JP2005527614A - 膵臓特異性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
糖尿病を治癒するためには、失われた β 細胞を置換する必要がある。これは現在、膵島または膵臓移植の際に行われている。しかしながら、ドナー臓器は、大部分のインスリン依存型糖尿病性の患者に対する移植のために必要な数にも満たない不足状態である。さらに、患者は臓器移植後に起こり得る一連の異なる副作用および長期にわたる合併症に対処するため、免疫抑制療法を受けなければならない。
多くの膵臓疾患は、膵臓構造の欠陥または不適切な細胞再生に関連するが、これらの欠陥の根底にある分子機構は不明である。しかしながら、数々の研究によって、膵臓細胞の運命、さらに膵臓構造の形態形成、例えば、FGF シグナル伝達、アクチビンシグナル伝達、ヘッジホッグ経路、ノッチシグナル伝達、VEGF シグナル伝達、およびTGF β シグナル伝達経路に影響を及ぼす多くのシグナル伝達経路が同定されている。従来の技術では、特定の膵臓組織における初期発育中に特異的に発現される候補遺伝子の同定が必要とされる。これらの遺伝子およびそれによってコード化されたタンパク質は、重度の膵臓障害および関連疾患の診断および治療に対するツールを提供する。以上の点から、本発明では、発育初期の膵臓組織において特異的に発現されたタンパク質を記述する。本発明は、糖尿病のような膵臓の機能障害、および他の疾患の診断、予防および(または)治療における、これらの遺伝子およびタンパク質の使用法に関するものである。
また、これは、特定の細胞型において発現されたLPA 受容体に特異的なアゴニスト、またはそれらの前駆体が、これらの細胞の成長、分化、または臓器特異性構造を調節できる可能性を高める。例えば、膵臓の幹細胞、その他の幹細胞または新しいインスリン分泌細胞を作成するために使用できるその他の細胞のような特定の細胞型において多かれ少なかれ特異的に発現されるLPA 受容体の刺激作用は、LPA に関する文献において記載された多くの効果にかかわらず、比較的に特異的な応答を作り出し得る。
シャルコー・マリー・ツース (CMT) 末梢神経障害は、末梢神経系に影響を及ぼす疾患の遺伝的な混成群を表す。常染色体優性 CMT 1C 型 (CMT1C)。染色体16p13.1-p12.3 に対して遺伝的にマッピングした。染色体16p13.2 に対してマッピングする上皮 膜タンパク質 2 の遺伝子(EMP2)は、CMT1C の候補遺伝子である (Street V. A., 2002, Am J Hum Genet 70(1):244-250)。
また、別の使用可能な方法としては、ヒトおよび酵母菌の人工染色体DNAにおける既知の配列に近傍するDN断片のPCR増幅を伴うキャプチャPCR法があげられる (Lagerstrom、M.らのPCR Methods Applic. 1:111〜119)。この方法では、PCR を行う前に複数の制限酵素の消化および連結反応をも使用して DNA 分子の未知の部分に組換え二本鎖配列を配置することができる。未知の配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Parker、J. D.らの方法が挙げられる (1991; Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)。加えて、PCR 法、ネステッドプライマー、および PROMOTERFINDER ライブラリを用いて、ゲノム DNA の中に入ることができる (Clontech社、Palo Alto、Calif.)。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。完全長cDNAをスクリーニングする際には、より大きなcDNAを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用することが望ましい。また、ランダム プライム ライブラリには、遺伝子の 5' 領域を含む多くの配列が含まれているので望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを産しない状況において特に望ましい。ゲノムライブラリは、5'および3'非転写調節領域への配列の伸長に対して有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシング産物または PCR 産物のサイズを分析したり、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシーケンシングは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザー駆動の4つの異なる蛍光色素 (各ヌクレオチドあたり 1 個)、および電荷結合素子 (CCD) カメラによる発光波長の検出を用いることが可能である。出力および光の強度は、適切なソフトウェア(例えばPerkin Elmer社のGENOTYPERおよびSEQUENCE NAVIGATOR)を使用して電気信号に変換することができ、試料の取り込みからコンピュータ分析までの全プロセス、および電子データ表示は、コンピュータ制御が可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないような DNA 小片のシークエンシングに特に適している。
