CN101498700A - 人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠癌诊断试剂盒制备与应用 - Google Patents

Abstract

人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠癌诊断试剂盒制备与应用。本发明有关人血液样本中脂类分子的提取与含量测定以及结直肠癌脂类分子标志物的确定。特别是，本发明包括了血液样本中几种结直肠癌脂类标志物检测的细节，并根据脂类分子标记物组成一种用于结直肠癌诊断的试剂盒。根据样本中脂类标记物的含量，通过特定的计算分析，可诊断样本提供者患结直肠癌的可能性，还为结直肠癌治疗中的疗效分析提供了新的手段。

Description

人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠癌诊断试剂盒制备与应用

技术领域

本发明提供了一种测定个体血液样本中多种脂类分子水平的方法，这些脂类分子包括：溶血磷脂酰胆碱(LPC)的各种亚型(14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC、22:0LPC、18:1LPC、18:2LPC、20:4LPC、22:6LPC，采用不饱和有机化合物的阿拉伯数字编号定位，冒号后数字表示双键位置)、神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)、血小板活化因子(L-PAF)，鞘磷脂(SM，包括SM703和SM731，其中703与731分别指两种亚型的分子量)。我们发明了一种脂类分子的生物标记组合，将其制备成试剂盒，以人体血液为样本，根据脂类标记分子的含量测定和综合分析，确定个体患有结直肠癌的可能性，以此进行结直肠癌的辅助检测。

背景技术

结直肠癌(CRC)是威胁人类健康的主要癌症之一，是常见的恶性肿瘤。近20多年来，世界上多数国家结直肠癌发病率和死亡率处于上升趋势。据世界卫生组织(WHO)Parkin博士报告，2002年结直肠癌新病例102.3万，死亡52.9万，分别比2000年增加了8.3％和7.5％，其发病率和死亡率分别居所有癌症的第三位和第四位。在现有癌症患者中，结直肠癌占了11.4％，居第二位。我国情况亦相似，以上海为例，1973--1993年结直肠癌发病率每年递增4.2％，比全球平均递增速度还要高一倍多。1990--1992年我国十分之一人口抽样调查表明，结直肠癌平均调整死亡率为4.54/10万，比1977年全国结直肠癌死亡率3.54/10万增加了28.2％，居所有癌症死亡率的第五位。最近据WH0报告的资料，我国结直肠癌死亡率2005年比1991年增加了70.7％，年均增加4.71％。

中国患者的发病年龄多在40—60岁，中位发病年龄比欧美约提前10年，高峰在50岁左右，但30岁以下的结直肠癌患者也比欧美多见。由于结直肠癌起病隐匿，症状的公众知晓度较低，许多患者在确诊时已经处于晚期。所以如果出现大便习惯与粪便性状的改变、腹痛或血便，应该及时就诊。结直肠癌的临床危险因素包括：年龄，大多在50岁以后；高蛋白高脂低纤维素饮食、吸烟和饮酒；家族史；患过大肠息肉；胆囊切除10年以上；重症溃疡性结肠炎多年不愈；接受过下腹部放射治疗；不明原因反复便血等等。

结直肠癌大约有25％的患者初次就诊时就已经发生转移。另外，高达50％的新诊断患者最终将进展为转移性结直肠癌，发生转移的患者能存活5年以上的不足5％，其最常见的转移部位是肝脏或其附近的淋巴结。转移性结直肠癌的医疗需求非常大，目前出现了西妥昔单抗这样第一个靶向作用于表皮生长因子受体的单克隆抗体，作为一种治疗结直肠癌且毒副作用远小于传统化疗药物的西妥昔单抗(爱必妥)，为伊立替康标准化疗失败的转移癌患者提供了一种新的治疗选择。

