JP2001516764A - ペルセフィン及び関連成長因子 - Google Patents

ペルセフィン及び関連成長因子

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Abstract

(57)【要約】 成長因子のＧＤＮＦ／ニュールツリンファミリーに属する新規の成長因子、ペルセフィンが開示される。ヒト、マウス及びラットのアミノ酸配列が同定された。ヒト、マウス及びラットのペルセフィンゲノムＤＮＡ配列は、クローン化され、配列決定され、夫々のｃＤＮＡ配列が同定された。また、ペルセフィンを使用して変性病状を治療する方法、ペルセフィン遺伝子変質を検出する方法、患者のペルセフィンレベルを検出、監視する方法が提供される。成長因子のペルセフィン−ニュールツリン−ＧＤＮＦファミリーの更なるメンバーを確認する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、概して栄養因子又は成長因子に関し、より詳細には、成長因子のニ
ュールツリン(neurturin) ‐ＧＤＮＦファミリーの新しい成長因子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
複合有機体における組織の発生及び維持には細胞の増殖、分化、生存及び機能
の過程で精密な管理を必要とする。これらの過程を管理する主要なメカニズムは
、「成長因子」として知られるポリペプチドの作用に依存している。これらの構
造的に多様な分子は、特定の細胞表面レセプタを介してこのような作用をもたら
す。
【０００３】 「神経栄養因子」と称される成長因子はニューロンの分化、成長及び生存を促
進し、神経系又は神経刺激組織の中に存在する。神経成長因子（ＮＧＦ）は最初
に認識と性格定義が行われた神経栄養因子である（参照として組み込まれるLevi
-Montalcini 外, J.Exp.Zool. 116:321, 1951)。ＮＧＦは交感神経ニューロン、
神経堤由来知覚ニューロン及び基底前脳コリン性ニューロンの生存及び成長を促
進する非共有結合ホモダイマーとして存在する。交感神経ニューロンの中で、こ
の物質は生体外ではニューライトの発芽後成長を生じさせ、生体内では増加され
た軸策及び樹状突起の成長を生じさせる（ここに参照として組み入れられるLevi
-Montalcini 及びBooker、Proc Nat'l Acad Sci 46; 1960:384-391；Johnson
外、Science 210:916-918,1980；Crowley 外、Cell 76:1001-12, 1994 を参照の
こと）。ＮＧＦは認知作用及びニューロンの可塑性に影響を与え、物理的、化学
的、ウイルス性及び免疫性といった多様な害によって損傷を受けたニューロンの
生存を促進しうる（参照として組み入れられるSnider及びJohnson 、Ann Neurol
26;489-506,1989；Hefti、J Neurobiol 25:1418-1418）。ＮＧＦはまた内分泌 系に対して、及び免疫及び炎症の過程において広く相互作用することが知られて
いる（参照として組み入れられるScully and Otten, Cell Biol Int 19:459-469
, 1995の観察; Otten and Gadient, Int. J. Devl Neurosci 13:147-151, 1995
）。例えば、ＮＧＦはマスト細胞の生存を促進する（参照として組み入れられる
Horigomeほか、 J Biol Chem 269:2695-2707, 1994）。
【０００４】 近年、成長因子はそれらのアミノ酸配列の近似性に基づいていくつかのクラス
、即ちファミリー又はスーパーファミリーに分類されることが明らかとなった。
これらのファミリーは、例えば繊維芽成長因子ファミリー、ニューロトロフィン
ファミリー及びトランスフォーミング成長因子ベータ（TGF −β）ファミリーで
ある。ファミリーメンバー配列の近似性の一例として、TGF −βファミリーのメ
ンバーはこのスーパーファミリーのメンバーを同定する７つのカノニカルフレー
ムワーク(canonical framework) システイン残基を有する。
【０００５】 ＮＧＦはかかる成長因子のファミリーの始原型である。このファミリーの２番
目に発見されたメンバーである脳由来神経栄養因子（BDNF）は、ＮＧＦモノマー
の３種の内部ジスルフィドを形成する６種のシステイン全ての保存によりNGF に
関連づけられることが示された（参照として組み入れられる(Barde, Prog Growt
h Factor Res 2:237-248, 1990及びLiebrock外、Nature 341:149-152,1989 参照
）。２つの因子の保存度の良い部分のBDNFによって提供される情報を利用するこ
とにより、このニューロトロフィンファミリーの更なるメンバー（NT-3,NT-4/5
）は幾つかのグループによって迅速に見出された（参照として組み入れられる(K
lein, FASEB J 8:738-44, 1994 ）。
【０００６】 最近、NGFに構造的に関連しない神経栄養因子が同定された。これらは繊毛神 経栄養因子（CNTF）といった「神経栄養性作用」に基づいて最初に分離された因
子（参照として組み入れられるLin 外、Science 246:1023-5,1989 ）と、非ニュ
ーロン活性の結果として最初に分離された他の因子（例えば、繊維芽細胞成長因
子（参照として組み入れられるCheng 及びMattson 、Neuron 1:1031-41 ）、IG
F-I （参照として組み入れられるKenje 外、Brain Res 486 :396-398,1989 ）及
び白血病阻止因子（参照として組み入れられるKotzbauer 外、Neuron 12:763-77
3,1994））とを含む。
【０００７】 グリア誘導神経栄養因子（GDNF）は、NGF とは構造的に関連しないこうした神
経栄養因子の１つである。従って、GDNFはこれまで何れの因子のサブファミリー
のメンバーであるかが知られていなかったユニークな因子であった。GDNFの発見
、精製及びクローニングは、パーキンソン病で変性する中脳ドーパミン作動性ニ
ューロンの生存に対して決定的な因子を調査した結果実現した。GDNFはラットB4
9 グリア細胞で調製された培地から精製された（参照として組み入れられる(Lin
ほか、Science 260:1130-2, 1993参照）。配列分析によって、GDNFは、TGF −β
スーパーファミリーの遠いメンバーであり、約20% の共通性の根拠は主として７
つのカノニカルフレームワークシステイン残基の特徴的なアラインメントに求め
られることが明らかとなっている（参照として組み入れられる(Linほか、Scienc
e 260:1130-2, 1993）。従って、GDNFはTGF −βスーパーファミリーの中の新し
いサブファミリーを表わしていると考えられる。バクテリアの中で生成された組
換えGDNFは、特にドーパミン作動性ニューロン（(Linほか、Science 260:1130-2
, 1993；Tomac 外、Nature 373:335-9,1995 ；Beck 外、Nature 373:339-41,19
95；Ebendal 外、J Nuerosci Res 40:276-84,1995）及び運動ニューロン（Hend
erson 外、Science 226:1062-4,1994 ；Yan 外、Nature 37 3:341-4,1995；Oppe
nheim 外、Nature 373:344-6,1995参照）の生存及び形態的分化を促進する。総
体的に、GDNFは他の因子に比べて運動ニューロンの生存を促進するより強力な因
子であり、これらの病変に応ずるニューロン萎縮を防ぎ、よって運動ニューロン
疾患の有望な治療物質として位置づける唯一の因子であった。
【０００８】 現在は概して神経栄養因子は胎児の生存及び発達並びに成人期における構造的
な完全性及び可塑性を含むニューロン機能の他の面を調節すると信じられている
。慢性神経変性疾患と同様急性神経系傷害は組織破壊及び恐らく疾患由来のアポ
プトシスによって特徴付けられるため、神経栄養因子がこれらの病気において何
らかの役割を果たすと信じられている。実際、かなりの証拠によって、神経栄養
因子が、現在人間社会を悩ませている社会的及び経済的に最も有害な疾患である
これらの神経変性症状の処置に有効な治療物質でありうる可能性が示唆されてい
る。それでもなお、多様な神経栄養因子は選択的に異なるレセプターを介し、各
種のニューロン又は非ニューロン細胞タイプに対して潜在的に作用しうるため、
神経系の各種の急性及び慢性疾患の診断及び治療に使用される神経栄養因子ファ
ミリーの新しいメンバーを同定することが引き続き必要とされている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上述の点に鑑みてなされたものであり、本発明はニューロン及び非ニ
ューロン細胞の生存及び成長を促進する実質的に精製された因子の識別及び分離
を目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
発明者は、本願中のGDNFを最初に知られたメンバーとする成長因子のファミリ
ーに属する新しいタンパク成長因子を発見することに成功した。この新しく発見
されたファミリーメンバーの最初のメンバーはニュールツリンであり、これは係
属中の特許出願第０８／５１９，７７７号の主題である。GDNFの配列及びニュー
ルツリンに基づき、発明者はここにペルセフィン（persephin：PSP）と称される
成長因子のGDNF−ニュールツリンファミリーの他のメンバーを発見した。この成
長因子は異なる哺乳類からの相同配列間では少なくとも７５％の配列同一性を示
すのに対し、鳥類といった非哺乳類では配列同一性は６５％と低いと考えられて
いる。実際に、マウス、ラット及びヒトの成熟ペルセフィン配列は約８０％乃至
約９４％の配列同一性を示す。本願で確認された成熟ペルセフィンタンパク質は
、配列番号(SEQ ID NO)７９及び１８７（図１７Ｂには、それぞれ６６乃至１５ ４及び６１乃至１５６のアミノ酸を示す。）で記述されるマウスの配列と、配列
番号(SEQ ID NO)８２及び１９６（図１８Ｂには、それぞれ６乃至９４及び１乃 至９６もアミノ酸を示す。）で記述されるラットの配列と、配列番号(SEQ ID NO
)２２１及び２２３（図２４には、アミノ酸６１‐１５６と６６‐１５４をそれ ぞれ示す。）で記述されるヒト配列とを含む。
【００１１】 ペルセフィンは本文中に発明者によって発見されたGDNF−ニュールツリンファ
ミリーの保存された領域に基づく方法によって識別され獲得された。よって、ポ
リメラーゼ連鎖反応過程で使用されるべきこれらの保存された領域の配列から構
築された縮重プライマーを使用する新しい方法が提案される。この方法を使用す
ることにより、新しいファミリーメンバー、即ちペルセフィンのマウス、ラット
及びヒトオーソログが識別され獲得された。
【００１２】 本発明はこのように、配列番号(SEQ ID NO)：７９、８２、１８７、１９６、 ２２１及び２２３のアミノ酸配列及び配列番号(SEQ ID NO)：１８３、１９３、 １９９及び２０１だけでなく、かかるヌクレオチド（配列番号(SEQ ID NO)：１ ８４、１９４、２００及び２０２）の補体のヌクレオチド配列を含むマウス、ラ
ット及びヒトのペルセフィンをコード化するアミノ酸配列及びヌクレオチド配列
の双方を提供する。加えて、本発明はプレ、プロ及びプレプロ領域だけでなく、
プレプロペルセフィンアミノ酸及びヌクレオチド配列をも含む。
【００１３】 ペルセフィンポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び安定に形質転換された
細胞は、本発明の範囲内にも入る。形質転換された細胞は、ペルセフィン生産用
の方法に利用される。
【００１４】 他の実施例では、本発明は、必要であれば患者に対して治療的に有効な量のペ
ルセフィンを投与する段階を含む細胞変性を防止又は処置する方法を提供する。
患者はまた、ペルセフィン若しくはペルセフィンをコード化するＤＮＡ配列を発
現する形質転換された細胞、又は、ペルセフィン中の成長によって培養され拡張
された細胞を患者の中に移植することによって処置されうる。
【００１５】 更に、本発明は、ペルセフィンを検出するための組成及び方法を提供する。１
つの方法はペルセフィン抗体に基づく方法であり、他の方法は組換えＤＮＡ技術
を使用してペルセフィンをコード化するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ
を検出することに基づく方法である。
【００１６】 更に別の実施例では、本発明はペルセフィン配列のセグメントと、ペルセフィ
ン以外の少なくとも一つの成長因子とを含むパン成長因子を包含する。更に、前
記パン成長因子をコード化するポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドと、
そのポリヌクレオチドを含む宿主細胞とを含むベクターをも包含する。
【００１７】 本発明によって達成される幾つかの利点のうち、特に注意すべき利点は、特に
ニューロンといったある細胞の萎縮、変性及び死滅を防ぐために使用される新し
い成長因子、即ちペルセフィンの呈示；ヒト配列が識別され獲得されうるマウス
又はラットのペルセフィンの特定配列を使用可能とすることによるヒトペルセフ
ィンの提供；他のファミリーメンバーを獲得することが可能な新しい方法を使用
可能にすることによる成長因子のニュールツリン−ペルセフィン−GDNFファミリ
ーの他のメンバーの提供；組換え技術によってペルセフィンを獲得する方法の提
供；細胞変性及び特にニューロン変性を生じさせる疾病を防止又は処置する方法
の提供；患者の中のペルセフィンレベルを検出及びモニターしうる方法の提供；
及びペルセフィン遺伝子中の変質を検出しうる方法の提供である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明は、新しい成長因子、即ちペルセフィンをコード化するDNA 分子の識別
、分離及び配列決定に基づいている。ペルセフィンは細胞生存、特に、神経細胞
の生存を促進する。本発明以前は、ペルセフィンは未知であり、別個の生物学的
物質として確認されておらず、また、純粋な形で分離されてもいなかった。
【００１９】 成長因子、ニュールツリン(NTN) は、本文に全体が参照として組み入れられる
、1995年8 月25日に出願された係属中の特許出願第08/519,777号の中に示される
ように識別され分離された。ニュールツリンの配列及び密接に関連する成長因子
、即ちグリア由来神経栄養因子（GDNF）の配列から、発明者は更なる関連因子を
見出す方法を案出し追求した。ニュールツリンはGDNFに対して約40% の同一性を
有するが、TGF −βスーパーファミリーの他のメンバーに対しては20% 以下の同
一性を有する。これらの２つのタンパクは両方でTGF−βスーパーファミリーの 中の新しいサブファミリーを定義する。ニュールツリン及びGDNFの中の幾つかの
配列領域は非常によく保存されていることが識別され、従ってこのサブファミリ
ーの追加的なメンバーの中にも存在すると考えられる。従って、この配列情報は
PCR 反応におけるプライマー又は雑種形成（ハイブリダイゼーション）研究にお
けるプローブのいずれかとして使用される縮重オリゴヌクレオチドを設計するこ
とによって、このサブファミリーのこれまで知られていなかったメンバーを分離
するのに使用されうる。
【００２０】 係属中の出願第08/519,777号の例１１に記載される新しい縮重プライマーPCR
方法を使用して、発明者はGDNF及びニュールツリンの両方に対して約40‐50%の 同一性を有する第３の因子、即ちペルセフィンを識別することに成功した。ニュ
ールツリン及びGDNFの保存された領域のアミノ酸配列に対応するプライマー（配
列番号(SEQ ID NＯ)：４２及び配列番号(SEQ ID NO)：４４）は、ラットゲノムD
NA から77nt断片を増幅するのに使用された。得られた生成物はブルースクリプ トKS(Bluescript KS) プラスミドにサブクローン化され、配列決定される。増幅
された生成物のうちの１つの配列は、GDNF及びニュールツリンのアミノ酸配列デ
ータとは異なるがGDNF及びニュールツリンに対し20% 以上の同一性を有するＰＣ
Ｒプライマーに内在するアミノ酸配列データであると予測され、一方獲得された
他の増幅された生成物の配列は、予期されるようにGDNF又はニュールツリンに対
応した。22ヌクレオチド配列（配列番号(SEQ ID ＮO)：９０は次にラットのGDNF
及びニュールツリン配列と一列に並べられ、ユニークであることが見出された。
この新しい配列は、本文中でペルセフィンと称される新しいファミリーメンバー
が識別されたことを示す。
【００２１】 追加的なペルセフィン配列情報を獲得するため、新生児ラット脳から獲得され
たｃＤＮＡを使用するｃＤＮＡ末端（RACE）技術（Frohman, M. A. Methods in
Enzymology 218:340-356 ,1993）の急速増幅において、増幅された断片のユニー
クな２２ヌクレオチド配列を含むプライマーが使用された。このPCR 反応から、
約３５０ヌクレオチド（配列番号(SEQ ID NO)：１０６）の部分的なラットペル セフィンｃＤＮＡ配列を構築する約３５０nt 断片が獲得された。このｃＤＮＡ の予測されたアミノ酸配列はGDNF及びニュールツリンのアミノ酸配列と比較され
、これらのタンパクの夫々に対して約４０％の同一性を有することが見出された
。重要な点としては、TGF −βスーパーファミリーのメンバーの中のカノニカル
フレームワークシステイン残基の特徴スペーシングが存在した。更に、ペルセフ
ィンを分離するのに使用された縮重プライマーによってコード化された類似領域
に加え、GDNF及びニュールツリンの間に高い相同性を有するがTGF −βスーパー
ファミリーの他のメンバーが存在しない他の領域もまたペルセフィンの中に存在
した。 GDNF ACCRPVAFDDDLSFLDD (aa 60‐76)（配列番号(SEQ ID NO)： ９８） NTN PCCRPTAYEDEVSFKDV (aa 61‐77)（配列番号(SEQ ID NO)： ９９） PSP PCCQPTSYAD-VTFLDD (aa 57‐72)（配列番号(SEQ ID NO)： １００） （アミノ酸の番号付けは最初のCys 残基をアミノ酸１として使用する）。
【００２２】 発明者は、ペルセフィンが実際にGDNF／NTN サブファミリーの新しいメンバー
であるという確信に基づいて、追加的な配列情報を獲得するためにペルセフィン
のマウスゲノムクローンを分離した。ラットペルセフィンcDNA配列と相同性のマ
ウスゲノムDNA から１５５ヌクレオチド（nt）断片を増幅するために、PCR 反応
においてラットｃＤＮＡ配列に対応するプライマーが使用された。これらのプラ
イマーは次にＰ１バクテリオファージベクター中のマウス１２９／Ｓｖライブラ
リからマウスペルセフィンゲノムクローンを獲得するために使用された（Genome
Systems, Inc., St.Louis, ＭＯのライブラリスクリーニングサービス）。
【００２３】 ペルセフィン遺伝子を含むこのＰ１クローンからの制限断片（3.4kb Nco I 及
び3.3kb Bam H1）は、マウスゲノムDNA 及びペルセフィン特有のプライマーを 使用したPCR によって獲得されたペルセフィンの210 nt断片によるハイブリダイ
ゼーションによって識別された。Nco I 及びBam H1断片は、ニュールツリン及び
GDNFの両方の成熟領域と相同であると同時に、ラットペルセフィンＲＡＣＥ生成
物の中に存在するアミノ酸に対応する一連のアミノ酸をコード化する配列決定さ
れ、見出された（図11）。
【００２４】 ヒトペルセフィンは、マウスペルセフィンと同じ方法で入手した。変性ＰＣＲ
プライマーはヒトゲノムＤＮＡを増幅させるために利用され、あるクローンはマ
ウスペルセフィンと相同な配列を有すると決定された。確認された配列に基づく
プライマーはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために利用された。陽
性クローンは確認された配列から誘導されたＤＮＡプローブでハイブリダイゼー
ションにより確認され，それから上記クローンは配列決定された。
【００２５】 ファミリーメンバー間の開裂部位の変性が第１のシステインの上流のセグメン
トの中に可変性を生じさせることにより、成熟マウスのGDNF，NTN 及びPSPのア ミノ酸配列が第１カノニカルフレームワークシステインを開始点として一列に並
べられるとき、ペルセフィン（９１アミノ酸）はニュールツリン（９５アミノ酸
）又はGDNF（９４アミノ酸）のいずれかよりもいくらか小さい。この領域におけ
る全体の同一性は、ニュールツリンでは約５０%であり、GDNFでは約４０%である
（図12）。
【００２６】 図17に図示されるように、マウスペルセフィンNcoI断片の更なるヌクレオチド
配列決定により、マウスペルセフィン遺伝子全体のヌクレオチド配列が明らかと
なった。更に、図18に示されるように、ラットペルセフィン遺伝子全体は、ラッ
トゲノムDNA のPCR 増幅断片を配列決定することによって決定された。マウス及
びラットペルセフィン遺伝子の双方においてオープンリーディングフレームはイ
ニシエータメチオニンに対する配列コーディングから位置２４４‐２４６におけ
る停止コドンまで延びる。しかしながら、この配列中のどこかに明らかな異形が
生ずることが分かったので、RXXR開裂部位（位置２５７‐２６８）をコード化す
る配列と、成熟ペルセフィンタンパクに対応する配列（位置２６９‐５５６）は
、このオープンリーディングフレームと同じ直線性ではない。代わりに、第２の
読み枠が開裂部位及び成熟ペルセフィンをコード化する。この明らかな異形とは
関係なく、哺乳類の細胞はマウス又はラットのいずれかの全長ゲノム配列からペ
ルセフィンを発現することが分かった（以下の例１４を参照）。
【００２７】 上記異常の発生を追跡するために、マウス及びラットのペルセフィンに対する
哺乳類発現ベクターを調製した。マウスプラスミドを構築するために、マウスペ
ルセフィン遺伝子を含むＰ１クローンを、ＰＣＲアッセイでのテンプレートとし
て利用した。プライマーは、結果生成するフラグメントがイニシエータメチオニ
ンから停止コドンまで伸長するペルセフィン遺伝子を含むように設計される。Ｐ
ＣＲ反応は順方向プライマーＭ３１７５［５’‐ＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧ
ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧＡ］と、逆プライマーＭ３１５６［５’‐
ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣ］
とを利用する。類似のラットプラスミドを構築するために、ラットゲノムＤＮＡ
はＰＣＲアッセイでのテンプレートとして利用した。ＰＣＲ反応は、順方向プラ
イマーＭ３１７５［５’‐ＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧ
ＡＣＴＴＣＧＧＡ］と、逆プライマーＭ３１５６［５’‐ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧ
ＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣ］とを利用した。増幅生
成物はＢＳＫＳへクローン化され、配列決定されて、正しいクローンは入手でき
たかを確認した。ラット及びマウスペルセフィンフラグメントはＳｍａＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩを利用して摘出され、哺乳類発現ベクターｐＣＢ６のＡｓｐ７１８
（平滑にされた）とＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローン化された。
【００２８】 ＣＯＳサル細胞は、ラット若しくはマウスペルセフィン発現ベクター、又は非
組換えベクター（ｐＣＢ６）自身のいずれかにより感染させた。４８時間後、そ
の細胞を溶解させ、サンプルを１５％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲルで展開さ
れて、タンパク質を電気泳動により分離した。続いて、そのタンパク質をエレク
トロブロッティングによりニトロセルロースへ移動させた。このニトロセルロー
ス膜は坑ペルセフィン抗体（ｐＥＴプラスミドからバイクテリア中で生産させた
マウスペルセフィンへ育てた）でインキュベートさせ、溶解生成物中のペルセフ
ィンの有無を検出した。ラット又はマウスペルセフィン発現ベクターの何れかで
感染させた細胞からの溶解生成物には、ｐＣＢ６で感染させた細胞からの溶解生
成物とは異なり、ペルセフィンの量が多かった。検出されたペルセフィンにサイ
ズは１０‐１５ｋＤであり、処理されたもの（つまり、ペルセフィンの成熟形態
）で予測されたサイズと一致した。条件設定された培養は成熟ペルセフィンを更
に含む上記細胞から収穫された。上記結果から、マウス及びラットのペルセフィ
ン遺伝子双方は、正しく処理されたペルセフィン分子の合成をもたらすことが可
能であることが分かる。
【００２９】 上記の発生機構を追跡するために、ラット又はマウスペルセフィン発現ベクタ
ーの何れかで感染させた細胞からＲＮＡを分離させた。イニシエーターＭｅｔ及
び停止コドンに対応するプライマーを利用して、ＲＴ/ＰＣＲ分析を行った。二 つのフラグメントを検出し、一つは予想されたサイズのペルセフィン遺伝子に対
応し、他方は若干小さいサイズに対応し、これによりＲＮＡスプライシングが起
こっていることが示唆された。我々は、これを他の多くのプライマーペアで確認
した。大きい及び小さいペルセフィンフラグメントの双方はクローン化され、配
列決定された。予想された通り、より大きなフラグメントはペルセフィン遺伝子
に対応した。小さなフラグメントはペルセフィンのスプライスされたバージョン
に対応する。プロ‐ドメイン内の小さい８８ｎｔイントロン（開始コドンの１５
４ｎｔ下流に位置する）はスプライシングされた。このスプライシング、「フレ
ームシフト」は、もはらラット又はマウスペルセフィンには存在しなかった（つ
まり、イニシエータＭｅｔ及び成熟領域はインフレームである）。
【００３０】 ペルセフィンのＮ末端はニュールツリン又はGDNFのＮ末端領域を参照すること
によって予測された。ニュールツリン配列相同性及び開裂シグナルを使用すると
、ペルセフィンの第１カノニカルフレームワークシステインの９残基上流から開
始して、（ニュールツリンが示唆するのと同じく）成熟マウスペルセフィンがこ
のシステインの上流に５つのアミノ酸(ALAGS) （配列番号(SEQ ID ＮO)：１０３
）を含むことを示唆する特徴RXXR開裂モチーフが与えられる。ラットペルセフィ
ンにおける対応する５つのアミノ酸はALPGL （配列番号(SEQ ID NO)：１１２） であり、ヒトペルセフィンはALSGP（配列番号(SEQ ID NO)：２２４）である。こ
れらのパラメータを使用すると、成熟ペルセフィンは９６アミノ酸からなり、10
.4kDの予測される分子量を有する。
【００３１】 「成熟」成長因子は、全てのプレ（pre）又はプロ（pro）領域が開裂され、TG
F‐βスーパーファミリーの他のメンバーに対する類似性によりモノマーとして 、又はジスルフィド結合によってリンクされるホモダイマーの形で存在しうる分
泌された形式の成長因子を指す。
【００３２】 上述のような新しい成長因子、即ちペルセフィンの発見は、本発明者による先
行したニュールツリンの発見の結果として生じた。従って、ニュールツリンの発
見に通じた実験は、本発明によるペルセフィンの発見だけでなく、ペルセフィン
の生物学的活性にも関係している。ニュールツリンの分離、識別及び性質は、後
述の例１〜５に詳細に説明される。
【００３３】 本願では、ペルセフィンという名称は、本発明において特徴付けされ、開示さ
れたペルセフィンと生物学的に等価であり、そのペルセフィンと実質的に相同で
ある起源の成長因子を含むように構成されるべきことを意味する。かかる実質的
に相同な成長因子はどんな組織や種にも特有であると考えられ、同様に生物学的
活性も、種々の生物学的アッセイシステムで特徴付けることが可能である。プレ
プロペルセフィンは、プレ又はリーダー若しくはシグナル配列領域、プロ配列領
域、及び、本発明において定義されたペルセフィンを含有するように構成される
べきことを意図している。
【００３４】 「生物学的に等価」という用語は、本発明の組成物が、組換えて生成されたヒ
ト、マウス、若しくは、ラットのペルセフィンと同程度でなくても構わないが、
類似した形式で同じ成長促進性質の一部又は全部を示すことができることを意味
する。
【００３５】 「実質的に相同」の意味は、ヒト・マウス及びラットのペルセフィンだけでな
く他の任意の種からのペルセフィンを含むペルセフィンオーソログの配列同一性
の程度が、ペルセフィン及びニュールツリン又はペルセフィン及びGDNFといった
パラログの間の配列同一性の程度よりも大きく、あらゆるTGF‐βスーパーファ ミリーのメンバーについて既に報告されている相同の程度よりも大きいというこ
とである。(TGF‐βスーパーファミリーの相同性の解説については引用文献に編
入されるKingsley, Genes and Dev 8:133-46, 1994を参照) 。
【００３６】 「配列同一性」または「パーセント同一性」とは、２つの配列間の同じ残基の
パーセント(%) を表すことを意図している。マウス又はラットペルセフィンと、
又は非ペルセフィン成長因子であるヒトGDNFとヒトニュールツリンとのパーセン
ト同一性を決定する場合はヒトペルセフィンが基準配列である。マウスGDNFとマ
ウスニュールツリンとのパーセント同一性を決定する場合と、ラットGDNF及びラ
ットニュールツリンとのパーセント同一性を決定する場合は、マウスペルセフィ
ンが基準配列である。ヒト以外のニュールツリンでパーセント同一性を決定する
場合、基準はヒトニュールツリンとヒトGDNFである。全ての上記の比較において
、比較される２つの配列はレーザージーン（Lasergene)バイオコンバイオコンピ
ューティング・ソフトウエア(DNASTAR, INC, Madison, WI) を使用する多重配列
アラインメントのクラスタル法 (Higgins et al, Cabios 8:189-191, 1992)を用
いて整列される。この方法では多重配列を次第に数珠つなぎ（アラインメント)
に並べてゆく。一連のペア方向のアラインメントから算出された類似性スコアを
用いて、この過程で大きさを増していく一連のアラインメント集団が集められる
。最適な配列アラインメントは好適なアラインメントのスコアを見出して得るこ
とができ、そのスコアはアラインメント内の独立した残基間の合計スコアの平均
である。これにより、所与の進化間隔にわたって２つの関連タンパク間で起こる
所与のアミノ酸変化の確率を表す残基重量表から決定することができる。アライ
ンメントのギャップを開き伸ばすことによるペナルティはスコアに加えられる。
本プログラムで使用するデフォルトパラメータは、以下の通りである。多重アラ
インメントのギャップペナルティ＝１０；多重アラインメントのギャップ長ペナ
ルティ＝１０；ペア方向アラインメントのｋ−タプル(k-tuple) 値＝１；ペア方
向アラインメントのギャップペナルティ＝３、ペア方向アラインメントのウイン
ドー値＝５；ペア方向アラインメントで保存された対角線＝５。アラインメント
・ プログラムに使用される残基重量表はPAM２５０である(Dayhoffほか、in Atla
s of Protein Sequence and Structure, Dayhoff, Ed., NBRF, Washington, Vol
. 5, suppl. 3, p. 345, 1978）。
【００３７】 パーセント保存は、同一残基の割合を２つの残基が(PAM２５０残基重量で０．
３以上の対数確率値を有すると定義される) 保存的置換を表す位置の割合に加算
することにより、上記のアラインメントから算出される。この基準を利用して、
好適な保存アミノ酸変化は、以下の通りである。つまり、R-K; E-D、Y-F 、L-M;
V-I、Q-Hである。「保存」は、他の種からのペルセフィン又は非ペルセフィン 成長因子によってパーセント保存を決定する場合はヒトペルセフィンでパーセン
ト保存を決定する場合は、ヒトペルセフィンを基準とし、非ペルセフィン・非ヒ
トニュールツリン又は非ペルセフィン、非ニュールツリン成長因子でパーセント
保存を決定する場合はヒトニュールツリンを基準とする。
【００３８】 表１は、成熟ペルセフィン、成熟ニュールツリンと多様な種からの成熟GDNFと
の比較のための同一性(identitiy)(Ｉ)と保存(conservation)(Ｃ) の計算を示す
。成熟ヒトペルセフィン（ｈＰＳＰ）と、成熟マウス及びラットペルセフィン（
それぞれ、ｍＰＳＰとｒＰＳＰ）との間で、成熟ヒトペルセフィンと成熟ヒトＧ
ＤＮＦ又はニュールツリン（それぞれ、ｈＧＤＮＦとｈＮＴＮ）との間で、比較
を行った。以下の表に示すように、ニュールツリン比較は、成熟ヒト及び成熟マ
ウスニュールツリン（それぞれ、ｈＮＴＮとｍＮＴＮ）との間で、及び上記と成
熟ヒト、ラット及びマウスＧＤＮＦ（それぞれ、ｈＧＤＮＦ、ｒＧＤＮＦとｍＧ
ＤＮＦ）との間で行った。
【００３９】 表１ 比較 同一性％ 保存％ ｈＰＳＰ ｖ．ｍＰＳＰ ８１ ８１ ｈＰＳＰ ｖ．ｒＰＳＰ ８０ ８１ ｍＰＳＰ ｖ．ｒＰＳＰ ９４ ９６ ｈＰＳＰ ｖ．ｈＮＴＮ ４９ ５０ ｈＰＳＰ ｖ．ｈＧＤＮＦ ４０ ４３ ｈＮＴＮ ｖ．ｍＮＴＮ ９０ ９３ ｈＮＴＮ ｖ．ｒＧＤＮＦ ４４ ５３ ｈＮＴＮ ｖ．ｍＧＤＮＦ ４３ ５２ ｈＮＴＮ ｖ．ｈＧＤＮＦ ４３ ５３ ｍＮＴＮ ｖ．ｒＧＤＮＦ ４２ ５２ ｍＮＴＮ ｖ．ｍＧＤＮＦ ４１ ５１ ｍＮＴＮ ｖ．ｈＧＤＮＦ ４１ ５２ ヒトペルセフィンとマウス又はラットペルセフィンとの間の相同の程度は、
約８０％であり、マウスとラットペルセフィンとの間の相同の程度は、約９４％
である。表１に示されるようにニュールツリン比較は、成熟マウス及び成熟ヒト
ニュールツリンタンパク質が約９０％の配列同一性を有することを示す。更に、
ヒト以外の哺乳類のすべてのペルセフィン及びニュールツリンホモログは、同様
に、ヒトペルセフィン、ヒトニュールツリン又はヒトＧＤＮＦと少なくとも約７
５％以上の配列同一性を有すると考えられている。鳥類などの非哺乳類では、ペ
ルセフィンとの相同性の程度は、ヒトペルセフィン若しくはヒトニュールツリン
又はヒトＧＤＮＦと少なくとも約６５％以上であると考えられている。比較のた
め、成長因子のニュールツリン‐ペルセフィン‐ＧＤＮＦファミリーのファミリ
ーメンバー間での変異は、ペルセフィンとＧＤＮＦとの間、又はニュールツリン
とＧＤＮＦとの間の比較により認められる。ヒトペルセフィンは、ヒトＧＤＮＦ
と約４０％の配列同一性と約４３％の配列保存を有し、ヒトニュールツリンと役
４９％の配列同一性と約５０％の配列保存を有する。同様に、ヒトニュールツリ
ンは、ヒトGDNFと約４０％の配列同一性及び約５０％の配列保存を有する。異な
るファミリーメンバーもまた、ニュールツリンと同様な配列同一性の４０％、ペ
ルセフィンの配列同一性の約４０％ 、GDNFの配列同一性の約４０％の配列同一 性をもち、ニュールツリンとの同一性は約３０％乃至８５％の範囲にあり、ペル
セフィンとの同一性は約３０％から８５％までの範囲にあり、ペルセフィンと約
３０％乃至７５％の範囲の同一性にあり、GDNFとの同一性は約３０％乃至８５％
の範囲にあると考えられている。
【００４０】 したがって、GDNF‐ニュールツリン‐ペルセフィンファミリーの所与のファミ
リーメンバーは、ヒトGDNF及びヒトニュールツリンが夫々互いに対して又はGDNF
に対してよりも、マウスGDNF及びマウスニュールツリンにより密接に関連するの
と同様に、同種の他のファミリーメンバーに対しては他の種のそのファミリーメ
ンバーのオーソログに存在するよりも少ない配列同一性を有することが期待され
、所与のファミリーメンバーは、他のファミリーメンバーに対してはTGF‐β上 部ファミリー因子のその他の既知のメンバーに対する配列同一性よりも大きい配
列同一性を有することが期待されている（上述のKingsley) 。
【００４１】 ヒト以外の哺乳類種のプレプロペルセフィンの相同性は、ヒトのペルセフィン
と少なくとも約７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列のペルセフィン部分に
よって確認することができ、非哺乳類種のプレプロペルセフィンの相同性は、ヒ
トペルセフィンと少なくとも約６５％の相同性をもつアミノ酸配列のペルセフィ