本発明のタンパク質を用いて in-situ 発現パターンから取得した本発明に記載のタンパク質が、島細胞 (例えば、DP685; DP160; RA770)、膵臓の間充織 (RA770)、膵臓上皮細胞 (例えば、DP685; DP160)、膵管細胞 (DP160)、同様に、神経管 (DP160; DP444) に沿った神経節、体節 (DP444)、背側菱脳 (DP444)、肝臓 (DP685)、心臓 (DP685)、胃腸 (DP444) および腸内細胞 (DP685; DP444) などの他の細胞のような膵臓細胞において特異的に発現されることが結論できる。以上の点から、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター/修飾因子は、診断目的および治療目的に関与する、例えば、限定するものではないが、上記臓器または組織に関連する糖尿病および肥満症のような代謝障害および機能障害、肝臓疾患および神経疾患、例えば神経変性障害および他の疾患および障害において有用である。従って、本発明のタンパク質は、診断マーカーとして、または小分子スクリーニングの標的として、および糖尿病および(または)肥満症および代謝障害および神経変性疾患、心臓、肝臓、胃腸、または腸内障害のような他の疾患の 予防 または治療において有用であり得る。
ポリヌクレオチド配列は、条件の診断、または本発明のタンパク質の発現に関係する疾患のために使用することができる。そのような状態または疾患の実施例には、糖尿病を含む膵臓の疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。また、ポリヌクレオチド配列を用いて、糖尿病を始めとする膵臓の疾患および障害に対する治療を受けている患者の進歩状況を監視することも可能である。ポリヌクレオチド配列は、本発明の変異タンパク質の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、および PCR 法、またはディップスティック法、ピンアッセイ、ELISA アッセイまたはチップアッセイにおいて使用することができる。このような定性的または定量的方法は当分野で周知である。
(a) 核酸分子またはその機能的断片;
(b) アミノ酸分子または機能的断片またはそのアイソフォーム;
(c) (a) の核酸を備えているベクター;
(d) (a) の核酸または(b) のベクターを含む宿主細胞;
(e) (a) の核酸によってコード化されたポリペプチド;
(f) (a) の核酸によってコード化された融合ポリペプチド;
(g) (a) の核酸または(d)または(e) のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(h) (a) の核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド。
図 1A は、ニワトリ胚 (5 日目、dpb = 背側膵芽、vbp = 腹側膵芽、st = 胃腸、nt = 神経管上でのホールマウント in-situ ハイブリダイゼーションを示す; Fig 1B は、発育中の膵臓組織切片上での in-situ ハイブリダイゼーションを示す。DP293 陽性細胞は青色で示し、インスリンは茶色で染色した)。発現は、膵島 (is) および膵臓上皮および管細胞 (du) の一部の細胞で見ることができる。Fig 1C は、ハイブリダイゼーションによって DP119 発現に対して染色された受精後 5 日目のニワトリの背側部の断面を示す。染色は、分散している神経管 (nt) 細胞および神経管を囲む神経節性細胞において明らかである。
図 1B は、ヒト DP119 の発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における DP119 発現の定量分析である。
図 2A: ヒトDKFZp586L151 に対するニワトリ遺伝子相同性の 3’ を含有する核酸配列 (配列識別番号 1)。下線を引いたのは 3' 非翻訳領域であり、終止コドンは太字で示した。
図 2B: 図 1A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質の配列(配列識別番号 2)。
図 2C: ヒトホモログのタンパク質をコードする 核酸配列(配列識別番号 3) (GenBank アクセッション番号 AL050137.1)。
図 2D: 図 2C に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 4) (GenBank アクセッション番号 CAB43286.1)。
図 2E: マウスホモログのタンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 5) (GenBank アクセッション番号 BC025654.1)。
図 2F: 図 8E に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 6) (GenBank アクセッション番号 Aah25654.1)。
図 2G: 異なる種から取り出した DP119 のアライメント (Mm、マウス; Hs、ホモサピエンス; Dr、ゼブラダニオ Danio rerio; Gg、ニワトリ)
図 3: DP444 の発現
図 3A: 受精後 3.5 日目のニワトリ胚および DP444 プローブを用いたホールマウント in-situ ハイブリダイゼーション。発現は、神経管 (nt) に沿って、および体節、発育中の腸 (in) および鰓弓において観察される。
図 3B: 受精後 4 日目のニワトリ胚および DP444 プローブを用いたホールマウント in-situ ハイブリダイゼーション。発現は、神経管 (nt) に沿って、および体節、発育中の腸 (in) および背側菱脳 (hb) において観察される。
図 3C: 受精後 5 日目のニワトリ胚および DP444 プローブを用いたホールマウント in-situ ハイブリダイゼーション。胃腸 (st) および膵芽 (dpb、vpb) における発現ドメインを示す。