由于生存时间的长短取决于疾病诊断的时期，因此早期诊断极为重要。就全球而言，迄今结直肠癌的“三早”(早期发现、早期诊断、早期治疗)远不如人意。按理，根据目前外科技术和放化疗条件，结直肠癌完全可以争取到更好的治疗效果。临床资料表明，I期结直肠癌术后5年生存率达90％以上，II期为68.4％，III期为39.7％，IV期仅为10.2％。事实上，临床所见I期患者仅10％～20％，误诊、漏诊情况十分严重。文献资料统计结直肠癌的误诊率达60％～70％，约64％～85％的患者经历6个月以上才获得正确诊断，以致相当多患者失去治愈机会。在治疗上，虽然公认结直肠癌以手术治疗为主，但是手术治疗的效果在很大程度上取决于结直肠癌所处的时期。

许多研究表明，结直肠癌变是一个涉及原癌基因激活、抑癌基因失活等多基因、多阶段、多步骤渐进演化的积累过程。与结直肠癌相关的抑癌基因有p53、APC、DCC等，原癌基因有K-ras、c-myc等，并可能用于临床辅助诊断。

1.CD44

人的CD44基因位于第11号染色体短臂上，大小约60kb，含有20个外显子。其中外显子6～15(即V1～V10)在转录过程中易于通过选择性剪接形成剪接变异体，即CD44V。Coppola D等(Coppola D.，Hyacinthe M.，Fu L.，et al.CD44V6 expression in human colorectalcarcinoma.Hum Pathol，1998，29：627-635.)对34例结直肠癌切除标本的检测结果发现：腺瘤中CD44V6检出率为100％，癌为91％，转移灶最弱，仅38％，因此认为D44V6的表达是结直肠癌的早期标志。国内吴健雄等(吴健雄，余宏迢，邵永孚，等.转移相关基因CD44V在大肠癌中的表达及其临床意义.中华肿瘤杂志，1996，18(5)：347-350)的研究证实：CD44VmRNA在结直肠癌中的异常表达具有普遍性，既可能是早期癌变伴随出现的生物学标志，也可能是判断结直肠癌转移的有用指标。Kim等(Kim H.，Yang X.Y.，Rosada C.，et al.CD44expression in colorectal adenomas is an early event occurring prior to k-ras and p53 genemutation.Arch Biochem Biophys，1994，310(2)：504-507)认为，在结肠癌进展过程中，CD44基因的表达与突变的K-ras基因相关联，是被活化的H-ras基因所诱导，并认为此种异常表达早于K-ras和p53基因突变。因而认为，CD44V6基因异常表达是肿瘤发生的早期事件。Yamao等(Yamao T.，Matsumura Y.，Shimada Y.，et al.Abnormal expression of CD44variants in the exfoliated cells in the faeces of patients with colorectal cancer.Gastroenterology，1998，144(6)：1196.)应用RT-PCR及Southern杂交技术检测了25例结直肠癌患者及15例健康对照者粪便中脱落细胞的CD44、CD44V6及CD44V10的表达。结果显示结直肠癌患者的CD44V6及CD44V10的阳性检出率分别为68％和60％，术后的阴转率分别为88.2％和80.0％。而且CD44V6及CD44V10均可在DuckesA期患者术前粪便中检出。因而，对粪便中脱落细胞的CD44基因异常表达分析可作为非侵袭性方法用于结直肠癌患者的早期诊断及无症状高危人群的筛选。

2.p53

p53基因位于人类17号染色体短臂(17p13.1)。全长约1620kb。由11个外显子和10个内含子组成。p53基因在进化过程中高度保守，外显子2、4、5、7、8分别编码5个在进化上高度保守的结构。野生型p53(WTp53)与调控细胞生长周期、调节细胞转化、DNA复制、诱导细胞程序性死亡有关。有实验表明，分化良好的腺瘤，包括家族性多发性结肠息肉这一常染色体显性遗传病以及结直肠息肉中p53的表达明显低于结直肠癌(何裕隆，王吉甫.p53基因突变及蛋白表达与大肠癌发生及预后关系探讨.中华实验外科杂志，1997，14(4)：224)。结直肠癌p53基因的缺失率为50％～70％(Lacopetta B.，Digrandi S.，Dix B.，et al.Loss of heterozygosity of tumor Suppressor gene loci in human colorectal，Eur JCancer，1994，30A：670-671；Campo E.Prognostic Significance of the loss of heterozygosity ofnm23H1 and p53 genes in human colorectal carcinomas.Cancer，1994，73，2913-2915；MelingGI，Lothe RA，Borressen AL，et al.The Tp53 tumor suppressor gene in colorectal carcinomas.Br JCancer，1993，67：88-90.)1996年，Eguchis等采用PCRSSCP技术对11例结直肠癌患者的粪便进行检查，7例中查到p53基因突变(64％)。由此推测p53基因的缺失或突变与结直肠癌的发生密切相关。

