JP2013227318A - 膵臓特異性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】配列番号 2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42 または44 のそれぞれに示したアミノ酸配列を持つ、十分に精製されたタンパク質によって解決される。
【選択図】なし
Description
また、これは、特定の細胞型において発現されたLPA 受容体に特異的なアゴニスト、またはそれらの前駆体が、これらの細胞の成長、分化、または臓器特異性構造を調節できる可能性を高める。例えば、膵臓の幹細胞、その他の幹細胞または新しいインスリン分泌細胞を作成するために使用できるその他の細胞のような特定の細胞型において多かれ少なかれ特異的に発現されるLPA 受容体の刺激作用は、LPA に関する文献において記載された多くの効果にかかわらず、比較的に特異的な応答を作り出し得る。
シャルコー・マリー・ツース (CMT) 末梢神経障害は、末梢神経系に影響を及ぼす疾患の遺伝的な混成群を表す。常染色体優性 CMT 1C 型 (CMT1C)。染色体16p13.1−p12.3 に対して遺伝的にマッピングした。染色体16p13.2 に対してマッピングする上皮 膜タンパク質 2 の遺伝子(EMP2)は、CMT1C の候補遺伝子である (Street V. A., 2002, Am J Hum Genet 70(1):244−250)。
本発明のタンパク質を用いて in−situ 発現パターンから取得した本発明に記載のタンパク質が、島細胞 (例えば、DP685; DP160; RA770)、膵臓の間充織 (RA770)、膵臓上皮細胞 (例えば、DP685; DP160)、膵管細胞 (DP160)、同様に、神経管 (DP160; DP444) に沿った神経節、体節 (DP444)、背側菱脳 (DP444)、肝臓 (DP685)、心臓 (DP685)、胃腸 (DP444) および腸内細胞 (DP685; DP444) などの他の細胞のような膵臓細胞において特異的に発現されることが結論できる。以上の点から、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター/修飾因子は、診断目的および治療目的に関与する、例えば、限定するものではないが、上記臓器または組織に関連する糖尿病および肥満症のような代謝障害および機能障害、肝臓疾患および神経疾患、例えば神経変性障害および他の疾患および障害において有用である。従って、本発明のタンパク質は、診断マーカーとして、または小分子スクリーニングの標的として、および糖尿病および/または肥満症および代謝障害および神経変性疾患、心臓、肝臓、胃腸、または腸内障害のような他の疾患の 予防 または治療において有用であり得る。
(a) 核酸分子またはその機能的断片;
(b) アミノ酸分子または機能的断片またはそのアイソフォーム;
(c) (a) の核酸を備えているベクター;
(d) (a) の核酸または(b) のベクターを含む宿主細胞;
(e) (a) の核酸によってコードされたポリペプチド;
(f) (a) の核酸によってコードされた融合ポリペプチド;
(g) (a) の核酸または(d)または(e) のポリペプチドに対する抗体、アプタマーまたは別の受容体および
(h) (a) の核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド。
図 1A は、ニワトリ胚 (5 日目、dpb = 背側膵芽、vbp = 腹側膵芽、st = 胃腸、nt = 神経管上でのホールマウント in−situ ハイブリダイゼーションを示す; Fig 1B は、発育中の膵臓組織切片上での in−situ ハイブリダイゼーションを示す。DP293 陽性細胞は青色で示し、インスリンは茶色で染色した)。発現は、膵島 (is) および膵臓上皮および管細胞 (du) の一部の細胞で見ることができる。Fig 1C は、ハイブリダイゼーションによって DP119 発現に対して染色された受精後 5 日目のニワトリの背側部の断面を示す。染色は、分散している神経管 (nt) 細胞および神経管を囲む神経節性細胞において明らかである。
図 1B は、ヒト DP119 の発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における DP119 発現の定量分析である。
図 2A: ヒトDKFZp586L151 に対するニワトリ遺伝子相同性の 3’ を含有する核酸配列 (配列番号 1)。下線を引いたのは 3' 非翻訳領域であり、終止コドンは太字で示した。
