DE69732350T2

DE69732350T2 - Persephin und verwandte wachstumsfaktoren

Info

Publication number: DE69732350T2
Application number: DE69732350T
Authority: DE
Inventors: M. Eugene JOHNSON; D. Jeffrey MILBRANDT; T. Paul KOTZBAUER; A. Patricia LAMPE
Original assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2017-03-15
Also published as: US6645937B1; ATE287953T1; DE69732350D1; JP2000507813A; US6403335B1; EP0886651A1; WO1997033911A1; NZ329482A; AU2580497A; AU716846B2; US6692943B1; ES2237793T3; EP0886651B1; EP0886651A4; US6232449B1; CA2225913A1

Description

Hintergrund der Erfindung
(1) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Nahrungs- oder Wachstumsfaktoren und insbesondere neue Wachstumsfaktoren der Neurturin-GDNF-Familie von Wachstumsfaktoren.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
Die Entwicklung und das Aufrechterhalten von Geweben in komplexen Organismen erfordert die präzise Kontrolle über die Prozesse der Zellvermehrung, -differenzierung, des -fortbestands bzw. -überlebens und der -funktion. Ein Hauptmechanismus, durch den die Prozesse kontrolliert bzw. reguliert werden, verläuft über die Wirkungen von Polypeptiden, welche als "Wachstumsfaktoren" bekannt sind. Diese strukturell unterschiedlichen Moleküle wirken durch spezifische Zelloberflächenrezeptoren unter Hervorrufen dieser Wirkungen.
Wachstumsfaktoren, bezeichnet als "neurotrophe Faktoren", fördern die Differenzierung, das Wachstum und den Fortbestand/das Überleben von Neuronen und befinden sich in dem Nervensystem oder in innervierenden Geweben. Der Nervenwachstumsfaktor (NGF) war der erste neurotrophe Faktor, welcher identifiziert und charakterisiert werden konnte (Levi-Montalcini et al., J. Exp. Zool. 116: 321, 1951). NGF existiert als ein nicht-kovalent gebundenes Homodimer, welches den Fortbestand und das Wachstum von sympathischen, Neuralleisten-abgeleiteten Sensoren und von cholinergen Basalvorderhirnneuronen fördert. In sympathischen Neuronen bildet diese Substanz einen Neurit-Auswuchs in vitro und ein erhöhtes axonales und dendritisches Wachstum in vivo. (Siehe Levi-Montalcini und Booker, Proc Nat'l Acad Sci 46: 384, 1960; Johnson et al. Science 210: 916–918, 1980; Crowley et al., Cell 76: 1001–12, 1994).
NGF weist Wirkungen auf die Erkennung und neuronale Formbarkeit auf und kann den Fortbestand bzw. das Überleben von Neuronen, welche aufgrund einer Vielzahl von mechanischen, chemischen, viralen und immunologischen Einflüssen einen Schaden erlitten haben, unterstützen bzw. fördern (Snider und Johnson, Ann Neurol 26: 489–506, 1989; Hefti, J Neurobiol 25: 1418–35, 1994). NGF ist ebenso dafür bekannt, mit dem endokrinen System und Immun- und Entzündungsprozessen erheblich wechselzuwirken. (Zusammengefasst in Scully und Otten, Cell Biol Int 19: 459–469, 1995; Otten und Gadient, Int. J. Deut Neurosci 13: 147–151, 1995). Beispielsweise fördert NGF das Überleben vom Mastzellen. (Horigome et al. J Biol Chem 269: 2695–2707, 1994).
In den vergangenen Jahren zeigte sich, dass Wachstumsfaktoren sich in Klassen einteilen lassen, d. h. Familien oder Superfamilien, auf der Basis von Ähnlichkeiten in deren Aminosäuresequenzen. Diese Familien umfassen beispielsweise die Familie der Fibroblast-Wachstumsfaktoren, die Neurotrophin-Familie und die Familie der transformierenden Wachstumsfaktoren-beta (TGF-β). Als ein Beispiel für Familienmitglied-Sequenzähnlichkeiten besitzen die TGF-β-Familienmitglieder sieben kanonische Gerüst-Cystein-Reste, welche die Mitglieder dieser Superfamilie identifizieren.
NGF ist der Prototyp solch einer Familie von Wachstumsfaktoren. Der Hirnabgeleitete neurotrophe Faktor (brain-derived neurotrophic factor, BDNF), das zweite Mitglied dieser zu entdeckenden Familie, zeigte sich als zu NGF verwandt aufgrund des Beibehalts sämtlicher sechs Cysteine, welche die drei inneren Disulfide des NGF-Monomeren bilden (Barde, Prog Growth Factor Res 2: 23 7–248, 1990 und Liebrock et al. Nature 341: 149–152, 1989). Unter Verwendung der Information vermittelt durch BDNF der hochkonservierten Anteile der zwei Faktoren wurden zusätzliche Mitglieder (NT-3, NT-4/5) dieser Neutrotrophinfamilie durch verschiedene Gruppen schnell gefunden (Klein, FASEB J 8: 738–44, 1994).
Strukturell zu NF unverwandte neutrotrophe Faktoren wurden kürzlich identifiziert. Diese umfassen Faktoren, welche ursprünglich auf der Basis einer "neurotrophen Wirkung" isoliert wurden, wie der ziliäre neurotrophe Faktor (CNTF) (Lin et al., Science 246: 1023–5, 1989), zusammen mit anderen ursprünglich als Ergebnis von nicht-neuronalen Aktivitäten Isolierten (z. B. Fibroblast-Wachstumsfaktoren (Cheng und Mattson, Neuron 1: 1031–41, 1991), IGF-I (Kanje et al, Brain Res 486: 396–398, 1989), Leukämie-inhibierender Faktor (Kotzbauer et al., Neuron 12: 763–773, 1994)).
Der Glial-abgeleitete neurotrophe Faktor (GDNF) ist ein solcher neurotropher Faktor, welcher strukturell unverwandt ist zu NGF. GDNF war folglich ein einzelner Faktor, welcher bis jetzt nicht als ein Mitglied irgendeiner Subfamilie von Faktoren bekannt war. Die Entdeckung, Reinigung und Klonierung von GDNF resultierte aus der Suche nach Faktoren, welche für das Überleben von dopaminergen Mittelhirnneuronen entscheidend sind, welche in der Parkinsonschen Krankheit degenerieren. GDNF wurde aus Ratten-B49-Glial-Zellen-konditionierten Medien (Lin et al., Science 260: 1130–2, 1993) aufgereinigt. Die Sequenzanalyse zeigte es als ein entferntes Mitglied der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren mit ungefähr 20% Identität auf der Basis in erster Linie der charakteristischen Aneinanderreihung der sieben kanonischen Gerüstcysteinreste (Lin et al., Science 260: 1130–2, 1993). Folglich könnte GDNF möglicherweise eine neue Unterfamilie innerhalb der TGF-β-Superfamilie darstellen.
In Bakterien gebildetes rekombinantes GDNF fördert spezifisch den Fortbestand bzw. das Überleben und die morphologische Differenzierung von dopaminergen Neuronen (Lin et al., Science 260: 1130–2, 1993); Tomac et al., Nature 373: 335–9, 1995; Beck et al., Nature 373: 339–41, 1995 und Ebendal et al., J Neurosci Res 40: 276–84, 1995) und Motorneuronen (Henderson et al., Science 266: 1062–4, 1994; Yan et al., Nature 373: 344–6, 1995). Insgesamt war GDNF ein potenterer Faktor für die Förderung des Fortbestands von Motorneuronen als die anderen Faktoren, und es war der einzige Faktor, welcher eine neuronalen Atrophie als Antwort auf diese Läsionen verhinderte, wodurch es sich als ein vielversprechendes Therapeutikum für Motorneuronerkrankungen darstellte.
Es wird jetzt allgemein angenommen, dass neurotrophe Faktoren viele Aspekte der neuronalen Funktion regulieren, einschließlich des Fortbestands bzw. Überlebens und der Entwicklung im fötalen Stadium, sowie der strukturellen Beständigkeit und Formbarkeit im Alter. Da sowohl akute Nervensystemerkrankungen als auch chronische neurodegenerative Erkrankungen durch strukturelle Schädigungen und möglicherweise durch erkrankungsinduzierte Apoptose gekennzeichnet sind, ist es wahrscheinlich, dass neurotrophe Faktoren in diesen Erkrankungen eine gewisse Rolle spielen. In der Tat sprechen viele Beweise dafür, dass neurotrophe Faktoren wertvolle therapeutische Mittel zur Behandlung dieser neurodegenerativen Erkrankungen darstellen können, welche möglicherweise die sozial und ökonomisch zerstörerischsten Erkrankungen darstellen, welche derzeit unsere Gesellschaft bedrohen. Nichts desto trotz verbleibt ein anhaltender Bedarf an der Identifizierung neuer Mitglieder von Familien neurotropher Faktoren zur Verwendung in der Diagnose und Behandlung von einer Vielzahl von akuten und chronischen Erkrankungen des Nervensystems, weil unterschiedliche neurotrophe Faktoren potenziell hauptsächlich durch unterschiedliche Rezeptoren und auf unterschiedlichen neuronale oder nicht-neuronale Zelltypen wirken.
Zusammenfassung der Erfindung
Kurz gesagt richtet sich die vorliegende Erfindung daher auf die Identifizierung und Isolierung von im Wesentlichen aufgereinigten Faktoren, welche den Fortbestand bzw. das Überleben und das Wachstum von Neuronen sowie von nicht-neuronalen Zellen unterstützen. Folglich hatten die Erfinder hierin Erfolg in der Entdeckung neuer Proteinwachstumsfaktoren, welche zu einer Familie von Wachstumsfaktoren gehören, für die GDNF das erste bekannte Mitglied war. Das erste solche neu entdeckte Familienmitglied war Neurturin, und dieses ist Gegenstand der EP-Veröffentlichung EP 787 142 . Auf der Basis der Sequenz von GDNF und Neurturin haben die Erfinder hierin ein weiteres Mitglied der GDNF-Neurturin-Familie von Wachstumsfaktoren entdeckt, welches hierin als Persephin (PSP) bezeichnet wird. Man nimmt an, dass dieser Wachstumsfaktor mindestens 85% Sequenzidentität unter homologen Sequenzen unterschiedlicher Säugerarten zeigt, obwohl die Sequenzhomologie in Nichtsäuger-Arten, wie bei Vogelarten, bis zu lediglich 65% betragen kann. Persephin-Proteine, welche hierin angegeben sind, umfassen Maussequenzen, wie sie in den SEQ ID NOS: 79, 80 und 81 (11; jeweils die Aminosäurereste 52 bis 140, 47 bis 142 und 9 bis 142) dargestellt sind, und Rattensequenzen, wie sie in SEQ ID NOS: 82 und 83 (14; jeweils Aminosäurereste 1 bis 89 und 1 bis 91) angegeben sind. Zusätzlich wird menschliches Persephin mittels dessen mindestens 85%-iger Sequenzhomologie mit seinem orthologen, reifen Mauspersephin, zusammen mit der Identifizierung bestimmter konservierter bzw. erhaltener Aminosäurereste, welche im menschlichem Persephin enthalten sind, wie in 15 gezeigt ist, identifiziert. Folglich wird angenommen, dass menschliches Persephin 28 Aminosäuren in der ausgerichteten bzw. aneinandergehängten Sequenz zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüstcysteinresten aufweist, wie es in 15 dargestellt ist, wobei die Reste, welche von dem N-terminalen Ende der aneinandergereihten Sequenz des Familienmitglieds nummeriert sind, darstellen (1) Cys, (3) Leu, (10) Val, (13) Leu, (14) Gly, (15) Leu, (16) Gly, (17) Tyr, (21) Glu, (25) Phe, (26) Arg, (27) Tyr, (28) Cys, (30) Gly, (32) Cys, (44) Leu, (47) Leu, (58) Cys, (59) Cys, (61) Pro, (66) Asp, (69) Phe, (70) Leu, (71) Asp, (83) Ser, (84) Ala, (87) Cys und (89) Cys.
Persephin wurde durch ein Verfahren, welches auf den erhaltenen Regionen der GDNF-Neurturin-Familie basiert, von den Erfindern hierin entdeckt, identifiziert und erhalten. Folglich wurde ein neues Verfahren entdeckt, welches degenerierte Primer, die aus den Sequenzen dieser erhaltenen Regionen aufgebaut sind, zur Verwendung in dem Polymerase-Kettenreaktionsprozess verwendet. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden die Maus- und Rattenorthologen des neuen Familienmitglieds, Persephin, identifiziert und erhalten.
Das vorliegende Verfahren offenbart folglich sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nucleotidsequenzen, welche Maus- und Rattenpersephin kodieren, wie sie in den Aminosäuresequenzen SEQ ID NOS: 79–83 und den Nucleotidsequenzen SEQ ID NOS: 84 und 85 dargestellt sind. Aufgrund der engen Homologie zwischen den Maus- und Rattensequenzen (95% Sequenzidentität) wird angenommen, dass die menschliche Persephinsequenz eine hohe Sequenzhomologie zu den Maus- und Rattensequenzen aufweist.
Dementsprechend wird gemäß der Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Polypeptid zur Verfügung gestellt, welches eine Sequenz von 89 angrenzenden Aminosäuren umfasst, wobei die Sequenz Aminosäuren mit den in Klammern angegeben Positionen aufweist:
Cys (1), Leu (3), Val (10), Leu (13), Gly (14), Leu (15), Gly (16), Tyr (17), Glu (21), Phe (25), Arg (26), Tyr (27), Cys (28), Gly (30), Cys (32), Leu (44), Leu (47), Cys (58), Cys (59), Pro (61), Asp (66), Phe (69), Leu (70), Asp (71), Ser (83), Ala (84), Cys (87) und Cys (89),
wobei diese Positionen durch Ausrichtung mit der Sequenz SEQ ID NO: 79 oder SEQ ID NO: 82 identifiziert werden, wobei diese Sequenz wenigstens 85%-ige Identität mit SEQ ID NO: 79 oder SEQ ID NO: 82 aufweist.
Die Erfindung stellt ebenso eine isolierte und gereinigte Nucleinsäure zur Verfügung, welche eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert.
Expressionsvektoren und stabil transformierte Zellen liegen ebenso innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Die transformierten Zellen können in einem Verfahren zur Herstellung von Persephin verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenso zur Verfügung:

– einen Vektor, der ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst, das seinerseits die Expression regulierende Elemente umfasst, die mit einer Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung operabel verknüpft sind;
– eine Wirtszelle, die mit einem Vektor der vorliegenden Erfindung transformiert ist; und
– ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA, welches umfasst:
(a) die Subklonierung eines Polynucleotids, das eine ein Polypeptid-kodierende DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung umfasst, in einen Expressionsvektor, der die für die Expression der DNA-Sequenz erforderlichen regulatorischen Elemente umfasst;
(b) die Transformation einer Wirtszelle mit diesem Expressionsvektor;
(c) die Züchtung der Wirtszelle in einer Wirtszellenkultur; und
(d) das Ernten des Polypeptids und/oder der Polynucleotid-DNA aus der Wirtszellenkultur.

In einer weiteren Ausführungsform beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung neuronaler Degenerationen, welches die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von Persephin an einen Patienten, der einen Bedarf aufweist, umfasst. Ein Patient kann ebenso durch Implantieren von transformierten Zellen, welche Persephin oder eine DNA-Sequenz, die Persephin in einen Patienten kodiert, exprimieren, oder von Zellen, welche durch Wachstum in Persephin kultiviert und vermehrt wurden, behandelt werden.
Die Erfindung stellt folglich zur Verfügung:

– die Verwendung eines Polypeptids der Erfindung oder einer Nucleinsäure, welche solch ein Polypeptid kodiert, in der Herstellung eines Medikaments zur Ver wendung in einem Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Zelldegenerationen oder -insuffizienz, wobei die Zelldegeneration oder -insuffizienz eine neuronale Degeneration ist, die verursacht wird durch eine Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus periphärer Neuropathie, amytropher Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Parkinsonismus, Huntington-Chorea, Ischemischem Infarkt, akuter Hirnverletzung, akuter Rückenmarksverletzung, Tumoren des Nervensystems, Multipler Sklerose und Infektionen.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Zusammensetzungen und Verfahren zur Detektierung von Persephin zur Verfügung. Ein Verfahren basiert auf Persephin-Antikörpern, und andere Verfahren basieren auf der Detektion von mRNA oder cDNA oder Genom-DNA, welche Persephin kodieren, unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken.
Die Erfindung stellt folglich ebenso isolierte und gereinigte Antikörper, welche zur spezifischen Reaktion mit einem Polypeptid der Erfindung oder einem Epitop davon in der Lage sind, zur Verfügung.
Unter den zahlreichen gefundenen Vorteilen, welche von der vorliegenden Erfindung erzielt werden, können daher die Bereitstellung eines neuen Wachstumsfaktors, Persephin, zur Verwendung in der Behandlung von Atrophie, der Degeneration oder dem Tod bestimmter Zellen, insbesondere Neuronen; die Bereitstellung von menschlichem Persephin durch Verfügbarmachen der spezifischen Sequenzen von Murin- (mausartig; zu den Mäusen gehörig) und Rattenpersephin, aus denen die menschliche Sequenz identifiziert und erhalten werden kann; die Bereitstellung anderer Mitglieder der Neurturin-Persephin-GDNF-Familie von Wachstumsfaktoren durch Verfügbarmachen neuer Verfahren, die zum Erhalt anderer Familienmitglieder in der Lage sind; die Bereitstellung von Verfahren zum Erhalten von Persephin durch rekombinante Techniken; die Bereitstellung von Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, die eine Zelldegeneration hervorrufen, und insbesondere von neuronaler Degeneration; die Bereitstellung von Verfahren, welche Persephingehalte in einem Patienten detektieren und verfolgen bzw. aufzeichnen können; sowie die Bereitstellung von Verfahren, welche Veränderungen in dem Persephingen detektieren können.
Die Erfindung stellt weiterhin zur Verfügung:

– ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe von einem Patienten, welches die Reaktion von Antikörpern der vorliegenden Erfindung mit einem in der Probe vorliegenden Wachstumsfaktor und den Nachweis der Bindung der Antikörper an den Wachstumsfaktor umfasst;
– ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe von einem Patienten, welches den Nachweis und/oder die Quantifizierung der Anwesenheit von mRNA, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, in der Probe umfasst; und
– ein Verfahren zur Beschleunigung des Wachstums und/oder der Differenzierung einer Zelle in einem Züchtungsmedium, welches die Zugabe eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung zum Züchtungsmedium umfasst.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt das Reinigungsschema zur Herstellung von Neurturin aus CHO-Zellen;
die 2 zeigt die Charakterisierung von Fraktionen, welche von einer Mono S-Säule beim Reinigen von Neurturin eluiert werden, wobei (a) die Elektrophorese einer jeden Fraktion auf einem SDS-Polyacrylamidgel und die Visualisierung der Proteine durch eine Silberfärbung und (b) die neurotrophe Aktivität, welche in einer jeden Fraktion vorliegt, in dem höheren Cervical-Ganglion-Überlebensassay (superior cervical ganglion survival assay) gezeigt ist;
die 3 zeigt die Fähigkeit von Neurturin zum Erhalt des Überlebens von höheren Cervical-Ganglion-Zellen in der Kultur, wobei (a) positive Kontrollzellen, welche mit Nervenwachstumsfaktor (NGF) gehalten werden, (b) negative Kontrollzellen, welche mit Anti-NGF-Antikörpern behandelt sind, wobei ein geringeres Überleben gezeigt ist, und (c) Zellen, die mit Anti-NGF und Neurturin (ungefähr 3 ng/ml) behandelt sind, wobei sich ein Überleben der Neuronen zeigt, dargestellt sind;
die 4 zeigt den Konzentrations-Antwort-Effekt von Neurturin in dem höheren Cervical-Ganglion-Überlebensassay;
die 5 zeigt die Homologie der Aminosäuresequenzen des reifen Wachstumsfaktors, von menschlichem Neurturin (hNTN), Mausneurturin (mNTN), Ratten-GDNF (rGDNF), Maus-GDNF (mGDNF) und menschlichem GDNF (hGDNF) mit identischen Aminosäureresten, die in Kästchen angehängt sind;
die 6 verdeutlicht die Gewebeverteilung von Neurturin-mRNA und von mRNA für GDNF unter Verwendung von RT/PCR-Analyse von RNA-Proben, die am Embryonentag 21 (E21) und von erwachsenen Ratten erhalten werden;
die 7 zeigt die cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz von menschlichem Pre-Pro-Neurturin (SEQ ID NO: 11), worin die Pre-Region von Nucleinsäure 1 bis 57 (SEQ ID NO: 17), die Pro-Region von Nucleinsäure 58 bis 285 (SEQ ID NO: 20), menschliches Neurturin von Nucleinsäure 286 bis 591 (SEQ ID NO: 9) und die Spleißstelle zwischen Nucleinsäuren 169 und 170, welche den kodierenden Sequenzteil von zwei Exons von den Nucleinsäuren 1 bis 169 (SEQ ID NO: 27) und 170 bis 594 (SEQ ID NO: 28) definiert, gezeigt ist;
die 8 zeigt die cDNA und die kodierte Aminosäuresequenz von Maus-Pre-Pro-Neurturin (SEQ ID NO: 12), wobei die Preregion von Nucleinsäuren 1 bis 57 (SEQ ID NO: 18), die Pro-Region von Nucleinsäuren 58 bis 285 (SEQ ID NO: 21), Maus-Neurturin von Nucleinsäuren 286 bis 585 (SEQ ID NO: 10) und die Spleißstelle zwischen Nucleinsäuren 169 und 170, welche den kodierenden Sequenzteil von zwei Exons von Nucleinsäuren 1 bis 169 (SEQ ID NO: 29) und 170 bis 588 (SEQ ID NO: 30) definiert, angegeben ist;
die 9 zeigt die Maus-cDNA-Sequenz, welche einen 5'-nichtkodierenden Bereich (SEQ ID NO: 13) und einen 3'-nichtkodierenden Bereich (SEQ ID NO: 14) enthalten, welche jeweils an den kodierenden Bereich des Pre-Pro-Neurturins angrenzen;
sdie 10 zeigt das prozentuale neuronale Überleben in E18-Ratten-Knoten-Ganglianeuronen, die 24 Stunden hinsichtlich NTN, GDNF, BDNF, NGF und AMO Post-Plating behandelt wurden;
die 11 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von Murin-Persephin (SEQ ID NOS: 79, 80 und 81; Aminosäurereste 52 bis 140, 47 bis 142, und 9 bis 142 jeweils);
die 12 zeigt die Familienmitgliedssequenzidentität in dem Bereich zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüstcysteinresten, welche beginnend mit dem ersten kanonischen Gerüstcystein für Murin-GDNF (SEQ ID NO: 87), Murin-Neurturin (NTN) (SEQ ID NO: 88) und Murinpersephin (PSP) (SEQ ID NO: 89) ausgerichtet sind;
die 13 zeigt die Teilsequenz von Rattenpersephin-cDNA (SEQ ID NO: 97), erhalten durch die Technik der schnellen Vervielfältigung von cDNA-Enden;
die 14 zeigt die Teilsequenz, beginnend mit dem ersten kanonischen Gerüstcystein für Rattenpersephin (SEQ ID NO: 83) und die korrespondierende Polynucleotid-Sequenz (SEQ ID NO: 86);
die 15 zeigt die ausgerichteten Teilaminosäuresequenzen des Familienmitglieds von den ersten bis siebten kanonischen Gerüstcysteinresten, welche die Familienmitgliedssequenzhomologie der reifen Wachstumsfaktoren, von menschlichem GDNF, Ratten-GDNF, Maus-GDNF, menschlichem Neurturin (NTN), Maus-Neurturin, Rattenpersephin (PSP) und Mauspersephin zeigen, wobei in den Kästchen die 28 erhaltenen Aminosäurereste, die in allen vorliegen, angehängt sind;
die 16 zeigt die Sequenzen von TGF-β-Superfamilienmitgliedern, die unter Verwendung der Clustal-Methode ausgerichtet wurden, von dem ersten kanonischen Gerüstcystein zu dem Ende der Sequenz zur Transformierung des Wachstumsfaktors-β1 (TGFβ1), zur Transformierung des Wachstumsfaktors-β2 (TGFβ2), zur Transformierung des Wachstumsfaktors-β3 (TGFβ3), Inhibin-βA-(INHβA), Inhibin-βB-(INHβB), das Nodal-Gen (NODAL), morphogenetische Knochenproteine 2 und 4 (BMP2 und BMP4), das Drosophiladecapentaplegic-Gen (dpp), die morphogenetischen Knochenproteine 5–8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8), die Drosophila-60A-Genfamilie (60A), das morphogenetische Knochenprotein 3 (BMP3), das Vg1-Gen, die Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und 3 (GDF1 und GDF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α-(INHα), der MIS-Gen (MIS), Wachstumsfaktor 9 (GDF-9), der Glial-abgeleitete neutrotrope Wachstumsfaktor (GDNF) und Neurturin (NTN);
die 17 zeigt die volle Länge des Murin-Persephingens (SEQ ID NO: 131), die Aminosäuresequenz, welche mindestens einen Teil der Pre-Pro-Region enthält, die von der Nucleotidsequenz kodiert wird in dem ersten Ableserahmen von dem Initiatormethionincodon bis zu dem Stopcodon an den Nucleotidpositionen 244–246 (SEQ ID NO: 132), und die Aminosäuresequenz, welche reifes Persephin in dem zweiten Ableserahmen von der Nucleotidposition 2 bis zu dem Stopcodon bei den Positionen 557–559 (SEQ ID NO: 133) enthält;
die 18 zeigt die volle Länge des Rattenpersephingens (SEQ ID NO: 134), die Aminosäuresequenz, welche mindestens einen Teil des Pre-Pro-Abschnitts enthält, welcher durch die Nucleotidsequenz kodiert wird in dem ersten Ableserahmen von dem Initiatormethionincodon bis zu dem Stopcodon an den Nucleotidpositionen 244–246 (SEQ ID NO: 135), und die Aminosäuresequenz, welche reifes Persephin in dem zweiten Ableserahmen von der Nucleotidposition 2 bis zu dem Stopcodon an den Positionen 557–559 (SEQ ID NO: 136) enthält;
die 19 zeigt eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Persephin-Antikörpern zum Nachweis von Persephinprotein in Celllysaten von COS-Affenzellen, die mit Murin-Persephingen (Reihe 2) oder dem Rattenpersephingen (Reihe 3) transfiziert sind, im Vergleich zu Zellen, welche mit dem nichtrekombinanten Vektor alleine (pCB6, Reihe 4) und dem reifen Protein, welches von E. Coli gebildet wurde (Reihe 1) transfiziert sind;
die 20 zeigt Murin-Chimären-Moleküle (A) PSP/NTN, enthaltend das Persephin-Fragment (Reste 1–63) und das Neurturin-Fragment (Reste 68–100), und (B) NTN/PSP, enthaltend das Neurturin-Fragment (Reste 1–67) und das Persephin-Fragment (Reste 64–96), wobei der Pfeil den Crossover-Punkt/Kreuzpunkt jeweils anzeigt;
die 21 zeigt den überlebensfördernden Effekt von Persephin in Murin-Mittelhirnzellen am embryonalen Tag 14, kultiviert innerhalb von drei Tagen (a) in Abwesenheit von Persephin, wobei fast alle Zellen abgestorben sind, und (b) in Anwesenheit von Persephin (100 ng/ml), wobei ein deutliches Überleben der neuronalen Zelle ersichtlich ist; und
die 22 zeigt einen RT/PCT-Test für die Persephinexpression in Geweben von erwachsenen Mäusen, wobei eine Persephinexpression durch die Nierenzellen gezeigt wird.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung, Isolierung und Sequenzierung eines DNA-Moleküls, welches einen neuen Wachstumsfaktor, Persephin, kodiert. Aufgrund der Sequenzähnlichkeit zu Neurturin und GDNF wird angenommen, dass Persephin zum Unterstützen des Zellüberlebens bzw. -fortbestands und insbesondere des Überlebens von Neuronen in der Lage ist. Vor dieser Erfindung war Persephin unbekannt und war weder als einzelne biologische Substanz identifiziert worden, noch wurde sie in reiner Form isoliert.
Der Wachstumsfaktor Neurturin (NTN) wurde wie in der EP-Veröffentlichung EP 0 787 142 angegeben identifiziert und isoliert. Aus der Sequenz von Neurturin und der Sequenz des eng verwandten Wachstumsfaktors, des Glial-abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF), haben die Erfinder hierin Strategien entwickelt und abgeleitet, um zusätzliche verwandte Faktoren aufzufinden. Neurturin ist ungefähr 40% identisch zu GDNF, allerdings weniger als 20% identisch zu irgendeinem anderen Mitglied der TGF-β-Superfamilie. Zusammen definieren diese beiden Proteine eine neue Subfamilie innerhalb der TGF-β-Superfamilie. Verschiedene Sequenzabschnitte innerhalb von Neurturin und GDNF wurden identifiziert, welche äußerst erhalten sind, sodass es wahrscheinlich ist, dass sie in jedem zusätzlichen Mitglied dieser Subfamilie vorliegen. Diese Sequenzinformation kann daher verwendet werden, um vorher unbekannte Mitglieder dieser Subfamilie durch den Entwurf von degenerierten Oligonucleotiden, welche entweder als Primer in PCR-Reaktionen oder als Sonden in Hybridisierungsstudien verwendet werden, zu isolieren.
Unter Verwendung der PCR-Strategie mit degeneriertem Primer, wie sie in Beispiel 11 der EP-Veröffentlichung EP 0 787 142 beschrieben ist, konnten die Erfinder hierin einen dritten Faktor, Persephin, identifizieren, welcher ungefähr 40–50% identisch ist zu sowohl GDNF als auch Neurturin. Die der Aminosäuresequenz von erhaltenen Regionen von Neurturin und GDNF (SEQ ID NO: 42 und SEQ ID NO: 44) entsprechenden Primer wurden zur Amplifizierung/Verstärkung eines 77 nt-Fragments aus Rattengenom-DNA verwendet. Die resultierenden Produkte wurden in das Bluescript KS-Plasmid subkloniert und sequenziert. Die Sequenz eines der amplifizierten Produkte sagte Aminosäuresequenzdaten, intern in den PCR-Primern, voraus, welche von denen von GDNF oder Neurturin unterschiedlich waren, wiesen aber mehr als 20% Identität mit GDNF und Neurturin auf, wohingegen die Sequenzen anderer amplifizierter Produkte, die wir erhalten haben, GDNF oder Neurturin entsprachen, wie es erwartet wurde. Die 22-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 90) wurde anschließend mit den Rattensequenzen von GDNF und Neurturin abgeglichen und als eindeutig bzw. identisch gefunden. Diese neue Sequenz legte daher nahe, dass ein neues Familienmitglied identifiziert worden war, welches hierin als Persephin bezeichnet wird.
Um zusätzliche Persephin-Sequenzinformationen zu erhalten, wurden Primer, welche die einheitliche 22-Nucleotidsequenz des verstärkten Fragments enthalten, in der Technik der schnellen Verstärkung von cDNA-Enden (RACE) verwendet (Frohman M. A. Methods in Enzymology 218: 340–356, 1993), wobei cDNA verwendet wurde, die aus neonatalem Rattenhirn erhalten wurde. Ein ungefähr 350 nt-Fragment wurde in dieser PCR-Reaktion erhalten, welches eine Teil-Ratten-Persephin-c-DNA-Sequenz von ungefähr 350 Nucleotiden (SEQ ID NO: 106) darstellte. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz dieser cDNA wurde mit der von GDNF und Neurturin verglichen, und es wurde herausgefunden, dass sie ungefähr 40% Identität mit jedem dieser Proteine aufwies. Wichtigerweise war der charakteristische Abstand der kanonischen Gerüstcysteinreste in den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie anwesend. Darüber hinaus war zusätzlich zu dem Ähnlichkeitsabschnitt, welcher durch die zur Isolierung von Persephin verwendeten degenerierten Primer kodiert wird, ein weiterer Abschnitt hoher Homologie, welcher von GDNF und Neurturin geteilt wird, allerdings in anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie nicht vorliegt, ebenso anwesend in Persephin.
(Aminosäure-Nummerierung verwendet den ersten Cys-Rest als Aminosäure 1).
Mit der Bestätigung, dass Persephin in der Tat ein neues Mitglied der GDNF/NTN-Subfamilie darstellt, isolierten wir murine Genom-Klone von Persephin, um zusätzliche Sequenzinformationen zu erhalten. Es wurden der Ratten-cDNA-Sequenz entsprechende Primer in einer PCR-Reaktion zur Verstärkung/Amplifizierung eines 155-Nucleotid-(nt)Fragments aus Mäusegenom-DNA verwendet, welches zu der Ratten-Persephin-cDNA-Sequenz homolog war. Diese Primer wurden anschließend verwendet, um Murin-Persephin-Genomklone aus einer Maus-129/Sv-Bibliothek in einem P1-Bakteriophagen-Vektor zu erhalten (library screening service of Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).
Die Restriktionsfragmente (3,4 kb Nco I und ein 3,3 kb Bam H1) aus diesem P1-Klon, welcher das Persephingen enthielt, wurden durch Hybridisierung mit einem 210 nt-Fragment von Persephin, erhalten durch PCR unter Verwendung von Mäusegenom-DNA und Persephin-spezifischen Primern, identifiziert. Die Nco I- und Bam H1-Fragmente wurden sequenziert, und es wurde gefunden, dass sie einen Abschnitt von Aminosäuren kodieren, welche denen entsprechen, die in dem Ratten-Perse phin-RACE-Produkt vorlagen, sowie dass sie homolog zu den reifen bzw. entwickelten Regionen von sowohl Neurturin als auch GDNF (11) sind.
Wenn die Aminosäuresequenzen von reifem Murin-GDNF, NTN und PSP, unter Verwendung des ersten kanonischen Gerüstcysteins als Ausgangspunkt abgeglichen werden, was erfolgt, weil Änderungen in den Spaltungsstellen zwischen den Familienmitgliedern eine Variabilität in den Segmenten aufwärts vom ersten Cystein hervorrufen, ist Persephin (91 Aminosäuren) geringfügig kleiner als entweder Neurturin (95 Aminosäuren) oder GDNF (94 Aminosäuren). Die Gesamtidentität innerhalb dieses Bereichs beträgt ungefähr 50% mit Neurturin und ungefähr 40% mit GDNF (12).
Ein weiteres Nucleotid-Sequenzieren des murinen Persephin-NcoI-Fragments ergab die Nucleotidsequenz des gesamten murinen Persephingens, wie es in 17 gezeigt ist. Zusätzlich wurde das gesamte Ratten-Persephin-Gen durch Sequenzieren eines PCR-verstärkten Fragments der Ratten-Genom-DNA bestimmt, wie es in 18 gezeigt ist. In sowohl dem murinen bzw. mausartigen als auch dem Ratten-Persephin-Gen erstreckte sich von der Sequenz, welche für einen Initiator Methionin kodiert, bis zu einem Stopkodon an den Positionen 244–246 ein offener Leserahmen bzw. ein offenes Leseraster. Jedoch irgendwo in dieser Sequenz trat eine erkennbare Anomalie auf, sodass die für die RXXR-Spaltungsstelle (Positionen 257–268) kodierende Sequenz und die dem entsprechenden reifen Persephinprotein (Positionen 269–556) entsprechende Sequenz mit diesem offenen Leserahmen nicht co-linear sind. Anstelle dessen kodiert ein zweiter Leserahmen die Spaltungsstelle und das reife Persephin. Die zwei stichhaltigen Leserahmen sind in den 17 und 18 gezeigt. Unabhängig von dieser erkennbaren Anomalie exprimieren Säugerzellen Persephin entweder von der Murin- oder Ratten-Genomsequenz vollständiger Länge (siehe Beispiel 14 unten).
