JP5794511B2 - オートタキシン測定による膵疾患の検査方法および検査薬 - Google Patents
オートタキシン測定による膵疾患の検査方法および検査薬 Download PDFInfo
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Description
(1)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定することによる膵疾患の検査方法。
(2)前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、(1)に記載の方法。
(3)膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である(1)又は(2)に記載の検査方法。
(4)非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである(2)に記載の検査方法。
(5)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の健常者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、(1)から(4)のいずれかに記載の検査方法。
(6)膵疾患が膵臓癌である(2)に記載の検査方法。
(7)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、(6)に記載の検査方法。
(8)血清検査または画像診断と、(1)から(7)のいずれかに記載の検査方法とを組み合わせた膵疾患の検査方法。
(9)血清検査がCA19−9、CA−50、DU−PAN−2、Span−1、CSLEX、sialyl SSEA−1、ST−439、STN、CA72−4、CA−125、CEA、hCGのいずれかの腫瘍マーカーを用いた検査である(8)に記載の検査方法。
(10)血清検査がアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ1、アルカリ性ホスファターゼ、γGTP、血糖、ヘモグロビンA1c、インスリンのいずれかの血清マーカーを用いた検査である(8)に記載の検査方法。
(11)ヒト検体が全血もしくは血球、血清、血漿などのヒト血液成分またはヒト細胞もしくは組織の抽出液である(1)から(10)のいずれかに記載の検査方法。
(12)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その測定値を男性健常者または女性健常者の統計学的数値で補正して得られるオートタキシン指数を用いて検査する膵疾患の検査方法。
(13)統計学的数値がオートタキシン濃度測定値の平均値、中央値、95パーセンタイル上限値のいずれかである(12)に記載の検査方法。
(14)前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、(12)又は(13)に記載の方法。
(15)膵疾患が膵臓癌以外の非癌膵疾患である(12)から(14)のいずれかに記載の検査方法。
(16)非癌膵疾患が慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患のいずれかである(15)に記載の検査方法。
(17)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が健常者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、(12)から(16)のいずれかに記載の検査方法。
(18)膵疾患が膵臓癌である(14)に記載の検査方法。
(19)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定し、その値が同性の非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、(18)に記載の検査方法。
(20)抗体を用いた免疫化学的方法でオートタキシン濃度を測定する(1)から(19)のいずれかに記載の検査方法。
(21)ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定する方法がリゾホスホリパーゼD活性を測定する方法である(1)から(19)のいずれかに記載の検査方法。
(22)(20)または(21)に記載の検査方法を利用した膵疾患の検査薬。
本発明者は、オートタキシン濃度と膵疾患との関係について鋭意検討した。その結果、膵疾患において健常者と比較し非癌膵疾患患者ではオートタキシン濃度が低値を示すこと、膵臓癌患者ではオートタキシン濃度が高値を示す例はあっても低値は示さないことを、それぞれ見いだした。本結果よりヒト検体中のオートタキシン濃度を測定することにより非癌膵疾患および膵臓癌の診断、ならびに膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌との判別が可能なことを見いだした。本発明は、たとえば血液検査にて、全血中または血球、血清、血漿などのヒト血液成分中のオートタキシン濃度を簡便に測定することにより膵疾患の診断を可能にする技術および試薬を提供するものである。
