Ser o Ala (SEQ ID NO: 127); y

Cebador J (M3118): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAANA (SEQ ID NO: 124) 25 nucleótidos, cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos, Xaa_{1}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{2}-Gly-Xaa_{3}-Cys donde Xaa_{l} es Ile o Leu, Xaa_{2} es Ser o Ala y Xaa_{3} es Ser o Ala (SEQ ID NO: 130).

Además de lo anterior, los cebadores siguientes se basan en regiones conservadas en GDNF y neurturina (SEQ ID NOS: 33-35).

Cebador 1, GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA (SEQ ID NO: 42) que codifica para la secuencia de aminoácidos, Val-Xaa_{1}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr donde Xaa_{l} es Ser o Thr y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 33);

Cebador 2, TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC (SEQ ID NO: 43) que codifica para la secuencia de aminoácidos Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{l}-Gly-Xaa_{2}-Cys-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ala donde Xaa_{l} es Ala o Ser, Xaa_{2} es Ala o Ser, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Ser o Ala (SEQ ID NO: 36);

Cebador 3 inverso GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA (SEQ ID NO: 44) cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{1}-Gly-Xaa_{2}-Cys-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ala donde Xaa_{1} es Ala o Ser, Xaa_{2} es Ala o Ser, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Ser o Ala (SEQ ID NO: 37);

Cebador 4 inverso TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA (SEQ ID NO: 45) cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa_{1}-Ala-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Asp-Xaa_{4} donde Xaa_{1} es Ile o Thr o Val, Xaa_{2} es Tyr o Phe, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 38);

Cebador 5 inverso TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC (SEQ ID NO: 46) cuya secuencia complementaria inversa codifica para la secuencia de aminoácidos Ala-Xaa_{l}-Xaa_{2}-Asp-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ser-Phe-Leu-Asp donde Xaa_{1} es Tyr o Phe, Xaa_{2} Glu o Asp, Xaa_{3} es Glu o Asp, y Xaa_{4} es Val o Leu (SEQ ID NO: 39);

Cebador 6 GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG (SEQ ID NO: 47) que codifica para la secuencia de aminoácidos Glu-Xaa_{l}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys donde Xaa_{l} es Glu o Thr, Xaa_{2} es Leu o Val y Xaa_{3} es Ile o Leu (SEQ ID NO: 40);

Cebador 7 GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA (SEQ ID NO: 48) que codifica para la secuencia de aminoácidos Glu-Xaa_{l}-Xaa_{2}-Xaa_{3}-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{4}-Gly-Xaa_{5}-Cys-Xaa_{6} donde Xaa_{l} es Glu o Thr, Xaa_{2} es Leu o Val, Xaa_{3} es Ile o Leu, Xaa_{4} es Ser o Ala, Xaa_{5} es Ser o Ala y Xaa_{6} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 41).

Las secuencias anteriores pueden utilizarse como sondas para la selección de bibliotecas de clones genómicos o como cebadores para la amplificación de fragmentos de genes a partir de ADN genómico o bibliotecas de clones genómicos o a partir de ADNc obtenido por transcripción inversa utilizando moldes de ARN de una variedad de tejidos. El ADN genómico o las bibliotecas de clones genómicos pueden utilizarse como moldes, porque las secuencias que codifican para la neurturina, la persefina y GDNF para las proteínas maduras no están interrumpidas por intrones.

Un oligonucleótido degenerado puede sintetizarse como una mezcla de oligonucleótidos que contienen todas las posibles secuencias de nucleótidos que codifican para la secuencia conservada de aminoácidos. Para reducir el número de oligonucleótidos diferentes en una mezcla degenerada, puede incorporarse una inosina o base universal (Loakes et al, Nucleic Acids Res 22:4039-43, 1994) en la síntesis en las posiciones en las que son posibles los cuatro nucleótidos. La inosina o base universal forma pares de bases con cada una de las cuatro bases normales del ADN que son menos estabilizantes que los pares de bases AT y GC, pero que también son menos desestabilizantes que los emparejamientos incorrectos entre las bases normales (es decir, AG, AC, TG, TC).

Para aislar los miembros de la familia puede marcarse un cebador anterior en un extremo con ^{32}P utilizando la polinucleótido cinasa de T4 e hibridando con bibliotecas de clones genómicos humanos según los procedimientos habituales.

Un método preferido para aislar los genes de los miembros de la familia sería utilizar diversas combinaciones de los cebadores degenerados anteriores como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa utilizando ADN genómico como molde. Las diversas combinaciones de cebadores pueden incluir reacciones secuenciales de PCR, utilizando cebadores anidados o mediante el uso de un cebador directo apareado con un cebador de oligo dT. Además, puede utilizarse uno de los cebadores degenerados con un cebador vector, un cebador individual puede utilizarse en un ensayo de PCR inversa o puede llevarse a cabo una PCR con un cebador degenerado y un cebador aleatorio. Como ejemplo de utilización del conjunto anterior de cebadores, puede utilizarse el cebador 2 (SEQ ID NO: 43) con el cebador 4 (SEQ ID NO: 45) en una PCR con 1 ug de ADN genómico humano y los parámetros de ciclo de 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s, y 72ºC durante 60 s. Las condiciones de PCR anteriores sólo son a modo de ejemplo y un experto en la técnica apreciará fácilmente que podría utilizarse una variedad de condiciones adecuadas y combinaciones de cebadores u optimizarse, tal como con diferentes temperaturas y diversas concentraciones de sales en el medio de tampón y similares. Se prefiere añadir DMSO a la reacción de PCR hasta una concentración final del 5%, puesto que se encontró que esto era necesario para la amplificación de esta región del gen de neurturina. La reacción de PCR, cuando se utiliza un gel de agarosa, debe contener productos en el intervalo de tamaños de 100-150 pares de bases, ya que se introduce un espacio de un aminoácido en la secuencia de la neurturina y se introduce un espacio de cinco aminoácidos en la secuencia de la persefina, cuando cualquiera de las secuencias se alinea con GDNF y, por tanto, los genes de los miembros de la familia también podrían contener una separación ligeramente variable entre las secuencias conservadas de los cebadores 2 y 4. Los productos de la PCR en el intervalo de 100-150 pares de bases deben contener múltiples productos génicos amplificados, incluyendo GDNF, neurturina y persefina, así como miembros de la familia no aislados anteriormente. Para identificar las secuencias de estos productos, pueden purificarse en gel y ligarse en el plásmido Bluescript (Stratagene), y después transformarse en la cepa huésped de E. coli XL1-blue (Stratagene). Las colonias bacterianas que contengan subclones individuales pueden seleccionarse para su aislamiento y sembrarse en placa en filtros de nitrocelulosa en dos copias. Cada uno de los filtros duplicados puede seleccionarse con una sonda de oligonucleótido para la secuencia única de GDNF o la secuencia única de neurturina o la secuencia única de persefina en la región amplificada. Los subclones que no hibriden ni con GDNF ni con neurturina ni con persefina, pueden secuenciarse, y si se encuentra que codifican para miembros de la familia no aislados anteriormente, la secuencia puede utilizarse para aislar clones de ADNc de longitud completa y clones genómicos, tal como se hizo para la neurturina (ejemplo 5). Se utilizó un método similar para aislar nuevos miembros de genes (GDF-3 y GDF-9) de la superfamilia de TGF-\beta basado en la homología entre los genes identificados anteriormente (McPherron, J Biol Chem 268: 3444-3449, 1993).