ン部分によって確認することができる。
【００４２】 本願で使用される用語としてのペルセフィンには、バイブリッド型及び変異型
のペルセフィンがあり、、それぞれ、融合タンパク質と、ペルセフィンフラグメ
ント、ハイブリッド型及び変異型が含まれ、ハイブリッド又は変異型がペルセフ
ィンの生物学的活性を保持する限り、ある種のアミノ酸が除去若しくは置換され
、一つ又はそれ以上のアミノ酸が変化して変異アミノ酸、又は異常アミノ酸やグ
リコソレーション（glycosolation)などの変異型にある。生物学的活性の維持と
は、ニューロンの生存が促進されることを意味するが、必ずしも本願で確認され
たヒト、マウス又はラットペルセフィンの能力と同じレベルでなくてもよい。
【００４３】 「実質的に相同」という意味には、本文に記載するペルセフィン抗体との交差
反応性により分離することができるペルセフィンが含まれる。或いは、ゲノムＤ
ＮＡ、ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡを含むコード化中のヌクレオチド配列が、ゲノ
ム若しくはサブゲノムヌクレオチド配列の相補性配列、ペルセフィンのｃＤＮＡ
、又は、それらの断片とのハイブリダイゼーションによって分離されるペルセフ
ィンが含まれる。変性DNA 配列は、ヒトニュールツリンをコード化し得ること、
かつ、ニュールツリンの対立遺伝子変種と同様、これらの配列を本発明の範囲に
含めることを意図していることが当業者には理解されるであろう。
【００４４】 更に、保存的に置換されたペルセフィンタンパク質は、本発明の範囲内である
。保存アミノ酸置換とは、同様な側鎖を有する残基の相互交換のことをいう。相
互交換アミノ酸は、それらの側鎖の化学的性質に基づきグループ化される。例え
ば、アミノ酸のあるグループには、中性で疎水性の側鎖（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ，
Ｆ及びＭ）を有するアミノ酸があり、別のグループには、中性で極性鎖（Ｇ、Ｓ
、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｎ及びＱ）を有するアミノ酸があり、更に別のグループには、塩
基性側鎖（Ｋ、Ｒ及びＨ）を有するアミノ酸があり、また別のグループには酸性
側鎖（Ｄ及びＥ）を有するアミノ酸があり、別のグループには、脂肪族側鎖（Ｇ
、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ）を有するアミノ酸があり、別のグループには、脂肪族水酸
基側鎖（Ｓ及びＴ）を有するアミノ酸があり、別のグループにはアミノ含有側鎖
（Ｎ、Ｑ、Ｋ、Ｒ及びＨ）を有するアミノ酸があり、別のグループには芳香族側
鎖（Ｆ、Ｙ及びＷ）を有するアミノ酸があり、別のグループには、硫黄含有側鎖
（Ｃ及びＭ）を有するアミノ酸がある。好適な保存アミノ酸置換基はＲ−Ｋ；Ｅ
−Ｄ、Ｙ−Ｆ、Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ及びＧ−Ｈがある。加えて、Ｑ‐Ｒ−Ｈ及びＡ−
Ｖは、ペルセフィンのヒト、マウス及びラットパラログ間で発生する限り、ペル
セフィンに対する好適な置換であると考えられる。
【００４５】 プレプロニュールツリンの場合、プロ領域のコーディング配列に位置するイン
トロンから得られる交互にスプライシングされたタンパク生成物が存在すること
がある。イントロンはマウスとヒトのプレプロニュールツリン配列のアミノ酸５
７内の位置に相応するCDNA核酸１６９と１７０間の配列に相応する位置のゲノム
配列に存在すると思われる（図７および図８参照）。したがって、この位置の交
互スプライシングは、本文で識別したヒトとマウスのプレプロ ニュールツリン
(それぞれ配列番号（SEQ ID NO)：１１および配列番号（SEQ ID NO)：１２) 配
列とは、1 つ以上のアミノ酸の追加及び／又は除去により識別されたアミノ酸の
部位において、異なる配列を生み出すかもしれない。本願中で使用した用語「プ
レプロニュールツリン」には、全ての交互スプライシングのプレプロニュールツ
リンを含めることが意図されており、同様に、何れの及び全ての交互スプライシ
ングプレプロペルセフィンタンパク質も、本願中で使用する用語「プレプロペル
セフィン」に含まれることを意図している。
【００４６】 理論的に制限されることを意図するわけではないが、識別されたヒト、マウス
及びラットタンパク、並びに他の組織及び種からの相同体は、TGF‐βスーパー ファミリーの他の因子に関して知られていることと矛盾しない方法で、生物学的
に活性な形のダイマーとして存在すると考えられる。
【００４７】 ホモダイマーの他に、ペルセフィンのダイマーのモノマー単位を使用して、ペ
ルセフィンから得られる最低１個のモノマー単位又はニュールツリンから得られ
る最低１個のモノマー単位を含む安定した成長因子のヘテロダイマーあるいはヘ
テロマルチタイマーを構築することができる。この構築は、ペルセフィンのホモ
ダイマーをその構成モノマー単位に分離させ、第２ホモダイマー成長因子のモノ
マー単位のあるところで、再び結合させることにより行うことができる。この第
２ホモダイマー成長因子は、多様な成長因子から選択することができる。例えば
、ニュールツリン、ペルセフィン、NGF 、BDNF、NT‐3、NT‐４/５などのNGFフ ァミリーメンバー、TGF‐βのスーパーファミリー、血管内皮成長因子、CNTF/LI
Fファミリーなどが第２ホモダイマー成長因子として挙げられる。
【００４８】 成長因子は特定のレセプターに作用すると考えられている。例えば、TGF‐β およびアクチビン（activins）のレセプターが確認されており、Ser/Thr キナー
ゼ・ トランスメンブレンタンパクのファミリーを構成する( ここに参照として組
み入れるKingsley, Genes and Dev 8:133-146, 1994; Bexk et al Nature 373: 339-341, 1995 )。NGF ファミリーでは、NGFは、末梢知覚および交感神経ニュ
ーロンならびに基底前脳ニューロンにおいてTrkAレセプターに結合する。BDNFと
NT‐４/５は、trkBレセプターに結合する。さらにNT‐３は、主としてCNS(中枢 神経系) 中に明確に分布するtrkCレセプターに結合する(Tuszynskiほか、Ann Ne
urol 35:S9-S12, 1994) 。更に、ペルセフィン‐ニュールツリン‐ＧＤＮＦファ
ミリーのメンバーは、他の成長因子ファミリーに対して示された明確な分布を有
する特定レセプターを介するように働くようである。最近、ＧＤＮＦは多成分レ
セプター複合体を介して働き、膜内外シグナル形質導入成分であるＲｅｔチロシ
ンキナーゼタンパク質（Ｒｅｔ ＰＴＫ）は、ＧＤＮＦレセプターα（ＧＤＮＦ
Ｒ−α）と呼ばれる他のタンパク質とＧＤＮＦの結合により活性化され、そのＧ
ＤＮＦＲ−αは膜内外ドメインを有しておらず、グルコシルホスファチジルイシ
トール（ＧＰＩ）リンケージを介して細胞表面に付く（Durbecら、Nature 381:
789‐793, 1996; Jingら、Cell 85: 1113‐1124, 1996； Treanorら、Nature 38
2: 80‐83, 1996; Truppら、Nature 381: 785‐789. 1996 これらは本願に引用
文献に編入される）。更に、Ｒｅｔチロシンキナーゼレセプターを介するニュー
ルツリン及びＧＤＮＦのシグナリングは、ＴｒｎＲ１というコレセプタータンパ
ク質ＧＤＮＦＲ‐αと、ＴｒｎＲ２というコレセプタータンパク質を含むコレセ
プターのファミリーにより媒介され、その何れかはニュールツリン及びＧＤＮＦ
に対するＲｅｔとの機能性レセプター複合体を形成する（Balohら、Neuron 18:
793‐802, 1997 本願の引用文献に編入される）。ペルセフィンのヘテロダイマ
ーもしくはヘテロマルチマー、およびその他の成長因子を１つ以上組成すること
により得られる成長因子は、異なる組織分布をもつ最低２つの明確なレセプター
タイプに結合できると考えられる。こうして得られたヘテロダイマーまたはヘテ
ロマルチマーは、異なり、おそらく細胞の拡大スペクトルを示すことが予想され
ている。ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーは細胞に作用するか、より大き
な効能を提供することが可能である。また、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチ
マーは、ホモダイマーまたはホモマルチマーには見られない相乗効果を提供する
ことも可能である。例えば、異なるクラスの因子の組み合わせは、乏突起神経膠
細胞の長期の生存を促進することが明らかにされたのに対し、同じクラス内の単
一の因子やその組合わせは短期の生存しか促進しなかった(Barres ほか、Develo
pment 118:283-295, 1993)。
【００４９】 ヘテロダイマーは多くの方法で構成することができる。例えば、解離／展開試
薬などの使用により解離／展開を起こすホモダイマーを混合して、コンディショ
ニング (前処理) をほどこす。次にモノマーの再結合とヘテロダイマー形成を可
能にするコンディショニングにさらす。解離／展開試薬には、タンパクの解離を
促進することが知られるあらゆる試薬が含まれる。代表的な試薬には、塩酸化グ
アニジン、尿素、チオシアン酸カリウム、HCl 緩衝液など、pH値を下げる試薬、
さらにアセトニトリルまたはアルコール (プロパノール、イソプロパノールなど
) など極性がある水混和性の有機溶剤などがある。さらに、二硫化結合で電子対
結合されたホモダイマーについては、TGF‐βファミリー因子の場合と同じく、 解離／展開および再結合を促進することが知られているジチオールトレイトール
やβ−メルカプトエタノールなどの還元剤を、解離／展開や再結合／再重複に用
いることができる。 またヘテロダイマーも、ニューロトロフィンで行ったように、形質転換された
細胞がヘテロダイマーを生成するような方法で、２つ以上の因子で細胞のトラン
スフェクションを行なって作ることができる(HeymachおよびSchooter, J BiolCh
em 270:12297-12304, 1995)。
【００５０】 ヘテロダイマーを作る別の方法は、ペルセフィン又はニュールツリンホモダ
イマーと第二成長因子からのホモダイマーを組み合わせ、混合物を37℃で培養す
ることである。
【００５１】 ホモダイマーからヘテロダイマーを生成する場合、予備的な非変性ポリアクリ
ルアミド・ゲルからの溶離などのように当業者が利用できる方法を用いて、ホモ
ダイマーからヘテロダイマーを分離することができる。別の方法として、モノS カチオン交換カラムまたは段階的免疫親和性カラムなどの高圧カチオン交換クロ
マトグラフィーを用いて、ヘテロダイマーを精製することができる。
【００５２】 成熟タンパクの配列のN 末端にあるシグナル配列をもつ細胞内で、多くのタン
パクが合成されることが本技術分野ではよく知られている。そのようなリーダー
配列を運ぶタンパクは、プレタンパクと呼ばれる。タンパクのプレ部分はタンパ
クの細胞処理の間に開裂される。プレリーダー配列のほかに、多くのタンパクが
、成熟タンパクの安定した前駆物質であるタンパク上の領域を示す明確なプロ配
列を含んでいる。プレ領域およびプロ領域の両方で合成されたタンパクは、プレ
プロタンパクと呼ばれる。他のTGF‐βファミリー因子および本文で決定された 配列で起きることが知られているプロセシングイベントをかんがみ、発明者は細
胞内で合成されるペルセフィンタンパクタンパクの形は、プレプロペルセフィン
であると信じる。ヒトプレプロニュールツリンはN 末端の２３アミノ酸シグナル
配列を含むと考えられる（ヒトプレシグナル配列、配列番号（SEQ ID NO)：２１
９、図２４ 、アミノ酸１乃至２３は配列番号（SEQ ID NO)：２０８及び２０９ 、図２４ 、核酸１乃至６９によってコード化）。リーダー配列の全長はシグナ ル配列として作用するためには必ずしも必要な配列ではないことが知られており
、したがって、ペルセフィンのプレ領域の定義にはその断片（普通はN 末端断片
）が含まれていない。これはシグナル配列として機能できる性質を有し、ミトコ
ンドリア、ゴルジ、血漿メンブレンやその他このような１つ以上の細胞器官のメ
ンブレンへの翻訳・挿入を容易にすることを意味する。
【００５３】 ペルセフィンシグナル配列のあとには、成熟ニュールツリンのN 末端のアミノ
酸配列直前のRXXRタンパク分解処理部位を含むプロ領域が続く（ヒトプロ領域配
列、配列番号（SEQ ID NO)：２２０、図２４、核酸配列、配列番号（SEQ ID NO)
：２２１によりコード化されたアミノ酸２４乃至６０、図２４ 核酸７０乃至１
８０）。
【００５４】 ペルセフィンのプレ領域およびプロ領域はともに、ヒトプレプロ配列 (配列番
号（SEQ ID NO)：２１９, 図 ２４，アミノ酸１乃至６０は配列番号（SEQ ID NO
)：２１３及び２１５、核酸１乃至２８５によってコード化)として識別したプレ
プロ配列を構成する。プレ領域配列およびプロ領域配列ならびにプレプロ領域配
列は、本文に定義のプレプロニュールツリンの内部に包含されている配列に基づ
いて、非ヒト哺乳類および非哺乳類の種として識別し採取することが可能である
。
【００５５】 上記標識を利用して、ヒトペルセフィンｃＤＮＡは、１５６のアミノ酸ロング
タンパク質（Ｍｒ １６．６ｋＤＡと予測される）をコード化する４７１ｂｐの
オープンリーディングフレームを有する。２３のアミノ酸の長い予測されたシグ
ナルタンパク質の解裂により、１３３のアミノ酸プロペルセフィン分子（Ｍｒ
１４．２ｋＤａ）が生じる。ＲＸＸＲコンセンサス配列でのプロペルセフィンの
タンパク質分解解裂により、１０．３ｋＤａの分子量のある９６のアミノ酸成熟
タンパク質が生成する。成熟し、分泌されたペルセフィン分子は、ＴＧＦ−βフ
ァミリーの他のメンバーと同様に、ジスルフィド結合したホモダイマーを形成す
る傾向にある。
【００５６】 ペルセフィンプレおよび／またはプロ領域又はペルセフィンDNA と関連づけら
れると考えられている同様の領域のヌクレオチド配列も、他の成長因子またはタ
ンパクのコードする配列でキメラ遺伝子を構成するのに用いることができる。 (
Boothほか、Gene 146:303-8, 199 4; Ibanez, Gene 146:303-8, 1994; Storici
ほか、FEBS Letters 337:303-7, 1994; Sha ほか J Cell Biol 114:827-839, 19
91参照により本文に採用) 。こうしたキメラタンパクは、活性タンパク種の生成
または発現の変更を示す可能性がある。
【００５７】 本発明による好適なペルセフィンは、組換えＤＮＡ技術により調製される。た
だし、ペルセフィンはニュールツリンに対して実行されたのと同じように、細胞
の条件設定された培養からの精製された形で分離される。
【００５８】 「純粋な形」、「精製された形」または「実質的に精製された形」とは、ペル
セフィン組成にはペルセフィン以外の他のタンパクが実質的には存在しないこと
を意味する。好ましくは、実質的に精製されたペルセフィン組成は、全タンパク
質、つまり存在する他の高分子種とのモルに基づく比較において、少なくとも約
５０％のペルセフィンを含む。より好ましくは、実質的に精製されたペルセフィ
ン組成は、全タンパク質、つまり存在する他の高分子種とのモルに基づく比較に
おいて、少なくとも約８０モル％乃至９０モル％のペルセフィンを含み、更に好
ましくは少なくとも約９５モル％以上のペルセフィンを含む。
【００５９】 組換え型ペルセフィンは、適切に形質転換された宿主細胞の中でペルセフィン
をコード化するDNA 配列を発現することによって生成することができる。本技術
分野で周知の方法を用いて、ペルセフィンをコード化するDNA を発現ベクターに
結合し、宿主細胞内へ形質転換する。こうして形質転換された細胞によるペルセ
フィンの発現に適した条件を設定することができる。
【００６０】 適切な発現ベクターならどんなベクターも組換え型ヒトペルセフィンの生成に
使用することができる。一例をあげると、哺乳類の発現ベクターpCB6(Brewer, M
eth Cell Biol 43:233-245, 1994) や、大腸菌 pET発現ベクターなどがあるが、
特にpET-30a(Studier ほか、Methods Enzymol 185:60-89, 1990 参照により本文
に採用) はよく知られている。本文では上記のベクターを用いている。哺乳動物
とバクテリア細胞内の発現に好適なその他の発現ベクターで、本分野で知られて
いるのは、イーストか昆虫の細胞で使用するための発現ベクターである。また、
バクロウイルス発現系を使うこともできる。
【００６１】 ペルセフィンはモノマー単位で発現させることもできる。またはそのようなモ
ノマー形を還元状態下の調製によって生成することができる。このような事例で
は、タンパクの再結合と復元は、タンパク類の解離／結合を促進することで知ら
れている上記因子の１つを使用してこれを達成することができる。例えば、モノ
マー形をまずジチオトレイトールによって培養し、次に酸化グルタチオン二ナト
リウム塩による培養、続いて尿素などの再結合試薬を含む緩衝液による培養で生
成する。
【００６２】 ペルセフィンはダイマーか他のマルチマーとして存在し、他の方法で糖化され
ているか、化学的に変質されうる。成熟ヒトペルセフィンは、Ｎ結合糖鎖形成部
位を含まない（図１５Ｂ及び配列番号（SEQ ID NO)：２２１参照）。潜在的Ｏ結
合糖鎖形成部位は、配列番号（SEQ ID NO)：２２１（図１５Ｂ）の位置３、１０
、１２、１４、２４、３６、４３、６７、７０及び８８の成熟ヒトペルセフィン
で発生する。
【００６３】 上述のように、ヒト核酸配列が示唆するのは、ペルセフィンが初めにプレプロ
ポリペプチドとして翻訳されたこと、そしてシグナル配列およびこの分子のプロ
領域のタンパク分解処理が成熟配列を生成することである。成熟配列は、本文中
で「成熟ペルセフィン」と称され、相同形のヒトおよび非ヒト種内に存在すると
記載されている。したがってペルセフィンは、ヒトおよび非ヒト種に由来するあ
らゆる「成熟ペルセフィン」配列を含み、かつペルセフィン遺伝子から翻訳可能
なあらゆるプレプロペルセフィンポリペプチドを含む。
【００６４】 ニュールツリンタンパク質と同様に、ペルセフィンのイソ型が存在することも
可能である。例えば、さまざまな起こり得る解裂部位（ＲＸＸＲ部位のような）
は、プレプロニュールツリン配列に存在し、プレプロニュールツリンの２以上の
可能なイソ型が存在する。このようにして、成熟ニュールツリンタンパク質は、
第一のカノニカルシステインに先行する可変数のアミノ酸を有する。
【００６５】 このような交互の開裂部位は、異なった生物間、並びに、同じ生物の異なった
組織間では異なった利用の仕方がなされるであろう。TGF‐βファミリーメンバ ーの成熟形にある７個の保存システインの第１番目に先行するN-末端アミノ酸は
、長さ並びに配列に著しい変動がある。さらに、１０個の残基からなるアミノ酸
配列を、最初に保存されたシステイン残基の２個上流に挿入することによって、
公知の１つのファミリーメンバーであるドルサリンの生物学的活性が影響を受け
ることはない (Basler, K., Edlund, T., Jessell,T.M., and Yamada, T., (199
3) Cell 73:687‐702）。同様に、第１番目のカノニカルシステインに先行する さまざまな長さの配列を含むペルセフィンタンパク質が存在し、作ることができ
、上記のタンパク質はそれらの生物学的活性を保持するであろう。
【００６６】 本願において、発明者らは、生物学的活性を示すペルセフィン‐ニュールツリ
ン‐ＧＤＮＦ成長因子の最小の配列で、第７番目のカノニカルシステインからの
第１番目からの配列を含んでいると信じている。ヒトペルセフィンの上記配列は
、図２４（配列番号（SEQ ID NO)：２２３）に示すシステイン６６からシステイ
ン１５４である。図１２に示すマウスペルセフィンに対する比較可能な配列は、
配列番号（SEQ ID NO)：７９のシステイン１からシステイン８７であり、図１４
に示すラットペルセフィンのそれは、システイン１からシステイン８７である。
したがって、本発明のペルセフィンタンパク質は、配列番号（SEQ ID NO)：２２
３、７９又は８２を含むアミノ酸配列と、上記アミノ酸をコード化する配列を含
む核酸分子とを含む。
【００６７】 本発明はまた、ニュールツリンがヒト、マウス、ラット及びヒトペルセフィン
（図１１、１４及び２３）並びにヒトペルセフィンをコード化する配列を含む核
酸配列を包含する。また本発明の範囲には、ペルセフィンをコード化する核酸配
列と実質的に同じ配列が含まれる。例えば、このような実質的に同じ配列は、周
知の標準的手法に従って、大腸菌などの一定の宿主細胞の中でより容易に発現す
るコドンで置き換えられる。そのような変更された核酸配列も本発明の請求範囲
の中に含まれる。
【００６８】 当業者は特定の核酸配列を変更することができる。したがって、プレプロペル
セフィンのアミノ配列、又は、ペルセフィンのプレ領域若しくはプロ領域に対し
コード化を行うすべての核酸配列を同様に変更することができる。したがって本
発明には、このようなすべての核酸配列（または適宜、核酸配列の補体と呼ばれ
る）とハイブリダイゼーションし、細胞生存又は成長促進作用を有するポリペプ
チドのコード化を行う核酸配列が含まれる。本発明にはまた、一つ以上の置換、
欠失又は付加を有する核酸分子を含み、核酸配列はペルセフィン核酸配列、又は
適当な場合はその補体とハイブリダイズする。
【００６９】 特定のハイブリダイゼーションは、本願ではポリヌクレオチド（例えば、一つ
以上の置換、欠失及び/又は付加を含むペルセフィンポリヌクレオチド）と特定 基準ポリヌクレオチド（例えば、成熟ペルセフィンをコード化し、配列番号（SE
QID NO)：１８３、１８４、１９５、１９９、２００、２０１又は２０２の配列 を有するポリヌクレオチド）との間のハイブリッド形成として定義され、ここで
、ポリヌクレオチドは優先的に特定基準ポリヌクレオチドとハイブリダイズする
。例えば、成熟ペルセフィンをコード化するポリヌクレオチドは、基準ペルセフ
ィンポリヌクレオチド（配列番号（SEQ ID NO)：１８３、１８４、１９４、１９
５、１９９、２００、２０１又は２０２）と特異的にハイブリダイズし、基準ニ
ュールツリンポリヌクレオチド（配列番号（SEQ ID NO)：９又は１０、若しくは
それらと相補的な配列）とはハイブリダイズしない。特定ハイブリダイゼーショ
ンは、当業者には容易に理解される高いストリジェンシー条件下で行われること
が望ましく、上記の条件は、ハイブリダイゼーション中及び洗浄工程中に、温度
、イオン強度、時間の長さ及びホルムアミドの濃度を含む多くの要因により決定
される（例えば、Sambrookらの1989年の上記文献を参照）。
【００７０】 本発明にはまた、生存若しくは成長促進活性を有し、ペルセフィンに結合する
抗体によって識別されるポリペプチドのコード化を行う核酸配列も含まれる。
【００７１】 また、本発明には、本発明の請求範囲に含めた核酸配列のいずれにも機能的に
結合する発現制限因子からなるベクターが含まれる。更に、本発明には、かかる
ベクターによって形質変換されたあらゆる変種の宿主細胞が含まれる。
【００７２】 また本願には、ペルセフィンを生成する方法が開示されている。標本は様々な
細胞タイプからの調製培地からの分離によって調製することができる。ただし当
該細胞タイプがペルセフィンを生成することを条件とする。２番目に好適な方法
として、ペルセフィンをコード化する核酸配列を分離し、配列を適切な制限配列
と共に適切なベクターおよび細胞タイプ内へクローニングし、ペルセフィンを生
成するための配列を発現させることによる、組換え型利用の方法がある。
【００７３】 ４つの神経栄養因子--神経成長因子(NGF) 、脳由来神経栄養因子(BDGF)、ニュ
ーロトロフィン（neurotrophin)-3(NT-3）、及び、ニューロトロフィン‐４/５(
NT‐４/５)からなる哺乳類の遺伝子ファミリーを確認した。これらの因子は約６
０のパーセントの核酸配列相同性を共有する( 参照として組み入れられるTuszyn
ski ＆Gage, Ann Neurol 35:S9-S12, 1994) 。ペルセフィンタンパク及びニュー
ルツリンタンパクは神経成長因子のNGF ファミリーに対しては顕著な相同性を示
さない。ペルセフィン又はニュールツリンは成長因子のTGF‐βスーパーファミ リーと２０％未満の相同性を共有するのみである。
【００７４】 しかし、ペルセフィン及びニュールツリンは共にGDNFと約４０％の配列の相同
性を示す。特に、ペルセフィン、ニュールツリン及びGDNFにある７個のシステイ
ン残基の位置は殆ど正確に保存される。タンパクをコード化し、ペルセフィン、
ニュールツリンおよびGDNFに対して著しいアミノ酸配列相同性を有し、同じ若し
くは異なる組織、及び、同じ若しくは異なる生物学的活性に対して選択性を有す
る成長因子として機能する他の未確認遺伝子が存在する可能性がある。影響を受
ける組織及び／又は誘発される反応に関しては、異なったファミリーメンバーに
よる異なったレセプターの優先的な活性化から、異なった多様な活動が生じる可
能性がある。これは神経成長因子のNGFファミリーメンバーで起こることが知ら れている（上記 Tuszynski and Gage, 1994)。
【００７５】 ファミリーメンバーのタンパク生成物の中に、アミノ酸配列の実質的な保存を
示す特異遺伝子ファミリーのメンバーの影響として、ＤＮＡレベルにおいて配列
が相当保存されている。これはＧＤＮＦ、ニュールツリン及びペルセフィンが属
する遺伝子ファミリーの他のメンバーを確認するための新しい方法の基礎を形成
する。そのような識別に用いられる方法は、１つのファミリーメンバーから得ら
れる核酸プローブを使用するクロスハイブリダイゼーションである。この方法で
は、遺伝子ファミリーの異なるメンバーから得た核酸配列を用いて、安定したハ
イブリッドの二重構造分子を形成することができる。または異なったファミリー
メンバーから核酸配列を増幅することができる。(Kaisho et al., FEBS Letters
266:187-191, 1990参照により本文に採用) 。異なったファミリーメンバーから
の配列はプローブと同じではないかもしれないが、プローブ配列と十分に関連し
ているのでプローブとのハイブリダイゼーションが行える。代替方法として、フ
ァミリーメンバーをさらに確認するため、１つのファミリーメンバーからのプラ
イマーを使用するＰＣＲを使用することができる。
【００７６】 上記方法では、これまで１つのファミリーメンバーであるGDNFしか知られてい
なかったため、他の遺伝子ファミリーメンバーの確認に成功していない。しかし
、係属中の特許出願第０８／５１９，７７７号でニュールツリンが確認されたこ
とで、この遺伝子ファミリーの保存的領域から配列を含むユニークで新しいプロ
ーブとプライマーを生成することができる。同じ保存的領域はまた第３のファミ
リーメンバー、ペルセフィンの中にも見出される。特に、新しいプローブとプラ
イマーを構築する基礎として使用できる３つの保存的領域が本発明で確認された
。ニュールツリン及びペルセフィンの研究によって利用可能になった新しいプロ
ーブとプライマーにより、この強力な新しい方法が可能になり、いまでは他の遺
伝子ファミリーメンバーを成功裡に識別することができるようになった。この新
しい方法を用いて、GDNFとニュールツリンの分子中の保存的領域に基づいてDNA
またはRNA のプローブを調製することにより、配列の相同性のあるGDNF、ニュー
ルツリン及びペルセフィンに関連した遺伝子の選別を行うことができる。したが
って、本発明の実施例の１つには、ヌクレオチド配列に固有またはそれらの配列
に由来するプローブとプライマーが含まれる。上述の配列はこのような保存的領
域および識別方法のコーディングを行う。これはニュールツリン- ペルセフィン
‐GDNF遺伝子ファミリーのメンバーをさらに識別するためである。
【００７７】 保存的領域のアミノ配列には以下の配列が含まれる。Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-
Leu-Gly-Tyr(うちXaa1はSer,Thr またはAla 、Xaa2はGlu またはAsp) (配列番号
（SEQ ID NO)：108); Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cy
s(うちXaa1はThr,Glu またはlys,Xaa2はVal,Leu またはIle,Xaa3はLeu またはIl
e,Xaa4はAla または Ser,Xaa5 はAla またはSer)( 配列番号（SEQ ID NO)：113)
;Cys-Cys-Xaa1-Pro-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Asp-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Phe-Leu-Asp-Xaa 9 （このうちXaa1はArg またはGln,Xaa2はTyr またはVal またIle,Xaa3はAla ま
たはSer,Xaa4はTyr またはPhe,Xaa5はGlu,Asp またはAla,Xaa6はGlu,Asp または
アミノ酸無し,Xaa7 はval またはleu,Xaa8はSer またはThr,Xaa9はAsp またはVa
l)（配列番号（SEQ ID NO)：114)。上記の保存配列または上記の保存配列の断片
のためのコーディング配列を含むヌクレオチド配列はプローブとして使用するこ
とができる。アミノ配列をコード化するプローブおよびプライマー配列の例には
、配列番号（SEQ ID ＮO)：１２５乃至１２９； その逆相補配列がアミノ酸配列
の配列番号（SEQ ID NO)：１２６、配列番号（SEQ ID NO)：１２７及び配列番号
（SEQ ID NO)：１２８をコード化するプライマー、及び特にヌクレオチド配列、
配列番号（SEQ ID NO)：１１５乃至１２９である。GDNF及びニュールツリンに基
づく追加的なプライマーは、アミノ酸配列、配列番号（SEQ ID NO)：３３、配列
番号（SEQ ID NO)：３６、配列番号（SEQ ID NO)：４０及び配列番号（SEQ ID N
O)：４１をコード化する核酸配列；その逆相補配列が配列番号（SEQ ID NO)：３
７、配列番号（SEQ ID NO)：３８及び配列番号（SEQ ID NO)：３９するプライマ
ー、及び特に核酸配列、配列番号（SEQ ID NO)：４２乃至４８である。
【００７８】 核酸配列の保存領域から得られた新しいプローブを使用するハイブリダイゼー
ションは、還元状態の刺激の強い条件下で行なわれるだろう。刺激の強い条件の
決定に係わる要素は、本技術でよく知られている (例えばSambrookほか、Molecu
lar Cloning, 2nd Ed., 1989参照により本文に採用) 。選別用の核酸の供給源に
は、哺乳類またはcDNAライブラリーから得られるゲノムDNA ライブラリーが含ま
れる。このライブラリーは、好適なベクター内へクローニングされた哺乳類の細
胞から得られるＲＮＡを用いて構築される。
【００７９】 ＰＣＲプライマーは低めのアニーリング（焼き戻し）温度のＰＣＲ条件下で利
用される。アニーリングによりGDNF、ニュールツリン及びペルセフィン以外の遺
伝子ファミリーメンバーからの配列の増幅が可能である。選別用の核酸の供給源
には、哺乳類からの好適なベクター内へクローニングされた哺乳類からのＤＮＡ
ライブラリー、哺乳類の細胞より得られたＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、そし
て哺乳類から採取されたゲノムＤＮＡが含まれる。
【００８０】 ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲアッセイに基づいて識別されたＤＮＡ配
列の配列決定を行った後、配列をGDNF、ニュールツリン及びペルセフィンと比較
する。すると本文に記述するのと同じ方法で、新しい因子の全配列をコーディン
グするＤＮＡ配列を得られる。また、ゲノムＤＮＡまたはゲノムクローンのライ
ブラリーも鋳型（テンプレート）として使用できる。なぜならGDNFおよびニュー
ルツリンのイントロン／エクソン構造は保存されており、成熟タンパクのコーデ
ィング配列はイントロンによって中断されないからである。
【００８１】 上述のアプローチを使用し、ニュールツリンGDNFの保存的領域から設計された
プライマーは本文で説明される新しいファミリーメンバー、ペルセフィンの配列
を識別し獲得するため使用されてきた。ペルセフィン、ニュールツリン及びGDNF
から設計された縮重プライマーは追加的なファミリー構成要素を識別し獲得する
ため更に使用されうる。
【００８２】 全てのGDNF‐ニュールツリン‐ペルセフィンファミリーメンバーは第１及び第
７のカノニカルフレームワークシステイン（図１２参照）の間の配列の部分では
３つの識別されたファミリーメンバーのうちの１つ以上に対して高い度合いの配
列同一性を有すると考えられている。特に、新しいファミリーメンバーは、共通
領域オクタペプチド、Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr ( うちXaa1はSer,Th
r またはAla 、Xaa2はGlu またはAsp) (配列番号（SEQ ID NO)：１０８)と６２ ．５％以上の同一性を有し; 共通領域オクタペプチド、Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-G
ly-Xaa2-Cys （うちXaa1及びXaa2はアラニン又はセリン (配列番号（SEQ ID NO)
：１０９)と６２．５％以上の同一性を有し; 共通領域オクタペプチド、Asp-Xaa 1 -Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Asp-Xaa4 ( うちXaa1はアスパラギン酸又はグルタミン酸 又はアミノ酸無し, Xaa2はバリン又はロイシン, Xaa3はセリン又はトレオニン,
Xaa4はバリン又はアスパラギン酸） (配列番号（SEQ ID NO)：１１０)と５０％ 以上の同一性を有することが期待されている。新しいファミリーメンバーは図１
５に示されるように、第１乃至第７の規定フレームワークシステイン残基の間に
整列された配列の中に２８のアミノ酸を有し、ファミリーメンバーのＮ末端から
番号付けされた残基は、(1) Cys,(3)Leu,(10) Val,(13)Leu,(14)Gly,(15)Leu,(1
6)Gly,(17)Tyr,(21)Glu,(25)Phe,(26)Arg,(27)Tyr,(28)Cys,(30)Gly,(32)Cys,(4
4)Leu,(47)Leu,(58)Cys,(59)Cys,(61)Pro,(66)Asp,(69)Phe,(70)Leu,(71)Asp,(8
3)Ser,(84)Ala,(87)Cys 及び(89)Cys であると考えられる。しかしながら、この
中には最大３つのミスマッチがありうる。
【００８３】 ニュールツリン及びGDNFに対するペルセフィンの構造的類似性に基づき、ペル
セフィンは、ニューロン細胞及び非ニューロン細胞の存続及び成長を促進すると
期待できる。例えば、ニュールツリンは上頸神経節細胞だけでなく、知覚神経節
ニューロン（図１〜３を参照）の生存を促進させることが分かった。更に、ＧＤ
ＮＦはドーパミン作動性、交感神経モータ及び数多の近くニューロンに作用する
ことが分かった（Hendersonら、1994の上記文献、Milesらによる、J. Cell Biol
130: 137‐148, 1995; Yanらによる Nature 373: 341‐344, 1995; Linらによ るScience 260: 1130‐1132., 1993; TruppらによるJ. Cell Biol. 130: 137‐1
48, 1995; MartinらによるBrain Res. 683: 172‐178, 1995; Bowenkampらによ るJ. Comp. Neurol. 355: 479‐489, 1995 本願の引用文献に編入される）。更 に、今日までに分離された全ての他の成長因子は、多くの異なる細胞タイプに作
用することが分かっている（例えば、ScullyとOtten, Cell Biol Int., 19: 459
‐469, 1005; Hefti, Neurotrophic Factor Therapy 25: 1418‐1435, 1994, 本
願の引用文献に編入される）。したがって、ペルセフィンは多種多様な神経細胞
、抹消及び中枢だけでなく、非神経系細胞に活性を示すであろう。抹消神経細胞
に関して、ペルセフィンが生存促進活性を示すであろう細胞のプロファイルは、