図 2B: 図 1A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質の配列(配列番号 2)。
図 2C: ヒトホモログのタンパク質をコードする 核酸配列(配列番号 3) (GenBank アクセッション番号 AL050137.1)。
図 2D: 図 2C に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 4) (GenBank アクセッション番号 CAB43286.1)。
図 2E: マウスホモログのタンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 5) (GenBank アクセッション番号 BC025654.1)。
図 2F: 図 8E に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 6) (GenBank アクセッション番号 Aah25654.1)。
図 2G: 異なる種から取り出した DP119 のアライメント (Mm、マウス; Hs、ホモサピエンス; Dr、ゼブラダニオ Danio rerio; Gg、ニワトリ)
図 3A: 受精後 3.5 日目のニワトリ胚および DP444 プローブを用いたホールマウント in−situ ハイブリダイゼーション。発現は、神経管 (nt) に沿って、および体節、発育中の腸 (in) および鰓弓において観察される。
図 3B: 受精後 4 日目のニワトリ胚および DP444 プローブを用いたホールマウント in−situ ハイブリダイゼーション。発現は、神経管 (nt) に沿って、および体節、発育中の腸 (in) および背側菱脳 (hb) において観察される。
図 3C: 受精後 5 日目のニワトリ胚および DP444 プローブを用いたホールマウント in−situ ハイブリダイゼーション。胃腸 (st) および膵芽 (dpb、vpb) における発現ドメインを示す。
図 3D: 発育中の膵臓 (受精後 5 目のニワトリ) 断面の二重標識。インスリンは茶色に染色し、DP444 発現は紫色に染色する。DP444 の発現は、積極的にインスリン発現とオーバーラップしている膵島 (is) で観察できる。
図 3E: DP444 機能低下はゼブラフィッシュにおける膵島欠損につながる。図 3Ea は、制御アンチセンスオリゴを投与した受精後 24 時間目の胚を示し、図 3Eb は、DP444 の翻訳をブロッキングするアンチセンスオリゴを投与した受精後 24 時間目の サカナ胚を示す。インスリン発現は紫色に染色する。
図 4A: 核酸配列 (配列番号 7)。終止コドンは太字で示し、および 3' UTR には下線を引いた。
図 4B: DP444のアミノ酸配列 (配列番号 8)。
図 4C: ヒトホモログQV2−NN2006−230401−628−d06 NN2006、配列番号 9 の核酸配列 (GenBank アクセッション番号 BI035296)。
図 4D: DP444 (配列番号 10) のヒトホモログのアミノ酸配列 (配列番号 9 の翻訳)。
図 4E: GenBank アクセッション番号 BF951817 の核酸配列 (QV1−NN0228−091100−436−g05 NN0228 ホモサピエンス、配列番号 11)。
図 4F: GenBank アクセッション番号 AI214480.1 の核酸配列; (qg69c12.x1 Soares_NFL_T_GBC_S1 ホモサピエンス、配列番号 12)。
図 4G: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_1 の予測 mRNA (配列番号 13)。
図 4H: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_1 の予測タンパク質 (配列番号 14)。
図 4I: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_3 の予測mRNA (配列番号 15)。
図 4J: GenBank アクセッション番号 Hs2_5191_28_4_3 の予測タンパク質 (配列番号 16)。
図 4K: 異なる種から取り出した DP444 のアライメント (Dr、ゼブラフィッシュ; Mm、マウス; Hs、ホモサピエンス; Gg、ニワトリ)
図 5A および 図 5B は、ニワトリ胚 (5 日目) 上でのホールマウント in−situ ハイブリダイゼーションを示す。li = 肝臓、ht = 心臓、dpb = 背側膵芽;
図 5C および 図 5D は、発育中の膵臓 (受精後 5 日目のニワトリ) の断面上での in−situ ハイブリダイゼーションを示す。pe = 膵臓上皮、is = 膵島、pm = 膵臓の間充織.