3.DCC

结直肠癌缺失基因(Deleted in Colorectal Carcinoma，DCC)作为90年代发现的肿瘤抑制基因，其与结直肠癌的相关性研究正在不断深入。Vogelstein等(Vogelstein B.，FearonE.R.，Hamilto S.R.，et al.Genetic alterations during Colorectal tumor devdlopment.N Engl JMed，1988，319：525-530.)报道，在结直肠黏膜上皮由正常转化为上皮增生和腺瘤，并演进到癌变的过程中，有47％的进展期腺瘤(腺体或细胞呈中、重度不典型增生)和73％的结直肠癌细胞中可检出染色体18q有LOH(DCC等位基因的杂合性丢失Loss OfHeterozygosity，LOH)，但在早中期腺瘤(<1.0cm)很少见。而在90％的有18qLOH的病人中，缺失区包含了DCC基因位点(Tanaka K，Oshimura M，Kikuchi R，et al.Suppression oftumorigenesity in human colon carcioma cells by introduction of normal chromosome 5 or 18.Nature，1991，349：340-342；Hedrick L，Cho KR，Fdaron ER，et al.The DCC gene product incellular differetiation and colorectal tumorigenesis.Genes Dev，1994，8：1174-1183.)。Goi等(Goi T.，Yamaguchi A.，Nakagawara G.，et al.Reduced expression of deleted colorectalcarcinoma(DCC)protein in established colon cancer.British Journal of Cancer，1998，77：466-471.)采用Western blotting法检测结肠癌、癌旁组织及腺瘤中的DCC蛋白表达情况，则发现癌组织中DCC蛋白明显减少或缺失，在腺瘤组织中DCC蛋白有明显表达，与正常组织几乎相同，提示DCC基因缺失或失活是结肠腺瘤向癌转变的一个促发因素。DCC基因是目前发现的最长的人肿瘤抑制基因，尤其在结直肠癌的发生发展中具有重要意义，其失活和表达异常与结直肠癌的诊断关系密切。然而DCC基因的失活机制、DCC蛋白的功能及其诱导细胞分化的机制还有待于进一步探索。

4.Ras

Ras基因家族分为K-ras、H-ras、N-ras，基因编码蛋白质的相对分子质量相同。Ras基因的突变在结直肠细胞癌变过程中起启动作用，并是一个早期事件，突变产生具有致癌活性的p21蛋白，通过Ras信号转导通路激活下游信号分子，持续刺激细胞生长、发育、增殖，引起细胞恶变。Smith Ravin等(Ravin J.S.，England J.，Tallot I.C.，et al.Detectionofk-ras mutations in faecal samples from sporadic colorectal cancer patients.GUT，1995，36(1)：81.)研究证实结直肠癌患者粪便中K-ras基因突变率达40％～50％以上，且突变点多位于12密码子，这就为结直肠癌点突变的诊断提供了依据。