ニュールツリン又はＧＤＮＦのそれとは異なるであろう。交感及び知覚神経でお
ニュールツリン及びＧＤＮＦにより生産される生存促進活性と対照的に、ペルセ
フィンはテストした濃度での上記細胞では活性を示さなかった。しかしながら、
ラット胚脳から入手した中脳細胞において、生存促進活性を示した。更に、何れ
の特定のターゲット細胞タイプへのペルセフィン活性は、標準的基準モデルを利
用して、日常的な実験により決定した。
【００８４】 更に、発明者は本文において脳及び心臓組織をペルセフィンを発現する組織と
して識別し、これはペルセフィンが多様なニューロン細胞及び非ニューロン細胞
の生存及び成長を促進するよう作用しうる結論を裏付けする。
【００８５】 神経栄養因子の非ニューロン組織に対する作用の例として、始原型の神経栄養
因子NGF は、新生児ラットに注入すると、マスト細胞に作用してマスト細胞の数
を増加させる（Aloe, J Neuroimmunol 18:1-12, 1988）。更に、マスト細胞はtr
d レセプターを発現し、NGF はマスト細胞分泌促進物質であり生存促進因子であ
るかのようにNGF に反応する( 参照として組み込まれるHorigome外,Jbiol Chem2
69:2695-2707,1994) 。さらに TGF‐βスーパーファミリーのメンバーは、異な った機能と胚形成起源の多くの細胞タイプに作用する。
【００８６】 本願の発明者らは、組織として、ペルセフィンが発現する脳及び心臓を確認し
、ペルセフィンは多くの他の神経細胞及び非神経組織で発現すると、更に考えた
。関連するファミリーメンバーであるニュールツリンは、血液、骨髄、新生児肝
臓及びマスト細胞を含む多くの非神経系組織で発現する。これにより、ニュール
ツリンが造血、炎症、アレルギー及び心筋症にある種の役割を果していること示
唆している。同様に、ペルセフィンも同じ活性プロファイルを有する。
【００８７】 NGFファミリーの神経栄養因子は、因子特有の親和性の高いレセプターを経由 して作用すると考えられる（上記、Tuszynski and Gage, 1994を参照のこと) 。
レセプターの結合には、レセプター部位で作用するタンパクの特定部分だけが必
要とされる。そのような特定部分又は不連続断片は、物質がペルセフィンレセプ
ターを活性化し、細胞の生存や成長を促進する作用をひき出す場合に作用剤とし
て機能することが考えられる。また、その特定部分又は不連続断片は、レセプタ
ーに結合しても、レセプターを活性化せず、生存や成長を促進しない場合に、ペ
ルセフィンに対する拮抗剤として機能することも考えられる。作用剤としてのそ
のような部分／断片（フラグメント）、並びに、拮抗剤としての部分／断片も本
発明の範囲に含まれる。
【００８８】 合成による汎成長因子(pan-growth factor) も、ペルセフィンの活性領域を他
の１つ以上の成長因子の活性領域と結合させることによって構築することができ
る。（例えば、本文に引用したIlagほか、Proc Nat'l Acad Sci 92:607-611, 19
95を参照のこと) 。これらの汎成長因子はペルセフィンと１つ以上の成長因子を
結合した又は他の効果的な作用を有することが予想される。汎成長因子はそれ自
体で強力な特効薬となる成長因子であると考えられ、活性領域が得られた親因子
の全てによって治療可能な病状を含む種々の退行型の病気や病状を治療するのに
役に立つ。また、そのような汎成長因子は親因子の活性以上の相乗効果を発揮す
るかもしれない（上記Barresほか）。
【００８９】 本発明の範囲に含まれる汎成長因子には、少なくとも２つの成長因子の断片部
分から構成されるキメラまたはハイブリッドポリペプチドを含めることができる
。TGF‐βスーパーファミリーの成長因子は構造的に関連しており、高度に保存 された配列の標識をもち、ファミリーメンバーの識別に役立つ。特に、７個のカ
ノニカルフレームワークシステイン残基はスーパーファミリーメンバー中でほと
んど不変である(Kingsley, Genes & Dev 8:133-146, 1994参照により本文に採用
)(図１７参照) 。したがって、キメラのポリペプチド分子は、１つ以上の交差点
までのペルセフィン分子のいずれかの部分と実質的に同一の配列と、対応した一
つ以上の交差点の反対側に延びる別のTGF‐βスーパーファミリーメンバーの一 部分と実質的に同一の一つ以上の各配列とから構成することができる。例えば、
ペルセフィンポリペプチドのアミノ末端の端の一部はニュールツリンポリペプチ
ドのカルボキシ末端の端の一部と結合されうる。或いは、ニュールツリンペプチ
ドのアミノ末端の端の一部はペルセフィンポリペプチドのカルボキシ末端の端の
一部に結合されうる。ニュールツリン又はペルセフィンペプチドのそのような部
分は、好適には、約５〜約９５個、より好適には、約１０〜約９０個、更に好適
には約２０〜約８０個、最も好適には約３０〜約７０の隣接するアミノ酸の鎖で
あり、他の非ペルセフィン又は場合によっては非ニュールツリンのTGF‐βスー パーファミリーメンバーのそのような部分は、好適には約５〜約９５個、より好
適には約１０〜約９０個、更に好適には約２０〜約８０、最も好適には約３０〜
約７０個の隣接するアミノ酸の鎖である。例えば、３番目のシステイン残基と４
番目のカノニカルフレームワークシステイン残基との間には、特定の交差点があ
るかもしれない。このような模範的な１つの構造は、５’末端にペルセフィン配
列から成る配列を含む。この配列は、残基１から第３カノニカルフレームワーク
システイン残基３７を経て残基３７と残基６３との間のどこかにある交差点まで
が含まれるが、第４カノニカルフレームワークシステイン残基６４は含まれない
（成熟ペルセフィン配列番号、（SEQ ID NO)：８０を参照のこと）。ハイブリッ
ド構造の３’末端は、例えばニュールツリンのような他のTGF‐βスーパーファ ミリーメンバーに由来する配列を構成するだろう。このTGF‐βスーパーファミ リー因子はペルセフィンに密接に関連している。ニュールツリンをもう片方のTG
F‐βファミリー因子として使用して、交差点からのハイブリッド構造を構成す ることができる。その構造は、第３カノニカルフレームワークシステイン残基３
７と第４カノニカルフレームワークシステイン残基６７との間の所望の交差点で
始まり、ニュールツリンの３’末端の残基１００まで継続する配列から構成され
るだろう（アラインメントについては図１２を参照のこと）。二番目の模範的な
ハイブリッド構造は、ニュールツリンの残基３７と残基６７との間の交差点を通
る残基１がペルセフィンの残基９６を通る残基３７と残基６４との間の交差点か
らの残基に継続的に結合されてなる。ペルセフィンおよびニュールツリンを有す
る上記構造体は、特定のTGF-βファミリーメンバーを有する事例のみを意図した
ものだが、この因子は以下に述べる因子他を含むファミリーメンバーから選択さ
れる。それらの因子は、トランスフォーミング成長因子β１(TGFβ１）、トラン
スフォーミング成長因子β２(TGFβ２）、トランスフォーミング成長因子β３(T
GFβ３) 、インヒビンβＡ(INHβＡ）、インヒビンβＢ(INHβＢ) 、結節性遺伝
子(NODAL) 、骨形態発生タンパク類２および４(BMP２とBMP４) 、ショウジョウ バエ・デカペンタプレジック（Drosophila decapentaplegic）遺伝子(dpp) 、骨
の形態発生タンパク類５−８(BMP５、BMP６、BMP７及びBMP８) 、ショウジョウ バエ６０Ａ遺伝子ファミリー(６０Ａ) 、骨形態発生タンパク３(BMP３) 、Vg1 遺伝子、成長分化因子１と３(GDF１とGDF３) 、ドルサリン（drsln)、インヒビ ンα (INH α）、MIS 遺伝子、成長因子9(GDF-9)、グリア由来神経営養成長因子
(GDNF)、ニュールツリン（NTN)及びペルセフィン（図１６参照) である。なお、
交差点は、第１および第７カノニカルフレームワークシスティン分子と、特定の
片方ファミリーメンバーとの間に存在する残基のいずれでも構わない。更に、追
加的な交差点は所望の数のペルセフィン部分又は断片を任意の１つ以上の他のフ
ァミリーメンバーの部分又は断片に組み入れるのに使用されうる。
【００９０】 特定のキメラ分子を構成するには、ペルセフィンの一部と、もう片方の部分つ
まり非ペルセフィン成長因子をPCR を用いて増幅し混合して、ＰＣＲ反応用の鋳
型として使用する。この反応にはキメラ分子の２つの構成部分の一方からのフォ
ワードプライマー(forward primer)と、もう片方からのリバースプライマー(rev
erse primer)を使用する。そこで、ペルセフィンプラスミッドを鋳型として使用
して最初から第３および第４カノニカルシステイン残基の間に存在する選択交差
点までのペルセフィンの部分を増幅するために、例えばフォワードプライマ及び
リバースプライマーが選択される。次に、ペルセフィン配列と重複する５’部分
をもつフォワードプライマーと、リバースプライマーを用いて、もう片方の部分
、つまり対応交差点から３’末端までのTGF−βスーパーファミリーの非ペルセ フィン成長因子を増幅する。鋳型には非ペルセフィンTGF‐βファミリー因子の コーディング配列を含むプラスミド鋳型を使用する。２つのPCR反応から得られ た生成物をゲルで精製し、混合して ＰＣＲ反応を行う。このアリコートを鋳型 として、ＰＣＲ反応は非ペルセフィン成長因子のペルセフィンのフォワードプラ
イマーおよびリバースプライマーを用いて行う。次にこの生成物をキメラ分子生
成のため発現ベクターへクローニングする。
【００９１】 キメラ成長因子は細胞の成長と発達の促進に有効なことが予想され、ニューロ
ン特有の細胞の機能低下や変性、壊死の予防に使用できることが期待される。ま
た、キメラのポリペプチドは、キメラポリペプチドを構成する完全な因子の同一
レセプターの拮抗剤として作用する可能性があり、また上述のレセプターで作用
するその他の成長因子の拮抗剤としても作用する可能性がある。
【００９２】 また本発明には、細胞変性患者を有効量のペルセフィンで治療する治療法また
は調剤、あるいは治療的に有効な量のニュールツリンを投与することを含む方法
が含まれる。これらの組成および方法は多くの変性疾患の治療に有効である。細
胞変性がニューロンの変性に係わる場合、次のような疾病がある。末梢（ニュー
ロパシー）神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン氏
病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経系腫瘍、
多発性硬化症、末梢神経外傷か負傷、神経毒由来傷害、糖尿病また腎不全のよう
な代謝不全症などであり、特に、ペルセフィンが中脳細胞の生存を促進させる可
能性はこの成長因子がCNSのニューロン変性疾患、例えばパーキンソン病の治療 への適用可能性を示唆する。
【００９３】 細胞変性が骨髄細胞変性に係わる場合、好酸球減少および／または好塩基球減
少などの血球欠乏症を含む以下のような疾病がある。リンパ球減少、単球減少、
好中球減少、貧血、血小板減少、上記疾病のいずれにも共通する茎細胞欠乏など
である。細胞変性はまた心筋症又はうっ血性心不全といった疾病における心筋細
胞を含みうる。また、上記の細胞と組織の機能低下も治療可能である。
【００９４】 本組成と方法は、他の非ニューロン組織内の変性を防止するのみでなく、生存
の促進にも有効であろう。当業者なら周知の様々なアッセイを使用して特定の細
胞タイプの生存や機能の促進にニュールツリンが有効か否かをただちに判断でき
るはずである。
【００９５】 ある条件の下では、発現ニュールツリンの量を調整するか減少させるのが望ま
しいかもしれない。したがって、本発明のもう１つの側面では、ペルセフィンア
ンチセンス・オリゴノヌクレオチドが生産され、細胞のペルセフィン発現のレベ
ルを夫々減らすため利用される方法は、１つ以上のペルセフィンアンチセンス・
オリゴノヌクレオチドの投与からなる。「ペルセフィンアンチセンス・オリゴノ
ヌクレオチド」とは、ヌクレオチド配列を持ち、塩基対の組合せを通じて、特定
の相補的核酸配列と相互作用するオリゴノヌクレオチドを意味する。この相補的
核酸配列はペルセフィンの発現が抑制されるような仕方でペルセフィンの夫々の
発現にかかわる。好適には、ペルセフィンの発現にかかわる特定の核酸配列には
、ペルセフィン遺伝子の配列を含むゲノムＤＮＡ分子かmRNA分子がある。このゲ
ノムＤＮＡ分子には、ペルセフィン遺伝子の調節領域、ペルセフィンｍＲＮＡの
翻訳されていない領域、ペルセフィン遺伝子のプレ領域またはプロ領域、ペルセ
フィンタンパクのコーディング配列などが含まれる。したがって、ペルセフィン
アンチセンス（非転写）・オリゴノヌクレオチドおよび生産方法に関連して用い
られるヌクレオチド配列に「相補的であること」という用語は、ヌクレオチド配
列に対して十分相補的であるため、生理的条件下で細胞内の当該配列へのハイブ
リダイゼーションを可能にすることを意味する。ペルセフィンアンチセンス・オ
リゴノヌクレオチドは好適には、オリゴノヌクレオチドが約８〜約１００個のヌ
クレオチドを含む配列からなり、より好適には、約１５〜約３０個のヌクレオチ
ドから構成されることである。またペルセフィンアンチセンス・オリゴノヌクレ
オチドには、様々な一時変異を含む誘導体を含めることができる。この誘導体に
より、変異したヌクレオシドの相互結合（参照として組み入れられるUhlmann ＆
Peyman, Chemical Reviews 90:543-584, 1990; Schneider＆ Banner, Tetrahedr
on Lett 31:335, 1990）変異核酸塩基及び/又は糖などに対して抵抗力が与えら
れる。
【００９６】 本発明の治療的又は薬学的組成物は、例えば、その経路には静脈、皮下、筋内
、経皮、硬膜下腔内、大脳内などを含む従来技術において公知の適切な経路で投
与できる。投与は注射のように迅速な場合と、一定の期間に及ぶ輸液とか低速放
出剤による投与のいずれかに分かれる。中枢神経系で組織を処置するために、投
与は脳脊髄液(CSF) の中に注射か注入を使用することができる。ニュールツリン
を中枢神経系の細胞に投与する場合、投与は血液脳関門を越えてニュールツリン
の浸透を促進することができる１種以上の薬剤を同時に使用することができる。
【００９７】 ペルセフィンはまた、好適な処方上または薬理的特長を供与する薬剤に結合さ
せることができる。例えば、ペルセフィンは、本技術で周知のどんな薬物とも結
合し、抗体など血液脳関門を越えたトランスフェリンレセプターへの浸透または
移送を促進することが知られている。ペルセフィンは静脈注射によって投与する
ことができる。(Friden ほか、Science 259:373-377, 1993 参照により本文に採
用) 。さらに、ペルセフィン又はニュールツリンをポリエチレングリコールのよ
うな高分子に安定した結合を行い、溶離度、安定性、半減期などの望ましい特性
、その他薬学的に有利な特性を獲得することができる。 (Davis ほか、Enzyme E
ng 4:169-73, 1978; Burnham, Am J Hosp Pharm 51:210-218, 1994参照により本
文に採用) 。
【００９８】 一般に本組成は製剤の形で利用されている。こうした製剤は製薬技術でよく知
られている方法で製造される。１つの好適な製剤は、生理的食塩水を賦形剤とし
て利用するが、その他の薬学的に妥当な担体も検討されている。例えば、その他
の非毒性塩の生理的濃縮剤、５パーセントのグルコース溶液、無菌水などを使用
することができる。また、適当な緩衝液が組成に存在することも望ましいかもし
れない。このような溶液は、必要に応じて凍結乾燥させたうえ無菌アンプルに保
存し、無菌水の添加によっていつでも再形成し、ただちに注射できるように用意
することができる。主要な溶液は水であり、或いは、非水を溶液として用いる場
合もある。また、処置を必要とする組織に埋め込むことができる固形や、生物学
的に対応する準固形のマトリクスにペルセフィンを組み入れることもできる。
【００９９】 また、担体には薬学的に許容される他の賦形剤を用いて、薬剤のpH、容量オス
モル濃度、粘性、透明度、カラー、無菌性、安定性、溶離速度、臭気の変更ある
いは維持を行うこともできる。同様に、担体に他の薬学的に許容できる賦形剤を
さらに採り入れ、血液脳関門を越えて徐放、吸収または浸透を変更したり維持す
ることができる。そのような賦形剤は、単独投与か複数投与のいずれかによる非
経口投与、継続的または周期的な注入によって脳脊髄液中に直接注入を行うべく
調剤する場合に、一般に慣習的に使用される。
【０１００】 投薬は、投与量の定式化の薬物動力学的パラメータおよび使用される投与経路
に応じて繰り返すことができる。
【０１０１】 また、ペルセフィン又はニュールツリンを含むある種の調製剤には経口投与も
検討されている。そのような調製剤は、固形状の適当な担体と共に調製され、カ
プセルに入れられることが望ましい。好適的な担体、賦形剤および希釈剤の例に
は、ラクトース、ブドウ糖、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプ
ン、ガムアカシア、りん酸カルシウム、アルギン酸塩、けい酸カルシウム、微晶
質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、ゼラチン、シロップ、メチ
ルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネ
シウム、ステアリン酸、水、ミネラルオイル、その他の類似物質が含まれる。そ
のほか調製剤には、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤または芳香剤を用いることもある。
薬剤の調製においては、本技術でよく知られている手順をもちいて、患者へ投与
を行った後、急速な放出、持続的な放出、徐々の放出など有効成分の放出スピー
ドを調節するように調製することができる。また、調製剤にはタンパク分解によ
る変性を減少させる物質や、例えば表面活性剤などのように吸収を促進する物質
も使用できる。
【０１０２】 特定の投与量は、患者のおおよその体重、身体の表面積または身体の体積に従
って計算される。また、投与量は選択された投与経路を考慮して計算される。治
療のための適切な投与量を決定するのに必要な計算の精度の向上は、当業者によ
って日常的に行われている。かかる計算は、ペルセフィンの活性を考えて不適当
な実験を用いることなく当業者によって行われうる。ニュールツリンの場合に、
目的細胞中の活性のデータは本明細書及び係属中の特許出願第０８／５１９，７
７７号に開示されており、ペルセフィンの場合は、細胞レベルにおける活性に必
要とされる濃度はニュールツリンの濃度と同様であると考えられる。中脳細胞へ
のペルセフィン活性は、以下の図１７で報告する。特定の目的細胞タイプに対す
るペルセフィン活性は日常的な実験によって決定されうる。正確な投与量は標準
の投与量対反応の研究と組み合わされて決定される。実際の処方は医師によって
なされ、治療される患者の病状、投与される薬剤の選択、年齢、体重、および各
患者の反応度、患者の症状の程度など、情況を適切に考慮して決定されることは
理解されるであろう。
【０１０３】 本発明の１つの実施例として、ペルセフィンを患者のベクターまたは細胞に治
療的に移植することにより投与することである。ベクターまたは細胞は生物学的
に活性を示すペルセフィン又はペルセフィンの前駆体の形を生み出すことができ
る。ペルセフィン又はペルセフィンの前駆体は体内で生物学的に活性を示すニュ
ールツリンを生成できる細胞である。１つの方法では、ペルセフィンを分泌する
細胞を半透過性の膜に包んで患者に移植される。細胞は一般にペルセフィン又は
の前駆体を発現する細胞を用いてもよく、ペルセフィンル又はペルセフィンの前
駆体を発現させるため形質転換された細胞を用いてもよい。患者がヒトである場
合、ヒト起源の細胞であること、またペルセフィンがヒトのペルセフィンである
ことが望ましい。しかし、本文に記載する調製薬と方法は、獣医学的治療にもヒ
トの治療にも応用することができ、本文に使用される用語の「患者」は人間およ
び動物の患者を意図している。
【０１０４】 細胞は体外で増殖することが可能で、例えば患者への移植（又は、engraftmen
t ）に使用することができる( 参照により組み入れられるMuenchほか、Leuk & L
ymph 16:1-11, 1994) 。この発明の別の実施例では、移植用の細胞の体外増殖を
促進させるため、ペルセフィン又はニュールツリンを使用することができる。本
方法では、エリスロポイエチン、コロニー刺激因子、幹細胞因子およびインタロ
イキンなどの因子を含むバイオリアクタ培養法を使用し、赤血球、単球、好中球
、およびリンパ球のための造血先祖細胞を増大させた( 参照により組み入れられ
るVerfaillie, Stem Cells 12:466-476, 1994)。これらの幹細胞はヒトドナーの
骨髄、または、ヒト末梢血液、へその緒の血球から分離することができる。増殖
させた血球は、特殊な病状の結果、または悪性疾患治療のための大量投与化学療
法の結果、これらの血球が欠乏している患者の治療に使用される( 参照により組
み入れられるGeorge, Stem Cells 12(Suppl 1):249-255, 1994)。化学療法後の 細胞移植の場合、化学療法の前に骨髄細胞を採取し、悪性細胞を取り除く機能を
有する方法を使用して体外で細胞を増殖させ、化学療法後に増殖させた細胞を患
者に移植することによって、自系移植を行うことができる（詳細については、参
照として組み入れられるRummel & Van Zant, J Hematotherapy 3:213-218, 1994
を参照のこと) 。ペルセフィン及び関連する成長因子、ニュールツリンは発達中
の動物の血液、骨髄および肝臓など先祖細胞の増殖と分化が起こる組織に発現す
るため、ペルセフィンが造血幹細胞の増殖および、成熟した造血細胞の分化を調
節する機能を有し得ると考えられる。したがって、細胞の体外増殖に使用される
培養系にペルセフィンを添加することによって、細胞数の増殖または分化の速度
が刺激され、移植に必要な細胞を生み出すこれらの増殖系の効率を向上させる。
【０１０５】 また、神経系での前駆体細胞の体外増殖にもペルセフィンを使用することがで
きると思われる。細胞の移植は現在、例えばパーキンソン氏病における場合と同
様、ニューロンの一定数が変性のため失われる疾病の療法として研究されている
（参照として組み入れられるBjorklund, Curr Opin Neurobiol 2:683-689, 1992
)。ニューロン前駆体細胞を動物、ヒトドナーまたはヒト胎児の組織から採取し 、次にペルセフィンを使用する培養で増すことが可能である。またこれらの細胞
は、患者に移植することができ、患者の体内で変性のため失われた細胞部分に代
って機能する。ニューロトロフィンは、例えば交感神経神経芽細胞のNT-3刺激な
どのニューロンの前駆体細胞の生存と増殖を刺激することが実証されているので
（参照として組み入れられるBirren et al., Develop 119:597-610, 1993)、ペ ルセフィンは、神経系の発達期間に同様の方法で機能することがわかり、ニュー
ロン細胞の体外増殖に役立つかもしれない。
【０１０６】 多くの病状において、患者のペルセフィンレベルを測定することが望ましいで
あろう。ペルセフィンの識別およびペルセフィンが特定組織の数によって発現さ
れるという本報告は、ペルセフィンの存在が細胞の成育および生存に関連して、
正常な生理学的機能を補助するという結論の根拠を提供している。事実、他の神
経栄養因子はニューロンと非ニューロン組織の機能においてある種の役割を果た
すことが知られている。（詳細については参照として組み入れられるScully＆ O
tten, Cell Biol Int 19:459-469, 1995; Otten and Gadient, Int J Devl Neur
osciences 13:147-151, 1995を参照のこと）。また、内因栄養的に作られたペル
セフィンも、ある種の病状、特に神経変性状態や疾患などにおける細胞変性があ
る場合に、ある種の役割を果し得る。他の神経栄養因子は疾病の間に変化するこ
とが知られている。例えば、多発性硬化症の場合、脳脊髄液におけるNGF タンパ
クのレベルは急性の疾病の段階で増加する(Bracci-Laudiero et al., Neuroscie
nce Lett 147:9-12, 1992 参照により本文に採用)。さらに全身性紅斑性狼瘡の 場合、炎症性のエピソード（症状の出現）と、血清中のNGF レベルとの間には相
関関係がある(Bracci-Laudiero et at., NeuroReport 4:563-565, 1993参照によ
り本文に採用)。
【０１０７】 ペルセフィンが特定組織中で発現し、同様に、ペルセフィンが発現すると考え
られる場合、ペルセフィンのレベルが様々な病状で変異し、ペルセフィンレベル
の定量化が臨床的に有益な情報を提供するであろう。さらに変性的病状の処置に
おいて、ペルセフィンを含む組成を投与することができ、さらに血清、脳脊髄液
または任意の必要な組織の部分においてペルセフィンの一定目標レベルを達成す
ることは望ましいに違いない。したがって患者の特定の成長因子、ペルセフィン
のレベルをモニターできることは有益であろう。以上の理由で、本発明は患者か
らのサンプルからペルセフィンの存在を検出するをも提供する。
【０１０８】 患者内のペルセフィンの有無を検出するという文脈で本文に使用される用語「
検出」には、以下の項目、即ち、患者内のペルセフィンの量又は患者内でペルセ
フィンの量を発現する能力の検出、ペルセフィンをその他の成長因子から見分け
ること、変性的疾病の考えられる結果及び回復の見込みに関する予測の評価、病
状の目安としての一定期間にわたるペルセフィンのレベルの監視、及び、患者の
ための好ましい治療的処方を決めるためのペルセフィンレベルの監視が含まれる
。
【０１０９】 患者内のペルセフィンの存在を検出するため、患者からサンプルを採取する。
サンプルは組織生検サンプルか血液、プラズマ、血清、ＣＤＦのサンプルまたは
類似のものでもよい。ペルセフィンは例１８に示すように腎臓及び脳組織中で発
現され、ペルセフィンも同様にテストされなかった組織の中で発現すると考えら
れている。従って、ペルセフィンを検出するためのサンプルは、ペルセフィンを
発現するあらゆる組織から採取することができる。末梢部分のペルセフィンのレ
ベルを評価するとき、サンプルは血液、プラズマまたは血清のサンプル、又は生
体組織サンプルであることが望ましい。中枢神経系のペルセフィンのレベルを評
価するとき、望ましいサンプルは脳脊髄液から採取されるサンプルである。
【０１１０】 いくつかの例では、ペルセフィン遺伝子が患者体内か、患者の組織か細胞系で
何らかの影響を受けていないかどうか調査することが望ましい。「無傷の(intac
t)ペルセフィン遺伝子」とは、ペルセフィンの生産物を変えるか、或いは、生物
学的活性や安定性などが変え、疾病過程若しくは細胞変性病状の感染生じさせる
点変異、欠失、挿入、染色体切断、染色体の配列換え、及び、その他の変化が遺
伝子に起きていないことを意味する。逆に、「無傷ではない(non-intact)ペルセ
フィン遺伝子」とは、このような変化が起きていることを意味する。したがって
、本発明の一実施例では、ペルセフィン遺伝子のあらゆる変異を検出し、特徴付
ける方法を提供している。この方法は、ペルセフィンのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
ないしその断片またはその誘導体を含むオリゴヌクレオチドを供与する。「オリ
ゴヌクレオチドの誘導体」とは、抽出された配列が、オリゴヌクレオチドが抽出
された配列と実質的に同じであることを意味し、この場合、抽出された配列は、
ペルセフィン遺伝子とハイブリダイゼーションを行うために、オリゴヌクレオチ
ドが抽出された起源配列と十分に相補性のある配列を有する。抽出されたヌクレ
オチド配列は必ずしも物理的にヌクレオチド配列から抽出されるとは限らず、化
学合成、ＤＮＡ複製、逆転写過程または転写などの方法でも生成することができ
る。
【０１１１】 典型的に、患者のゲノムＤＮＡは患者から採取された細胞サンプルから分離さ
れ、例えばTaqIやAluIなどの１つ以上の制限エンドヌクレアーセで消化される。
周知技術であるサザンブロット法を用いて、このアッセイは、患者ないし患者の
特定組織に、正常なペルセフィン遺伝子、又は、異常ペルセフィン遺伝子のいず
れが存在するかを判定する。
【０１１２】 ペルセフィン遺伝子とのハイブリダイゼーションには、一本鎖のDNA を採取す
るための染色体DNA 変性が伴うだろう。そのほかにも、ペルセフィン遺伝子配列
に関連した遺伝子プローブによる一本鎖のＤＮＡへの接触、さらに、少なくとも
ヒトのペルセフィン遺伝子の一部を含む染色体ＤＮＡを検出するハイブリッド形
成されたＤＮＡプローブを確認することが伴うであろう。
【０１１３】 本文で使用される用語「プローブ」とは、プローブ配列が目的部位において配
列と相補性があるため、目的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチ
ドから成る構造を指している。プローブはターゲット配列の正確な配列を反映し
ている必要はないが、増幅されるべきストランドと選択的にハイブリダイズする
のに十分相補的でなければならない。選択的ハイブリダイゼーション又は特定ハ
イブリダイゼーションとは、ポリヌクレオチドがターゲットポリヌクレオチドと
優先的にハイブリダイズすることを意味する。また、プローブとしての使用に適
したオリゴマーは最低約８‐１２個の連続したヌクレオチドを有し、このヌクレ
オチドは目的（ターゲット）配列に対して相補性をもつ。好適には最低約１５個
までのヌクレオチドを有し、ポリヌクレオチドは約２０のポリヌクレオチドまで
、本発明の範囲内では、約１００個のポリヌクレオチド又はそれ以上をプローブ
する。
【０１１４】 本発明のペルセフィン遺伝子プローブは、ＤＮＡ又はＲＮＡオリゴノヌクレオ
チドであることが予想され、例えば、切り出し、転写または化学合成など従来公
知のいずれの方法によっても生成することができる。プローブは、例えば放射性
または蛍光標識または酵素のマーカーのような従来公知の任意の検出可能なラベ
ルによって標識化することができる。プローブの標識化はＰＣＲ、ランダム・プ
ライミング、末端のマーク付け、ニック翻訳などの技術で知られるいずれかの方
法によっても達成することができる。また、当業者であれば、ハイブリダイゼー
ションを決定するのに標識化されたプローブを使わない他の方法を使用し得るこ
とを認識するであろう。ハイブリダイゼーションを検出するのに使用することが
できる方法の例にはサザンブロット法、蛍光による切片上（in situ)ハイブリッ
ド形成法、及びＰＣＲ増幅による１本鎖の立体配座多型現象などがある。
【０１１５】 ハイブリダイゼーションは通常、２５〜４５℃、好適には３２〜４０℃、最も
好適には３７〜３８℃で実行される。ハイブリダイゼーションに必要な時間は約
０．２５〜約９６時間までで、より好適には約１〜約７２時間、最も好適には約
４〜約２４時間までである。
【０１１６】 ペルセフィン遺伝子異常は、ＰＣＲ法、及び、ペルセフィン遺伝子内に側接触
若しくは存在するプライマーを使用することによって検出され得る。ＰＣＲ方法
は周知技術である。簡潔に言えば、この方法は２つのオリゴヌクレオチドプライ
マーを使用して実行されるが、かかるオリゴヌクレオチドプライマーはペルセフ
ィン遺伝子内部に存在するターゲット配列に側接触し、ターゲット配列を増幅す
る核酸配列にハイブリッド形成させ得る。本願にて使用される用語「オリゴヌク
レオチドプライマー」は、約８〜約３０個の塩基の長さをもつＤＮＡかＲＮＡの
短い鎖を指す。上流および下流プライマーは、長さで最低約１５のヌクレオチド
から約２０のヌクレオチドであることが好ましく、約３０のヌクレオチド又はそ
れ以上であることが好ましい。そのプライマーは側接触領域にハイブリッド形成
をしてヌクレオチド配列を複製する。重合は、二本鎖のＤＮＡ分子を生産するた
め、デオキシヌクレオチド三リン酸塩若しくはヌクレオチド類似体の存在下で、
ＤＮＡポリメラーゼによる触媒作用を受ける。次に、二重鎖は、物理的、化学的
または酵素の作用を利用する変性法により切り離される。一般的に、物理的変性
法では通常約８０℃〜１０５℃で約１分〜約１０分間核酸の加熱を行う。この過
程は必要なサイクル数だけ繰り返される。
【０１１７】 プライマーは増幅されるＤＮＡ鎖に実質的に相補的であるように選択される。
したがって、プライマーは、鋳型の正確な配列を表す必要はないが、増幅される
DNA 鎖と選択的にハイブリッド形成するために十分相補的でなければならない。
選択的ハイブリダイゼーション又は特定ハイブリダイゼーションとは、ポリヌク
レオチドがターゲットポリヌクレオチドと優先的にハイブリダイズすることを意
味する。
【０１１８】 ＰＣＲ増幅の後に、ペルセフィン又はプレプロペルセフィンまたはその断片を
包含するDNA 配列は、直ちに配列決定され、活性若しくは発現レベル等を変える
可能性がある変異を確認するため、本発明で明らかにされている配列と比較分析
される。
【０１１９】 別の実施例として、ペルセフィンの検出法を呈示する。これはペルセフィン遺
伝子遺伝子を発現する組織の分析を根拠としている。以下の例１８で確認された
特定組織は、ペルセフィン遺伝子を発現することが判明した。同方法では、ポリ
ヌクレオチドを、通常ニュールツリン遺伝子を発現する組織のサンプルからのmR
NAに、又はサンプルのｍＲＮＡから生産されたｃＤＮＡにポリヌクレオチドプロ
ーブをハイブリッド形成される。サンプルは、ペルセフィン遺伝子に、或いは、
特定の細胞のペルセフィン遺伝子に異常を持つと疑われる患者から入手される。
基準ペルセフィンポリヌクレオチドプローブは、以下の誘導体又は断片がペルセ
フィンｍＲＮＡに、又はペルセフィンｍＲＮＡから生産されたｃＤＮＡから特別
にハイブリダイズする限り、配列番号(SEQ ID NO)：１７９、１８０、１９０、 １９１、２０３−２０６及びそれらの誘導体又は断片を含む。
【０１２０】 ペルセフィンタンパクタンパクをコード化するｍＲＮＡの存在を検出するため
、患者からサンプルを採取する。サンプルは血液または組織生検サンプルからも
得られる。サンプルはそこに含まれる核酸を抽出するため処理してもよい。サン
プルから採取された核酸はゲル電気泳動か他のサイズ分離器にかけられる。 サンプルのｍＲＮＡを、ハイブリッド二本鎖を形成するプローブとして機能す
る核酸と接触させる。上記の標識プローブの使用によって、生成された二重らせ
んの検出が可能になる。
【０１２１】 ペルセフィンタンパクタンパクをコード化するｃＤＮＡまたはｃＤＮＡの誘導
体をプローブとして使用する場合、非常に厳格な条件を作り出して偽陽性を防ぐ
ことができる。偽陽性とは、実際に混じりけの無い、機能しているペルセフィン
遺伝子が存在しない場合に、ペルセフィンヌクレオチド配列のハイブリダイゼー
ションおよび外観が検出されることである。ペルセフィンのcDNAから得られる配
列を使用する場合は、さほど厳しくない条件を用いることができる。しかしこの
方法では偽陽性が起こりがちなのであまり勧められない。ハイブリダイゼーショ
ンの厳格さはハイブリダイゼーションおよび洗浄過程においていくつかの要素で
決定される。例えば、温度、イオン濃度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度
などである。これらの要素は例えば、Sambrookほかで概説されている (上記、Sa
mbrookほか、1989）。
【０１２２】 ペルセフィンタンパクタンパクをコード化するmRNAのサンプルの検出の精度を
増加させるため、逆転写過程／重合連鎖反応(RT/PCR)の技法を使用して、ペルセ
フィンタンパクタンパクをコード化するmRNAから転写されるｃＤＮＡを増幅する
ことができる。ＲＴ/ＰＣＲ法は本技術でよく知られている（例９と図６を参照)
。
【０１２３】 ＲＴ/ＰＣＲ法は以下の通り実行することができる。総細胞ＲＮＡは、例えば 、標準のグアニジウム（guanidium)イソチオシアン酸法によって分離でき、総Ｒ
ＮＡが逆転写される。逆転写過程方法では、逆転写酵素と３'末端プライマーを 使用して、ＲＮＡの鋳型上でＤＮＡの合成を行うことができる。通常は、プライ
マーにはオリゴ(dT)配列が含まれる。次に、このようにして生成されたｃＤＮＡ
を、ＰＣＲ法とニュールツリン固有のプライマーを使用して増幅する。 (参照と
して組み入れられるBelyavsky ほか、 Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Kru
g and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152, pp.