図 6A: DP810 タンパク質. 3' 非翻訳領域は下線を引いて示し、終止コドンは太字で示した。(配列番号 17)
図 6B: 図 6A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質の配列(配列番号18)。
図 6C: ヒトホモログ DP810 タンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 19) (GenBank アクセッション番号 NM_02400.1; 多ドメインタンパク質)。
図 6D: 図 6C に示したコーディング配列によってコードされた タンパク質配列(配列番号 20) (GenBank アクセッション番号 NP_078776.1)。
図 7A および 図 7B は、ニワトリ胚 (A: 受精後 4 日目; B: 受精後 5 日目) 上でのホールマウントin−situ ハイブリダイゼーションを示す。図 7A では、発現が、背側神経管 (nt) に沿って、背側前脳 (fb) および菱脳 (hb) において、鰓弓 (ba) および発育中の後肢 (ahl) の前部において観察される。また、強力なシグナルが、発育中の胃腸 (st) の領域においても観察される。図 7B では、発現が、発育中の胃腸 (st) および背側膵芽 (dpb) において観察される。
図 7C は、ヒトDP685 の発現を示す。ここに示したのは、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のヒト腹部脂肪細胞における DP685 発現の定量分析である。
図 8A: ニワトリDP685 タンパク質をコードする核酸配列(配列番号 21)。
図 8B: 図 8A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列 (配列番号 22)。
図 8C: ヒトホモログの DP685 タンパク質(オートタキシン) をコードする核酸配列 (配列番号 23)。
図 8D: 図 8C に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 24)。
図 8E: マウスホモログDP685 タンパク質をコードする核酸配列(配列番号 25)。
図 8F: 図 8E に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 26)。
図 9A は、ニワトリ胚 (受精後 5 日目) 上のホールマウント in−situ ハイブリダイゼーションを示す。in = 腸、li = 肝臓原基;
図 10A: ニワトリコレクチンの 3' 非翻訳領域から成る核酸配列(配列番号 27)。
図 10B: 図 6A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 28)。
図 10C: ヒトホモログコレクチン COLEC10 タンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 29) (GenBank アクセッション番号 NM_006438.2)。
図 10D: 図 10C に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列 (配列番号 30) (GenBank アクセッション番号 NP_006429.1)。
図 11A は、ニワトリ胚 (受精後 5 日目) 上のホールマウント in−situ ハイブリダイゼーションを示す。DP160 は、神経管 (nt) に沿って、中腎 (mn) においておよび発育中の消化管 (胃腸: st; 背側膵芽および腹側膵芽:dpb、vpb) において発現される。
図 11B. 発育中の膵臓 (受精後 5 日目) 断面上の二重標識を示す。インスリンは茶色に染色し、DP160 発現は紫色に染色する。発現は、膵島 (is) および膵臓上皮細胞で見ることができる。
図 12A: 核酸配列 (配列番号 31)
図 12B: 図 12A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列 (配列番号 32)。
図 12C: ヒトホモログタンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 33)。
図 12D: 図 12C に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列 (配列番号 34)。
図 13A および 図 13B: 受精後 5 日目 ニワトリ胚およびRA977 プローブを用いたホールマウント in−situ ハイブリダイゼーション。RA977 の発現が背側膵芽 (dpb) で観察される。胃腸 (st) で見られる強力なシグナルは、非特異的なプローブ とラッピングに起因する。同一胚を 2 通りの異なる拡大率で示す。
図 14A: RA977 の核酸配列(配列番号 35)。終止コドンおよび開始コドンは太字で表し、UTR には下線を引いた。
図 14B: RA977 のアミノ酸配列 (配列番号 36)。
図 14C: ホモサピエンス上皮膜タンパク質 2 (EMP2)、mRNA の核酸配列 (GENBANK アクセッション番号 XM_030218.1; 配列番号 37)。
図 14D: EMP2_ヒト上皮 膜タンパク質 2 (EMP−2) (XMP タンパク質) のアミノ酸配列 (GenBank アクセッション番号 P54851; 配列番号 38)。