5.APC

APC基因是结直肠癌常见的变异基因之一，与结直肠癌的关系密切(Kinzler K.W.，Nilbert M.C.，Su L.K.，etal.Identification of FAP locus genes from chromosome 5q21.Science，1991,253：661-665；Nishisho I.，Nakamura Y.，Miyosm Y.，etal.Mutations of chromosome 5q21genes in FAP and colorectal cancer patients.Science，1991，253：585-609.；Groden J.，Thlivers Q.，Samowitz W.，et al.Identification and characterization of the familial adenomatous ployposiscoli gene.Cell，1991，66：589-600.；Joslyn G.，Calson M.，Thliveris A.，et al.Identification ofdeletion mutations and three new genes at the familial polyposis locus.Cell，1991，66：601-603.)。变异的APC基因与ras基因一起被认为是结直肠癌发生的促发事件(Gerds H.，Chen Q，Hlahi AH，et al.Recurrent deletions involving chromosomes 1，5，17and 18 in colorevtalcarcinoma；possible role in biological and clinical behavior of tumours.Anticancer Res，1995，15：13.)。激活型ras基因能使缺乏APC基因的正常小鼠上皮细胞转化肿瘤细胞(GiovannaM，D′abaco GM，Whitehead RH，et al.Synergy between APCmin and an activated ras mutationis sufficient to induce cloln carcinomas.Mol Cell boil，1996，16(3)：884.)。而且Friedl等报道APC基因突变位点与病变程度有关(Friedl W.，Meuschel S.，Caspari R.，et al.Attenuatedfamilial adenomatous polyposis due to a mutation in the function of the APC gene.A clue forunderstanding the function of the APC protein.Hum Genet，1996，97：57.)。Powel等(Powel S.M.Nature.1992.359：235-237.)通过对APC基因编码区及剪切位点的测序发现，63％的结直肠腺瘤、60％的结直肠腺癌有APC基因的突变。由于APC基因是结直肠癌发生的早期事件，随着分子生物学的进步，可望成为早期结直肠癌的诊断焦点。

6.bcl-2

细胞凋亡或程序性细胞死亡(PCD)在组织的发生、分化和内稳态的调节中起重要的作用，而bcl-2与凋亡的关系较为密切，通过抑制细胞凋亡而调节细胞运动。Bcl-2作为一种原癌基因，可以通过PCD而有利于肿瘤细胞的生长，在癌组织中bcl-2基因重排在结直肠癌早期就已出现。骆成玉等(骆成玉，李世拥，祝学光.应用半巢式PCR检测大肠癌组织及患者粪便中bcl-2基因的重排.中华实验外科杂志，1999，16(3)：197.)应用半巢式PCR检测发现，28例结直肠癌组织标本中24例(85.7％)捡出重排；粪便中检测出17例bcl-2重排(70.8％)。由此可见，检测粪便中脱落癌细胞的基因有助于早期结直肠癌的诊断。

这些基因虽然与结直肠癌有密切的相关性，但仍未临床上发展成为以这些基因检测为基础的成熟的早期诊断方法。

近些年国外对结直肠癌的诊断方法进行了探索，主要方法如下：

1.遗传学检测：

近日，《柳叶刀肿瘤学》杂志网络版上刊登了意大利米兰的Salvatore Siena博士关于应用遗传学检查检查结肠癌治疗效果的研究报告，该报告指出：表皮生长因子受体(EGFR)基因拷贝数升高可以预测转移性结肠癌患者使用抗EGFR治疗的疗效。Siena博士的研究小组对10名治疗有效的患者和21名无效的患者进行了EGFR拷贝数的检测。9名治疗有效的患者中8人EGFR拷贝数升高，相比之下，21名无效患者只有1人EGFR拷贝数升高。体外分析表明，可以完全阻断有EGFR拷贝数升高癌症细胞增殖的化疗药物浓度，对于EGFR无升高的癌症细胞治疗无效。

美国约翰斯·霍普金斯大学Kimmel癌症中心Feinberg等报告，通过检测遗传密码发生细微改变的血液试验可确定结肠癌发病的危险程度。

相关研究显示，印记缺失(loss of imprinting LOI)与几种癌症有关。IGF2基因的LOI存在于高于40％的结肠癌病人。Feinberg等研究的目的就是确定LOI是否与结肠癌有关。该研究共采集172例做结肠镜检病人的血液标本。其中，25例有结肠癌和息肉家族史或本人有结肠癌和息肉病史，而且血液LOI检测阳性。结果发现，有结肠癌家族史病人的血液LOI标记阳性率是无结肠癌家族史病人的5倍之多。有息肉病人的血液LOI标记阳性率增高近3.5倍，有结肠癌病史者的血液LOI标记阳性率增高是无家族史的4.4倍以