316-325, 1987 ) 。
【０１２４】 ポリメラーゼ連鎖反応法は、増幅されるべきＤＮＡセグメントの二つの側結合
領域に実質的に相補性がある二つつのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて上
記の通り実行される。
【０１２５】 増幅に続いて、ＰＣＲ生成物は電気泳動された後、エチジウムブロミド染色法
またはリン酸造影法によって検出される。
【０１２６】 本発明はさらに、患者から採取されるサンプル中のペルセフィンタンパクの存
在を検出する方法を提供する。従来技術で公知のタンパク検出方法のいずれも使
用することができる。そのような方法には、免疫拡散法、免疫電気泳動、免疫化
学法、バインダー配位子分析評価、免疫組織化学技法、凝集および補体測定法な
どがあるが、これらに限られない。（例として、Basic and Clinical Immunolog
y, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 19
91参照により本文に採用) 。望ましいのはバインダー配位子免疫検定法であり、
この方法は、ペルセフィンタンパク又はその誘導体のエピトープ又はエピトープ
類と抗体を反応させ、又は、標識ペルセフィンタンパク若しくはそれらの誘導体
を競合的に置き換えることを含む。
【０１２７】 上記の通り、ペルセフィンタンパクの誘導体にはポリペプチドを含めることを
意図しており、ポリペプチド中ではある種のアミノ酸は、欠失、置換、変異で異
常なアミノ酸に変化しており、そこでペルセフィン誘導体は生物学的にペルセフ
ィンに相当し、及び/又はポリペプチド誘導体はペルセフィンタンパクに対立す る抗体と交差反応する。「交差反応」とは、抗体が、その生成を誘発した抗原以
外の抗原と反応することである。
【０１２８】 多数の競合的・非競合的タンパク結合免疫アッセイ法は従来技術において周知
である。そのようなアッセイで用いられる抗体は、例えば凝集テストでの使用の
ために標識化（マーク）されない場合や、様々なアッセイ法での使用のために標
識化されることもある。使用できる標識として、例えば、放射性核種、酵素、フ
ルオレッサー（fluorescers)（蛍光剤）、ケミルミネセッサー（chemiluminesce
rs）（化学発光剤）、酵素基質、補因子、酵素抑制剤、粒子、染料などがあり、
ラジオ免疫アッセイ(RIA) 法、酵素免疫アッセイ法（例：酵素結合免疫吸着アッ
セイ(ELISA) 法）、蛍光免疫検定などを用いてマークされる。
【０１２９】 従来技術において公知のいずれの方法によっても、ペルセフィンタンパク及び
ニュールツリンタンパクに対応するポリクローン抗体、単クローン抗体、又は、
それらのエピトープを免疫アッセイ法に使用することができる。「エピトープ」
とは、ポリペプチドの抗原のデターミナント（決定基）のことである。用語「エ
ピトープ」には、ペルセフィン特異Ｂ細胞エピトープ又はＴヘプパー細胞エピト
ープをも含む。１個のエピトープは、エピトープ特有の空間立体配座の中の３個
のアミノ酸によって構成される。一般にエピトープは５個以上のかかるアミノ酸
から成る。アミノ酸の空間立体配座を決定する方法には、従来技術で公知である
、例えばエックス線結晶学と二次元核磁気共鳴などがある。
【０１３０】 タンパクに対応する抗体を調製する１つの方法には、配列を化学的に合成して
、合成した配列を通常ウサギかマウスなどの適切な動物に注入し、タンパクのす
べてまたは一部のアミノ酸配列を選択、調製することが含まれる (例１０参照)
。
【０１３１】 オリゴペプチドはペルセフィンタンパクに対応する抗体を生成するための候補
として選択することができる。これはオリゴペプチドが親水性領域に存在するた
め、成熟タンパクの中で露出しているという事実にもとづいている。
【０１３２】 ペルセフィンに対する抗体は、抗体が他のファミリーメンバーと交差反応し得
るように識別された一つ以上の保存的部位を含むオリゴペプチドに対しても持ち
出される。こうした抗体は他のファミリーメンバーの確認や分離に使用すること
ができる。
【０１３３】 ペルセフィンタンパクタンパクまたはそのエピトープの調製のための方法には
、化学合成、組換え体DNA 技法または生物サンプルからの分離その他がある。例
えば、固相ペプチドの化学合成は、古典的なメリーフィールド（Merrifeld)法(M
errifeld, J Am Chem Soc 85:2149, 1963 参照により本文に採用) 、または迅速
自動化複合ペプチド合成装置を用いたFMOC法などで行うことができる(DuPont Co
mpany, Wilmington, DE) (参照により組み入れられるCaprino and Han, J Org C
hem 37:3404, 1972)。
【０１３４】 ポリクローナル抗体は、ウサギか他の動物に抗原を注入し、続いて適切な間隔
をおいたブースター注入を行うことにより免疫性を与えて調製できる。その方法
は通常ELISA またはバイオアッセイを用いて、動物から採取された血清のアッセ
イを精製ペルセフィンタンパクに対して行う。これはニューロンまたは他の細胞
に及ぶペルセフィンの作用をブロックする能力に基づくものである。鳥類、例え
ば、にわとり、七面鳥などを使用するときには、卵の卵黄から抗体を単離できる
。単クローン抗体の調製はMilsteinとKohlerの方法にしたがって行うことができ
る。これは骨髄腫やリンパ腫細胞などの腫瘍細胞を絶え間なく複製することによ
って免疫マウス脾細胞を溶断する方法である。（Milstein and Kohler Nature 2
56:495-497, 1975; Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunoche
mical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981
参照により本文に採用)。次にこうして形成されたハイブリドーマ細胞抗体のク ローン生成を行う。その方法には、ELISA 、RIA 、バイオアッセイなどで生成さ
れた抗体をアッセイする限界希釈法やスーパネート（supernates）がある。
【０１３５】 目的タンパクを認識し限定結合する抗体のユニークな能力によって、タンパク
の過剰発現を処置する方法が得られる。したがって本発明の別の面は、ペルセフ
ィンタンパクの過剰発現が関与する疾病を予防する方法や、ペルセフィンタンパ
クに対して特異抗体をもつ患者を治療する方法を提供することである。
【０１３６】 ペルセフィンタンパクに特異性を示すポリクローン抗体またはモノクローン抗
体などの特異抗体は、本技術で知られる既述の適切な方法によって生成すること
ができる。例えば、ネズミまたはヒト単クローン抗体はハイブリドーマ技術によ
って生成することができる。その他、ペルセフィンタンパク、その断片で免疫学
的に活性のあるもの、抗イデオティピック（idiotypic)抗体、その断片などを動
物に投与することにより、ペルセフィンタンパクを識別できそれに結合できる抗
体を生産する方法もある。こうした抗体はどのようなクラスの抗体からも得られ
、例としてIgG 、IgA 、IgM 、IgD 、IgE 他があり、鳥類の場合、IgY および抗
体のどのようなサブクラスからも得られる。
【０１３７】 本発明の好適な実施例は以下に続く例に記述されている。請求の範囲に含まれ
るその他の実施例は、開示された明細書又は本発明の実施例を検討することによ
り当業者には明らかになるであろう。本明細書並びに以下の例の記載の意図は、
以下の例に続く請求の範囲に示された本発明の範囲及び精神に関する例示に過ぎ
ない。
【０１３８】 例１ 本例は調製済培地にあるCHO 細胞からのニュールツリン（neurturin ）の分離
と精製について説明する。調製済培地にあるCHO 細胞の準備: DG４４チャイニーズハムスターの卵巣細胞の誘導体、DG44CHO-pHSP-NGFI-B(CH
O)細胞を使用した(Dayほか、J Biol Chem 265:15253-15 260, 1990 参照により
本文に採用) 。前述のように、発明者はまた、DG４４チャイニーズハムスター卵
巣細胞の他の誘導体から部分的に精製されたニュールツリンを得た。CHO 細胞は
150cm2フラスコ(Corning Inc., Corning NY)内の20ml培地に維持された。この培
地は１０％のウシ胎児の血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT) 、2mM l-グル
タミン、100U/ml のペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび25nMメ トトレキセートを含有する最低必須培地(Minimum Essential Medium, MEM) アル
ファ(Gibco-BRL No. 12561, Gaithersburg, MD) である。継代と増殖を改善する
ため、当該融合フラスコからの培地を吸引した。細胞は10mlリン酸塩緩衝食塩水
(PBS)(濃度：KH2PO4 0.144g/l 、Na2HPO4 0.795g/l、NaCl 9.00g/l) にて洗浄し
、次に、フラスコを２〜３分間、2ml の0.25%トリプシンでPBS の中で培養した 。続いて、細胞をフラスコ表面から振り落とし8ml の培地を加えたあと、ピペッ
トで何度か粉砕した。次に、細胞を５分の１か10分の１に分け、CO2 ５％を含む
大気中で３７℃で３〜４日間培養して融合させた。
【０１３９】 次に、細胞培養を850cm2のローラーボトルの中へ展開させた(Becton Dickinso
n, Bedford, MA)。150cm2の融合フラスコのトリプシン化を行い、上述のMEM 培 地からメトトレキセートを除いた変更培地240ml が含まれるローラーボトル(1本
の)に移植した。水素イオン濃度(pH)の維持は、５％のCO2 を含有する空気でお おうか、または培地を25mM HEPES(pH7.4) (Sigma, St. Louis, MO)で調製するこ
とにより行った。ローラーボトルは１分間に０．８〜１．０の回転数で回転させ
た。細胞は４日で融合状態に達した。
【０１４０】 調製済培地を採集するため、無血清CHO 細胞(SF-CHO)培地を使用した。SF-CHO
は１：１DME/F１２を主成分とする培地を用いて準備した。それには１：１(v/v)
DMEM(Gibco-BRL product No. 11965, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)をHam のF
１２(Gibco-BRL product No. 11765)と混合して調製した。最終的なSF-CHO培地 は以下のような成分を含有していた。15 mM HEPES (pH7.4) (Sigma, St. Louis,
MO)、0.5mg/mlのウシ血清アルブミン(BSA, Sigma, St. Louis MO)、25μg /ml
のヘパリン(Sigma, St. Louis, MO)、1Xインシュリントランスフェリン亜セレン
酸塩剤 (ウシのインシュリン 5μg /ml 、ヒトのトランスフェリン ５μg /ml 、ナトリウム亜セレン酸塩５ ng/ml)(Sigma, St. Louis, MO)、2mMl- グルタミ ン、100U/ml のペニシリン、および100μg /ml のストレプトマイシンである。 融合ローラーボトルから培地を取り出し、細胞を３０mlSF-CHO培地で１回洗浄し
て血清タンパクを取り除いた。次に、細胞を80mlSF-CHO培地中で３７℃で１６〜
２４時間培養して、血清タンパクをさらに取り除いた。こうして８０mlの培地を
取り除き廃棄した。SF-CHO培地１２０ml をフラスコに加え、細胞を３７℃で培 養した。その後は、48時間毎に１２０ml を採取し、同量のSF-CHO培地と取り替 えた。
【０１４１】 採取した培地を集めて、ポリプロピレン製円錐管の中で４℃で遠心分離して細
胞くずを取り除き、上澄みは-70 ℃で保存された。培地は１０日間で５回集めら
れ、ローラーボトル１本当り合計約600ml の調製済培地を得た。
【０１４２】 精製の各段階でカラムから集められた分画の生物学的活性を調べるため、ニュ
ーロン生存アッセイを行った。タンパクの含有量についてはブラッドフォード法
(染色結合アッセイ) (Anal Biochem 7 2:248 et seq., 1976 参照により本文に
採用) 。調製済培地の開始量 (一般に50リットル) 中のタンパクの総質量 (mg)
を決定した。上頚部神経節生存アッセイ: 前述した上頚部神経節生存アッセイ法(Martin ほか、J of Cell Biology 106:
829-844; Deckwerth and Johnson, J Cell Bio 123:1207-1222, 1993参照により
本文に採用) を用いて、CHO 調製済培地の開始材料の神経栄養性活動および様々
な段階における精製を評価した。上頚部神経節(SCG) からの交感神経ニューロン
の初代培養を準備した。その方法としてまず受胎後20〜21日目のラットの胎児(E
20-E21) から得た組織を解剖した。SCG をl-グルタミン培地(Cat#11415-023 Gib
co-BRL, Gaithersburg, MD) と共にLeibovitz のL15 培地に入れ、Leibovitz の
L15 培地の中で1mg/mlのコラゲナーゼ(Cat #4188 Worthington Biochemical, Fr
eehold, NJ) で３７℃で３０分間消化させた。次にトリプシン低圧下凍結乾燥お
よび放射線照射により３０分間消化させた(Type TRLVMF Cat #4454 Worthington
Biochemical, Freehold, NJ) 。続いて、一部変更されたHanks のバランスド
ソルト ソリューション（Balanced Salt Solution)(平衡食塩水) (Cat #H-8389
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)に再懸濁した。消化の停止に用いた材料 は以下の通りである。Earle の塩を含みl-グルタミンを含まないMEM 培地を含む
AM50(Cat #11090-016 Gibco-BRL)、10% のウシ胎児血清(Cat #1115 Hyclone Lab
oratories 、Logan 、UT)、2mM l-グルタミン(Cat #G5763 Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO)、20μM FuDr(F-0503 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、2
0μM ウリジン(Cat #3003 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、100U/ml のペ
ニシリン、100 μg/mlストレプトマイシン、および50 ng/ml 2.5SNGF。シラン化
され炎でつや出ししたパスツールピペットを用いて細胞を解離させ、単独細胞と
して溶液に懸濁させた。次に、ナイテックス（nitex)フィルタ（サイズ3-20/14
、Tetko Inc., Elmsford, NY)を用いて懸濁液をろ過させた後、非ニューロン細 胞数を減らすため、細胞を上記の通りAM50培地に入れ、100mm のファルコン（Fa
lcon）またはプリマリア（Primaria）培養皿(Becton Dickinson Labware, Linco
ln Park, NJ)で再び平板培養した。２時間後に、互いに付着していないニューロ
ン細胞を含む培地を取りだし、シラン化され炎でつや出ししたパスツールピペッ
トを用いて再び粉砕した。単独細胞の浮遊液を、あらかじめ二層のコラーゲンで
コーティングされた（第１層ではコラーゲンがアンモニアと化合しており、第２
層ではコラーゲンが空気乾燥させられた）２４ウエル ティッシュ プレート（
24ーwell tissue plates）(Costar, Wilmington, MA)上で平板培養した。こう
した層は３０分から２時間付着が可能であった。生存可能な特定数の細胞（１ウ
エル当りの細胞数は約1200〜約3000個）または特定割合の神経節（通常、１神経
節当り得られる細胞量の25%)を各ウエルに移し平板培養した。細胞カウントを行
う場合は、上述の通り24ウエルティッシュプレートに置くか、または代替方法と
して２ウエルのチャンバスライド上に置いてもよい (Nunc, Naperville, IL) 。
次に、培養液を５〜６日間37℃で5% CO2/95%空気とAM50培地で培養した。同培地
をNGF を欠く培地および０．０５％のヤギ抗NGFと交換することによって、培養 ニューロンの壊死を招いた（ウエル中の最終タイターは１：１０)。このように してNGF を枯渇させることにより２４〜７２時間後にニューロンの壊死が起こっ
た。NGF 除去の時点で、部分的または完全に精製された因子のアリコート（Aliq
uots）または適切な対照を培養に加えて、ニューロンの壊死を防ぐ能力を決定し
た。
【０１４３】 ニューロンの壊死を防ぐカラム分画、ゲル溶離液または精製因子の能力評価は
、位相差顕微鏡の下で培養液を直接観察することにより行った。生存可能なニュ
ーロンは完全な軸索を維持し位相が明るいままで残っていたが、壊死したニュー
ロンはしなびて位相は暗く、不規則な細胞膜を持ち、軸索は断片になっていた（
図３)。生存ニューロンの正確な数量化が必要な場合には、PBS の中で培養を４ ％のパラホルムアルデヒドか１０％のホルマリンで固定し、ゲンチアナ・バイオ
レット溶液で染色した(Huntoon Formula Harleco E.M. Diagnostics Systems, G
ibbstown, NJ) 。２４ウエル培養皿を使用する場合は、１０％ホルマリンを含有
する各ウエルに１μｌのゲンチアナ・バイオレット溶液を加えた。そして位相差
顕微鏡下で細胞のカウントを行った。２ウエルのチャンバスライドを使用する場
合は、培養を固定し、ゲンチアナ・バイオレットで染色した後、水で脱色し、続
いて対トルエン濃度の高いエタノール中で培養を脱水させた。そしてトルエンベ
ースのスライド用溶液で固めて顕微鏡用のスライドを作った。ニューロンに透明
な核小体および核が存在し、ゲンチアナ・バイオレットで明瞭に染色された場合
はそのニューロンは生存していると判定した。
【０１４４】 ７２時間後のニューロンの壊死を図３（Ｂ）で示した。また、同図には（Ａ）
神経成長因子で維持された陽性対照細胞、（Ｃ）ニューロンの生存を示す抗NGF およびニュールツリン（約3ng/ml) で処置された細胞も示した。
【０１４５】 活性度は「生存ユニット」の計算で数量化した。サンプル中の総生存ユニット
はサンプルのアリコートの最少量と定義され、それはサンプルの総ボリュームを
最大生存で割って算出した。比活性度は生存ユニットを総タンパク(mg)で除して
算出した。
【０１４６】 「生存ユニット」は、約１２００の個の生存可能なニューロンを0.5ml の培養
アッセイの中で、４８時間培養させた後、分留を加えるというアッセイにより算
出した。生存は４８時間後に顕微鏡下で観察した。図４で示す本質的な活性度は
、約2700個のニューロンおよび７２時間の培養期間のアッセイで決定した。生存
の評価は、ニューロンを固定した後、生存ニューロン数を数えて行った。活性度
の半減期から予想されるように、ニュールツリンの安定度は、ニューロンの数が
増加するに従って減少するので、固有活性度の測定値は、「比活性度」の測定値
から予測される数値よりも低いことが予想される。また、固有活性度の測定値は
、生存が４８時間でなく７２時間後に測定されたため、比活性度によって予測さ
れる活性度よりも低いことが予想される。
【０１４７】 これらの活性ユニットのアッセイの再現性を確保するため、最初のニューロン
培養を再現可能な細胞濃度で培養する必要があった。これはニューロンの密度が
増加するに従い、活性度の安定性が著しく減少するからである。細胞濃度の範囲
は、１ウエル当り約1200〜2700個であった。アッセイ培地中の可溶ヘパリンの存
在は、生存活性度の短期の(３日以内) 安定性にはなんら影響がなかった。ニュールツリンの精製: プールされた調製済培地を0.2 μｌ孔ボトルトップフィルタ（セルロースアセ
テートメンブレン、Corning Inc., Corning, NY)でろ過した。ろ過には標準的な
50リットルの調製済培地を用いて、25リットルのバッチで処理した。各25リット
ルのバッチを、1 分間20mlの速度で５×５cmカラムへ導入した。このカラムには
150mM NaClを含む25mM HEPES(pH7.4) 緩衝液で平衡にされた100ml のヘパリンア
ガロース(Sigma, St. Louis, MO)が含まれていた。次に、0.5M NaCl(20ml/min) を含む約1000mlの25mM HEPES(pH7.4)緩衝液でカラムを洗浄し、続いて1.0M NaCl
を含む25mM HEPES (pH7.4) 緩衝液で培地を溶離させた。1.0M NaCl 溶離緩衝 液に交換した後、最初の50mlの緩衝液は捨てられ、その後、300ml の分画１本を
採取した。
【０１４８】 ヘパリン−アガロース・ カラムから溶離されたプール物質を、1:1(v/v)の割合
で、0.04% のツイーン 20(TWEEN 20)を含む25mM HEPES (pH7.4)緩衝液を用いて 希釈して0.5M NaCl の濃度を得、これを16mlのSP SEPHAROSE・ハイパフォーマン
ス(High Performance)イオン交換樹脂(Pharmacia, Piscataway, NJ) を含む1.5c
mｘ9cm カラムへ導入した。このイオン交換樹脂は0.5M NaCl と0.02%のTWEEN 20
を含む25mM HEPES(pH7.4) 緩衝液で中和されていた。次に、カラムを0.5M NaCl と０．０２％のTWEEN 20を含む25mM HEPES (pH7.4) 緩衝液160ml で洗浄し、続 いて1.0M NaCl と0.02%のTWEEN 20を含む25mM HEPES (pH7.4) 緩衝液で、2 ml／
分のフローレートで溶離させた。カラムからの最初の7ml の溶離を捨てた後、50
mlの分画１本を採取した。
【０１４９】 SP SEPHAROSE・カラムから溶離された物質を、高速タンパク液体クロマトグラ
フィ(FPLC)を使用して、Cu++で電荷の付与されたChelating Superose HR 10/2カ
ラム上で分画させた(Pharmacia, Piscataway, NJ) 。カラムは、準備しておいた
10mlの水で洗浄し、3ml の2.5mg/ml CuSO4・5H2Oで電荷付加し、10mlの水で洗浄
し、且つ1.0M NaCl および0.02%のTWEEN20 を含む10mlの25 mM HEPES(pH7.4)緩 衝液で平衡状態にした。溶離物質を、1.0M NaCl 含有の25mM HEPES(pH7.4) 緩衝
液で満たされたコラムヘ1.0 ml／分の速度で導入した。結合タンパクを、1.0M N
aCl 含有の25mM HEPES(pH7.4) 緩衝液の中でグリシンの濃度を一定の率で増加さ
せながら(0-300 mM)、1.0 ml／分の速度で溶離させた。濃度の勾配は、LCC-500
制御装置とP-500 ポンプを使用するPharmacia FPLC装置によって作りだし、0-30
0mM のグリシン濃度勾配40mlを1.0 ml /分の速度で得た。その結果、グリシンの
濃度勾配を１分当り7.5mM 増加させることができた。SCG 生存促進のため1ml の
分画１本を採取しアッセイを行った。活性度のピークは分画１７‐２０ 、すな わち勾配の初めから１７‐２０分後または17-20ml のところで観測された。
【０１５０】 インラインUVモニターによる280nM の吸光度測定値では、ほとんどのタンパク
が分画１７‐２０の生存活性度以前に溶離したことを示した。したがって、重要
な精製はこのステップで達成された。25kDバンドは生存活性度で準精製された。
【０１５１】 Cu++ superose カラムからの結合溶離分画は、0.02%のTWEEN 20含有の25mM HE
PES緩衝液 (pH7.4)を使用して0.45M NaClに希釈され、Mono S HR 5/5 陽イオン 交換カラム(Pharmacia, Piscataway, NJ) に導入され、FPLCの精製をさらに進め
た。カラムのpH値は、0.02% のTWEEN 20を含む45M NaCl含有の25mM HEPES 緩衝 液 (pH7.4)で平衡とした。結合タンパクはNaClの濃度を一定の率で増加させなが
ら(0. 45-1.0M)で溶離させた。濃度勾配は上記のように35mls の0.45M-1.0M NaC
l から1.0 ml /分で作り出され、その結果、濃度は１ミリリットル当りまたは１
分当り0.0157M で増加した。1.0ml 分画13本（分画1-13) を、続いて0.5ml 分画
44本 (分画14-53)を採取した。SCG アッセイにおける活性のピークは分画26-29
において見られた。SCG生存アッセイにて各分画を0.5ml の培養当り0.1 〜1.0 μｌの範囲でアッセイした。
【０１５２】 各断片の１パーセント(5μｌ）を、非還元性の14% のSDS ポリアクリルアミド
・ゲルへ移し、25℃、750V−時で電気泳動させた。タンパクは銀染色法よって視
覚的に観察可能となった。結果を図２に示す。ゲル上のレーンＭに示されるマー
カーは、（分子量の重い方から軽い順に) 20ngのウシの血清アルブミン、炭酸脱
水酵素、B-ラクトグロブリン、およびリゾチームを表す。
【０１５３】 25 kD バンドが分画25-30に現れ、28kDタンパクは勾配の前半で溶離され、18k
Dは勾配の後半で溶離された。図２は各分画における生存活性度を示す。生存活 性度は、分画25-30の25kDタンパクの存在と見かけの強度に一致していることが 明らかである。
【０１５４】 25kDバンドが生存促進活動の原因となっていることを示すために、25kDタンパ
クを電気泳動の後ポリアクリルアミド・ゲルから溶離させて、SCG アッセイで生
存活性度のアッセイを行った。前述のように、非還元性の14% のSDS-ポリアクリ
ルアミドゲルの１つのレーンで、150 μｌのSP SEPHAROSE・ 1.0M NaCl分画を電
気泳動させた後、レーンを12スライスに切り分け、各スライスを25℃で18時間、
25mM HEPES (pH7.4)、0.5M NaCl 、0.02% のTween-20を含んでいる緩衝液の中で
、前後運動による拡散で破砕させ溶離させた。BSA を溶離物質に最終濃度が200
μg/mlになるまで加え、次に、アクリルアミド・ゲル断片を取り除くため、溶離
液を0.45ミクロンのフィルタを通してろ過した。次にサンプルを濃縮させ精製さ
せるため、ろ過液をSP SEPHAROSE・カラムに加えた。サンプルを溶離させる前に
、カラムを、１ml当り0.5M NaCl 、0.02%のTween‐20および200 μg のBSAを含 む400 μｍｌの25mM HEPES緩衝液 (pH7.4)で一度、１ml当り0.02%のTween-20と2
00 μg のBSAを含む400 μｌ lの25mM HEPES緩衝液 (pH7.4)で一度、洗浄した。
次に、カラムを再び、１ml当り0.5M NaCl 、0.02%のTWEEN 20および200 μg のB
SA を含む400 μｌの25mM HEPES緩衝液(pH7.4) で洗浄した。サンプルを、１ml 当り1.0M NaCl 、0.02%のTween‐20および200 μｇのBSAを含む25mM HEPES緩衝 液 (pH7.4)で溶離させた。続いてサンプルの生存活性度を分析した。25kDバンド
に対応するスライスだけが生存活性の証拠を示した。調製済培地のＣＨＯ細胞か
ら精製された25kDタンパクはホモダイマーであると考えられる。
【０１５５】 上述の精製過程により、５０リットルのＣＨＯ細胞による調製済培地から得ら
れた収穫量は、標準的に１-１．５mg であった。全体的な回収は、１０-３０%で
あると見積もられ、約３９万倍の精製がもたらされた。
【０１５６】 上記工程を利用した段階的精製を表２に示す。
【０１５７】
【表１】 例２ 本例は、ＳＣＧアッセイにおけるニュールツリンおよび成長因子のTGF-βファ
ミリーのいくつかのメンバの特徴づけならびに、抗ＧＤＮＦ抗体のニュールツリ
ンとの相互反応性の欠如について説明する。
【０１５８】 精製タンパクのＳＣＧアッセイでは、同因子の濃度が約3ng/mlまたは約100pM
のとき活性度が最高になり、拡散性ペプチド成長因子については EC50 は約1.5n
g/mlまたは約50pMの予想範囲にあることを示した（図４）。
【０１５９】 TGF‐βファミリーのメンバのあるものは交感神経系ニューロンの神経ペプチ ド遺伝子発現に影響を及ぼすが、他のものは異なるニューロン個体群の生存を促
進する。ニュールツリン（タンパクのこのファミリーの遠縁因子である）は、交
感神経系ニューロンのほぼ完璧な生存を３日間促進させることができる。さらに
、SCG細胞の培養をさらに進めることによって、ニュールツリンが、NGFの除去後
、少なくとも１０日間これらのニューロンを維持し続け得ることが明らかになっ
た。
【０１６０】 我々はSCG アッセイで、TGF‐β１、アクチビン（activin)、BMP‐２、BMP‐ ４、BMP‐６およびGDNFを含む、TGF‐βファミリーの他のいくつかのメンバーを
テストして、これらの因子の生存促進能力を調べた。これらの因子の中では、GD
NFだけが生存促進の活性を有していた。しかし、GDNFの生存促進の活性はニュー
ルツリンよりもはるかに弱く、３日間の生存アッセイでは2‐4 nMのEC50を示し た。このアッセイでテストされたGDNFはrhGDNFで、prepro Tech, Inc., Rocky
Hill, N. J.から入手した大腸菌（E.coli）から生成した。また、GDNFの活性の 持続時間もニュールツリンの活性より短く、３日間以上生存を維持させるGDNF(5
0ng/ml) の能力はいちじるしく縮小された。これらの実験は、GDNFがニュールツ
リン受容体に対する弱い作動物質である可能性を示唆している。さらに、アクチ
ビンおよびBMP‐2に生存促進能力がないのとは対照的に、これらのニューロンに
神経伝達物質関連の遺伝子発現を誘導する高度な活性がある(Fann and Paterson
, Int J Dev Neurosci 13:317-330, 1995; Fann and Patterson, J Neurochem 6
1:1349-1355, 1993)ことは、アクチビンやBMP‐２が別のレセプターまたは情報 伝達系路を通じてシグナルを伝達していることを示唆している。
【０１６１】 抗GDNF抗体の部分精製ニュールツリンとの相互作用性を決定するため、例１に
説明したごとく、解剖され平板培養されたSCG ニューロンを、６日目に抗NGFの み存在するなかで、または抗GDNFおよび抗NGF(大腸菌由来のrhGDNFに対するヤギ
の IgG抗体, R & D Systems, Minneapolis, Minn) が存在するなかで、1ng/ml、
3ng/ml、10ng/ml 、または30ng/ml のGDNF(Prepro Tech, Inc, Rocky Hill, N.