図 15A は、ニワトリ胚 (受精後 5 日目) 上でのホールマウント in−situ ハイブリダイゼーションを示す 。dpb = 背側膵芽; vpb = 腹側膵芽; lu = 肺臓、st = 胃腸領域; dd = 十二指腸
図 16A: ニワトリ RA770 タンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 39)
図 16B: 図 16A に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 40)。
図 16C: ヒトホモログRA770 タンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 42) (GenBank アクセッション番号 NM_004558.1; Neurturin)。
図 16D: 図 16C に示したコーディング配列によってコードされたタンパク質配列(配列番号 43) (GenBank アクセッション番号 NP_004549.1)。
図 16E: マウスホモログRA770 タンパク質をコードする核酸配列 (配列番号 44) (GenBank アクセッション番号 NM_008738.1; Neurturin)。
図 16F: 図 16E に示したコーディング配列によってコードされた タンパク質配列(配列番号 44) (GenBank アクセッション番号 NP_032764.1)。
ニワトリ DPd6 の cDNA ライブラリは、6 日目のニワトリ胚から採取した背側膵芽を使用して構築したものである。凍結組織はホモジナイズかつ溶解した。Brinkmann POLYTRON homogenizer PT−3000 (Brinkman Instruments, Westbury, N.J.)をグラニジウム イソチオシアネート溶液において使用した。溶解物に遠心力 5.7 M CsCl 以上をかける。Beckman SW28 ローター、Beckman L8−70M 超遠心分離機 (Beckman Instruments、Fullerton、Calif.)使用。 18 時間、25,000 rpm、室温。RNA を、4.7 pH 酸フェノールで抽出し、0.3 M 酢酸ナトリウムと容積 2.5 のエタノール沈殿させ、無 RNA 水で再懸濁し、37℃ にてDNAe 処理した。以前の通り RNA を4.7 pH 酸フェノールで繰返し抽出し、酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿させた。 その後、Micro−FastTrack 2.0 mRNA 分離キット(Invitrogen、Groningen、Netherlands)を使用して mRNA を単離し、cDNA ライブラリを構築するために使用した。mRNAs の取り扱いは、SUPERSCRIPT cDNA synthesis and plasmid cloning system (Gibco/BRL) の推奨プロトコルに従って行なった。DH10B 宿主細胞への形質転換に続いて、単一コロニーを摘出し、PCR 法を用いてクローン化された cDNA インサートを増幅した。単一 cDNA インサートを代表する PCR 法によって増幅された断片を、その後に生体外転写し、Digoxygenin 標識 RNA プローブ(Roche)を生成した。RNA プローブをホールマウント in−situ スクリーニングにおいて使用して初期のニワトリ胚におけるそれぞれの遺伝子産物の発現を確定した。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドを、膵臓組織におけるその高発現のおかげで同定した。
当業者であれば周知の標準プロトコルおよび以前に説明した(例えば、Pelton, R.W. らの(1990) Development 110, 609−620、Belo, J.A. らの(1997) Mech. Dev. 68, 45−57) に従って in−situ ハイブリッド形成法を実行した。
REAL プレP 96 ウェルのプラスミド分離キット (QIAGEN) を用いて、プラスミドDNA を細胞から開放し精製した。このキットは、多重試薬ディスペンサーを使用した96 ウェル ブロックにおいて、96 個のサンプルの同時精製を可能にした。 下記の変更を除いてメーカーの推奨するプロトコルを使用した。変更(i): 細菌を 1 ml の消毒した Terrific Broth (LIFE TECHNOLOGIESTM, Gaithersburg, Md, USA)でカルベニシリンを 25 mg/L で、グリセロームを 0.4 % で用いて培養した。変更(ii): 接種後、培養を 19 時間インキュベートした後、細胞を 0.3 ml 溶解バッファで溶解した。変更(iii): イソプロパノール沈殿に続いて、プラスミドDNA ペレットを 0.1 ml の蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最後のステップの後、サンプルを 4℃ にて保管する 96 ウェル ブロックへ移した。cDNA を GATC Biotech AG (Konstanz、Germany)によって、当業者であれば既知の標準プロトコルに従って配列せしめた。