Los inventores del presente documento creen que la forma más preferida para aislar los genes de los miembros de la familia puede ser aplicar el procedimiento anterior de PCR como un método de selección para aislar clones genómicos individuales de los miembros de la familia a partir de una biblioteca. Esto se debe a que sólo hay un exón para la región codificante tanto de neurturina como de GDNF maduros. Si, por ejemplo, la reacción de PCR anterior con los cebadores 2 y 4 genera productos del tamaño apropiado utilizando ADN genómico humano como molde, la misma reacción puede realizarse utilizando como molde, conjuntos de clones genómicos en el vector P1, según los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el que se utiliza para aislar clones genómicos humanos de neurturina (ejemplo 5). Los conjuntos que contienen el gen de neurturina en esta biblioteca se han identificado previamente y los conjuntos que contienen persefina y GDNF pueden identificarse fácilmente mediante la selección con cebadores específicos de GDNF. Por tanto, los conjuntos sin neurturina, sin persefina y sin GDNF que generan un producto del tamaño correcto utilizando los cebadores degenerados se reconocerán fácilmente como miembros de la familia no aislados previamente. Los productos de la PCR generados a partir de estos conjuntos pueden secuenciarse directamente utilizando el secuenciador automático y pueden aislarse clones genómicos mediante la subdivisión y selección adicionales de los clones reunidos como un servicio habitual ofrecido por Genome Systems, Inc.

Ejemplo 12

El siguiente ejemplo ilustra el aislamiento y la identificación de persefina utilizando los procedimientos y cebadores descritos en el ejemplo 11.

La estrategia de PCR degenerada ideada por los inventores en el presente documento se ha utilizado ahora con éxito para identificar un tercer factor, la persefina, que es aproximadamente idéntica en un 35-50% tanto a GDNF como a neurturina. El enfoque experimental se describió anteriormente y se facilita en mayor detalle a continuación. Los cebadores correspondientes a la secuencia de aminoácidos Val-Xaa_{l}-Xaa_{2}-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr donde Xaa_{l} es Ser o Thr y Xaa_{2} es Glu o Asp (SEQ ID NO: 33) [M1996; 5'-GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA (SEQ ID NO: 42)] y Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa_{l}-Gly-Xaa_{2}-Cys-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Ala donde Xaa_{l} es Ala o Ser, Xaa_{2} es Ala o Ser, Xaa_{3} es Glu o Asp y Xaa_{4} es Ser o Ala (SEQ ID NO: 37) [M1999; 5'-GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRCARTANCKRAA (SEQ ID NO: 44)] se utilizaron para amplificar un fragmento de 77 nucleótidos a partir de ADN genómico de rata utilizando la enzima Klentaq y tampón en las condiciones siguientes: 94ºC durante 30 s; 44ºC durante 30 s; 72ºC durante 30 s durante 40 ciclos. El producto resultante se subclonó en el plásmido Bluescript KS y se secuenció. Toda la secuenciación de nucleótidos se realizó utilizando tecnología de terminador con colorante fluorescente según las instrucciones del fabricante en un secuenciador automático de Applied Biosystems Modelo nº 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA). El ADN de plásmido para la secuenciación se preparó utilizando el kit Wizard Miniprep (Promega Corp., Madison, WI) según las instrucciones del fabricante.

La secuencia de uno de los productos amplificados predijocorrectamente los datos de la secuencia de aminoácidos interna para los cebadores de PCR que fue diferente de la de GDNF o neurturina, pero que tenía una identidad de más del 20% con GDNF y neurturina, mientras que las secuencias de otros que se obtuvieron correspondieron a GDNF o neurturina, tal como se habría esperado. Se pensó que la secuencia novedosa identificaba a un nuevo miembro de esta familia que se denominó persefina.

La secuencia de este fragmento interno a los cebadores fue 5'-TGCCTCAGAGGAGAAGATTATC (SEQ ID NO: 90). Esto codifica para el último nucleótido del codón de Tyr y entonces codifica para los aminoácidos: Ala-Ser-Glu-Glu-Lys-Ile-Ile (SEQ ID NO: 91). Esta secuencia se alineó después con las secuencias de rata de GDNF y neurturina. Este análisis confirmó que persefina era única.