J.) によって処置した。ニュールツリンの部分的に精製した1.0M SP Sepharose
分画を約375pg/ml、750pg/ml、1.5ng/mlおよび3 ng/ml の濃度でアッセイに使用
した。この分画は、抗NGF のみ存在する場合、および抗NGF と抗GDNFが存在する
中でテストした。抗GDNF抗体は30ng/ml までの濃度でGDNFの生存促進活性を阻止
したが、ニュールツリンの生存促進活性は阻止しなかった。
【０１６２】 例３ 本例では、結節性神経節生存アッセイでの知覚ニューロンへのニュールツリン
の効果について説明する。
【０１６３】 結節性神経節を使用して知覚ニューロンに対するニューロトロフィンの作用を
調べるため、SP Sepharoseカラムで部分的に精製されたCHO 細胞の調製済培地を
アッセイした。生存アッセイは上頚部神経節に関して先に述べたアッセイを修正
したものである。最初のに解離した結節性神経節の培養組織は、E１８スプラグ ダウレイ（Sprague Dawley）子ネズミからの組織を細切して準備した。組織が
細切されるにつれ結節性神経節を2mM l-グルタミンと共にライボビッツ（Leibov
itz)のL15 に置いた(Cat# 11415-023, GIBCO-BRL. Gaithersburg, MD) 。次に、
ライボビッツのL１５培地において３７℃で３０分間１mg／mlのコラゲナーゼに よって蒸解し(Cat#4188, Worthington Biochemical, Freehold, New Jersey）、
続いてトリプシン中で３０分間消化させた（凍結乾燥および照射が行われた typ
e TRLVMF, Cat #4454 Worthington Biochemical, Freehold, NJ)あと、変更Hank
's Balanced Salt Solution(Cat #H-8389 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
で0.25%の最終濃度へ再懸濁した。消化の停止に用したのは、 AM0-BDNF100、ア ーレ（Earle)の塩を含み１−グルタミンを含まないMEM 培地(#11090-016 GIBCO-
BRL)、10% のウシ胎児血清(Cat #1115, Hyclone Laboratories, Logan, UT)、2m
M l-グルタミン(Cat #G5763 Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) 、20μMの
FuDr(F-0503, Sigma Chemical Co.) 、20μM のウリジン(Cat #3003, Sigma Che
mical Co., St. Louis, Mo.) 、100 U/ mlのペニシリン、100 μg/mlのストレプ
トマイシン、および100ng の脳由来ニューロトロフィン因子(BDNF, Amgen, Thou
sand Oaks, CA)などである。AMO-BDNF１００培地の中でシラン化され炎でつや出
ししたパスツールピペットを用いて、細胞を単独細胞の懸濁液として溶離させ、
続いて非ニューロン細胞を排除するため100mm のファルコン（Falcon）またはプ
リマリア(Primaria)の培養皿 (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ)
にあらかじめ平板培養させた。２時間後に、結合していないニューロン細胞を含
む培地をこれらの皿から取り除き、シラン化され炎でつや出しされたパスツール
ピペットを使用して再び粉砕した。単独細胞の浮遊液を、あらかじめ二層のコラ
ーゲンでコーティングされた（第１層ではコラーゲンがアンモニアと化合してお
り、第２層ではコラーゲンが空気乾燥させられた）２４ウエル培養プレート(Cos
tar, Wilmington, MA)上で平板培養した。こうした層は３０分から２時間付着が
可能であった。生存可能な特定数の細胞（１ウエル当りの細胞数は約1200〜約30
00個）または特定割合の神経節（通常、１神経節当り得られる細胞量の25%)を各
ウエルに移し平板培養した。E１８ラット胎児１０体からの神経節を2.5mlsの培 地に溶離させ、この懸濁液100 μｌを各ウエルに加えた。細胞を、３７℃で３０
分間微生物培養器で５％ CO2/９５％の空気で付着させた。ウエルにはAM0-BDNF
100 を一晩中与えた。
【０１６４】 翌日、細胞を２０分間、３回洗浄したが、各回ともAM0 培地にはBDNFがなかっ
た。ウエルにこの培地0.5ml を単独でまたはこの培地に50ng/ml のNGF 、100ng/
mlの BDNF(Amgen, Thousand Oaks, CA) 、100ng/mlのGDNF (Prepro Tech, Inc.,
Rocky Hill, N.J) か、3ng/mlのニュールツリンかのいずれかを含むものを与え
た。細胞を３７℃、5% CO2/95%エアー培養器で３日間培養したあと、１０％のホ
ルマリンで固定し、ゲンチアナ・ バイオレット (１μｌ／ml 10%フォルマリン)
で染色し、カウントを行った。前述のように生存が確認された。
【０１６５】 図１０は、７２時間後のニューロンの死を示す。BDNFで培養された結節性ニュ
ーロンのニューロンの生存は先に報告した(Thaler ほか、Develop Biol 161:338
-344, 1994参照により本文に採用) 。これはこうしたニューロンの生存の規格と
して使用され、１００％の生存値が与えられた。栄養(AMO) を全く与えられなか
った結節性神経節は、50ng/ml NGF 中で培養されたニューロンと同じく２０％〜
３０％の生存率を示した。3ng/mlニュールツリンを含みBDNF (100 ng/ml)を含ま
ない培地で培養されたニューロンは、BDNF(100ng/ml)を含む培地で培養されたニ
ューロンと同様の生存率を示した。GDNFは100ng/mlの濃度のとき、BDNF(100ng/m
l)に比べて結節性ニューロンの生存をはるかに促進した。GDNFに関する同様の発
見が、にわとりの知覚ニューロンについて最近報告されている(Ebendalほか、J
Neurosci Res 40:276-284 1995参照により本文に採用)。
【０１６６】 例４ 本例では、調製済培地のＣＨＯ細胞から分離されたニュールツリンの部分アミ
ノ酸配列の決定について説明する。
【０１６７】 精製されたニュールツリン約１μｇのサンプルからN 末端アミノ酸配列を得る
ため、活性のピークを含むMono S分画２６‐２９を、ミクロコン（microcon）-3
濃縮装置(Amicon, Inc., Beverley, MA)を用いた遠心超ろ過で25μｌに濃縮し、
14% の非還元性SDS ポリアクリルアミド・ゲルに移した。続いて電気泳動による
分離を行った後、タンパクをPVDFメンブレン(Bio-Rad, Hercules, CA) に電気ブ
ロット（blot）し、０．１％のクーマジー（Coomassie)ブルーで染色した。25kD
バンドを切り取り、自動シーケンサの反応カートリッジに挿入した(Model 476,
Applied Biosystems (Foster City, CA)。自動シーケンサーの最初の2-3 サイク
ルでエドマン分解（Edman degradation ）によるフェニルチオヒダントインアミ
ノ酸(PTH-aa)の回収は、４ｐモル（ｍｏｌ）の配列収量を示した。４ｐモル（ｍ
ｏｌ）はSDS ゲル上に置いた推定タンパク量の約１０％であった。
【０１６８】 N-末端の配列決定は、各５０リットルの精製サンプル２組から２回実行した。
最初の実行では、総量1.5ml のプール分画３本中のタンパク１μｇを、5%のメタ
ノールを含む10mM CAPSpH11.0 の電気ブロットバッファ(Sigma, St. Louis, MO)
を使用して25μｌに濃縮し、２時間25℃、100Vで電気ブロットを行った。アミノ
酸配列は13サイクルのエドマン分解から得られ、配列収穫量は上記と同様４ｐモ
ノ（moles)だった。
【０１６９】 ２番目の実行では、総量2.0ml のプール分画４個本中のタンパク1.5 μｇを、
25mMのトリアミノメタン、192mM のグリシン、0.04% のSDS および17%のMeOHの 電気ブロットバッファを使用して25μｌに濃縮し、１２時間４℃、３６V で電気
ブロットを行った。配列収量は15ｐモル（moles)で、16サイクル後の配列はSGAR
PXGLRELEVSVSであった（配列番号（SEQ ID NO)：３）。１６サイクル後に得られ
た配列は、最初の実行で得られた短い配列に対応した。配列のアミノ酸残基のう
ち３つについては確定ができなかった(N‐末端からの残基１、６および11) 。タ
ンパクデータベースの検索では著しく相同な配列は検出されず、精製因子が新種
のタンパクであることを示唆した。
【０１７０】 この初期のN 末端のアミノ酸配列データでは、変性オリゴノヌクレオチドをPC
R プライマーか選別ライブラリのプローブとして使用するｃＤＮＡクローンの分
離を実現できなかった。これらのアプローチを容易にするため、タンパクをさら
に精製して、タンパク分解断片から内部アミノ酸配列が得られた。ニュールツリ
ンから内部アミノ酸配列を得るため、前述のクロマトグラフィーの最初の３ステ
ップだけを使用して、50リットルのCHO 細胞による調製済培地をさらに精製した
。ただし、Cu++キレーティングSuperoseカラムの溶離に使用した濃度勾配は異な
り、0-60のmMグリシン(4ml) 、60mMのグリシン(10ml)、60-300のmMグリシン(32m
l)を使用した。ニュールツリンを含む分留No. 20-23 を超ろ過(Amicon microcon
3, Amicon, Beverley, MA) によって25μｌに濃縮し、非還元性のポリアクリル
アミドゲルSDS 上に移した。電気泳動の後、ゲルをクーマジー（Coomassie)ブル
ーで染色し、25kDニュールツリンバンドを切り取った。ニュールツリンをゲル・
スライス内でエンドプロテイナーゼLys-C で消化させ、溶離されたタンパク分解
断片を逆位相のHPLCによって精製した。溶離ペプチドのHPLC分離時に１つのピー
クだけが観察されたが、自動シーケンサーを使用して、溶離ペプチドから１ｐモ
ルシグナルレベルで２３サイクルにわたりアミノ酸配列情報を得た（内部断片P2
, 配列番号（SEQ ID NO)：５)。
【０１７１】 消化させる前の上記サンプル１０％で行ったアミノ酸分析では、７．６％のリ
ジンと１９．５％のアルギニンから成るゲル・ スライス中に150 ｐモルのタンパ
クが存在すること示した。Lys-C 消化からの単独の低いピークは、ペプチドの消
化と溶離の効率が悪いことを示した。同じゲル・ スライスをトリプシンと共に再
消化させ、溶離ペプチドをHPLCで分離した。２つのピークがHPLC上で観察され、
結果としてのN-末端と前出の内部アミノ配列(４‐５pモルシグナルレベル、内部
断片P1, 配列番号（SEQ ID NO)：４および内部断片Ｐ３, 配列番号（SEQ ID NO)
：６)と異なる２つ追加の１０の残基アミノ配列の解明につながった。ペプチド の本来の部位での消化、溶離、精製、およびペプチド配列は、エール大学のW. M
. Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory で本実験の標準プロト
コルに従って実行された。
【０１７２】 例５ 以下の例はマウスとヒトニュールツリンｃＤＮＡクローンの分離と配列分析に
ついて説明する。
【０１７３】 逆転写されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡ配列を増幅するため、様々な長さの確実
なアミノ酸配列データに対応する変性オリゴノヌクレオチドを、ポリメラーゼ連
鎖反応(ＰＣＲ) におけるプライマーとして合成し使用した。フォワード（fowar
d）プライマー(M1676; 5'‐CCNACNGCNTAYGARGA, 配列番号（SEQ ID NO)：５０)
は、ペプチド配列P2 Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Ala-Lys-Pro-Cys-Cys-Gly-Pro-Thr-Ala
-Tyr-Glu-Asp-Xaa3-Val-Ser-Phe-Leu-Ser-Val(Xaa1およびXaa2は不明,Xaa3 はGl
n またはGlu) (配列番号（SEQ ID NO)：５）に対応する。リバース（reverse ）
プライマー(M1677; 5'‐ARYTCYTGNARNGTRTGRTA （配列番号（SEQ ID NO)：５２)
は、ペプチド配列Ｐ３(Tyr-His-Thr-Leu-Gln-Glu-Leu-Ser-Ala-Arg) (配列番号
（SEQ ID NO)：６)に対応する。これらのプライマーを用いて、E２１ラットおよ
び成熟マウス脳から得られたｃＤＮＡ鋳型からの６９ヌクレオチド生成物を増幅
するのに使用した。ＰＣＲパラメータは：94℃で30秒；55℃で30秒；72℃で１分
間を３５サイクルを用いた。生成物をブルースクリプト（Bluescript)KS プラス
ミドにサブクローニングして配列決定した。すべてのヌクレオチド配列決定を、
Applied Biosystems社の自動シーケンサーModel #373 (Applied Biosystems, Fo
ster City, CA)でメーカーの指示に従い、蛍光染料ターミネーター技術を使用し
て行った。配列決定のためのプラスミドDNA は、メーカーの指示に従いウイザー
ド ミニプレップ（Wizard Miniprep)キット(Promega社、Madison 、WI) を使用
して生成した。増幅された生成物の配列は、ＰＣＲプライマーより内部のアミノ
酸配列データを正しく予測した。
【０１７４】 増幅された配列に対応するプライマーを縮重プライマーと共に用いて、cDNA末
端(RACE)技法(Frohman, M.A. Methods in Enzymology 218:340-356, 1993) の高
速増幅を行った。これにはメーカーの指示にしたがい、マラソン(Marathon) RAC
E キット(CLONTECH 、Palo Alto 、CA) を使用したが、メーカーの指示と異なる
のは、スーパースクリプトII（SuperscriptII)の逆転写酵素(Gibco-BRL) を使用
して最初のcDNA鎖の合成を50℃で実行したことだった。簡潔に述べると、二本鎖
のアダプタ・ オリゴノクレオチドを、生後１日目のラットの脳のmRNAから合成さ
れた二本鎖のｃＤＮＡの末端に結合させた。繰り込まれたフォワードニュールツ
リンＰＣＲプライマー(M1676; 5'‐CCNACNGCNTAYGARGA, 配列番号（SEQ ID NO) ：５０ and 1678; 5'‐GACGAGGGTCCTTCCTGGACGTACACA,配列番号（SEQ ID NO)： ５３) をキット(AP1, AP2)供給の結合アダプタに対応するプライマーと組み合わ
せて使用し、ニュールツリンｃＤＮＡの３'末端を２つの連続したPCR 反応によ って増幅した（初回：M1676 およびAP1,94℃で30秒、55℃で30秒、続いて72℃で
２分を35サイクル使用で; ２回目: M1678 およびAP2,94℃で30秒および68℃で２
分を35サイクル使用で) 。結合ｃＤＮＡを鋳型として使用した２つの連続したPC
R 反応で、ラットのニュールツリンｃＤＮＡの5'末端を得た。１回目の反応はプ
ライマーM1677(配列番号（SEQ ID NO)：５２) とＡＰ１を用いた。パラメータは
94℃を30秒、55℃を30秒；次に、72℃を２分、３５サイクル使用。２回目の反応
は、M1679 5'-TAGCGGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT(配列番号（SEQ ID NO)：54
) およびＡＰ２を用いて、９４℃で３０秒、６８℃を２分を３５回くり返すパラ
メータで行った。これらの反応の結果、ニュールツリンｃＤＮＡの５'末端の上 部欠損形が生成されたが、これは明らかに逆転写過程における時期尚早なｃＤＮ
Ａの終了の結果である。これらの５'および３'RACE生成物をプラスミッド ブル
ースクリプト（Bluescript)KS にサブクローンし、配列決定を行った。これらの
３'と５'末端RACE生成物の配列は、ラットニュールツリンの部分的なｃＤＮＡ配
列２２０ntとなった。ラットの部分的なｃＤＮＡ配列に対応するプライマー(#46
7921 ５'-CAGCGACGACGCGTGCGCAAAGAGCG, 配列番号（SEQ ID NO)：５５；及び M1
679 (配列番号（SEQ ID NO)：５４) を用いて(ＰＣＲパラメータ：９４℃で３０
秒および６８℃で１分、これを３５サイクル)、ラットニュールツリンｃＤＮＡ 配列と相同のマウスゲノムDNA からの１０１ヌクレオチドＰＣＲ生成物を増幅す
るのに使用した。
【０１７５】 次に、これらのプライマーを、Ｐ１バクテリオファージベクターのマウス129/
Svライブラリーで、遺伝子片の増幅がされているネズミ科ニュールツリンゲノム
クローンを得るのに使用した(library screening service of Genome Systems,
Inc., St. Louis, MO)。ニュールツリン遺伝子を含むこのＰ１クローンからのA1
. 6kb Nco I 断片をプライマー(#465782; 5'-TAYGARGACGAGGTGTCCTTCCTGGACGTAC
ACAGCCGCTAYCAYAC, 配列番号（SEQ ID NO)：５６) とのハイブリダイゼーション
で確認した。このNco I 断片は、N-末端およびCHOの細胞の調製済培地から分離 された活性タンパクの配列決定から得られる生体アミノ配列に対応するコーディ
ング配列の鎖を含むことが判明した。このヌクレオチド配列は精製されたタンパ
クのN 末端のアミノ酸配列で始まり、11.5kDの予測分子量をもつ１００アミノ酸
タンパクをコード化する。タンパクと核酸データベースの検索によって、ニュー
ルツリンがグリア由来神経栄養因子（GDNF) と約４０％まで一致する新種のタン
パクがであることを確認した。GDNFは、中脳のドーパミン性ニューロンの生存を
促進し、TGF‐β上位ファミリーの遠い親戚のメンバとして精製されクローン化 された。このTGF‐β上位ファミリーには現在までのところ、様々な増殖・分化 活性をもつ２５を超す異なった遺伝子が存在している。GDNFはTGF‐βファミリ ーの他のどの因子と比べても、その共通性は２０％未満であるが、７つのシステ
イン残基をファミリー全体にわたって保存し、TGF‐β２の水晶構造測定で観察 された保存型システイン結節構造の基礎であると信じられる。ニュールツリンも
これらの７つのシステイン残基を含むが、GDNFのようにTGF‐βファミリーの他 の因子と比較しても相同性は２０％未満である。したがって、ニュールツリンお
よびGDNFは、成長因子の下位ファミリーを表し、TGF‐β上位ファミリーの残り の因子から相当離れているように見える。
【０１７６】 マウスのニュールツリンｃＤＮＡの全長配列を測定するため、５'および３'RA
CE PCRを上記のようにラットで実行したが、この場合、新生マウスの脳からのマ
ウスゲノム配列とｃＤＮＡから予想された繰り込みプライマーを使用した。3'末
端用の最初の反応のプライマーには: M1777 5'‐GCGGCCATCCGCATCTACGACCGGG（ 配列番号（SEQ ID NO)：5 7 ）、及びAP1 を用いて、94℃で30秒; 65℃で15秒、
68℃で2 分を35回繰り返すパラメータで行った。2 番目の反応にはプライマー#4
67921(配列番号（SEQ ID NO)：５５）とAP2 を使用し、94℃で30秒; 65℃で15秒
、68℃で２分を20回くり返した。 ５'‐末端は最初の反応プライマーM1759 に５
'‐CRTAGGCCGTCGGGCGRCARCACGGGT（配列番号（SEQ ID NO)：５８）およびAP1 を
使用して、94℃で30秒; 65℃で15秒、68℃で2 分を35サイクルの条件で行った。
２番目の反応にはプライマーM1785 、5５‐GCGCCGAAGGCCCAGGTCGTAGATGCG（配列
番号（SEQ ID NO)：59) およびAP2 を使用したが、条件は94℃で30秒; 65℃で15
秒、68℃で2 分を20サイクル。両セットのPCR 反応には5%のDMSOを含めた。マウ
スの5'と3'RACE生成物をプラスミッドブルースクリプトKSにサブクローンし、配
列を決定した。RACE生成物を使用し、1.0kb のマウスニュールツリンｃＤＮＡ配
列を組み立てることができる。このｃＤＮＡ配列には、24kDの分子質量のタンパ
クをコード化する５８５ヌクレオチドの開放読取り枠が含まれる。図７にこのマ
ウスcDNA全長配列を示す（配列番号（SEQ ID NO)：１２) 。TGF‐βファミリー 因子に関して起こることが知られる処理上の出来事と違わず、24kDのニュールツ
リンタンパクには、アミノ末端１９アミノ酸シグナル配列が含まれ、次に、続い
てRXXRタンパク分解処理部位を含むプロドメインが続く。この処理部位はCHO 細
胞による調製済培地からの精製タンパクの配列を決定する際に得るN末端アミノ 酸配列の直前にある。これらのランドマークを使用し、11.5kD成熟ニュールツリ
ン分子が11.5kDであると予測し、またTGF‐βファミリーの他のメンバからの類 推で、23kDのホモダイマーに結合された二硫化物を構成することが予測される。
さらに、このホモダイマはSDS-PAGE分析で予測されているようにCHO 細胞調製済
培地から精製されたタンパクの質量25kDとも一致する。
【０１７７】 ヒトゲノムクローンの分離には、マウスの配列から予測されたプライマー(#46
7524; ５'‐CGCTACTGCGCAGGCGCGTGCGARGCGGC, 配列番号（SEQ ID NO)：６０及び
#10005, 5'-CGCCGACAGCTCTTGCAGCGTRTGGTA、配列番号（SEQ ID NO)：６１) を 使用して、ヒトゲノムＤＮＡからの１９２ヌクレオチド断片を増幅した(PCRパラ
メータ: 最初のタンパクの変成：95℃で１分30秒、94℃で30秒、60℃で15秒、68
℃で60秒を35回サイクル) 。ＰＣＲ生成物の配列は、マウスのニュールツリンが
ヒトと同相であることを示した。次にプライマーを、P1ベクター(library scree
ning service, Genome Systems, Inc.) で構成されたヒトゲノムライブラリーの
選別に使用した。こうして、ヒトニュールツリンゲノム遺伝子座を含む２つのク
ローンが得られた。
【０１７８】 同じ手法を用いて、前出のマウスの配列で述べたように、ヒトの配列を予測し
た。オリゴ（小数発振）(#30152, GACCTGGGCCTGGGCTACGCGTCCGACGAG,配列番号（
SEQ ID NO)：６２） をプローブとして使用し、サザンブロット分析法を用いて 、ヒトニュールツリンコーディング配列を含むP1クローン(Clones)の制限断片を
識別した。これらの制限断片(Eag I, Pvu II, Hind III, Kpn I)をブルースクリ
プトKSプラスミッドにサブクローンし、配列を決定した。
【０１７９】 ヒトゲノム断片のサブクローニングと配列決定の結果は以下の通りだった。Ea
g I 断片のサイズは約6kb で、３'Eag I 部位が停止コドンから60bp下流に位置 していることがわかった。 Pvu II 断片のサイズは約3.5kbで、3' Pvu II 部位 は停止コドンから 250bp下流に位置していることがわかった。Hind III断片のサ
イズは約4.8kbで、3' Hind III 部位は停止コドンから 3bp下流に位置している ことがわかった。Kpn I 断片のサイズは約4.2kb で、3' Kpn I部位は停止コドン
から 3.1bp下流に位置していることがわかった。
【０１８０】 第２の暗号化エクソンの配列は、サブクローンされたこれらの断片を用いて決
定された。また、第２エクソンの3'側に位置する250bpからも配列を得た。さら に、暗号化エクソンの5'側に位置する1000bpからも配列を得た。これらの側面配
列から、前向プライマー30341 (5'‐CTGGCGTCCCAMCAAGGGTCTTCG-3',配列番号（S
EQ ID NO)：７１)および、リバースプライマー30331 (5'-GCCAGTGGTGCCGTCGAGGC
GGG-3'、配列番号（SEQ ID NO)：７２) を設計した。これは第２エクソンの全暗
号化配列が、ＰＣＲ法により増幅されるためである。
【０１８１】 第１暗号化エクソンのマッピングは上記の制限部位に関連しては行われなかっ
たが、Eag I の断片に内包された。このエクソン配列は、サブクローンを行った
Eag 1 断片から、ATGイニシエーション・コドンを含むマウスのプライマー、466
215 (5'-GGCCCAGGATGAGGCGCTGGAAGG-3', 配列番号（SEQ ID NO)：73) を用いて 得られた。第１暗号化エクソンの以降の配列は、プライマー466215で得た配列か
ら設計されたリバースプライマー、20215 (5'-CCACTCCACTGCCTGAWATTCWACCCC-3'
, 配列番号（SEQ ID NO)：７４) を用いて得られた。前向プライマー、20205 (5
'-CCATGTGATTATCGACCATTCGGC-3',配列番号（SEQ ID NO)：７５) は、プライマー
20215で得られた配列から設計された。プライマー20205と20215 は、第１暗号化
エクソンの暗号化配列の側面に並び、ＰＣＲを用いてこの暗号化配列の増幅に使
用することが可能である。
【０１８２】 ヒトｃＤＮＡ及び推測されたアミノ酸配列を図７に示し、マウスｃＤＮＡ及び
推測されたアミノ酸配列を図８に示す。
【０１８３】 例６ 本例はニュールツリンｃＤＮＡを内包する発現ベクターの調製法について説明
する。
【０１８４】 組換え体ニュールツリンを哺乳動物の細胞で発現させるため、ニュールツリン
ベクター、pCMV-NTN-3-1が構築された。ニュールツリンｃＤＮＡの５８５ヌクレ
オチド転写解読枠は、ニュールツリン暗号化配列 (５'-GCGACGCGTACCATGAGGCGCT
GGAAGGCAGCGGCCCTG, 配列番号（SEQ ID NO)：６３) の最初の２７個のヌクレオ チドを含むプライマーおよび、最後の５つのコドンおよびストップ・コドン(５'
-GACGGATCCGCATCACACGCACGCGCACTC, 配列番号（SEQ ID NO)：６４) を含むプラ イマーを用いるPCR 法で、生後１日目のマウスの脳のmRNAの逆転写を鋳型として
使用して増幅された。使用されたＰＣＲパラメータは(PCRパラメータ：94℃で30
秒；60℃で15秒；68℃で2分を35サイクル、反応には5%のDMSOを含める) であっ た。ＰＣＲ生成物は、ＰＣＲによる突然変異がないことを確認するため、BSKSの
Eco RV部位へサブクローンされ、配列決定が行われた。次にMlu I (5' 末端) お
よびBam H1（3'末端) を用いてニュールツリン暗号化配列はこのベクターから切
除され、哺乳類発現ベクターpCB6(Brewer, C.B. Methods in Cell Biology 43:2
33-245, 1994)中のCMV IEプロモーター／エンハンサーの下流へ挿入され、これ らの部位を用いたpCMV-NTN-3-1ベクターが生成された。
【０１８５】 大腸菌内における組換えタンパクの発現のため、マウスニュールツリンの成熟
した暗号化部位がＰＣＲで増幅された。増幅には成熟暗号化配列(5'-GACCATATGC
CGGGGGCTCGGCCTTGTGG) (配列番号（SEQ ID NO)：６５) の最初の７つのコドンを
含むプライマー、および最後の５つのコドンと停止コドン (5'-GACGGATCCGCATCA
CACGCACGCGCACTC) (配列番号（SEQ ID NO)：６６) を含むプライマーを使用し、
その方法としてネズミ科のニュールツリン遺伝子を含む断片を鋳型（テンプレー
ト）として、以下のPCR パラメータ(ＰＣＲパラメータ：94℃で30秒；60℃で15 秒；68℃で90秒を２５サイクル、反応には5%のDMSOが加えられた) が使用された
。増幅された生成物は、BSKSのEco RV部位へサブクローンされ、ヌクレオチド配
列を確認した後、この断片はNde 1 部位(5' 末端) およびEco R1部位(3' 末端)
を用いて、発現ベクターpET-30a (Novagen, Madison, WI)へ移転された。pET-ニ
ュールツリン (pET-NTN)ベクターは、成熟マウスのニュールツリンタンパクの最
初のアミノ酸の前にあるイニシエータメチオニンを暗号化する。これはＣＨＯ細
胞調製済培地から精製されたニュールツリンのN-末端アミノ酸配列から予想され
たものである。
【０１８６】 例７ 本例は、ニュールツリン発現ベクターpCMV-NTN-3-1を有するNIH3T3細胞の一時
的なトランスフェクション（transfection）ならびに、例５のゲノム配列の生成
物が生物学的に活性であることを示すものである。
【０１８７】 クローンされたニュールツリンｃＤＮＡにより生物学的に活発なニュールツリ
ン合成が十分行われることを示すため、トランスフェクションのリポフェクトア
ミン（lipofectamine)法を用いて、pCMV-NTN-3-1プラスミドをNIH3T3細胞へ一時
的に導入した。トランスフェクションの前に、NIH3T3細胞を１ウェル (直径34.6
mm) 当たり４０万細胞の濃度で６ウェルのプレート (Corning, Corning, NY) で
２４時間平板培養した。DNA リポソーム複合体をメーカーのプロトコルに従って
調製し細胞に加えた。その方法として、1.5 μｇ CMV−ニュールツリンプラスミ
ドDNA(Qiagen (Chatsworth, CA）のtip-500 カラムを用いて同社のプロトコルに
従い分離し精製した) および、10μｌのlipofectamine試薬(Gibco BRL, Gaither
sburg, MD)並びに、5 μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリ
ンおよび5ng/mlの亜セレン酸ナトリウム (Sigma, St. Louis, MO) を含む１：１
DME/F１２培地を使用した。ＤＮＡリポソーム複合体をウェル当たり1ml の培地 に加えた５時間後に、２０％の子牛血清を含む1ml DME 培地を各ウェルに加えた
。DNA リポソーム複合体を加えた24時間後に、上記の培地2ml を子牛血清10% 、
グルタミン2mM 、ペニシリン100U/ml 、ストレプトマイシン100 μ/ml およびヘ
パリン25 ug/mlを含む1ml DME 培地と置き換えた。細胞をさらに２４時間培養し
た後、調製済培地を採取し、遠心分離機にかけて細胞破片を除去して、冷凍した
。
【０１８８】 対照として、1.5 μｇ CMV- ニュールツリンプラスミドの代わりに1.5 μｇ C
MV−ネオ(neo) 発現プラスミド(ｃＤＮＡ挿入を含まない) を用いて、NIH3T3細 胞のトランスフェクションを上述のように行った。対照プラスミドかCMV-ニュー
ルツリンプラスミドでトランスフェクションされたNIH3T3細胞から得た調製済培
地のアッセイは、NGFを枯渇させた時点でSCG培地に直接加えることにより行った
。CMV-ニュールツリントランスフェクション細胞から得た0.25mlの調製済培地を
加えることにより、交感神経ニューロンの70% の生存率を向上させた。この調製
済培地0.45mlを付加すれば、９０％以上の生存率が実現したかもしれない。対照
トランスフェクションNIH3T3細胞の調製済培地には、生存を促進するような顕著
な活動は認められなかった。
【０１８９】 例８ 本例はニュールツリンｃＤＮＡで安定した形質転換が行われたチャイニーズハ
ムスター卵巣細胞の調製法について説明する。
【０１９０】 ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ(DHFR) (UrlaubほかCell 3: 405-412, 1983 を参
照により本文に採用) を欠損しているチャイニーズハムスター卵巣細胞の誘導体
であるDG44細胞の同時トランスフェクションを、発現プラスミド(pCMV-NTN-3-1)
およびDHFR発現プラスミド(HLD) を用いて行った(McArthur, and Stanners, J.
Biol. Chem. 266: 6000-6005, 1991 参照により本文に採用) 。
【０１９１】 １日目に、１０％のウシ胎児血清 (FCS)を含有したHam のF１２培地の中で、1
0cm培養プレート当たり1x106 個のDG44細胞を培養した。この濃度は最大許容濃 度であり、これを超えた場合、５日目に選択培地を加える前に細胞が増殖し過ぎ
る恐れがある。
【０１９２】 ２日目に、リン酸カルシウム法 (10ug DNA/10 cmプレート) (Chen and Okayam
a, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987 参照により本文に採用) を用いて、
pCMV-NTNとDHFR発現プラスミドの比率を９：１とする細胞のトランスフェクショ
ンを行った。
【０１９３】 ３日目に、トランスフェクション細胞をHam's F１２培地で洗浄し、Ham's F１
２へ１０％のFCS を与えた。
【０１９４】 ５日目に、細胞はMEM アルファ培地で洗浄され、１０％のFCS および400ug/ml
のG418を内容とする選択培地を与えられた。細胞を選択培地に保存し、４日毎に
栄養を与えた。トランスフェクション後約１４日目にコロニーが形成され始めた
。次に選択培地で繁殖するコロニーを、２４のウェル付き培養プレートに移し、
翌日トリプシン化を行って細胞を拡散させた。組換えタンパク発現用の細胞を選
別するため、２４のウェルまたは６つのウェル付き培養プレートで細胞を稠密培
養させた。１０本のクローン系でニュールツリンの発現を調べ、SCG生存アッセ イを用いて２本の高度な発現系を検出した。これらのクローン系を拡大し、これ
らの選択細胞系における発現を50nMのメトトレキセート(MTX) の中での選別によ
り増幅した。MTX 中での選別のため、細胞は150cm2フラスコの選択培地で５０％
の密度にまで増殖した。培地は50nM MTX濃縮体を含むMEM アルファに変更された
(MTX 増幅中にG418を用いる必要はなかった) 。50nM MTXに移した後、大多数の 細胞は死亡し、抵抗力の強い細胞コロニーが１〜２週間で出現した。この時点で
細胞をトリプシン化してコロニーを拡散させ、細胞が稠密化した時点で細胞を分
割した。細胞は間もなく以前と同様の成長率に達した。組換えタンパクの発現を
目的として、選択細胞の選別が行われた。50nM MTX中での選別後、２〜３倍の発
現の増加が観察された。冷凍ストックが、オリジナルの選別および50nMのMTX 中
での選別から得られた細胞系用として保存された。 MTXの増加とともに、目標レ
ベルの発現が得られるまで選別をさらに続けてもよい。
【０１９５】 上記の方法を用いて、DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1)およびDG44CHO5-3(50n
M MTX)(pCMV-NTN-3-1)と識別された細胞を分離した。DG44CHO5-3(50nM MTX)(pCM
V-NTN-3-1)変種からの細胞は、１リットルの調製済培地当たり約100 μｇの生物
学的に活性を示すタンパク量を発現した。これは例１の方法によるSCGアッセイ 中の調製済培地の直接アッセイにより決定した。
【０１９６】 例９ 本例はさまざまな組織内におけるニュールツリンの発現について説明する。
【０１９７】 準定量的なＲＴ/ＰＣＲ(Estus ほか、J Cell Boil 127 :1717-1727, 1994, を
参照により本文に採用) を用いて、ラットの胎児組織(E１０, 受胎後１０日目)
、新生児組織 (P1, 生後１日目) 、および成体組織 (生後３ヶ月以上) における
、ニュールツリンおよびGDNFの発現の調査を行った(Estusほか、J Cell Biol 12
7:1717-1727, 1994 参照により本文に採用) 。各種の組織からRNA の試料を採取
、またα−３２Ｐ−dCTPをPCR 中へ組入れた後のオートラジオグラフィおよびポ
リアクリルアミド・ゲル（図６) 上の電気泳動により、またはアガロース・ゲル
上の電気泳動後のＤＮＡのエチジウムブロマイド染色(表３及び４) のいずれか の方法により、ＰＣＲ生成物を検出した。フォワードプライマーCAGCGACGACGCGT
GCGCAAAGAGCG (配列番号（SEQ ID NO)：６７) および、リバースプライマーTAGC
GGCTGTGTACGTCCAGGAAGGACACCTCGT(配列番号（SEQ ID NO)：６８) を用いて、１ ０１個の塩基対のニュールツリン断片を得、またフォワードプライマーAAAAATCG
GGGGTGYGTCTTA(配列番号（SEQ ID NO)：６９）、およびリバースプライマーCATG
CCTGGCCTACYTTGTCA(配列番号（SEQ ID NO)：７０) を用いて、１９４個の塩基対
のGDNF断片を得た。
【０１９８】 調査した胎児初期 (受胎後１０日目、E１０)には、ニュールツリンもGDNF mRN
A も認められなかった。新生児期 (誕生１日目、P1) には、両転写が多くの組織
で発現されたが、ほとんどの組織でニュールツリンの発現がGDNFよりはるかに多
く認められる傾向にあった（表３を参照) 。
【０１９９】
【表２】 表３に示すごとく、ニュールツリンとGDNFの組織分布に相違が見られた。肝臓
と胸線には特にGDNFを認めなかったが、ニュールツリン発現を認めた。また座骨
神経にはニュールツリンを認めなかったがGDNFを認めた。 動物成体の多くの組織にニュールツリンとGDNF mRNA を認めたが、 この２つの遺伝子に関しては発現の組織固有パターンに大きな違いが見られた (
表４、図５) 。
【０２００】
【表３】 表４に示すごとく、ニュールツリンは脳および脊髄並びに血液及び骨髄に発現
されたことが分かったが、GDNFは認められなかった。しかし脳および血液内での
ニュールツリンの発現レベルは新生児組織で認められたよりも低かった。
【０２０１】 ニュールツリンは新しく分離されたラットの腹膜のマスト細胞できわめて多く
発現されたが、GDNFはほとんどまたは全く発現されなかった。
【０２０２】 例１０ 本例は、ニュールツリンペプチドでウサギに免疫性を与えることにより、ニュ
ールツリンに対する抗血清の調製について説明する。
【０２０３】 成熟したネズミのニュールツリンタンパクのアミノ酸７３‐８７に対応するペ
プチド配列を合成し、前述のごとく、キーホール・カサガイ・ヘモシアニン (Ke
yhole limpet hemocyanin, KLH) に結合させた（Harlow and Lane, Antibodies:
a laboratory manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, NY.