Der N-Terminus von Persephin wurde durch Bezugnahme auf die N-terminalen Regionen von Neurturin oder GDNF vorhergesagt. Unter Verwendung der Neurturin-Sequenzhomologie und der Spaltungssignale liegt ein kennzeichnendes RXXR-Spaltungsmotiv beginnend mit 9 Resten oberhalb des ersten kanonischen Gerüstcysteins von Persephin vor, welches vorschlägt, dass reifes Murin-Persephin 5 Aminosäuren (ALAGS) (SEQ ID NO: 103) oberhalb dieses Cysteins enthält (wie es ebenso bei Neurturin der Fall ist).
Die korrespondierenden 5 Aminosäuren in Rattenpersephin sind ALPGL (SEQ ID NO: 112). Unter Verwendung dieser Parameter würde reifes Persephin aus 96 Aminosäuren bestehen und ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 10,4 kD aufweisen. Die Verwendung der GDNF-Sequenzhomologie und der Spaltungssignale legt auf der anderen Seite nahe, dass der N-Terminus oberhalb des ersten Cysteins von Persephin länger sein könnte gemäß dem, welcher für GDNF beobachtet wurde, der 40 Reste beträgt. Ein charakteristisches RXXR-Spaltungsmotiv befindet sich folglich 47 Reste oberhalb des ersten Cysteins, und dieses würde bedeuten, dass reifes Persephin 43 Aminosäuren
(VRIPGGLPTPQFLLSKPSLCLTILLYLALGNNHVRLPRALAGS) (SEQ ID NO: 104) oberhalb dieses Cysteins enthalten würde. Unter Verwendung dieser Parameter würde reifes Persephin aus 134 Aminosäuren bestehen und ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 14,5 kD aufweisen. Folglich kann reifes Persephin entweder in der Form von 96 Aminosäuren, was 10,4 kD vorausgesagt, oder in der Form von 134 Aminosäuren, was 14,5 kD voraussagt, oder in beiden dieser Formen existieren.
Unter "reifem" bzw. "voll entwickeltem" (mature) Wachstumsfaktor wird hierin die ab- bzw. ausgeschiedene Form des Wachstumsfaktors verstanden, in der jegliche Pre- oder Pro-Regionen (ab)gespalten wurden und welche als Monomer oder in Analogie zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie in der Form eines Homodimers, welches durch Disulfidbrücken verbunden ist, vorliegen.
Die Entdeckung des neuen Wachstumsfaktors, Persephin, wie oben beschrieben, ist ein Ergebnis der früheren Entdeckung von Neurturin durch die vorliegenden Erfinder, wie es in der EP-Veröffentlichung EP 0 787 142 beschrieben ist. Somit sind die zu der Entdeckung von Neurturin führenden Experimente für die vorliegende Entdeckung von Persephin und für die vorhergesagte menschliche Form von Persephin als auch für die biologische Aktivität von Persephin relevant.
Neurturin wurde durch die Erfinder hierin aus einem konditionierten Medium von CHO-Zellen identifiziert und isoliert. Die anfängliche Aktivität zur Förderung des neuronalen Überlebens wurde durch die Erfinder in einer teilweise aufgereinigten Zubereitung dieses CHO-konditionierten Mediums identifiziert. Die Herstellung des konditionierten Mediums für eine gegebene Zelllinie ist im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Reid in Methods in Enzymology Vol. LVIII, Cell Culture, Jakoby und Pastan, Hrsg., Academic Press, San Diego, Seiten 161–164, 1979; Freshney, Culture of Animal Cells in A Manual of Basic Technique, 2. Auflage, Wiley-Liss, NY, Seite 84, 1987). Folglich wird es dem Fachmann leicht ersichtlich sein, dass jede Zelle, welche Neurturin exprimiert, als eine Quelle verwendet werden kann, obwohl in der vorliegenden Arbeit CHO-Zellen kultiviert und das konditionierte Medium zur Identifizierung und zum Erhalt von Neurturin in reiner Form verwendet wurde. Einige der Zellen, welche Neurturin exprimieren, werden unten in Beispiel 9 identifiziert, und die vorliegenden Erfinder glauben, dass jede der als Neurturin exprimierend identifizierten Zellen zum Erhalt eines konditionierten Mediums verwendet werden kann, aus dem Neurturin isoliert werden kann.
In der Isolierung von Neurturin aus dem konditionierten CHO-Zellenmedium kann ein erstes Rohkonditionierungsmedium durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren unter Entfernung von zellulärer Debris erhalten werden. Für die weitere Aufreinigung ist es für den Fachmann leicht ersichtlich, dass irgendein der vielen im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Isolierung auf Aufreinigung von Neurturin aus einer biologischen Probe verwendet werden kann, wie die Affinitätschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die präparative Elektrophorese oder ähnliches, wobei die Verfahren entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Der das Zellüberleben fördernde Effekt von Neurturin kann in irgendeinem geeigneten System zur Bestimmung des Zellüberlebens beurteilt werden. Die vorliegenden Erfinder glauben, dass Neurturin das Überleben in einer Vielzahl von unterschiedlichen Geweben auf der Basis dessen, was für andere Wachstumsfaktoren bekannt ist, und auf der Beobachtung, dass Neurturin in einer Vielzahl von Geweben exprimiert wird, von denen angenommen wird, dass es eine überlebensfördernde Wirkung darin aufweist, fördern kann.
Mittels des Grads der Sequenzidentität von Persephin mit seinen Paralogen, Neurturin und GDNF, und der für diese Substanzen in der Unterstützung des Überlebens und des Wachstums von neuronalen und nichtneuronalen Geweben bekannten Wirkungen wird ebenso angenommen, dass Persephin das Überleben und das Wachstum in neuronalen Geweben sowie in einer Vielzahl nichtneuronaler Gewebe fördert. In der Tat haben die vorliegenden Erfinder Hirn-, Nieren- und Herzgewebe als Persephin-exprimierende Gewebe identifiziert, was die Schlussfolgerung weiter unterstützt, dass Persephin zur Förderung des Wachstums und des Überlebens in neuronalen und nichtneuronalen Zellen wirken kann.
In der hierin berichteten Arbeit wurde die neuronale Aktivität für Neurturin unter Verwendung eines sympathischen Neuronalüberlebenstests (sympathische Cervicalganglien, SCG) bestimmt, welcher intensiv charakterisiert wurde (Martin et al., J. Cell. Biol. 106: 829–844, 1989; Deckwerth und Johnson, J. Cell. Biol. 123: 1207–1222, 1993) (siehe 3). Wir zeigen ebenso die überlebensfördernden Wirkungen von Neurturin auf Sensorneuronen (siehe 10). In dem selben sympathischen und Sensorneuronal-Zellassays zeigte Persephin eine geringe überlebensermöglichende Wirksamkeit. Jedoch zeigte Persephin in einer Zubereitung von CNS-Nervenzellen, welche dem Mittelhirn entstammen, eine neuronale überlebensermöglichende Wirksamkeit. Dieses legt nahe, dass Persephin in der Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen, welche die neuronale Degeneration in dem CNS beinhalten, beispielsweise in der Parkinsonschen Krankheit, anwendbar ist.
Um die in den obengenannten Überlebensassays verwendeten Verfahren weiter zu verdeutlichen, beinhaltete der SCG-Assay das Kultivieren von Zellen, welche von den höheren Cervicalganglien des Rattenembryos erhalten wurden, innerhalb von 5 Tagen bei 37°C in einem Nervenwachstumsfaktor (NGF) enthaltenden Medium. Das Medium wurde anschließend mit einem Medium, welches keinen NGF enthielt und welches Anti-NGF-Antiserum beinhaltete, ausgetauscht. Die Entfernung von NGF resultiert normalerweise in dem Tod von den Neuronen innerhalb von 24 bis 72 Stunden. Das neuronale Überleben wurde sichtbar gemacht unter einem Mikroskop an den Tagen 7–8. Das maximale neuronale Überlebenskriterium umfasste die Abwesenheit der Degeneration sowohl der neuronalen Zellkörper als auch der Neuriten. Die Zellkörperdegeneration war indiziert, wenn der Nervenzellkörper in der Größe reduziert war, ungewöhnliche Membranschwellungen zeigte, Vakuolen enthielt oder die Refraktilität verloren hatte. Ein Bereich der Neuriten wurde als ein Zeichen des Zerfalls anzeigend eingestuft, wenn Schwellungen und Blasen entlang der Neuritbündel auftraten. Das Überleben wurde durch Vergleich mit Neuronen, welche in Anwesenheit von NGF (positive Kontrolle) oder in Abwesenheit von NGF mit NGF-Antiseren (negative Kontrolle) gezüchtet wurden, bestimmt.
Die Aktivität wurde quantifiziert durch Berechnung einer "Überlebenseinheit". Die Gesamtüberlebenseinheiten in einer Probe wurden definiert als das minimale Volumen eines Aliquots der Probe, welche ein maximales Überleben ergab, geteilt in das Gesamtvolumen der Probe. Beispielsweise wurde ein Volumen von 600 ml aus der Heparin-Agarose-Säule eluiert, und aus diesem Eluat waren 12,5 μl das minimale Volumen, welches ein maximales Volumen begünstigte. Folglich betrugen die Überlebenseinheiten in dem Eluat aus der Heparin-Agarose-Säule 48.000. Die spezifische Aktivität wurde als die Überlebenseinheiten, geteilt durch das Gesamtprotein in mg, berechnet. Die intrinsische bzw. innere Aktivität von Neurturin ist hierin in Konzentrations-Einheiten von pg/ml oder pM ausgedrückt, wodurch ein maximales oder halbmaximales Überleben gefördert wird. Wie in 5 angegeben ist, zeigt eine Konzentration-Antwort-Kurve von gereinigtem Neurturin-Protein, dass die intrinsische Aktivität von Neurturin, ausgedrückt als ein EC₅₀, ungefähr 1,5 ng/ml oder ungefähr 50 pM beträgt und ein EC₁₀₀ ungefähr 3 ng/ml oder ungefähr 100 pM ist.
Die Überlebenseinheiten wurden in einem Assay unter Verwendung von ungefähr 1.200 Neuronen in einem 0,5 ml-Kultur-Assay und einer Kulturdauer von 48 Stunden, welche der Zugabe der Fraktion folgt, bestimmt. Das Überleben wurde visuell nach 48 Stunden bestimmt. Die intrinsische Aktivität, wie sie in 4 gezeigt ist, wurde in einem Assay unter Verwendung von ungefähr 2.700 Neuronen und einer Kulturdauer von 72 Stunden bestimmt. Das Überleben wurde durch Fest setzen der Neuronen oder Zählen der Anzahl der überlebenden Neuronen bestimmt. Weil die Stabilität, wie sie durch das Halbwertsleben der Aktivität bestimmt wird, für Neurturin mit steigender Anzahl der Neuronen abnimmt, wurde angenommen, dass die Messung der intrinsischen Aktivität geringer als die durch die spezifische Aktivitätsbestimmungen (Specific Activity determinations) Vorhergesagte ist. Man würde ebenso annehmen, dass die Messung der intrinsischen Aktivität geringer ist als die durch die spezifische Aktivität Vorausgesagte, weil das Überleben nach 72 Stunden anstelle von 48 Stunden gemessen wurde.
Die Reinigung von Neurturin wird detailliert in Beispiel 1 unten beschrieben. Das konditionierte Medium-Ausgangsmaterial wurde aus einem Derivat von DG44-Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters, DG44CHO-pHSP-NGFI-B (Day et al., J. Biol. Chem. 265: 15253–15260, 1990) hergestellt. Die Erfinder hierin haben ebenso Neurturin in teilweise gereinigter Form aus einem konditionierten Medium anderer Derivate von DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters isoliert, und diese anderen Zellen konnten in gleicher Weise wie die DG44CHO-pHSP-NGFI-B-Zellen verwendet werden, wie auch die erwachsenen DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, Eierstockzellen von anderen Spezies und Zellen von anderen Geweben, wie jenen, die zur Exprimierung von Neurturin (siehe Beispiel 9) bekannt sind, verwendet werden konnten. Bei der Herstellung des konditionierten Mediums wurden die Zellen in ein serumfreies Medium 2 Tage lang gelegt, währenddessen das konditionierte Medium gesammelt wird und das Medium ergänzt wird. Dieser Zyklus wurde unter Erhalt von 5 Erträgen an konditioniertem Medium aus jedem Ansatz der CHO-Zellen wiederholt. Das gesammelte Medium wurde zentrifugiert zur Entfernung von zellulärer Debris.
Der erste Schritt in der Reinigung von Neurturin aus dem CHO-Zellen-konditionierten Medium beinhaltete das Einleiten des konditionierten Mediums in eine Heparin-Agarose-Säule und die Elution von teilweise gereinigtem Neurturin daraus. Dieser Schritt resultierte in einem 111-fachen Anstieg in der spezifischen Aktivität und Reinigung des Proteins. Der Puffer, welcher zum Anpassen des Mediums an die Säule verwendet wird, enthält 0,5 M NaCl. Bei dieser Konzentration an NaCl bindet das Neurturin an die Heparin-Agarose-Matrix. Die vorliegenden Erfinder nehmen an, dass auf der Basis der isoelektrischen Punkte LIF und CNTF entweder nicht an die Heparin-Agarose-Matrix binden oder von der Matrix mit dem 0,5 m NaCl enthaltenden Puffer abgewaschen werden. Folglich wird angenommen, dass dieser Schritt Neurturin von den Wachstumsfaktoren, wie LIF und CNTF, isolieren kann. Nach dem Waschen der Säule wird Neurturin von der Säule unter Verwendung von 1,0 M NaCl eluiert.
Zur weiteren Aufreinigung wurde das eluierte Material anschließend verdünnt und in eine Säule, welche SP SEPHAROSE^® Hochleistungsionenaustauschharz (Pharmacia, Piscataway, NJ) enthielt, geleitet. Das von dieser Säule eluierte Material wurde unter Verwendung der Schnell-Protein-Flüssigchromatographie (fast protein liquid chromatography; FPLC) auf einer Chelating Superose HR 10/2-Säule, beladen mit Cu⁺⁺ (Pharmacia, Piscataway, NJ), gereinigt. Die eluierten Fraktionen von der Cu⁺⁺-Superose-Säule wurden in eine Mono-S HR 5/5-Kationenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) zur weiteren FPLC-Reinigung geleitet. Die Zusammensetzung der Proteine in den Mono-S-Fraktionen wurden unter Verwendung von nichtreduzierender SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert.
Die von den Säulen an jedem Reinigungsschritt gesammelten Fraktionen wurden hinsichtlich der biologischen Aktivität unter Verwendung des neuronalen Überlebensassays und hinsichtlich des Proteingehalts unter Verwendung des Farbstoffbindungsverfahrens von Bradford (Anal. Biochem. 72: 248–254, 1976) mit einem Bio-Rad-Protein-Assay-Farbstoffreagenz (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) getestet. Die schrittweise Reinigung unter Verwendung der obigen Schritte ist in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Ergebnisse dieser Analyse zusammen mit den Ergebnissen des neuronalen Überlebensassays der Fraktionen zeigte, dass ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 25 kD mit der sympathischen Neuron-Überlebens-Aktivität co-gereinigt wird.
Das gereinigte Material, welches aus dem CHO-Zellen-konditioniertem Medium isoliert wurde, wurde zur Bestimmung der Teilaminosäuresequenzen des Proteins in dem CHO-Zellen-konditionierten Medium verwendet und anschließend als eine Basis zur Bestimmung der Sequenzen in unterschiedlichen Spezies eingesetzt. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines automatischen Protein/Peptid-Sequenzierers bestimmt, und die ersten 16 Aminosäuren wurden als Ser-Gly-Ala-Arg-Pro-Xaa-Gly-Leu-Arg-Glu-Leu-Glu-Val-Ser-Val-Ser, wobei Xaa eine unbekannte Aminosäure darstellt (SEQ ID NO: 3), mit einer Unsicherheit bei der Position 6 angenommen. Innere Aminosäurefragmente wurden aus dem gereinigten Material nach der Digerierung mit Proteaseenzymen erhalten, und die Sequenzen wurden bestimmt. Drei auf diese Weise erhaltene interne Fragmente waren (1), mit einer Unsicherheit an den Positionen 1, 2 und 6, Xaa₁-Cys-Ala-Gly-Ala-Xaa₂-Glu-Ala-Ala-Val, worin Xaa₁ eine unbekannte Aminosäure darstellt, Xaa₂ Ser oder Cys ist (SEQ ID NO: 4); (2), mit einer Unsicherheit an den Positionen 1, 2, 4, 10, 17 und 22, Xaa₁-Xaa₂-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa₃-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val, worin Xaa₁ und Xaa₂ unbekannt sind, Xaa₃ Gln oder Glu darstellt (SEQ ID NO: 5), und (3) Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg darstelle (SEQ ID NO: 6). Auf der Basis dieser Teilaminosäuresequenzen können DNA-Sonden und Primer hergestellt werden und zum Erhalt von cDNA-Klonen von unterschiedlichen Arten auf der Basis des hohen Sequenzerhalts zwischen den Säugerarten verwendet werden. Die menschliche cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 7 gezeigt, und die Maus-cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 8 gezeigt.
Der cDNA-Klon aus der Maus betrug 1,0 kb mit einem offenen Leserahmen von 585 Nucleotiden (SEQ ID NO: 12), welcher das Maus-Pre-Pro-Neurturin-Protein kodiert (SEQ ID NO: 8, 8). Zusätzlich wurden nichtkodierende Bereiche an beiden 5'- und 3'-Enden des kodierenden Bereichs identifiziert, wie in 9 gezeigt ist. (SEQ ID NO: 13, 5'-nichtkodierender Bereich, Nucleinsäuren -348 bis -1; SEQ ID NO: 14, 3'-nichtkodierender Bereich, Nucleinsäuren 589 bis 675). Die Maus-Neurturin-Sequenz kann verwendet werden, um PCR-Primer zur Verwendung in der Identifizierung von Homologen anderer Arten zu erhalten. Ein menschliches 192-Nucleotid- Fragment aus menschlicher Genom-DNA wurde durch dieses Verfahren amplifiziert und weiterhin verwendet, um eine menschliche Genom-Bibliothek zu screenen, wodurch Klone erhalten werden, welche menschlichen Neurturin-Genomlokus enthalten. Die menschliche cDNA-Sequenz wurde von der Sequenz dieser Klone abgeleitet. (7, cDNA-Sequenz von menschlichem Pre-Pro-Neurturin).
Der Bezug zu Persephin oder zu Neurturin soll hierin als Wachstumsfaktoren jeglichen Ursprungs umfassend ausgelegt werden, welche zu dem hierin charakterisierten und beschriebenen Persephin oder zu dem hierin charakterisierten und beschriebenen Neurturin jeweils im Wesentlichen homolog und biologisch äquivalent sind. Solche im Wesentlichen homologen Wachstumsfaktoren können in jeglichem Gewebe oder jeglicher Art nativ sein, und in ähnlicher Weise kann die biologische Aktivität in einer Vielzahl von biologischen Assay-Systemen charakterisiert werden. Der Bezug auf Pre-Pro-Neurturin hierin soll derartig ausgelegt werden, dass Pre-Pro-Wachstumsfaktoren eingeschlossen sind, welche einen Pre- oder Führungs- oder Signalsequenzabschnitt, einen Pro-Sequenzbereich und Neurturin, wie hierin definiert, enthalten.
Der Begriff "biologisch äquivalent" soll bedeuten, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zum Zeigen eines Teils oder sämtlicher Wachstumseigenschaften in ähnlicher Weise, allerdings nicht notwendigerweise zu demselben Grad in der Lage sind, wie aus dem CHO-Zellen-konditionierten Medium hierin isoliertes Neurturin oder rekombinant hergestelltes menschliches oder Maus- oder Ratten-Neurturin oder -Persephin, je nachdem, wie der Fall liegen mag.
Unter "im Wesentlichen homolog" wird verstanden, dass der Grad der Sequenzidentität von Neurturin-Orthologen, einschließlich menschlichem und Maus-Neurturin sowie Neurturin von irgendeiner anderen Art, oder der Grad der Sequenzidentität von Persephin-Orthologen, einschließlich menschlichem, Maus- und Ratten-Persephin sowie Persephin von jeglicher anderer Art, größer ist als der zwischen Paralogen, wie Persephin und Neurturin oder Persephin und GDNF, und größer ist als der früher für Mitglieder der TGF-β-Superfamilie angegebene ist. (Hinsichtlich der Diskussion der Homologie von TGF-β-Supferfamilien-Mitgliedern siehe Kingsley, Genes and Dev. 8: 133–46, 1994).
Die Sequenzidentität oder prozentuale Identität soll der Prozentanteil derselben Reste zwischen zwei Sequenzen bedeuten. Die Referenzsequenz ist Maus-Persephin, wenn die prozentuale Identität mit Maus-GDNF bestimmt wird, und Maus-Neurturin und Ratten-Persephin, wenn die prozentuale Identität mit Ratten-GDNF und Ratten-Neurturin bestimmt wird. Auf menschliches Neurturin wird Bezug genommen, wenn die prozentuale Identität mit nicht-menschlichem Neurturin bestimmt wird, auf menschliches Neurturin, wenn die prozentuale Identität mit Nicht-Neurturin-Wachs tumsfaktoren bestimmt wird, und auf menschliches GDNF, wenn die prozentuale Identität von Nicht-Neurturin-Wachstumsfaktoren mit GDNF bestimmt wird. In allen dieser Vergleiche werden die zu vergleichenden Sequenzen unter Verwendung des Clustal-Verfahrens (Higgins et al., Cabios 8: 189–191, 1992) des vielfachen Sequenz-Ausrichtens in der Lasergene biocomputing Software (DNASTAR, INC, Madison, WI) ausgerichtet. In diesem Verfahren werden mehrfache Ausrichtungen in progressiver Weise durchgeführt, wobei größere und größere Ausrichtungsgruppen unter Verwendung von Ähnlichkeitszahlen, berechnet aus einer Reihe von paarweisen Ausrichtungen, aufgebaut werden. Die optimalen Sequenzausrichtungen werden durch das Auffinden der maximalen Ausrichtungszahl erhalten, welche der Mittelwert aller Zahlen zwischen den getrennten Resten in der Ausrichtung, bestimmt aus einer Restgewichtstabelle, welche die Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines gegebenen Aminosäurewechsels in zwei verwandten Proteinen innerhalb eines angegebenen Evolutionsabschnitts darstellt, ist. Abzüge für das Öffnen und Verlängern von Spalten in der Ausrichtung tragen zu der Zahl bei. Die bei diesem Programm verwendeten Grundeinstellungen sind wie folgt: Spaltenabzug für mehrfache Ausrichtung = 10; Spaltenlängeabzug für mehrfache Ausrichtung = 10; k-Tupel-Wert in paarweiser Ausrichtung = 1; Spaltenabzug in paarweiser Ausrichtung = 3; Fensterwert bei der paarweisen Ausrichtung = 5; gesicherte Diagonalen in paarweiser Ausrichtung = 5. Die Restgewichtstabelle, welche für das Ausrichtungsprogramm verwendet wird, ist PAM 250 (Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Herausgeber, NBRF, Washington, Vol. 5, suppl. 3, Seite 345, 1978).
Der prozentuale Erhalt bzw. die prozentuale Konservierung wird aus der obengenannten Ausrichtung durch Addition des Prozentanteils der identischen Reste zu dem Prozentanteil der Positionen, an denen die zwei Reste eine bewahrte Substitution darstellen (definiert als einen log ungerade Zahlen-Wert von größer als oder gleich 0,3 in der PAM250-Restgewichtstabelle aufweisend), berechnet. Die Bewahrung ist bezogen auf Maus-Persephin, wenn die prozentuale Bewahrung mit Persephin von anderen Arten oder mit Nicht-Persephin-Wachstumsfaktoren bestimmt wird; sie ist auf menschliches Neurturin bezogen, wenn die prozentuale Bewahrung mit nichtmenschlichem Neurturin oder mit Nicht-Neurturin-Wachstumsfaktoren bestimmt wird, und sie ist bezogen auf menschliches GDNF, wenn die prozentuale Bewahrung gegenüber Nicht-Persephin, Nicht-Neurturin-Wachstumsfaktoren mit GDNF, bestimmt wird. Die erhaltenen Aminosäure-Änderungen, welche dieses Erfordernis erfüllen, sind: R-K; E-D, Y-F, L-M; V-I, Q-H.
Tabelle 2 zeigt die Berechnungen der Identität (I) und der Bewahrung bzw. Konservierung (C) für Vergleiche von Persephin und Neurturin und GDNF von verschiedenen Arten. Die Vergleiche wurden zwischen Maus-Persephin von dem ersten kano nischen Gerüst-Cystein zu dem Ende (SEQ ID NO: 89) und Ratten-Persephin von dem ersten kanonischen Gerüst-Cystein zu dem Ende (SEQ ID NO: 83); zwischen Maus-Persephin und Maus-GDNF von dem ersten Cystein zu dem Ende (mGDNF/C-END, SEQ ID NO: 87) oder Maus-Neurturin von dem ersten Cystein zu dem Ende (mNTN/C-END, SEQ ID NO: 88); und zwischen Ratten-Persephin und Ratten-GDNF von dem ersten Cystein zu dem Ende (rGDNF/C-END) durchgeführt. Neurturin-Vergleiche wurden zwischen reifem menschlichen und reifem Maus-Neurturin (jeweils hNTN und mNTN) und zwischen jedem von diesen und reifem menschlichen, Ratten- und Maus-GDNF (jeweils hGDNF, rGDNF und mGDNF) durchgeführt, wie es in der Tabelle angegeben ist.
Tabelle 2
Der Homologiegrad zwischen dem Maus-Persephin und Ratten-Persephin beträgt ungefähr 96%, und es wird angenommen, dass der Homologiegrad zwischen entweder Maus- oder Ratten-Persephin und menschlichem Persephin mindestens ungefähr 85% Identität auf der Basis eines ähnlichen Vergleichs mit Neurturin beträgt. Die Neurturin-Vergleiche, wie sie in Tabelle 2 angegeben sind, zeigen, dass reife Maus- und Menschen-Neurturin-Proteine ungefähr 90% Sequenzidentität aufweisen. Darüber hinaus nimmt man an, dass sämtliche Persephin- und Neurturin-Homologen von nicht-menschlichen Säugerarten in ähnlicher Weise mindestens ungefähr 85% Sequenzidentität mit jeweils menschlichem Persephin und Neurturin aufweisen. Für Nicht-Säuger-Arten, wie Vogelarten, wird angenommen, dass der Homologiegrad mit Persephin oder Neurturin mindestens ungefähr 65% Identität mit jeweils menschlichem Persephin oder menschlichem Neurturin beträgt. Zum Vergleich können die Variationen zwischen Familienmitgliedern der Neurturin-Persephin-GDNF-Familie von Wachstumsfaktoren durch den Vergleich von Persephin und GDNF oder Neurturin und GDNF erkannt werden. Maus- und Ratten-Persephin weisen ungefähr 35 bis 40% Sequenzidentität mit jeweils Maus- und Ratten-GDNF auf. In ähnlicher Weise besitzt menschliches und Maus-Neurturin ungefähr 40% Se quenzidentität und ungefähr 50% Sequenzbewahrung bzw. Sequenzerhalt mit menschlichem, Maus- und Ratten-GDNF auf. Es wird angenommen, dass die unterschiedlichen Familienmitglieder ebenso eine ähnliche Sequenzidentität von ungefähr 40% der von Neurturin, ungefähr 40% der von Persephin und ungefähr 40% der von GDNF aufweisen und innerhalb eines Bereichs von ungefähr 30% bis ungefähr 85% Identität mit Neurturin, innerhalb eines Bereichs von ungefähr 30% bis ungefähr 85% Identität mit Persephin und innerhalb eines Bereichs von ungefähr 30% bis ungefähr 85% Sequenzidentität mit GDNF liegen. Folglich wird erwartet, dass ein gegebenes Mitglied der GDNF-Neurturin-Persephin-Familie eine geringere Sequenzidentität mit irgendeinem anderen Familienmitglied derselben Art aufweist als die, welche in Orthologen dieses Familienmitglieds in anderen Arten vorliegt, nur weil menschliches GDNF und menschliches Neurturin zu Maus-GDNF und Maus-Neurturin jeweils enger verwandt sind als zueinander oder zu GDNF, und es wird angenommen, dass irgendein gegebenes Familienmitglied eine größere Sequenzidentität mit einem anderen Familienmitglied als zu irgendeinem weiteren bekannten Mitglied der TGF-β-Superfamilie aufweist (Kingsley, supra).
In dem Fall von Pre-Pro-Neurturin können Homologe von Pre-Pro-Neurturin in nicht-menschlichen Säugerarten mittels des Neurturin-Anteils der Aminosäuresequenz mit mindestens ungefähr 85% Sequenzidentität mit menschlichem Neurturin identifiziert werden, und Homologe von Pre-Pro-Neurturin in Nicht-Säuger-Arten können mittels des Neurturin-Anteils der Aminosäuresequenz mit mindestens ungefähr 65% Identität mit menschlichem Neurturin identifiziert werden. Es wird in ähnlicher Weise angenommen, dass Säuger-Pre-Pro-Persephin-Proteine, welche das menschliche Orthologe einschließen, mindestens ungefähr 85% Sequenzidentität in dem reifen Persephin-Anteil des Moleküls aufweisen und dass Nicht-Säuger-Pre-Pro-Persephin-Proteine mindestens ungefähr 65% Sequenzidentität mit menschlichem Pre-Pro-Persephin aufweisen.
Entweder Persephin oder Neurturin, wie die Begriffe hierin verwendet werden, können ebenso Hybrid- und modifizierte Formen von Persephin oder Neurturin jeweils einschließen, inklusive Fusionsproteine und Persephin- oder Neurturin-Fragmente und Hybrid- und modifizierte Formen, in denen bestimmte Aminosäuren weggelassen oder ersetzt wurden sowie Modifikationen, wie jene, worin ein oder mehrere Aminosäuren gegen eine modifizierte Aminosäure oder eine ungewöhnliche Aminosäure ausgetauscht wurden, und Modifikationen, wie Glykosolierungen, solange die Hybrid- oder modifizierte Form die biologische Aktivität von Persephin oder Neurturin beibehält. Unter Beibehalten der biologischen Aktivität wird verstanden, dass das neuronale Überleben gefördert wird, obwohl nicht notwendigerweise auf demselben Potenzniveau wie jenes des aus CHO-Zellen-konditioniertem Medium isolierten Neurturins oder des rekombinant gebildeten menschlichen oder Maus-Neurturins oder menschlichen oder Maus- oder Ratten-Persephins.
Ebenso enthalten in der Bedeutung von im Wesentlichen homolog ist ein jedes Persephin oder Neurturin, welches mittels Kreuzreaktivität bzw. Cross-Reaktivität mit Antikörpern gegenüber jeweils Persephin oder Neurturin isoliert werden kann, wie es hierin beschrieben ist, oder deren kodierende Nucleotid-Sequenzen, einschließlich Genom-DNA, mRNA oder cDNA, durch Hybridisierung mit der komplentären Sequenz der Genom- oder Subgenom-Nucleotidsequenzen oder cDNA von jeweils Persephin oder Neurturin, wie es hierin beschrieben ist, oder Fragmente davon isoliert werden können. Es ist ebenso klar für den Fachmann, dass degenerierte DNA-Sequenzen menschliches Neurturin oder menschliches Persephin kodieren können, und diese sollen ebenso innerhalb der vorliegenden Erfindung liegen, wie es für allelische Varianten von Neurturin oder Persephin jeweils der Fall ist.
In dem Fall von Pre-Pro-Neurturin können alternativ gespleißte Proteinprodukte, resultierend von einem Intron, lokalisiert in der Kodierungssequenz des Pro-Abschnitts existieren. Es wird angenommen, dass das Intron in der Genomsequenz an einer Position vorliegt, welche der zwischen den Nucleinsäuren 169 und 170 der cDNA entspricht, welche wiederum einer Position an der Aminosäure 57 in sowohl den Maus- als auch Mensch-Pre-Pro-Neurturin-Sequenzen entspricht (siehe 7 und 8). Folglich kann ein alternatives Spleißen an dieser Position eine Sequenz bilden, die sich von der hierin für Menschen- und Maus-Pre-Pro-Neurturin (SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 12 respektive) Identifizierten an der identifizierten Aminosäurestelle durch Hinzufügen und/oder Weglassen ein oder mehrerer Aminosäuren unterscheidet. Es sollen sämtliche alternativ gespleißten Pre-Pro-Neurturin-Proteine innerhalb der hierin verwendeten Begriffe Pre-Pro-Neurturin enthalten sein.
Obwohl die Erfinder der vorliegenden Erfindung durch keine Theorie gebunden sein wollen, wird angenommen, dass die hierin identifizierten Mensch- und Maus-Proteine sowie die Homologen anderer Gewebe und Arten als Dimere in ihrer biologisch aktiven Form in einer derartigen Weise existieren können, dass sie mit der für andere Faktoren der TGF-β-Superfamilie bekannten konsistent ist.
Zusätzlich zu Homodimeren können die monomeren Einheiten der Dimere von Neurturin oder Persephin zum Aufbau von stabilen Wachstumsfaktor-Heterodimeren oder Heteromultimeren, umfassend mindestens eine Monomereinheit, welche von Persephin abgeleitet ist, oder mindestens eine Monomereinheit, welche von Neurturin abgeleitet ist, verwendet werden. Dieses kann durch Dissoziieren eines Homodimers von Neurturin oder eines Homodimers von Persephin in seine monomeren Komponenteneinheiten und Reassoziierung in Gegenwart einer monomeren Einheit eines zweiten oder folgenden homodimeren Wachstumsfaktors erfolgen. Dieser zwei te oder folgende homodimere Wachstumsfaktor kann ausgewählt sein aus einer Vielzahl von Wachstumsfaktoren, einschließlich Neurturin, Persephin, GDNF, einem Mitglied der NGF-Familie, wie NGF, BDNF, NT-3 und NT-4/5, einem Mitglied der TGF-β-Superfamilie, einem Endothelgewebe-Wachstumsfaktor, einem Mitglied der CNTF/LIF-Familie oder ähnlichem.
Man nimmt an, das Wachstumsfaktoren als spezifische Rezeptoren wirken. Beispielsweise wurden die Rezeptoren für TGF-β und Aktivine identifiziert und einer Familie von Ser/Thr-Kinase-Transmembran-Proteinen zugeordnet (Kingsley, Genes and Dev. 8: 133–146, 1994; Bexk et al. Nature 373: 339–341, 1995). In der NGF-Familie bindet NGF an den TrkA-Rezeptor in peripher sensorischen und sympathischen Neuronen und in den Neuronen des basalen Vorderhirns; BDNF und NT-4/5 binden an trkB-Rezeptoren; und NT-3 bindet primär an trkC-Rezeptoren, welche innerhalb des CNS eine unterschiedliche Verteilung zeigen (Tuszynski et al., Ann. Neurol. 35: S9–S12, 1994). Die vorliegenden Erfinder glauben, dass Persephin, Neurturin, GDNF und bisher unbekannte Mitglieder dieser Familie von Wachstumsfaktoren über spezifische Rezeptoren mit unterschiedlichen Verteilungen wirken, wie es für andere Wachstumsfaktor-Familien gezeigt wurde. Diese können getrennte Rezeptoren darstellen, oder es ist ebenso möglich, dass Mitglieder der GDNF-Neurturin-Persephin-Familie auf denselben Rezeptor wirken, wie es bei BDNF und NT-4/5 der Fall ist, welche auf den trkB-Rezeptor wirken. Nichtsdestotrotz wird angenommen, dass durch Bilden von Heterodimeren oder Heteromultimeren von Persephin oder Neurturin und einem oder mehreren anderen Wachstumsfaktoren der resultierende Wachstumsfaktor zum Binden an mindestens zwei verschiedene Rezeptortypen mit vorzugsweise einer unterschiedlichen Gewebeverteilung in der Lage ist. Die resultierenden Heterodimere oder Heteromultimere zeigen, so wird erwartet, ein vergrößertes Spektrum von Zellen, auf die sie wirken könnten oder eine größere Potenz ausüben könnten. Es ist ebenso möglich, dass das Heterodimer oder Heteromultimer synergistische Effekte zeigen könnte, welche mit Homodimeren oder Homomultimeren nicht beobachtet werden. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Kombination von Faktoren unterschiedlicher Klassen das Langzeitüberleben von Oligodendrozyten fördert, wohingegen einzelne Faktoren oder Kombinationen solcher Faktoren innerhalb derselben Klasse ein Kurzzeitüberleben förderten (Barres et al., Development 118: 283–295, 1993).