LGLGYETKEELIFRYC GDNF (rata) (SEQ ID NO: 92)

LGLGYTSDETVLFRYC NTN (rata) (SEQ ID NO: 93)

LGLGYASEEKIIFRYC PSP (rata) (SEQ ID NO: 94)

Para obtener una secuencia de persefina adicional, se utilizaron cebadores que contenía partes de los 22 nucleótidos únicos del fragmento amplificado anteriormente en la técnica de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE) (Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) utilizando el kit Marathon de RACE (CLONTECH, Palo Alto, CA) según las instrucciones del fabricante, excepto que la síntesis de la primera cadena de ADNc se llevó a cabo a 50ºC utilizando la transcriptasa inversa Superscript II (Gibco-BRL). En resumen, un oligonucleótido adaptador de doble cadena se ligó a los extremos del ADNc de doble cadena sintetizado a partir de ARNm de cerebro de rata de 1 día tras el nacimiento. Utilizando cebadores de PCR de neurturina, directos, anidados (10135; 5'-AGTCGGGGTTGGGGTATGCCTCA, SEQ ID NO: 95 y M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT SEQ ID NO: 96) en combinación con cebadores para el adaptador ligado suministrado en el kit (AP1, AP2), el extremo 3' del ADN de persefina se amplificó mediante dos reacciones de PCR sucesivas (primera: 10135 y AP1, utilizando 94ºC durante 30 s, 60ºC durante 15 s y 68ºC durante 2 min durante 35 ciclos; segunda: M2026 y AP2 utilizando 94ºC durante 30 s, 60 durante 15 s y 68ºC durante 2 min durante 21 ciclos). Se obtuvo un fragmento de aproximadamente 350 nucleótidos a partir de esta reacción de PCR y este fragmento se secuenció directamente utilizando el cebador M2026. La secuencia de este producto de RACE en 3' dio como resultado una secuencia de ADNc de persefina parcial de rata de aproximadamente 350 nucleótidos (SEQ ID NO: 97). La secuencia de aminoácidos prevista de este ADNc se comparó con la de GDNF y neurturina, y se encontró que era homóloga en aproximadamente el 40% a cada una de esas proteínas. Es importante que estuviera presente la separación característica de los residuos de cisteína en los miembros de la superfamilia de TGF-\beta. Además, aparte de la región de similitud codificada por los cebadores degenerados utilizados para aislar la persefina, otra región de alta homología compartida entre GDNF y neurturina, pero ausente en otros miembros de la superfamilia de TGF-\beta, también estaba presente en la persefina.

\newpage

GDNF ACCRPVAFDDDLSFLDD (aa 60-76) (SEQ ID NO: 98)

NTN PCCRPTAYEDEVSFKDV (aa 61-77) (SEQ ID NO: 99)

PSP PCCQPTSYAD-VTFLDD (aa 57-72) (SEQ ID NO: 100)

(La numeración de los aminoácidos utiliza el primer residuo de Cys como aminoácido 1).

Con la confirmación de que persefina era verdaderamente un nuevo miembro de la subfamilia GDNF / neurturina, se aislaron clones genómicos murinos de persefina para obtener información adicional de la secuencia. Se utilizaron cebadores (directo, M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT SEQ ID NO: 96 e inverso, M3028; 5'-TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA, SEQ ID NO: 101) correspondientes a la secuencia del ADNc de rata en una reacción de PCR (parámetros de PCR: 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 15 s y 72ºC durante 30 s durante 35 ciclos) para amplificar un fragmento de 155 nucleótidos de ADN genómico de ratón que era homólogo a la secuencia de ADNc de persefina de rata. Estos cebadores se utilizaron entonces para obtener clones genómicos de persefina murina a partir de una biblioteca de ratón 129/Sv en un vector de bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).

Se identificaron fragmentos de restricción (NcoI de 3,4 kb y Bam H1 de 3,3 kb) a partir de este clon P1 que contenía el gen de persefina mediante hibridación con un fragmento de 210 nucleótidos obtenido por PCR utilizando ADN genómico de ratón con cebadores (directo, M2026; SEQ ID NO: 96 e inverso, M3159; 5'-CCACCACAGCCACAAGCTGCGGSTGAGAGCTG, SEQ ID NO: 102) y parámetros de PCR: 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 15 s y 72ºC durante 30 s durante 35 ciclos. Los fragmentos Nco I y Bam H1 se secuenciaron y se encontró que codificaban para un tramo de aminoácidos correspondientes al presente en el producto de RACE de persefina de rata, así como también era homólogo a las regiones maduras tanto de neurturina como de GDNF (figura 11).

Cuando se alinearon las secuencias de aminoácidos de GDNF, neurturina y persefina murinas utilizando la primera cisteína como punto de partida (lo que se realiza porque las alteraciones en los sitios de escisión entre los miembros de la familia crea variabilidad en los segmentos en el sentido 5' de la primera cisteína), la persefina (91 aminoácidos) es algo más pequeña que la neurturina (95 aminoácidos) o GDNF (94 aminoácidos). La identidad global dentro de esta región es de aproximadamente el 50% con neurturina y de aproximadamente el 40% con GDNF (figura 12).

La secuenciación adicional de los nucleótidos del fragmento Nco I de la persefina murina reveló la secuencia de nucleótidos de la totalidad del gen de persefina murina (SEQ ID NO: 131; figura 17). Un marco de lectura abierto se extiende desde la secuencia que codifica para una metionina iniciadora hasta un codón de terminación en las posiciones 244-246. Sin embargo, en algún lugar de esta secuencia hay una anomalía evidente, de manera que la secuencia que codifica para el sitio de escisión RXXR (nucleótidos en las posiciones 257-268) y la secuencia correspondiente a la proteína madura persefina (posiciones 269-556) no son co-lineales con este marco de lectura abierto. En cambio, un segundo marco de lectura codifica para el sitio de escisión y la persefina madura. Los dos marcos de lectura convincentes de muestran en la figura 17.

También se ha llevado a cabo la secuenciación adicional de la persefina de rata. Los fragmentos genómicos de rata se amplificaron por PCR utilizando Klentaq y ADN genómico de rata como molde. Se utilizó el cebador directo nº 40266 (5'-AATCCCCAGGACAGGCAGGGAAT; SEQ ID NO: 137) correspondiente a una región en el sentido 5' del gen de persefina de ratón y un cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138) correspondiente a una región dentro de la secuencia de persefina de rata madura, con los parámetros siguientes (95ºC durante 15 s, 55ºC durante 15 s, 68ºC durante 45 s x 30 ciclos). El producto amplificado se sometió a la acción de la cinasa con la polinucleótido cinasa de T4, los extremos se volvieron romos con la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) de E. coli y se clonó en el plásmido BSKS.