p.72-81を参照により本文に採用）。KLH に結合されたペプチドをCaltag, Inc
に提出し、２匹のウサギに免疫処理が行われた。免疫処理は皮下注射で７〜10カ
所に行った。初回投与として、0.5ml の生理食塩水に懸濁され、0.5ml の完全な
フロイントアジュバント（complete Freun d's adjuvant）で乳化された150
μｇのKLH 結合ペプチドを注射した。初回投与の４週間後にブースター投与を行
い、その後は100μｇのKLH 結合ペプチドおよび不完全なフロインドアジュバン トを使用した以外は、７日毎に合計５回上記のような注射を行った。５回目のブ
ースター投与の１週間後に血清試料を採取した。
【０２０４】 ５回目の注射の後２匹のウサギから採取した20mlの血清を合わせて精製した。
精製には、メーカーのプロトコル (Pharmacia Biotech)に従い、上記のペプチド
を臭化シアン活性化Sepharose 4Bに結合することにより、ペプチド・アフィニテ
ィ・カラムを準備した。血清を10mMトリス緩衝液(pH 7.5)で１０倍に希釈し、４
℃で16時間軽く揺すって5 mgの結合ペプチドを含む０．５mlのペプチドアガロー
ス・ マトリックスと混合させた。マトリックスをカラムに入れ、5ml の10mMトリ
ス (pH 7.5), 150mM NaCl で洗浄し、0.4M NaCl 5ml を含む10mMトリス(pH7.5)
緩衝液で洗浄し、且つ5.5ml の100mMグリシン(pH2.5) 緩衝液で溶離させた。溶 離後ただちに1.0Mトリス(pH8.0) 緩衝液の10分の１量を溶出液に加え、酸度を低
下させた。グリシン溶出液を10mMトリス(pH7.5)NaCl に対して一泊、透析した。
【０２０５】 組換えニュールツリンタンパクが特に確認されたことを実証するため、ウェス
タン・ ブロット法でアフィニティ精製された抗体を使用した。DG44CHO5-3(G418)
(pCMV-NTN-3-1)細胞から採取した10mlの調製済培地を、例１に述べたごとくSP S
epharose上で精製し、タンパクをトリシン(tricine）緩衝液装置内の還元SDS-PA
GEゲル上で電気泳動させた (Schagger and von Jagow, Analytical Biochemistr
y 166 :368-379, 1987) 。タンパクは、25mMトリス, 192mM グリシン、0.04% の
SDS 、17% のメタノールの中で、４℃で１６時間ニトロセルローズメンブレンに
電気ブロットされた。メンブレンはアフィニティ精製された抗ニュールツリンペ
ブチド抗体、続いてセイヨウワサビ・ ペルキシダーゼ結合のヒツジの抗ラビット
IgC で培養された (上記、Harlow and Lane, p. 498-510)。化学発光をより強力
に放つ結合抗体が認められた (ECL kit, Amersham, Buckinghamshire, England)
。抗ニュールツリン抗体は、DG44CHO5-3(pCMV-NTN-3-1)細胞の調製済培地の中 に約11.5kDのタンパクバンドを１本認識した。これらの抗ニュールツリン抗体を
使用して、DG44CHO5-3(G418)(pCMV-NTN-3-1)細胞からの10ml調製済培地内にニュ
ールツリンタンパクを認めることができたが、ニュールツリン発現ベクターで形
質転換を行わなかったDG44細胞で調製された10mlの調製済培地にはタンパクを認
めることができなかった。
【０２０６】 例１１ 本例はGDNF／ニュールツリン遺伝子のサブファミリー（Subfamily ）の追加メ
ンバーの同一性について説明する。
【０２０７】 TGF-βスーパーファミリー（superfamily ）には現在25以上の異なる遺伝子因
子がある (詳細についてはKingsley, Genes and Development 8: 133-146,1994 を参照により本文に採用) 。各ファミリーメンバは、互いに様々な程度の相同性
を示し、スーパーファミリー内の幾つかの亜族はClustal V プログラムを用いた
系統発生的分析 (Higgins ほか、 Comput Appl Biosci 8: 189-191, 1992、を参
照により本文に採用) 、並びに系統発生的系統樹のブートストラップ分析 (Fels
enstein, Evolution 39: 783-791, 1985、を参照により本文に採用）による定義
が可能である。ニュールツリンまたはペルセフィンはGDNFと約４０％同じである
が、TGF‐βスーパーファミリーの他のメンバとの同一性は２０％未満である。G
DNF／ニュールツリン／ペルセフィンのサブファミリーには多く保存されている が、TGF-βスーパーファミリーには保存されていないニュールツリンの数カ所の
配列部位を識別することが可能である（図５）。これらの保存部位は、以前は不
可能だった分離が今では可能な遺伝子を含むサブファミリーの特徴を有する傾向
にある。分離は、ニュールツリン及びペルセフィン遺伝子の発見および配列決定
から識別された保存配列部位を使用することにより可能である。配列が多く保存
されているニュールツリン、ペルセフィンおよびGDNF間の部位を用いることによ
り、プローブまたはプライマーとして使用できる変性オリゴヌクレオチドを設計
することができる。識別された保存部位のアミノ酸配列は以下の通りである。Va
l-Xaa1-Xaa-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr、ここでXaa1はSer、Thr又はAlaで、Xaa2はGlu
又はAspである (配列番号（SEQ ID NO)：108 ）。Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg-
Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys、ここでXaa1はThr、Glu又はLys、Xaa2はVal、Leu又
はIle、Xaa3はLeu又はIle、Xaa4はAla又はSer、Xaa5はAla又はSer （配列番号（
SEQ ID NO)：１１３)。Cys-Cys-Xaa1-Pro-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Asｐ-Xaa6-Xaa7 -Xaa8-Phe-Leu-Asp-Xaa9、このうちXaa1はArg又はGln、Xaa2はThr又はVal又はIl
e、Xaa3はAla又はSer、Xaa4はTyr又はPhe、Xaa5はGlu,Asp又はAla、Xaa6はGlu、
Asp又は非アミノ酸、Xaa7はVal又はLeu、Xaa8はSer又はThr、Xaa9はAsp又はVal （配列番号（SEQ ID NO)：１１４)。上記の保存的配列又は上記の保存的配列の 断片のための暗号化配列を含むヌクレオチド配列をプローブとして使用すること
が可能である。これらの部位から設計が可能な典型的なプローブおよびプライマ
ーは以下の通りである。
【０２０８】 フォワードプライマー： Primer A (M3119):5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTA(SEQ ID NO:115)23ntはアミ ノ酸配列、Val-Ｘaa1-Xaａ2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr、ここでXaa1はThr,Serまたは
Ala, Xaa2はGlu またはAsp(SEQ ID NO：125)をコードする。
【０２０９】 Primer B (M3123):5'-GANBTNWCNTTYYTNGANG(SEQ ID NO:116)19ntはアミノ酸 配列、Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Xaa4-Xaa5、ここでXaa1はAsp又はGlu、Xaa2はVa
lまたはLeu、Xaa3はThr又はSer,Xaa4はAsp又はGlu、Xaa5はAsp又はVal（SEQ ID
NO：126）をコードする。
【０２１０】 Primer C (M3126):5'-GANBTNWCNTTYYTNGANGW(SEQ ID NO：117)20ntはアミノ 酸配列、Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Leu-Xaa4-Xaa5、ここでXaa1はAsp又はGlu,Xaa2はV
al又はLeu、Xaa3はThr又はSer、Xaa4はAsp又はGlu、Xaa5はAsp又はVal（SEQ ID NO：126）をコードする。
【０２１１】 Primer D (M3121):5'-TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTG(SEQ ID NO： 118)23ntはア
ミノ酸配列、Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys、ここでXaa1はSer又はAla, X
aa2はSer又はAla（SEQ ID NO:127）をコードする。
【０２１２】 Primer E (M3122):5'-GTNDGNGANYTGGGNYTNGG(SEQ ID NO：119)20ntはアミノ 酸配列、Val-Xaa1-Xaa2-Lue-Gly-Leu-Gly、ここでXaa1はThr又はSer又はAla、Xa
a2はAsp又はGlu (SEQ ID NO：128）をコードする、と Primer F (M3176):5'-GTNDGNGANYTGGGNYTGGGNTT(SEQ ID NO：120)23ntはアミ
ノ酸配列、Val-Xaa1-Xaa2-Lue-Gly-Leu-Gly-Phe、ここでXaa1はThr又はSer又はA
la、Xaa2はGlu又はAsp（SEQ ID NO：129）をコードする。
【０２１３】 リバースプライマー： Primer G (M3125)：5'-WCNTCNARRAANGWNAVNTC(SEQ ID NO:121)20ntの逆相補 配列（reverse complementary sequence）は、アミノ酸配列、Xaa1-Xaa2-Xaa3-P
he-Leu-Xaa4-Xaa5、ここでXaa1はAsp又はGlu、Xaa2はVal又はLeu、Xaa3はThr又 はSer、Xaa4はAsp またはGlu 、Xaa5はAsp又はVal（SEQ ID NO：126）をコード
する。
【０２１４】 Primer H (M3124)：5'-WCNTCNARRAANGWNAVNT(SEQ ID NO：122)19ntの逆相補 配列（reverse complementary sequence）は、アミノ酸配列、Xaa1-Xaa2-Xaa3-P
he-Leu-Xaa4-Xaa5、ここでXaa1はAsp又はGlu、Xaa2はVal又はLeu、Xaa3はThr又 はSer、Xaa4はAsp又はGlu、Xaa5はAsp又はVal（SEQ ID NO：126）をコードする 。
【０２１５】 Primer I (M3120)：5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAA(SEQ ID NO：123)23ntの逆
相補配列（reverse complementary sequence）は、アミノ酸配列、Phe-Arg-Tyr-
Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys、ここでXaa1はSer又はAla, Xaa2はSer又はAla（SEQ ID NO：127 ）をコードする、と Primer J (M3118)：5'-CANSHNCCNSHRCARTANCKRAANA(SEQ ID NO:124)25ntの逆
相補配列（reverse complementary sequence）は、アミノ酸配列、Xaa1-Phe-Arg
-Tyr-Cys-Xaa2-Gly-Xaa3-Cys、ここでXaa1はIle又はLue、Xaa2はSer又はAla、Xa
a3はSer又はAla (SEQ ID NO：１３０）をコードする。
【０２１６】 上記の記載に加えて、以下のプライマーはGDNFおよびニュールツリン保存的な
領域（conserved region）に基づくものである（SEQ ID NOS：33-35）。
【０２１７】 プライマー1 GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA（配列番号（SEQ IＤ NO)：42) 。こ
のプライマー１は次のアミノ酸配列をコード化（encode）する：Val-Xaa1-Xaa2-
Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr（うちXaa1はSer又はThr、Xaa2はGlu またはAsp)（配列番 号（SEQ ID NO)：33) 。
【０２１８】 プライマー2 TTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGYGANKCNGC（配列番号（SEQ ID NO)：43
) 。プライマー２は次のアミノ酸配列をコード化する：Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-G
ly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala（ここで、Xaa1はAlａ又はSer、Xaa2はAla又はSer、
Xaa3はGlu またはAsp、Xaa4はSer又はAla) (配列番号（SEQ ID NO)：36) 。
【０２１９】 プライマー3 （リバース：reverse) : GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTA NCKRAA（配
列番号（SEQ ID NO)：44) 。このプライマー３の逆相補配列（reverse compleme
ntary sequence）は、次のアミノ酸配列をコード化する： Phe-Arg-Tyr-Cys-Xa
a1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala (ここで、Xaa1はAla又はSer、Xaa2はAla又はSe
r、Xaa3はGlu又はAsp、Xaa4はSer 又はAla)（配列番号（SEQ ID NO)：37）。
【０２２０】 プライマー４（リバース)：TCRTCNTCRWANGCNRYNGGNCKCARCA （配列番号（S
EQ ID NO)：45) 。このプライマー4の逆相補配列（reverse complementary sequ
ence）は、次のアミノ酸配列をコード化する：Cys-Cys-Arg-Pro-Xaa1-Ala-Xaa2-
Xaa3-Asp-Xaa4（ここで、Xaa1はIle又はThr又はVal、Xaa2はTry又はPhe、Xaa3は
Glu又はAsp、Xaa4はGlu又はAsp)（配列番号（SEQ ID NO)：38）。
【０２２１】 プライマー５（リバース)：TCNARRAANSWNAVNTCRTCNTCRWANGC (配列番号（SE
Q ID NO)：46) 。このプライマー5 の逆相補配列（reverse complementary sequ
ence）は、次のアミノ酸配列を暗号化する：Ala‐Xaa1-Xaa2-Asp-Xaa3-Xaa4-Ser
-Phe-Leu-Asp（ここで、Xaa1はTyr又はPhe、Xaa2はGlu又はAsp、Xaa3はGlu又はA
sp、Xaa4はVal又はLeu)（配列番号（SEQ ID NO)：39) 。
【０２２２】 プライマー6：GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTG (配列番号（SEQ ID NO)：47)。この プライマー6 は次のアミノ酸配列をコード化する：Glu-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Phe-Arg
-Tyr-Cys（ここで、Xaa1はGlu又はThr、Xaa2はLeu又はVal、Xaa3はIle又はLeu (
配列番号（SEQ ID NO)：40) 。
【０２２３】 プライマー7：GARRMNBTNHTNTTYMGNTAYTGYDSNGGNDSNTGHGA (配列番号（SEQ ID
NO)：48) 。このプライマー７は次のアミノ酸配列をコード化する:Glu-Xaa1-Xa
a2-Xaa3-Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa4-Gly-Xaa5-Cys-Xaa6（ここで、Xaa1はGlu又はThr
、Xaa2はLeu又はVal、Xaa3はIle又はLeu、Xaa4はSer又はAla、Xaa5はSer又はAla
、Xaa6はGlu又はAsp)（配列番号（SEQ ID NO)：41) 。
【０２２４】 上記の配列は、ゲノムクローンの選別ライブラリー用プローブとして、または
ゲノムDNA かゲノムクローンのライブラリーから、または多様な組織のRNA 鋳型
を用いた逆転写cDNAから得た遺伝子断片の増幅用プライマーとしても用いること
ができる。ゲノムDNA またはゲノムクローンのライブラリーは鋳型としても使用
できるが、その理由は、ニュールツリン、ペルセフィンおよびGDNFがコードして
いる配列は成熟タンパクであり、イントロンによって遮断されないからである。
【０２２５】 縮重（degenerate）オリゴヌクレオチドを、保存（conserved）アミノ酸配列 の暗号化に可能なヌクレオチド配列を全て含むオリゴヌクオチドの混合物として
合成することができる。縮重混合物内の各種オリゴヌクレオチドの数を減少させ
るため、４種の全ヌクレオチドが存在する位置で、イノシン塩基またはユニバー
サルベース（universal base）（Loakes et al、Nucleic Acids Res 22：4039-4
3、1994）を合成物へ組み込むことが可能である。イノシン塩基またはユニバー サルベースは４つの通常DNA 塩基の各々と塩基対を形成する。このイノシン塩基
の対はATおよびGC塩基対より安定性が少ないが、普通塩基 (AG, AC, TG, TC) 間
の不釣り合いに比べると安定性がある。
【０２２６】 ファミリーメンバーを単離するため、上記のプライマー末端にT4ポリオヌクレ
オチド・ キナーゼを用いて、32Pの標識付けが可能である。また標準的方法に従 ってヒトのゲノムクローンのライブラリーにハイブリダイゼーションを行うこと
ができる。
【０２２７】 ファミリーメンバーの遺伝子を単離する好適な手順は、ゲノムDNA を鋳型とし
て用いるポリメラーゼ連鎖反応で、上記の縮重プライマーの各種組合せをプライ
マーとして使用することである。プライマーの色々な組合せはネストプライマ（
nested primer）を利用する連鎖ＰＣＲ反応や、オリゴ（Oligo）ｄＴプライマ とペアで使用されるフォワードプライマを含めることができる。加えて、縮重プ
ライマの１つはベクタープライマと共に使用でき、シングルプライマは逆ＰＣＲ
アッセイあるいは縮重プライマおよびランダムプライマでなされるＰＣＲにおい
て使用できる。例えば、上述したプライマの組合せを用いるものとして、プライ
マー2 （配列番号（SEQ ID NO)：４３) とプライマー4 （配列番号（SEQ ID NO)
：４５) を組み合わせて、PCR で1ug のヒトのゲノムDNA と用いることができる
（使用パラメータ：94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で60秒を繰り返す)。上述のP
CR 条件は模範例のみであるが、当業者であれば、緩衝液培地などでの温度や塩 分濃度を変えるなど、広範な好適条件やプライマの組合せを使用することや最適
化が可能なことをただちに理解するはずである。好適な方法として、ニュールツ
リン遺伝子のこの部位の増幅に必要だと認められる場合に限り、5%の最終濃度が
得られるまでDMSOをＰＣＲ反応に付加することである。アガロースゲル上で実行
される場合、ＰＣＲ反応は規模にして１００〜１５０の塩基対の生成物を含んで
いることが必要である。その理由はニュールツリン配列に１つのアミノ酸のギャ
ップが導入され、さらに５つのアミノ酸のギャップいずれかのシーケンスがＧＤ
ＮＦと一致（aligneｄ）した時にペルセフィンに導入されるからである。従って
ファミリーメンバの遺伝子間の間隔は、プライマー2 および4 の保存配列間でわ
ずかに異なるかもしれない。塩基対が１００〜１５０個のＰＣＲ生成物は、GDNF
、ニュールツリンとペルセフィンおよび事前に分離できなかったファミリーメン
バを含む多重増幅遺伝子生成物を含んでいることが必要である。これらの生成物
の配列を識別するには、ゲルで精製を行い、ブルースクリプトプラスミド（スト
ラタゲン（Stratagene))内へ連結（リゲート）し、続いてXL1-ブルー(blue)大腸
菌の宿主株(Stratagene)へと形質転換を行う。独立したサブクローンを含むバク
テリアのコロニーを選択して分離し、ニトロセルローズの２つに分かれた同型フ
ィルターに培養してもよい。増幅部位にあるユニークなGDNFまたはユニークなニ
ュールツリンまたはユニークなペルセフィン配列を検出するため、オリゴヌクレ
オチド・ プローブで同型フィルターの各々を覆うことができる。GDNFまたはニュ
ールツリンまたはペルセフィンへもハイブリダイセーションされないサブクロー
ンの配列を行い、もし以前分離されなかったファミリーメンバをコード化するこ
とが分かったら、ニュールツリンで行ったように配列を用いて標準長のｃＤＮＡ
クローンおよびゲノムクローンを分離することができる(例５)。同様の方法を用
いて、TGF‐βスーパーファミリーの新遺伝子(GDF‐3およびGDF‐9)を、以前識 別された遺伝子間の相同性を基準として分離した(McPherron, J Biol Chem 268:
3444-3449, 1993,を参照により本文に採用) 。
【０２２８】 ファミリーメンバの遺伝子を分離する最適な方法は、上記のPCR 手順を選別方
法として応用し、ファミリーメンバの各独立ゲノムクローンをライブラリーから
分離することであると発明者は信じる。これは成熟したニュールツリンの暗号化
部位にもGDNFの暗号化部位にも、エクソンはただ１つしかないからである。例え
ば、もしプライマー２および４との上記のPCR 反応が、ヒトゲノムのDNA を鋳型
として適切なサイズの生成物を生み出せば、P1ベクター内のゲノムクローンの集
合体を鋳型として使用し、かつニュールツリンのヒトゲノムクローンの分離法な
ど、本技術分野でよく知られる方法に従って同様の反応を生ぜしめることが可能
である（例５）。このライブラリー中のニュールツリン遺伝子を含む集合体はす
でに識別されており、ペルセフィンとGDNFを含む集合体は、GDNF及びＰＳＰ固有
のプライマーによる選別を行えば容易に識別できる。従って、これらの集合体か
ら得た縮重プライマーを用いて、適度のサイズの生成物を生み出す非ニュールツ
リン、非ペルセフィン、非GDNFの集合体は以前の非分離のファミリーメンバとし
て容易に確認することができる。こうした集合体から発生したＰＣＲ生成物は自
動シーケンサーを使用して直接的に配列決定されることが可能で、またゲノムク
ローンの単離もGenome Systems社提供の標準的手法でクローンの集合体の下位分
割と選別を進めることによって可能である。
【０２２９】 例１２ 以下の例は例１１で示した手法とプライマを利用してペルセフィンの分離と同
一性（identification）について説明する。
【０２３０】 前述の縮重(degenerate)PCR による手法は、本発明者によりここで工夫され、
GDNFとニュールツリンの両者に対しておおよそ３５―５０％の同一性がある第三
の因子「ペルセフィン」を同定するため巧く利用された。その実験的試みについ
ては既に説明済みであるので、以下ではこれをより詳細に説明する。アミノ酸配
列:Val-Xaa1-Xaa2-Leu-Gly-Leu-Gly-Tyr（うちXaa1はSer又はThr、Xaa2はGlu又 はAsp)（SEQ ID NＯ：３３) ［Ｍ1996；５’−GTNWSNGANYTNGGNYTNGGNTA（SEQ I
D NＯ：４２) ］と:Phe-Arg-Tyr-Cys-Xaa1-Gly-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Ala (この うちXaa1はAla又はSer、Xaa2はAla又はSer、Xaa3はGlu又はAsp、Xaa4はSer又はA
la ）（SEQ ID N0 ：37）[ Ｍ1999；５’−GCNGMNTCRCANSHNCCNSHRTANCKRAA(SEQ
ID N0 ：44) ] に対応するプライマは、９４℃で３０秒、４４℃で３０秒、７ ２℃で３０秒、の４０サイクルの条件で、クレンタク酵素（klentaq enzyme）と
緩衝液を用いて、ラットゲノムＤＮＡからの７７nt断片を増幅するため使用され
た。その結果物はサブクーロン化されブルースクリプトＫＳプラスミド（Bluesc
ript KS plasmid ）に入れられ、そして配列決定された。全てのヌクレオチド配
列決定は、アプライドバイオシステム自動シーケンスMODEL ＃３７３（Applied
Biosystems、 Foster City 、ＣＡ）の製品説明に従って蛍光染料ターミネイタ技
術を使用して行った。配列決定のためのプラスミドDNA はWizard Miniprep kit
（Promega Corp．、 Madison WI）の製品説明にしたがって準備した。
【０２３１】 増幅された生成物のうちの１つの配列は、GDNF及びニュールツリンのアミノ酸
配列データとは異なるがGDNF及びニュールツリンに対し２０％以上の同一性を有
するＰＣＲプライマーに内在するアミノ酸配列データであると予測され、一方獲
得された他の増幅された生成物の配列は、予期されるようにGDNF又はニュールツ
リンに対応した。この新しい配列は、本文中でペルセフィンと称される新しいフ
ァミリーメンバーが識別されたことを示す。
【０２３２】 この断片本体のプライマに対するシーケンスは、５‘−TGCCTCAGAGGAGAAGATTA
TC（SEQ ID NO：９０）である。これはチロシン（Ｔｙｒ）コドンの最後のヌク レオチドをエンコードし、その時アミノ酸：Ala‐Ser‐Gul‐Gul‐Lys‐Ile‐Il
e (SEQ ID ＮＯ：９１) をエンコードする。このシーケンスはGDNFとニュール
ツリンのラットシーケンスでアライン（aligne）された。この分析でペルセフィ
ンがユニーク（unique）であることが確認された。 LGLGYETKEELIFRYC ＧＤＮＦ（ｒａｔ）（SEQ ID NO：９２） LGLGYTSDETVLFRYC ＮＴＮ （ｒａｔ）（SEQ ID NO：９３） LGLGYASEEKIIFRYC ＰＳＰ （ｒａｔ）（SEQ ID NO：９４） 追加のペルセフィン配列を得るために、上述した増幅されたユニーク２２nt（
unique 22nt）の部分を含むプライマは、ｃDNA 端末（RACE）テクニック（Froh
man, Ｍ. Ａ．methods in Enzymology 218:340-356、1993）の急速増幅で使 用された。このテクニックはthe Marathon RACE kit(CLONTECH, Palo Aito, CA)
の製品説明に沿って使用した。ただし、第１ストランドｃDNA の合成にあっては
、Superscrip逆転写酵素（Gibco-BRL ）を５０℃で使用した。簡単に説明すると
、二重鎖アダプターオリゴヌクレオチド（Adaptor oligonucleotide ）は、生後
１日のラットの脳ｍRNA から合成されたｃDNAの二重鎖末端に配位された。ネス ト型フォワード（nested forward ）ペルセフィンPCR プライマ（10135 ；５’
‐AGTCGGGGTTGGGGTATGCCTCA, SEQ ID NO：95 and M2026 ； ５’‐TATGCCTCAGAG
GAGAAGATTATCTT SEQ ID NO：９６)を組合わせて、キット（ＡＰ１、ＡＰ２）内
に供給された配位アダプタに使用すると、２つの連続したＰＣＲ反応によってペ
ルセフィンの３’端末が増幅される（第１反応：10135とＡＰ１を使用して、９ ４℃で３０秒、６０度で１５秒、６８度で２分を３５サイクル；第２反応：M202
6 とＡＰ２を使用して、９４℃で３０秒、６０℃で１５秒、６８℃で２分を２１
サイクル）。このＰＣＲ反応から、凡そ３５０ｎｔ断片が得られ、この断片はプ
ライマＭ2026を使用して直接的に配列化された。この３’レース プロダクト（
RACE Product ）の配列は、凡そ３５０ｎｔ（SEQ ID NO：９７）の不完全なラ
ットペルセフィンｃＤＮＡ配列を生じさせた。このｃＤＮＡの予想されたアミノ
酸配列は、ＧＤＮＦおよびニュールツリンのものと比較され、これらプロテイン
のそれぞれについて凡そ、４０％の相同性が認められた。重要なことに、ＴＧＦ
‐βスーパーファミリーのメンバーの中に、システイン残基に特有の距離（spac
ing）が存在していた。さらに、ペルセフィンの分離に用いられた縮重プライマ によってコード化される類似領域に加えて、ＴＧＦ‐βスーパーファミリーの他
のメンバーには存在しない、ＧＤＮＦとニュールツリンとの間で共有する高い相
同性ある別の領域が同様にペルセフィンにも存在した。 ＧＤＮＦ ACCRPVAFDDDLSFLDD (aa 60-76)(SEQ ID NO：９８) ＮＴＮ PCCRPTAYEDEVSFKDV (aa 61-77)(SEQ ID NO：９９) ＰＳＰ PCCQPTSYAD-VTFLDD (aa 57-72)(SEQ ID NO：１００) （アミノ酸のナンバリングは第１のシステイン残基をアミノ酸１として使用する
）。
【０２３３】 ペルセフィンが、本当にＧＤＮＦ／ニュールツリンのサブファミリーの新しい
メンバーであることを確認することに関して、我々は追加の配列情報を得るため
にペルセフィンのマウスゲノム クローンを分離した。ラットｃＤＮＡ配列に対
応するプライマフォワード、Ｍ2026； 5'‐TATGCCTCAGAGGAGAAGATTATCTT, SEQ I
D NO:96 と、リバース、Ｍ3028；５’‐TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA, SEQ ID N
O：１０１)は、ラットペルセフィンｃＤＮＡ配列に対して相同性があるマウスゲ
ノムＤＮＡから155ｎｔ断片を増幅するために、ＰＣＲ反応（PCR parameters：9
4℃で30秒、55℃で15秒、72℃で30秒を３５サイクル）で使用した。そして、こ れらのプライマは、Ｐ１バクテリオファージベクター（library screening serv
ice of Genome Systems, Inc., St. Louis, MO）のマウス１２９／Ｓｖ ライブ
ラリからマウスペルセフィン ゲノムクーロンを得るために用いられた。
【０２３４】 ペルセフィン遺伝子を有するＰ１クーロンからの制限断片（3.4kb Nco と 3.3
kb Bam H1）は、マウスゲノムＤＮＡにプライマ（foward、M2026; SEQ ID NO：
９６ and reverse, M3159; 5'-CCACCACAGCCACAAGCTGCGGSTGAGAGCTG, SEQ ID NO
：１０２）を使うＰＣＲによって得られる２１０ｎｔ断片で、ハイブリダイゼイ
ション（hybridization）されて、一体化（identified）された。このときの、 ＰＣＲのパラメータは94℃で30秒、55℃で15秒、72℃で30秒を３５サイクルであ
った。ＮｃｏとＢａｍ Ｈ１断片は配列化された後、ニュールツリンとＧＤＮＦ
の両方の成熟領域に相同性があるように、ラットのペルセフィンのレースプロダ
クト（RACE Product）にあるその存在に対応したアミノ酸のストレッチ（stret
ch）をコード化するために見出される（図１１）。
【０２３５】 マウスのＧＤＮＦ、ニュールツリンそしてペルセフィンが、第１システインを
出発点（ファミリーメンバー間で、切断サイトにおける変化は、第１システイン
のセグメント上流での変異性を創出するからである）として整列されるとき、ペ
ルセフィン（91 アミノ酸）は、ニュールツリン（９５ アミノ酸）もしくはＧ ＤＮＦ（94 アミノ酸）の何れかよりもいくらか小さい。この領域での全体的な 同一性はニュールツリンとは約５０％、ＧＤＮＦとは約４０％である（図１２）
。
【０２３６】 さらに、マウスペルセフィンのＮｃｏ Ｉフラグメントのヌクレオチド配列は 、マウスペルセフィン全遺伝子（SEQ ID NO：１３１；図１７Ａ）のヌクレオチ
ド配列で明らかにされた。オープンリーディングフレーム（open reading fra
me ）はイニシエータメチオニンをコードする配列からストップコドンの場所244
‐246 まで延びている。しかしながら、このシーケンスのある部位には、ＲＸＸ
Ｒ切断サイト（257‐268位置のヌクレオチド）をコードする配列のような明らか
な変則部がある。そして、成熟ペルセフィンタンパク質（269‐556 の位置）に 対応する配列は、オープンリーディングフレームと共直線状態（colinear）にな
い。その代わりに、第２リーディングフレームが切断サイト(cleavage site）と
成熟ペルセフィンをコードしている。
【０２３７】 さらに、ラットペルセフィンの配列決定が同様になされた。ラットゲノム断片
はクレンタク（klentaq）とラットゲノム ＤＮＡを鋳型（テンプレート）とし て用いたＰＣＲにより増幅された。マウスペルセフィン遺伝子の上流域に対応す
るフォワードプライマ＃40266 （５’‐ATTCCCCAGGACAGGCAGGGAAT;SQE ID NO： １３７）と、成熟ラットペルセフィン配列内の領域に対応するリバースプライマ
M3156(5'‐CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC,SEQ ID NO：１３８) はパラ メータ（95℃で15秒、55℃で15秒、68℃で45秒を３０サイクル）の下で使用され
た。増幅された結果物（product）はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキナーゼ 処理され、その末端は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（klenow fragment）平滑処理
された。そして、ＢＳＫＳプラスミド内にクローン化した。
【０２３８】 ヌクレオチドの配列化はラットペルセフィンの全遺伝子（SEQ ID NO：１３ ４；図１８Ａ）の配列を決定するためになされた。オープンリーディングフレー
ム（open reading frame）はイニシエータメチオニンをコードしている配列か ら、マウスペルセフィンに見られるようにストップコドンの位置244‐246 まで 、延びていることが見出された。マウスペルセフィンの場合にも同様に見られる
ように、２つの好ましいリーディングフレームが存在するように、イニシエータ
メチオニンをコードする配列と、成熟ラットペルセフィンについての切断サイト
をコードする配列との間に異常（anomaly）が生じていることが発見された。こ の異常にかかわらず、哺乳類の細胞は、以下で説明があるようにマウスあるいは
ラットの全長のゲノム配列何れかからのペルセフィンを発現する（図１４参照）
。
【０２３９】 上記異常の発生を追跡するために、発明者らはマウス及びラットペルセフィン
双方の哺乳類発現ベクターを調製した。マウスプラスミドを構築するために、マ
ウスペルセフィン遺伝子を含むＰ１クローンを、ＰＣＲアッセイにて、テンプレ
ートとして利用した。プライマーは、結果得られる断片がイニシエーターメチオ
ニンから停止コドンに伸長するペルセフィン遺伝子を含むように設計される。Ｐ
ＣＲ反応は、フォーワードプライマーＭ３１７５［５’‐ＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣ
ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧＡ］とリバースプライマーＭ３１
５６［５’‐ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡ
ＣＡＡＧＣ］を利用した。同様なラットプラスミドを構築するために、ラットゲ
ノムＤＮＡを、ＰＣＲアッセイでのテンプレートとして利用した、。ＰＣＲ反応
は、フォーワードプライマーＭ３１７５［５’‐ＴＧＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧ
ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧＡ］とリバースプライマーＭ３１５６［５