Heterodimere können durch eine Vielzahl von Verfahren gebildet werden. Beispielsweise können Homodimere gemischt und Bedingungen unterzogen werden, bei denen Dissoziation/ein Auffalten auftritt, wie in Gegenwart eines Dissoziations/Entfaltungsmittels, gefolgt von dem Unterziehen gegenüber Bedingungen, welche die Monomer-Reassoziierung und Bildung von Heterodimeren erlauben. Dissozations-/ Entfaltungs-Mittel umfassen jegliche Mittel, welche zum Fördern der Dissoziation von Proteinen bekannt sind. Solche Mittel umfassen, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, Guanidinhydrochlorid, Harnstoff, Kaliumthiocyanat, pH-vermindernde Mittel, wie gepufferte HCl-Lösungen, und polare, wassermischbare organische Lösungsmittel, wie Acetonitril, oder Alkohole, wie Propanol oder Isopropanol. Zusätzlich können für durch Disulfidbindungen kovalent verbundene Homodimere, wie es bei TGF-β-Familienmitgliedern der Fall ist, Reduktionsmittel, wie Dithiothreitol und β-Mercaptoethanol, zur Dissoziation/Entfaltung und zur Reassoziierung/Wiederfaltung verwendet werden.
Heterodimere können ebenso zum Transfizieren einer Zelle mit zwei oder mehreren Faktoren hergestellt werden, sodass die transformierte Zelle Heterodimere produziert, wie es mit den Neurotrophinen durchgeführt wurde. (Heymach und Schooter, J. Biol. Chem. 270: 12297–12304, 1995).
Ein weiteres Verfahren zur Bildung von Heterodimeren liegt in der Kombination von Persephin- oder Neurturin-Homodimeren und einem Homodimer eines zweiten Wachstumsfaktors und das Inkubieren der Mischung bei 37°C.
Wenn Heterodimere aus Homodimeren hergestellt werden, können die Heterodimere anschließend von den Homodimeren unter Verwendung von dem Fachmann verfügbaren Verfahren abgetrennt werden, wie beispielsweise durch Eluierung von präparativen, nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelen. Alternativ können Heterodimere unter Verwendung von Hochdruckkationenaustauschchromatographie, wie mit einer Mono-S-Kationenaustauschsäule, oder durch Sequenzimmunoaffinitätssäulen aufgereinigt werden.
Es ist im Stand der Technik bekannt, dass viele Proteine in einer Zelle mit einer Signalsequenz an dem N-Terminus der reifen Proteinsequenz synthetisiert werden, und das solch eine Leitsequenz tragende Protein wird als Preprotein bezeichnet. Der Pre-Teil des Proteins wird während des Zellvorgangs des Proteins abgespalten. Zusätzlich zu der Pre-Leitsequenz enthalten viele Proteine eine unterschiedliche Pro-Sequenz, welche einen Bereich auf einem Protein beschreibt, der ein stabiler Precursor des reifen Proteins darstellt. Mit sowohl Pre- als auch Pro-Bereichen synthetisierte Proteine werden als Preproproteine bezeichnet. Hinsichtlich des Entwicklungsablaufs, der bekanntermaßen bei anderen TGF-β-Familienmitgliedern als auch bei den hierin bestimmten Sequenzen auftritt, nehmen die Erfinder an, dass die Formen des Persephin- oder Neurturin-Proteins, wie es innerhalb einer Zelle synthetisiert wird, das Pre-Pro-Persephin oder ein Pre-Pro-Neurturin ist. In dem Fall von Neurturin nimmt man an, dass das Pre-Pro-Neurturin eine N-terminale 19-Aminosäuresignalsequenz (menschliche Pre-Signalsequenz, SEQ ID NO: 15, 7, Aminosäuren 1 bis 19 kodiert durch SEQ ID NO: 17, 7, Nucleinsäuren 1 bis 57; Maus-Pre- Signal-Sequenz, SEQ ID NO: 16, 8, Aminosäuren 1 bis 19, kodiert durch SEQ ID NO: 18, 8, Nucleinsäuren 1 bis 57) enthält. Es ist bekannt, dass die volle Länge einer Leitsequenz nicht notwendigerweise für das Wirken der Sequenz als eine Signalsequenz erforderlich ist, und daher sind in der Definition des Pre-Bereichs von Neurturin die Fragmente davon, gewöhnlich N-terminale Fragmente, enthalten, welche die Eigenschaft der Fähigkeit zur Wirkung als eine Signalsequenz beibehalten, d. h. die Erleichterung von co-translatorischer Insertion in die Membranen von ein oder mehreren zellulären Organellen, wie dem endoplasmatischen Retikulum, Mitochondrien, dem Golgi-Apparat, der Plasmamembran und ähnlichem.
Der Neurturin-Signalsequenz schließt sich eine Pro-Domäne an, welche eine RXXR-Proteolyse-Entwicklungsstelle direkt vor der N-terminalen Aminosäuresequenz für das reife Neurturin enthält. (Menschliche Pro-Bereich-Sequenz, SEQ ID NO: 19, 7, Aminosäuren 20 bis 95, kodiert durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 20, 7, Nucleinsäuren 58 bis 285; Maus-Pro-Bereich-Sequenz, SEQ ID NO: 22, 8, Aminosäuren 19 bis 95, kodiert durch die Nucleinsäuresequenz SEQ ID NO: 21, 8, Nucleinsäuren 58 bis 285).
Die Neurturin-Pre- und -Pro-Bereiche umfassen zusammen eine Pre-Pro-Sequenz, welche als die menschliche Pre-Pro-Sequenz identifiziert wurde (SEQ ID NO: 23, 7, Aminosäuren 1 bis 95, kodiert durch SEQ ID NO: 25, Nucleinsäuren 1 bis 285), und die Maus-Pre-Pro-Sequenz (SEQ ID NO: 24, 8, Aminosäuren 1 bis 95, kodiert durch SEQ ID NO: 26, Nucleinsäuren 1 bis 285). Die Pre-Bereichssequenzen und Pro-Bereichssequenzen sowie die Pre-Pro-Bereichssequenzen können für nicht-menschliche Säugerarten und für Nicht-Säugerarten mittels der Sequenzen, welche innerhalb des Pre-Pro-Neurturins, wie es hierin definiert ist, enthalten sind, identifiziert und erhalten werden. Es wird angenommen, dass Persephin in ähnlicher Weise mit Pre- und Pro-Bereichen zum Aufbau einer Pre-Pro-Persephin-Sequenz assoziiert ist.
Unter Verwendung der obengenannten Charakteristika wird vorausgesagt, dass das reife sekretierte Neurturin-Molekül ungefähr 11,5 kD aufweist, welches wahrscheinlich ein Disulfid-verbundenes Homodimer mit ungefähr 23 kD in Analogie zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie ausbildet. Das vorausgesagte ungefähre 23 kD-Protein ist mit dem 25 kD-Neurturin-Protein, welches aus CHO-Zellen-konditionierten Medien gereinigt erhalten wird, das ein Homodimer darstellt, konsistent. Die vorliegenden Erfinder haben aus dem konditionierten Medium der Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, transfiziert mit dem Neurturinexpressionsvektor (pCMV-NTN-3-1) unter Verwendung von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ein Neurturin-Protein mit ungefähr 11,5 kD detektiert, und dieses Protein wird als das Monomer angesehen.
Wie oben diskutiert, würde ein reifes Persephin-Molekül, vorausgesagt auf der Basis der Homologie zu Neurturin, fünf Aminosäuren oberhalb des ersten kanonischen Gerüst-Cysteins enthalten, wobei es 96 Aminosäuren und ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 10,4 kD aufweist. Ein reifes Persephin-Molekül, auf der Basis der Homologie zu GDNF, würde 43 Aminosäuren oberhalb des ersten kanonischen Gerüst-Cysteins aufweisen, wobei es 134 Aminosäuren und ein vorausgesagtes Molekulargewicht von 14,5 kD besitzt.
Die Nucleotid-Sequenzen von Neurturin-Pre- und/oder -Pro-Abschnitten oder ähnlichen Abschnitten, von denen man annimmt, dass sie mit Persephin-DNA verbunden sind, können zum Aufbau von chimären Genen mit den Kodierungssequenzen anderer Wachstumsfaktoren oder Proteine verwendet werden, und chimäre Gene können in ähnlicher Weise aus der kodierenden Sequenz von Neurturin, gekoppelt an Sequenzen, welche Pre- und/oder Pro-Abschnitte von Genen für andere Wachstumsfaktoren oder Proteine kodieren, aufgebaut werden. (Booth et al., Gene 146: 303–8, 1994; Ibanez, Gene 146: 303–8, 1994; Storici et al., FEBS Letters 337: 303–7, 1994; Sha et al., J. Cell. Biol. 114: 827–839, 1991). Solche chimären Proteine können eine geänderte Bildung oder Exprimierung der aktiven Protein-Spezies aufweisen.
Ein bevorzugtes Neurturin wurde in gereinigter Form aus einem Medium, welches durch CHO-Zellen konditioniert ist, identifiziert und isoliert. Ebenso bevorzugt ist durch die rekombinante DNA-Technologie hergestelltes Neurturin. In ähnlicher Weise wird ein bevorzugtes Persephin gemäß der vorliegenden Erfindung durch die rekombinante DNA-Technologie hergestellt.
Unter "reiner Form" oder "aufgereinigter Form" oder "im Wesentlichen aufgereinigter Form" wird hierin verstanden, dass eine Persephin- oder Neurturin-Zusammensetzung im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, welche nicht jeweils Persephin oder Neurturin darstellen.
Rekombinantes Persephin oder Neurturin kann durch das Exprimieren der DNA-Sequenzen, welche Persephin oder Neurturin jeweils kodieren, in einer geeigneten transformierten Wirtszelle gebildet werden. Unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren kann die Persephin- oder Neurturin-kodierende DNA an einen Expressionsvektor gebunden werden, in eine Wirtszelle transformiert werden und Bedingungen angelegt werden, welche zur Expression von jeweils Persephin oder Neurturin durch die transformierte Zelle geeignet sind.
Ein jeglicher geeigneter Expressionsvektor kann zur Herstellung von rekombinantem menschlichen Persephin oder rekombinantem menschlichen Neurturin verwendet werden, wie beispielsweise der Säuger-Expressionsvektor pCB6 (Brewer, Meth. Cell. Biol. 43: 233–245, 1994) oder die E. Coli-pET-Expressionsvektoren, insbesondere pET-30a (Studier et al., Methods Enzymol. 185: 60–89, 1990), welche beide hierin verwendet wurden. Andere geeignete Expressionsvektoren zur Expression in Säuger- und Bakterienzellen sind im Stand der Technik ebenso wie Expressionsvektoren zur Verwendung in Hefen oder Insektenzellen bekannt. Baculovirus-Expressionssysteme können ebenso eingesetzt werden.
Persephin oder Neurturin kann in den monomeren Einheiten exprimiert werden, oder solch eine monomere Form kann durch die Präparierung unter reduzierenden Bedingungen gebildet werden. In solchen Fällen kann das erneute Falten und die Renaturierung unter Verwendung eines der oben angegebenen Mittel erreicht werden, welches zur Förderung der Dissoziierung/Assoziierung von Proteinen bekannt ist. Beispielsweise kann die monomere Form mit Dithiothreitol inkubiert werden, gefolgt von der Inkubierung mit oxidiertem Glutathion-Dinatriumsalz, gefolgt von der Inkubierung mit einem Puffer, welcher ein Wiederfaltungsmittel, wie Harnstoff, enthält.
In dem Fall von Neurturin wurde die reife Maussequenz durch Analogie mit der N-terminalen Sequenz und internen Fragmenten des aus einem CHO-Zellen-konditionierten Medium gereinigten Neurturins abgeleitet, und daraus wurde die reife menschliche Form unter Verwendung der Sequenz aus dem menschlichen Gen vorhergesagt. Die Aminosäuresequenz der reifen menschlichen Form ist in 5 gezeigt (hNTN, SEQ ID NO: 1). Das von dem CHO-Zellen-konditionierten Medium aufgereinigte Material wird als reifes Neurturin angesehen und kann als Dimer oder anderes Multimer existieren und glykosyliert oder auf andere Weise chemisch modifiziert vorliegen.
Persephin, wie Neurturin, kann ebenso als ein Dimer oder ein anderes Multimer vorliegen und kann glykosyliert oder auf andere Weise chemisch modifiziert sein.
Wie oben angegeben lassen die Maus- und Human- bzw. Menschen-Nucleinsäuresequenzen vermuten, dass Neurturin anfänglich als Pre-Pro-Polypeptid translatiert wird und dass die proteolytische Entwicklung der Signalsequenz und des "Pro"-Teils dieses Moleküls in der reifen Sequenz resultiert, welche hierin als "reifes Neurturin" bezeichnet wird, wie es von mit CHO-Zellen konditionierten Medien erhalten wird und in menschlichen und in nicht-menschlichen Arten in homologer Form existiert. Daher umfasst Neurturin sämtliche "reife Neurturin"-Sequenzen von menschlichen und nicht-menschlichen Arten sowie sämtliche Pre-Pro-Neurturin-Polypeptide, welche von dem Neurturin-Gen translatiert werden können.
Wie bei Neurturin umfasst das Persephin in der vorliegenden Erfindung ebenso sämtliche reife Persephin-Sequenzen von menschlichen und nicht-menschlichen Arten und sämtliche Pre-Pro-Persephin-Polypeptide, welche von dem Persephin-Gen translatiert werden können.
Es wird angenommen, dass die Kodierungssequenz für das Pre-Pro-Neurturin-Polypeptid an dem ersten ATG-Codon, welches Methionin kodiert, an dem 5'-Ende des Klons (Position 1 in 9) beginnt, welches in demselben Leserahmen angeordnet ist wie die Sequenzen, welche die von dem gereinigten Neurturin erhaltenen Aminosäuresequenzen kodieren. Unterhalb des ersten Codons befindet sich der größte offene Leserahmen, welcher die Kodierungssequenz für die Pre- und Pro-Bereiche enthält, gefolgt von der Kodierungssequenz für das reife Maus-Neurturin.
Die Sequenzanalyse für die murinen Neurturin-Genom-Klone identifizierte ein 0.5 kb-Intron, lokalisiert zwischen Nucleotid 169 und 170 des Pre-Pro-Neurturins von den cDNA-Klonen. Dieses Intron ist in der Kodierungssequenz des Pro-Abschnitts des Pre-Pro-Neurturin-Proteins lokalisiert. Folglich wird angenommen, dass das Maus-Neurturin-Gen mindestens zwei Exons aufweist, von denen eines die Kodierungssequenzen oberhalb der Spleißstelle aufweist und das andere die Kodierungssequenz unterhalb enthält (8, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30). Es ist bekannt, dass das Gen für GDNF ein Intron enthält, welches an einer analogen Position lokalisiert ist, und es wurde eine andersartig gespleißte Form von GDNF mittels RT-PCR-Experimenten detektiert (Suter-Crazzolara und Unsicker, Neuroreport 5: 2486–2488, 1994). Diese andere Form resultiert aus der Verwendung einer Spleißstelle in dem zweiten Kodierungsexon, lokalisiert 78 bp 3' von der angegebenen Originalspleißstelle. Die anders gespleißte Form kodiert ein GDNF-Protein mit einem Auslassen von 26 Aminosäuren relativ zu der ursprünglich angegebenen Form. Die zwei Formen werden in unterschiedlichen Verhältnissen in unterschiedlichen Geweben exprimiert. Wir haben keine andersartig gespleißte Formen von Neurturin in RT-PCR- und RACE-Experimenten unter Verwendung von Maus-P1-Hirn- und -P1-Leber-cDNAs detektiert. Die Möglichkeit besteht jedoch, dass andere Spleißstellen in dem Neurturin-Gen in unterschiedlichen Geweben verwendet werden können.
Die Kodierungssequenz der menschlichen Neurturin-cDNA wurde von der Sequenz der menschlichen Neurturin-Genom-Klone abgeleitet. Die Kodierungssequenz der menschlichen cDNA, wie die der Maus-cDNA, wird durch ein Intron zwischen den Nucleotiden 169 und 170 der Kodierungssequenz unterbrochen. Folglich nimmt man an, dass das menschliche Neurturin-Gen mindestens zwei Exons enthält, von denen eines die Kodierungssequenz oberhalb der Spleißstelle und das andere die Kodierungssequenz unterhalb enthält (7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28). Die Spleißstellen an den Intron-Exon-Verbindungen der Mensch- und Maus-Gene wurde bewahrt bzw. konserviert.
Von der abgeleiteten Aminosäuresequenz des menschlichen Neurturins liegt die früher vorhergesagte N-terminale Sequenz zwischen den Positionen 286 und 339, und die vorhergesagten inneren Sequenzen liegen zwischen den Positionen 385 und 417, den Positionen 477 und 533 und den Positionen 547 und 576. Das TGA-Stopkodon an den Positionen 592–594 terminiert den offenen Leserahmen.
Die vorausgesagte Länge des Pre-Pro-Neurturins beträgt 197 Aminosäurereste für das menschliche Pre-Pro-Neurturin (SEQ ID NO: 7) und 195 Aminosäurereste für das Maus-Pre-Pro-Neurturin (SEQ ID NO: 8). Das vorausgesagte Molekulargewicht dieses Polypeptids beträgt 22,2 kD für die Maus und 22,4 kD für den Menschen. Die vorausgesagte Länge des gereinigten Neurturins beträgt 100 Aminosäurereste, und dessen vorausgesagtes Monomeren-Molekulargewicht beträgt 11,5 kD. Es liegen keine N-verbundenen Glykosylierungsstellen vor, jedoch treten potenzielle O-verbundene Glykosylierungsstellen bei Aminosäureresten in den Positionen 18, 26, 80, 86 und 95 bei menschlichem Neurturin auf. Die Glykosylierung an irgendeiner oder einer Kombination dieser Stellen würde das Molekulargewicht des Moleküls erhöhen.
In dem Fall von Persephin befinden sich keine N-verbundenen Glykosylierungsstellen in dem Bereich zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüst-Cysteinen (SEQ ID NO: 79), noch treten dort irgendwelche N-verbundenen Glykosylierungsstellen in einem reifen Persephinmolekül auf, wie es auf der Basis der Homologie zu Neurturin vorhergesagt wurde (SEQ ID NO: 80). In einem reifen Persephinmolekül gibt es auf der Basis der Homologie zu GDNF zwei potenzielle N-verbundene Glykosylierungsstellen in den 43 Aminosäuren oberhalb des ersten kanonischen Gerüst-Cysteins an den Positionen 31 und 32 in SEQ ID NO: 81 (entsprechend den Positionen 39 und 40 in der in 11 gezeigten Sequenz).
Potenzielle O-gebundene Glykosylierungsstellen treten in Persephin in dem Bereich zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüst-Cysteinen bei den Positionen 5, 7, 19, 31, 38, 41, 62, 63, 68 und 83 in SEQ ID NO: 79 (12) auf, und in einem reifen Persephinmolekül, vorausgesagt auf der Basis der Homologie zu Neurturin (SEQ ID NO: 80), gibt es eine zusätzliche potenzielle O-verbundene Glykosylierungsstelle einen Rest oberhalb des ersten kanonischen Gerüst-Cysteins (Position 51 in der Sequenz, wie in 11 gezeigt). In einem reifen Persephin-Molekül, auf der Basis der Homologie zu GDNF, gibt es fünf potenzielle O-gebundene Glykosylierungsstellen in den 43 Aminosäuren oberhalb des ersten kanonischen Gerüst-Cysteins bei den Positionen 9, 15, 18, 22 und 43 in SEQ ID NO: 81 (entsprechend den Positionen 17, 23, 26, 30 und 51 in der Sequenz, wie sie in 11 gezeigt ist), zusammen mit den oben erwähnten zehn potenziellen O-gebundenen Glykosylierungsstellen in dem Bereich zwischen den kanonischen Gerüst-Cysteinen (entsprechend den Positionen 48, 50, 62, 74, 81, 84, 105, 106, 111 und 126 in SEQ ID NO: 81 und den Positionen 56, 58, 70, 82, 89, 92, 113, 114, 119 und 134 in der Sequenz, wie sie in 11 gezeigt ist).
Unterschiedliche mögliche Spaltungsstellen können in der Pre-Pro-Neurturinsequenz vorliegen. Die Aminosäuresequenz des reifen Maus-Neurturins (5, SEQ ID NO: 2) wird vorhergesagt von der Ausrichtung mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Neurturins des chinesischen Hamsters. Eine vier Reste aufweisende RRAR-Spaltungsstelle (Aminosäuren 92–95) wurde direkt vor der vorausgesagten N-terminalen Aminosäure des reifen Maus-Neurturins gefunden. Diese RRAR-Sequenz passt zu der RXXR-Consensussequenz, bei der die Mitglieder der TGF-β-Superfamilie gewöhnlich gespalten werden. Diese vermutliche RRAR-Spaltungssequenz bleibt in menschlichem Neurturin erhalten. Jedoch wird vorausgesagt, dass reifes menschliches Neurturin eine N-terminale Erstreckung um zwei Aminosäuren im Vergleich zu reifem Maus-Neurturin aufweist, wenn an dieser Sequenz gespalten wird. Da Neurturin andere Sequenzen enthält, welche den RXXR-Consensus erfüllen (beispielsweise die Sequenz RRRR bei den Aminosäuren 90–93), und die bei dieser Spaltung involvierten Proteasespezifitäten nicht vollständig verstanden werden, besteht die Möglichkeit, dass in einigen Situationen Neurturin an von der obigen RRAR-Sequenz verschiedenen Stellen gespalten wird, und das reife Neurturin-Protein kann eine variable Zahl von Aminosäuren aufweisen, welche dem Cysteinrest an der Position 101 in der Maussequenz (Pre-Pro-Protein) und der Position 103 in der menschlichen Sequenz vorausgehen. Solche sich ändernde Spaltungsstellen könnten bei verschiedenen Organismen und bei unterschiedlichen Geweben desselben Organismus auf verschiedene Weise verwendet werden. Die N-terminalen Aminosäuren, welche dem ersten der sieben erhaltenen Cysteine in den reifen Formen der Mitglieder der TGF-β-Familie vorangehen, variieren weitreichend sowohl in der Länge als auch in der Sequenz. Darüber hinaus beeinflusst das Einsetzen einer Sequenz von zehn Aminosäuren zwei Reste oberhalb des ersten erhaltenen Cysteins nicht die bekannten biologischen Wirkungen eines Familienmitglieds, Dorsalin (Basler, K., Edlund, T., Jessell, T. M. und Yamada, T. (1993), Cell 73: 687–702). Folglich würden Neurturin-Proteine, welche Sequenzen unterschiedlicher Längen enthalten, die dem Cystein 101 bei der Maus und dem Cystein 103 beim Menschen vorangehen, wahrscheinlich ihre biologische Wirkung beibehalten.
Es wird ebenso angenommen, dass Persephin-Proteine, welche Sequenzen unterschiedlicher Längen vor dem ersten Cystein aufweisen (Rest Nr. 1 des Maus-Persephins in 12 und Rest Nr. 1 des Rattenpersephins in 14), wahrscheinlich ihre biologische Wirkung beibehalten.
Die Erfinder hierin glauben, dass die Sequenz des Neurturins, welche biologische Wirkung zeigt, mindestens die Sequenz enthält, welche bei dem Cystein 103 beginnt und bei dem Cystein 196 endet für menschliches Neurturin (7, SEQ ID NO: 31) und welche bei dem Cystein 101 beginnt und bei Cystein 194 endet für Maus-Neurturin (7, SEQ ID NO: 32). Somit liegen innerhalb des Umfangs der Neurturin-Polypeptide Aminosäuresequenzen, welche SEQ ID NO: 31 enthalten, und Aminosäuresequenzen, welche SEQ ID NO: 32 enthalten, sowie Nucleinsäuresequenzen, welche für diese Aminosäuresequenzen kodieren.
In ähnlicher Weise glauben die Erfinder hierin, dass die Sequenz von Persephin, welches biologische Wirkung zeigt, mindestens die Sequenz enthält, welche bei dem Cystein 1 beginnt und bei Cystein 87 endet für das Maus-Persephin (12, SEQ ID NO: 79) und welche bei dem Cystein 1 beginnt und bei dem Cystein 87 endet für Ratten-Persephin (14, SEQ ID NO: 82). Folglich liegen innerhalb des Umfangs von Persephin der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenzen, welche SEQ ID NO: 79 enthalten, und Aminosäuresequenzen, welche SEQ ID NO: 82 enthalten, sowie Nucleinsäuresequenzen, welche für diese Aminosäuresequenzen kodieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso Nucleinsäuresequenzen, einschließlich Sequenzen, welche für Maus- und Ratten-Persephin (11 und 14) sowie für menschliches Persephin kodieren, in derselben Weise, wie Neurturin Menschen- und Maus-Neurturin-Nucleinsäuresequenzen umfasst (7 und 8). Ebenso enthalten innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind Sequenzen, welche im Wesentlichen dieselben wie die Nucleinsäuresequenzen sind, die jeweils für Persephin oder Neurturin kodieren. Solche im Wesentlichen identischen Sequenzen sind beispielsweise substituiert mit Codons, welche in einer gegebenen Wirtszelle, wie E. Coli, gemäß bekannten Standardverfahren leichter exprimiert werden. Solche modifizierten Nucleinsäuresequenzen sind innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung enthalten.
Spezifische Nucleinsäuresequenzen können durch den Fachmann modifiziert werden, und folglich können sämtliche Nucleinsäuresequenzen, welche für die Aminosäuresequenzen von Pre-Pro-Neurturin oder Persephin oder die Pre-Region oder die Pro-Region von Neurturin oder Persephin kodieren, in ähnlicher Weise modifiziert sein. Die vorliegende Erfindung schließt folglich ebenso eine Nucleinsäuresequenz ein, welche mit sämtlichen solcher Nucleinsäuresequenzen hybridisieren – oder Komplementäre der Nucleinsäuresequenzen, sofern diese geeignet sind – und für ein Polypeptid mit einer das Zellüberleben oder das Wachstum fördernden Wirkung kodieren. Die vorliegende Erfindung schließt ebenso Nucleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide kodieren, die eine überlebens- oder wachstumsfördernde Wirkung aufweisen und welche von Antikörpern, welche an Neurturin binden, oder von Antikörpern, welche an Persephin binden, erkannt werden, ein.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso Vektoren, welche die Expression regulierende Elemente umfasst, die an irgendeine der Nucleinsäuresequenzen, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, operabel verknüpft sind. Diese Erfindung umfasst ebenso Wirtszellen – irgendeiner Art –, welche mit Vektoren transformiert wurden, die die Exprimierung regulierende Elemente umfassen, welche an irgendeine der Nucleinsäuresequenzen, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen, operabel verknüpft sind.
Verfahren zur Herstellung von Neurturin oder Persephin werden ebenso hierin zur Verfügung gestellt. Die Herstellung kann durch Isolierung von einem konditionierten Medium von einer Vielzahl von Zelltypen erfolgen, solange der Zelltyp Neurturin oder Persephin bildet. Ein zweites und bevorzugtes Verfahren umfasst die Verwendung von rekombinanten Methoden durch Isolierung einer Nucleinsäuresequenz, welche für Neurturin oder Persephin kodiert, das Klonen der Sequenz zusammen mit geeigneten Regulationssequenzen in geeignete Vektoren und Zelltypen und die Exprimierung der Sequenz unter Bildung von Neurturin oder Persephin.
Eine Säugergenfamilie, welche vier neurotrophe Faktoren umfasst, wurde identifiziert, einschließlich des Nervenwachstumsfaktors (NGF), des Hirn-abgeleiteten neurotrophen Faktors (BDGF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4/5 (NT-4/5). Diese Faktoren teilen ungefähr 60% Nucleinsäuresequenz-Homologie (Tuszynski und Gage, Ann. Neurol. 35: S9–S12, 1994). Das Persephin-Protein und das Neurturin-Protein zeigen keine deutliche Homologie zu der NGF-Familie von neurotrophen Faktoren. Entweder Persephin oder Neurturin teilt weniger als ungefähr 20% Homologie mit der TGF-β-Superfamilie von Wachstumsfaktoren. Jedoch zeigen sowohl Persephin als auch Neurturin ungefähr 40% Sequenzidentität mit GDNF und ungefähr 50% Sequenzidentität untereinander. Insbesondere sind die Positionen der sieben Cysteinreste, welche in Persephin, Neurturin und GDNF vorliegen, annähernd exakt erhalten. Die Erfinder hierin glauben, dass andere unidentifizierte Gene existieren könnten, welche Proteine kodieren, die im Wesentlichen eine Aminosäuresequenz-Homologie zu Persephin, Neurturin und GDNF aufweisen und welche als Wachstumsfaktoren selektiv für dieselben oder unterschiedlichen Gewebe und dieselben oder unterschiedlichen biologischen Wirkungen fungieren und welche an denselben oder unterschiedlichen Rezeptoren wirken können. Ein unterschiedliches Wirkungsspektrum hinsichtlich der betroffenen Gewebe und/oder der gewonnenen Antwort könnte von einer vorherigen Aktivierung unterschiedlicher Rezeptoren durch unterschiedliche Familienmitglieder herrühren, wie es für Mitglieder der NGF-Familie von neurotrophen Faktoren bekannt ist (Tuszynski und Gage, 1994, supra).
Als eine Konsequenz von Mitgliedern besonderer Genfamilien, welche im Wesentlichen den Erhalt der Aminosäuresequenz in den Proteinprodukten der Familienmitglieder zeigen, kommt es zu einem deutlichen Erhalt von Sequenzen auf dem DNA-Level. Dieses bildet die Basis für ein neuen Ansatz zur Identifizierung anderer Mitglieder der Genfamilie, zu der GDNF, Neurturin und Persephin gehören. Das für eine solche Identifizierung verwendete Verfahren stellt die Kreuzhybridisierung dar, welche von einem Familienmitglied abgeleitete Nucleinsäuresonden verwendet, wobei ein stabiles Hybrid-Duplex-Molekül mit einer Nucleinsäuresequenz von unterschiedlichen Mitgliedern der Genfamilie gebildet wird oder wodurch Nucleinsäuresequenzen von unterschiedlichen Familienmitgliedern amplifiziert werden. (Siehe beispielsweise Kaisho et al., FEBS Letters 266: 187–191, 1990). Die Sequenz von dem unterschiedlichen Familienmitglied sollte nicht identisch zu der Sonde sein, wird allerdings nichtdestotrotz zu der Sondensequenz zur Hybridisierung mit der Sonde ausreichend verwandt sein. Alternativ kann die PCR unter Verwendung von Primern von einem Familienmitglied zur Identifizierung zusätzlicher Familienmitgliedern verwendet werden.
Die obengenannten Ansätze waren bisher in der Identifizierung anderer Genfamilienmitglieder nicht erfolgreich, weil nur ein Familienmitglied, GDNF, bekannt war. Mit der Identifizierung von Neurturin in der EP-Veröffentlichung EP 0 787 142 können jedoch erstmalig neue Sonden und Primer vorgesehen werden, welche Sequenzen von den erhaltenen Regionen dieser Genfamilie enthalten. Dieselben erhaltenen Regionen werden ebenso in dem dritten Familienmitglied, Persephin, gefunden. Insbesondere wurden drei erhaltene Regionen hierin identifiziert, welche als eine Basis für den Aufbau neuer Sonden und Primer verwendet werden können. Die neuen Sonden und Primer, welche durch die Arbeit mit Neurturin und Persephin zugänglich wurden, ermöglichen diesen vielseitigen neuen Ansatz, welcher nun erfolgreich andere Genfamilienmitglieder identifizieren kann. Unter Verwendung dieses neuen Ansatzes kann nach zu GDNF, Neurturin und Persephin in der Sequenzhomologie verwandten Genen gescreent werden durch Herstellen von DNA- oder RNA-Sonden auf der Basis der erhaltenen Bereiche in den GDNF- und Neurturin-Molekülen. Daher umfasst eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Sonden und Primer, welche einer Nucleotidsequenz, welche für solche erhaltene Regionen kodieren, entsprechen oder davon abgeleitet sind sowie ein Verfahren zur Identifizierung weiterer Mitglieder der Neurturin-Persephin-GDNF-Genfamilie.
Die Aminosäuresequenzen des erhaltenen Bereichs wurden hierin identifiziert und umfassen Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa₁ Ser, Thr oder Ala und Xaa₂ Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 108); Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₄-Gly-Xaa₅-Cys, worin Xaa₁ Thr, Glu oder Lys ist, Xaa₂ Val, Leu oder Ile darstellt, Xaa₃ Leu oder Ile ist, Xaa₄ Ala oder Ser darstellt und Xaa₅ Ala oder Ser ist (SEQ ID NO: 113); und Cys-Cys-Xaa₁-Pro-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Asp-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Phe-Leu-Asp-Xaa₉, worin Xaa₁ Arg oder Gln ist, Xaa₂ Thr oder Val oder Ile darstellt, Xaa₃ Ala oder Ser ist, Xaa₄ Tyr oder Phe ist, Xaa₅ Glu, Asp oder Ala darstellt, Xaa₆ Glu, Asp oder keine Aminosäure ist, Xaa₇ Val oder Leu darstellt, Xaa₈ Ser oder Thr ist und Xaa₉ Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 114). Die Nucleotidsequenzen, welche eine Kodierungssequenz für die obigen erhaltenen Sequenzen oder Fragmente der obigen erhaltenen Sequenzen aufweisen, können als Sonden verwendet werden. Beispielhafte Sonden- und Primersequenzen, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, sind SEQ ID NOS: 125–129; Primer, deren reverse komplementäre Sequenzen Aminosäuresequenzen kodieren, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 130; und insbesondere Nucleotidsequenzen SEQ ID NOS: 115–124. Zusätzliche Primer auf der Basis von GDNF und Neurturin umfassen Nucleinsäuresequenzen, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40 und SEQ ID NO: 41; Primer, deren reverse komplementäre Sequenzen kodieren SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 und SEQ ID NO: 39; und insbesondere Nucleinsäuresequenzen SEQ ID NOS: 42–48.
Die Hybridisierung unter Verwendung der neuen Sonden von erhaltenen Regionen der Nucleinsäuresequenzen kann unter verminderten Stringenzbedingungen durchgeführt werden. Die in der Bestimmung der Stringenzbedingungen involvierten Faktoren sind im Stand der Technik bekannt (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1989). Nucleinsäurequellen zum Screenen umfassen Genom-DNA-Bibliotheken von Säugerarten oder cDNA-Bibliotheken, welche unter Verwendung von RNA, erhalten von Säugerzellen, die in irgendeinen geeigneten Vektor geklont sind, erstellt wurden.
PCR-Primer werden unter PCR-Bedingungen einer verminderten Annealtemperatur, welche die Vervielfältigung der Sequenzen von Genfamilienmitgliedern abgesehen von GNDF, Neurturin und Persephin erlauben, verwendet. Nucleinsäurequellen zum Screenen umfassen Genom-DNA-Bibliotheken für Säugerarten, welche in irgendeinen geeigneten Vektor geklont sind, von RNA transkribierte cDNA, erhalten aus Säugerzellen, und Genom-DNA von Säugerarten.
Auf der Basis der Hybridisierung oder von PCR-Assays identifizierte DNA-Sequenzen werden sequenziert und mit GDNF, Neurturin und Persephin verglichen. Die DNA-Sequenzen, welche die Gesamtsequenz des neuen Faktors kodieren, würden anschließend in derselben Weise wie hierin beschrieben erhalten werden. Genom-DNA oder Bibliotheken von Genom-Klonen können ebenso als Template verwendet werden, weil die Intron-/Exon-Strukturen von GDNF und Neurturin erhalten bleiben und die Kodierungssequenzen der reifen Proteine nicht von Introns unterbrochen sind.