La secuenciación de los nucleótidos se llevó a cabo para establecer la secuencia de la totalidad del gen de persefina de rata (SEQ ID NO: 134; figura 18). Se encontró que un marco de lectura abierto se extendía desde la secuencia que codifica para una metionina iniciadora hasta un codón de terminación en las posiciones 244-246, tal como se había observado con la persefina murina. Tal como también se había observado con la persefina murina, se encontró que se producía una anomalía entre la secuencia que codifica para la metionina iniciadora y la que codifica para el sitio de escisión para la persefina de rata madura, de manera que existen dos marcos de lectura convincentes tal como se indica en la figura 18. Independientemente de esta anomalía, las células de mamífero expresan persefina a partir de la secuencia genómica de longitud completa de rata o murina, tal como se ilustra más adelante.

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra la preparación de un vector de expresión bacteriano para persefina murina y su introducción en E. coli para la expresión de persefina madura recombinante.

El polinucleótido de persefina que codifica para la proteína persefina murina madura que comienza 5 aminoácidos en el sentido 5' del primer residuo de Cys del marco de lectura (SEQ ID NO: 80) se clonó en el vector de expresión pET, pET-30a, en los sitios Nde I y Bgl II. Este polinucleótido de persefina se generó mediante PCR utilizando el clon genómico de persefina murina P1 como molde. Se utilizó un cebador directo M3157 (5-GGACTATCATATGGCC-
CACCACCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGGCCTTGGCTGGTTCATGCCGA, SEQ ID NO:
139) que codifica para un sitio Nde I, 8 residuos de histidina y un sitio enterocinasa, y un cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138), que corresponde a la secuencia que codifica para los últimos 6 residuos de aminoácidos de la secuencia de persefina madura, el codón de terminación y un sitio Bgl II. Las condiciones de la reacción de PCR fueron 95ºC durante 15 s, 55ºC durante 15 s, 68ºC durante 60 s x 25 ciclos. Este producto de PCR se subclonó en el sitio EcoRV del plásmido BSKS y se secuenció para verificar que no contenía mutaciones. La secuencia de persefina se cortó entonces de este vector utilizando Nde I y Bgl II y se clonó en los sitios Nde I (5') y Bgl II (3') del vector de expresión bacteriano pET30a (Novagen, Madison, WI). Por tanto, este vector de expresión produciría la forma madura de la proteína persefina que posee un marcador en el extremo amino terminal que consiste en 8 residuos de histidina seguidos directamente por un sitio de
enterocinasa.

El plásmido se introdujo en la cepa de E. coli BL21 (DE3). Para producir persefina, la bacteria que alberga este plásmido se hizo crecer durante 16 h, se recogió y se lisó utilizando guanidina-HCl 6 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M a pH 8,0, y la proteína recombinante persefina se purificó a partir de estos lisados mediante cromatografía sobre una resina de Ni-NTA (Qiagen). La proteína se eluyó utilizando 3 volúmenes de columna de tampón E que contenía urea 8 M, NaH_{2}PO_{4} 0,1 M, Tris 0,01 M a pH 4,5. La persefina se renaturalizó entonces mediante diálisis en tampón de renaturalización que consiste en NaH_{2}PO_{4}1 M, Tris 0,01 M a pH 8,3, NaCl 0,15, cisteína 3 mM, el 0,02% de Tween20, el 10% de glicerol y que contenía concentraciones decrecientes de urea que comenzaban con 4 M durante 16 h, seguido por 2 M durante 16 h, 1M durante 72 h, y 0,5 M durante 16 h. La concentración de persefina se determinó entonces utilizando un ensayo Dot Metric (Geno Technology, St. Louis, MO) y se almacenó a 4ºC.

Esta persefina recombinante producida de manera bacteriana se utilizó como un inmunógeno en conejos para producir anticuerpos frente a persefina madura. Todas las inyecciones de inmunógeno y las extracciones de sangre se realizaron en Cal Tag Inc. (Healdsburg, CA). Se demostró que el antisuero anti-persefina reconocía específicamente a la persefina, pero no a la neurturina ni a GDNF, utilizando análisis de transferencia ("blot") de proteínas. Este antisuero específico para persefina se utilizó entonces para detectar persefina en lisados preparados a partir de células COS transfectadas.

Ejemplo 14

Este ejemplo ilustra la preparación de vectores de expresión de mamíferos que contienen los genes de persefina de rata o murinos y su incorporación en líneas celulares de mamíferos para la producción de persefina madura. Para construir el plásmido murino, se utilizó un clon P1 que contenía la persefina murina como molde en un ensayo de PCR. Los cebadores se diseñaron de manera que el polinucleótido resultante contuviera el gen de persefina extendiéndose desde el codón iniciador de metionina hasta el codón de terminación 3' para la secuencia codificante de la persefina madura (SEQ ID NO: 131). La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ ID NO: 140) y un cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138). Para construir el plásmido de rata análogo se utilizó ADN genómico de rata como molde en un ensayo de PCR. La reacción de PCR utilizó un cebador directo M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ ID NO: 140) y un cebador inverso M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138). Ambas reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando Klentaq y los parámetros siguientes: 95ºC durante 15 s, 55ºC durante 15 s, 68ºC durante 45 s x 25 ciclos. Los productos amplificados se sometieron a la acción de la cinasa con polinucleótido cinasa de T4, los extremos se volvieron romos con ADN polimerasa I (fragmento Klenow) de E. coli, y se clonaron en el plásmido BSKS. La secuenciación de los nucleótidos se llevó a cabo para verificar que se había obtenido el clon correcto. Los polinucleótidos de persefina murina y de rata se cortaron utilizando Sma I y Hind III y cada uno se clonó en los sitios Asp718 (que se habían vuelto romos) y Hind III del vector de expresión de mamífero pCB6.

Células COS de mono se transfectaron con los vectores de expresión de persefina murina o de rata (16 \mug por 5 x 10^{5} células) o con el propio vector no recombinante (pCB6) utilizando el método de precipitación del fosfato de calcio (Chen y Okayama, Mol Cell Biol 7:2745-2752, 1987). Cuarenta y ocho horas después, las células se lisaron en tampón IP que contenía Tris 50 mM a pH 7,5, NaCl 300 mM, el 1% de Triton X-100, el 1% de desoxicolato, EDTA 10 mM, el 0,1% de SDS, leupeptina 5 \mug/ml, pepstatina 7 \mug/ml y PMSF 250 \muM. Las muestras se cargaron en gel de SDS-poliacrilamida al 15% y las proteínas se separaron por electroforesis. Las proteínas se transfirieron entonces a nitrocelulosa mediante electrotransferencia. Esta membrana de nitrocelulosa se incubó con anticuerpos anti-persefina para detectar la presencia de persefina en los lisados.