図 3D: 発育中の膵臓 (受精後 5 目のニワトリ) 断面の二重標識。インスリンは茶色に染色し、DP444 発現は紫色に染色する。DP444 の発現は、積極的にインスリン発現とオーバーラップしている膵島 (is) で観察できる。
図 3E: DP444 機能低下はゼブラフィッシュにおける膵島欠損につながる。図 3Ea は、制御アンチセンスオリゴを投与した受精後 24 時間目の胚を示し、図 3Eb は、DP444 の翻訳をブロッキングするアンチセンスオリゴを投与した受精後 24 時間目の サカナ胚を示す。インスリン発現は紫色に染色する。
図 4A: 核酸配列 (配列識別番号 7)。終止コドンは太字で示し、および 3' UTR には下線を引いた。
図 4B: DP444のアミノ酸配列 (配列識別番号 8)。
図 4C: ヒトホモログQV2-NN2006-230401-628-d06 NN2006、配列識別番号 9 の核酸配列 (GenBank アクセッション番号 BI035296)。
図 4D: DP444 (配列識別番号 10) のヒトホモログのアミノ酸配列 (配列識別番号 9 の翻訳)。
図 4E: GenBank アクセッション番号 BF951817 の核酸配列 (QV1-NN0228-091100-436-g05 NN0228 ホモサピエンス、配列識別番号 11)。
図 4F: GenBank アクセッション番号 AI214480.1 の核酸配列; (qg69c12.x1 Soares_NFL_T_GBC_S1 ホモサピエンス、配列識別番号 12)。
図 4G: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_1 の予測 mRNA (配列識別番号 13)。
図 4H: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_1 の予測タンパク質 (配列識別番号 14)。
図 4I: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_3 の予測mRNA (配列識別番号 15)。
図 4J: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_3 の予測タンパク質 (配列識別番号 16)。
図 4K: 異なる種から取り出した DP444 のアライメント (Dr、ゼブラフィッシュ; Mm、マウス; Hs、ホモサピエンス; Gg、ニワトリ)
図 5: DP810 タンパク質に対する in-situ ハイブリダイゼーションの結果
図 5A および 図 5B は、ニワトリ胚 (5 日目) 上でのホールマウント in-situ ハイブリダイゼーションを示す。li = 肝臓、ht = 心臓、dpb = 背側膵芽;
図 5C および 図 5D は、発育中の膵臓 (受精後 5 日目のニワトリ) の断面上での in-situ ハイブリダイゼーションを示す。pe = 膵臓上皮、is = 膵島、pm = 膵臓の間充織.
図 6: DP810 配列。
図 6A: DP810 タンパク質. 3' 非翻訳領域は下線を引いて示し、終止コドンは太字で示した。(配列識別番号 17)
図 6B: 図 6A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質の配列(配列識別番号18)。
図 6C: ヒトホモログ DP810 タンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 19) (GenBank アクセッション番号 NM_02400.1; 多ドメインタンパク質)。
図 6D: 図 6C に示したコーディング配列によってコード化された タンパク質配列(配列識別番号 20) (GenBank アクセッション番号 NP_078776.1)。
FIG 7: DP685 タンパク質の発現。
図 7A および 図 7B は、ニワトリ胚 (A: 受精後 4 日目; B: 受精後 5 日目) 上でのホールマウントin-situ ハイブリダイゼーションを示す。図 7A では、発現が、背側神経管 (nt) に沿って、背側前脳 (fb) および菱脳 (hb) において、鰓弓 (ba) および発育中の後肢 (ahl) の前部において観察される。また、強力なシグナルが、発育中の胃腸 (st) の領域においても観察される。図 7B では、発現が、発育中の胃腸 (st) および背側膵芽 (dpb) において観察される。
図 7C は、ヒトDP685 の発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における DP685 発現の定量分析である。
図 8A: ニワトリDP685 タンパク質をコードする核酸配列(配列識別番号 21)。
図 8B: 図 8A に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列 (配列識別番号 22)。
図 8C: ヒトホモログの DP685 タンパク質(オートタキシン) をコードする核酸配列 (配列識別番号 23)。
図 8D: 図 8C に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 24)。
図 8E: マウスホモログDP685 タンパク質をコードする核酸配列(配列識別番号 25)。
図 8F: 図 8E に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 26)。
図 9A は、ニワトリ胚 (受精後 5 日目) 上のホールマウント in-situ ハイブリダイゼーションを示す。in = 腸、li = 肝臓原基;
図 10: WE474 配列.