Unter Verwendung dieses oben beschriebenen Ansatzes wurden die von den erhaltenen Regionen von Neurturin und GDNF abgeleiteten Primer zur Identifizierung und zum Erhalt der Sequenz des neuen hierin beschriebenen Familienmitglieds, Persephin, verwendet. Degenerierte Primer, welche von Persephin, Neurturin und GDNF abgeleitet sind, können weiterhin zur Identifizierung und zum Erhalt zusätzlicher Familienmitglieder verwendet werden.
Es wird angenommen, dass sämtliche GDNF-Neurturin-Persephin-Familienmitglieder einen hohen Grad an Sequenzidentität mit ein oder mehreren der drei Consensusregionen der identifizierten Familienmitglieder in dem Abschnitt der Sequenz zwischen dem ersten und siebten kanonischen Gerüstcystein aufweisen (siehe 12). Insbesondere wird bei einem neuen Familienmitglied mindestens eine Identität von 62,5% mit dem Consensusabschnitt-Octapeptid, Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa₁ Ser, Thr oder Ala ist, und Xaa₂ Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 108), oder mindestens eine Sequenzintensität von 62,5% mit dem Consensusabschnitt-Octapeptid, Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys, worin Xaa₁ und Xaa₂ Alanin oder Serin darstellen (SEQ ID NO: 109), oder mindestens eine Sequenzintensität von 50% mit dem Consensuabschnitt-Octapeptid, Asp-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Leu-Asp-Xaa₄, worin Xaa₁ Asparaginsäure oder Glutaminsäure oder keine Aminosäure darstellt, Xaa₂ Valin oder Leucin ist, Xaa₃ Serin oder Threonin darstellt; und Xaa₄ Valin oder Asparaginsäure ist (SEQ ID NO: 110), erwartet. Die Erfinder hierin glaubten, dass jedes neue Familienmitglied 28 Aminosäuren in der ausgerichteten Sequenz zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüst-Cystein-Resten aufweist, wie es in 15 gezeigt ist, wobei die Reste von dem N-terminalen Ende der ausgerichteten Sequenz des Familienmitglieds (1) Cys, (3) Leu, (10) Val, (13) Leu, (14) Gly, (15) Leu, (16) Gly, (17) Tyr, (21) Glu, (25) Phe, (26) Arg, (27) Tyr, (28) Cys, (30) Gly, (32) Cys, (44) Leu, (47) Leu, (58) Cys, (59) Cys, (61) Pro, (66) Asp, (69) Phe, (70) Leu, (71) Asp, (83) Ser, (84) Ala, (87) Cys und (89) Cys sind. Jedoch ist es möglich, dass es bis zu drei Fehlanpassungen bzw. fehlerhaften Paarungen kommt.
Obwohl Neurturin auf der Basis seiner Fähigkeit der Förderung des Überlebens eines spezifischen Neuronal-Typs aufgereinigt wurde, wirkt dieser Faktor auf andere neuronale Zelltypen ebenso. Beispielsweise wird hierin gezeigt, dass Neurturin das Überleben von Knoten-(Nodose)-Sensor-Ganglia-Neuronen (siehe Beispiel 3) fördert. Neurturin fördert ebenso wahrscheinlich das Überleben von nichtneuronalen Zellen. In der Tat hat sich für sämtliche bisher isolierte Wachstumsfaktoren gezeigt, dass sie auf viele verschiedene Zelltypen wirken (siehe beispielsweise Scully und Otten, Cell. Biol. Int. 19: 459–469, 1005; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25: 1418–1435, 1994). Es ist bekannt, dass NGF auf sympathische Neuronen, verschiedene Typen von Sensorneuronen und bestimmte Populationen von CNS-Neuronen wirkt. Es wurde gezeigt, dass GDNF, das näher mit Neurturin verwandt ist, auf dopaminerge, sympathische Motor- und verschiedene Sensorneuronen wirkt (Henderson et al., supra, 1994; Miles et al., J. Cell. Biol. 130: 137–148, 1995; Yan et al., Nature 373: 341–344, 1995; Lin et al., Science 260: 1130–1132, 1993; Trupp et al., J. Cell. Biol. 130: 137–148, 1995; Martin et al., Brain Res. 683: 172–178, 1995; Bowenkamp st al., J. Comp. Neurol. 355: 479–480, 1995). Folglich ist es wahrscheinlich, dass Neurturin zusätzlich zu periphären sympathischen und sensorischen Neuronen auf eine breite Vielfalt von zentral- und peripheral-neuronale Zelltypen wirkt.
Auf der Basis der strukturellen Ähnlichkeiten von Persephin zu den Sequenzen von Neurturin und GDNF wird ebenso angenommen, dass Persephin das Überleben und das Wachstum von neuronalen sowie von nichtneuronalen Zellen fördert. In der Tat, wie bereits oben angegeben wurde, zeigten sämtliche bisher isolierte Wachstumsfaktoren eine Wirkung auf viele unterschiedliche Zelltypen (Scully und Otten, Cell. Biol. Int. 19: 459–469, 1005; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25: 1418–1435, 1994). Darüber hinaus haben die Erfinder hierin Hirn- und Herz-Gewebe als Persephin-exprimierende Gewebe identifiziert, was weiterhin die Schlussfolgerung stützt, dass Persephin zur Förderung des Überlebens und Wachstums in einer Vielzahl von neuronalen und nichtneuronalen Zellen wirken kann.
Als ein Beispiel für die Wirkungen von neurotrophen Faktoren auf nichtneuronale Gewebe wirkt der prototypische neurotrophe Faktor, NGF, ebenso auf Mastzellen, sodass deren Anzahl bei Injektion in neugeborene Ratten erhöht wird (Aloe, J. Neuroimmunol. 18: 1–12, 1988). Zusätzlich exprimieren Mastzellen den trk-Rezeptor und antworten auf NGF, sodass NGF ein Mastzellen-Sekretagogum und das Überleben fördernder Faktor (Horigome et al., J. Biol. Chem. 269: 2695–2707, 1994) ist. Darüber hinaus wirken Mitglieder der TGF-β-Superfamilie auf viele Zelltypen mit unterschiedlicher Funktion und embryologischem Ursprung.
Die Erfinder hierin haben verschiedene nichtneuronale Gewebe identifiziert, in denen Neurturin exprimiert wird, einschließich dem Blut, Knochenmark, neonatalen Leber- und Mastzellen. Dieses legt eine Rolle für Neurturin in der Hämatopoese, Entzündung, Allergie und Cardiomyopathie nahe.
In ähnlicher Weise haben die Erfinder hierin das Gehirn und das Herz als Gewebe identifiziert, in denen Persephin exprimiert wird, und es wird weiterhin angenommen, dass Persephin in einer Vielzahl von anderen neuronalen und nichtneuronalen Geweben exprimiert wird. Folglich kann Persephin ebenso eine Rolle in der Hämatopoese, Entzündung, Allergie und bei Cardiomyopathien aufweisen.
Es wird angenommen, dass neurotrophe Faktoren der NGF-Familie über Faktor-spezifische Rezeptoren hoher Affinität wirken (Tuszynski und Gage, 1994, supra). Nur besondere Abschnitte des Proteins, welche als eine Rezeptorstelle wirken, sind für das Binden an den Rezeptor erforderlich. Solche besonderen Abschnitte oder diskrete Fragmente können als ein Agonist wirken, wobei die Substanz den Rezeptor unter Auslösen der fördernden Wirkung auf das Zellüberleben und das Wachstum aktiviert, und als Antagonisten zu Neurturin oder Persephin, wo sie an den Rezeptor binden, allerdings diesen nicht aktivieren, oder ein Überleben und Wachstum fördern. Solche Abschnitte oder Fragmente, welche Agonisten darstellen, und jene, die Antagonisten sind, liegen ebenso innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Synthetische Form(pan)-Wachstumsfaktoren können ebenso durch Kombinieren der aktiven Domainen von Persephin oder Neurturin mit den aktiven Domainen von ein oder mehreren anderen Wachstumsfaktoren aufgebaut werden. (Siehe beispielsweise Ilag et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92: 607–611, 1995). Diese Form-Wachstumsfaktoren, so wird angenommen, weisen die kombinierten Aktivitäten von Neurturin oder Persephin und dem einen oder den mehreren anderen Wachstumsfaktoren auf. Ebenso wird angenommen, dass sie potente und multispezifische Wachstumsfaktoren darstellen, welche in der Behandlung eines breiten Spektrums von degenerativen Erkrankungen und Zuständen, einschließich von Erkrankungen, welche durch sämtliche der zugrunde liegenden Faktoren, von denen die aktiven Domainen erhalten wurden, behandelt werden können, nützlich sind. Solche Form-Wachstumsfaktoren können ebenso synergistische Effekte jenseits der Aktivitäten der zugrunde liegenden Faktoren zur Verfügung stellen (Barres et al., supra).
Form-Wachstumsfaktoren innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung können ebenso Chimäre- oder Hybrid-Polypeptide einschließen, welche ebenso aus Abschnitten von Fragmenten von mindestens zwei Wachstumsfaktoren aufgebaut sind. Wachstumsfaktoren der TGF-β-Superfamilie sind strukturell verwandt und weisen hoch-konservierte Sequenzgrenzen auf, wodurch die Familienmitglieder identifiziert werden. Insbesondere sind sieben kanonische Grundgerüst-Cystein-Reste annähernd invariant in den Mitgliedern der Superfamilie (Kingsley, Genes & Dev. 8: 133–146, 1994) (siehe 17). Chimäre Polypeptidmoleküle können daher aufgebaut sein aus einer Sequenz, welche im Wesentlichen identisch zu einem Abschnitt von entweder dem Persephin- oder dem Neurturin-Molekül ist, bis zu ein oder mehreren Kreuzpunkten, und ein oder mehreren Sequenzen, die jeweils im Wesentlichen identisch sind mit einem Abschnitt eines anderen TGF-β-Superfamilien-Mitglieds, welches sich auf der anderen Seite des/der entsprechenden ein oder mehreren Kreuzpunkte erstreckt. Beispielsweise kann ein Abschnitt des Amino-terminalen Endes des Persephin-Polypeptids mit einem Abschnitt des Carboxy-terminalen Endes eines Neurturin-Polypeptids kombiniert werden, oder alternativ kann ein Abschnitt des Amino-terminalen Endes eines Neurturin-Polypeptids mit einem Abschnitt des Carboxy-terminalen Endes eines Persephin-Polypeptids kombiniert werden. Solche Abschnitte von Neurturin- oder Persephin-Polypeptiden reichen vorzugsweise von ungefähr 5 bis ungefähr 95, besonders bevorzugt von ungefähr 10 bis ungefähr 90, noch mehr bevorzugt von ungefähr 20 bis ungefähr 80 und am meisten bevorzugt von ungefähr 30 bis ungefähr 70 zusammenhängenden Aminosäuren, und solche Abschnitte eines anderen Nicht-Persephin oder, je nach dem, Nicht-Neurturin TGF-β-Superfamilien-Mitglieds beinhalten bevorzugt ungefähr 5 bis ungefähr 95, besonders bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 90, noch mehr bevorzugt ungefähr 20 bis ungefähr 80 und am meisten bevorzugt ungefähr 30 bis ungefähr 70 zusammenhängende Aminosäuren. Beispielsweise kann ein besonderer Kreuzpunkt zwischen den dritten und vierten kanonischen Gerüst-Cystein-Resten liegen. Ein solches beispielhaftes Konstrukt würde an dem 5'-Ende eine Sequenz, welche eine Persephinsequenz vom Rest 1 bis zum dritten kanonischen Gerüst-Cystein-Rest 37 und bis zu einem Kreuzpunkt irgendwo zwischen dem Rest 37 und dem Rest 63, allerdings ohne den vierten kanonischen Gerüst-Cystein-Rest 64 einzuschließen, umfasst, enthalten (zur Verdeutlichung siehe das reife Persephin, SEQ ID NO: 80). Das 3'-Ende des Hybrid-Aufbaus würde eine Sequenz darstellen, welche von einem anderen TGF-β-Superfamilienmitglied abgeleitet ist, wie beispielsweise Neurturin, welches ein anderes TGF-β-Superfamilienmitglied darstellt, welches Persephin nah verwandt ist. Unter Verwendung von Neurturin als anderes TGF-β-Familienmitglied würde der Hybrid-Aufbau jenseits des Kreuzpunktes eine Sequenz umfassen, welche an dem gewünschten Kreuzpunkt in der Neurturin-Sequenz zwischen dem dritten kanonischen Gerüst-Cystein-Rest 37 und dem vierten kanonischen Gerüst-Cystein-Rest 67 von Neurturin beginnt und über den Rest 100 an dem 3'-Ende von Neurturin sich fortsetzt (für die Ausrichtung siehe 12). Ein zweiter beispielhafter Hydrid-Aufbau würde den Rest 1 über einen Kreuzpunkt zwischen den Resten 37 und 67 von Neurturin umfassen, angrenzend verknüpft mit Resten von dem Kreuzpunkt zwischen den Resten 37 und 64 bis zum Rest 96 von Persephin. Die obengenannten Konstrukte mit Persephin und Neurturin sollen lediglich als Beispiele mit dem spezifischen TGF-β-Familienmitglied dienen, welches ausgewählt ist aus den Familienmitgliedern, einschließlich, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, dem transformierenden Wachstumsfaktor-β1 (TGFβ1), dem transformierenden Wachstumsfaktor-β2 (TGFβ2), dem transformierenden Wachstumsfaktor-β3 (TGFβ3), Inhibin β A (INHβA), Inhibin β B (INHβB), dem Nodal-Gen (NODAL), der morphogenetischen Knochenproteine 2 und 4 (BMP2 und BMP4), dem Drosophiladecapentaplegic-Gen (dpp), der morphogenetischen Knochenproteine 5–8 (BMP5, BMP6, BMP7 und BMP8), der Drosophila-60A-Genfamilie (60A), dem morphogenetischen Knochenprotein 3 (BMP3), dem Vg1-Gen, der Wachstumsdifferenzierungsfaktoren 1 und 3 (GDF1 und GDF3), Dorsalin (drsln), Inhibin-α-(INHα), des MIS-Gens (MIS), Wachstumsfaktor 9 (GDF-9), dem Glial-abgeleiteten neutrotropen Wachstumsfaktor (GDNF), Neurturin (NTN) und Persephin (siehe 16). Zusätzlich kann der Kreuzpunkt irgendeinen Rest zwischen den ersten und siebten kanonischen Gerüst-Cystein-Molekülen von Neurturin und dem speziellen anderen Familienmitglied darstellen. Darüber hinaus können zusätzliche Kreuzpunkte zum Einführen irgendeiner erwünschten Zahl von Persephin-Abschnitten oder Fragmenten mit Abschnitten oder Fragmenten von irgendeinem oder mehreren anderen Familienmitgliedern verwendet werden.
Beim Aufbau eines besonderen Chimären-Moleküls werden die Abschnitte von Persephin und die Abschnitte des anderen Nicht-Persephin-Wachstumsfaktors unter Verwendung von PCR vervielfältigt/amplifiziert, gemischt und als Templat für eine PCR-Reaktion unter Verwendung des Forward-Primers (Vorwärts-Primer) von dem einen und des Reverse-Primers (Rückwärts-Primer) von dem anderen der beiden Komponentabschnitten des chimären Moleküls eingesetzt. Folglich sind beispielsweise ein Vorwärts- und Rückwärts-Primer ausgewählt, um den Abschnitt von Persephin von dem Anfang zu dem ausgewählten Kreuzpunkt zwischen den dritten und vierten kanonischen Cystein-Resten zu vervielfältigen bzw. zu verstärken, wobei ein Persephin-Plasmid als Templat verwendet wird. Ein Vorwärts-Primer mit einem mit der Persephinsequenz überlappenden 5'-Abschnitt und ein Rückwärts-Primer werden anschließend zur Vervielfältigung des Abschnitts des anderen Nicht-Persephin-Wachstumsfaktors-Mitglieds der TGF-β-Superfamilie von dem entsprechenden Kreuzpunkt bis zum 3'-Ende unter Verwendung eines Plasmid-Templats, welches die Kodierungssequenz für das Nicht-Persephin-TGF-β-Familienmitglied enthält, verwendet. Die Produkte der zwei PCR-Reaktionen werden gelgereinigt und zusammen vermischt, und eine PCR-Reaktion wird durchgeführt. Unter Verwendung eines Aliquots dieser Reaktion als Templat wird eine PCR-Reaktion unter Verwendung des Persephin-Vorwärts-Primers und des Rückwärts-Primers für den Nicht-Persephin-Wachstumsfaktor durchgeführt. Das Produkt wird anschließend in einen Expressionsvektor zur Bildung des chimären Moleküls geklont.
Man nimmt an, dass die chimären Wachstumsfaktoren in der Förderung des Wachstums und der Entwicklung von Zellen und zur Verwendung in der Vorbeugung der Atrophie, der Degeneration oder dem Tod von Zellen, insbesondere in Neuronen wirksam sind. Die chimären Polypeptide können ebenso als ein Rezeptor-Antagonist einer oder beider der Wachstumsfaktoren in voller Länge, von denen das chimäre Polypeptid abgeleitet wurde, oder als ein Antagonist irgendeines anderen Wachstumsfaktors, der an denselben Rezeptor oder den Rezeptoren wirkt, dienen.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, welche Persephin oder Neurturin in einer wirksamen Menge enthalten, zur Behandlung von Patienten mit einer zellulären Degeneration oder Fehlfunktion, sowie ein Verfahren, umfassend die Verarbreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Neurturin oder Persephin. Diese Zusammensetzungen und Verfahren sind nützlich zur Behandlung einer Vielzahl von degenerativen Er krankungen. Wenn die zelluläre Degeneration die neuronale Degeneration einschließt, umfassen diese Erkrankungen, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, die periphäre Neuropathie, amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Parkinsonismus, Huntington-Chorea, den ischämichen Infarkt, akute Hirnverletzung, akute Rückenmarksverletzung, Tumoren des Nervensystems, Multiple Sklerose, periphäre Nerventraumata oder -verletzungen, Aussetzung gegenüber Neurotoxinen, metabolische Erkrankungen, wie Diabetes oder Niervenfehlfunktionen und die durch infektiöse Mittel bedingte Schäden. Insbesondere die Fähigkeit von Persephin, das Überleben in Mittelhirnzellen zu fördern, legt eine Anwendbarkeit dieses Wachstumsfaktors in der Behandlung von neuronalen degenerativen Erkrankungen des CNS, wie der Parkinsonschen Erkrankung, nahe.
Wenn die zelluläre Degeneration eine Knochenmarkzellendegeneration einschließt, umfassen diese Erkrankungen, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, Erkrankungen unzureichender Blutzellen, wie beispielsweise Leukopenien, einschließlich Eosinopenie und/oder Basopenie, Lymphopenie, Monocytopenie, Neutropenie, Anämien, Thrombocytopenie sowie eine Insuffizienz der Stammzellen bei einem der Obengenannten. Die zelluläre Degeneration kann ebenso Herzmuskelzellen bei Krankheiten, wie der Cardiomyopathie und der kongestiven Herzinsuffizienz, einschließen. Die obengenannten Zellen und Gewebe können ebenso hinsichtlich einer unterdrückten bzw. verminderten Funktion behandelt werden.
Die Zusammensetzungen und Verfahren hierin können ebenso zur Vorbeugung der Degeneration und/oder zur Förderung des Überlebens auch in anderen nichtneuronalen Geweben verwendet werden. Der Fachmann kann unter Verwendung einer Vielzahl von Assays, welche im Stand der Technik zur Identifizierung bekannt sind, leicht bestimmen, ob Neurturin oder Persephin in der Förderung des Überlebens oder der Funktion in einem spezifischen Zelltyp nützlich ist.
Unter bestimmten Umständen kann es ebenso wünschenswert sein, die Menge an exprimiertem Persephin oder Neurturin zu modulieren oder zu verringern. Folglich können in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotide hergestellt werden sowie ein Verfahren bereitgestellt werden, welches für das Vermindern des Anteils der Expression von jeweils Persephin oder Neurturin durch eine Zelle, die die Verabreichung eines oder mehrerer Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotide umfasst, verwendet wird. Unter Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotiden werden hierin Oligonucleotide verstanden, welche eine Nucleotidsequenz aufweisen, die über eine Basenpaarung mit einer spezifischen komplementären Nucleinsäuresequenz, welche in der Exprimierung von jeweils Persephin oder Neurturin involviert ist, wechselwirken, sodass die Exprimierung von Persephin oder Neurturin vermindert ist. Vorzugsweise ist die in der Exprimierung von Persephin oder Neurturin involvierte spezifische Nucleinsäuresequenz ein Genom-DNA-Molekül oder mRNA-Molekül, welches Sequenzen des Persephin- oder Neurturin-Gens enthält. Dieses Genom-DNA-Molekül kann flankierende Abschnitte des Persephin- oder Neurturin-Gens, untranslatierte Abschnitte von Persephin- oder Neurturin-mRNA, die Pre- oder Pro-Abschnitte des Persephin- oder Neurturin-Gens oder die Kodierungssequenz für reifes Persephin- oder Neurturin-Protein umfassen. Der Begriff komplementär zu einer Nucleotid-Sequenz in dem Kontext von Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotiden und Verfahren dafür bedeutet ausreichend komplementär gegenüber solch einer Sequenz, um die Hybridisierung mit dieser Sequenz in einer Zelle zu erlauben, d. h. unter physiologischen Bedingungen. Die Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotide umfassen vorzugsweise eine Sequenz, welche ungefähr 8 bis ungefähr 100 Nucleotide enthält, und besonders bevorzugt umfassend die Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotide ungefähr 15 bis ungefähr 30 Nucleotide. Die Persephin- oder Neurturin-Anti-Sense-Oligonucleotide können ebenso eine Vielzahl von Modifikationen enthalten, die eine Resistenz gegenüber nucleolytischem Abbau verleihen, wie beispielsweise modifizierte Internucleosid-Bindungen (Uhlmann und Peyman, Chemical Reviews 90: 543–548, 1990; Schneider und Banner, Tetrahedron Lett. 31: 335, 1990), modifizierte Nucleinsäurebasen und/oder Zucker und ähnliches.
Die therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch eine jegliche geeignete im Stand der Technik bekannte Route verabreicht werden, einschließlich beispielsweise der intravenösen, subkutanen, intramuskulären, transdermalen, intrathecalen oder intracerebralen Verabreichung. Die Verabreichung kann entweder schnell durch Injektion oder innerhalb einer Zeitdauer durch langsame Infusion oder Verabreichung von einer langsam freisetzenden Zubereitung erfolgen. Zur Behandlung von Geweben in dem Zentralnervensystem kann die Verabreichung durch Injektion oder Infusion in das cerebrospinale Fluid (CSF) erfolgen. Wenn Neurturin oder Persephin in Zellen in dem zentralen Nervensystem verabreicht werden sollen, kann die Verabreichung mit ein oder mehreren Mitteln, welche zur Förderung des Eindringens von Neurturin oder Persephin durch die Blut-Hirn-Schranke in der Lage sind, erfolgen.
Persephin oder Neurturin kann ebenso mit Mitteln verbunden oder konjugiert werden, welche die erwünschten pharmazeutischen oder pharmakodynamischen Eigenschaften verleihen. Beispielsweise kann Persephin oder Neurturin an irgendeine im Stand der Technik zur Förderung der Penetration bzw. des Eindringens oder des Transports durch die Blut-Hirn-Schranke bekannten Substanz gekoppelt sein, wie ein Antikörper an den Transferrin-Rezeptor, und mittels intravenöser Injektion ver abreicht werden. (Siehe beispielsweise Friden et al., Science 259: 373–377, 1993). Darüber hinaus kann Persephin oder Neurturin an ein Polymer, wie Polyethylenglykol, stabil gebunden sein, um wünschenswerte Eigenschaften hinsichtlich der Solubilität, Stabilität, der Halbwertszeit und anderer pharmazeutisch annehmbarer Eigenschaften zu erhalten. (Siehe beispielsweise Davis et al., Enzyme Eng. 4: 169–73, 1978; Burnham, Am. J. Hosp. Pharm. 51: 210–218, 1994).
Die Zusammensetzungen werden gewöhnlich in der Form von pharmazeutischen Zubereitungen eingesetzt. Solche Zubereitungen werden in einer im pharmazeutischen Stand der Technik bekannten Weise hergestellt. Eine bevorzugte Zubereitung verwendet einen Träger von physiologischer Salzlösung, allerdings wird in Erwägung gezogen, dass andere pharmazeutisch annehmbare Träger, wie physioglogische Konzentrationen anderer nichttoxischer Salze, 5%-ige wässrige Glucoselösung, steriles Wasser oder ähnliches, ebenso verwendet werden können. Es kann ebenso wünschenswert sein, dass ein geeigneter Puffer in der Zusammensetzung vorliegt. Solche Lösungen können, sofern dieses erwünscht ist, lyophilisiert und in einer sterilen Ampulle, welche für die Wiederherstellung durch Zugabe von sterilem Wasser für die Injektion vorgesehen sind, gelagert werden. Das primäre Lösungsmittel kann wässrig oder alternativ nicht wässrig sein. Persephin oder Neurturin kann ebenso in eine feste oder halbfeste biologisch kompatible Matrix, welche in eine Behandlung erfordernde Gewebe implatiert werden kann, eingefügt werden.
Der Träger kann ebenso andere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe zur Modifizierung oder zum Erhalt des pH-Wertes, der Osmolarität, der Viskosität, der Klarheit, der Farbe, der Sterilität, der Stabilität, der Auflösungsrate oder des Geruchs der Zubereitung enthalten. In ähnlicher Weise kann der Träger noch weitere pharmazeutisch annehmbare Hilfsmittel zur Modifizierung oder zum Erhalt der Freisetzung oder der Absorption oder der Penetration durch die Blut-Hirn-Schranke enthalten. Solche Trägerstoffe sind jene Substanzen, welche gewöhnlich und herkömmlich zur Formulierung von Dosierungen für die parenterale Verabreichung in entweder Einheitsdosierungs- oder Mehrfachdosierungs-Form oder für die direkte Infusion in das cerebrospinale Fluid durch kontinuierliche oder periodische Infusion eingesetzt werden.
Die Dosierungsverabreichung kann in Abhängigkeit von den pharmakokinetischen Parametern der Dosierungsformulierung und der verwendeten Verabreichungsroute wiederholt werden.
Es wird ebenso in Erwägung gezogen, dass bestimmte Formulierungen, welche Persephin oder Neurturin enthalten, oral verabreicht werden. Solche Zubereitungen sind vorzugsweise verkapselt und mit geeigneten Trägern in festen Dosierungsformen formuliert. Einige Beispiele geeigneter Träger, Hilfsstoffe und Verdünnungsmit tel umfassen Lactose, Dextrose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Stärken, Akaziengummit, Calciumphosphat, Alginate, Calciumsilicat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Gelatine, Sirup, Methylcellulose, Methyl- und Propylhydroxybenzoate, Talk, Magnesiumstearat, Wasser, Mineralöl und ähnliches. Die Zubereitungen können zusätzlich Schmier- bzw. Gleitmittel, Benetzungsmittel, Emulgierungs- und Suspendierungsmittel, Konservierungsmittel, Süßstoffe und Geschmacksstoffe enthalten. Die Zusammensetzungen können derartig formuliert sein, dass eine schnelle, andauernde oder verzögerte Freisetzung der Wirkstoffbestandteile nach der Verabreichung an den Patienten durch Einsetzen von im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Verfügung gestellt wird. Die Zubereitungen können ebenso Substanzen enthalten, welche den proteolytischen Abbau vermindern und die Absorption fördern, wie beispielsweise oberflächenaktive Mittel.
Die spezifische Dosierung wird gemäß dem ungefähren Körpergewicht oder der Körperoberfläche des Patienten oder dem Volumen des zu belegenden Körperraums berechnet. Die Dosierung wird ebenso in Abhängigkeit der ausgewählten spezifischen Verabreichungsroute berechnet. Eine darüber hinausgehende Verfeinerung der Berechnungen, welche zur Bestimmung der geeigneten Dosierung für die Behandlung notwendig ist, wird routinemäßig vom Fachmann vorgenommen. Solche Berechnungen können ohne unzumutbares Experimentieren vom Fachmann im Lichte der Aktivität von Neurturin oder GDNF vorgenommen werden. Für Neurturin sind die Daten hinsichtlich der Aktivität in den Zielzellen hierin sowie in der EP-Veröffentlichung EP 0 787 142 beschrieben, und in dem Fall von Persephin wird angenommen, dass die für die Aktivität in einen zellulären Niveau erforderliche Konzentration ähnlich zu der von Neurturin ist. Die Persephin-Aktivität auf einen spezifischen Zielzellentyp kann durch Routineexperimente bestimmt werden. Die exakten Dosierungen werden in Verbindung mit Standard-Dosierungs-Antwort-Studien bestimmt. Es versteht sich von selbst, dass die Menge der letztendlich verabreichten Zusammensetzung durch einen Praktiker im Lichte der relevanten Umstände, einschließlich der zu behandelnden Erkrankung oder Erkrankungen, der Wahl der zu verabreichenden Zusammensetzung, des Alters, des Gewichts und der Antwort des einzelnen Patienten, der Schwere der Symptome des Patienten und der gewählten Verabreichungsroute, bestimmt wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann Persephin oder Neurturin therapeutisch durch Implantieren in Patienten-Vektoren oder zur Herstellung von einer biologisch aktiven Form von Persephin oder Neurturin oder von einer Vorstufe von Persephin oder Neurturin, d. h. einem Molekül, welches leicht in eine biologisch aktive Form von Neurturin durch den Körper umgewandelt werden kann, fähigen Zelle verabreicht werden. In einem Ansatz können Persephin oder Neurturin ausschüttende Zellen in semipermeable Membranen zur Implantierung in einen Patienten eingekapselt werden. Die Zellen können Zellen darstellen, die Persephin oder Neurturin oder eine Vorstufe davon normal exprimieren, oder die Zellen können zur Expression von Persephin oder Neurturin oder eines Vorläufers davon transformiert werden. Es ist bevorzugt, dass die Zelle menschlichen Ursprungs ist und dass das Persephin oder Neurturin menschliches Persephin oder Neurturin darstellt, wenn der Patient ein Mensch ist. Jedoch können die Zubereitungen und Verfahren hierin für veterinäre sowie für menschliche Anwendungen verwendet werden, und der Begriff "Patient", wie er hierin verwendet wird, soll menschliche und veterinäre Patienten einschließen.
Zellen können ex vivo für die Verwendung in der Transplantation oder der Verpflanzung in Patienten gezüchtet werden (Muench et al., Leuk & Lymph 16: 1–11, 1994). In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Persephin oder Neurturin zur Förderung der ex vivo-Vermehrung von einer Zelle für die Transplantation oder Verpflanzung verwendet. Bisherige Verfahren haben Bioreaktor-Kultur-Systeme, welche Faktoren enthalten, wie Erythropoietin, koloniestimulierende Faktoren, Stammzellenfaktor und Interleukine, zur Vermehrung der hämatopoethischen Stammzellen für Erythrocyten, Monocyten, Neutrophile und Lymphocyten verwendet (Verfaillie, Stem Cells 12: 466–476, 1994). Diese Stammzellen können aus dem Knochemark eines menschlichen Spenders, aus menschlichem periphären Blut oder aus Nabelschnurblutzellen isoliert werden. Diese erweiterten Blutzellen werden zur Behandlung von Patienten verwendet, denen es an diesen Zellen als ein Ergebnis spezifischer Erkrankungen oder als ein Ergebnis einer hochdosierten Chemotherapie zur Behandlung eines bösartigen Tumors mangelt (George, Stem Cells 12 (Suppl. 1): 249–255, 1994). In dem Fall eines Zelltransplantats nach der Chemotherapie können autologe Transplantate durch Entfernung von Knochenmarkzellen vor der Chemotherapie, das Vermehren der Zellen ex vivo unter Verwendung von Verfahren, welche ebenso zum Eliminieren von bösartigen Zellen dienen, und durch Transplantieren der vermehrten Zellen zurück in den Patienten nach der Chemotherapie durchgeführt werden (als Überblick siehe Rummel und Van Zant, J. Hematotherapy 3: 213–218, 1994). Da man annimmt, dass Persephin oder Neurturin in der Entwicklung eines Tieres im Blut, Knochenmark und der Leber, Geweben, bei denen die Proliferation und Differentation von Stammzellen auftritt, exprimiert wird, nimmt man an, dass Persephin oder Neurturin zur Regulierung bzw. Kontrolle der Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen und der Differentiation von reifen hämatopoetischen Zellen dienen kann. Folglich könnte die Zugabe von Persephin oder Neurturin zu Kultursystemen, welche für die ex vivo-Vermehrung von Zellen verwendet werden, die Rate, bei der bestimmte Populationen von Zellen sich vermehren oder differenzie ren, stimulieren und die Effektivität dieser Vermehrungssysteme in der Bildung von für die Transplantation benötigten Zellen verbessern.
Es wird ebenso angenommen, dass Persephin oder Neurturin für die ex vivo-Vermehrung von Vorläuferzellen in dem Nervensystem verwendet werden kann. Die Transplantation oder Verpflanzung von Zellen wird momentan als eine Therapie für Erkrankungen untersucht, bei denen bestimmte Populationen von Neuronen aufgrund der Degeneration verloren gingen, wie beispielsweise in der Parkinsonschen Krankheit (Bjorklund, Curr. Opin. Neurobiol. 2: 683–689, 1992). Neuronale Vorläuferzellen können von tierischen oder menschlichen Spendern oder von menschlichem Fötalgewebe erhalten werden und anschließend in einer Kultur unter Verwendung von Persephin oder Neurturin oder anderen Wachstumsfaktoren vermehrt werden. Diese Zellen können dann in die Patienten verpflanzt werden, wo sie zum Ersatz einiger der aufgrund der Degeneration verlorenen Zellen dienen können. Weil sich gezeigt hat, dass Neurotrophine zur Stimulierung des Überlebens und der Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen in der Lage sind, wie beispielsweise zur NT-3-Stimulierung von sympathischen Neuroplast-Zellen (Birren et al., Develop. 119: 597–610, 1993), könnte Persephin oder Neurturin ebenso in ähnlicher Weise während der Entwicklung des Nervensystems fungieren und könnte in der ex vivo-Vermehrung von neuronalen Zellen nützlich sein.
In einer Anzahl von Umständen wäre es wünschenswert, die Anteile von Persephin oder Neurturin in einem Patienten zu bestimmen. Die Identifizierung von Persephin oder Neurturin zusammen mit dem vorliegenden Bericht, dass Persephin und Neurturin durch eine Anzahl von Geweben exprimiert werden, liefert die Basis für den Rückschluss, dass die Anwesenheit von Persephin oder Neurturin eine normale physiologische Funktion hinsichtlich des Zellenwachstums und -überlebens ausübt. In der Tat sind andere neurotrophe Faktoren dafür bekannt, dass sie eine Rolle in der Funktion von neuronalen und nichtneuronalen Geweben spielen. (Als Überblick siehe Scully und Otten, Cell. Biol. Int. 19: 459–469, 1995; Otten und Gadient, Int. J. Devl. Neurosciences 13: 147–151, 1995). Endogen gebildetes Persephin oder Neurturin kann ebenso eine Rolle in bestimmten Erkrankungen spielen, insbesondere wo eine zelluläre Degeneration auftritt, wie in neurodegenerativen Zuständen oder Erkrankungen. Andere neurotrophe Faktoren sind dafür bekannt, dass sie sich während des Erkrankungsverlaufs ändern. Beispielsweise werden bei der Multiplen Sklerose die Anteile an NGF-Protein in dem cerebrospinalen Fluid während den akuten Phasen der Erkrankung erhöht (Bracci-Laudiero et al., Neuroscience Lett. 147: 9–12, 1992), und bei systemischen Lupus erythematosus besteht ein Zusammenhang zwischen den Entzündungsabschnitten und NGF-Anteilen in den Seren (Bracci-Laudiero et al., NeuroReport 4: 563–565, 1993).