Tal como se muestra en la figura 19, los lisados de las células transfectadas con los vectores de expresión de persefina de rata o murina, pero no el lisado de las células transfectadas con pCB6, contienen grandes cantidades de persefina. El tamaño de la persefina detectada fue de aproximadamente 14 kD, lo que es coherente con el tamaño previsto para la forma de persefina procesada, es decir, madura. Esto demuestra que los genes de persefina de rata y murina pueden dirigir la síntesis de una molécula de persefina procesada apropiadamente.

Ejemplo 15

El siguiente ejemplo ilustra los métodos que pueden utilizarse para el aislamiento y la identificación de la persefina humana.

La identificación de las secuencias de la persefina de rata y murina permite ahora identificar y aislar el gen de la persefina humana. Debido a la alta conservación entre GDNF humano y de roedor (aproximadamente una identidad del 95%) y entre la neurturina humana y de roedor (aproximadamente una identidad del 90%), se cree que estará presente una relación similarmente próxima (es decir, una identidad mayor del 85%) entre la persefina humana y de roedor.

Pueden utilizarse diferentes estrategias para obtener el gen de la persefina humana. En una estrategia preferida, se seleccionan bibliotecas de ADNc y genómicas humanas mediante hibridación con las secuencias de persefina murina y/o de rata que se han identificado en el presente documento (SEQ ID NOS:79-83) o con partes de estas secuencias. Estas sondas o secuencias de ADN se marcan tal como se describió anteriormente, por ejemplo, con ^{32}P-dCTP utilizando o bien cebado aleatorio o polinucleótido cinasa. Las condiciones de hibridación se describieron anteriormente y se utilizan diversas condiciones de rigurosidad en la hibridación. La rigurosidad de la hibridación se determina por varios factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, incluyendo la temperatura, la fuerza iónica, la longitud de tiempo y la concentración de formamida. Estos factores se explican, por ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente.

En una estrategia preferida alternativa, se emplean cebadores correspondientes a partes de la secuencia nucleotídica de la persefina de rata o murina (o derivados de la misma) en una reacción de PCR utilizando o bien ADN genómico humano o ADNc obtenido mediante transcripción inversa a partir de ARN aislado de tejido humano. Como ejemplo, puede utilizarse el cebador directo M2026 (SEQ ID NO: 96) y el cebador inverso, M3028 (SEQ ID NO: 101) en una reacción de PCR utilizando diversas condiciones, tal como se describió anteriormente, y moldes de ADN humano para amplificar un fragmento de persefina humana. Los cebadores que amplifican tal fragmento, tal como se confirma por la secuenciación de los nucleótidos del fragmento, se utilizan entonces para obtener clones de persefina humana. Los clones se identifican en virtud de su producción del mismo fragmento amplificado tras PCR con los cebadores seleccionados en una biblioteca genómica humana en un vector de bacteriófago P1 (servicio de rastreo de bibliotecas de Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).

Tras obtener clones positivos por cualquiera de los métodos anteriores, estos clones de persefina humana se aíslan y los fragmentos se subclonan en plásmidos Bluescript KS y se secuencian. La secuenciación de los nucleótidos se lleva a cabo utilizando la tecnología de terminador con colorante fluorescente en un secuenciador automático de Applied Biosystems Modelo nº 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN de plásmido para la secuenciación se preparó utilizando el kit Wizard Miniprep (Promega Corp., Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de estos fragmentos humanos que son ortólogas a las secuencias de persefina de rata y murina se identifican entonces y se establece la secuencia de nucleótidos de longitud completa de la persefina humana a partir de las secuencias de estos fragmentos.

Ejemplo 16

Este ejemplo ilustra la preparación de moléculas de polipéptido híbridas o quiméricas que contienen partes derivadas de persefina (PSP) y partes derivadas de neurturina (NTN).

Como miembros estrechamente relacionados de la familia de TGF\beta, se prevé que tanto persefina como neurturina tengan una estructura global muy similar, aunque mientras que neurturina promueve la supervivencia de las neuronas simpáticas, la persefina estrechamente relacionada no lo hace. Se produjeron dos quimeras sustituyendo esencialmente partes persefina con neurturina, localizándose el punto de cruce entre los dos residuos de cisteína adyacentes, altamente conservados, tercero y cuarto. La primera quimera, denominada PSP/NTN (SEQ ID NO: 141, figura 20), contiene los primeros 63 residuos de persefina murina madura combinada con los residuos 68 a 100 de la neurturina murina madura (utilizando codones preferidos de E. coli). Para construir esta molécula, se llevaron a cabo dos reacciones de PCR: 1) utilizando el cebador directo M2012 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAA, SEQ ID NO: 142) y el cebador inverso M2188 (5'-TCGTCTTCGTAAGCAGTCGGACGGCAGCAGGGTCGGCCATGGGCTCGAC, SEQ ID NO: 143) y el plásmido de persefina murina pET30a como molde (véase el ejemplo 13); y 2) utilizando el cebador directo M2190 (5'-TGCTGCCGTCCGACTGCTTACGAAGACGA, SEQ ID NO: 144) y el cebador inverso M2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT, SEQ ID NO: 145) y el plásmido de neurturina murina pET30a (codones preferidos de E. coli) como molde (véase el ejemplo 6). Ambas reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando los parámetros siguientes: 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, 72ºC durante 30 s x 25 ciclos. Los productos de estas dos reacciones de PCR se purificaron en gel, se mezclaron juntos, y se llevó a cabo una reacción de PCR en las condiciones siguientes: 94ºC durante 30 s, 60ºC durante 20 min, 68ºC durante 5 min. Tras 8 ciclos, se utilizó una alícuota de esta reacción como molde en una tercera reacción de PCR utilizando el cebador directo M2012 y el cebadorinverso M2186 en las condiciones siguientes: 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, 72ºC durante 30 s x 25 ciclos. El producto resultante se sometió a la acción de la cinasa con la polinucleótido cinasa de T4, los extremos se volvieron romos con la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) de E. coli, y se clonó en el plásmido BSKS. Se llevó a cabo la secuenciación de los nucleótidos para verificar que se había obtenido el clon correcto. El fragmento PSP/NTN se cortó utilizando Nde I y Bam H1 y se clonó en los sitios correspondientes del vector de expresión bacteriano
pET30a.