研究人员称：“我们希望能像识别心脏病高危人群的方法一样，此检验也能帮助我们识别结肠癌高危人群，对他们进行密切随访和预防，至少能帮助我们早期诊断结肠癌病人。”但目前此血液遗传标记检测还只能用于研究中。Feinberg等说，我们可能需要很多年才能研制出有效的检验方法。

2.粪便检查：

德国吉森大学医院的研究人员Hardt等发现，检测粪便中的肿瘤M2丙酮酸激酶(M2-PK)可以敏感地筛查结直肠癌。

粪便潜血试验可以间接了解有无结肠肿瘤。但该方法不能鉴别出血来自肿瘤还是其他疾病。该研究发现，在结肠癌的病人与无肿瘤的病人之间，粪便中的肿瘤M2-PK水平存在显著差异。并且该酶的水平与肿瘤转移之间存在非常强的相关性。采用ELISA方法检测无结肠癌对照者与结直肠癌病人的粪便标本。结果：对照组M2-PK为(3.3±0.4)U/ml，而结直肠癌病人为(56.1±15.3)U/ml。在将正常值定为4U/ml时，结肠癌患者的M2-PK值是正常人的14倍。所以，粪便肿瘤M2-PK检测有可能成为结直肠癌筛查的新手段。

3.结肠镜检查

美国密歇根大学医学院Schoenfeld等对有结肠癌家族史、但肠镜检查正常患者的结肠镜复查时间进行了研究，初步结果显示，5年是高危人群随诊的最适间隔时间。但该结果是否同样适合于中国人尚待进一步研究。

目前认为，年龄大于50岁的人均应该接受结直肠癌的筛查。这些检测对于那些高危人群尤为重要。被认为有更高几率患结直肠癌的人群包括：有遗传倾向的(比如说有家族息肉病史的，以及遗传性的非息肉结直肠癌家族)，患溃疡性大肠炎，直系亲属患有结直肠癌或者腺瘤，以及有卵巢癌或者子宫癌患病史的。然而，目前大多数推荐的筛查方法的灵敏度和特异性都在50％以下。最近，利用粪便样本，建立在分子基础上的结直肠癌基因检查得到了很大关注，但是这种测试方法的准确度也只有57％。已报道的结肠镜检查的灵敏度和特异性较高，但由于费用较高、痛苦较大和操作要求高等原因降低了病人愿意做该项检查的程度，致使很多病人拖到晚期成了不治之症。因此急切需要开发出一种可应用于结直肠癌早期筛查的简单可靠、无创或微创的大通量检查方法。

发明内容

发明概述：

采用简便准确的方法对来自临床的人血液样本中多种脂类分子进行了抽提检测，在获得样本中脂类分子的含量数据后，通过逐步回归方法进行了变量筛选，最后确定SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731可以作为结直肠癌的生物标记应用于试剂盒组成，同时加入年龄因素与试剂盒中几种脂类分子含量共同确定样本提供者患结直肠癌的可能性。在对全部样本的172个正常人，169个结直肠癌(CRC)患者的鉴定过程中有着86.98％的灵敏度和85.47％的特异度。这种发明可应用于利用血液样本来检测个体中多种标记物，通过检测出的个体中脂类分子水平来直接预测患有结直肠癌可能性。

当个体血液中所选定的脂类分子水平低于对照组时，即表明该个体患有结直肠癌的可能性很大。而所谓对照组的脂类分子水平，即已知未患有结直肠癌的健康个体群体中检测到的SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731含量水平。对受试样品检测到的脂类分子(SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731)的含量水平进行计算，其结果与正常水平相比降低，就可预测该接受检测者可能患有结直肠癌。该方法可以检测无临床症状的结直肠癌个体。其具体的判断方法依据公式：