Unter der Annahme, dass Neurturin in Blutzellen, im Knochenmark und in Mastzellen exprimiert wird, und da angenommen wird, dass Persephin in ähnlicher Weise exprimiert wird, ist es sehr wahrscheinlich, dass der Anteil an Persephin oder Neurturin in einer Vielzahl von Erkrankungen sich ändern kann und dass die Quantifizierung des Persephin- oder Neurturin-Niveaus klinisch nützliche Informationen zur Verfügung stellen kann. Darüber hinaus können in der Behandlung von degenerativen Erkrankungen Zusammensetzungen, welche entweder Persephin oder Neurturin oder beides enthalten, verabreicht werden, und es wäre äußerst wünschenswert, ein bestimmtes Zielniveau von Persephin und/oder Neurturin, je nach Fall, in dem Serum, in dem cerebrospinalen Fluid oder in irgendeinem gewünschten Gewebe-Abschnitt zu erhalten. Es wäre daher von Vorteil, dazu in der Lage zu sein, die Anteile der jeweiligen Wachstumsfaktoren Persephin oder Neurturin in einem Patienten zu verfolgen. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ebenso Verfahren zur Detektierung der Anwesenheit von Persephin oder zur Detektierung der Anwesenheit von Neurturin in einer Probe von einem Patienten zur Verfügung.
Der Begriff "Detektierung", wie er hierin in dem Kontext der Detektierung der Anwesenheit von Persephin oder Neurturin in einem Patienten verwendet wird, soll die Bestimmung der Menge von Persephin oder Neurturin oder der Fähigkeit, eine Menge an Persephin oder Neurturin in einem Patienten zu exprimieren, die Unterscheidung von Persephin oder Neurturin von anderen Wachstumsfaktoren, die Abschätzung der Vorhersage hinsichtlich des möglichen Ausbruchs einer degenerativen Erkrankung und der Aussicht auf Heilung, die Verfolgung des Persephin- oder Neurturin-Niveaus innerhalb einer Zeitdauer als Maß des Status der Erkrankung sowie das Verfolgen des Persephin- oder Neurturin-Niveaus zur Bestimmung einer bevorzugten therapeutischen Behandlung für den Patienten einschließen.
Um die Anwesenheit von Persephin oder Neurturin in einen Patienten zu detektieren, wird eine Probe von dem Patienten genommen. Die Probe kann eine Gewebebiopsieprobe oder eine Blut-, Plasma-, Serum-, CSF- oder eine ähnliche Probe darstellen. Neurturin wird in einer Vielzahl von Geweben exprimiert, wie in Beispiel 9 gezeigt ist, und es wird angenommen, dass Persephin ebenso in einer Vielzahl von Geweben sekretiert wird. Folglich können Proben für die Detektierung von Persephin oder Neurturin von jeglichen Geweben genommen werden, welche den spezifischen Wachstumsfaktor exprimieren. Wenn das Periphär-Niveau von Persephin oder Neurturin beurteilt wird, ist es bevorzugt, dass die Probe eine Blut-, Plasma- oder Serum-Probe darstellt. Wenn das Niveau von Persephin oder Neurturin in dem zentralen Nervensystem bestimmt wird, ist eine bevorzugte Probe eine aus dem cerebrospinalen Fluid stammende Probe.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, zu bestimmen, ob das Persephin- oder Neurturin-Gen in den Patienten oder in einem Gewebe oder einer Zelllinie innerhalb des Patienten intakt ist. Unter einem intakten Persephin- oder Neurturin-Gen wird verstanden, dass keine Veränderungen in dem Gen, wie Punktmutationen, Löschungen, Insertionen, Chromosomenbrüche, Chromosomen-Neuanordnungen und ähnliches, auftreten, wobei solche Veränderungen die Bildung von Persephin oder Neurturin oder deren biologische Aktivität, Stabilität oder ähnliches ändern kann, was zu Erkrankungsprozessen oder Empfindlichkeit gegenüber zellulären degenerativen Erkrankungen führt. Umgekehrt wird hierin unter einem nicht-intakten Persephin- oder Neurturin-Gen verstanden, dass solche Veränderungen vorliegen. Folglich wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Detektierung und Charakterisierung jeglicher Veränderungen in dem Persephin- oder Neurturin-Gen zur Verfügung gestellt. Das Verfahren umfasst die Bereitstellung eines Oligonucleotids, welches die Persephin- oder Neurturin-cDNA, Genom-DNA oder ein Fragment davon oder ein Derivat davon enthält. Unter einem Derivat eines Oligonucleotids wird verstanden, dass das abgeleitete Oligonucleotid im Wesentlichen dasselbe ist wie die Sequenz, von der es abgeleitet ist, d. h. die abgeleitete Sequenz weist ausreichende Sequenzkomplementarität zu der Sequenz auf, von der sie abgeleitet ist, um an das Persephin- oder Neurturin-Gen zu hybridisieren. Die abgeleitete Nucleotidsequenz ist nicht notwendigerweise physisch bzw. physikalisch von der Nucleotidsequenz abgeleitet, sondern kann in irgendeiner Weise gebildet werden, einschließlich beispielsweise der chemischen Synthese oder DNA-Replikation oder der reversen Transkription oder der Transkription.
Typischerweise wird eine Patienten-Genom-DNA von einer Zellprobe des Patienten isoliert und mit ein oder mehreren Restriktions-Endonukleasen, wie beispielsweise TaqI und AluI, aufgeschlossen. Unter Verwendung des Southern-Blot-Protokolls, welches im Stand der Technik bekannt ist, bestimmt dieser Assay, ob ein Patient oder ein bestimmtes Gewebe in einem Patienten ein intaktes Persephin- oder Neurturin-Gen oder eine Persephin- oder Neurturin-Gen-Anomalität aufweist.
Die Hybridisierung an das Persephin- oder Neurturin-Gen würde die Denaturierung der Chromosomen-DNA unter Erhalt einer Einzelstrang-DNA; das Kontaktieren der Einzelstrang-DNA mit einer Gensonde, welche mit der Persephin- oder Neurturin-Gen-Sequenz verbunden ist; und die Identifizierung der hybridisierten DNA-Sonde zur Detektierung der Chromosomen-DNA, welche mindestens einen Teil des menschlichen Persephin- oder Neurturin-Gens enthält, einschließen.
Der Begriff "Sonde", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Struktur, welche ein Polynucleotid umfasst, das eine Hybridstruktur mit einer Zielsequenz aufgrund der Komplementarität der Sondensequenz mit einer Sequenz in dem Zielbereich bildet. Oligomere, welche zur Verwendung als Sonden geeignet sind, können ein Minimum von ungefähr 8 bis 12 aufeinanderfolgenden Nucleotide enthalten, welche zu der Zielsequenz komplementär sind, und vorzugsweise ein Minimum von ungefähr 20 aufweisen.
Die Persephin- oder Neurturin-Gen-Sonden der vorliegenden Erfindung können DNA- oder RNA-Oligonucleotide darstellen und können durch irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren hergestellt werden, wie beispielsweise durch Ausschneiden, Transkription oder chemische Synthese. Sonden können mit jeglichen im Stand der Technik bekannten Labeln, wie beispielsweise mit radioaktiven oder fluoreszierenden Labeln oder enzymatischen Markern, gelabelt sein. Das Labeln der Sonde kann durch irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren erfolgen, wie durch PCR, Randompriming, End-Labeln, Nick-Translation oder ähnliches. Der Fachmann wird ebenso feststellen, dass andere Verfahren, welche keine gelabelte Sonde einsetzen, zur Bestimmung der Hybridisierung verwendet werden können. Beispiele für Verfahren, welche zur Detektierung der Hybridisierung verwendet werden können, umfassen den Southern-Blot, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Einzelstrangkonformationspolymorphismus mit PCR-Amplifikation.
Die Hybridisierung wird typischerweise bei 25 bis 45°C, besonders bevorzugt bei 32 bis 40°C und ganz besonders bevorzugt bei 37 bis 38°C durchgeführt. Die für die Hybridisierung erforderliche Zeit reicht von ungefähr 0,25 bis ungefähr 96 Stunden, besonders bevorzugt von ungefähr 1 bis ungefähr 72 Stunden und am meisten bevorzugt von ungefähr 4 bis ungefähr 24 Stunden.
Persephin- oder Neurturin-Gen-Anomalien können ebenso unter Verwendung des PCR-Verfahrens und von Primern, welche innerhalb des Persephin- oder Neurturin-Gens liegen oder dieses flankieren, detektiert werden. Das PCR-Verfahren ist im Stand der Technik bekannt. Kurz gesagt wird dieses Verfahren durchgeführt unter Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern, welche zur Hybridisierung der Nucleinsäuresequenzen, welche eine Zielsequenz flankieren, die innerhalb eines Persephin- oder Neurturin-Gens liegt, in der Lage sind, sowie unter Amplifizieren der Zielsequenz. Der Begriff "Oligonucleotid-Primer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen kurzen Strang der DNA oder RNA im Längenbereich von ungefähr 8 bis ungefähr 30 Basen. Die Aufwärts- und Abwärts-Primer reichen typischerweise von ungefähr 20 bis ungefähr 30 Basenpaaren in der Länge und hybridisieren an die flankierenden Bereiche zur Replikation der Nucleotidsequenz. Die Polymerisation wird durch eine DNA-Polymerase in Gegenwart von Deoxynucleotid-Triphosphaten oder Nucleotid-Analoga unter Bildung von doppelsträngigen DNA-Molekülen katalysiert. Die Doppelstränge werden anschließend durch irgendein Denaturierungsverfahren, einschließlich dem physikalischen, chemischen oder enzymatischen, ge trennt. Normalerweise wird das Verfahren der physikalischen Denaturierung verwendet, welches das Erwärmen der Nucleinsäure, typischerweise auf Temperaturen von ungefähr 80°C bis 105°C innerhalb von Zeitdauern im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 Minuten einschließt. Das Verfahren wird bis zur gewünschten Anzahl von Zyklen wiederholt.
Die Primer sind derartig ausgewählt, dass sie zu dem Strang der zu amplifizierenden DNA im Wesentlichen komplementär sind. Daher müssen die Primer nicht die exakte Sequenz des Templats wiedergeben, sondern müssen ausreichend komplementär sein, um mit dem zu amplifizierenden Strang selektiv zu hybridisieren.
Nach der PCR-Verstärkung bzw. -Amplifizierung wird die DNA-Sequenz, welche Persephin oder Neurturin oder Pre-Pro-Persephin oder -Neurturin oder ein Fragment davon umfasst, anschließend direkt sequenziert und durch Vergleich der Sequenz mit den hierin offenbarten Sequenzen analysiert, um die Veränderungen zu identifizieren, welche die Aktivität oder das Expressionsniveau oder ähnliches ändern könnten.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zur Detektierung von Persephin oder Neuturin auf der Basis einer Gewebeanalyse, welche das Persephin-Gen oder das Neurturin-Gen exprimiert, zur Verfügung gestellt. Es wurde gefunden, dass bestimmte Gewebe, wie die unten in Beispiel 9 identifizierten, das Neurturin-Gen exprimieren. Es wird ebenso angenommen, dass eine Vielzahl von Geweben das Persephin-Gen exprimieren, was auf den Erkenntnissen für Neurturin und der Identifizierung von Gehirn und Herz als Persephin-exprimierende Gewebe hierin beruht. Das Verfahren umfasst das Hybridisieren eines Polynucleotids an mRNA aus einer Probe von Geweben, welche normalerweise das Persephin-Gen oder das Neurturin-Gen exprimieren. Die Probe wird von einem Patienten erhalten, welcher unter dem Verdacht steht, eine Anomalität in dem Persephin-Gen oder dem Neurturin-Gen oder in dem Persephin-Gen oder dem Neuturin-Gen bestimmter Zellen aufzuweisen. In dem Fall von Neurturin umfasst das Polynucleotid SEQ ID NO: 11 oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon. In dem Fall von Persephin umfasst das Polynucleotid SEQ ID NO: 105 oder SEQ ID NO: 107 oder ein menschliches Orthologes von Persephin oder Derivate davon oder Fragmente davon.
Zur Detektierung der Anwesenheit von das Persephin-Protein oder Neurturin-Protein kodierender mRNA wird eine Probe von einem Patienten entnommen. Die Probe kann dem Blut oder einer Gewebebiopsie-Probe entstammen. Die Probe kann zur Extraktion der Nucleinsäuren, welche darin enthalten sind, behandelt werden. Die resultierende Nucleinsäure aus der Probe wird einer Gelelektrophorese oder einer anderen Technik zur Größentrennung unterzogen.
Die mRNA der Probe wird mit einer DNA-Sequenz, welche als eine Sonde fungiert, unter Bildung von Hybrid-Duplexen in Kontakt gebracht. Die Verwendung von gelabelten Sonden, wie oben diskutiert, erlaubt die Detektierung des resultierenden Duplex.
Bei Verwendung der Persephin-Protein oder Neurturin-Protein kodierenden cDNA oder eines Derivats der cDNA als Sonde können hoch stringende Bedingungen verwendet werden, um falsche positive Ergebnisse zu verhindern, d. h. die Hybridisierung und scheinbare Detektion von Persephin- oder Neurturin-Nucleotidsequenzen, wobei eigentlich ein intaktes und funktionierendes Persephin-Gen oder Neurturin-Gen nicht vorliegt. Bei Verwendung von Sequenzen, welche von Persephin- oder Neurturin-cDNA abgeleitet sind, könnten weniger strikte Bedingungen verwendet werden. Jedoch würde dieses einen weniger bevorzugten Ansatz darstellen, da die Wahrscheinlichkeit von falschen positiven Ergebnissen existiert. Die Stränge der Hybridisierung wird durch eine Vielzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschverfahrens, einschließlich der Temperatur, der Ionenstärke, der Zeitdauer und der Konzentration an Formamid, bestimmt. Diese Faktoren sind beispielsweise in Sambrook et al. ausgeführt (Sambrook et al., 1989, supra).
Um die Empfindlichkeit der Detektierung in einer Probe der das Persephin-Protein oder Neurturin-Protein kodierenden mRNA zu erhöhen, kann die Technik der reversen Transkription/Polymerisationskettenreaktion (RT/PCR) verwendet werden, um von mRNA transkribierte cDNA, welche das Persephin-Protein oder das Neurturin-Protein kodiert, zu amplifizieren. Das Verfahren der RT/PCR ist im Stand der Technik bekannt (siehe Beispiel 9 und 6 unten).
Das RT/PCR-Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden. Die gesamte zelluläre RNA wird beispielsweise durch Standard-Guanidiniumisothiocyanat-Verfahren isoliert, und die gesamte RNA wird revers-transkribiert. Das Reverse-Transkriptions-Verfahren umfasst die Synthese von DNA auf einem Templat von RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptase-Enzyms und eines 3'-End-Primers. Typischerweise enthält der Primer eine Oligo(dT)-Sequenz. Die so gebildete cDNA wird anschließend unter Verwendung des PCR-Verfahrens und Persephin-spezifischen Primern oder Neurturin-spezifischen Primern amplifiziert. (Belyavsky et al., Nucl. Acid. Res. 17: 2919–2932, 1989; Krug und Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 152, Seiten 316–325, 1987).
Das Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt, wobei zwei Oligonucleotid-Primer verwendet werden, welche zu den zwei flankierenden Bereichen des zu verstärkenden bzw. zu amplifizierenden DNA-Segments im Wesentlichen komplementär sind.
Nach der Amplifizierung wird das PCR-Produkt anschließend einer Elektrophorese unterzogen und durch Ethidiumbromid-Färbung oder durch Phospho-Kennzeichnung detektiert.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Detektierung der Anwesenheit des Persephin-Proteins oder des Neurturin-Proteins in einer von einem Patienten erhaltenen Probe zur Verfügung. Ein jedes im Stand der Technik zur Detektierung von Proteinen bekanntes Verfahren kann verwendet werden. Solche Verfahren umfassen, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, die Immunodiffusion, Immunoelektrophorese, immunochemische Verfahren, Binder-Ligand-Assays, immunohistochemische Techniken, Agglutinierung und Komplementär-Assays. (Siehe beispielsweise Basic and Clinical Immunology, Sites und Terr, Herausgeber, Appleton & Lange, Norwalk, Conn. Seiten 217–262, 1991). Bevorzugt sind Binder-Ligand-Immunoassay-Verfahren, welche die Umsetzung von Antikörpern mit einem Epitop oder Epitopen des Persephin-Proteins oder die Umsetzung Antikörpern mit einem Epitop oder Epitopen des Neurturin-Proteins oder das kompetitive Ersetzen eines gelabelten Persephin-Proteins oder eines gelabelten Neurturin-Proteins oder eines Derivats davon umfassen.
Wie hierin verwendet soll ein Derivat des Persephin-Proteins oder ein Derivat des Neurturin-Proteins ein Polypeptid einschließen, in welchem bestimmte Aminosäuren gelöscht oder ersetzt oder gegen modifizierte oder unübliche Aminosäuren ausgetauscht wurden, worin das Persephin-Derivat oder das Neurturin-Derivat biologisch äquivalent zu jeweils Persephin oder Neurturin ist und worin das Polypeptid-Derivat mit Antikörpern, welche gegen jeweils das Persephin-Protein oder das Neurturin-Protein gerichtet sind, kreuz reagieren. Unter Kreuzreaktion bzw. Cross-Reaktion wird verstanden, dass ein Antikörper mit einem Antigen reagiert, welches sich von dem Antigen unterscheidet, welches seine Bildung induziert hat.
Eine Vielzahl kompetitiver und nichtkompetitiver Proteinbindungsimmunoassays sind im Stand der Technik bekannt. In solchen Assays verwendete Antikörper können ungelabelt sein, wie sie beispielsweise in Agglutinierungstests verwendet werden, oder zur Verwendung in einer breiten Vielfalt von Assay-Verfahren gelabelt sein. Labels, welche verwendet werden können, umfassen Radionuklide, Enzyme, fluoreszierende Label, chemilumineszierende Label, Enzymsubstrate oder Co-Faktoren, Enzyminhibitoren, Teilchen, Farbstoffe und ähnliches zur Verwendung in Radioimmunoassays (RIA), Enzymimmunoassays, z. B. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Fluoreszenzimmunoassays und ähnliches.
Polyklonale oder monoklonale Antikörper für das Persephin-Protein oder das Neurturin-Protein oder ein Epitop davon können zur Verwendung in Immunoassays durch irgendeines der Vielzahl der im Stand der Technik bekannten Verfahren her gestellt werden. Bei Epitop wird auf eine antigene Determinante eines Polypeptids Bezug genommen. Ein Epitop könnte drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation umfassen, welche für das Epitop einzigartig ist. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus mindestens 5 solcher Aminosäuren. Verfahren zur Bestimmung der räumlichen Konformation bzw. Anordnung der Aminosäuren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise die Röntgenkristallographie und zweidimensionale Kernmagnetresonanz.
Ein Ansatz für die Herstellung von Antikörpern für ein Protein ist die Auswahl und Herstellung einer Aminosäuresequenz des gesamten oder eines Teils des Proteins, die chemische Synthese der Sequenz und deren Injektion in ein geeignetes Tier, gewöhnlich einen Hasen oder eine Maus (siehe Beispiel 10).
Oligopeptide können als Kandidaten für die Herstellung eines Antikörpers für das Persephin-Protein oder für die Herstellung eines Antikörpers für das Neurturin-Protein auf der Basis der in hydrophilen Bereichen liegenden Oligopeptide ausgewählt werden, welche folglich leicht in das reife Protein exponiert werden.
Antikörper für Persephin oder für Neurturin können ebenso gegen Oligopeptide gerichtet sein, welche ein oder mehrere der erhaltenen bzw. konservierten Bereiche aufweisen, die hierin identifiziert wurden, sodass der Antikörper mit anderen Familienmitgliedern kreuzreagieren kann. Solche Antikörper können zur Identifizierung und Isolierung der anderen Familienmitglieder verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung des Persephin-Proteins oder des Neurturin-Proteins oder eines Epitops davon umfassen, allerdings ohne auf die chemische Synthese begrenzt zu sein, rekombinante DNA-Techniken oder die Isolierung aus biologischen Proben. Die chemische Synthese eines Peptids kann durchgeführt werden, beispielsweise durch die klassische Merrifeld-Methode der Festphasenpeptid-Synthese (Merrifeld, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963) oder durch die FMOC-Strategie auf einem Rapid Automated Multiple Peptide Synthesis System (DuPont Company, Wilmington, DE) (Caprino und Han, J. Org. Chem. 37: 3404, 1972).
Polyklonale Antikörper können durch Immunisieren von Hasen oder anderen Tieren durch Injizierung des Antigens gefolgt von anschließenden Boosts in geeigneten Intervallen hergestellt werden. Man lässt die Tiere ausbluten und untersucht die Seren gegenüber gereinigtem Persephin-Protein oder gereinigtem Neurturin-Protein gewöhnlich durch ELISA oder durch einen Bioassay auf der Basis der Fähigkeit, die Wirkung von Persephin oder Neurturin zu blockieren, je nach Fall. Wenn Vogelarten verwendet werden, z. B. Hühner, Truthähne oder ähnliches, kann der Antikörper aus dem Dotter des Eis isoliert werden. Monoklonale Antikörper können nach dem Verfahren von Milstein und Kohler durch Verschmelzen von Splenozyten aus immunisierten Mäusen mit kontinuierlich replizierenden Tumorzellen, wie Myelom- oder Lymphom-Zellen, hergestellt werden. (Milstein und Kohler, Nature 256: 495–497, 1975; Gulfre und Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73: 1–46, Langone und Banatis Herausgeber, Academic Press, 1981). Die so gebildeten Hybridom-Zellen werden anschließend durch limitierende Verdünnungsverfahren geklont, und die Überstände werden hinsichtlich der Antikörperbildung durch ELISA, RIA oder Bioassays geprüft.
Die einzigartige Fähigkeit von Antikörpern, Zielproteine zu erkennen und spezifisch zu binden stellt einen Ansatz zur Behandlung einer Überexprimierung des Proteins dar. Folglich stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Erkrankungen, welche eine Überexprimierung des Persephin-Proteins oder des Neurturin-Proteins einschließen, durch Behandlung eines Patienten mit spezifischen Antikörpern zu jeweils dem Persephin-Protein oder zu dem Neurturin-Protein zur Verfügung.
Spezifische Antikörper, entweder polyklonal oder monoklonal, für das Persephin-Protein oder das Neurturin-Protein können durch jegliche im Stand der Technik, wie oben diskutiert, bekannte geeignete Verfahren gebildet werden. Beispielsweise können Murin- oder menschliche monoklonale Antikörper durch die Hybridom-Technologie hergestellt werden, oder alternativ können das Persephin-Protein oder das Neurturin-Protein oder ein immunologisch wirksames Fragment davon oder ein antiidiotpyischer Antikörper oder ein Fragment davon einem Tier verabreicht werden, um die Bildung von Antikörpern auszulösen, welche zur Erkennung von und Bindung an das Persephin-Protein oder das Neurturin-Protein in der Lage sind. Solche Antikörper können aus irgendeiner Klasse von Antikörpern gebildet sein, einschließlich, allerdings ohne darauf begrenzt zu sein, IgG, IgA, IgM, IgD und IgE, oder in dem Fall von Vogelarten, IgY, sowie aus jeder Subklasse der Antikörper.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben. Andere Ausführungsformen innerhalb des Umfangs der Ansprüche hierin werden dem Fachmann in Betrachtung der Beschreibung oder der Praxis der Erfindung, wie sie hierin beschrieben ist, ersichtlich werden. Die Beschreibung soll zusammen mit den Beispielen nur exemplarisch verstanden werden, wobei der Umfang und der Gedanke der Erfindung durch die Ansprüche, die den Beispielen folgen, angegeben ist.
Beispiel 1
Dieses Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Reinigung von Neurturin aus einem konditionierten CHO-Zellen-Medium.
Herstellung des konditionierten CHO-Zellenmediums
Ein Derivat von DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, DG44CHO-pHSP-NGFI-B (CHO)-Zellen, wurde verwendet (Day et al., J. Biol. Chem. 265: 15253– 15260, 1990). Wie oben angegeben haben die Erfinder ebenso Neurturin in teilweise gereinigter Form aus anderen Derivaten der DG44-Eierstockzellen des chinesischen Hamsters erhalten. Die CHO-Zellen wurden in 20 ml Medium gehalten, welches minimales essentielles Medium (MEM)-alpha (Gibco-BRL Nr. 12561, Gaithersburg, MD) enthielt, das 10% fötales Kalbserum (Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 25 nM Methotrexat unter Verwendung von 150 cm²-Flaschen (Corning Inc., Corning NY) aufwies. Für den Durchlass und die Vermehrung wurde Medium aus einer konfluenten Flasche eingezogen; die Zellen wurden mit 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend in g/l 0,144 KH₂PO₄, 0,795 Na₂HPO₄ und 9,00 NaCl, gewaschen; und die Flasche wurde anschließend zwei bis drei Minuten mit 2 ml 0,25% Trypsin in PBS inkubiert. Die Zellen wurden anschließend von der Flaschenoberfläche entnommen, 8 ml des Mediums wurden zugesetzt, und die Zellen wurden mehrere Male mit einer Pipette trituriert. Die Zellen wurden 1 : 5 oder 1 : 10 aufgeteilt, bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% CO₂ in Luft inkubiert und 3 bis 4 Tage lang bis zum Zusammentreffen (Konfluenz) wachsen gelassen.
Anschließend ließ man die Zellkultur in 850 cm²-Rollflaschen (Becton Dickinson, Bedford, MA) sich vermehren. Eine konfluente 150 cm²-Flasche wurde trypsinisiert und in eine Rollflasche, enthaltend 240 ml des obengenannten modifizierten MEM-Mediums ohne Methotrexat, gesetzt. Der pH wurde entweder durch Überlagern des Mediums mit 5% CO₂ in Luft oder durch Herstellen des Mediums mit 25 mM HEPES pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO) gehalten. Die Rollflaschen wurden bei 0,8 bis 1,0 Umdrehungen pro Minute routieren gelassen. Die Zellen erreichten eine Konfluenz in 4 Tagen.
Zum Sammeln des konditionierten Mediums wurde serumfreies CHO-Zellen-Medium (SF-CHO) verwendet. SF-CHO wurde unter Verwendung von 1 : 1 DME/F12-Basis-Medium hergestellt, welches durch Mischen von 1 : 1 (v/v) DMEM (Gibco-BRL Produkt Nr. 11965, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) mit Ham's F12 (Gibco-BRL Produkt Nr. 11765) hergestellt wurde. Das fertige SF-CHO-Medium enthielt 15 mM HEPES pH 7,4 (Sigma, St. Louis, MO), 0,5 mg/ml bovines Serum-Albumin (BSA, Sigma, St. Louis, MO), 25 μg/ml Heparin, (Sigma, St. Louis, MO), ein 1X Insulin-Transferrin-Selenit-Supplement (bovines Insulin, 5 μg/ml; humanes Transferrin, 5 μg/ml; Natriumselenit, 5 ng/ml; Sigma, St. Louis, MO), 2 mM 1-Glutamin, 100 U/ml Penezillin und 100 μg/ml Streptomycin. Das Medium aus den konfluenten Rollflaschen wurde entfernt, und die Zellen wurden einmal mit 30 ml SF-CHO-Medium zur Entfernung der Serumproteine gewaschen. Die Zellen wurden anschließend bei 37°C 16 bis 24 Stunden lang in 80 ml SF-CHO-Medium zur weiteren Entfernung von Serumproteinen inkubiert. 80 ml Medium wurden entfernt und verworfen. Es wurde ein Volumen von 120 ml SF-CHO-Medium zu der Flasche zugesetzt, und die Zellen wurden bei 37°C inkubiert. Weitere 48 Stunden später wurden 120 ml entnommen und durch dasselbe Volumen SF-CHO-Medium ersetzt. Die gesammelten Medien wurden gepoolt und bei 4°C in konischen Polypropylenrohren zur Entfernung von zellulärer Debris zentrifugiert, und der Überstand wurde bei –70°C gelagert. Die Medien wurden fünfmal innerhalb von 10 Tagen gesammelt, um insgesamt ungefähr 600 ml konditioniertes Medium pro Rollflasche zu erhalten.
Die gesammelten Fraktionen aus den Säulen wurden bei jeder Reinigungsstufe hinsichtlich der biologischen Aktivität unter Verwendung des neuronalen Überlebensassays und hinsichtlich des Proteingehalts durch den Farbstoffbindungsassay von Bradford (Anal. Biochem. 72: 248 et seq., 1976) untersucht. Die Gesamt-mg an Protein in dem Ausgangsvolumen, typischerweise 50 l, des konditionierten Mediums wurden bestimmt.
Höheres Cervical-Ganglion-Überlebens-Assay (Superior Cervical Ganglion Survival Assay)
Die neurotrophe Aktivität von konditioniertem CHO-Medium-Ausgangsmaterial wurde bei verschiedenen Aufreinigungsstufen unter Verwendung des höheren Cervial-Ganglion-Überlebens-Assay-Systems, von dem bereits früher berichtet wurde (Martin et al., J. of Cell Biology 106: 829–844; Deckwerth und Johnson, J. Cell. Bio. 123: 1207–1222, 1993), untersucht. Es wurden primäre Kulturen sympathischer Neuronen aus dem höheren/oberen Cervical-Ganglion (SCG) durch Entnahme von Gewebe aus dem Rattenembryo am Tag 20-21 (E20-E21) hergestellt. Die SCG's wurden in Leibovitz's L15-Medium mit 1-Glutamin (Cat #11415-023 Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) gegeben, 30 Minuten lang mit 1 mg/ml Kollagenase (Cat #4188 Worthington Biochemical, Freehold, NJ) in Leibovitz's L15-Medium bei 37°C digeriert, gefolgt von einer 30-minütigen Digerierung in lyophilisiertem und bestrahltem Trypsin (Typ TRLVMF Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), welches in modifizierter Hanks' Balanced Salt Solution (Cat #H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert wurde. Die Digerierung wurde unter Verwendung von AM50 gestoppt, welches minimales essentielles Medium (Minium Essential Medium) mit Earle's Salzen und ohne 1-Glutamin (Cat #11090-016 Gibco-BRL), 10% fötales Kalbsserum (Cat #1115 Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin (Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM FuDr (F-0503 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM Uridine (Cat #3003 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 50 ng/ml 2,5 S NGF enthält. Die Zellen wurden in eine Suspension einzelner Zellen unter Verwendung einer silanierten und flammpolierten Pasteur-Pipette aufgetrennt. Nach der Filtration der Suspension durch einen Nitex-Filter (Größe 3-20/14, Tetko Inc., Elmsford, NY) wurden die Zellen in ein AM50-Medium wie oben angegeben überführt und auf eine 100 mm Falcon- oder Primaria-Kulturplatte (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) gegeben, um die Anzahl von nichtneuronalen Zellen zu vermindern. Nach 2 Stunden wurde das Medium, welches die ungebundenen neuronalen Zellen enthielt, von diesen Platten entfernt und wiederum durch eine silanierte und flammpolierte Pasteur-Pipette trituriert. Die Einzelzellsuspension wurde auf 24-Well-Gewebekulturplatten (Costar, Wilmington, MA) gegeben, welche vorher mit einer Doppelschicht aus Kollagen überzogen wurden, wobei eine Kollagenschicht ammonisiert wurde und eine zweite Kollagenschicht luftgetrocknet wurde. Man ließ sie 30 Minuten bis 2 Stunden lang anhaften. Eine spezifische Zahl viabler bzw. lebensfähiger Zellen, gewöhnlich ungefähr 1.200 bis ungefähr 3.000 Gesamtzellen pro Well, oder ein spezifischer Prozentanteil des Ganglions, gewöhnlich 25% der pro Ganglion erhaltenen Zellen, wurden in jedes Well gegeben. Sofern das Auszählen der Zellen durchgeführt werden musste, wurden sie in 24-Well-Platten, wie oben angegeben, oder alternativ in 2-Well-Kammer-Slides (Nunc, Naperville, IL) überführt. Die Kulturen wurden anschließend 5 bis 6 Tage bei 37°C in AM50-Medium in einer 5% CO₂/95% Luftatmosphäre inkubiert. Der Tod der kultivierten Neuronen wurde durch Austausch des Mediums mit Medium ohne NGF und mit 0,05% Ziegen-Anti-NGF (finaler Titer in den Wells ist 1 : 10) induziert. Dieser NGF-Verlust resultiert in dem Tod der Neuronen innerhalb einer Zeitdauer von 24 bis 72 Stunden. Aliquots von teilweise aufgereinigtem oder gereinigtem Faktor oder geeignete Kontrollen wurden zu den Kulturen zur Zeit der NGF-Entfernung zugesetzt, um die Fähigkeit des Vorbeugens bzw. Verhinderns des neuronalen Tods zu bestimmen.
Die Evaluierung der Fähigkeit der Säulenfraktion, der Gel-Eluate oder des gereinigten Faktors zur Vorbeugung des neuronalen Tods wurde durch visuelle Inspektion der Kulturen unter dem Phasen-Kontrast-Mikroskop vorgenommen. Die viablen Neuronen verblieben in der hellen Phase mit intakten Neuriten, wohingegen die toten Neuronen zusammengeschrumpft in der dunklen Phase waren, unregelmäßige Membranen aufwiesen und fragmentierte Neuriten zeigten (3). Wenn eine genaue Quantifizierung des neuronalen Überlebens erforderlich war, wurden die Kulturen in 4% Paraformaldehyd oder 10% Formalin in PBS fixiert und mit Crystal Violet-Lösung angefärbt (Huntoon Formula Harleco E. M. Diagnostics Systems, Gibbstown, NJ). Wenn 24-Well-Platten verwendet wurden, wurde 1 μl Crystal Violet-Lösung zu jedem Well, enthaltend 10% Formalin, zugesetzt, und die Zellen wurden unter Verwendung eines Phasen-Kontrast-Mikroskops gezählt. Wenn die 2-Well-Kammer-Slides verwendet wurden, wurden die Kulturen fixiert, mit Crystal Violet angefärbt, mit Wasser gewaschen, in steigenden Ethanolkonzentrationen gegenüber Toluol entwässert und in einer Toluol-basierten Mounting-Lösung befestigt. Die Neu ronen wurden als lebensfähig gezählt, wenn sie einen klaren Nucleolus aufwiesen, und die Kerne mit Crystal Violet deutlich gefärbt waren.
Der neuronale Tod nach 72 Stunden ist in 3B gezeigt. Ebenso gezeigt sind (A) die positiven Kontrollzellen, welche mit Nervenwachstumsfaktor versehen wurden, und (C) die Zellen, welche mit Anti-NGF und Neurturin (ungefähr 3 ng/ml) behandelt wurden und das Überleben von Neuronen zeigen.
Die Aktivität wurde durch Berechnung einer "Überlebenseinheit" quantifiziert. Die Gesamtüberlebenseinheiten in einer Probe wurden als das minimale Volumen eines Aliquots der Probe definiert, welches ein maximales Überleben, geteilt durch/in das Gesamtvolumen der Probe, hervorruft. Die spezifische Aktivität wurde als die Überlebenseinheiten, geteilt durch die mg-Gesamtprotein, berechnet.
Überlebenseinheiten wurden in einem Assay unter Verwendung von ungefähr 1.200 lebensfähigen Neuronen in einem 0,5 ml-Kulturassay und einer Kulturierungsdauer von 48 Stunden, die der Zugabe der Fraktion folgt, bestimmt. Das Überleben wurde visuell nach den 48 Stunden bestimmt. Die intrinsische Aktivität, wie sie in 4 gezeigt ist, wurde in einen Assay unter Verwendung von ungefähr 2.700 Neuronen und einer Kulturierungsdauer von 72 Stunden bestimmt. Das Überleben wurde durch Fixieren der Neuronen und Zählen der Anzahl der überlebenden Neuronen beurteilt. Weil die Stabilität, wie mittels des Halbwertslebens der Aktivität beurteilt, für Neurturin mit steigender Anzahl der Neuronen abnimmt, wurde angenommen, dass die Messung der intrinsischen Aktivität geringer ist als die durch die Specific Activity-Bestimmungen vorausgesagten. Man würde ebenso erwarten, dass die Messung der intrinsischen Aktivität geringer ist als die durch die spezifische Aktivität vorausgesagte, da das Überleben nach 72 Stunden anstelle von 48 Stunden gemessen wurde.