La segunda quimera, denominada NTN/PSP (SEQ ID NO: 146, figura 20), codifica para la molécula opuesta. Contiene los primeros 67 residuos de la neurturina murina madura (utilizando los codones preferidos de E. coli) combinados con los residuos 64 a 96 de la persefina murina madura. Para construir esta molécula, se llevaron a cabo dos reacciones de PCR: 1) utilizando el cebador directo M2012 y el cebador inverso M2183 (5'-CACATCAGCATAGCTGGTGGGCTGGCAGCACGGGTGAGCACGAGCACGTT, SEQ ID NO: 147) y el plásmido de neurturina madura pET30a (codones preferidos de E. coli) como molde; y 2) utilizando el cebador directo M2187 (5'-TGCTGCCAGCCCACCAGCTATGCTG, SEQ ID NO: 148) y el cebador inverso M2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT, SEQ ID NO: 145) y el plásmido de persefina murina pET3Oa como molde. Ambas reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando los parámetros siguientes: 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s, 72ºC durante 30 s x 25 ciclos. Los productos de estas dos reacciones de PCR se utilizaron para construir el plásmido final NTN/PSP pET30a tal como se detalló anteriormente para PSP/NTN, excepto en que se utilizó Bgl II en lugar de Bam H1. Estas proteínas quiméricas se produjeron en E. coli y se purificaron mediante cromatografía con Ni-NTA, tal como se describió anteriormente (ejemplo 13).

Las proteínas purificadas se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para estimular la supervivencia en el ensayo de las neuronas simpáticas de SCG. La proteína NTN/PSP no estimuló la supervivencia, mientras que la proteína PSP/NTN estimuló la supervivencia de las neuronas simpáticas de forma similar a la observada para la propia neurturina. Estos resultados indican que los residuos de neurturina que se encuentran en el sentido 3' de los 2 residuos de cisteína adyacentes, altamente conservados, son críticos para la actividad en la estimulación de la supervivencia en las neuronas simpáticas de SCG. Por el contrario, los residuos correspondientes de persefina no son suficientes para estimular la supervivencia en las neuronas simpáticas.

Ejemplo 17

Este ejemplo ilustra la actividad de estimulación de la supervivencia neuronal de persefina en las células del mesencéfalo.

El perfil de actividad de estimulación de la supervivencia de persefina es diferente del de la neurturina y el GDNF. A diferencia de la actividad de estimulación de la supervivencia producida por neurturina y GDNF en las neuronas sensitivas y simpáticas, la persefina no mostró actividad de estimulación de la supervivencia en estos tejidos. Se evaluó adicionalmente la actividad de estimulación de la supervivencia neuronal de la persefina en las células del
mesencéfalo.

Se adquirieron ratas Sprague-Dawley en estado de gestación de Harlan Sprague-Dawley. Se obtuvo el mesencéfalo de las ratas que medía de 1,2 a 1,4 cm de longitud y se determinó que correspondían al día embrionario 14. El cráneo se extrajo y la totalidad del mesencéfalo se colocó en medio L15 frío. El tejido de mesencéfalo reunido se resuspendió en un medio sin suero que consistió en DME/F12 de Ham (nº 11330-032, Life Technologies), BSA 1 mg/ml, Fracción V (A-6793, Sigma Chemical Co.,), insulina 5 \muM (I-5500, Sigma), progesterona 10 nM (P0130, Sigma), putrescina 100 \muM (p7505, Sigma), selenio 30 nM (S07150, Pflatz & Bauer), transferrina de rata 10 ng/ml (012-000-050, Jackson Chrompure), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 U/ml. Los tejidos mesencefálicos reunidos se trituraron aproximadamente 80 veces utilizando una pipeta con la punta curvada y las células se sembraron en una placa de 24 pocillos (CoStar) a una densidad de 15.000 células en una gota de 100 \mul. Las placas se recubrieron con poli-d-lisina 125 ng/ml (p-7280, Sigma) y laminina 25 ng/ml (nº 40232, Collaborative Biomedical Products). Se dejó que estas células disociadas se unieran durante 2 horas a 37ºC en el 5% de CO_{2} y después se alimentaron con otros 500 \mul del medio sin suero anterior con aproximadamente persefina recombinante 10 ng/ml o sin ésta. Estas células se fotografiaron tras 3 días de cultivo.

La inspección de las células durante el transcurso de los 3 días en cultivo mostró una disminución gradual en el número de células. En ausencia de cualquier factor de crecimiento, casi todas las células murieron (figura 21A). En presencia de persefina, fue evidente un gran aumento en la supervivencia de las células neuronales del mesencéfalo (figura 21B).

Ejemplo 18

Este ejemplo ilustra la expresión de persefina en diversos tejidos.

Se llevó a cabo un estudio de expresión de persefina en tejidos de ratón adulto utilizando RT/PCR semi-cuantitativa (véase el ejemplo 9). Se aisló ARN poli-A de cerebro, cerebelo, riñón, pulmón, corazón, ovario, nervio ciático, ganglios de la raíz dorsal, sangre y bazo. Éste se sometió después a transcripción inversa para producir ADNc (véase Kotzbauer et al., Nature 384:467-470, 1996). Los cebadores de PCR utilizados fueron los siguientes: cebador directo: 5'-CCTCGGAGGAGAAGGTCATCTTC (SEQ ID NO: 149) y cebador inverso: 5'TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA (SEQ ID NO: 101). Se realizó la PCR durante 26 ciclos con una temperatura de hibridación de 60ºC. Para controlar la presencia de ADN genómico, se utilizaron muestras de ARN que no se habían sometido a transcripción inversa para PCR (por ejemplo, el tejido control mostrado en la figura 22 se marca como "riñón no sometido a RT"). Se encontró que todas las muestras carecían de contaminación por ADN genómico.