’‐ＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＧ
Ｃ］を利用した。増幅生成物はＢＳＫＳにクローン化され、配列決定されて、正
確なクローンが得られたことを確かめた。ラット及びマウスペルセフィン断片は
ＳｍａＩ及びＨｉｎｄIIIを利用して切断され、哺乳類発現ベクターｐCB６のAsp
７１８（平滑）とHindIII部位にクローン化された。
【０２４０】 COSサル細胞はラット若しくはマウスペルセフィン発現ベクター、又は非組換 えベクター（ｐCB6）自体でトランスフェクトされた。４８時間後、細胞を溶解 させ、サンプルを１５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミンドゲルにて展開させ、そ
のタンパク質を電気泳動により分離させた。その後、タンパク質をエレクトロブ
ロッティングによるニトロセルロースへ移動させた。このニトロセルロース膜は
、（ｐＥＴプラスミドからバクテリア中で生産させた成熟ペルセフィンに育成さ
せた）アンチ‐ペルセフィン抗体にてインキュベートさせ、溶解産物中のペルセ
フィンの有無を検出した。ｐＣＢ６でトランスフェクトさせた細胞の溶解産物で
はなく、ラット又はマウスペルセフィン発現ベクターの何れかでトランスフェク
トさせた細胞からの溶解産物には、相当量のペルセフィンが含まれる。検出され
たペルセフィンのサイズは１０〜１５ｋＤであり、処理されたもの（processed ）（つまり、ペルセフィンの成熟形態）で予測されたサイズと一致した。上記細
胞から収穫された調製済培地には、成熟ペルセフィンが含まれていた。上記結果
から、マウス及びラット双方のペルセフィン遺伝子は、正しく処理されたペルセ
フィン分子の合成を行うことが可能であることを示している。
【０２４１】 上記現象のメカニズムを追跡するために、発明者らはラット又はマウスペルセ
フィン発現ベクターの何れかでトランスフェクトされた細胞からＲＮＡを分離し
た。イニシエーターＭｅｔ及び停止コドンに対応するプライマーを利用して、Ｒ
Ｔ/ＰＣＲ分析が行われた。発明者らは、二つの断片を検出した。一つはペルセ フィン遺伝子の予想されたサイズに対応し、もう一つはそれよりも僅かに小さい
サイズに対応しており、これにより、ＲＮＡスプライシングが起こっているが示
唆される。更に、発明者らは多くの他のプライマーペアを確認した。大きいもの
と小さいペルセフィン断片がクローン化され、配列決定された。予想された通り
、大きい断片はペルセフィン遺伝子に対応した。小さい断片はペルセフィンのス
プライシングされたものに対応した。（開始コドンの１５４ｎｔ下流に位置する
）プロドメイン内の小さな８８ｎｔイントロンはスプライスアウトされた（spli
ced out）。上記スプライシング後、「フレームシフト」（つまり、イニシエー ターＭｅｔと成熟領域がインフレームである）は、もはやラット又はマウスペル
セフィンのどちらにも存在しなかった（図１７Ｂ及び図１８Ｂを参照）。
【０２４２】 例１３ この例はマウスペルセフィンの細菌発現ベクターの調製と、組換え成熟ペルセ
フィン発現のための大腸菌へのこれの導入について説明する。
【０２４３】 第１のフレームワークシステイン（Cys)の残基（SEQ ID NO：８０）の５アミ
ノ酸上流で始まる、成熟のマウスペルセフィンタンパク質をコードするペルセフ
ィンポリヌクレオチドは、Ｎｄｅ とＢｇｌ サイトでｐＥＴ発現ベクターｐＥＴ
‐３０ａへクローン化される。このペルセフィンポリヌクレオチドは、Ｐ１ゲノ
ムクーロンを鋳型とした成熟ペルセフィンを用いたＰＣＲによって生み出された
。Ｎｄｅ Ｉサイトと、８ヒスチジン残基と、エンテロキナーゼサイトをコード するフォワードプライマーM3157(5'‐GGACTATCATATGGCCCACCACCACCACCACCACCACC
ACGACGACGACGACAAGGCCTTGGCTGGTTCATGCCGA、SEQ ID NO：１３９)、並びに、成熟
ペルセフィンの配列の６アミノ酸残基と、停止コドンと、Ｂｇｌ サイトをコー ドしている配列に対応するリバースプライマ M3156(5'-CGGTACCCAGATCTTCAGCCAC
CACAGCCACAAGC, SEQ ID NO：１３８) が使用された。ＰＣＲ反応条件は、９５℃
で１５秒、５５℃で１５秒、６８℃で６０秒の２５サイクルであった。このＰＣ
Ｒによる産出物はＢＳＫＳプラスミドのＥｃｏＲＶサイトへサブクーロン化され
、そして突然変異が含まれていないことを確認するために配列化された。そして
、このペルセフィン配列は，Ｎｄｅ ＩとＢｄｌ ＩＩを使った前述ベクターから
削除され、そして細菌発現ペクターｐＥＴ３０ａ（Novagen、Madison、WI）のＮ
ｄｅ Ｉ（5’）とＢｇｌ ＩＩ（３’）サイトへクーロン化された。これにより
、この発現ベクタは、エンテロキナーゼサイトが直接つながる８ヒスチジン残基
を含むアミノ末端タグ（amino terminal tag ）を有するペルセフィンタンパ ク質の成熟した形（form）を創出するであろう。
【０２４４】 プラスミドは大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）へ導入された。ペルセフィンを産出
するために、細菌がバーバーリング（harboring）している前記プラスミドを１ ６時間保持後に収集した。そして、これを６Ｍグアニジン―ＨＣＬ、0.1ＭＮａ Ｈ2 ＰＯ4，０．０１ＭトリスをｐＨ8.0 を使って溶解し、ＮｉーＮＴＡレシン （Qiagen）でのクロマトグラフィによってこれらの溶解液（lysates）から組換 えペルセフィンタンパク質を精製した。このタンパク質は、8Ｍの尿素、0. 1Ｍ のＮａＨ2 ＰＯ4、ｐＨ4.5 で0.01Ｍのトリスを含む緩衝液Ｅの３コラムボリュ ーム（volumes ）を使用して、溶離された。このペルセフィンは、0.1MのＮａＨ 2 ＰＯ4、0.01ＭのトリスでｐＨは8.3 、0.15ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのシステイ ン、0.02％のＴｗｅｅｎ-20、10％のグリセロールから成る復元緩衝液中で透析 され、復元された。ここで、尿素の濃度は４Ｍで１６時間をはじめに、以降２Ｍ
で１６時間、1 Ｍで７２時間さらに0. 5Ｍで１６時間と、順に減少するように維
持された。このペルセフィン濃度は、ドットメトリックアッセイ（Dot Metric
assay ）（Geno Technology、St, Louis、MO）を使用して決定された後、４℃ で蓄えられた。
【０２４５】 この細菌性組換えペルセフィンは、成熟ペルセフィンに対する抗体を産出する
ためにウサギの免疫原として使用された。免疫原の注入と採血（blood drawin
g ）のすべては、Cal Tag Inc.（Healdsburg、CA）で行われた。坑ペルセフィ
ン坑血清は明らかにペルセフィンを確認することが認められるが、ニュールツリ
ンもしくはＧＤＮＦは認められなかった。これには、タンパク質ブロット分析（
Protein blot analysis）を使用した。このペルセフィンー特異坑血清は、トラ
ンスフェクト（transfected）ＣＯＳセルから調製された溶菌液中でペルセフィ ンを見つけるために使用された。
【０２４６】 例１４ この例はマウスまたはラットのペルセフィン遺伝子を保有している哺乳類の発現
ベクターの調製について説明すると共に、成熟ペルセフィンの産出のために哺乳
類の細胞系への組み込みについて説明する。マウスのプラスミドの構築のために
、マウスペルセフィンの遺伝子を有するＰ１クローンが、ＰＣＲアッセイでの鋳
型として使用された。プライマは、イニシエイターメチオニンコドンから成熟ペ
ルセフィンをコードする配列（SEQ ID NO：１３１）のストップコドン３’まで
、延びているペルセフィン遺伝子を含有するようなポリヌクレオチドとなるよう
にデザインされた。ＰＣＲ反応には、フォワードプライマーM3175(5'‐TGCTGTCA
CCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ ID NO：１４０) とリバースプライマーM3156(
5'‐CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO：１３８) を利用した。
類似のラットプラスミドを構築するために、ラットゲノムＤＮＡがＰＣＲアッセ
イの鋳型として使用された。ＰＣＲ反応には、フォワードプライマーM3175(5'‐
TGCTGTCACCATGGCTGCAGGAAGACTTCGGA, SEQ ID NO：１４０) とリバースプライ マーM3156(5'‐CGGTACCCAGATCTTCAGCCACCACAGCCACAAGC, SEQ ID NO：１３８) 利
用した。両ＰＣＲ反応は、クレンタク（klentaq）を使用して行われた。そのパ ラメータは以下のとおりである：95℃で15秒、55℃で15秒、68℃で45秒を２５サ
イクル。増幅されたプロダクトはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでキナーゼ処理
（kinased）され、その末端は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（klenow fragment） で平滑化され、そしてＢＳＫＳプラスミド内へクローン化された。ヌクレオチド
の配列決定は、正しいクーロンが得られたという確認のために行われた。ラット
とマウスのペルセフィンポリヌクレオチドは、Ｓａｍ とＨｉｎｄ により削除
され、それぞれはＡｓｐ718（blunted ）と哺乳類の発現ベクタｐＣＢ６のＨｉ ｎｄサイトへクローン化された。
【０２４７】 ＣＯＳモンキー細胞は、ラットまたはマウスのペルセフィン発現ベクタ（16μ
ｇ per ５ｘ１０５ cell）で、あるいはリン酸カルシューム沈殿法（Chen and
okayama，Mol Cell Biol 7：2745- 2752、1987 参照により本文に採用）をそ
れ自身に用いた非組換えベクター（pＣＢ６）により転移された。条件は、ｐＨ7
.5 で５０mMのトリス、300mM のＮａＣｌ、１％のTriton Ｘ-100、１％のdeoxy
cholate、10mMのEDTA, 0. 1％SDS、５μｇ／mlのleupeptin、７μg／mlのpepsta
tin、そして250 μM のPMSFを含有するＩＰ緩衝液内で細胞を溶菌した後、４８ 時間である。このサンプルは15％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に展開さ
れ、タンパク質は電気泳動により分離された。そして、タンパク質はエレクトロ
ブロティングによりニトロセルロースに転移された。このニトロセルロース膜は
、溶菌液内のペルセフィンの存在を検出するために坑ペルセフィン抗体で培養さ
れた。
【０２４８】 図１９に示されるように、ラットまたはマウスのペルセフィン発現ベクタで転
移された細胞からの溶菌液（ただし、これはｐＣＢ６で転移された細胞からの溶
菌液ではない）は多くのペルセフィンを含んでいた。ペルセフィンの検出された
大きさは凡そ１４ＫＤであり、これはペルセフィンの処理された、即ち、成熟し
た形体によって予想されたサイズに一致する。マウスおよびラットのペルセフィ
ン遺伝子が適切に加工されたペルセフィン分子の合成へ導くことができるという
ことを示している。
【０２４９】 例１５ 以下の例では、ヒトペルセフィンの分離と確認を説明する。
【０２５０】 ヒトペルセフィンのホモログ又はＧＤＮＦファミリーの追加メンバーを確認す
るために、縮重ＰＣＲプライマーがヒトニュールツリン及びＧＤＮＦ配列に基づ
き設計され、ヒトゲノムＤＮＡを増幅させるために利用された。以下のプライマ
ーが利用された（配列番号（SEQ ID NOS）：２２５‐２２８）。 DhNeurturin１（ＤＮ１）GTSASYGASYTGGGYCTGGGCTAY REF：B‐４６Z DhNeurturin２（ＤＮ２）TTYMGSTACTGCRSMGGCKCYTGC REF：B‐４６X DhNeurturin３（ＤＮ３）RAGGCSRTSGGKCKGCARCAKGS REF：B‐４６V DhNeurturin４（ＤＮ４）MKCRTCYARRAASGACASSTC REF：B−４６W ヒトゲノムDNA（クロンテック６５５０‐１ ０．１μｇ/μｌ）は、全ての４
つの可能な組合わせ（DN１−DN3ｒ、DN１−DN４ｒ、DN2−DN3ｒ、DN2−DN4ｒ） で増幅された。反応混合物は、５μｌの１０ｘKlentag緩衝液、０．５μｌｄNTP
（２０ｍM）と、１μｌヒトゲノムDNAと、０．６μｌKlentag（クロンテック） と、全体積５０μｌ中の１．５μｌの各プライマー（０．１OD/μｌ）とを含ん だ。ＤＮＡは、以下の条件でパーキンエルマージーンＡＭＰ９６００でのタッチ
ダウンＰＣＲにより増幅された。初期変性９８℃で２分（２’）、次に９８℃で
３０’’（３０秒）と７２℃で１．５分（１．５’）の５サイクルと、９８℃で
３０分（３０’）と６８℃で１．５’（１．５分）の２５サイクルと、それに続
く６８℃で５’（５分）での最後の伸長の条件で行う。
【０２５１】 約１３０〜２００ｂｐのＰＣＲ生成物は、アガロースゲルでの電気泳動後に精
製し、In Vitrogen TAクローニングキット（Cat＃K２０００−０１）を利用し
て、ｐCR ２．１ベクターへクローン化させて確認した。１３０〜２００ｂｐ挿
入を含むクローン（EcoR１消化後）が配列決定され、プライマーペアDN１−DN３
ｒで得られたそれらの一つ（クローンA3）のクローンはマウスペルセフィンと相
同な配列を有し、ヒトペルセフィンに相当する。
【０２５２】 クローンA3におけるヒトペルセフィンゲノムDNAの部分配列を以下に示す（配 列番号（SEQ ID NOS）：２２９）。 CGGCTTGTGACCGAGCTGGGCCTGGGCTACGCCTCAGAGGAGAAGGTCATCTTCCGCTACTGCGCCGGCAGC
TGCCCCCGTGGTGCCCGCACCCAGCATGGCCTGGCGTGGCCCGGCTGCAGGGCCAGGGCCGAGCCCACGGCG
GGCCCTGCTGCCGCCCCATGGCCである。
【０２５３】 上記配列のソースを確認し、ヒトペルセフィンの全長ｃDNAクローンを分離さ せるために、ｃＤＮＡライブラリーが、前述のゲノムＤＮＡ配列に基づいた正確
なマッチプライマーを利用してPCRによりスクリーニングされたされた。二つの セットの人ペルセフィン特異プライマーが調整され（配列番号（SEQ ID NOS）：
２２０−２３３）、 hPSP‐5’.1 GAGGAGAAGGTCATCTTCCG REF：B‐95K hPSP‐3’.1 GCCGTGGGCTCGGCCCTGGC REF：B‐95L hPSP‐5’.3 AGAGGAGAAGGTCACTTCCGCTA REF：C‐62Y hPSP‐3’.4 CTCGGCCCTGGCCCTGCAGC REF：C‐62X 前述と同じ条件を利用して、ｐRK5ｃDNAライブラリー（200ｎｇ/μｌの１μｌ）
又はストラタジーンクイックスクリーンパネル（Stratagene’s Quickscreen pa
nel）から一本鎖DNAを増幅させるのに利用された。予想されたサイズのPCR生成 物（hPSP‐5’.1とhPSP‐3’.1とでは１０８ｂｐであり、hPSP‐5’.3とhPSP‐3
’.4とでは１０１ｂｐである）は、胎児肺、胎児肝臓、胎児腎臓、小さな腸、網
膜、小脳及びｈT+１３リンパ芽球にて検出された。
【０２５４】 ヒトペルセフィンをコード化するｃＤＮＡクローンを分離させるために、ヒト
組織からのｐRK5ライブラリーを、以下のプライマー（配列番号（SEQ ID NOS） ：２３３−２３４）の何れかを利用して、ｄｕｔ-/ｕｎｇ-−ホストでのプラス ミドライブラリーからの一本鎖DNAの伸長によりクローン化されたペルセフィン ｃDNAに対して、豊富にさせた。 hPSP‐3’.2 TGCAGCCGGGCCAGCGCCAG REF：D‐68T hPSP‐3’.4 CTCGGCCCTGGCCCTGCAGC REF：C‐62X 10x ＰＣＲ緩衝液（パーキンエルマー）の10μｌを含む反応にて、１μｌｄＮＴ
Ｐ（２０ｍＭ）、１μｌライブラリーＤＮＡ（２００ｎｇ）、０．５μｌプライ
マープライマー８６．５μｌの水及び１μｌのAmplitaq（パーキンエルマー）を
ホットスタート後に添加した。反応液を９５℃で１分間変性させ、５０、６０又
は６８℃で１分間アニールしたのちに、７２℃で２０分間伸長させた。ＤＮＡを
フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させて、エレクトロポレ ーションによりDH10Bホストバクテリアへトランスフォームさせた。
【０２５５】 各形質転換（transformation）からの約４０，０００コロニーはナイロン膜に
リフトされ、（前述の）クローンA3の配列から誘導されたDNAプローブでスクリ ーニングされた。断片はランダムオリゴヌクレオチド法により、［３２P］‐ｄC
TPを利用して標識された。フィルタは５０％のホルムアミド、５ｘSSC、１０ｘD
enhardt’s、０．０５Mリン酸ナトリウム（ｐH ６．５）、０．１％ピロリン酸
ナトリウム、５０μｇ/ｍｌの超音波処理されたサケ精子DNA中の４２℃で一晩ハ
イブリダイズされた。その後、フィルターは２ｘSSCでリンスされ、０．１ｘSSC
で洗浄され、それから０．１％SDSがコダックＸ線フィルムに一晩晒された。純 粋な陽性クローンは第２回目のスクリーニング後に得られ、分離クローンの配列
が決定された。ヒトペルセフィンクローンは胎児肺、胎児腎臓及び胎児肝臓ライ
ブラリーから分離された。分離された全てのペルセフィンクローンは二つのカテ
ゴリーに属する。それらはスプライシングされていないもの（１０クローン）又
はキメラ（６クローン）である。スプライシングされていないクローンは〜９０
０ｂｐの長さであり、ヒトペルセフィンに相当する断片をコード化する領域を含
む。しかしながら、そのリーディングフレームには、開示メチオニン及びシグナ
ルペプチドが全く存在しない（フレーム+２）。潜在的な上流開示コドン（ＡＴ Ｇ）は別のリーディングフレーム（+１）に存在し、潜在的なシグナルペプチド に相当する疎水性配列に続く。これにより、かかるｃＤＮＡは不完全にスプライ
シングされており、イントロンはシグナルペプチドをコード化するエキソンとペ
ルセフィンタンパク質との間にある。コンセンサススプライスドナーとアクセプ
ター配列は、実際にはそれぞれ位置３４０と４２５にて確認された。上記位置の
間に位置するイントロンのスプライシングによりｃＤＮＡが導かれ、配列をコー
ドするペルセフィンは開示メチオニンのある「インフレーム」である。興味深い
ことに、異常キメラクローンは、位置４２５に存在するスプライスアクセプター
部位で、ペルセフィンの予想されたエキソン２をコード化するｃＤＮＡの正確な
接合からの結果として確認された。対応する転写物は異常スプライシングにより
多分生じ、位置４２５のスプライスアクセプターの有無を確認する。
【０２５６】 ヒトペルセフィンｃＤＮＡクローンを分離する別のアプローチとして、ラムダ
ＺＡＰ（Stratagene cat #935201）のヒト小脳ライブラリー３百万のクローンが
、［３２Ｐ］‐ｃＣＴＰを利用して、ランダムオリゴヌクレオチド法により標識
されたクローンＡ３に相当するＤＮＡプローブでスクリーニングされた。そのラ
イブラリーは高ストリジェンシーハイブリダイゼーション条件化でスクリーニン
グされた。フィルターは２時間予めハイブリダイゼーションされ、その後、５０
％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１０ｘDenhardt’s、０．０５Mリン酸ナトリウム
（ｐH ６．５）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０μｇ/ｍｌの超音波処理
されたサケ精子DNA中の４２℃で一晩ハイブリダイズされた。次いで、フィルタ ーは２ｘＳＳＣでリンスされ、０．１ｘSSCで洗浄した。フィルタはコダックＸ 線フィルムに一晩晒された。４つの陽性クローン（Cere １．１、１．２、６．
１、６．２）を集め、プラーク精製された。ラムダＺＡＰファージアーム内に含
まれるプラスミドは、Ｅｘアシストヘルパーファージを利用して、製造者説明書
ごとに説明されたようにレスキューされた。４つのクローンに配列からは、上記
クローンは同胞種であり、前述のｐＲＫ５ライブラリーから分離されたヒトペル
セフィンクローンと比較した際に、２つのサイレント突然変異を含む。上記サイ
レント突然変異は図２４に示す配列の位置３０（Ｔ→Ｃ）と３６０（Ｔ→Ｃ）で
起こる。ヒトペルセフィン遺伝子の直接の配列決定により、上記サイレント突然
変異は、遺伝子の真性対立変異であることを示す。 正確なタンパク質が上記確認されたスプライシングされていないｃＤＮＡから
発現されるかどうかを求めるために、位置６８５（フレーム+１）又は位置７４ ６（フレーム+２）に存在する停止コドンがFlag tagをコード化する配列が位置 ４６又は１９３に存在するＡＴＧコドンから出発する前に、構成体が発生する。
酢で手の４つの可能な構成体は、以下のプライマー（配列番号（SEQ ID NOS）：
２３５‐２３８）を利用して、ＰＣＲにより生じた。 hPSP1stMet. F 5’ CGC GGA TCC ATG CCT GGA TTC GAG GGT GCA G 3’ REF：B‐127R hPSP2ndMet. F 5’ CGC GGA TCC ATG GCC GTA GGG AAG TTC CTG C 3’ REF：A‐127S hPSP.FLAG.R 5’ CTC CCA AGC TTT TAC TTG TCA TCG TCG TCC TTG TAG TCG CCA CCA CAG CCG CAG GCA GCC 3’ REF：A‐120C hPSP.sig.FLAG.R 5’ CTC CCA AGC TTT TAC TTG TCA TCG TCG TCC TTG TAG TCT CGA GGA AGG CCA CGT CGG TG 3’ REF：A-120B 全ての４つのＰＣＲ反応では、Cere１．２クローンはテンプレートとして利用さ
れ、Stratagene Robocyclerグラジエントサイクラー９６のPｆｕポリメラーゼで
増幅された。ＰＣＲ条件は９５℃で２分間（２’）と、９５℃で３０秒間（３０
’’）、５２、５６、６０又は６３℃で１分間（１’）、７２℃で２分間（２’
）の３０サイクルと、それに続く７２℃で５分間の最後の伸長である。
【０２５７】 フォーワードプライマーはＢａｍ ＨＩ部位を有し、リバースプライマーはHi
nd III制限部位を有する。ＰＣＲ生成物はＢａｍ ＨＩとHind IIIで消化され
、ｐRK５の上記部位へサブクローン化された。各構成体からのDNAは、CaPO４法 を利用して２９３細胞へ一晩でトランスフェクトされた。培地を含む血清は２４
時間調製され、２つに分けられ、各プレートの１/４はＲＴ‐ＰＣＲに使われ、 各プレートの残りの３/４は免疫沈澱（immunoprecipitation）に使われた。
【０２５８】 発現タンパク質の分析は免疫沈殿により行われた。細胞ペレットはリーシス緩
衝液（50mM Tris ｐH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，1% NPO4，アプロチニン、ロ
イペチン、PMSF、1mM NaFと1mM バナジン酸ナトリウム）中で、４℃２０分間溶 解させた。抽出物を１０Kｒｐｍで１０分間回転させ、その後上澄み液を新しい 管に移し、１時間２０μｌプロテインAセファロースで予め清澄させた。その時 から、１ｍｌの調製済培地を平行して処理した。プロテインAセファロースは回 転させ、１μｇのアンチFlag抗体（３．６μｇ）を各管に添加した。４℃で一晩
インキュベートさせた後、３０μｌのプロテインGセファロースを添加し、１時 間４℃でインキュベートさせた。プロテインGビーズを１分間回転させ、リーシ ス緩衝液で３回洗浄し、β‐メルカプトエタノールの存在下で、２０μｌのLaem
li緩衝液で再権濁させた。サンプルを１００℃で５分間変性させ、１６％ポリア
クリルアミドゲルで展開させた。それから、タンパク質をニトロセルロースに移
し、ブロッキング緩衝液（PBS+0.5％tween+5%無脂肪乾燥ミルク+３％ヤギ血清）
中で、１μｇ/ｍｌの同じアンチFｌａｇ抗体を利用して、一晩ウエスタンブロッ
ティングにより解析した。上記に続き、アンチマウスHRP.ECLを検出用に利用し 、その膜をX線フィルムに９０秒間晒した。
【０２５９】 １６ｋDaの特定バンドは、フレーム+１のＡＴＧ１９３で出発する構成体とフ レーム+２に挿入されｆｌａｇでトランスフェクトされた細胞の細胞ペレットに て検出され、約１０ｋＤａの特定バンドが対応する上澄液にて検出された。Ｆｌ
ａｇ標識された（tagged）タンパク質はトランスフェクションにて、又は偽トラ
ンスフェクトされた細胞において検出されなかった。
【０２６０】 正確にスプライシングされたｍＲＮＡは、以下のＲＴ‐ＰＣＲにより確認され
た。全ＲＮＡはＲＮＡｚｏｌＢ（Tel‐Test Inc．）を利用してトランスフェク
トされた細胞（各ペレットの１/４）から抽出され、DNａｓｅで３７℃４０分間 処理された。その後、ＲＮＡはＲＮＡａｓｙカラム（プロメガ）にて精製され、
最終体積５０μｌに集められた。第一の鎖ｃＤＮＡは３７℃１時間で、スーパス
クリプトＲＴ（GIBCO‐BRL）を利用して４μｌＲＮＡで合成され、９５℃５分間
（５’）処理して不活性化された。
【０２６１】 ２μｌの各ＲＴ反応液がテンプレートとして、以下の２つのプライマー（配列
番号（SEQ ID NOS）：２３６と２３９）の存在下で、Stratagene Robocyclerグ ラジエントサイクラー９６にて、ＰＣＲによる増幅用に利用された。 ｈPSP2ndMet. F 5’ CGCGGATCCATGGCCGTAGGGAAGTT CCTGC 3’ REF：B‐127S hPSP.停止.R TCAGCCACCACAGCCGCAGGCAGCC REF：D‐103N ＰＣＲ条件は、９８℃で１．５分間（１．５’）と、９８℃で３０秒間（３０’
’）、６０℃と７６℃、７２℃との間で１．５分間（１．５’）の２８サイクル
に続き、７２℃で５分間の最後の伸長を行った。
【０２６２】 アガロースゲルでのＰＣＲ生成物の分析から、テンプレートとしてｐRK５.ｈP
SP‐FALG.２プラスミドを利用したＰＣＲにより、約５７０ｂｐの予想された生 成物を生じ、テンプレートとして上記構成体でトランスフェクトされた細胞から
のＲＮＡを利用したＲＴＰＣＲ生成物は、５００ｂｐ以下であることが分かった
。後者の反応からのＰＣＲ生成物は、In Vitrogen TAクローニングキット（ca
t #K2000‐01）を利用してｐCRベクターへサブクローン化され、配列決定された
。配列解析により、予想された８４ｂｐインと論は転写物からスプライスアウト
（spliced out）されたことが判明した。
【０２６３】 要約すると、ヒトペルセフィンｃＤＮＡは１５６のアミノ酸の長いタンパク質
（予想されたMr １６．６ｋDA）をコード化する４７１ｂｐのオープンリーディ
ングフレームを有する。２３のアミノ酸の長い予想されたシグナルペプチドの解
裂により、１３３のアミノ酸プロペルセフィン分子（Mr 14.2ｋDa）をもたらす
。RXXRコンセンサス配列でのプロペルセフィンタンパク質分解解裂により、分子
量１０．３ｋDaを有する９６のアミノ酸成熟タンパク質が生じる。この予期され
たサイズは、トランスフェクトされた２９３細胞の調整済培地から免疫沈澱した
Flag‐taggedタンパク質のサイズに相当する。更に、２９３トランスフェクトさ
れた細胞の調製済培地から精製されたFlag‐taggedペルセフィンのアミノ末端配
列から、成熟形態の第一の残基はAla61であることが確認された。ヒトペルセフ ィンとヒトニュールツリンとの間の配列から、二つの分子間には３８％の類似性
があり（成熟領域に対して５０％）、ヒトペルセフィンはヒトGDNFと３０％の類
似性（成熟領域では４０％）があることが判明した。
【０２６４】 例１６ この例は、ペルセフィン（PSP）からの誘導体部分あるいはニュールツリン（N
TN ）からの誘導体部分を含むキメラもしくはハイブリッドポリペプチド分子の 調製について説明する。
【０２６５】 TGF‐βファミリーの密接に関係するメンバーとして、ペルセフィンとニュー ルツリンのそれぞれは、構造全体的に非常に類似性があることが予想される。し
かし、ニュールツリンは交感神経の生存を促進するが、密接な関係にあるペルセ
フィンはそのように働かない。2 つのキメラは、ニュールツリンでペルセフィン
の置換えられた重要な部分により作られ、交差点は、隣接して配置され高度に保
存された第３と第４の２個のシステイン残基の間にある。第1 キメラはPSP/NTN
（SEQ ID NO：１４１、Figure 20 ）と命名され、成熟マウスニュールツリン（ 大腸菌をコドンに使用）の６８から１００の残基を成熟マウスペルセフィンに結
合した第１の６３残基を有する。この分子を構築するために、以下の２つのプラ
イマーを用いて2 つのＰＣＲ反応がなされた。１）フォワードプライマーM2012
(5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAA, SEQ ID NO：１４２) と、リバースプライマーM2
188(5'-TCGTCTTCGTAAGCAGTCGGACGGCAGCAGGGTCGGCCATGGGCTCGAC, SEQ ID NO：１ ４３)と、鋳型（図13を参照）としてｐET30ａ−マウスペルセフィンプラスミド を使用。２）フォワードプライマーM2190(5'-TGCTGCCGTCCGATCGCTTACGAAGACGA,
SEQ ID NO：１４４) と、リバースプライマーM2186(5'-GTTATGCTAGTTATTGCTCAGC
GGT, SEQ ID NO：１４５)と、鋳型としてｐＥＴ30ａ−マウス（大腸菌をコドン とする）ニュールツリンプラスミド（図６参照）を使用。両方のＰＣＲ反応は次
のパラメータ：94℃で30秒、55℃で30秒、７２℃で30秒を25サイクルにより実施
された。これらＰＣＲ反応の産出物は、ゲル精製（gel purified ）された後、 一緒にミックスされた。PCR 反応は次の条件（94℃で30秒、60℃で20秒、68℃で
5 分）行われた。８サイクル行った後、この反応のアリコート（aliquot）はフ ォワードプライマーM2012とリバースプライマーM2186 を使用する第３のPCR 反 応において、テンプレートとして使用された。その時の条件は、94℃で30秒、55
℃で30秒, 72 ℃で30秒の２５サイクルである。生じた結果物はＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼでキナーゼ処理（kinased）された。その末端は、大腸菌DNA ポ リメラーゼ・（Klenow fragment）で平滑処理された。そして、BSKSプラスミド へクローン化された。正しいクーロンが得られたことを確認するために、ヌクレ
オチドの配列化が行われた。PSP／NTN 断片はNde・とBam H1を使って削除され、
続いて細菌発現ベクターｐET30ａの対応サイトにクーロン化された。
【０２６６】 NTN／PSP（SEQ ID NO：１４６、図20参照）と命名された第２のキメラは、コ ンバース分子（converse molecule ）をコードする。これは成熟マウスニュール
ツリン（大腸菌をコドンに使用）の第１の６７残基を含み、成熟マウスペルセフ
ィンの６４から９６の残基と結合する。この分子の構築のために、２つのＰＣＲ
反応を行った。１）フォワードプライマーM2012 とリバースプライマーM2183 （
5'‐CACATCAGCATAG CTGGTGGGCTGGCAGCACGGGTGAGCACGAGCACGTT, SEQ ID NO：１４
７）と、鋳型としてのｐET30ａ−マウス（大腸菌をコドンとして使用）ニュール
ツリンプラスミドとを使用するＰＣＲ反応。２）フォワードプライマーM2187 （
5'‐TGCTGCCAGCCCACCAGCTATGCTG, SEQ ID NO：１４８）と、リバースプライマー
M2186（5'‐GTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGT, SEQ ID NO：１４５）と、鋳型として のｐET30ａ−マウスペルセフィンプラスミドとを使用するＰＣＲ反応。両ＰＣＲ
反応は次の条件（94℃で30秒、55℃で30秒、７２℃で30秒を25サイクル）で行っ
た。これらＰＣＲ反応による結果物は。BamH1 に変えてBgl ・を使用したこと以
外は、上記で詳細に説明した様に、PSP ／NTN のための最終的なNTN ／PSP pET3
0aプラスミドを構築するために使用された。これらのキメラタンパク質は大腸菌
内に産出され、上述したようにＮｉ−ＮTAクロマトグラフィにより精製された（
例１３参照）。
【０２６７】 この精製されたタンパク質は、ＳＣＧ交感神経アッセイにおいて、それらの生
存を促進する能力が評価された。このNTN／PSP タンパク質は生存促進作用が無 い。ところが、この PSP／NTNタンパク質は、ニュールツリンそれ自身で観察さ れた事に類似して、交感神経の生存を促進する。これらの結果は、ＳＧＣ交感神
経において生存促進の活性のために高度な保存性があるシステイン端末は重要で
あり、この２隣接端の下流にニュールツリン残基がある事を示している。対照的
に、ペルセフィンの対応する残基は、交感神経で生存促進に十分な作用が無い。
【０２６８】 例１７ この例は中脳（mesencephalic）細胞中のペルセフィンの神経生存促進活性に ついて説明する。
【０２６９】 ペルセフィンの生存促進活性のプロファイルはニュールツリンとＧＤＮＦのそ
れとは異なる。交感あるいは感覚神経でのニュールツリンとＧＤＮＦによって生
み出される生存促進活性とは対照的に、ペルセフィンはそれらの組織でそのよう
な活性を示さない。我々はさらに、中脳（mesencephalic）細胞中のペルセフィ ンの神経生存促進活性について評価した。
【０２７０】 タイムド−プレグナントスプラグ−ダウリー（Timeed−pregnant Sprague −D
awley）のラットは、Harlan Sprague Dawley から購入した。中脳（mesenceph
alon）は、１．２から１．４ｃｍの身長、で１４日胚であるラットから採取した
。頭蓋は除去され、全メセンセファロンはcold L15 に静置された。DME／Hams Ｆ12（#11330-032、Life Technologies）１mg／mlBSA 、Fraction V （Ａー
6793、Sigma Chemical co.,）、５μM insulin（- 5500、Sigma）、10 nMｐ
progesterone（PO 130、Sigma）、100 μM putrescine、（p7505、Sigma）、3
0 nM Selenium（SO7150、Pflatz＆ Bauer ）、10 ng／ml ラットTransferr
rin（0120-000-050、Jackson Chrompure ）、100 U／ml penicillin、そしてst
reptomysin 100 U／mlからなる無血清培地で、このプールされた中脳組織は再 懸濁された。このプールされた中脳組織は、凡そ８０回、ベントーチップピペッ
トを使用して粉砕された。そして、100-μl のドロップ（drop）中 15000 の細
胞密度で、２４−ウエル皿（Coster）内で平板培養された。この皿は125ng ／ml
poly-d-lysine、（ｐ-7280,Sigma）と、２５ng／ml laminin （#40232 Coll
aborative BiomedicalProduct）によってコートされた。これら解離された細胞 は５％のＣＯ2,３７℃で２時間、付着することができ、さらに、約100 ng／mlの
組換えペルセフィンと共に、或いは、組換えペルセフィン無しで、上記血清培地
500μl を別途加えた。これらの細胞は、３日間の培養の後、写真撮影された。
【０２７１】 培養の３日間に亘る細胞の観察で、細胞数が徐々に減ることが確認された。何
らかの成長因子が欠如して、ほとんどすべての細胞が死滅した（図２１A参照） 。ペルセフィンの存在下では、中脳神経細胞の生存に関して、大きく増加するこ
とが確認された（図２１B参照）。
【０２７２】 上記研究は繰り返され、ペルセフィン及び関連する成長因子であるニュールツ
リン及びGDNFに対する中脳細胞における相対的な効果を得た。中脳組織はE１４ パール（par）ppsから除去され、プールされて、３０分間ディスパーゼ（dispas