Um die Wiederholbarkeit dieser Aktivitätseinheitsassays sicher zu stellen, war es notwendig, die primären Neuronal-Kulturen bei reproduzierbaren Zelldichten zu plattieren, da die Stabilität der Aktivität deutlich mit einem Anstieg der neuronalen Dichte abnimmt. Der Bereich der Zelldichten reichte von ungefähr 1.200 bis 2.700 Zellen pro Well. Die Anwesenheit von löslichem Heparin in dem Assay-Medium hatte keinen Effekt auf die Kurzzeit-(ungefähr 3 Tage)Stabilität der Überlebensaktivität.
Reinigung von Neurturin
Gepooltes konditioniertes Medium wurde durch 0,2 μl-Poren-Flaschenaufsatz-Filter (Celluloseacetatmembran, Corning Inc., Corning, NY) filtriert. Typischerweise wurden 50 l des konditionierten Mediums verwendet und in 25-l-Ansätzen verarbeitet. Jeder 25-l-Ansatz wurde in einer Rate von 20 ml/Min auf eine 5 × 5 cm Säule geleitet, welche 100 ml Heparin-Agarose (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, äquilibriert mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer mit 150 nM NaCl. Die Säule wurde anschließend mit ungefähr 1.000 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, bei 20 ml/Min gewaschen, und die Aktivität wurde anschließend mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl eluiert. Nach dem Umschalten auf den 1,0 M NaCl-Elutions-Puffer wurden die ersten 50 ml Puffer verworfen, und anschließend wurde eine 300 ml-Fraktion gesammelt.
Gepooltes Material, eluiert aus der Heparin-Agarose-Säule, wurde anschließend 1 : 1 (v/v) mit 25 mM HEPES, pH 7,5 Puffer, enthaltend 0,04% TWEEN 20, auf eine NaCl-Konzentration von 0,5 M verdünnt und in eine 1,5 cm × 9 cm-Säule, enthaltend 16 ml SP SEPHAROSE^® High Performance-Ionenaustauschharz (Pharmacia, Piscataway, NJ), äquilibriert in 25 mM HEPES 7,4, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, geleitet. Die Säule wurde anschließend mit 160 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, gewaschen, und die Aktivität wurde mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl und 0,02% TWEEN 20 bei einer Fließrate von 2 ml/Min eluiert. Eine 50 ml-Fraktion wurde nach den ersten 7 ml Eluat von der Säule entnommen.
Das von der SP SEPHAROSE^®-Säule eluierte Material wurde unter Verwendung von schneller Protein-Flüssigchromatographie (fast protein liquid chromatography; FPLC) auf einer Chelating Superose HR 10/2-Säule, welche mit Cu⁺⁺ beladen war (Pharmacia, Piscataway, NJ), fraktioniert. Die Säule wurde durch Waschen mit 10 ml Wasser, beladen mit 3 ml 2,5 mg/ml CuSO₄·5H₂O, Waschen mit 10 ml Wasser und Äquilibrieren mit 10 ml 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl und 0,02% TWEEN 20, hergestellt. Das Eluat wurde in die Säule in 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl in einer Rate von 1,0 ml/Min eingeleitet. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Gradienten steigender Glycin-Konzentration (0–300 mM) in 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl, in einer Rate von 1,0 ml/Min. eluiert. Der Gradient wurde durch ein Pharmacia-FPLC-System unter Verwendung eines LCC-500-Controllers und P-500-Pumpen gebildet, sodass ein 0–300 mM-Glycin-Gradient in 40 ml bei 1,0 ml/Min. bereitgestellt wurde. So stieg der Gradient um 7,5 mM Glycin pro Minute. Es wurden 1 ml-Fraktion gesammelt und hinsichtlich der SCG-Überlebenspromotion untersucht. Die Peak-Aktivität wurde in den Fraktionen 17–20 beobachtet, d. h. 17 bis 20 Minuten oder ml von dem Startpunkt des Gradienten.
Die Absorbanz-Messungen bei 280 mM durch einen Inline-UV-Monitor zeigte an, dass die meisten Proteine vor der Überlebensaktivität in den Fraktionen 17–20 eluiert wurden. Somit wurde eine deutliche Aufreinigung bei diesem Schritt erreicht. Ein 25 kD-Band wurde mit der Überlebensaktivität co-gereinigt.
Die kombinierten eluierten Fraktionen der Cu⁺⁺-Superose-Säule wurden auf 0,45 M NaCl unter Verwendung von 25 mM HEPES pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,02% TWEEN 20, verdünnt und in eine Mono-S-HR 5/5-Kationenaustauschsäule (Pharmacia, Piscataway, NJ) für die weitere FPLC-Reinigung geleitet. Die Säule wurde mit 25 mM HEPES pH 7,4-Puffer, enthaltend 0,45 M NaCl, enthaltend 0,02% TWEEN 20, äquilibriert. Die gebundenen Proteine wurden mit einem linearen Gradienten ansteigender NaCl-Konzentration (0,45–1,0 M) eluiert. Der Gradient wurde wie oben beschrieben aus 0,45 M–1,0 M NaCl in 35 ml bei 1,0 ml/Min gebildet, wodurch die Konzentration um 0,0157 M pro ml oder Minute stieg. Dreizehn 1,0 ml-Fraktionen (Fraktionen 1–13) wurden gesammelt, gefolgt von 44 0,5 ml-Fraktionen (Fraktionen 14–53). Die Peak-Aktivität in dem SCG-Assay lag in den Fraktionen 26–29. Eine jede Fraktion wurde in dem SCG-Überlebens-Assay innerhalb eines Bereichs von Volumina von 0,1 bis 1,0 μl pro 0,5 ml Kulturmedium untersucht.
Ein Prozent (5 μl) einer jeden Fraktion wurde auf ein nichtreduzierendes, 14%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel gegeben und für 750 V-Stunde bei 25°C einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden mittels Silberfärbung visualisiert. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Die in Reihe M auf dem Gel gezeigten Marker repräsentieren 20 ng bovines Serumalbumin, Kohlensäureanhydrase, B-Lactoglobulin und Lysozym in der Reihenfolge des abnehmenden Molekulargewichts.
Ein 25 kD-Band erschien bei den Fraktionen 25–30, ein 28 kD-Protein wurde früher in dem Gradienten eluiert, und ein 18 kD wurde später in dem Gradienten eluiert. Die 2 zeigt die Überlebensaktivität in jeder der Fraktionen. Es wurde verzeichnet, dass die Überlebensaktivität der Anwesenheit und der sichtbaren Intensität des 25 kD-Proteins in den Fraktionen 25–30 entsprach.
Um zu zeigen, dass das 25 kD-Band für die überlebensfördernde Aktivität verantwortlich ist, wurde das 25 kD-Protein von dem Polyacrylamid-Gel nach der Elektrophorese eluiert und hinsichtlich der Überlebensaktivität in dem SCG-Assay untersucht. Nach der Elektrophorese von 150 μl der SP SEPHAROSE^® 1,0 M NaCl-Fraktion in einer Reihe eines oben beschriebenen nichtreduzierenden 14%-igen SDS-Polyacrylamid-Gels wurde die Reihe in 12 Streifen geschnitten, und jeder Streifen wurde zerstoßen und durch Diffusion unter Schwenken in Puffer, enthaltend 25 mM HEPES, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20, innerhalb von 18 Stunden bei 25°C eluiert. BSA wurde zugesetzt, um eine finale Konzentration von 200 μg/ml zu eluieren, und das Eluat wurde durch einen 0,45 μm-Filter filtriert, um Acrylamidgel-Fragmente zu entfernen. Das Filtrat wurde anschließend einer SP SEPHAROSE^®-Säule zugesetzt, um die Probe aufzukonzentrieren und zu reinigen. Vor der Elution der Probe wurde die Säule einmal in 400 ml μl 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, und einmal in 400 μl 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, gewaschen. Die Säule wurde anschließend wiederum in 400 μl 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthal tend 0,5 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, gewaschen. Die Probe wurde mit 25 mM HEPES, pH 7,4 Puffer, enthaltend 1,0 M NaCl, 0,02% Tween-20 und 200 μg BSA pro ml, eluiert. Die Proben wurden anschließend hinsichtlich ihrer Überlebensaktivität analysiert. Nur der Streifen, welcher dem 25 kD-Band entsprach, zeigte den Beweis für eine Überlebensaktivität. Das 25 kD-Protein, gereinigt aus den konditionierten CHO-Zellenmedien, wird als ein Homodimer angenommen.
Die Ausbeute aus der oben beschriebenen Aufreinigung betrag typischerweise 1–1,5 μg für 50 l konditioniertes CHO-Zellenmedium. Die Gesamtgewinnung wird auf 10 bis 30% geschätzt, was in einer Aufreinigung von ungefähr 390.000-fach resultiert.
Beispiel 2
Diese Probe verdeutlicht die Charakterisierung von Neurturin und verschiedenen Mitgliedern der TGF-β-Familie von Wachstumsfaktoren in dem SCG-Assay sowie die Abwesenheit der Kreuzreaktivität von Anti-GNDF-Antikörpern mit Neurturin.
Der SCG-Assay des aufgereinigten Proteins zeigte, dass der Faktor bei einer Konzentration von ungefähr 3 ng/ml oder ungefähr 100 pM maximal wirksam bzw. aktiv ist, und dass der EC₅₀ ungefähr 1,5 ng/ml oder ungefähr 50 pM in dem erwareten Bereich für einen diffusionsfähigen Peptid-Wachstumsfaktor lag (4).
Mehrere Mitglieder der TGF-β-Familie beeinflussen die Neuropeptid-Gen-Expression in sympathischen Neuronen, während andere das Überleben unterschiedlicher neuronaler Populationen fördern. Neurturin, welches ein entferntes Mitglied dieser Proteinfamilie darstellt, ist zur Förderung des annähernd vollständigen Überlebens von sympathischen Neuronen innerhalb von drei Tagen in der Lage. Zusätzlich zeigte ein weiteres Kultivieren der SCG-Zellen, dass Neurturin den Erhalt dieser Neuronen innerhalb von mindestens 10 Tagen nach der Entfernung von NGF fortsetzen konnte.
Wir haben verschiedene andere Mitgleider der TGF-β-Familie hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Unterstützung des Überlebens in dem SCG-Assay untersucht, einschließlich von TGF-β1, Aktivin, BMP-2, BMP-4, BMP-6 und GDNF. Unter diesen Faktoren zeigte nur GDNF eine überlebensfördernde Aktivität. Jedoch war die Aktivität von GDNF viel weniger potent als die von Neurturin hinsichtlich dieser Aktivität, welches einen EC₅₀ von 2–4 nM in dem 3-Tages-Überlebensassay zeigt. Das in diesem Assay untersuchte GDNF war rhGDNF, welches von E. Coli, erhalten von Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J., gebildet wurde. Die Dauer der Wirkung von GDNF war ebenso geringer als die von Neurturin, dahingehend, dass die Fähigkeit von GDNF (50 ng/ml), ein Überleben von länger als 3 Tagen zu bewerkstelligen, wesentlich nachließ. Diese Experimente legen die Möglichkeit nahe, dass GDNF ein schwacher Agonist für den Neurturin-Rezeptor ist. Darüber hinaus legt die Unfähigkeit von Ak tivin und BMP-2, das Überleben im Gegensatz zu ihrer starken Induktion der Transmitter-bezogenen Gen-Expression in diesen Neuronen zu fördern (Fann und Paterson, Int. J. Dev. Neurosci. 13: 317–330, 1995; Fann und Patterson, J. Neurochem. 61: 1349–1255, 1993), nahe, dass sie über andere Rezeptoren oder Signalübertragungswege signalisieren.
Um die Kreuzreaktivität von Anti-GDNF-Antikörpern mit teilweise aufgereinigtem Neurturin zu bestimmen, wurden SCG-Neuronen, welche wie in Beispiel 1 beschrieben entnommen und plattiert wurden, am Tag 6 mit 1 ng/ml, 3 ng/ml, 10 ng/ml oder 30 ng/ml GDNF (Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J.) in Gegenwart von Anti-NGF allein oder in Gegenwart von Anti-NGF und Anti-GDNF (Ziegen-IgG-Antikörper gegenüber E. coli-abgeleitetem rhGDNF, R & D Systems, Minneapolis, Minn) behandelt. Eine teilweise gereinigte 1,0 M SP Sepharose-Fraktion von Neurturin wurde in dem Assay in geeigneten Konzentrationen von 375 pg/ml, 750 pg/ml, 1,5 ng/ml und 3 ng/ml verwendet. Diese Fraktion wurde in Gegenwart von Anti-NGF alleine und in Anwesenheit von Anti-NGF und Anti-GDNF untersucht. Der Anti-GDNF-Antikörper blockierte die überlebensfördernde Aktivität von GDNF bei einer Konzentration bis zu 30 ng/ml, blockierte allerdings nicht die überlebensfördernde Aktivität von Neurturin.
Beispiel 3
Dieses Beispiel verdeutlicht die Wirkung von Neurturin auf Sensorneuronen in einem Knoten-Ganglion-Überlebensassay.
Konditionierte CHO-Zellen-Medien, welche teilweise auf der SP Sepharose-Säule gereinigt wurden, wurden hinsichtlich der neurotrophen Aktivität gegenüber Sensorneuronen unter Verwendung von Knoten-Ganglien untersucht. Der Überlebensassay stellt eine Modifikation des vorstehend Beschriebenen hinsichtlich der höheren Cervical-Ganglien dar. Primär dissoziierte Kulturen von Knoten-Ganglien wurden durch Entnahme von Gewebe von E18-Sprague-Dawley-Ratten-Jungen hergestellt. Die Knoten-Ganglien (Nodose-Ganglien) wurden in Leibovitz's L15 mit 2 mM 1-Glutamin (Cat # 11415-023, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) gegeben und die Gewebe wurden entnommen, 30 Minuten mit 1 mg/ml Collagenase (Cat #4188, Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey) in Leibovitz's L15-Medium bei 37°C digeriert, gefolgt von 30 minütiger Digerierung in Trypsin (lyophilisiert und bestrahlt, Typ TRLVMF, Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ), und auf eine finale Konzentration von 0,25% in modifizierter Hank's Balanced Salt Solution (Cat #H8389, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) resuspendiert. Die Digerierung wurde unter Verwendung von AMO-BDNF100, einem Medium, welches Minimum Essential Medium mit Earle's Salzen und ohne 1-Glutamin (#11090-016 GIBCO-BRL), 10% fötales Kalbsserum (Cat #1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT), 2 mM 1-Glutamin (Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 20 μM FuDr (F-0503, Sigma Chemical Co.), 20 μM Uridine (Cat #3003, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 U/ml Penizillin, 100 μg/ml Streptomycin und 100 ng hirnabgeleiteten neurotrophen Faktor (BDNF, Amgen, Thousand Oaks, CA) enthält, gestoppt. Die Zellen wurden in eine Suspension von Einzelzellen unter Verwendung einer silanierten und flammpolierten Pasteur-Pipette in das AMO-BDNF100-Medium dissoziiert und auf einer 100 mm-Falcon- oder Primaria-Kulturplatte (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) zur Entfernung von nichtneuronalen Zellen präplattiert. Nach 2 Stunden wurde das Medium, welches die nichtbefestigten neuronalen Zellen enthielt, von diesen Platten entfernt und erneut durch eine silanierte und flammpolierte Pasteur-Pipette trituriert. Die Einzelzellensuspension wurde auf 24-Well-Gewebe-Kultur-Platten (Costar, Wilmington, MA) gegeben, welche vorher mit einer Kollagendoppelschicht überzogen wurden, wobei eine Schicht ammonisiert wurde und die zweite Schicht luftgetrocknet wurde. Die Ganglien von 10 E18-Rattenembryos wurden in 2,5 ml Medium dissoziiert, und 100 μl dieser Suspension wurde zu jedem Well zugesetzt. Die Zellen ließ man 30 Minuten in einem 37°C-Inkubator mit 5% CO2/95% Luft anhaften. Die Wells wurden mit AMO-BDNF100-Medium über Nacht versehen.
Am nächsten Tag wurden die Zellen dreimal 20 Minuten lang jeweils mit AMO-Medium, welches kein BDNF enthielt, gewaschen. Diese Wells wurden mit 0,5 ml dieses Mediums alleine oder dieses Mediums, welches entweder 50 ng/ml NGF, 100 ng/ml BDNF (Amgen, Thousand Oaks, CA), 100 ng/ml GDNF (Prepro Tech, Inc., Rocky Hill, N. J.) oder 3 ng/ml Neurturin enthielt, versehen. Die Zellen wurden bei 37°C in einem 5% CO2/95% Luft-Inkubator drei Tage lang inkubiert, mit 10% Formalin fixiert, mit Crystal Violet gefärbt (1 μl/ml 10% Formalin) und gezählt. Das Überleben wurde wie vorstehend angegeben festgestellt.
Der neuronale Tod nach 72 Stunden ist in 10 gezeigt. Das neuronale Überleben von Knoten-Neuronen, kultiviert in BDNF, wurde kürzlich vorgestellt (Thaler et al., Develop. Biol. 161: 338–344, 1994). Dieses wurde als Standard für das Überleben dieser Neuronen verwendet, und ihm wurde der Wert von 100% Überleben bzw. Fortbestand verliehen. Knoten-Ganglien, welche keinen trophischen Träger (AMO) aufwiesen, zeigten 20% bis 30% Überleben, genau so wie Neuronen, welche in Gegenwart von 50 ng/ml NGF kultiviert wurden. Die in Gegenwart von 3 ng/ml Neurturin und in Abwesenheit von BDNF kultivierten Neuronen zeigten ein Überleben, welches dem von in Gegenwart von BDNF (100 ng/ml) kultivierten Neuronen ähnlich ist. GDNF bei einer Konzentration von 100 ng/ml förderte das Überleben von Knoten-Neuronen in höherem Maße als BDNF (100 mg/ml). Ähnliche Ergebnisse mit GDNF wurden kürzlich für Sensorneuronen vom Huhn vorgestellt (Ebendal, T. et al., J. Neurosci. Res. 40: 276–284, 1995).
Beispiel 4
Dieses Beispiel verdeutlicht die Bestimmung von Teilaminosäuresequenzen von Neurturin, isoliert aus konditioniertem CHO-Zellenmedium.
Um eine N-terminale Aminosäuresequenz aus einer aufgereinigten Zubereitung von ungefähr 1 μg Neurturin zu erhalten, wurden die Mono-S-Fraktionen 26 bis 29, welche den Peak der Aktivität enthielten, auf 25 μl durch Zentrifugalultrafiltration in einem Microcon-3-Konzentrator (Amicon, Inc., Beverly, MA) aufkonzentriert und auf ein nichtreduzierendes 14%-iges SDS-Polyacrylamidgel beladen. Nach elektrophoretischer Trennung wurden die Proteine gegen eine PVDF-Membran elektrogeblotted (Bio-Rad, Hercules, CA) und mit 0,1%-igem Coomassie Blue gefärbt. Das 25 kD-Band wurde ausgeschnitten und in die Reaktionskartusche eines automatischen Sequenzierers (Model 476, Applied Biosystems, Foster City, CA) eingesetzt. Eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure-Gewinnung (PTH-aa) in den ersten 2–3 Zyklen eines automatischen Sequenzierens durch Edman-Abbau zeigte eine Sequenzierungsausbeute von 4 pMol, was ungefähr 10% der abgeschätzten Menge des auf das SDS-Gel beladenen Proteins entspricht.
Zwei N-terminale Sequenzierungsdurchläufe wurden aus zwei 50 l-Aufreinigungszubereitungen durchgeführt. In dem ersten Durchlauf wurden 1 μg Protein in drei gepoolten Fraktionen mit 1,5 ml Gesamtvolumen auf 25 μl auikonzentriert und bei 100 V zwei Stunden lang bei 25°C unter Verwendung eines Elektroblot-Puffers aus 10 mM CAPS pH 11,0 Puffer (Sigma, St. Louis, MO), enthaltend 5% Methanol, elektrogeblotted. Die Aminosäuresequenz wurde aus 13 Zyklen Edman-Abbau erhalten, und die Sequenzierungsausbeute betrug 4 pMol, wie oben.
In dem zweiten Durchlauf wurden 1,5 μg Protein in vier gepoolten Fraktionen mit 2,0 ml Gesamtvolumen auf 25 μl aufkonzentriert und bei 36 V 12 Stunden lang bei 4°C unter Verwendung eines Elektroblot-Puffers aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,04% SDS und 17% MeOH elektrogeblotted. Die Sequenzierungsausbeute betrug 15 pMol, und die Sequenz nach 16 Zyklen war SGARPXGLRELEVSVS (SEQ ID NO: 3). Die nach 16 Zyklen erhaltene Sequenz entspricht der kürzeren Sequenz, welche in dem ersten Durchlauf erhalten wurde. Definitive Zuordnungen konnten bei drei der Aminosäurereste in der Sequenz nicht vorgenommen werden (Reste 1, 6 und 11 vom N-terminalen Ende). Eine Recherche in Protein-Datenbanken detektierte keine deutlich homologen Sequenzen, was nahelegt, dass der aufgereinigte Faktor ein neues Protein war.
Diese ersten N-terminalen Aminosäuresequenzdaten ermöglichten nicht die Isolierung von cDNA-Klonen unter Verwendung von degenerierten Oligonucleotiden als PCR-Primer oder Sonden zum Screenen von Bibliotheken. Um diese Ansätze zu erleichtern, wurde zusätzliches Protein aufgereinigt, um eine interne Aminosäurese quenz aus proteolytischen Fragmenten zu erhalten. Um die interne Aminosäuresequenz aus Neurturin zu erhalten, wurden zusätzliche 50 l des konditionierten CHO-Zellenmediums unter Verwendung nur der ersten drei Chromatographieschritte, wie sie oben angegeben sind, aufgereinigt, außer dass der zum Eluieren der Cu⁺⁺-Chelating-Superose-Säule verwendete Gradient wie folgt lautete: 0–60 mM Glycin (4 ml), 60 mM Glycin (10 ml), 60–300 mM Glycin (32 ml). Die Fraktionen Nr. 20–23, welche Neurturin enthielten, wurden auf 25 μl durch Ultrafiltration (Amicon Microcon 3, Amicon, Beverly, MA) aufkonzentriert und auf ein nichtreduzierendes SDS-Polyacrylamid-Gel geladen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Blue angefärbt, und das 25 kD-Neurturinband wurde ausgeschnitten. Neurturin wurde in dem Gelstreifen mit Endoproteinase-Lys-C digeriert bzw. aufgeschlossen, und die eluierten proteolytischen Fragmente wurden durch reverse Phasen-HPLC aufgereinigt. Nur ein Peak wurde durch HPLC-Auftrennung der eluierten Peptide beobachtet, welcher eine Aminosäuresequenzinformation aus 23 Zyklen bei dem 1 pMol-Signallevel unter Verwendung des automatischen Sequenzierers ergab (internes Fragment P2, SEQ ID NO: 5).
Die Aminosäureanalyse, welche bei 10% der oben angegebenen Probe vor deren Unterziehen einer Digerierung durchgeführt wurde, zeigte, dass 150 pMol Protein in dem Gelstreifen vorlagen, bestehend aus 7,6% Lysin und 19,5% Arginin. Der einzige Peak niedrigen Niveaus aus der Lys-C-Digerierung deutete an, dass die Digerierung und Eluierung der Peptide ineffizient war. Derselbe Gelstreifen wurde erneut mit Trypsin digeriert, und die eluierten Peptide wurden durch HPLC aufgetrennt. Zwei Peaks wurden in der HPLC beobachtet, was in der Sichtbarmachung von zwei zusätzlichen Aminosäuresequenzen mit 10 Resten resultierte (4–5 pMol Signalanteil, internes Fragment P1, SEQ ID NO: 4, und internes Fragment P3, SEQ ID NO: 6), welche sich von den N-terminalen und vorstehenden internen Aminosäuresequenzen unterschieden. Die in situ-Digerierung, Elution und Aufreinigung von Peptiden und das Peptidsequenzieren wurde durch die W. M. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory an der Yale University gemäß Standardprotokollen für diesen Service durchgeführt.
Beispiel 5
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Sequenzanalyse von Maus- und Human-Neurturin-cDNA-Klonen.
Es wurden entartete bzw. degenerierte Oligonucleotide, welche verschiedene Strecken zuverlässiger Aminosäuresequenzdaten entsprachen, synthetisiert und als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung von cDNA-Sequenzen von revers-transkribierter mRNA verwendet. Ein Vorwärts-Primer (M1676; 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, SEQ ID NO: 50), entsprechend der Peptidsequenz P2 Xaa₁- Xaa₂-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala-Tyr-Glu-Asp-Xaa₃-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val, worin Xaa₁ und Xaa₂ unbekannt waren, Xaa₃ Gln oder Glu war (SEQ ID NO: 5), in Kombination mit einem Rückwärts-Primer (M1677; 5'-ARYTCYTGNARNGTRTGRTA (SEQ ID NO: 52), entsprechend der Peptidsequenz P3 (Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg) (SEQ ID NO: 6), wurden zur Amplifizierung eines 69-Nucleotid-Produkts von aus E21-Ratten- und erwachsenem Mäusehirn abgeleiteten cDNA-Templaten verwendet. Die PCR-Parameter waren: 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden; 72°C für 1 Minute für 35 Zyklen. Das Produkt wurde in den Bluescript KS-Plasmid subkloniert und sequenziert. Sämtliche Nucleotidsequenzierungen wurden unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoffterminator-Technologie gemäß den Herstellerangaben auf einem automatischen Applied Biosystems-Sequenzierer vom Modell Nr. 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die Plasmid-DNA zum Sequenzieren wurde unter Verwendung des Wizard Miniprep-Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Herstellerangaben hergestellt. Die Sequenz des amplifizierten Produkts sagte die Aminosäuresequenzdaten innerhalb der PCR-Primer korrekt voraus.
Die Primer, welche der amplifizierten Sequenz entsprechen, wurden in Kombination mit den entarteten Primern in der schnellen Verstärkung der cDNA-Enden (RACE)-Technik (Frohman, M. A. Methods in Enzymology 218: 340–356, 1993) unter Verwendung des Marathon-RACE-Kits (CLONTECH, Palo Alto, CA) gemäß den Herstellerangaben verwendet, außer dass die Synthese des ersten cDNA-Strangs bei 50°C unter Verwendung von Superscript-II-Reverse-Transkriptase (Gibco-BRL) durchgeführt wurde. Kurz gesagt wurde ein Doppelstrang-Adaptor-Oligonucleotid an die Enden einer Doppelstrang-cDNA ligiert, synthetisiert aus Rattenhirn-mRNA am postnatalen Tag 1. Unter Verwendung von verschachteltem Vorwärts-Neurturin-PCR-Primer (M1676: 5'-CCNACNGCNTAYGARGA, SEQ ID NO: 50 und 1678: 5'-GACGAGGGTCCTTCCTGGACGTACACA, SEQ ID NO. 53) in Kombination mit Primern des in dem Kit bereitgestellten gebundenen Adapters (AP1, AP2) wurde das 3'-Ende der Neurturin-cDNA durch zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen amplifiziert (Erstens: M1676 und AP1 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 2 Minuten für 35 Zyklen; Zweitens: M1678 und AP2 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen). Ein 5'-Abschnitt der Ratten-Neurturin-cDNA wurde durch zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen unter Verwendung der gelinkerten cDNA als Templat erhalten. Die erste Reaktion verwendete Primer M1677 (SEQ ID NO: 52) und AP1; unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden; 55°C für 30 Sekunden; und 72°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete M 1679 5'-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 54) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Diese Reaktionen resultierten in einer trunkierten Form des 5'-Endes der Neurturin-cDNA, dem Anschein nach das Ergebnis von vorzeitigem Abbruch der cDNA während der reversen Transkription. Die 5'- und 3'-RACE-Produkte wurden in das Plasmid Bluescript KS subkloniert und sequenziert. Die Sequenz dieser 3'- und 5'-RACE-Produkte resultierte in einer teilweisen Ratten-Neurturin-cDNA-Sequenz mit 220 nt. Die Primer (#467921 5'-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG, SEQ ID NO: 55; und M1679, SEQ ID NO: 54), entsprechend der teilweisen Ratten-cDNA-Sequenz, wurden verwendet (PCR-Parameter 94°C für 30 Sekunden und 68°C für 1 Minute für 35 Zyklen) zur Amplifizierung eines 101-Nucleotid-PCR-Produkts aus Maus-Genom-DNA, welches zu der Ratten-Neurturin-cDNA-Sequenz homolog war.
Diese Primer wurden anschließend verwendet, um murine Neurturin-Genom-Klone durch Amplifizieren von Genfragmenten in einer Maus-129/Sv-Bibliothek in einem P1-Bakteriophagen-Vektor zu erhalten (library screening service von Genome Systems, Inc., St. Louis, MO). Ein 1,6 kb Nco I-Fragment aus diesem P1-Klon, enthaltend das Neurturin-Gen, wurde mittels Hybridisierung mit dem Primer (#465782; 5'-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTGGACGTACACAGCCGCTAYCAYAC, SEQ ID NO: 56) identifiziert. Dieses Nco I-Fragment wurde sequenziert, und es wurde gefunden, dass es einen Abschnitt der Kodierungssequenz enthielt, welche den N-terminalen und internen Aminosäuresequenzen, welche durch das Sequenzieren des aktiven Proteins, isoliert aus konditionierten CHO-Zellenmedien, erhalten wurde, entsprach. Beginnend mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins kodiert diese Nucleotid-Sequenz ein 100-Aminosäure-Protein mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 11,5 kD. Eine Recherche in Protein- und Nucleinsäure-Datenbanken identifizierte Neuturin als ein neues Protein, welches ungefähr 40% identisch zu Glial-abgeleitetem neurotrophen Faktor (GDNF) ist. GDNF wurde aufgereinigt und als ein Faktor kloniert, welcher das Überleben von dopaminergen Mittelhirn-Neuronen förderte und welcher ein entfernt verwandtes Mitglied der TGF-β-Superfamilie darstellt, welche nun mehr als 25 unterschiedliche Gene enthält, die eine breite Vielfalt von vielfältigen und unterschiedlichen Wirkungen zeigen. Obwohl GDNF weniger als 20% identisch ist zu jeglichen anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie, enthält es die sieben Cystein-Reste, welche innerhalb der gesamten Familie erhalten sind und von denen man annimmt, dass sie die Basis für eine erhaltene Cystein-Knoten-Struktur darstellt, welche in der Kristallstrukturbestimmung von TGF-β 2 beobachtet wurde. Neurturin enthält ebenso diese sieben Cystein-Reste, allerdings ist es wie GDNF weniger als 20% homolog zu irgendeinem anderen Mitglied der TGF-β-Familie. Folglich scheinen Neurturin und GDNF eine Subfamilie von Wachstumsfaktoren zu repräsentieren, welche sich von dem Rest der TGF-β-Superfamilie deutlich unterscheidet.
Um die Sequenz der vollen Länge der Maus-Neurturin-cDNA zu bestimmen, wurde eine 5'- und 3'-RACE-PCR durchgeführt, wie sie oben für die Ratte angegeben ist, wobei verschachtelte Primer, die von der Maus-Genom-Sequenz vorausgesagt wurden, und cDNA aus neonatalem Mäusehirn verwendet wurden. Die erste Reaktion für das 3'-Ende verwendete Primer: M 1777 5'-GCGGCCATCCGCATCTACGACCGGG (SEQ ID NO: 57) und AP1 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete Primer #467921 (SEQ ID NO: 55) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 20 Zyklen. Das 5'-Ende wurde erhalten unter Verwendung des Primers M 1759 für die erste Reaktion, 5'-CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGT (SEQ ID NO: 58) und AP1 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen. Die zweite Reaktion verwendete Primer M1785, 5'-GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTAGATGCG (SEQ ID NO: 59) und AP2 bei 94°C für 30 Sekunden; 65°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 20 Zyklen. Beide Sätze an PCR-Reaktionen verwendeten 5% DMSO. Die 5'- und 3'-Maus-RACE-Produkte wurden in das Plasmid Bluescript KS subkloniert und sequenziert. Unter Verwendung der Sequenz von RACE-Produkten konnte eine 1,0 kb-Maus-Neurturin-cDNA-Sequenz zusammengestellt werden. Diese cDNA-Sequenz enthält einen offenen Leserahmen von 585 Nucleotiden, welcher ein Protein mit einem Molekulargewicht von 24 kD kodiert. Diese Maus-cDNA-Sequenz ist in voller Länge in 7 gezeigt (SEQ ID NO: 12). In Übereinstimmung mit den Prozessabläufen, welche bekanntermaßen bei den TGF-β-Familienmitgliedern auftreten, enthält das 24 kD-Neurturin-Protein eine Amino-terminale 19-Aminosäure-Signalsequenz, gefolgt von einer Pro-Domäne, die eine proteolytische RXXR-Prozessstelle unmittelbar vor der N-terminalen Aminosäuresequenz, die beim Sequenzieren des aus konditioniertem CHO-Zellenmedien gereinigten Proteinen erhalten wird, enthält. Unter Verwendung dieser Charakteristika wird vorausgesagt, dass das reife 11,5 kD-Neurturin-Molekül 11,5 kD aufweist, und es wird durch Analogie zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Familie vorausgesagt, dass es ein Disulfid-gebundenes Homodimer mit 23 kD bildet, was mit der 25 kD Masse des aus konditioniertem CHO-Zellenmedien gereinigtem Protein konsistent ist, wie es durch SDS-PAGE-Analyse abgeschätzt wurde.
Zur Isolierung von Human-Genom-Klonen wurden Primer (#467524; 5'-CGCTACTGCGCAGGCGCGTGCGARGCGC, SEQ ID NO: 60 und #1005, 5'-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA, SEQ ID NO: 61), vorausgesagt von der Sequenz von Maus-Neurturin, zur Amplifizierung (PCR-Parameter: anfängliche Denaturierung bei 95°C für 1 Minute 30 Sekunden, gefolgt von 94°C für 30 Sekunden; 60°C für 15 Sekunden; und 68°C für 60 Sekunden für 35 Zyklen) eines 192-Nucleotid-Fragments aus Human-Genom-DNA verwendet. Die Sequenz des PCR-Produkts zeigte, dass es das menschliche Homologe von 1-Neurturin war. Die Primer wurden anschließend verwendet, um eine Humangenom-Bibliothek zu screenen, aufgebaut in dem P1-Vektor (library screening service, Genome Systems, Inc.), und es wurden zwei Klone erhalten, welche den Human-Neurturin-Genom-Lokus enthielten.
Dieselbe Strategie wurde verwendet zur Bestimmung der menschlichen Sequenz, wie sie oben für die Maus-Sequenz diskutiert wurde. Ein Oligo (#30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGACGAG, SEQ ID NO: 62) wurde als eine Sonde in einer Southern-Blot-Analyse zur Identifizierung der Restriktions-Fragmente der P1-Klone verwendet, welche die Human-Neurturin-Kodierungssequenz enthielten. Diese Restriktionsfragmente (Eag I, Pvu II, Hind III, Kpn I) wurden in das Bluescript KS-Plasmid subkloniert und sequenziert.