リーディング・フレームを決定した後に、本発明のヌクレオチド配列から演繹したアミノ酸配列のみならず、本発明のヌクレオチド配列も、GenBank、SwissProt、BLOCKS、および Pima II のようなデータベースに対する問い合わせ配列として使用した。以前に同定され注釈された配列を含むこれらのデータベースで、相同性(類似性) の領域を検索した。使用したのはBLAST(Basic Local Alignment Search Toolの略語、Altschul S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290−300; Altschul、S.F. らの(1990) J. Mol. Biol. 215:403−10)である。BLAST 検索により、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列両方のアライメントを産生し、配列類似性を決定した。ローカル特性をもつアライメントのおかげで、BLAST 検索は、完全なマッチの決定において、または相同体真核(細菌)または原核(動物、カビ、植物) の起源の識別に特に有用である。ここに引用として取り込まれたSmith らの(1992、Protein Engineering 5:35−51)において説明されたような他のアルゴリズムは、一次配列パターンおよび二次構造ギャップのペナルティーを取り扱う場合に使用された。BLAST 検索の方法は、Karlin らの(前出)で詳細に説明したように、ここに引用として取り込まれ、問い合わせ配列とデータベース配列との間のマッチを検索した。BLAST 検索によって見出された任意のマッチの統計的な重要性が評価され、重要性をもつユーザ選択限界を満足するマッチのみが報告された。本出願において、限界値はヌクレオチドに対して 10〜25、およびペプチドに対して 10−14 と設定した。ヌクレオチド配列は、GenBank データベースの霊長類、げっ歯類、および他の哺乳動物の配列に対して検索し、それから同一クローンからの演繹アミノ酸配列を、GenBank の機能的タンパク質データベースの哺乳動物、脊椎、真核生物の相同性に対して検索した。
本発明のタンパク質をコードする完全長核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド配列を完全長に拡張するため、またはゲノム ライブラリから 5' または 3' イントロンまたは他の調節配列を取得するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。単一プライマーを合成してアンチセンス方向における伸長を開始し、他を合成してセンス方向における配列を伸長する。プライマーを用い、領域目的に対して新規ヌクレオチド配列、未知ヌクレオチド配列を含む既知の配列「outward」生成 amplicons の伸長を促進する。初期プライマーは、オリゴ 4.06 プライマー分析ソフトウェア(National Biosciences)、または別の適切なプログラムを用いて、ヌクレオチド長が 22〜30 となるように、GC 含有率が 50% 以上を有するように、および温度約 68℃ 〜 72℃ で標的配列にアニールするように cDNA から設計した。ヘアピン二量化をもたらすようなヌクレオチドは避けた。元の選択したcDNA ライブラリ、またはヒトゲノム ライブラリを用い、配列を伸長した。後者(ヒトゲノム ライブラリ)は5' 上流領域を取得するために最も有用である。より多くの伸長または所望の必要な場合は、追加プライマーセットをデザインして既知領域を伸長する。XL−PCR キット(Perkin Elmer) の指示に従い、充分に酵素および反応混合液を攪拌することによって、高い忠実度増幅を得た。40 pmol の各プライマーおよび推奨濃度の他の全ての組成物キットの準備を発端として、Peltier thermal cycler (Peltier thermal cycler (PTC200; M.J. Research、Watertown、Mass.)および下記のパラメータを用いて、PCR 法を実行した。
ステップ 2 65℃ にて、1 分間
ステップ 3 68℃ にて、6 分間
ステップ 4 94℃ にて、15 秒間
ステップ 5 65℃ にて、1 分間
ステップ 6 68℃ にて、7 分間
ステップ 7: ステップ 4〜6 をさらに15 サイクル繰返す
ステップ 8 94℃ にて、15 秒間
ステップ 9 65℃ にて、1 分間
ステップ 10 68℃ にて、7〜15 分間
ステップ 11: ステップ 8〜10 を 12 サイクル繰返す
ステップ 12 72℃ にて、8 分間
ステップ 13 4℃ にて、(保持)
ステップ 2 94℃ にて、20 秒間
ステップ 3 55℃ にて、30 秒間
ステップ 4 72℃ にて、90 秒間
ステップ 5: ステップ 2〜4 をさらに29 サイクル繰返す
ステップ 6 72℃ にて、180 秒間
ステップ 7 4℃ にて、(保持)