Tal como se muestra en la figura 22, se observó una banda de tamaño correcto (160 pb) en la muestra de riñón. Con número de ciclos superior, también se observó una banda de persefina en el cerebro. Por tanto, la distribución de la expresión de persefina en diversos tejidos de ratón difiere de la de la neurturina en la rata (ejemplo 8).

\newpage

Depósito de cepas. La siguiente cepa está en depósito bajo las condiciones del Tratado de Budapest, con la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. El número de registro indicado se asignó tras pruebas de viabilidad satisfactorias y una vez pagadas las tasas requeridas.

Cepa	Fecha de depósito	Nº. ATCC
DG44CHO-pHSP-NGFI-B	25 de agosto de 1995	CRL 11977

<110> UNIVERSIDAD DE WASHINGTON

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<112> PERSEFINA Y FACTORES DE CRECIMIENTO RELACIONADOS

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<130> N74088 TJD

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<140> 97917509.8

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<141> 1997-03-14

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<150> US 08/615.944

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<151> 1996-03-14

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<160> 176

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<170> PatentIn Ver 2.1

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<210> 1

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

6

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<210> 2

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<211> 100

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

7

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<210> 3

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<220>

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<221> MOD RES

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<222> 6

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<223> CUALQUIER AMINOÁCIDO

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<400> 3

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\sa{Ser Gly Ala Arg Pro Xaa Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Ser Val Ser}

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<210> 4

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<220>

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<221> MOD RES

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<222> 1

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<223> CUALQUIER AMINOÁCIDO

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<220>

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<221> MOD RES

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<222> 6

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<223> Ser O Cys

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<400> 4

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\sa{Xaa Cys Ala Gly Ala Xaa Glu Ala Ala Val}

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<210> 5

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<211> 23

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<220>

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<221> MOD RES

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<222> 1

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<223> CUALQUIER AMINOÁCIDO

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<220>

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<221> MOD RES

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<222> 2

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<223> CUALQUIER AMINOÁCIDO

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<220>

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<221> MOD RES

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<222> 17

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<223> Gln O Glu

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<400> 5

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\sa{Xaa Xaa Val Glu Ala Lys Pro Cys Cys Gly Pro Thr Ala Tyr Glu Asp}

\sac{Xaa Val Ser Phe Leu Ser Val}

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<210> 6

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<400> 6

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\sa{Tyr His Thr Leu Gln Glu Leu Ser Ala Arg}

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<210> 7

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<211> 197

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

8

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<210> 8

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<211> 195

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 8

9

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<210> 9

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<211> 306

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

10

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<210> 10

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<211> 300

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 10

11

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<210> 11

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<211> 591

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

12

13

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<210> 12

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<211> 585

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 12

14

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<210> 13

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<211> 348

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 13

15

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<210> 14

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<211> 87

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 14

500

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<210> 15

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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\sa{Het Gln Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Ala Ser Val Leu Cys Ser Ser}

\sac{Val Leu Ser}

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<210> 16

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 16

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\sa{Het Arg Arg Trp Lys Ala Ala Ala Leu Val Ser Leu Ile Cys Ser Ser}

\sac{Leu Leu Ser}

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<210> 17

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCAGCGCT GGAAGGCGGC GGCCTTGGCC TCAGTGCTCT GCAGCTCCGT GCTGTCC

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAGGCGCT GGAAGGCAGC GGCCCTGGTG TCGCTCATCT GCAGCTCCCT GCTATCT

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr O Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu O Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: región conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr O Val O Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr O Phe

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Cys Arg Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Ser Phe Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa Xaa Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile O Thr O Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr O Phe

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Cys Arg Pro Xaa Ala Xaa Xaa Asp Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr O Phe

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Ser Phe Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu O Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile O Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu O Val

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile O Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNWSNGANY TNGGNYTNGG NTA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYMGNTAYT GYDSNGGNDS NTGYGANKCN GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGMNTCRC ANSHNCCNSH RCARTANCKR AA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCRTCNTCRW ANGCNRYNGG NCKRCARCA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCNARRAANS WNAVNTCRTC NTCRWANGC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GARRMNBTNH TNTTYMGNTA YTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GARRMNBTNH TNTTYMGNTA YTGYDSNGGN DSNTGHGA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Ala Arg Pro Xaa Gly Leu Arg Glu Leu Glu Val Ser Val Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCNACNGCNT AYGARGA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Ala His Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val}

\sac{Ser Phe Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ARYTCYTGNA RNGTRTGRTA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCGAGGTGT CCTTCCTGGA CGTACACA

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGCGGCTGT GTACGTCCAG GAAGGACACC TCGT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCGACGAC GCGTGCGCAA AGAGCG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAYGARGACG AGGTGTCCTT CCTGGACGTA CACAGCCGCT AYCAYAC

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGCCATCC GCATCTACGA CCTGGG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CRTAGGCCGT CGGGCGRCAR CACGGGT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCCGAAGG CCCAGGTCGT AGATGCG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCTACTGCG CAGGCGCGTG CGARGCGGC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCGACAGC TCTTGCAGCG TRTGGTA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCTGGGCC TGGGCTACGC GTCCGACGAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGACGCGTA CCATGAGGCG CTGGAAGGCA GCGGCCCTG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGGATCCG CATCACACGC ACGCGCACTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCATATGC CGGGGGCTCG GCCTTGTGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGGATCCG CATCACACGC ACGCGCGCACTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCGACGAC GCGTGGCGCAA AGAGCG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGCGGCTGGT GTTTACGTCCAG GAAGGACACC TCGT

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAATCGGG GGTGYGTCTT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGCCTGGC CTACYTTGTC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGCGTCCC AMCAAGGGTC TTCG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGTGGTG CCGTCGAGGC GGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCCAGGAT GAGGCGCTGG AAGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATCTCCACT GCCTGAWATT CWACCCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATGTGATT ATCGACCATT CGGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

41

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCTCAGAG GAGAAGATTA TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Glu Glu Lys Ile Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Leu Gly Tyr Thr Ser Asp Glu Thr Val Leu Phe Arg Tyr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys Ile Ile Phe Arg Tyr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTCGGGGTT GGGGTATGCC TCA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATGCCTCAG AGGAGAAGAT TATCTT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Cys Cys Arg Pro Val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp}