Die Ergebnisse des Subklonierens und Sequenzierens von Human-Genom-Fragmenten war wie folgt. Es wurde gefunden, dass das Eag I-Fragment eine Größe von ungefähr 6 kb aufwies mit der 3'-Eag I-Stelle 60 bp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Pvu II-Fragment war ungefähr 3,5 kb groß mit der 3'-Pvu II-Stelle 250 bp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Hind III-Fragment war ungefähr 4,8 kb groß mit der 3'-Hind III-Stelle 3 kp unterhalb des Stopkodons angeordnet. Das Kpn I-Fragment war ungefähr 4,2 kb groß mit der 3'-Kpn I-Stelle 3,1 kb unterhalb des Stopkodons angeordnet.
Das zweite Kodierungsexon wurde unter Verwendung dieser subklonierten Fragmente sequenziert. Zusätzlich wurde eine Sequenz von 250 bp, die die 3'-Seite des zweiten Exons flankiert, erhalten. Die Sequenz wurde ebenso von 1.000 bp erhalten, welche die 5'-Seite des Kodierungsexons flankieren. Von diesen Flankierungs-Sequenzen wurden der Vorwärts-Primer 30341 (5'-CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3', SEQ ID NO: 71) und der Rückwärts-Primer 30331 (5'-GCCAGTGGTGCCGTCGAGGCGGG-3', SEQ ID NO: 72) derartig entworfen, dass die Gesamt-Kodierungssequenz des zweiten Exons durch PCR amplifiziert werden konnte.
Das erste Kodierungsexon wurde nicht relativ zu den Restriktionsstellen oben gemapped, sondern war in dem Eag I-Fragment enthalten. Die Sequenz dieses Exons wurde aus dem subklonierten Eag I-Fragment unter Verwendung des Maus-Primers 466215 (5'-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3', SEQ ID NO: 73), erhalten, welcher das ATG-Initialisierungskodon enthält. Die weitere Sequenz des ersten Kodierungsexons wurde erhalten mit dem reversen Primer 20215 (5'-CCACTCCACTGCCTGAWATTCWACCCC-3', SEQ ID NO: 74), entworfen aus der mit dem Pri mer 466215 erhaltenen Sequenz. Der Vorwärts-Primer 20205 (5'-CCATGTCATTATCGACCATTCGGC-3', SEQ ID NO: 75) wurde aus der mit dem Primer 20215 erhaltenen Sequenz entworfen. Die Primer 20205 und 20215 flankieren die Kodierungssequenz des ersten Kodierungsexons und können zur Amplifizierung dieser Kodierungssequenz unter Verwendung von PCR verwendet werden.
Beispiel 6
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Expressionsvektoren, welche Neurturin-cDNA enthalten.
Zur Expression von rekombinantem Neurturin in Säugerzellen wurde der Neurturin-Vektor pCMV-NTN-3-1 hergestellt. Der offene 585-Nucleotid-Leserahmen der Neurturin-cDNA wurde durch PCR unter Verwendung eines Primers, welcher die ersten 27 Nucleotide der Neurturin-Kodierungssequenz (5'-GCGACGCGTACCATGAGGCGCTGGAAGGCAGCGGCCCTG, SEQ ID No. 63) enthält, und eines Primers, welcher die letzten 5 Kodons und das Stopkodon (5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC) (SEQ ID NO: 64) enthält, amplifiziert, wobei revers-transkribierte Maushirn-mRNA am postnatalen Tag 1 als Templat verwendet wurde, wobei PCR-Parameter eingesetzt wurden: 94°C für 30 Sekunden; 60°C für 15 Sekunden; und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen, einschließlich 5% DMSO in der Reaktion. Das PCR-Produkt wurde in die Eco RV-Stelle von BSKS subkloniert und sequenziert, um zu verifizieren, dass es keine PCR-generierten Mutationen enthielt. Die Neurturin-Kodierungssequenz wurde anschließend aus diesem Vektor ausgeschnitten, wobei Mlu I (5'-Ende) und Bam H1 (3'-Ende) verwendet wurden, und unterhalb des CMV IE-Promoters/Enhancers in den Säugerexpressionsvektor pCB6 eingesetzt (Brewer, C. B. Methods in Cell Biology 43: 233–245, 1994), um den pCMV-NTN-3-1-Vektor unter Verwendung dieser Stellen zu bilden.
Zur Expression von rekombinantem Protein in E. Coli wurde der reife Kodierungsabschnitt von Maus-Neurturin durch PCR amplifiziert, wobei ein Primer, der die ersten sieben Kodons von der reifen Kodierungssequenz (5'-GACCATATGCCGGGGGCTCGGCCTTGTGG) (SEQ ID NO. 65) enthielt, und ein Primer, welcher die letzten fünf Kodons und das Stopkodon 5'-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC (SEQ ID NO: 66) enthielt, unter Verwendung eines Fragments, enthaltend das Murin-Neurturin-Gen als Templat, verwendet wurde, wobei PCR-Parameter verwendet wurden: 94°C für 30 Sekunden; 60°C für 15 Sekunden und 68°C für 90 Sekunden für 25 Zyklen mit 5% DMSO, welches zu der Reaktion zugesetzt wurde. Das amplifizierte Produkt wurde in die Eco RV-Stelle von BSKS subkloniert, die Nucleotid-Sequenz wurde verifiziert, und dieses Fragment wurde anschließend in dem Expressionsvektor pET-30a (Novagen, Madison, WI) unter Verwendung einer Nde 1-Stelle (5'-Ende) und einer Eco R1-Stelle (3'-Ende) transferiert. Der pET-Neu rturin-Vektor (pET-NTN) kodiert für ein Initiator-Methionin vor der ersten Aminosäure des reifen Maus-Neurturin-Proteins, vorausgesagt auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz von Neuturin, welche aus dem konditionierten CHO-Zellenmedium gereinigt wurde.
Beispiel 7
sDieses Beispiel verdeutlicht die vorübergehende Transfizierung von NIH3T3-Zellen mit dem Neurturin-Expressions-Vektor pCMV-NTN-3-1, und dass das Produkt der Genom-Sequenz in Beispiel 5 biologisch aktiv ist.
Um zu zeigen, dass geklonte Neurturin-cDNA ausreichte, um die Synthese von biologisch wirksamem Neurturin hervorzurufen, wurde das pCMV-NTN-3-1-Plasmid in NIH3T3-Zellen vorübergehend eingefügt, wobei das Lipofectamin-Verfahren der Transfizierung verwendet wurde. Die NIH3T3-Zellen wurden bei einer Dichte von 400.000 Zellen pro Well (34,6 mm Durchmesser) auf 6 Well-Platten (Corning, Corning, NY) 24 Stunden vor der Transfizierung gegeben. DNA-Liposom-Komplexe wurden hergestellt und zu den Zellen gemäß dem Herstellerprotokoll zugesetzt, wobei 1,5 μg CMV-Neurturin-Plasmid-DNA (isoliert und gereinigt unter Verwendung einer Qiagen-(Chatsworth, CA)Tip-500-Säule gemäß dem Herstellerprotokoll) und 10 μl Lipofectamin-Reagenz (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) in 1 : 1 DME/F12-Medium, enthaltend 5 μg/ml Insulin, 5 μg/ml Transferrin und 5 ng/ml Natriumselenit (Sigma, St. Louis, MO), verwendet wurde. Fünf Stunden nach der Zugabe von DNA-Liposom-Komplexen in 1 ml Medium pro Well wurden 1 ml DME-Medium, enthaltend 20% Kalbsserum, zu jedem Well zugesetzt. 24 Stunden nach der Zugabe der DNA-Liposom-Komplexe wurden die obigen 2 ml Medium durch 1 ml DME-Medium, enthaltend 10% Kalbsserum, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penizillin, 100 μ/ml Streptomycin und 25 μg/ml Heparin, ersetzt. Die Zellen wurden zusätzliche 24 Stunden inkubiert, bevor das konditionierte Medium geerntet, zur Entfernung von zellulärer Debris zentrifugiert und eingefroren wurde.
Als Kontrolle wurden NIH3T3-Zellen wie oben transfiziert, wobei 1,5 μg CMV-Neo-Expressions-Plasmid (enthaltend keinen cDNA-Einsatz) anstelle von 1,5 μg CMV-Neurturin-Plasmid verwendet wurden. Das konditionierte Medium aus NIH3T3-Zellen, welches mit entweder Kontrollplasmid oder CMV-Neurturin-Plasmid transfiziert worden ist, wurde durch direkte Zugabe zu dem SCG-Kulturmedium zu der Zeit der NGF-Deprivation untersucht. Die Zugabe von 0,25 ml konditioniertem Medium aus CMV-Neurturin-transfektierten Zellen förderten 70% Überleben der sympathischen Neuronen, und ein Überleben von > 90% konnte mit 0,45 ml dieses konditionierten Mediums erhalten werden. Es konnte keine signifikante überlebensfördernde Wirkung in dem konditionierten Medium der transfizierten Kontroll-NIH3T3-Zellen detektiert werden.
Beispiel 8
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, welche stabil mit Neurturin-cDNA transformiert wurden. DG44-Zellen, ein Eierstockzellen-Derivat des chinesischen Hamsters, dem es an Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) mangelt (Urlaub et al. Cell. 3: 405–412, 1983), wurden mit Expressionsplasmid (pCMV-NTN-3-1) und einem DHFR-Expressionsplasmid (HLD) (McArthur, und Stanners J. Biol. Chem. 266: 6000–6005, 1991) stabil co-transfiziert.
Am Tag 1 wurden DG44-Zellen in 1 × 10⁶ Zellen pro 10 cm Platte in Ham's F12-Medium mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS) platziert. Diese Dichte darf nicht überschritten werden, oder die Zellen würden überwuchern, bevor das Selektionsmedium am Tag 5 zugesetzt wird.
Am Tag 2 wurden die Zellen mit einem 9 : 1-Verhältnis von pCMV-NTN zu DHFR-Expressionsplasmid unter Verwendung der Calciumphosphatmethode (10 μg DNA/10 cm Platte) (Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752, 1987 welche durch Bezugnahme hierin eingeschlossen ist) transfiziert.
Am Tag 3 wurden die transfizierten Zellen mit Ham's F12-Medium und mit 10% FCS gefütterten Ham's F12 gewaschen.
Am Tag 5 wurden die Zellen mit MEM-alpha-Medium gewaschen und mit Selektionsmedium, welches MEM-alpha mit 10% FCS und 400 μg/ml G418 darstellt, gefüttert. Die Zellen wurden in dem Selektionsmedium gehalten und alle 4 Tage gefüttert. Die Kolonien begannen ungefähr 14 Tage nach der Transfizierung sichtbar zu werden. Die in dem Selektionsmedium wachsenden Kolonien wurden anschließend in eine 24-Well-Platte überführt und am nächsten Tag trypsinisiert, um die Zellen zu dispergieren. Man ließ die Zellen in entweder 24-Well- oder 6-Well-Platten zur Konfluenz zusammenwachsen, um die Zellen hinsichtlich der Expression von rekombinantem Protein zu screenen. Die Expression von Neurturin wurde in 10 Klonreihen bestimmt, und zwei hochexprimierende Reihen wurden unter Verwendung des SCG-Überlebensassays detektiert. Diese Klonreihen wurden vermehrt, und die Expression in diesen ausgewählten Zellreihen wurde durch Selektion in 50 mM Methotrexat (MTX) amplifiziert. Für die Selektion in MTX ließ man Zellen bis auf 50% Konfluenz in einer 150 cm²-Flasche in dem Selektionsmedium wachsen. Das Medium wurde nach MEM-alpha, enthaltend 50 nM MTX-Konzentration geändert (es war nicht notwendig, G418 während der MTX-Amplifikation zu verwenden). Nach Platzieren in 50 mM MTX starb die Mehrzahl der Zellen ab, und Kolonien der resistenten Zellen traten in 1 bis 2 Wochen erneut auf. Dann wurden die Zellen trypsinisiert, um die Kolonien zu dispergieren, und aufgeteilt, wenn die Zellen die Konfluenz erreichten. Die Zellen erreichten letztendlich dieselbe Wachstumsrate wie vorher. Die ausgewählten Zellen wurden hinsichtlich der Expression von rekombinantem Protein gescreent. Ein 2–3-facher Anstieg in der Expression wurde nach der Selektion in 50 mM MTX beobachtet. Gefrorene Stocks wurden gehalten für Zelllinien, die von der ursprünglichen Selektion und der 50 mM MTX-Selektion erhalten wurden. Eine weitere Selektion konnte in zunehmendem MTX fortgesetzt werden, bis erwünschte Expressionsniveaus erhalten wurden.
Unter Verwendung des obengenannten Verfahrens konnten als DG44CHO5-3(G418) (pCMV-NTN-3-1) und DG44CHO5-3 (50 nMMTX) (pCMV-NTN-3-1) identifizierte Zellen isoliert werden. Die Zellen des DG44CHO5-3 (50 nMMTX) (pCMV-NTN-3-1)-Stammes exprimierten Mengen von ungefähr 100 μg biologisch aktives Protein pro Liter konditioniertem Medium, wie es durch direkte Untersuchung des konditionierten Mediums in dem SCG-Assay gemäß dem Verfahren im Beispiel 1 bestimmt wurde.
Beispiel 9
Dieses Beispiel verdeutlicht die Expression von Neurturin in verschiedenen Geweben.
Es wurde eine Studie der Neurturin- und GDNF-Expression in Rattenembryo-Geweben (E10, Tag 10 nach der Empfängnis), neonatalen Geweben (P1, postnataler Tag 1) und erwachsenen Geweben (> 3 Mos) unter Verwendung von semiquantitativer RT/PCR durchgeführt (Estus et al., J. Cell. Biol. 127: 1717–1727, 1994). Die RNA-Proben wurden aus verschiedenen Geweben erhalten, und PCR-Produkte wurden entweder durch Autoradiographie nach der Inkorporierung von α-³²P-dCTP in der PCR und Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel (6) oder durch Ethidiumbromid-Färbung der DNA nach der Elektrophorese auf Agarosegelen (Tabellen 3 und 4) detektiert. Das Neurturin-Fragment mit 101 Basenpaaren wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primers CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG (SEQ ID NO: 67) und des Rückwärts-Primers TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT (SEQ ID NO: 68) erhalten, und das GDNF-Fragment mit 194 Basenpaaren wurde unter Verwendung des Vorwärts-Primers AAAAATCGGGGGTGYGTCTTA (SEQ ID NO. 69) und des Rückwärts-Primers CATGCCTGGCCTACYTTGTCA (SEQ ID NO: 70) erzielt.
Es wurde keine Neurturin- oder GDNF-mRNA im frühesten embryonalen Alter (embryonaler Tag 10, E10), welches erfasst wurde, detektiert.
Bei Neugeborenen (postnataler Tag 1, P1) wurden beide Transkripte/Kopien in vielen Geweben exprimiert, obwohl Neurturin dazu neigte, eine größere Expression in den meisten Geweben zu zeigen, als es bei GDNF der Fall war (siehe Tabelle 3).
Tabelle 3
Wie in Tabelle 3 gezeigt ist, wurden Unterschiede in den Gewebeverteilungen von Neurturin und GDNF verzeichnet. Insbesondere wurde kein GDNF in Leber und Thymus detektiert, worin eine Neurturin-Expression detektiert wurde, und kein Neurturin wurde in dem Ischiasnerv detektiert, wo GDNF detektiert wurde.
Neuturin- und GDNF-mRNA wurden in vielen Geweben in dem erwachsenen Tier detektiert, allerdings war das gewebespezifische Muster der Expression für diese zwei Gene äußerst unterschiedlich (Tabelle 4, 5).
Tabelle 4
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, wurde gefunden, dass Neurturin im Gehirn und Rückenmark sowie im Blut und Knochenmark exprimiert wurde, wo kein GDNF detektiert wurde. Das Expressionsniveau von Neurturin im Gehirn und Blut war jedoch geringer als das, welches in neonatalem Gewebe detektiert wurde.
Neuturin wurde ebenso in frisch isolierten Rattenbauchfell-Mastzellen hoch exprimiert, wohingegen GDNF nur eine geringe oder keine Expression zeigte.
Beispiel 10
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Antiseren gegenüber Neurturin durch Immunisieren von Kaninchen mit einem Neurturinpeptid.
Die Peptidsequenz, welche den Aminosäuren 73–87 des reifen Murin-Neurturin-Proteins entsprach, wurde synthetisiert und an Keyhole-Limpet-Hemocyanin (KLH) gekoppelt, wie bereits früher beschrieben wurde (Harlow und Lane, Antibodies: α laboratory manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY., Seiten 72–81). Das KLH-gekoppelte Peptid wurde an die Caltag, Inc. geschickt, und ein jeder von zwei Hasen wurden immunisiert. Die Immunisierung wurde durch subkutane Injektion an 7–10 Stellen durchgeführt. Die erste Injektion erfolgte mit 150 μm KLH-gekoppeltem Peptid, welches in 0,5 ml Salzlösung resuspendiert wurde und mit 0,5 ml Freundschem kompletten Adjuvants emulgiert wurde. Es wurden Boost-Injektionen 4 Wochen nach der ersten Injektion begonnen und einmal in 7 Tagen wie oben für insgesamt 5 Injektionen durchgeführt, außer dass 100 μg KLH-gekoppeltes Peptid und Freundsches inkomplettes Adjuvants verwendet wurde. Serumproben wurden 1 Woche nach dem fünften Boost gesammelt.
Ein gepooltes Volumen von 20 ml Serum, welche von beiden Kaninchen eine Woche nach der fünften Injektion gesammelt wurde, wurde aufgereinigt. Für die Aufreinigung wurde eine Peptidaffinitätssäule durch Kupplung des obengenannten Peptids and Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B gemäß dem Herstellerprotokoll (Pharmacia Biotech) präpariert. Das Serum wurde 10-fach in 10 mM Tris pH 7,5 Puffer verdünnt und durch behutsames Schwenken 16 Stunden lang bei 4°C mit 0,5 ml Peptid-Agarose-Matrix, enthaltend 5 mg gekoppeltes Peptid, gemischt. Die Matrix wurde auf eine Säule gegeben, mit 5 ml 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl gewaschen, mit 5 ml 10 mM Tris pH 7,5-Puffer, enthaltend 0,4 M NaCl, gewaschen und mit 5,5 ml 100 mM Glycin pH 2,5-Puffer eluiert. Ein zehntel Volumen von 1,0 M Tris pH 8,0 Puffer wurde zu dem Eluat direkt nach der Elution zugesetzt, um den pH zu neutralisieren. Das Glycin-Eluat wurde über Nacht gegenüber 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl dialysiert.
Die Affinitäts-gereinigten Antikörper wurden in einem Western Blot verwendet, um die spezifische Erkennung des rekombinanten Neurturin-Proteins zu zeigen. 10 ml konditioniertes Medium, gesammelt aus DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)- Zellen, wurden über SP-Sepharose, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, und die Proteine wurden auf einem reduzierenden SDS-PAGE-Gel in dem Tricine-Puffer-System (Schagger und von Jagow Analytical Biochemistry 166: 368–479, 1987) elektrophoresiert. Die Proteine wurden an eine Nitrocellulose-Membran in 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,04% SDS, 17% Methanol bei 4°C 16 Stunden lang elektrogeblotted. Die Membran wurde mit den Affinitäts-gereinigten Anti-Neurturin-Peptid-Antikörpern und anschließend mit Meerettich-Peroxidase-gekoppelten Schaf-Anti-Kaninchen-IgG inkubiert (Harlow und Lane, supra, Seiten 498–510). Die gebundenen Antikörper wurden mit verstärkter Chemilumineszenz detektiert (ECL Kit, Amersham, Buckinghamshire, England). Die Anti-Neurturin-Antikörper erkannten ein einzelnes ungefähr 11,5 kD-Protein-Band in dem konditionierten Medium der DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)-Zellen. Unter Verwendung dieser Anti-Neurturin-Antikörper konnte Neurturin-Protein in 10 ml konditioniertem Medium aus DG44CHO5-3 (G418) (pCMV-NTN-3-1)-Zellen detektiert werden, konnte allerdings nicht in 10 ml Medium, konditioniert mit DG44-Zellen detektiert werden, welche nicht mit dem Neurturin-Expressionsvektor transformiert worden waren.
Beispiel 11
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Identifizierung von zusätzlichen Mitgliedern der GDNF/Neurturin/Persephin-Gen-Subfamilie.
Die TGF-β-Superfamilie enthält derzeit über 25 unterschiedliche Genmitglieder (als Überblick siehe Kingsley, Genes and Development 8: 133–146, 1994). Die einzelnen Familienmitglieder zeigen unterschiedliche Homologiegrade miteinander auf, und nähere Subgruppen können innerhalb der Superfamilie durch phylogenetische Analyse unter Verwendung des Clustal V-Programms (Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189–191, 1992) und durch Bootstrap-Analyse von phylogenetischen Bäumen (Felsenstein, Evolution 39: 783–791, 1985) definiert werden. Neurturin oder Persephin ist ungefähr 40% identisch zu GDNF, allerdings weniger als 20% identisch zu jedem anderen Mitglied der TGF-β-Superfamilie. Nähere Sequenzbereiche in Neurturin können identifiziert werden (5), welche innerhalb der GDNF/Neurturin/Persephin-Subfamilie, allerdings nicht innerhalb der TGF-β-Superfamilie hoch konserviert bzw. hoch erhalten sind. Diese erhaltenen Bereiche können wahrscheinlich eine Subfamilie kennzeichnen, die bisher unisolierte Gene enthält, welche nun unter Verwendung der erhaltenen Sequenzbereiche isoliert werden können, die durch die Entdeckung und Sequenzierung der Neurturin- und Persephin-Gene identifiziert wurden. Die Bereiche hoher Sequenz-Konservierung bzw. hohem Sequenzerhalt zwischen Neurturin, Persephin und GDNF erlauben den Entwurf von entarteten bzw. degenerierten Oligonucleotiden, welche entweder als Sonden oder Primer verwendet werden können. Aminosäuresequenzen konservierter Bereiche wurden hierin identifiziert und umfassen Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa₁ Ser, Thr oder Ala ist, und Xaa₂ Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 108); Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₄-Gly-Xaa₅-Cys, worin Xaa₁ Thr, Glu oder Lys darstellt, Xaa₂ Val, Leu oder Ile ist, Xaa₃ Leu oder Ile darstellt, Xaa₄ Ala oder Ser ist und Xaa₅ Ala oder Ser darstellt, (SEQ ID NO: 113); und Cys-Cys-Xaa₁-Pro-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Xaa₅-Asp-Xaa₆-Xaa₇-Xaa₈-Phe-Leu-Asp-Xaa₉, worin Xaa₁ Arg oder Gln ist, Xaa₂ Thr oder Val oder Ile darstellt, Xaa₃ Ala oder Ser ist, Xaa₄ Tyr oder Phe ist, Xaa₅ Glu, Asp oder Ala darstellt, Xaa₆ Glu, Asp oder keine Aminosäure ist, Xaa₇ Val oder Leu ist, Xaa₈ Ser oder Thr darstellt und Xaa₉ Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 114). Nucleotidsequenzen, welche eine Kodierungssequenz für die obengenannten konservierten Sequenzen oder Fragmente der obengenannten konservierten Sequenzen enthalten, können als Sonden verwendet werden. Beispielhafte Sonden- und Primer-Sequenzen, welche aus diesen Bereichen bzw. Abschnitten erstellt werden können, sind die folgenden:
Vorwärts-Primer,
Primer A (M3119): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTA (SEQ ID NO: 115) 23 nt, welcher für die Aminosäuresequenz Val-Xaal-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr kodiert, worin Xaa₁ Thr, Ser oder Ala darstellt und Xaa₂ Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 125);
Primer B (M3123): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANG (SEQ ID NO: 116) 19 nt, welcher für die Aminosäuresequenz Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Leu-Xaa₄-Xaa₅ kodiert, worin Xaa₁ Asp oder Glu darstellt, Xaa₂ Val oder Leu ist, Xaa₃ Thr oder Ser ist, Xaa₄ Asp oder Glu ist, und Xaa₅ Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 126);
Primer C (M3126): 5'-GANBTNWCNTTYYTNGANGW (SEQ ID NO: 117) 20 nt, welcher für die Aminosäuresequenz Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Leu-Xaa₄-Xaa₅ kodiert, worin Xaa₁ Asp oder Glu darstellt, Xaa₂ Val oder Leu ist, Xaa₃ Thr oder Ser ist, Xaa₄ Asp oder Glu ist, und Xaa₅ Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 126);
Primer D (M3121): 5'-TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTG (SEQ ID NO: 118) 23 nt, welcher für die Aminosäuresequenz Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys kodiert, worin Xaa₁ Ser oder Ala darstellt und Xaa₂ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 127);
Primer E (M3122): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTNGG (SEQ ID NO: 119) 20 nt, welcher für die Aminosäuresequenz Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly kodiert, worin Xaa₁ Thr, Ser oder Ala darstellt und Xaa₂ Asp oder Glu ist (SEQ ID NO: 128);
Primer F (M3176): 5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTT (SEQ ID NO: 120) 23 nt, welcher für die Aminosäuresequenz Val-Xaa_l-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Phe kodiert, worin Xaa₁ Thr, Ser oder Ala darstellt und Xaa₂ Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 129);
Rückwärts-Primer,
Primer G (M3125): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNTC (SEQ ID NO: 121) 20 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Xaa₁-Xaa2-Xaa₃-Phe-Leu-Xaa₄-Xaa₅ kodiert, worin Xaa₁ Asp oder Glu darstellt, Xaa₂ Val oder Leu ist, Xaa₃ Thr oder Ser ist, Xaa₄ Asp oder Glu ist und Xaa₅ Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 126);
Primer H (M3124): 5'-WCNTCNARRAANGWNAVNT (SEQ ID NO: 122) 19 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Leu-Xaa₄-Xaa₅ kodiert, worin Xaa₁ Asp oder Glu darstellt, Xaa₂ Val oder Leu ist, Xaa₃ Thr oder Ser ist, Xaa₄ Asp oder Glu ist und Xaa₅ Asp oder Val ist (SEQ ID NO: 126);
Primer I (M3120): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAA (SEQ ID NO: 123) 23 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys kodiert, worin Xaa₁ Ser oder Ala darstellt und Xaa₂ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 127); und
Primer J (M3118): 5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAANA (SEQ ID NO: 124) 25 nt, dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Xaa₁-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₂-Gly-Xaa₃-Cys kodiert, worin Xaa₁ Ile oder Leu darstellt, Xaa₂ Ser oder Ala ist und Xaa₃ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 130).
Zusätzlich zu den Obengenannten basieren die folgenden Primer auf konservierten Abschnitten in GDNF und Neurturin (SEQ ID NOS: 33–35).
Primer 1, GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA (SEQ ID NO: 42), welche für die Aminosäuresequenz Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr kodiert, worin Xaa₁ Ser oder Thr ist und Xaa₂ Glu oder Asp darstellt (SEQ ID NO: 33);
Primer 2, TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC (SEQ ID NO: 43), welche für die Aminosäuresequenz Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄- Ala kodiert, worin Xaa₁ Ala oder Ser darstellt, Xaa₂ Ala oder Ser ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 36);
Primer 3, reverse GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA (SEQ ID NO: 44), dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Ala kodiert, worin Xaa₁ Ala oder Ser darstellt, Xaa₂ Ala oder Ser ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Ser oder Ala ist (SEQ ID NO: 37);
Primer 4, reverse TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA (SEQ ID NO: 45), dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa₁-Ala-Xaa₂-Xaa₃-Asp-Xaa₄ kodiert, worin Xaa₁ Ile oder Thr oder Val darstellt, Xaa₂ Try oder Phe ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Glu oder Asp ist (SEQ ID NO: 38);
Primer 5, reverse TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC (SEQ ID NO: 46, dessen reverse komplementäre Sequenz für die Aminosäuresequenz Ala-Xaa₁-Xaa₂-Asp-Xaa₃-Xaa₄-Ser-Phe-Leu-ASp kodiert, worin Xaa₁ Tyr oder Phe darstellt, Xaa₂ Glu oder Asp ist, Xaa₃ Glu oder Asp ist und Xaa₄ Val oder Leu ist (SEQ ID NO: 39);
Primer 6, GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG (SEQ ID NO: 47), welche für die Aminosäuresequenz Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys kodiert, worin Xaa₁ Glu oder Thr darstellt, Xaa₂ Leu oder Val ist und Xaa₃ Ile oder Leu ist (SEQ ID NO: 40);
Primer 7, GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA (SEQ ID NO: 48), welche für die Aminosäuresequenz Glu-Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₄-Gly-Xaa₅-Cys-Xaa₆ kodiert, worin Xaa₁ Glu oder Thr darstellt, Xaa₂ Leu oder Val ist, Xaa₃ Ile oder Leu ist, Xaa₄ Ser oder Ala ist, Xaa₅ Ser oder Ala ist und Xaa₆ Glu oder Asp ist. (SEQ ID NO: 41).
Die obigen Sequenzen können als Sonden zum Screenen von Bibliotheken für Genomklone oder Primer zur Amplifizierung von Genfragmenten aus Genom-DNA oder Bibliotheken von Genomklonen oder von revers-transkribierter cDNA unter Verwendung RNA-Templaten aus einer Vielzahl von Geweben verwendet werden. Genom-DNA oder Bibliotheken von Genom-Klonen als Template verwendet werden, weil die Neurturin-, Persephin- und GDNF-kodierenden Sequenzen für die reifen Proteine nicht durch Introns unterbrochen sind.
Ein entartetes Oligonucleotid kann als eine Mischung von Oligonucleotiden synthetisiert werden, welche sämtliche der möglichen Nucleotidsequenzen enthält, die für die konservierte Aminosäuresequenz kodieren. Um die Anzahl unterschiedlicher Oligonucleotide in einer entarteten Mischung zu vermindern, kann ein Inosin oder eine Universalbase (Loakes et al., Nucleic Acids Res. 22: 4039–43, 1994) in die Synthese an Positionen eingefügt werden, wo sämtliche vier Nucleotide möglich sind. Das Inosin oder die Universalbase bildet Basenpaare mit jedem der vier normalen DNA-Basen, welche weniger stabilisierend sind als AT- und GC-Basenpaare, welche allerdings ebenso weniger destabilisierend sind als Fehlordnungen zwischen den normalen Basen (d. h. AG, AC, TG, TC).
Um Familienmitglieder zu isolieren, kann ein obiger Primer mit ³²P unter Verwendung von T4-Polynucleotid-Kinase endgelabelt werden und an Bibliotheken humaner Genomklone gemäß Standardverfahren hybridisiert werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung von Familienmitglieds-Genen wäre die Verwendung verschiedener Kombinationen der obigen entarteten Primer als Primer in der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Genom-DNA als ein Templat. Die verschiedenen Kombinationen von Primern können sequenzielle PCR-Reaktionen unter Verwendung von verschachtelten Primern oder die Verwendung eines Vorwärts-Primers, gepaart mit einem Oligo-dT-Primer, einschließen. Zusätzlich kann einer der entarteten Primer mit einem Vektorprimer verwendet werden, ein einzelner Primer kann in einem invertierten PCR-Assay verwendet werden, oder die PCR kann mit einem entarteten Primer und einem randomisierten Primer durchgeführt werden. Als ein Beispiel, welches den obigen Satz Primer verwendet, kann Primer 2 (SEQ ID NO: 43) mit Primer 4 (SEQ ID NO: 45) in der PCR mit 1 μg Humangenom-DNA und zyklierenden Parametern von 94°C für 30 Sekunden, 50°C für 30 Sekunden und 72°C für 60 Sekunden verwendet werden. Die obengenannten PCR-Bedingungen sind nur beispielhaft, und der Fachmann wird leicht erkennen, dass ein Bereich geeigneter Bedingungen und Primer-Kombinationen verwendet oder optimiert werden können, wie unterschiedliche Temperaturen und variierende Salzkonzentrationen in dem Puffermedium und ähnliches. Es ist bevorzugt, dass DMSO zu der PCR-Reaktion in einer finalen Konzentration von 5% zugesetzt wird, da gefunden wurde, dass dieses für die Amplifizierung dieses Abschnitts des Neurturin-Gens notwendig ist. Die PCR-Reaktion, wenn sie auf einem Agarose-Gel laufen gelassen wird, sollte Produkte in dem Größenbereich von 100–150 Basenpaaren enthalten, da eine Ein-Aminosäure-Spalte in die Neurturin-Sequenz eingefügt wird und eine Fünf-Aminosäure-Spalte in die Persephin-Sequenz eingefügt wird, wenn eine der beiden Sequenzen mit GDNF ausgerichtet/abgeglichen wird, und folglich können die Familienmitgliedsgene ebenso einen leicht variablen Abstand zwischen den konservierten Sequenzen der Primer 2 und 4 enthalten. Die PCR-Produkte in dem Bereich von 100 bis 150 Basenpaaren sollten mehrfach amplifizierte Genprodukte enthalten, einschließlich GDNF, Neurturin und Persephin sowie bisher unisolierte Familienmitglieder. Um die Sequenzen dieser Produkte zu identifizieren, können sie gelgereinigt und in das Bluescript-Plasmid (Stratagene) ligiert werden und anschließend in den XL1-Blue E. Coli-Wirtsstamm (Stratagene) transformiert werden. Die Bakterienkolonien, welche einzelne Subklone enthalten, können für die Isolierung herausgegriffen und auf Nitrocellulose-Filter in zwei Repliken platiert werden. Jeder der Replikfilter kann mit einer Oligonucleotidsonde nach entweder einzelner GDNF- oder einzelner Neurturin- oder einzelner Persephin-Sequenz in dem amplifizierten Abschnitt gescreent werden. Subklone, welche weder an GDNF noch an Neurturin oder Persephin hybridisieren, können sequenziert werden und, sofern sie als die bisher unisolierten Familienmitglieder kodierend gefunden werden, kann die Sequenz zur Isolierung der cDNA-Klone voller Länge und der Genomklone verwendet werden, wie es für Neurturin vorgenommen wurde (Beispiel 5). Ein ähnliches Verfahren wurde zur Isolierung neuer Genmitglieder (GDF-3 und GDF-9) der TGF-β-Superfamilie auf der Basis der Homologie zwischen den bisher identifizierten Genen verwendet (McPherron, J. Biol. Chem. 268: 3444–3449, 1993).
Die vorliegenden Erfinder glauben, dass der am meisten bevorzugte Weg zur Isolierung der Familienmitgliedergene die Anwendung des obengenannten PCR-Verfahrens als Screening-Verfahren zur Isolierung der einzelnen Familienmitglieder-Genomklone aus einer Bibliothek sein kann. Dieses liegt daran, weil nur ein Exon für den Kodierungsabschnitt sowohl von reifem Neurturin als auch von GDNF existiert. Wenn beispielsweise die obengenannte PCR-Reaktion mit den Primern 2 und 4 Produkte geeigneter Größe unter Verwendung von Humangenom-DNA als Templat bildet, kann dieselbe Reaktion durchgeführt werden, wobei als Templat Pools von Genomklonen in dem P1-Vektor gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden, beispielsweise jenes, das für die Isolierung von Neurturin-Humangenomklonen verwendet wurde (Beispiel 5). Pools bzw. Datensammlungen, welche das Neurturin-Gen in dieser Bibliothek enthalten, wurden früher identifiziert, und Persephin und GDNF-enthaltende Pools können leicht durch Screening mit GDNF-spezifischen Primern identifiziert werden. Folglich werden Nicht-Neurturin-, Nicht-Persephin-, Nicht-GDNF-Pools, welche ein Produkt der richtigen Größe bilden unter Verwendung der entarteten Primer, leicht als die bisher unisolierten Familienmitglieder erkannt werden. Die PCR-Produkte, welche aus diesen Pools gebildet werden, können direkt unter Verwendung automatischer Sequenzierer sequenziert werden, und Genomklone können durch weitere Unterteilung und Screenen der gepool ten Klone als ein von Genom Systems, Inc. angebotener Standardservice isoliert werden.
Beispiel 12
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Isolierung und Identifizierung von Persephin unter Verwendung der in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren und Primer.