ヒトオートタキシンモノクローナル抗体R10.23を固相用抗体として用い、ヒトオートタキシンモノクローナル抗体R10.21を二次抗体として用いた2ステップ2抗体サンドイッチELISAにより、血清中のヒトオートタキシンを測定した。固相用抗体R10.23はペプシン消化によりF(ab)2化し使用した。R10.23を96穴イムノプレート(NUNC社製)に2μg/mL濃度で50μL/ウェルにて添加し、一昼夜、4℃にてプレートに結合させた。TBSにより3回洗浄後、3% BSAを含むTBSを250μL/ウェルで添加し2時間ブロッキング処理を行った。TBSにより3回洗浄後、ヒトオートタキシン標準品(0、0.34、0.675、1.35、2.70、5.40μg/mL)ならびに濃度未知のヒト血清をELISAアッセイ緩衝液で1/5に希釈し50μL/ウェルにて添加した。室温で2時間反応後、TBSTにより4回洗浄し、0.8μg/mLのビオチン標識R10.21を含むELISAアッセイ緩衝液を50μL/ウェル添加した。室温で2時間放置後、TBSTにより4回洗浄し、1000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジン(Zymed社製)を含むELISA緩衝液を50μL/ウェル添加した。1時間室温放置後、TBSTにより6回洗浄し、TMB基質を50μL/ウェルで添加した。室温30分後、1N−リン酸により反応を停止し450nmの吸光度を測定した。ヒトオートタキシンの標準品による検量線の回帰を、3次回帰により行った。ヒトオートタキシン濃度依存的に450nmの吸光度上昇が確認された。本検量線を用い未知濃度のヒト血清で得られた450nmの吸光度より検体中のヒトオートタキシンの濃度を算出した。
リゾホスフォリパーゼD活性測定はFEBS letters 571,197−204,2004を若干変更し行った。具体的には、サンプル20μLと2mMのリゾホスファチジルコリン(14:0−リゾホスファチジルコリン)、100mM Tris−HCl、500mM NaCl、5mM MgCl2、0.05% Triton X−100(pH9.0)を含む基質溶液20μLを混合し、37℃にて6時間から一昼夜反応させた。続いて本酵素反応により生成したコリンを定量するため、0.5mM TOOS(N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルフォプロピル)−3−メチルアニリン)、10Unit/mL 西洋ワサビペルオキシダーゼ、0.01% Triton X−100、100mM Tris−HCl(pH8.0)からなるR1溶液150μLを加え5分間放置した後、1mM 4−アミノアンチピリン、10Unit/mL コリンオキシダーゼ、0.01% Triton X−100、100mM Tris−HCl(pH8.0)からなるR2溶液50μLを加えた。30分後、生成したコリンを550nmの吸光度で測定し、既知濃度の塩化コリンを基準にしてリゾホスホリパーゼD活性値とした。
患者検体測定に先立ち、コントロール群として健常者血清のオートタキシン濃度を測定した。血液は採血7日前より投薬のない健常な成人ボランティアからインフォームドコンセントを得た後、肘前中静脈より採取し、室温15分放置後、1500×gにて5分間遠心分離することにより血清を取得し測定した。
実施例1と同一検体のリゾホスホリパーゼD活性を測定した。120名全員のリゾホスホリパーゼD活性測定値は3.56±0.80nmol/(L・min)(算術平均値±標準偏差)であり、中央値3.46nmol/(L・min)、95パーセンタイルからなる参考基準範囲は3.28nmol/(L・min)から3.55nmol/(L・min)であった。実施例1で測定したオートタキシン定量値との相関性は相関係数r=0.946と極めて良好であり、免疫測定によるオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼD活性測定値とはともに同等の診断が可能なことを示している(図1)。なお、男性健常者のリゾホスホリパーゼD活性測定値は3.18±0.55nmol/(L・min)、中央値3.17nmol/(L・min)、95パーセンタイル参考基準範囲2.97nmol/(L・min)から3.32nmol/(L・min)であり、女性健常者のリゾホスホリパーゼD活性測定値は4.15±0.79nmol/(L・min)、中央値4.00nmol/(L・min)、95パーセンタイル参考基準範囲3.80nmol/(L・min)から4.48nmol/(L・min)であった(図2)。女性血清中リゾホスホリパーゼD活性は男性に比べ明らかに高濃度であり、Mann−Whitney U testではP<0.0001の有意差を示した。
膵疾患患者の血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼD活性測定値とを測定し検証した。検体は膵臓癌患者検体9例と非癌膵疾患2例、計11例用いた。測定した11検体における血清中のオートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼD活性測定値との相関性はr=0.983と非常に良好な相関性を示した(図4)。また図4より得られた相関式は、