本発明に記載の核酸に由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、ゲノム DNA、または mRNA をスクリーニングした。約 20 塩基対から成るオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなcDNA 断片に対しても実質的には同手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06 プライマー分析ソフトウェア(National Bioscience)のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50 pmol の各オリゴマーおよび 250 マイクロ Ci の [.gamma.−32 P] アデノシン三リン酸(Amersham) および T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (DuPont Nen(r), Boston, Mass.)とを組み合わせることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G−25 超細繊分子樹脂カラム(Pharmacia & Upjohn)を用いて十分に精製する。毎分 107 カウントの各センス オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス オリゴヌクレオチドを含む部分を、(Ase I, Bgl II, EcoRI, Pst I, Xba I, or Pvu II; DuPont NEN(r)) の 1 つの膜で消化されたヒトゲノム DNA の典型的膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。各消化物から得た DNA は、0.7% アガロースゲル上で分画してナイロン膜(NYTRAN PLUS membrane, Schleicher & Schuell, Durham, N.H.)に移す。スクリーニングハイブリダイゼーションは40℃にて 16 時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、最大 0.1 x クエン酸食塩水(SSC)および 0.5% ドデシル硫酸ナトリウムの一層ストリンジェントな条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。XOMAI AR オートラジオグラフィーフィルム (Kodak Rochester、N.Y.)をブロットに晒した後、またはブロットを PHOSPHOIMAGER (Molecular Dynamics、Sunnyvale、Calif.)に数時間置いた後にオートラジオグラフィーパターンを肉眼で比較する。
本発明のタンパク質をコードする配列、またはその一部に対するアンチセンス分子を用い、生体内または試験管内の天然の本発明のタンパク質の発現を抑制する。約 20 塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、特に記載するが、より大きなcDNA 断片に使用される手順と本質的に同一である。オリゴヌクレオチドを用いて、天然の本発明のタンパク質の発現を抑制する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは多数の方法で遺伝子機能を抑制することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写物の 5'UTR に結合して、翻訳をブロッキングすることができる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの結合は、RNAseH による転写物の切断を誘発することもできる。また、アンチセンスオリゴが、プレ−mRNA のスプライシングをブロッキングすることも証明されており、その結果、特異的なスプライス形態の形成がブロッキングされるか、またはスプライシングされていない、成熟タンパク質を作ることができない不安定なメッセージの蓄積につながるかのいずれか、またはその両方が起こり得る。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用機構は、オリゴヌクレオチドの化学組成および/または 標的転写物内の結合部位によって決定される。
本発明のタンパク質および相同タンパク質のような本発明のタンパク質の発現は、cDNA の適切なベクターへのサブクローニングおよびベクターの宿主細胞への形質転換によって達成する。この場合、以前に cDNA ライブラリを作成するために使用したクローンニング ベクター、PSPORT 1 を用いて、大腸菌において本発明のタンパク質を発現させる。クローンニング部位の上流では、このベクターにはプロモーター βガラクトシダーゼ、継いで、アミノ末端 Met を含有する配列、およびその結果生じた βガラクトシダーゼの 7 残基が含まれる。これらの 8 残基の直後に続くのは、転写に有用なバクテリオファージ プロモーター、および多数のユニークな制限部位を含むリンカーである。標準方法を使用するIPTG を有する単離形質転換細菌株の誘発は、β−ガラクトシダーゼの最初の8 つの残基から成る融合タンパク質、約 5〜15 のリンカー残基、および全長タンパク質を産生する。シグナル残基は、活性化のため下記のアッセイで直接使用することができる細菌の成長培地中に本発明のタンパク質の分泌物を誘導する。
PAGE 電気泳動法(前出の Sambrook)または他の精製技術を用いて十分に精製した本発明のタンパク質を用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産生する。DNASTARアミノ酸配列をDNASTARソフトウェア(DNASTAR 社)を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴポリペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生する。C末端に近傍するエピトープ、または親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については前出のAusubel らによって説明されている。