\sac{Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Cys Cys Arg Pro Thr Ala Tyr Glu Asp Glu Val Ser Phe Lys Asp}

\sac{Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Cys Cys Gln Pro Thr Ser Tyr Ala Asp Val Thr Phe Leu Asp Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATCAAGGA AGGTCACATC AGCATA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACCACAGC CACAAGCTGC GGSTGAGAGC TG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Ala Gly Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento génico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 544

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser, Thr, O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp, Glu O NINGÚN AMINOÁCIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Xaa Xaa Xaa Phe Leu Asp Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Pro Gly Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Glu O Lys

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val, Leu O Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu O Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Xaa Xaa Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia conservada

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg O Gln

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Val O Ile

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr O Phe

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu, Asp O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu, Asp O NINGÚN AMINOÁCIDO

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Thr

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp O Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Cys Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Phe Leu Asp Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNDGNGANY TGGGNYTGGG NTA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GANBTNWCNT TYYTNGANG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GANBTNWCNT TYYTNGANGW

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYMGNTAYT GYDSNGGNDS NTG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNDGNGANY TGGGNYTNGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNDGNGANY TGVGGNYTGGG NTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

WCNTCNARRA ANGWNAVNTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

WCNTCNARRA ANGWNAVNT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CANSHNCCNS HRCARTANCK RAA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CANSHNCCNS HRCARTANCK RAANA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp O Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val O Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr O Ser

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp O Glu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp O Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Phe Leu Xaa Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp O Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu O Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Xaa Xaa Leu Gly Leu Gly Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: base para el cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ile O Leu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser O Ala

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Phe Arg Tyr Cys Xaa Gly Xaa Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

55

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

57

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus rattus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATCCCCAGG ACAGGCAGGG AAT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTACCCAG ATCTTCAGCC ACCACAGCCA CAAGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

501

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGTACCCAG ATCTTCAGCC ACCACAGCCA CAAGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: quimera

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATACGACT CACTATAGGG GAA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTCTTCGT AAGCAGTCGG ACGGCAGCAG GGTCGGCCAT GGGCTCGAC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTGCCGTC CGACTGCTTA CGAAGACGA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTATGCTAG TTATTGCTCA GCGGT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: quimera

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACATCAGCA TAGCTGGTGG GCTGGCAGCA CGGGTGAGCA CGAGCACGTT

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCTGCCAGC CCACCAGCTA TGCTG

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCGGAGGA GAAGGTCATC TTC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

64

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

65

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>155

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 162

76

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<210> 163

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 163

77

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<210> 164

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<211> 103

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 164

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78

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<210> 165

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<210> 167

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<211> 101

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 167

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<211> 103

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<210> 169

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<211> 105

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 169

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<210> 170

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<211> 99

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 170

84

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<210> 171

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<211> 102

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 171

85

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<210> 172

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<211> 94

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 172

86

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<210> 173

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<211> 95

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: dominio alineado

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<400> 173

87

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<210> 174

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<211> 291

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<400> 174

88

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<210> 175

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<211> 405

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<400> 175

89

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<210> 176

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<211> 291

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia clonada

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<400> 176

Claims (14)

1. Polipéptido aislado y purificado que comprende una secuencia de 89 aminoácidos contiguos, teniendo dicha secuencia los aminoácidos en las posiciones indicadas entre paréntesis:

Cys (1), Leu (3), Val (10), Leu (13), Gly (14), Leu (15), Gly (16), Tyr (17), Glu (21), Phe (25), Arg (26), Tyr (27), Cys (28), Gly (30), Cys (32), Leu (44), Leu (47), Cys (58), Cys (59), Pro (61), Asp (66), Phe (69), Leu (70), Asp (71), Ser (83), Ala (84), Cys (84) y Cys (89),

identificándose dichas posiciones por la alineación con la SEQ ID NO: 79 o la SEQ ID NO: 82; en el que dicha secuencia tiene al menos una identidad del 85% con la SEQ ID NO: 79 o la SEQ ID NO: 82.

2. Polipéptido aislado y purificado según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido estimula la supervivencia de las células del mesencéfalo.

3. Polipéptido aislado y purificado según la reivindicación 1 ó 2, que comprende la SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 o SEQ ID NO: 83.

4. Polipéptido aislado y purificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. Ácido nucleico aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Vector que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende elementos de regulación de la expresión unidos de manera operativa a un ácido nucleico según la reivindicación 5.

7. Célula huésped aislada transformada con un vector según la reivindicación 6.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, en la que dicha célula huésped es una célula de mamífero, una célula bacteriana o un sistema de expresión de baculovirus.

9. Método de ADN recombinante que comprende:

(a) subclonar un polinucleótido que comprende una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido tal como se define en la reivindicación 1, en un vector de expresión que comprende los elementos de regulación necesarios para expresar la secuencia de ADN;

(b) transformar una célula huésped con dicho vector de expresión;

(c) hacer crecer la célula huésped en un cultivo de célula huésped; y

(d) recoger el polipéptido y/o el ADN polinucleotídico del cultivo de la célula huésped.

10. Anticuerpos aislados y purificados que pueden reaccionar específicamente con un polipéptido, tal como se define en la reivindicación 1 o un epítopo de los mismos.

11. Uso de un polipéptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o de una molécula de ADN que codifica para dicho polipéptido, en la fabricación de un medicamento para su uso en un método para prevenir o tratar la insuficiencia o la degeneración celular, en el que la insuficiencia o la degeneración celular es degeneración neuronal que resulta de un estado seleccionado del grupo que consiste en neuropatía periférica, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular isquémico, lesión cerebral aguda, lesión de la médula espinal aguda, tumores en el sistema nervioso, esclerosis múltiple e infección.

12. Método para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente, que comprende hacer reaccionar anticuerpos según la reivindicación 10 con un factor de crecimiento presente en la muestra y detectar la unión de los anticuerpos con el factor de crecimiento.

13. Método para detectar la presencia de un factor de crecimiento en una muestra de un paciente, que comprende detectar y/o cuantificar la presencia en la muestra de ARNm que codifica para un polipéptido, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

14. Método para estimular el crecimiento y/o la diferenciación de una célula en un medio de cultivo, que comprende añadir al medio de cultivo un polipéptido, tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.