図 10A: ニワトリコレクチンの 3' 非翻訳領域から成る核酸配列(配列識別番号 27)。
図 10B: 図 6A に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 28)。
図 10C: ヒトホモログコレクチン COLEC10 タンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 29) (GenBank アクセッション番号 NM_006438.2)。
図 10D: 図 10C に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列 (配列識別番号 30) (GenBank アクセッション番号 NP_006429.1)。
図 11A は、ニワトリ胚 (受精後 5 日目) 上のホールマウント in-situ ハイブリダイゼーションを示す。DP160 は、神経管 (nt) に沿って、中腎 (mn) においておよび発育中の消化管 (胃腸: st; 背側膵芽および腹側膵芽:dpb、vpb) において発現される。
図 11B. 発育中の膵臓 (受精後 5 日目) 断面上の二重標識を示す。インスリンは茶色に染色し、DP160 発現は紫色に染色する。発現は、膵島 (is) および膵臓上皮細胞で見ることができる。
図 12A: 核酸配列 (配列識別番号 31)
図 12B: 図 12A に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列 (配列識別番号 32)。
図 12C: ヒトホモログタンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 33)。
図 12D: 図 12C に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列 (配列識別番号 34)。
図 13A および 図 13B: 受精後 5 日目 ニワトリ胚およびRA977 プローブを用いたホールマウント in-situ ハイブリダイゼーション。RA977 の発現が背側膵芽 (dpb) で観察される。胃腸 (st) で見られる強力なシグナルは、非特異的なプローブ とラッピングに起因する。同一胚を 2 通りの異なる拡大率で示す。
図 14A: RA977 の核酸配列(配列識別番号 35)。終止コドンおよび開始コドンは太字で表し、UTR には下線を引いた。
図 14B: RA977 のアミノ酸配列 (配列識別番号 36)。
図 14C: ホモサピエンス上皮膜タンパク質 2 (EMP2)、mRNA の核酸配列 (GENBANK アクセッション番号 XM_030218.1; 配列識別番号 37)。
図 14D: EMP2_ヒト上皮 膜タンパク質 2 (EMP-2) (XMP タンパク質) のアミノ酸配列 (GenBank アクセッション番号 P54851; 配列識別番号 38)。
図 15A は、ニワトリ胚 (受精後 5 日目) 上でのホールマウント in-situ ハイブリダイゼーションを示す 。dpb = 背側膵芽; vpb = 腹側膵芽; lu = 肺臓、st = 胃腸領域; dd = 十二指腸
図 16: RA770 配列。
図 16A: ニワトリ RA770 タンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 39)
図 16B: 図 16A に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 40)。
図 16C: ヒトホモログRA770 タンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 42) (GenBank アクセッション番号 NM_004558.1; Neurturin)。
図 16D: 図 16C に示したコーディング配列によってコード化されたタンパク質配列(配列識別番号 43) (GenBank アクセッション番号 NP_004549.1)。
図 16E: マウスホモログRA770 タンパク質をコードする核酸配列 (配列識別番号 44) (GenBank アクセッション番号 NM_008738.1; Neurturin)。
図 16F: 図 16E に示したコーディング配列によってコード化された タンパク質配列(配列識別番号 44) (GenBank アクセッション番号 NP_032764.1)。
ニワトリ DPd6 の cDNA ライブラリは、6 日目のニワトリ胚から採取した背側膵芽を使用して構築したものである。凍結組織はホモジナイズかつ溶解した。Brinkmann POLYTRON homogenizer PT-3000 (Brinkman Instruments, Westbury, N.J.)をグラニジウム イソチオシアネート溶液において使用した。溶解物に遠心力 5.7 M CsCl 以上をかける。Beckman SW28 ローター、Beckman L8-70M 超遠心分離機 (Beckman Instruments、Fullerton、Calif.)使用。 18 時間、25,000 rpm、室温。RNA を、4.7 pH 酸フェノールで抽出し、0.3 M 酢酸ナトリウムと容積 2.5 のエタノール沈殿させ、無 RNA 水で再懸濁し、37℃ にてDNAe 処理した。以前の通り RNA を4.7 pH 酸フェノールで繰返し抽出し、酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿させた。 その後、Micro-FastTrack 2.0 mRNA 分離キット(Invitrogen、Groningen、Netherlands)を使用して mRNA を単離し、cDNA ライブラリを構築するために使用した。mRNAs の取り扱いは、SUPERSCRIPT cDNA synthesis and plasmid cloning system (Gibco/BRL) の推奨プロトコルに従って行なった。DH10B 宿主細胞への形質転換に続いて、単一コロニーを摘出し、PCR 法を用いてクローン化された cDNA インサートを増幅した。単一 cDNA インサートを代表する PCR 法によって増幅された断片を、その後に生体外転写し、Digoxygenin 標識 RNA プローブ(Roche)を生成した。RNA プローブをホールマウント in-situ スクリーニングにおいて使用して初期のニワトリ胚におけるそれぞれの遺伝子産物の発現を確定した。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドを、膵臓組織におけるその高発現のおかげで同定した。
実施例 2: in-situ ハイブリダイゼーション