相同タンパク質および核酸分子コーディングは、それゆえ昆虫または各種の脊椎動物、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。配列に対して相同性を持つニワトリタンパク質および核酸分子は、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI) の非重複タンパク質データベースのプログラムBLASTP 2.2.3を用いて同定した(Altschulらの、1997、Nucleic Acids Res. 25:3389−3402を参照)。
Claims (30)
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、もしくはRA770から選択される核酸分子、またはそれによってコードされるポリペプチド、または当該核酸分子もしくは当該ポリペプチドの断片もしくは変異体、または当該核酸分子もしくは当該ポリペプチドのエフェクター/修飾因子を、医薬品製造のために用いる使用法。
- 核酸分子が脊椎動物の核酸、特にヒト核酸、またはその断片もしくは変異体である、請求項1に記載の使用法。
- 当該核酸分子が
(a) ストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、12、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43および/またはその相補鎖の核酸分子に対してハイブリダイズするか、
(b) (a)の核酸分子に対して縮重するか、
(c) 配列番号2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44に対して少なくとも80%の同一性を持つポリペプチドをコードするか、または
(d) 突然変異により、(a)〜(c)の核酸分子と異なる、および当該突然変異体がコードされるポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止の原因となる、請求項1または2に記載の使用法。 - 当該核酸分子がDNA分子である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の使用法。
- 核酸分子が膵臓組織またはその他の組織に特異的に発現される本発明のタンパク質をコードする、請求項1から4までのいずれか1項に記載の使用法。
- 当該核酸分子が組換え核酸分子である、請求項1から5までのいずれか1項に記載の使用法。
- 当該組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである、請求項6に記載の使用法。
- 当該ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項1から5までのいずれか1項に記載の使用法。
- 当該ポリペプチドが融合ポリペプチドである、請求項8に記載の使用法。
- 当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアプタマーから選択される、請求項1から7までのいずれか1項に記載の使用法。
- 診断目的に用いる、請求項1から10までのいずれか1項に記載の使用法。
- 治療目的に用いる、請求項1から10までのいずれか1項に記載の使用法。
- 糖尿病のような膵臓の障害、および関連障害、さらに神経変性疾患、および他の疾患の診断、監視、予防または治療のための薬剤製造に対して用いる、請求項1から12までのいずれか1項に記載の使用法。
- 膵臓機能障害(例えば、糖尿病、高血糖症、および耐糖能異常)、および肥満症を始めとする関連障害、および神経変性疾患、および細胞、細胞塊、臓器および/または被検者における他の疾患の検出および/または検証、治療、軽減および/または予防のために用いる、請求項13に記載の使用法。
- 試験管内および/または生体内におけるβ細胞の分化および/または機能を促進するために用いる、請求項13に記載の使用法。
- 試験管内および/または生体内におけるβ細胞再生のために用いる、請求項13に記載の使用法。
- 請求項1から10までのいずれか1項で定義されるDP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、もしくはRA770から選択される核酸分子、またはそれによってコードされるポリペプチド、または当該核酸分子もしくは当該ポリペプチドの断片もしくは変異体、または当該核酸分子もしくは当該ポリペプチドのエフェクター/修飾因子を、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドによって影響および/または修飾される遺伝子および/または遺伝子産物の機能を監視および/または管理するために用いる使用法。
- 請求項1から10までのいずれか1項で定義されるDP119、DP444、DP810、DP685、WE474、もしくはRA977から選択される核酸分子、またはそれによってコードされるポリペプチド、または当該核酸分子もしくは当該ポリペプチドの断片もしくは変異体、または当該核酸分子もしくは当該ポリペプチドのエフェクター/修飾因子を、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するために用いる使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子導入動物を、膵臓機能障害における機能研究または薬物スクリーニングのために用いる使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドの発現が増加および/または低下される、請求項19に記載の使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドの修飾発現を示す組換え型宿主細胞(ただし該宿主細胞はヒトの生殖細胞系の細胞ではない)を、膵臓機能障害における機能研究または薬物スクリーニングのために用いる使用法。