$\log \left(\frac{{\mathrm{\&pi;}}_2}{{\mathrm{\&pi;}}_0}\right)=0.1259\&times;x_2-20.0514\&times;x_3-0.6517\&times;x_4-0.0314\&times;x_{12}-0.0632\&times;x_{13}$

公式I

其中记π₀是样本为正常人的概率，π₂是样本患CRC的概率。变量x₂表示年龄、x₃表示血液中的SPC值、x₄表示血液中14:0LPC值、x₁₂表示血液中SM731值、x₁₃表示18:2LPC值。将公式I右侧值大于0判别为CRC，小于0判别为正常。

这个发明包含有检测个体中血液样本脂类分子水平的试剂盒，包括可以检测某一样本中SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731以及综合检测它们的化合物。其中还进一步包括一种检测样本中脂类分子水平的方法；和/或一种比较样本脂类分子水平和对照脂类水平的方法。

另外，本发明还提供了一种筛选用于治疗或预防结直肠癌的化合物的方法，该方法包括以下步骤：当受试化合物应用于临床阶段时，可将脂类分子的含量水平变化作为一种检测效果的参考指标。

采用所发明的试剂盒中的脂类分子(SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731)对血液进行检测，筛查结直肠癌患者比起结肠镜更为简便快速，成本较低，痛苦很小，可大规模进行。

此外，本发明还提供了各种脂类分子的分离提取，定量比较的方法，包括SPC、LPC、SM、L-PAF等。该方法比以往的脂类分子提取方法适应面更广，能够对多种活性脂类分子进行准确提取鉴定。

发明详述：

近年来，有研究表明脂类分子中的溶血磷脂是重要的细胞信号转导分子。溶血磷脂分子，如LPA(Lysophosphatidic Acid)、S1P(Sphingosine-1-phosphate)、LPC(Lysophosphatidylcholine)和SPC(Sphingosylphosphorylcholine)等可以由细胞产生并分泌到胞外，作为胞外信号分子广泛地参与各类生物活动，因此被称为生物活性脂类分子。这些生物活性脂类分子的代谢又与一些生物活性因子如血小板活化因子紧密相关。

LPA是人们近些年来研究得最多的生物活性脂类分子。LPA参与多种生理活动，如脑的发育、血压的调节、伤口的愈合和嗅觉，以及免疫和生殖系统的功能等，同时LPA又与一些疾病密切相关，特别是它在肿瘤发生和发展中的作用备受关注。1994年XuY.等从卵巢癌病人的腹水中纯化鉴定出卵巢癌细胞激活因子(OCAF)，并进一步发现OCAF由生物活性脂类分子LPA组成，从而首先揭示了LPA对卵巢癌的发生和发展有直接的作用。LPA作为一个自分泌生长因子，能刺激卵巢癌细胞的增殖、黏附以及迁移(XuY.etal，Characterization ofan Ovarian Cancer Activating Factor(OCAF)inAscites from OvarianCancer Patients，Clinical Cancer Res.1995.1：1223-1232.；XuY.et al.Lysophospholipids Activate Ovarianand Breast Cancer Cells.Biochem.J.1995.309：933—940.；Baudhuin L.M.，et al，Activationinduced by LPA and S1P requires both MEK and p38 MAP kinase and is cell-line specific，MolPharmaco L 2002.62：660—671.；Sengupta S.，et al.，A novel laminin-induced LPA autocrineloop in the migration of ovarian cancer cell，FASEB J.2003.17：1570-1572.)。在卵巢癌发生的早期，从卵巢癌患者的腹水和血液中就可以检测到LPA水平的升高。LPA不仅是卵巢癌患者腹水中促进癌细胞生长的因子，还具有抗凋亡和诱导癌细胞迁移的作用。随后的研究初步显示，LPA也在肝癌、前列腺癌、肺癌和直肠癌的发生和发展中发挥作用，可以诱导上述多种癌细胞的增殖和迁移。在卵巢癌和其它一些妇科癌症中，LPA水平在病人的血浆样本中明显升高，但是在乳腺癌和白血病中LPA的水平并没有提高(Xu Yetal.，Lysophosphatidic acid as a potential biomarker for ovarian and other gynecologic cancers.JAMA 1998.280：719-723.；Sutphen R et al.Lysophospholipids are potemial biomarkers forovarian cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.，2004.13：1185-1191.)。