Die von den Erfindern hierin ausgearbeitete entartete bzw. degenerierte PCR-Strategie wurde nun erfolgreich zur Identifizierung eines dritten Faktors, Persephin, verwendet, welches ungefähr 35 bis 50% identisch zu sowohl GDNF als auch Neurturin ist. Der experimentelle Ansatz war der oben beschriebene und wurde detaillierter wie folgt durchgeführt. Primer, entsprechend der Aminosäuresequenz Val-Xaa₁-Xaa₂-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr, worin Xaa₁ Ser oder Thr ist und Xaa₂ Glu oder Asp darstellt, SEQ ID NO: 33) [M 1996; 5'-GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA (SEQ ID NO: 42)], und Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa₁-Gly-Xaa₂-Cys-Xaa₃-Xaa₄-Ala, worin Xaa₁ Ala oder Ser ist, Xaa₂ Ala oder Ser ist, Xaa₃ Glu oder Asp darstellt, und Xaa₄ Ser oder Ala darstellt (SEQ ID NO: 37) [M1999; 5'-GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRCARTANCKRAA (SEQ ID NO: 44)], wurden zur Amplifizierung eines 77 nt-Fragments aus Rattengenom-DNA unter Verwendung von Klentaq-Enzym und Puffer unter den folgenden Bedingungen verwendet: 94°C für 30 Sekunden, 44°C für 30 Sekunden; 72°C für 30 Sekunden für 40 Zyklen. Das resultierende Produkt wurde in das Bluescript KS-Plasmid subkloniert und sequenziert. Sämtliches Nucleotid-Sequenzieren wurde unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoff-Terminatortechnologie gemäß den Benutzeranweisungen auf einem automatischen Sequenzierer von Applied Biosystems Modell #373 (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt. Die Plasmid-DNA zum Sequenzieren wurde unter Verwendung des Wizard-Miniprep-Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Betriebsanleitungen hergestellt.
Die Sequenz eines der amplifizierten Produkte sagte Aminosäuresequenzdaten innerhalb der PCR-Primer voraus, welche unterschiedlich von denen von GDNF oder Neurturin waren, welche allerdings mehr als 20% Identität mit GDNF und Neurturin aufwiesen, wohingegen die Sequenzen anderer, die wir beobachtet haben, GDNF oder Neurturin entsprachen, wie es erwartet wurde. Es wird angenommen, dass die neue Sequenz ein neues Mitglied dieser Familie identifiziert, welches wir Persephin genannt haben.
Die Sequenz dieses Fragments innerhalb der Primer war 5'-TGCCTCAGAGGAGAAGATTATC (SEQ ID NO: 90). Diese kodiert das letzte Nucleotid des Tyr-Codons und kodiert anschließend die Aminosäuren: Ala-Ser-Glu-Glu-Lys-Ile-Ile (SEQ ID NO: 91). Diese Sequenz wurde anschließend mit den Rattensequenzen von GDNF und Neurturin ausgerichtet/abgeglichen. Diese Analyse bestätigte, dass Persephin einzigartig war.
Um eine zusätzliche Persephinsequenz zu erhalten, wurden Primer, welche Abschnitte der einzigartigen 22 nt des amplifizierten Fragments oben enthalten, in der schnellen Amplifizierung von cDNA-Enden (RACE)-Technik (Frohman, M. A. Methods in Enzymology 218: 340–356, 1993) unter Verwendung des Marathon-RACE-Kits (CLONTECH, Palo Alto, CA) gemäß der Betriebsanleitung verwendet, außer dass die Synthese des ersten cDNA-Strangs bei 50°C unter Verwendung von Superscript II-Reverse-Transkriptase (Gibco-BRL) ausgeführt wurde. Kurz gesagt wurde ein Doppelstrang-Adapter-Oligonucleotid an die Enden der Doppelstrang-cDNA legiert, synthetisiert aus Rattenhirn-mRNA am postnatalen Tag 1. Unter Verwendung von verschachtelten Vorwärts-Persephin-PCR-Primern (10135; 5'-AGTCGGGGTTGGGGTATGCCTCA, SEQ ID NO: 95 und M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT, SEQ ID NO: 96) in Kombination mit Primern zu dem in dem Kit zugeführten ligierten Adapter (AP1, AP2) wurden die 3'-Enden der Persephin-cDNA durch zwei sukzessive PCR-Reaktionen amplifiziert (Erstens: 10135 und AP1 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 15 Sekunden und 68°C für 2 Minuten für 35 Zyklen; Zweitens: M2026 und AP2 unter Verwendung von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 15 Sekunden und 68°C für 2 Minuten für 21 Zyklen). Ein ungefähr 350 nt-Fragment wurde aus dieser PCR-Reaktion erhalten, und dieses Fragment wurde unter Verwendung des Primers M2026 direkt sequenziert. Die Sequenz dieses 3'-RACE-Produkts resultierte in einer partiellen Ratten-Persephin-cDNA-Sequenz mit ungefähr 350 nt (SEQ ID NO: 97). Die vorausgesagte Aminosäuresequenz dieser cDNA wurde mit der von GDNF und Neurturin verglichen, und es wurde befunden, dass sie ungefähr 40% homolog zu jedem dieser Proteine ist. Wichtigerweise waren die charakteristischen Abstände der Cystein-Reste in den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie anwesend. Darüber hinaus war zusätzlich zu dem Ähnlichkeitsbereich, welcher durch die zur Isolierung von Persephin verwendeten degenerierten Primer kodiert wird, ein weiterer Bereich hoher Homologie, welcher von GDNF und Neurturin geteilt wird, allerdings den anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie abwesend ist, ebenso anwesend in Persephin.
(Aminosäurenummerierung verwendet den ersten Cys-Rest als Aminosäure 1).
Mit der Bestätigung, dass Persephin in der Tat ein neues Mitglied der GDNF/Neurturin-Subfamilie ist, isolierten wir murine Genomklone von Persephin, um zu sätzliche Sequenzinformation zu erhalten. Die Primer (vorwärts, M2026; 5'-TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT, SEQ ID NO: 96 und rückwärts, M3028; 5'-TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA, SEQ ID NO: 101), welche der Ratten-cDNA-Sequenz entsprechen, wurden in einer PCR-Reaktion verwendet (PCR-Parameter: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden für 35 Zyklen), um ein 155 nt-Fragment aus Maus-Genom-DNA zu amplifizieren, welches zu der Ratten-Persephin-cDNA-Sequenz homolog war. Diese Primer wurden anschließend verwendet, um murine Persephin-Genom-Klone aus einer Maus-129/Sv-Bibliothek in einem P1-Bakteriophagen-Vektor zu erhalten (Library Screening Service von Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).
Restriktions-Fragmente (3,4 kb Nco I und ein 3,3 kb Bam H1) dieses P1-Klons, welcher das Persephin-Gen enthielt, wurden durch Hybridisierung mit einem 210 nt-Fragment identifiziert, welches durch PCR unter Verwendung von Maus-Genom-DNA mit Primern (vorwärts, M2026; SEQ ID NO: 96 und rückwärts, M3159; 5'-CCACCACAGCCACAAGCTGCGGSTGAGAGCTG, SEQ ID NO: 102) und den PCR-Parametern: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden für 35 Zyklen, erhalten wurde. Die Nco I- und Bam H1-Fragmente wurden sequenziert, und es wurde gefunden, dass sie einen Aminosäureabschnitt kodieren, welcher dem entspricht, der in dem Ratten-Persephin-RACE-Produkt vorlag, und welcher zu den reifen Abschnitten von sowohl Neurturin als auch GDNF homolog ist (11).
Wenn die Aminosäuresequenzen von Murin-GDNF, Neurturin und Persephin unter Verwendung des ersten Cysteins als Ausgangspunkt abgeglichen werden (was vorgenommen wird, weil Änderungen in den Spaltungsstellen zwischen den Familienmitgliedern eine Variabilität in den Segmenten oberhalb des ersten Cysteins bilden), ist Persephin (91 Aminosäuren) etwas kleiner als sowohl Neurturin (95 Aminosäuren) als auch GDNF (94 Aminosäuren). Die Gesamtidentität innerhalb dieses Bereichs beträgt ungefähr 50% mit Neurturin und etwa 40% mit GDNF (12).
Ein weiteres Nucleotid-Sequenzieren des murinen Persephin-Nco I-Fragments ergab die Nucleotid-Sequenz des gesamten Murin-Persephin-Gens (SEQ ID NO: 131; 17). Ein offener Leserahmen erstreckt sich von der Sequenz, welche für ein Initiator-Methionin kodiert, bis zu einem Stopkodon an den Positionen 244–246. Jedoch ist irgendwo in dieser Sequenz eine scheinbare Anomalie, sodass die Sequenz, welche die RXXR-Spaltungsstelle (Nucleotide an den Positionen 257–268) kodiert, und die Sequenz, welche das reife Perspephin-Protein (Positionen 269–556) kodiert, nicht mit diesem offenen Leserahmen co-linear sind. Anstelle dessen kodiert ein zweiter Leserahmen die Spaltungsstelle und das reife Persephin. Die zwei überzeugenden Leserahmen sind in 17 gezeigt.
Ein zusätzliches Sequenzieren des Ratten-Persephins wurde ebenso durchgeführt. Ratten-Genom-Fragmente wurden durch PCR unter Verwendung von Klentaq und Ratten-Genom-DNA als ein Templat amplifiziert. Der Vorwärts-Primer #40266 (5'-AATCCCCAGGACAGGCAGGGAAT; SEQ ID NO: 137), entsprechend einem Abschnitt oberhalb des Maus-Persephin-Gens, und ein Rückwärts-Primer M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138), entsprechend einem Abschnitt innerhalb der reifen Ratten-Persephin-Sequenz, wurden mit den folgenden Parametern verwendet (95°C für 15 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden, 68°C für 45 Sekunden × 30 Zyklen). Das amplifizierte Produkt wurde einer T4-Polynucleotid-Kinase unterzogen, die Enden wurden mit E. Coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) abgeschlossen (gebluntet) und in BSKS-Plasmid kloniert.
Das Nucleotid-Sequenzieren wurde durchgeführt, um die Sequenz des gesamten Ratten-Persephin-Gens aufzufinden (SEQ ID NO: 134; 18). Ein offener Leserahmen wurde als von einer Sequenz, welche für ein Initiator-Methionin kodiert, bis zu einem Stop-Kodon an den Positionen 244–246 erstreckend gefunden, wie es bei Murin-Persephin der Fall war. Wie ebenso bei Murin-Persephin wurde eine auftretende Anomalie zwischen der Sequenz, welche das Initiator-Methionin kodiert, und der die Spaltungsstelle für das reife Ratten-Persephin kodierenden gefunden, sodass zwei überzeugende Leserahmen existieren, wie in 18 angegeben. Unabhängig von dieser Anomalie exprimieren Säugerzellen Persephin von entweder der Murin- oder Ratten-Genom-Sequenz in voller Länge, wie nachstehend angegeben ist.
Beispiel 13
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung eines bakteriellen Expressionsvektors für murines Persephin und dessen Einführen in E. Coli zur Exprimierung von rekombinatem reifen Persephin.
Das Persephin-Polynucleotid, welches das reife Murin-Persephin-Protein kodiert, das fünf Aminosäuren oberhalb des ersten Gerüst-Cys-Restes beginnt (SEQ ID NO: 80) wurde in den pET-Expressionsvektor pET-30a an den Nde I- und Bgl II-Stellen geklont. Dieses Persephin-Polynucleotid wurde durch PCR unter Verwendung des Murin-Persephin-P1-Genom-Klons als ein Templat gebildet. Ein Vorwärts-Primer M3157 (5'-GGACTATCATATGGCCCACCACCACCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGGCCTTGGCTGGTTCATGCCGA, SEQ ID NO: 139), welcher eine Nde I-Stelle, acht Histidin-Reste und eine Enterokinase-Stelle kodiert, und ein Rückwärts-Primer M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO; 138), welcher der Sequenz entspricht, welche die letzten drei Aminosäurereste der reifen Persephinsequenz, das Stopkodon und eine Bgl II-Stelle kodiert, wurden verwendet. Die PCR-Reaktionsbedingungen betrugen 95°C für 15 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden, 68°C für 60 Sekunden × 25 Zyklen. Dieses PCR-Produkt wurde an der EcoRV-Stelle des BSKS-Plasmids subkloniert und sequenziert, um zu verifizieren, dass es keine Mutationen aufwies. Die Persephin-Sequenz wurde anschließend aus diesem Vektor ausgeschnitten unter Verwendung von Nde I und Bgl II und in die Nde I-(5') und Bgl II-(3')-Stellen des bakteriellen Expressionsvektors pET-30a (Novalgen, Madison, WI) kloniert. Dieser Expressionsfaktor würde daher die reife Form des Persephin-Proteins bilden, welches einen Amino-terminalen Marker aufweist, bestehend aus acht Histidin-Resten, gefolgt direkt von einer Enterokinase-Stelle.
Das Plasmid wurde in den E. Coli-Stamm BL21 (DE3) eingefügt. Um Persephin zu bilden, wurden dieses Plasmid enthaltende Bakterien 16 Stunden lang gezüchtet, geerntet und unter Verwendung von 6 M Guanidin-HCl, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris bei pH 8,0 lysiert, und rekombinantes Persephin-Protein wurde aus diesen Lysaten via Chromatographie über einem Ni-NTA-Harz (Qiagen) gereinigt. Das Protein wurde unter Verwendung von drei Säulenvolumina Puffer E, enthaltend 8 M Harnstoff, 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris, bei pH 4,5 eluiert. Das Persephin wurde anschließend durch Dialyse in einem Renaturierungspuffer, bestehend aus 0,1 M NaH₂PO₄, 0,01 M Tris bei pH 8,3, 0,15 M NaCl, 3 mM Cystein, 0,02% Tween-20, 10% Glycerin und enthaltend abnehmende Konzentrationen an Harnstoff, beginnend mit 4 M für 16 Stunden, gefolgt von 2 M für 16 Stunden, 1 M für 72 Stunden und 0,5 M für 16 Stunden, renaturiert. Die Persephinkonzentration wurde anschließend unter Verwendung eines Dot Metric-Assays (Geno Technology, St. Louis, MO) bestimmt und bei 4°C gelagert.
Dieses bakteriell gebildete rekombinante Persephin wurde als ein Immunogen in Hasen zur Bildung von Antikörpern gegenüber reifem Persephin verwendet. Sämtliche der immunogenen Injektionen und Blutentnahmen wurden bei Cal Tag Inc. (Healdsburg, CA) durchgeführt. Es zeigt sich, dass das Anti-Persephin-Antiserum spezifisch Persephin erkennt, allerdings nicht Neurturin oder GDNF, unter Verwendung der Protein-Blot-Analyse. Dieses Persephin-spezifische Antiserum wurde anschließend zur Detektion von Persephin in Lysaten, welche aus transfizierten COS-Zellen gebildet wurden, verwendet.
Beispiel 14
Dieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Säuger-Expressions-Vektoren, welche Murin- oder Ratten-Persephin-Gene enthalten, sowie deren Einfügen in Säugerzelllinien zur Herstellung von reifem Persephin. Um das Murin-Plasmid zu bilden, wurde ein P1-Klon, enthaltend das Murin-Persephin-Gen, als ein Templat in einem PCR-Assay verwendet. Primer wurden derartig entworfen, dass das resultierende Polynucleotid das Persephin-Gen enthält, welches sich von dem Initiator-Methionin-Kodon zu dem Stoppkodon 3' zu der reifen Persephin-Kodierungs-Sequenz (SEQ ID NO: 131) erstreckt. Die PCR-Reaktion verwendete einen Vorwärts-Primer M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ ID NO: 140) und Rückwärts-Primer M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138). Um das analoge Ratten-Plasmid zu bilden, wurde Ratten-Genom-DNA als ein Templat in einem PCR-Assay verwendet. Die PCR-Reaktion verwendete einen Vorwärts-Primer M3175 (5'-TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ ID NO: 140) und Rückwärts-Primer M3156 (5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO: 138). Beide PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Klentaq und den folgenden Parametern durchgeführt: 95°C für 15 Sekunden, 55°C für 15 Sekunden, 68°C für 45 Sekunden × 25 Zyklen. Die amplifizierten Produkte wurden einer T4-Polynucleotid-Kinase unterzogen, die Enden wurden mit E. Coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geblunted und in das BSKS-Plasmid kloniert. Ein Nucleotid-Sequenzieren wurde durchgeführt, um zu verifizieren, dass der korrekte Klon erhalten wurde. Die Ratten- und Murin-Persephin-Polynucleotide wurden unter Verwendung von Sma I und Hind III ausgeschnitten, und jedes wurde in eine Asp718- (gebluntet) und Hind-III-Stelle des Säugerexpressionsvektors pCB6 kloniert.
COS-Affenzellen wurde mit entweder den Ratten- oder Murin-Persephin-Expressionsvektoren (16 μg pro 5 × 10⁵ Zellen) oder dem nicht rekombinanten Vektor (pCB6) selbst transfiziert, wobei das Calciumphosphat-Ausfällungsverfahren (Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752, 1987) verwendet wurde. 48 Stunden später wurden die Zellen in IP-Puffer, enthaltend 50 mM Tris bei pH 7,5, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% Deoxycholat, 10 mM EDTA, 0,1% SDS, 5 μg/ml Leupeptin, 7 μg/ml Pepstatin und 250 μm PMSF, lysiert. Die Proben wurden auf ein 15%-iges SDS-Polyacrylamid-Gel geladen, und die Proteine wurden durch Elektrophorese aufgetrennt. Die Proteine wurden anschließend in Nitrocellulose durch Elektroblotting transferiert. Diese Nitrocellulose-Membran wurde mit Anti-Persephin-Antikörpern inkubiert, um die Anwesenheit von Persephin in den Lysaten zu detektieren.
Wie in 19 gezeigt ist, enthalten Lysate aus Zellen, welche mit entweder dem Ratten- oder Murin-Persephin-Expressionsvektor transfiziert wurden, allerdings nicht die Lysate aus mit pCB6 transfizierten Zellen, hohe Mengen an Persephin. Die Größe des detektierten Persephins betrug ungefähr 14 kD, was mit der für das prozessierte, d. h. die reife Form von Persephin vorausgesagte Größe, konsistent ist. Dieses zeigt, dass sowohl die Murin- als auch Ratten-Persephin-Gene zur Führung der Synthese eines angemessen prozessierten Persephin-Moleküls in der Lage sind.
Beispiel 15
Das folgende Beispiel verdeutlicht die Verfahren, welche zur Isolierung und Identifizierung von menschlichem Persephin verwendet werden können.
Die Identifizierung von Murin- und Ratten-Persephin-Sequenzen erlaubt uns nun die Identifizierung und Isolierung des menschlichen Persephin-Gens. Aufgrund des hohen Erhalts bzw. einer hohen Konservierung zwischen Human- und Nager-GDNF (ungefähr 95% Identität) und zwischen Human- und Nager-Neurturin (ungefähr 90% Identität) wird angenommen, dass eine ähnlich enge Verwandtschaft (d. h. größer als 85% Identität) zwischen Nager- und Human-Persephin vorliegt.
Unterschiedliche Strategien können verwendet werden, um das Human-Persephin-Gen zu erhalten. In einer bevorzugten Strategie werden Human-Genom- und cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung an die Murin- und/oder Ratten-Persephin-Sequenzen gescreent, welche hierin identifiziert wurden (SEQ ID NOS: 79–83), oder Teile dieser Sequenzen. Diese DNA-Sequenzen oder Sonden werden wie oben beschriebenen beispielsweise mit 32P-dCTP unter Verwendung entweder von Random Priming oder Polynucleotid-Kinase gelabelt. Die Hybridisierungsbedingungen sind wie oben beschrieben, und unterschiedlich stringente Hybridisierungsbedingungen werden verwendet. Die Striktheit der Hybridisierung wird durch eine Vielzahl von Faktoren während der Hybridisierung und während des Waschverfahrens bestimmt, einschließlich der Temperatur, der Ionenstärke, der Länge der Zeit und Konzentration an Formamid. Diese Faktoren sind beispielsweise in Sambrook et al. supra, dargestellt.
In einer alternativen bevorzugten Strategie werden Primer, welche den Abschnitten der Ratten- oder der Murin-Persephin-Nucleotid-Sequenz (oder Derivaten davon) entsprechen, in einer PCR-Reaktion unter Verwendung entweder von Human-Genom-DNA oder cDNA, revers transkribiert aus RNA, isoliert aus Humangewebe, eingesetzt. Als ein Beispiel können der Vorwärts-Primer M2026 (SEQ ID NO: 96) und Rückwärts-Primer M3028 (SEQ ID NO: 101) in einer PCR-Reaktion unter Verwendung verschiedener Bedingungen, wie sie oben beschrieben wurden, und von DNA-Templaten zur Amplifizierung eines Human-Persephin-Fragments verwendet werden. Primer, welche solch ein Fragment amplifizieren, wie es durch Nucleotid-Sequenzierung des Fragments bestätigt wird, werden anschließend zum Erhalt von Human-Persephin-Klonen verwendet. Die Klone werden mittels deren Bildung desselben amplifizierten Fragments nach der PCR mit den ausgewählten Primern in einer Human-Genom-Bibliothek in einem P1-Bakteriophagen-Vektor identifiziert (Library Screening Service von Genome Systems, Inc., St. Louis, MO).
Nach dem Erhalt von positiven Klonen durch eines der oben beschriebenen Verfahren werden diese Human-Persephin-Klone isoliert, und Fragmente werden in Bluescript KS-Plasmide subkloniert und sequenziert. Das Nucleotid-Sequenzieren wird unter Verwendung der Fluoreszenz-Farbstoff-Terminator-Technologie auf einem automatischen Sequenzierer von Applied Biosystems, Model #373 (Applied Biosys tems, Foster City, CA), gemäß den Herstellerangaben durchgeführt. Plasmid-DNA zur Sequenzierung wird unter Verwendung des Wizard Miniprep Kits (Promega Corp., Madison, WI) gemäß den Herstellerangaben hergestellt. Die Sequenzen dieser Humanfragmente, welche zu den Ratten- und Murin-Persephin-Sequenzen ortholog sind, werden anschließend identifiziert, und die Nucleotidsequenz des menschlichen Persephins wird aus den Sequenzen dieser Fragmente in voller Länge festgelegt.
Beispiel 16
sDieses Beispiel verdeutlicht die Herstellung von Chimären- oder Hybrid-Polypeptid-Molekülen, welche von Persephin abgeleitete Abschnitte (PSP) und von Neurturin abgeleitete Abschnitte (NTN) enthalten.
Als eng verwandte Mitglieder der TGF-β-Familie wird vorausgesagt, dass sowohl Persephin als auch Neurturin eine äußerst ähnliche Gesamtstruktur aufweisen, auch wenn Neurturin das Überleben von sympathischen Neuronen fördert, während das eng verwandte Persephin dieses nicht tut. Zwei Chimären wurden durch im Wesentlichen Ersetzen der Abschnitte von Persephin durch Neurturin hergestellt, wobei der Kreuzpunkt zwischen den zwei benachbarten hochbewahrten dritten und vierten Cystein-Resten lag. Die erste Chimäre, genannt PSP/NTN (SEQ ID NO: 141, 20), enthält die ersten 63 Reste des reifen Murin-Persephins, kombiniert mit den Resten 68 bis 100 des reifen Murin-Neurturins (unter Verwendung von E. Coli-bevorzugten Kodons). Um dieses Molekül zu bilden, wurden zwei PCR-Reaktionen durchgeführt: 1) unter Verwendung des Vorwärts-Primers M2012 (5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAA, SEQ ID NO: 142) und des Rückwärts-Primers M2188 (5'-TCGTCTTCGTAAGCAGTCGGACGGCAGCAGGGTCGGCAATGGGCTCGAC, SEQ ID NO: 143) und dem pET30a-Murin-Persephin-Plasmid als Templat (siehe Beispiel 13); und 2) unter Verwendung des Vorwärts-Primers M2190 (5'-TGCTGCCGTCCGACTGCTTACGAAGACGA, SEQ ID NO: 144) und des Rückwärts-Primers 2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT, SEQ ID NO: 145) und dem pET30a-Murin-(E. Coli-bevorzugte Kodons)Neurturin-Plasmid als Templat (siehe Beispiel 6). Beide PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden × 25 Zyklen. Die Produkte dieser zwei PCR-Reaktionen wurden gelgereinigt, zusammen vermischt, und eine PCR-Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 20 Minuten, 68°C für 5 Minuten. Nach 8 Zyklen wurde ein Aliquot dieser Reaktion als Templat in einer dritten PCR-Reaktion unter Verwendung des Vorwärts-Primers M2012 und des Rückwärts-Primers M2186 unter den folgenden Bedingungen verwendet: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden × 25 Zyklen. Das resultierende Produkt wurde einer T4-Polynucleotid-Kinase unterzogen, die Enden wurden mit E. Coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) geblunted und in BSKS-Plasmid kloniert. Ein Nucleotid-Sequenzieren wurde durchgeführt, um zu verifizieren, dass der korrekte Klon erhalten wurde. Das PSP/NTN-Fragment wurde unter Verwendung von Nde I und Bam H1 ausgeschnitten und in die korrespondierenden Stellen des Bakterien-Expressionsvektors pET30a kloniert.
Das zweite Chimäre, genannt NTN/PSP (SEQ ID NO: 146, 20), kodiert das entgegengesetzte Molekül. Es enthält die ersten 67 Reste des reifen Murin-Neurturins (unter Verwendung von E. Coli-bevorzugten Kodons), kombiniert mit den Resten 64 bis 96 von reifem Murin-Persephin. Um dieses Molekül herzustellen, wurden die folgenden PCR-Reaktionen durchgeführt: 1) unter Verwendung des Vorwärts-Primers M2012 und des Rückwärts-Primers M2183 (5'-CACTCAGCATAGCTGGTGGGCTGGCAGCACGGGTGAGCACGAGCACGTT, SEQ ID NO: 147) und des pET30a-Murin-(E. Coli-bevorzugte Kodons)Neurturin-Plasmids als Templat; und 2) unter Verwendung des Vorwärts-Primers M2187 (5'-TGCTGCCAGCCCACCAGCTATGCTG, SEQ ID NO: 148) und des Rückwärts-Primers M2186 (5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT, SEQ ID NO: 145) und des pET30a-Murin-Persephin-Plasmids als Templat. Beide PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden, 72°C für 30 Sekunden × 25 Zyklen. Die Produkte dieser zwei PCR-Reaktionen wurden zum Aufbau des finalen NTN/PSP-pET30a-Plasmids, wie oben im Detail für PSP/NTN beschrieben, verwendet, außer dass Bgl II anstelle von Bam H1 verwendet wurde. Diese chimären Proteine wurden in E. Coli hergestellt und durch Ni-NTA-Chromatographie gereinigt, wie es oben beschrieben wurde (Beispiel 13).
Die gereinigten Proteine wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, dass Überleben in dem SCG-Assay sympathischer Neuronen zu fördern. Das NTN/PSP-Protein förderte nicht das Überleben, wohingegen das PSP/NTN-Protein das Überleben von symphatischen Neuronen ähnlich dem, welches für Neurturin selbst beobachtet wurde, förderte. Diese Ergebnisse zeigen, dass Neurturin-Reste, welche unterhalb der zwei benachbarten hochkonservierten Cystein-Reste liegen, für die Wirksamkeit in der Förderung des Überlebens in SCG-sympathischen Neuronen kritisch sind. Im Gegensatz dazu sind die entsprechenden Reste von Persephin nicht ausreichend zur Förderung des Überlebens in sympathischen Neuronen.
Beispiel 17
Dieses Beispiel verdeutlicht die neuronale überlebensfördernde Wirkung von Persephin in Mittelhirnzellen.
Das Profil der überlebensfördernden Wirkung von Persephin unterscheidet sich von dem von Neurturin und GDNF. Im Gegensatz zur durch Neurturin und GDNF in sympathischen und Sensorneuronen gebildeten überlebensfördernden Wirkung zeig te Persephin keine überlebensfördernde Wirkung in diesen Geweben. Wir haben weiterhin die neuronale überlebensfördernde Wirkung von Persephin in Mittelhirnzellen untersucht.
Getimed-schwangere Sprague-Dawley-Ratten wurden von Harlan Sprague-Dawley gekauft. Das Mittelhirn wurde den Ratten entnommen und maß 1,2 bis 1,4 cm in der Länge, wobei als Zeit der embryonale Tag 14 datiert wurde. Die Schädeldecke wurde entfernt, und das gesamte Mittelhirn wurde in kalte L15 gegeben. Das gepoolte Mittelhirngewebe wurde in einem serumfreien Medium, bestehend aus DME/Hams F12 (#11330-032, Life Technologies), 1 mg/ml BSA, Fraktion V (A-6793, Sigma Chemical Co.,), 5 μM Insulin (I-5500, Sigma), 10 nM Progesteron (P0130, Sigma), 100 μM Putrescin, (p7505, Sigma), 30 nM Selen (SO7150, Pflatz & Bauer), 10 ng/ml Ratten-Transferrin (012-000-050, Jackson Chrompure), 100 U/M1 Penizillin und 100 U/ml Streptomycin, resuspendiert. Die gepoolten Mittelhirngewebe wurden ungefähr 80 mal unter Verwendung einer Pipette mit gebogener Spitze (Bent-Tip) trituriert, und die Zellen wurden auf eine 24-Well-Platte (CoStar) in einer Dichte von 15.000 Zellen in einem 100 μl Tropfen platiert. Diese Platten wurden mit 125 ng/ml Poly-d-Lysin (p-7280, Sigma) und 25 ng/ml Laminin (#40232, Collaborative Biomedical Products) beschichtet. Diese dissoziierten bzw. getrennten Zellen ließ man 2 Stunden bei 37°C in 5% CO₂ anhaften und fütterte sie anschließend mit weiteren 500 μl des obengenannten serumfreien Mediums mit oder ohne ungefähr 100 ng/ml rekombinantes Persephin. Diese Zellen wurden nach 3 Tagen Kultivierung fotografiert.
Die Inspizierung der Zellen über den Verlauf von 3 Tagen der Kultivierung zeigte eine graduelle Abnahme der Zellanzahl. In der Abwesenheit jeglichen Wachstumsfaktors waren annähernd alle Zellen tot (21A). In Anwesenheit von Persephin war ein starker Anstieg des Überlebens von Mittelhirn-Neuronalzellen ersichtlicht (21B).
Beispiel 18
Dieses Beispiel verdeutlicht die Expression von Persephin in verschiedenen Geweben.
Eine Studie zur Persephin-Expression wurde in erwachsenen Mausgeweben unter Verwendung von semiquantitativer RT/PCR (siehe Beispiel 9) durchgeführt. Poly-A-RNA wurde aus dem Hirn, dem Kleinhirn, der Niere, der Lunge, dem Herz, den Eierstöcken, dem Ischiasnerv, den Rückenwirbelganglien, dem Blut und der Milz isoliert. Diese wurde anschließend unter Bildung von cDNA revers transkribiert (siehe Kotzbauer et al., Nature 384: 467–470, 1996). Die verwendeten PCR-Primer waren wie folgt: Vorwärts-Primer: 5'-CCTCGGAGGAGAAGGTCATCTTC (SEQ ID NO: 149) und Rückwärts-Primer: 5'-TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA (SEQ ID NO: 101). Die PCR wurde 26 Zyklen lang mit einer Anneal-Temperatur von 60°C durchgeführt. Um die Anwesenheit von Genom-DNA zu regulieren bzw. kontrollieren, wurden RNA-Proben, welche nicht revers transkribiert wurden, für die PCR verwendet (beispielsweise wird die in 22 gezeigte Gewebekontrolle "Kidney no RT" bezeichnet). Es wurde gefunden, dass sämtliche der Proben ohne Genom-DNA-Kontamination vorlagen.
Wie in 22 gezeigt ist, wurde ein Band der richtigen Größe (160 bp) in der Nierenprobe entdeckt. Bei höheren Zyklenanzahlen wurde ebenso ein Persephinband in dem Gehirn beobachtet. Folglich unterscheidet sich die Verteilung der Expression von Persephin in verschiedenen Mausgeweben von denen von Neurturin in der Ratte (Beispiel 8).
Hinterlegung des Stamms. Der folgende Stamm wird unter dem Budapester Abkommen bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD hinterlegt. Das angegebene Aktenzeichen wurde nach erfolgreichem Lebensfähigkeitstest zugeordnet, und die erforderlichen Gebühren wurden bezahlt. Sollte eine Kultur nicht überlebensfähig werden oder unwiderruflich zerstört werden oder, im Fall von Plasmid-enthaltenden Stämmen, bei Verlust des Plasmids, wird sie durch eine lebensfähige Kultur ersetzt werden.
Sequenzliste

Claims

Isoliertes und gereinigtes Polypeptid, das eine Sequenz von 89 angrenzenden Aminosäuren umfasst, wobei die Sequenz Aminosäuren mit den in Klammern angegebenen Positionen aufweist: Cys (1), Leu (3), Val (10), Leu (13), Gly (14), Leu (15), Gly (16), Tyr (17), Glu (21), Phe (25), Arg (26), Tyr (27), Cys (28), Gly (30), Cys (32), Leu (44), Leu (47), Cys (58), Cys (59), Pro (61), Asp (66), Phe (69), Leu (70), Asp (71), Ser (83), Ala (84), Cys (87) und Cys (89), wobei diese Positionen durch Ausrichtung mit der Sequenz SEQ ID NO: 79 oder SEQ ID NO: 82 identifiziert werden, wobei diese Sequenz wenigstens 85%ige Identität mit SEQ ID NO:79 oder SEQ ID NO:82 aufweist.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1, bei dem das Polypeptid das Überleben von Mittelhirnzellen begünstigt.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 oder SEQ ID NO:83 umfasst.
Isoliertes und gereinigtes Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche das Polypeptid nach einem der Ansprüche 1–4 codiert.
Vektor, der ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst, das seinerseits die Expression regulierende Elemente umfasst, die mit einer Nucleinsäure nach Anspruch 5 operabel verknüpft sind.
Isolierte Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 6 transformiert ist.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei diese eine Säugerzelle, eine Bakterienzelle oder ein Baculovirus-Expressionssystem darstellt.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA, das a) die Subklonierung eines Polynucleotids, das eine, ein Polypeptid codierende DNA-Sequenz, wie in Anspruch 1 definiert, umfasst, in einen Expressionsvektor, der die für die Expression der DNA-Sequenz erforderlichen regulatorischen Elemente umfasst, b) die Transformation einer Wirtszelle mit diesem Expressionsvektor, c) die Züchtung der Wirtszelle in einer Wirtszellenkultur und d) das Ernten des Polypeptids und/oder der Polynucleotid-DNA aus der Wirtszellenkultur umfasst.
Isolierte und gereinigte Antikörper, die zur spezifischen Reaktion mit einem Polypeptid, wie es in Anspruch 1 definiert wird, oder einem Epitop davon geeignet sind.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder eines DNA-Moleküls, welches das Polypeptid codiert, zur Herstellung eines Medikaments für die Verwendung bei einem Verfahren zur Verhütung oder Behandlung von Zell degenerationen oder -insuffizienz, wobei die Zelldegeneration oder -insuffizienz eine neuronale Degeneration ist, die verursacht wird durch Bedingungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus peripherer Neuropathie, amyotropher Lateralsklerose, Alzheimer-Krankheit, Parkinsonismus, Huntington-Chorea, ischämischem Infarkt, akuter Hirnverletzung, akuter Rückenmarksverletzung, Tumoren des Nervensystems, Multipler Sklerose und Infektionen.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe aus einem Patienten, welches die Reaktion von Antikörpern nach Anspruch 10 mit einem in der Probe vorliegenden Wachstumsfaktor und den Nachweis der Bindung der Antikörper an den Wachstumsfaktor umfasst.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit eines Wachstumsfaktors in einer Probe aus einem Patienten, welches den Nachweis und/oder die Quantifizierung der Anwesenheit von mRNA, die ein Polypeptid, wie es in einem der Ansprüche 1–4 definiert wird, codiert, in einer Probe umfassen.
Verfahren zur Beschleunigung des Wachstums und/oder der Differenzierung einer Zelle in einem Züchtungsmedium, welches die Zugabe eines Polypeptids, wie es in einem der Ansprüche 1–4 definiert wird, zum Züchtungsmedium umfasst.