当業者であれば周知の標準プロトコルおよび以前に説明した(例えば、Pelton, R.W. らの(1990) Development 110, 609-620、Belo, J.A. らの(1997) Mech. Dev. 68, 45-57) に従って in-situ ハイブリッド形成法を実行した。
REAL プレP 96 ウェルのプラスミド分離キット (QIAGEN) を用いて、プラスミドDNA を細胞から開放し精製した。このキットは、多重試薬ディスペンサーを使用した96 ウェル ブロックにおいて、96 個のサンプルの同時精製を可能にした。 下記の変更を除いてメーカーの推奨するプロトコルを使用した。変更(i): 細菌を 1 ml の消毒した Terrific Broth (LIFE TECHNOLOGIESTM, Gaithersburg, Md, USA)でカルベニシリンを 25 mg/L で、グリセロームを 0.4 % で用いて培養した。変更(ii): 接種後、培養を 19 時間インキュベートした後、細胞を 0.3 ml 溶解バッファで溶解した。変更(iii): イソプロパノール沈殿に続いて、プラスミドDNA ペレットを 0.1 ml の蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最後のステップの後、サンプルを 4℃ にて保管する 96 ウェル ブロックへ移した。cDNA を GATC Biotech AG (Konstanz、Germany)によって、当業者であれば既知の標準プロトコルに従って配列せしめた。
リーディング・フレームを決定した後に、本発明のヌクレオチド配列から演繹したアミノ酸配列のみならず、本発明のヌクレオチド配列も、GenBank、SwissProt、BLOCKS、および Pima II のようなデータベースに対する問い合わせ配列として使用した。以前に同定され注釈された配列を含むこれらのデータベースで、相同性(類似性) の領域を検索した。使用したのはBLAST(Basic Local Alignment Search Toolの略語、Altschul S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul、S.F. らの(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10)である。BLAST 検索により、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列両方のアライメントを産生し、配列類似性を決定した。ローカル特性をもつアライメントのおかげで、BLAST 検索は、完全なマッチの決定において、または相同体真核(細菌)または原核(動物、カビ、植物) の起源の識別に特に有用である。ここに引用として取り込まれたSmith らの(1992、Protein Engineering 5:35-51)において説明されたような他のアルゴリズムは、一次配列パターンおよび二次構造ギャップのペナルティーを取り扱う場合に使用された。BLAST 検索の方法は、Karlin らの(前出)で詳細に説明したように、ここに引用として取り込まれ、問い合わせ配列とデータベース配列との間のマッチを検索した。BLAST 検索によって見出された任意のマッチの統計的な重要性が評価され、重要性をもつユーザ選択限界を満足するマッチのみが報告された。本出願において、限界値はヌクレオチドに対して 10〜25、およびペプチドに対して 10-14 と設定した。ヌクレオチド配列は、GenBank データベースの霊長類、げっ歯類、および他の哺乳動物の配列に対して検索し、それから同一クローンからの演繹アミノ酸配列を、GenBank の機能的タンパク質データベースの哺乳動物、脊椎、真核生物の相同性に対して検索した。
本発明のタンパク質をコードする完全長核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド配列を完全長に拡張するため、またはゲノム ライブラリから 5' または 3' イントロンまたは他の調節配列を取得するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。単一プライマーを合成してアンチセンス方向における伸長を開始し、他を合成してセンス方向における配列を伸長する。プライマーを用い、領域目的に対して新規ヌクレオチド配列、未知ヌクレオチド配列を含む既知の配列「outward」生成 amplicons の伸長を促進する。初期プライマーは、オリゴ 4.06 プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences)、または別の適切なプログラムを用いて、ヌクレオチド長が 22〜30 となるように、GC 含有率が 50% 以上を有するように、および温度約 68℃ 〜 72℃ で標的配列にアニールするように cDNA から設計した。ヘアピン二量化をもたらすようなヌクレオチドは避けた。元の選択したcDNA ライブラリ、またはヒトゲノム ライブラリを用い、配列を伸長した。後者(ヒトゲノム ライブラリ)は5' 上流領域を取得するために最も有用である。より多くの伸長または所望の必要な場合は、追加プライマーセットをデザインして既知領域を伸長する。XL-PCR キット(Perkin Elmer) の指示に従い、充分に酵素および反応混合液を攪拌することによって、高い忠実度増幅を得た。40 pmol の各プライマーおよび推奨濃度の他の全ての組成物キットの準備を発端として、Peltier thermal cycler (Peltier thermal cycler (PTC200; M.J. Research、Watertown、Mass.)および下記のパラメータを用いて、PCR 法を実行した。
ステップ 1 94℃ にて、1 分間 (初期変性)
ステップ 2 65℃ にて、1 分間
ステップ 3 68℃ にて、6 分間
ステップ 4 94℃ にて、15 秒間
ステップ 5 65℃ にて、1 分間
ステップ 6 68℃ にて、7 分間
ステップ 7: ステップ 4〜6 をさらに15 サイクル繰返す
ステップ 8 94℃ にて、15 秒間
ステップ 9 65℃ にて、1 分間
ステップ 10 68℃ にて、7〜15 分間
ステップ 11: ステップ 8〜10 を 12 サイクル繰返す
ステップ 12 72℃ にて、8 分間
ステップ 13 4℃ にて、(保持)