e）にて分解させた。それから細胞は粉砕され、捕足N2倍地にてプ培養させ、８ ウエルチャンバースライク（slike）でのウエル当たり２０，０００細胞の密度 で培養された。一定のウエル中での細胞は、処理されない又は４日間５０ｎｇ/ ｍｌでの成長因子で処理されるかの何れかを受けた。細胞を１回PBSで洗浄し、 ４％のパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、チロシンヒドロキシラーゼ（TO
H）抗体で染色して（Chemicon, ABC‐Vectastainキット）、数を数えた。TOH染 色は、TOHがドーパミンに対する合成酵素であるので、ドーパミン作動性細胞の マーカーとして働く。図２２は、未処理と処理済細胞とに対する平均細胞数を示
す。ペルセフィン（PSP）、ニュールツリン（NTN）及びGDNFは、比較できる程度
に、中脳神経細胞の生存を促進させる。
【０２７３】 例１８ この例は種々の組織におけるペルセフィンの発現について説明する。
【０２７４】 ペルセフィン発現の調査は、準定量的（semi-quantitative ）ＲＴ／ＰＣＲを
使って、成体マウスの組織中で行った（例９参照）。ポリＲＮＡは脳、小脳、腎
臓、肺、心臓、卵巣、坐骨神経、背根神経節、血液そして脾臓から分離された。
そして、これはｃＤＮＡを創出するために逆転写された（Kotzbauer et al．Na
ture 384：467- 470、1996 参照により本文に採用）。ＰＣＲプライマーには 次のものを使用した。フォワードプライマー： 5'‐CCTCGGAGGAGAAGGTCATCTTC(S
EQ ID NO：１４９)、そして,リバースプライマー：TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCATA
(SEQ ID NO：１０１)。ＰＣＲは60℃のアニーリング温度で２６サイクル行った 。ゲノムＤＮＡの有無を対照するため、逆転写されていないＲＮＡのサンプルが
ＰＣＲに用いられた（例えば、図２２に示された組織対照はkidney RTと符号が
付された）。すべてのサンプルはゲノムＤＮＡの汚染無しに見出された。
【０２７５】 図２３で明らかなように、腎臓サンプルには正しい大きさ（160ｂｐ）のバン ドが見られた。より高い周期数のペルセフィンバンドは脳で見られた。すなわち
、種々のマウス組織のペルセフィンの発現分布は、ラットのニュールツリンのそ
れとは異なる（例８参照）。菌株の寄託 以下の菌株はブダペスト条約に従い、American Type Culture Collection(123
01 Parklawn Drive, Rockville, MD) に寄託されている。生存能力試験をパスし
た後、表示の受入れ番号が割り当てられ、必要な供託料が支払われた。特許出願
中の当該培養組織へのアクセスは、37 CFR( 連邦規制基準) 1.14 および35 USC
（合衆国法典) 122 の規定により、コミッショナーにより同培養組織を入手する
権限を有するとみなされる者に対して許可される。当該培養組織の一般による利
用可能性に対するあらゆる制約は、出願に基づいた特許が下りた時点で全て撤廃
される。さらに指定寄託金は、供託日から３０年間、または寄託の最終要請日後
５年間、または米国特許が効力を有する期間のうち、いずれか最長の期間保管さ
れる。培養組織の生存能力が失われた場合、または不注意で培養組織が破壊され
た場合、またはプラスミド含有菌株の場合でプラスミドが失われた場合、生存能
力のある培養組織と取り換えるものとする。本文に記載する寄託物は、便宜のみ
を目的に意図されたものであり、ここに説明した観点からは本発明の実施に必要
なものではない。なお、これらの寄託物は参考のため本文に引用されている。
【０２７６】
【表４】 上記に鑑みて、本発明でいくつかの利点が得られ、かつ他にも有益な結果が得
られることを理解できるであろう。
【０２７７】 政府助成金について 本発明は助成金番号NS24679及びCA53524の政府助成を受けて行われた。政府は
本発明に関与する権利を有する。
【０２７８】 発明の範囲から逸脱することなく、上記の方法および構成を様々に変えること
が可能であるゆえに、上記の説明に含まれ且つ添付の図で示した全ての事項は、
実例的なものであり、制限を目的とするものではないと解釈されるべきであるこ
とが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＣＨＯ細胞からニュールツリンを調製する精製スキームを示す図であ
る。
【図２】 図２ａはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上の各分画の電気泳動及び銀染色に
よるタンパクの視覚化、図２ｂは上頸神経節生存アッセイ検定中の各分画の中に
ある神経栄養性活性とを示す、ニュールツリンを精製する段階においてモノＳカ
ラムから溶離された分画の特徴を示す図である。
【図３】 図３ａは神経成長因子（NGF）によって維持される陽性対照細胞、図３ｂは減 少された生存を示す抗NGF 抗体によって処置される陰性対照細胞、図３ｃはニュ
ーロンの生存を示す抗NGF 及びニュールツリン（約３ng/ml ）によって処置され
た細胞とを示す、培養中の上頸神経節細胞の生存を維持するニュールツリンの能
力を示す図である。
【図４】 図４は、上頸神経節生存検定におけるニュールツリンの濃度−応答効果を示す
図である。
【図５】 図５は、ヒトニュールツリン（ｈNTN ）、マウスニュールツリン（ｍNTN ）、
ラットGDNF（ｒGDNF）、マウスGDNF（ｍGDNF）及びヒトGDNF（ｈGDNF）といった
成熟成長因子に対するアミノ酸配列の相同性が、同一のアミノ酸残基をボックス
で囲んで示される図である。
【図６】 図６は、胚２１日目（E２１）のラット及び成体ラットから獲得されたＲＮＡ 試料に対するＲＴ/ＰＣＲ分析を使用したニュールツリンｍＲＮＡ及びGDNFに対 するｍＲＮＡの組織分布を示す図である。
【図７】 図７は、核酸１乃至５７のプレ領域（配列番号(SEQ ID NO)：１７）、核酸５ ８乃至２８５のプロ領域（配列番号(SEQ ID NO)：２０）、核酸２８６乃至５９ １のヒトニュールツリン（配列番号(SEQ ID NO)：９）及び核酸１乃至１６９（ 配列番号(SEQ ID NO)：２７）及び核酸１７０乃至５９４（配列番号(SEQ ID NO)
：２８）の２つのエキソンのコーティング配列部分を画成する核酸１６９及び１
７０の間のスプライス部位を示す、ｃDNA 及びヒトプレプロ(pre-pro) ニュール
ツリンのコード化されたアミノ酸配列（配列番号(SEQ ID NO)：１１）を示す図 である。
【図８】 図８は、核酸１乃至５７のプレ領域（配列番号(SEQ ID NO)：１８）、核酸５ ８乃至２８５のプロ領域（配列番号(SEQ ID NO)：２１）、核酸２８６乃至５８ ５のヒトニュールツリン（配列番号(SEQ ID NO)：１０）及び核酸１乃至１６９ （配列番号(SEQ ID NO)：２９）及び核酸１７０乃至５９４（配列番号(SEQ ID N
O)：３０）の２つのエキソンのコーティング配列部分を画成する核酸１６９及び
１７０の間のスプライス部位を示す、ｃＤＮＡ及びマウスプレプロニュールツリ
ンのコード化されたアミノ酸配列（配列番号(SEQ ID NO)：１２）を示す図であ る。
【図９】 図９は、プレプロニュールツリンのコーディング領域に連続する、５’非コー
ディング領域（配列番号(SEQ ID NO)：１３）及び３’非コーディング領域（配 列番号(SEQ ID NO)：１４）を夫々含むマウスｃＤＮＡ配列を示す図である。
【図１０】 図１０は、NTN ，GDNF，BDNF，NGF 及びAMO に対する平板培養の２４時間後に
処理されたＥ１８ラット結節性神経節ニューロンのニューロン生存の割合を示す
図である。
【図１１】 図１１は、マウスペルセフィンのヌクレオチド及びアミノ酸配列（夫々、配列
番号(SEQ ID NO) ：７０，８０，８１；アミノ酸残基５２乃至１４０，４７乃至
１４２，９乃至１４２）を示す図である。
【図１２】 図１２は、マウスGDNF（配列番号(SEQ ID NO)：８７），マウスニュールツリ ン(NTN) （配列番号(SEQ ID NO)：８８）及びマウスペルセフィン(PSP) （配列 番号(SEQ ID NO)：８９）に対する第１カノニカルフレームワーク(canonical fr
amework) システインから開始して整列された第１カノニカルフレームワークシ ステイン残基と第７カノニカルフレームワークシステイン残基の間の領域の中の
ファミリーメンバー配列同一性を示す図である。
【図１３】 図１３は、ｃＤＮＡの末端の急速増幅技術によって獲得されたラットペルセフ
ィンｃＤＮＡ（配列番号(SEQ ID NO)：９７）の部分配列を示す図である。
【図１４】 図１４は、ラットペルセフィンの第１カノニカルフレームワークシステインか
ら始まる部分配列（配列番号(SEQ ID NO)：８３）及び対応するポリヌクレオチ ド配列（配列番号(SEQ ID NO)：８６）を示す図である。
【図１５】 図１５ＡはヒトGDNF（配列番号(SEQ ID NO)：２４０）、ラットGDNF（配列番 号(SEQ ID NO)：２４１）、マウスGDNF（配列番号(SEQ ID NO)：２４２）、ヒト
ニュールツリン(h NTN)（配列番号(SEQ ID NO)：３１） 、マウスニュールツリ ン（ＮＴＮ（マウス）；配列番号(SEQ ID NO)：３２）及びラットペルセフィン(
PSP（マウス）；配列番号(SEQ ID NO)：８２))といった成熟成長因子のファミリ
ーメンバー配列相同性を示す第１乃至第７カノニカルフレームワークシステイン
残基からの部分アミノ酸配列に整列されたファミリーメンバーが、２８の保存ア
ミノ酸残基をボックスで囲んで示された図であり、図１５Ｂは成熟マウスペルセ
フィン（ｍＰＳＰ；配列番号(SEQ ID NO)：１８７）、成熟ラットペルセフィン （ｍＰＳＰ；配列番号(SEQ ID NO)：１９８）及び成熟ヒトペルセフィン（ｈＰ ＳＰ；配列番号(SEQ ID NO)：２２１）の整列配列を示す。
【図１６】 図１６は、クラスタル方法を使用して整列されたＴＧＦ‐βスーパーファミリ
ーのメンバーの配列を、第１カノニカルフレームワークシステインから配列の末
端まで、形質転換成長因子‐β１（ＴＧＦβ１），形質転換成長因子‐β２（Ｔ
ＧＦβ２），形質転換成長因子‐β３（ＴＧＦβ３），インヒビンβＡ（ＩＮＨ
βＡ），インヒビンβＢ（ＩＮＨβＢ），結節遺伝子（ＮＯＤＡＬ），骨形態形
成タンパク２及び４（ＢＭＰ２及びＢＭＰ４），ショジョウバエデカペンタプレ
ジック（decapentaplegic ）遺伝子（ｄｐｐ），骨形態形成タンパク５乃至８（
ＢＭＰ５，ＢＭＰ６，ＢＭＰ７及びＢＭＰ８），ショウジョウバエ６０Ａ遺伝子
ファミリー（６０Ａ），骨形態形成タンパク３（ＢＭＰ３），Ｖｇ１遺伝子，成
長分化因子１及び３（ＧＤＦ１及びＧＤＦ３），ドーサリン（ｄｒｓｌｎ），イ
ンヒビンα（ＩＮＨα），ＭＩＳ遺伝子（ＭＩＳ），成長因子９（ＧＤＦ‐９）
，グリア由来神経成長因子（GDNF）及びニュールツリン（NTN ）の順で示す図で
ある。
【図１７】 図１７（Ａ）は位置１５５‐２４２からの８８ｎｔイントロンを示す矢印と共
に全長マウスペルセフィン遺伝子（配列番号(SEQ ID NO)：１７１）を示し、図 １７（Ｂ）は、コード化されたアミノ酸配列（配列番号(SEQ ID NO)：１８５） のあるマウスプレプロペルセフィン（配列番号(SEQ ID NO)：１７９）のヌクレ オチド配列を示す。
【図１８】 図１８（Ａ）は、位置１５５‐２４２からの８８ｎｔイントロンを示す矢印と
共に全長ラットペルセフィン遺伝子（配列番号(SEQ ID NO)：１８８）を示し。 図１８（Ｂ）は、コード化されたアミノ酸配列（配列番号(SEQ ID NO)：１９６ ）のあるラットのプレプロペルセフィン（配列番号(SEQ ID NO)：１９０）のヌ クレオチド配列を示す。
【図１９】 図１９は、非組換えベクターのみ（ｐＣＢ６，レーン４）及び大腸菌によって
生成された成熟タンパク（レーン１）で形質変換された細胞と比較して、マウス
ペルセフィン遺伝子（レーン２）又はラットペルセフィン遺伝子（レーン３）で
形質変化されたＣＯＳサル細胞から、細胞ライゼート中のペルセフィンタンパク
を検出するための抗ペルセフィン抗体を使用したウェスタンブロット図を示す。
【図２０】 図２０は、マウスキメラ分子を示す図であり、Ａは、ペルセフィン断片（残基
１乃至６３）及びニュールツリン断片（残基６８乃至１００９を含むＰＳＰ／Ｔ
ＮＴ、Ｂは、ニュールツリン断片（残基１乃至６７）及びペルセフィン断片（残
基６４乃至９６）を含むＮＴＮ／ＰＳＰが夫々交差点を示す矢印と共に示す。
【図２１】 図２１は、３日間に亘って培養されたマウス胚１４日目の中脳細胞の中のペル
セフィンの生存促進効果を、（ａ）殆ど全ての細胞が死滅したペルセフィンの無
い場合と、（ｂ）実質的なニューロン細胞生存が明らかであるペルセフィン（１
００ｎｇ／ｍｌ）が存在する場合とによって示す。
【図２２】 図２２は、チロシンヒドロキシラーゼで染色された細胞の数を測定し、ニュー
ルツリン（ＮＴＮ）及びＧＤＮＦの効果と比較して、マウス胚１４日目の中脳細
胞中のペルセフィンの生存促進効果を示す。
【図２３】 図２３は、腎臓細胞によるペルセフィン発現を示す大人のマウス組織でのペル
セフィン発現でのＲＴ/ＰＣＲサーベイを示す図である。
【図２４】 図２４は、位置３０及び３６０に示す二つのサイレント突然変異のあるヒトプ
レプロペルセフィン（配列番号(SEQ ID NO)：２０３）のｃＤＮＡ配列と、アミ ノ酸の位置２４で二つの星印（**）で示されるプロ領域の第一のアミノ酸と、ア
ミノ酸の位置６１で一つの星印（*）で示される成熟ヒトペルセフィンの第一の アミノ酸のあるコード化されたアミノ酸配列（配列番号(SEQ ID NO)：２１７） とを示す。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月１６日（２０００．３．１６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項９】 請求項１記載のペルセフィンポリペプチドのフラグメントと
、ペルセフィン以外のＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーからの少なくとも一つの成
長因子のフラグメントとを含むパン(pan) 成長因子。
【請求項１０】 請求項１の成長因子をコード化するヌクレオチド配列、又
は少なくとも１５の隣接ヌクレオチドからなる前記ヌクレオチド配列のフラグメ
ントを含む分離、精製された核酸分子又はそれと相補的核酸分子。
【請求項１１】 中脳細胞で生存を促進させるペルセフィンポリペプチドを
コード化するヌクレオチド配列を含む請求項１０の分離、精製された核酸分子ま
たはそれと相補的核酸分子であって、配列番号(SEQ ID NO)１８３、配列番号(SE
Q ID NO)１８４、配列番号(SEQ ID NO)１９４、配列番号(SEQ ID NO)１９５、配
列番号(SEQ ID NO)１９９、配列番号(SEQ ID NO)２００、配列番号(SEQ ID NO) ２０１、又は配列番号(SEQ ID NO)２０２と特別にハイブリダイズする核酸分子 又はそれの補体。
【請求項１２】 配列番号(SEQ ID NO)１８３、配列番号(SEQ ID NO)１９４
、配列番号(SEQ ID NO)１９９又は配列番号(SEQ ID NO)２０１を含む請求項１１ の分離、精製された核酸分子又はそれと相補的核酸分子。
【請求項１３】 請求項１０記載の核酸分子と操作可能的に連鎖した発現調
節要素を有する組換えＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項１４】 請求項１３のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】 （ａ）配列番号(SEQ ID NO)１７９、配列番号(SEQ ID N
O)１８０、配列番号(SEQ ID NO)１９０、配列番号(SEQ ID NO)１９１、配列番号
(SEQ ID NO)２０３、配列番号(SEQ ID NO)２０４、配列番号(SEQ ID NO)２０５ 又は配列番号(SEQ ID NO)２０６で記述されるプレプロペルセフィン核酸配列、 又は配列番号(SEQ ID NO)１７９、配列番号(SEQ ID NO)１８０、配列番号(SEQ I
D NO)１９０、配列番号(SEQ ID NO)１９１、配列番号(SEQ ID NO)２０３、配列 番号(SEQ ID NO)２０４、配列番号(SEQ ID NO)２０５又は配列番号(SEQ ID NO) ２０６と特別にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、 （ｂ） 配列番号(SEQ ID NO)１８１、配列番号(SEQ ID NO)１８２、配列番号
(SEQ ID NO)１９２、配列番号(SEQ ID NO)１９３、配列番号(SEQ ID NO)２１３ 、配列番号(SEQ ID NO)２１４、配列番号(SEQ ID NO)２１５又は配列番号(SEQ I
D NO)２１６で記述されるペルセフィンポリヌクレオチドのプレプロ領域と、 （ｃ） 配列番号(SEQ ID NO)２０７、配列番号(SEQ ID NO)２０８、配列番号
(SEQ ID NO)２０９又は配列番号(SEQ ID NO)２１０で記述されるペルセフィンポ
リヌクレオチドのプレ領域と、 （ｄ） 配列番号(SEQ ID NO)２１１又は配列番号(SEQ ID NO)２１２で記述さ
れるペルセフィンポリヌクレオチドのプロ領域と、又は （ｅ） 少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含むそれらのフラグメント
とを含む分離、精製された核酸分子。
【請求項１６】 （ａ）請求項１記載の成長因子をコード化するポリヌクレ
オチドを、ポリヌクレオチドと操作可能に連鎖した調節要素を含む発現ベクター
にサブクローン化し、 （ｂ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質変換し、 （ｃ）前記宿主細胞を宿主細胞培養内で成長させ、 （ｄ）前記宿主細胞培養から成長因子及び／又はポリヌクレオチドを収穫する ことからなる組換え方法。
【請求項１７】 請求項１に記載された成長因子又はそのエピトープと反応
し得る分離、精製された抗体。
【請求項１８】 患者から採取されたサンプル中の成長因子の有無を検出す
る方法であって、 請求項１７記載の抗体を前記サンプル中の成長因子と反応させ、 前記抗体と前記成長因子の結合を検出する方法。
【請求項１９】 患者から採取されたサンプル中の成長因子の有無を検出す
るキットであって、 容器内に包装された前記成長因子と検出可能な反応を起こし得る請求項１７記
載の抗体を含むキット。
【請求項２０】 個体の細胞の変性又は機能不全を防止又は処置する方法で
あって、請求項１の成長因子若しくは請求項１の成長因子をコード化するポリヌ
クレオチドの治療に有効な量を、個体に投与することからなる方法。
【請求項２１】 細胞の変性又は機能不全は、 （ａ） 末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソ
ン氏病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経系腫
瘍、多発性硬化症、又は感染から生じた神経変性疾患である、 （ｂ） 好酸球減少、好塩基球減少、リンパ球減少、単球減少、好中球減少、 貧血、血小板減少、及び、それらに対する幹細胞機能不全から生ずる造血細胞の 変性又機能不全である、 （ｃ） 心筋症又は鬱血性心不全から生じた心筋の変性又は機能不全である請 求項２０記載の方法。
【請求項２２】 請求項１の成長因子を発現する細胞を個体に移植すること
からなる、個体の細胞の変性又は機能不全を防止又は処置する方法。
【請求項２３】 患者から採取されたサンプル中の成長因子の有無を検出す
る方法において、 請求項１記載の成長因子をコード化するｍＲＮＡのサンプル中で有無を検出及
び／又は定量する方法。
【請求項２４】 ペルセフィン遺伝子変質を検出する方法において、 細胞内で遺伝子変質の存在を示す完全ではないペルセフィン遺伝子の有無を検
出する方法。
【請求項２５】 請求項１記載の成長因子を培養培地に添加することからな
る、培養培地中の細胞の成長及び／又は分化を促進させる方法。
【請求項２６】 請求項１０記載の核酸配列と相補性があり、コード化され
たペルセフィンポリペプチドの転写及び／又は翻訳を防止するためペルセフィン
をコード化する天然ＤＮＡ又はｍＲＮＡポリヌクレオチド配列とハイブリダイズ
し得る配列を含む、分離、精製されたペルセフィンアンチセンスポリヌクレオチ
ド。
【請求項２７】 細胞の集合によるペルセフィンの発現によって感染された
疾病病状を治療する方法であって、 請求項２６記載のアンチセンスポリヌクレオチドの抑制に有効な量を前記細胞
に投与する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０２７４】 ペルセフィン発現の調査は、準定量的（semi-quantitative ）ＲＴ／ＰＣＲを
使って、成体マウスの組織中で行った（例９参照）。ポリＲＮＡは脳、小脳、腎
臓、肺、心臓、卵巣、坐骨神経、背根神経節、血液そして脾臓から分離された。
そして、これはｃＤＮＡを創出するために逆転写された（Kotzbauer et al．Na
ture 384：467‐470、1996 参照により本文に採用）。ＰＣＲプライマーには 次のものを使用した。フォワードプライマー： 5'‐CCTCGGAGGAGAAGGTCATCTTC(S
EQ ID NO：１４９)、そして, リバースプライマー：TCATCAAGGAAGGTCACATCAGCAT
A(SEQ ID NO：１０１) 。ＰＣＲは60℃のアニーリング温度で２６サイクル行っ た。ゲノムＤＮＡの有無を対照するため、逆転写されていないＲＮＡのサンプル
がＰＣＲに用いられた（例えば、図２３に示された組織対照はkidney RTと符号
が付された）。すべてのサンプルはゲノムＤＮＡの汚染無しに見出された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】 図１５（Ａ）ヒトGDNF（配列番号(SEQ ID NO)：２４０）、ラットGDNF（配列 番号(SEQ ID NO)：２４１）、マウスGDNF（配列番号(SEQ ID NO)：２４２）、ヒ
トニュールツリン(h NTN)（配列番号(SEQ ID NO)：３１） 、マウスニュールツ リン（ＮＴＮ（マウス）；配列番号(SEQ ID NO)：３２）及びラットペルセフィ ン(PSP（マウス）；配列番号(SEQ ID NO)：８２))といった成熟成長因子のファ ミリーメンバー配列相同性を示す第１乃至第７カノニカルフレームワークシステ
イン残基からの部分アミノ酸配列に整列されたファミリーメンバーが、２８の保
存アミノ酸残基をボックスで囲んで示された図であり、図１５（Ｂ）は成熟マウ
スペルセフィン（ｍＰＳＰ；配列番号(SEQ ID NO)：１８７）、成熟ラットペル セフィン（ｒＰＳＰ；配列番号(SEQ ID NO)：１９８）及び成熟ヒトペルセフィ ン（ｈＰＳＰ；配列番号(SEQ ID NO)：２２１）の整列配列を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 19/34 Ａ ４Ｃ０８６ 5/10 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 19/34 Ｇ０１Ｎ 33/53 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ミルブラント，ジェフリー ディ アメリカ合衆国 ミズーリ州 63105 セ ント・ルイス アバディーン・プレイス 75 (72)発明者 コッツバウアー，ポール ティ アメリカ合衆国 ペンシルヴェニア州 19014 アストン ビショップス・ドライ ヴ 17 (72)発明者 ランプ，パトリシア エイ アメリカ合衆国 ミズーリ州 63123 セ ント・ルイス グラント・フォレスト・レ ーン 10323 (72)発明者 クライン，ロバート アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94301 パロ・アルト ウェブスター・ス トリート 1044 (72)発明者 ドゥソヴェジ，フレッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94404 フォスター・シティ ビーチ・パ ーク・ブールヴァード 166 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA56 BA61 CA03 CA04 CA09 CA12 DA02 DA06 EA03 EA04 GA11 GA13 GA14 HA14 HA15 4B063 QA01 QA07 QA18 QA19 QQ03 QQ08 QQ53 QQ79 QR32 QR48 QR51 QR56 QS16 QS25 QS33 QS34 QS36 QX02 4B064 AG13 AG26 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 CE06 CE11 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA90X AA91Y AA93Y AB01 BA02 BA03 BA05 BD17 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 BA21 BA22 BA23 CA53 DB59 MA67 NA14 ZA021 ZA022 ZA151 ZA152 ZA161 ZA162 ZA361 ZA362 ZA401 ZA402 ZA511 ZA512 ZB261 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA67 ZA02 ZA15 ZA16 ZA36 ZA40 ZA51 ZB26 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA15 BA17 BA19 BA20 BA21 CA40 DA21 DA75 DA76 EA21 EA23 EA24 EA50 FA74 GA10 GA23 GA26

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ペルセフィン若しくはそのフラグメント又はその保存的置換
    変異型を含む分離、精製された成長因子。 【請求項２】 配列番号(SEQ ID NO)７９若しくは配列番号(SEQ ID NO)８２
    又は配列番号(SEQ ID NO)２２３、又はそれらの保存的置換変異型と少なくとも 約７５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む請求項１記載の分離、精
    製された成長因子。 【請求項３】 配列番号(SEQ ID NO)１８７、配列番号(SEQ ID NO)１９８、
    配列番号(SEQ ID NO)２２１及びそれらの保存的置換変異型で記述されるポリペ プチド配列を含む請求項２記載の分離、精製された成長因子。 【請求項４】 中脳細胞での生存を促進させる請求項３記載の分離、精製さ
    れた成長因子。 【請求項５】 （ａ） 配列番号(SEQ ID NO)２１７、配列番号(SEQ ID NO)
    １８５、又は配列番号(SEQ ID NO)１９６で記述されるプレプロペルセフィンと 、 （ｂ） 配列番号(SEQ ID NO)２１８、配列番号(SEQ ID NO)１８６、又は配列
    番号(SEQ ID NO)１９７で記述されるペルセフィンのプレプロ領域と、 （ｃ） 配列番号(SEQ ID NO)２１９で記述されるペルセフィンのプレ領域と 、 （ｄ） 配列番号(SEQ ID NO)２２０で記述されるペルセフィンのプロ領域と 、 （ｅ） 上記の保存的置換変異型とを含む分離、精製されたポリペプチド。 【請求項６】 配列番号(SEQ ID NO)７９若しくは配列番号(SEQ ID NO)８２
    又は配列番号(SEQ ID NO)２２３と少なくとも約６５％の配列同一性を有するア ミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、非哺乳類からのものである請求項１記載
    の分離、精製された成長因子。 【請求項７】 ニュールツリン−ペルセフィン−ＧＤＮＦファミリーメンバ
    ー成長因子を獲得する方法であって、 （ａ）ヒトゲノム又はｃＤＮＡライブラリから、ペルセフィン、ニューツリン
    若しくはＧＤＮＦ配列又はそれらのフラグメントを含むポリヌクレオチドとハイ
    ブリダイズするクローンを分離し、又は、ヒトゲノム又はｃＤＮＡテンプレート
    から、ペルセフィン、ニューツリンの二つの保存領域若しくはＧＤＮＦ又は前記
    保存領域のフラグメントのプライマーを変性させるポリメラーゼチェーン反応法
    を利用してクローンを分離し、 （ｂ）前記クローンを配列決定することからなる方法。 【請求項８】 ペルセフィンと約３０％乃至約７５％の配列同一性を有し、
    ニュールツリンと約３０％乃至約８５％の配列同一性を有し、ＧＤＮＦと約３０
    ％乃至約７５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むニュールツリン−ペル
    セフィン−ＧＤＮＦファミリーメンバーであり、配列番号(SEQ ID NO)１０８と 少なくとも６２．５％の配列同一性を、又は配列番号(SEQ ID NO)１０９と少な くとも６２．５％の配列同一性を、又は配列番号(SEQ ID NO)１１０と少なくと も５０％の配列同一性を有するアミノ酸の保存領域の配列を含む分離、精製され
    た成長因子。 【請求項１３】 請求項１記載のペルセフィンポリペプチドのフラグメント
    と、ペルセフィン以外のＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーからの少なくとも一つの
    成長因子のフラグメントとを含むパン(pan) 成長因子。 【請求項１４】 請求項１の成長因子をコード化するヌクレオチド配列、又
    は少なくとも１５の隣接ヌクレオチドからなる前記ヌクレオチド配列のフラグメ
    ントを含む分離、精製された核酸分子又はそれと相補的核酸分子。 【請求項１５】 中脳細胞で生存を促進させるペルセフィンポリペプチドを
    コード化するヌクレオチド配列を含む請求項１４の分離、精製された核酸分子ま
    たはそれと相補的核酸分子であって、配列番号(SEQ ID NO)１８３、配列番号(SE
    Q ID NO)１８４、配列番号(SEQ ID NO)１９４、配列番号(SEQ ID NO)１９５、配
    列番号(SEQ ID NO)１９９、配列番号(SEQ ID NO)２００、配列番号(SEQ ID NO) ２０１、又は配列番号(SEQ ID NO)２０２と特別にハイブリダイズする核酸分子 又はそれの補体。 【請求項１６】 配列番号(SEQ ID NO)１８３、配列番号(SEQ ID NO)１９４
    、配列番号(SEQ ID NO)１９９又は配列番号(SEQ ID NO)２０１を含む請求項１５
    の分離、精製された核酸分子又はそれと相補的核酸分子。 【請求項１７】 請求項１４記載の核酸分子と操作可能的に連鎖した発現調
    節要素を有する組換えＤＮＡ分子を含むベクター。 【請求項１８】 請求項１７のベクターで形質転換された宿主細胞。 【請求項１９】 （ａ）配列番号(SEQ ID NO)１７９、配列番号(SEQ ID N
    O)１８０、配列番号(SEQ ID NO)１９０、配列番号(SEQ ID NO)１９１、配列番号
    (SEQ ID NO)２０３、配列番号(SEQ ID NO)２０４、配列番号(SEQ ID NO)２０５ 又は配列番号(SEQ ID NO)２０６で記述されるプレプロペルセフィン核酸配列、 又は配列番号(SEQ ID NO)１７９、配列番号(SEQ ID NO)１８０、配列番号(SEQ I
    D NO)１９０、配列番号(SEQ ID NO)１９１、配列番号(SEQ ID NO)２０３、配列 番号(SEQ ID NO)２０４、配列番号(SEQ ID NO)２０５又は配列番号(SEQ ID NO) ２０６と特別にハイブリダイズするポリヌクレオチドと、 （ｂ） 配列番号(SEQ ID NO)１８１、配列番号(SEQ ID NO)１８２、配列番号
    (SEQ ID NO)１９２、配列番号(SEQ ID NO)１９３、配列番号(SEQ ID NO)２１３ 、配列番号(SEQ ID NO)２１４、配列番号(SEQ ID NO)２１５又は配列番号(SEQ I
    D NO)２１６で記述されるペルセフィンポリヌクレオチドのプレプロ領域と、 （ｃ） 配列番号(SEQ ID NO)２０７、配列番号(SEQ ID NO)２０８、配列番号
    (SEQ ID NO)２０９又は配列番号(SEQ ID NO)２１０で記述されるペルセフィンポ
    リヌクレオチドのプレ領域と、 （ｄ） 配列番号(SEQ ID NO)２１１又は配列番号(SEQ ID NO)２１２で記述さ
    れるペルセフィンポリヌクレオチドのプロ領域と、又は （ｅ） 少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを含むそれらのフラグメント
    とを含む分離、精製された核酸分子。 【請求項２０】 （ａ）請求項１記載の成長因子をコード化するポリヌクレ
    オチドを、ポリヌクレオチドと操作可能に連鎖した調節要素を含む発現ベクター
    にサブクローン化し、 （ｂ）宿主細胞を前記発現ベクターで形質変換し、 （ｃ）前記宿主細胞を宿主細胞培養内で成長させ、 （ｄ）前記宿主細胞培養から成長因子及び／又はポリヌクレオチドを収穫する
    ことからなる組換え方法。 【請求項２１】 請求項１に記載された成長因子又はそのエピトープと反応
    し得る分離、精製された抗体。 【請求項２２】 患者から採取されたサンプル中の成長因子の有無を検出す
    る方法であって、 請求項２１記載の抗体を前記サンプル中の成長因子と反応させ、 前記抗体と前記成長因子の結合を検出する方法。 【請求項２３】 患者から採取されたサンプル中の成長因子の有無を検出す
    るキットであって、 容器内に包装された前記成長因子と検出可能な反応を起こし得る請求項２１記
    載の抗体を含むキット。 【請求項２４】 個体の細胞の変性又は機能不全を防止又は処置する方法で
    あって、請求項１の成長因子若しくは請求項１の成長因子をコード化するポリヌ
    クレオチドの治療に有効な量を、個体に投与することからなる方法。 【請求項２５】 細胞の変性又は機能不全は、 （ａ） 末梢神経障害、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソ
    ン氏病、ハンティントン病、虚血性発作、急性脳傷害、急性脊髄傷害、神経系腫
    瘍、多発性硬化症、又は感染から生じた神経変性疾患である、 （ｂ） 好酸球減少、好塩基球減少、リンパ球減少、単球減少、好中球減少、
    貧血、血小板減少、及び、それらに対する幹細胞機能不全から生ずる造血細胞の
    変性又機能不全である、 （ｃ） 心筋症又は鬱血性心不全から生じた心筋の変性又は機能不全である請
    求項２４記載の方法。 【請求項２６】 請求項１の成長因子を発現する細胞を個体に移植すること
    からなる、個体の細胞の変性又は機能不全を防止又は処置する方法。 【請求項２７】 患者から採取されたサンプル中の成長因子の有無を検出す
    る方法において、 請求項１記載の成長因子をコード化するｍＲＮＡのサンプル中で有無を検出及
    び／又は定量する方法。 【請求項２８】 ペルセフィン遺伝子変質を検出する方法において、 細胞内で遺伝子変質の存在を示す完全ではないペルセフィン遺伝子の有無を検
    出する方法。 【請求項２９】 請求項１記載の成長因子を培養培地に添加することからな
    る、培養培地中の細胞の成長及び／又は分化を促進させる方法。 【請求項３０】 請求項１４記載の核酸配列と相補性があり、コード化され
    たペルセフィンポリペプチドの転写及び／又は翻訳を防止するためペルセフィン
    をコード化する天然ＤＮＡ又はｍＲＮＡポリヌクレオチド配列とハイブリダイズ
    し得る配列を含む、分離、精製されたペルセフィンアンチセンスポリヌクレオチ
    ド。 【請求項３１】 細胞の集合によるペルセフィンの発現によって感染された
    疾病病状を治療する方法であって、 請求項３０記載のアンチセンスポリヌクレオチドの抑制に有効な量を前記細胞
    に投与する方法。
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