オートタキシン濃度[μg/L]=
2.163×リゾホスホリパーゼD活性[nmol/(L・min)]+0.0654
であり、健常者(図1)における相関式、
オートタキシン濃度[μg/L]=
2.072×リゾホスホリパーゼD活性[nmol/(L・min)]−0.0057
と大きな差が認められなかった。よって、健常者同様、膵疾患を評価する際にも、オートタキシン濃度とリゾホスホリパーゼD活性測定値、いずれを用いても問題ないことがわかる。
健常者120例および非癌膵疾患患者73例について血清中のリゾホスホリパーゼD活性を測定し、オートタキシン指数(lysoPLD index)を算出比較した。なお、非癌膵疾患患者は慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患よりなる。結果、健常者のlysoPLD indexと比較し、非癌膵疾患患者のlysoPLD indexは有意に低値を示した(Mann−Whitney試験)。前記結果より、オートタキシン濃度、リゾホスホリパーゼD活性測定値またはlysoPLD indexにより非癌膵疾患の診断が可能なことがわかる。
膵臓癌患者103例および非癌膵疾患患者73例について血清リゾホスホリパーゼD活性を測定し、オートタキシン指数(lysoPLD index)を算出比較した。非癌膵疾患患者は慢性膵炎、急性膵炎、膵嚢胞性疾患よりなる。結果、膵臓癌患者のlysoPLD indexと比較し、非癌膵疾患患者のlysoPLD indexは有意に低値を示した(Mann−Whitney試験)。前記結果より、オートタキシン濃度、リゾホスホリパーゼD活性測定値またはlysoPLD indexにより膵疾患が疑われる患者において非癌膵疾患と膵臓癌の判別が可能なことがわかる。
Claims (14)
- ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を用いることによる慢性膵炎、急性膵炎、及び膵嚢胞性疾患からなる群から選ばれる非癌膵疾患の検査方法。
- ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を測定し、その値が健常者群のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数から算出したカットオフ値に対し低値を示した場合に膵臓癌以外の非癌膵疾患を罹患するとすることを特徴とする、請求項1に記載の検査方法。
- ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を用いることによる膵臓癌の検査方法。
- ヒト検体中のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数を測定し、その値が非癌膵疾患患者群のオートタキシン濃度又はオートタキシン指数から算出したカットオフ値に対し高値を示した場合に膵臓癌を罹患するとすることを特徴とする、請求項3に記載の検査方法。
- 前記オートタキシン指数が、オートタキシン濃度の測定値を男性健常者または女性健常者の統計学的数値で補正することにより得られる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記統計学的数値がオートタキシン濃度測定値の平均値、中央値、95パーセンタイル上限値のいずれかである請求項5に記載の検査方法。
- 前記方法が、膵疾患が疑われる患者に対して行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 血清検査または画像診断と、請求項1から7のいずれか一項に記載の検査方法とを組み合わせた膵疾患の検査方法。
- 血清検査がCA19−9、CA−50、DU−PAN−2、Span−1、CSLEX、sialyl SSEA−1、ST−439、STN、CA72−4、CA−125、CEA、hCGのいずれかの腫瘍マーカーを用いた検査である請求項8に記載の検査方法。
- 血清検査がアミラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ1、アルカリ性ホスファターゼ、γGTP、血糖、ヘモグロビンA1c、インスリンのいずれかの血清マーカーを用いた検査である請求項8に記載の検査方法。
- ヒト検体が全血もしくは血球、血清、血漿などのヒト血液成分またはヒト細胞もしくは組織の抽出液である請求項1から10のいずれか一項に記載の検査方法。
- 抗体を用いた免疫化学的方法でオートタキシン濃度を測定する請求項1から11のいずれか一項に記載の検査方法。
- ヒト検体中のオートタキシン濃度を測定する方法がリゾホスホリパーゼD活性を測定する方法である請求項1から11のいずれか一項に記載の検査方法。
- ヒトオートタキシン抗体又はリゾホスファチジルコリンを含む、請求項12または13に記載の検査方法に利用される膵疾患の検査薬。
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