5〜10 マイクロリットルの反応混合物を、低濃度(約0.6〜0.8%)のアガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。最も大きな産生物を保持すると思われた領域を選択して、ゲルから除去した。さらなる精製には、QIAQUICK DNA 精製キット(QIAGEN)などのような商業用ゲル抽出方法が必要とされる。DNA の回収後、クレノウ酵素を用い、一本鎖、ヌクレオチド張出部をトリムし、再連結反応およびクローニングを促進する鈍端を作った。エタノール沈殿の後、産生物を13 マイクロリットルの連結反応バッファに再溶解し、1 マイクロリットルの T4-DNA リガーゼ (15 単位)および1 マイクロリットルの T4 ポリヌクレオチドキナーゼを加え、そして混合物を室温で 2〜3 時間または 16℃ で一晩インキュベートした。適格大腸菌細胞(40 マイクロリットルの適切な 培地中)を 3 マイクロリットルの連結反応 混合物で形質転換し、80 マイクロリットルの SOC 媒体(前出のSambrook らの)で培養せしめた。37 ℃ にて 1 時間インキュベーションした後、全形質転換混合液を、2x 炭水化物を含む Luria Bertani (LB)-寒天(前出のSambrook らの)上にプレートする。次の日、各プレートから幾つかのコロニーをランダムに摘出し、適切な市販の消毒済 96 ウェル マイクロタイター プレートの個別ウェルに配置した 150 マイクロリットルの液体 LB/2x 炭水化物媒体で培養する。 次の日、一晩培養した 5 マイクロリットルの各培養を 無償毒 96 ウェル プレートに移し、1:10 に水で希釈後、5 マイクロリットルの各サンプルを PCR 法 アレーへ移す。PCR 法の増幅は、4 単位の rTth DNA ポリメラーゼ、ベクター プライマー、および 1 つまたは両方の伸長反応に使用した遺伝子特定プライマーを含む 18 マイクロリットルの濃縮 PCR 法反応混合液(3.3x)を各ウェルに加える。増幅は、下記の条件を用いて実行する:
ステップ 1 94℃ にて、60 秒間
ステップ 2 94℃ にて、20 秒間
ステップ 3 55℃ にて、30 秒間
ステップ 4 72℃ にて、90 秒間
ステップ 5: ステップ 2〜4 をさらに29 サイクル繰返す
ステップ 6 72℃ にて、180 秒間
ステップ 7 4℃ にて、(保持)
PCR 法反応のアリコットを分子量マーカーと共に寒天ゲル剤上で実行する。PCR 産物の寸法を元の部分的cDNA に比較し、適切なクローンを選択し、プラスミドに連結反応して配列する。
本発明に記載の核酸に由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、ゲノム DNA、または mRNA をスクリーニングした。約 20 塩基対から成るオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなcDNA 断片に対しても実質的には同手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06 プライマー分析ソフトウェア(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50 pmol の各オリゴマーおよび 250 マイクロ Ci の [.gamma.-32 P] アデノシン三リン酸(Amersham) および T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (DuPont Nen(r), Boston, Mass.)とを組み合わせることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25 超細繊分子樹脂カラム(Pharmacia & Upjohn)を用いて十分に精製する。毎分 107 カウントの各センス オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドを含む部分を、(Ase I, Bgl II, EcoRI, Pst I, Xba I, or Pvu II; DuPont NEN(r)) の 1 つの膜で消化されたヒトゲノム DNA の典型的膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。各消化物から得た DNA は、0.7% アガロースゲル上で分画してナイロン膜(NYTRAN PLUS membrane, Schleicher & Schuell, Durham, N.H.)に移す。スクリーニングハイブリダイゼーションは40℃にて 16 時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、最大 0.1 x クエン酸食塩水(SSC)および 0.5% ドデシル硫酸ナトリウムの一層ストリンジェントな条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。XOMAI AR オートラジオグラフィーフィルム (Kodak Rochester、N.Y.)をブロットに晒した後、またはブロットを PHOSPHOIMAGER (Molecular Dynamics、Sunnyvale、Calif.)に数時間置いた後にオートラジオグラフィーパターンを肉眼で比較する。
実施例 7: アンチセンス分子
本発明のタンパク質をコードする配列、またはその一部に対するアンチセンス分子を用い、生体内または試験管内の天然の本発明のタンパク質の発現を抑制する。約 20 塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、特に記載するが、より大きなcDNA 断片に使用される手順と本質的に同一である。オリゴヌクレオチドを用いて、天然の本発明のタンパク質の発現を抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは多数の方法で遺伝子機能を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写物の 5'UTR に結合して、翻訳をブロッキングすることができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、RNAseH による転写物の切断を誘発することもできる。また、アンチセンスオリゴが、プレ-mRNA のスプライシングをブロッキングすることも証明されており、その結果、特異的なスプライス形態の形成がブロッキングされるか、またはスプライシングされていない、成熟タンパク質を作ることができない不安定なメッセージの蓄積につながるかのいずれか、またはその両方が起こり得る。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用機構は、オリゴヌクレオチドの化学組成および(または) 標的転写物内の結合部位によって決定される。