- ヒト細胞である、請求項21に記載の使用法。
- 哺乳動物における代謝障害または代謝症候群、特に膵臓機能障害に関与する(ポリ)ペプチドを同定する方法において、
(a) 試験用(ポリ)ペプチドのコレクションと、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片とを、当該試験用(ポリ)ペプチドの結合を可能にする条件下で接触させるステップ、
(b) 結合しない試験用(ポリ)ペプチドを除去するステップ、および
(c) 当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片に結合する試験用(ポリ)ペプチドを同定するステップ
を含む同定方法。 - DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片の結合標的/薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法において、
(a) 下記
(aa) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片;
(ab) 当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片の結合標的/薬剤;および
(ac) 候補薬剤;
を含む混合物を、基準親和性で当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片が特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下にインキュベートするステップ、
(b) (候補)薬剤偏向親和性を決定するため、当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片の当該結合標的に対する結合親和性を検出するステップ;および
(c) (候補)薬剤偏向親和性と基準親和性間の差異を確定するステップ
を含むスクリーニング方法。 - DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドの活性を調整する薬剤をスクリーニングする方法において、
(a) 下記
(aa) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片;および
(ab) 候補薬剤;
を含む混合物を、当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片が基準活性を持つような条件下にインキュベートするステップ、
(b) (候補)薬剤偏向の活性を決定するため、当該DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770ポリペプチドまたはその断片の活性を検出するステップ;および
(c) (候補)薬剤偏向活性と基準活性との間の差異を確定するステップ
を含むスクリーニング方法。 - 請求項23に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項24もしくは25に記載の方法によって同定された薬剤と一緒に、医薬用に許容できるキャリアおよび/または希釈剤を含む組成物の製造方法。
- 当該組成物が、膵臓の機能障害(例えば、糖尿病、高血糖症、および耐糖能異常)、および肥満症を含む関連障害、および神経変性疾患などの防止、軽減または治療をするための医薬品組成物である、請求項26に記載の方法。
- 請求項23に記載の方法によって同定された(ポリ)ペプチド、または請求項24もしくは25に記載の方法によって同定された薬剤を、膵臓の機能障害(例えば、糖尿病、高血糖症、および耐糖能異常)、および肥満症を含めた関連障害、および神経変性疾患などの治療、軽減および/または予防に対する医薬品組成物の製造のために用いる使用法。
- DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770遺伝子ファミリーの核酸分子、またはその断片を、DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト動物を製造するために用いる使用法。
- 少なくとも1つの下記
(a) DP119、DP444、DP810、DP685、WE474、DP160、RA977、またはRA770核酸分子;
(b) (a)の核酸を含むベクター;
(c) (a)の核酸分子または(b)のベクターを含む宿主細胞;
(d) (a)の核酸分子によってコードされるポリペプチド;
(e) (a)の核酸分子によってコードされる融合ポリペプチド;
(f) (d)もしくは(e)のポリペプチドに対する抗体、および
(g) (a)の核酸分子のアンチセンスオリゴヌクレオチド
を含むキットを、膵臓機能障害の診断目的または治療目的に対して用いる使用法。
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