本発明のタンパク質および相同タンパク質のような本発明のタンパク質の発現は、cDNA の適切なベクターへのサブクローニングおよびベクターの宿主細胞への形質転換によって達成する。この場合、以前に cDNA ライブラリを作成するために使用したクローンニング ベクター、PSPORT 1 を用いて、大腸菌において本発明のタンパク質を発現させる。クローンニング部位の上流では、このベクターにはプロモーター βガラクトシダーゼ、継いで、アミノ末端 Met を含有する配列、およびその結果生じた βガラクトシダーゼの 7 残基が含まれる。これらの 8 残基の直後に続くのは、転写に有用なバクテリオファージ プロモーター、および多数のユニークな制限部位を含むリンカーである。標準方法を使用するIPTG を有する単離形質転換細菌株の誘発は、β-ガラクトシダーゼの最初の8 つの残基から成る融合タンパク質、約 5〜15 のリンカー残基、および全長タンパク質を産生する。シグナル残基は、活性化のため下記のアッセイで直接使用することができる細菌の成長培地中に本発明のタンパク質の分泌物を誘導する。
PAGE 電気泳動法(前出の Sambrook)または他の精製技術を用いて十分に精製した本発明のタンパク質を用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産生する。DNASTARアミノ酸配列をDNASTARソフトウェア(DNASTAR 社)を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴポリペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生する。C末端に近傍するエピトープ、または親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については前出のAusubel らによって説明されている。
相同タンパク質および核酸分子コーディングは、それゆえ昆虫または各種の脊椎動物、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。配列に対して相同性を持つニワトリタンパク質および核酸分子は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI) の非重複タンパク質データベースのプログラムBLASTP 2.2.3を用いて同定した(Altschulらの、1997、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402を参照)。
ニワトリ RA977 (配列識別番号 35; コード化されたタンパク質配列識別番号 36、図 14 を参照) は、ヒトEMP-2 (ヌクレオチド用の XM_030218.1; 配列識別番号 37; タンパク質配列用の P54851; 配列識別番号 38) に対して 70% の同一性および 83% の相同性を示した。Derwent GenSeq データベース検索を行い、癌の診断用途を請求の範囲とする特許出願番号 WO200194629-A2、および癌の診断および療法用途を請求の範囲とする特許出願番号 WO200229086-A2 が一致することを明らかにした。
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことながら共通認識とする。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載した本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
Claims (30)
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 から選択した核酸分子、またはそれによってにコード化されたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異体または当該ポリペプチドまたは当該核酸のエフェクター/修飾因子または薬剤製造のための当該ポリペプチドの使用法。
- 核酸分子が脊椎動物の核酸、特にヒト核酸、またはその断片またはその変異体である請求項 1 の使用法。
- 当該核酸分子が下記である場合の請求項 1 または 2 の組成物。
(a) ストリンジェントな条件下で、配列識別番号 1、3、5、7、9、11、12、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 および(または)その相補鎖の核酸分子に対してハイブリダイズする場合、
(b) (a) の核酸分子に対して縮重する場合、
(c) 配列識別番号 2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44 に対して少なくとも 80% の同一性を持つポリペプチドをコード化する場合、または
(d) 突然変異により、(a)〜(c) の核酸分子と異なる場合、および当該突然変異体がコードされたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となる場合。 - 当該核酸分子が DNA 分子である、請求項 1〜3 の任意の 1 項の使用法。
- 核酸分子が膵臓組織またはその他の組織に特異的に発現された本発明のタンパク質をコード化するような特許請求の範囲 1〜4 の任意の 1 項の使用法。
- 当該核酸分子が修飾核酸分子である、請求項 1〜5 の任意の 1 項の使用法。
- 当該組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである、請求項 6 の使用法。
- 当該ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項 1〜5 の任意 1 項の使用法。
- 当該ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項 8 の使用法。
- 当該核酸分子が ハイブリダイゼーション プローブ、プライマーおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドおよびアプタマーから選択される、請求項 1〜7 の任意の 1 項の使用法。
- 診断目的に対する請求項 1〜10 の任意の 1 項の使用法。
- 治療目的に対する請求項 1〜10 の任意の 1 項の使用法。
- 糖尿病のような膵臓の障害、および関連障害、さらに神経変性疾患、および他の疾患の診断、監視、予防 または治療のための薬剤製造に対する特許請求の範囲 1〜12 の任意の 1 項の使用法。
- 膵臓機能障害(例えば、糖尿病、高血糖症、および耐糖能異常)、および肥満症を始めとする関連障害、および神経変性疾患、および細胞、細胞塊、臓器および(または)被検者における他の疾患の検出および(または)検証、治療、軽減および(または)予防のための請求項 13 の使用法。
- 試験管内および(または)生体内における β 細胞の分化および(または)機能を促進するための請求項 13 の使用法。
- 試験管内および(または)生体内における β 細胞再生のための請求項 13 の使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドによって影響および(または)修飾される遺伝子および(または)遺伝子産物の機能を監視および(または)管理するために、特許請求の範囲 1〜10 の任意の 1 項において定義したような、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 から選択した核酸分子、またはそれによってにコード化されたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異体または当該ポリペプチドまたは当該核酸分子または当該ポリペプチドのエフェクター/修飾因子の使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するために、特許請求の範囲 1〜10 の任意の 1 項において定義した、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、またはRA977 から選択した核酸分子、またはそれによってにコード化されたポリペプチドまたは断片または当該核酸分子の変異体または当該ポリペプチドまたは当該核酸分子または当該ポリペプチドのエフェクター/修飾因子の使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子導入動物。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドの発現が増加および(または)低下されるような、請求項 19 の動物。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドの修飾発現を示す組換え型宿主細胞。
- ヒト細胞である請求項 21 の細胞。
- 哺乳動物代における謝障害または代謝症候群、特に膵臓機能障害に関与する (ポリ)ペプチドを同定するステップは下記の通りである。
(a) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドまたはその断片を用い、当該試験用(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下で、試験用(ポリ)ペプチドのコレクションに接触するステップ。
(b) 結合しない試験用(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c) 当該 DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドまたはその断片に結合する試験用(ポリ)ペプチドを同定するステップ。 - DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドまたはその断片の結合標的および薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a) 下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドまたはその断片;
(ab) 当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドまたはその断片の結合標的/薬剤; および
(ac)
基準親和性にて当該 DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下の候補薬剤;
(b) (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドまたはその断片の当該結合標的に対する結合親和性を検出するステップ; および
(c) (候補)薬剤偏向親和性と基準親和性間の差異を確定するステップ。 - DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 ポリペプチドの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法は下記のステップから成る。
(a) 下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
(aa) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドまたはその断片; および
(ab)
当該 DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドまたはその断片が基準活性を持つような条件下の候補薬剤;
(b) (候補) 薬剤偏向の活性を決定するため、当該 DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 ポリペプチドまたはその断片の活性を検出するステップ; および
(c) (候補)薬剤偏向活性と基準活性との間の差異を確定するステップ。 - 医薬用に許容できるキャリアおよび(または)希釈剤を有する、請求項 23 または25 の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項 24 の方法によって同定された薬剤、 を含む組成物を産生する方法。
- 当該組成物が、膵臓の機能障害 (例えば、糖尿病、高血糖症、および耐糖能異常)、および肥満症を含む関連障害、および神経変性疾患などの防止、軽減または治療をするための医薬品組成物である、請求項 26 の方法。
- 膵臓の機能障害 (例えば、糖尿病、高血糖症、および耐糖能異常)、および肥満症を含めた関連障害、および神経変性疾患などの治療、軽減および(または)予防に対する医薬品組成物の調製のための、請求項 23 の方法によって同定された(ポリ)ペプチドの使用法、または特許請求の範囲 24 または 25 の方法によって同定された薬剤の使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物を調製するための、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770 遺伝子ファミリーの核酸分子、またはその断片の使用法。
- 少なくとも下記の 1 つを備えたキット。
(a) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、または RA770 核酸分子またはその断片;
(b) (a) の核酸から成るベクター;
(c) (a) の核酸分子または (b) のベクターから成る宿主細胞;
(d) (a) の核酸分子によってコード化されたポリペプチド;
(e) (a) の核酸分子によってコード化された融合ポリペプチド;
(f) (a) の核酸分子または (d) または (e) のポリペプチド(に対する)抗体、アプタマーまたは別の受容体、および
(g) (a) の核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
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