除LPA以外，S1P(Sphingosine-1-phosphate)和SPC也与肿瘤的发生、肿瘤发展过程中血管的生成等有关。生物活性脂类分子之间是可以相互转化的，新近发现一个被称为Autotaxin(ATX)的蛋白是生物活性脂类代谢中关键的酶。ATX(也被称为NPP2)具有lysoPLD的作用，可以催化LPC和SPC分别生成LPA和S1P(Umezu-Goto，M.，etal.，Autotaxin has lysophospholipase D activity leading to tumor cell growth and motility bylysophosphatidic acid production.J Cell Biol，2002.158(2)：p.227-33.；Tokumura，A.，et al.，Identification of human plasma lysophospholipase D，a lysophosphatidic acid-producingenzyme，as autotaxin，a multifunctional phosphodiesterase.J Biol Chem，2002.277(42)：p.39436-42.；Clair，T.，et al.，Autotaxin hydrolyzes sphingosylphosphorylcholine to produce theregulator of migration，sphingosine-1-phosphate.Cancer Res，2003.63(17)：p.5446-53.)，而LPA和S1P是与癌症发生和发展相关的脂类分子(Xu，Y.，et al.，Unfolding thepathophysiological role of bioactive lysophospholipids.Curr Drug Targets Immune EndocrMetabol Disord，2003.3(1)：p.23-32.；Xu，Y.，etal.，Lysophospholipids activate ovarian andbreast cancer cells.Biochem J，1995.309(Pt3)：p.933-40.；Sengupta，S.，Y.J.Xiao，and Y.Xu，A novel laminin-induced LPA autocrine loop in the migration of ovarian cancer cells.Faseb J，2003.17(11)：p.1570-2.；Jemal，A.，et al.，Cancer statistics，2004.CA Cancer J Clin，2004.54(1)：p.8-29.；CHI Zhao-chun Update on management of patients with colon-rectal cancerCurrent status and new strategy of screen test for patients with colon-rectal cancer，2006.Chinese Journal of postgraduates of medicine，2006 Vol.29No.13P.1-2.；Smart，C.R.，Theimpact of the U.S.Preventive Services Task Force guidelines on cancer screening：perspectivefrom the National Cancer Institute.J Gen Intern Med，1990.5(5Suppl)：p.S28-33.)。更为重要的是，ATX在许多肿瘤细胞和肿瘤组织中，甚至肿瘤发生的早期出现高表达。这些研究结果进一步揭示了生物活性脂类分子代谢与肿瘤发生之间的关系。

肿瘤发生早期生物活性脂类分子代谢的异常可以从人的体液(血清/血浆)中直接检测到。与之相比，传统的组织样本检测不仅创伤大，而且对肿瘤难以做到早期诊断。与基因和蛋白标记物相比，作为代谢标记物生物活性脂类分子的检测更方便、快捷，适于临床推广。因此，建立灵敏、准确和高效的生物活性脂类分子方法，筛选针对不同肿瘤特异的生物活性脂类分子标记物，对肿瘤早期诊断具有重要的意义。

典型来说，脂类分子的水平可以在从个体获得的样本(比如整个血液、血浆、血清、淋巴和组织)中进行测定，例如使用液相层析-质谱(LC.MS)的方法、紫外(UV)法、免疫分析方法(免疫共沉淀、免疫荧光)、酶学分析(比色法)和/或综合的方法。

液相层析-质谱(LC-MS)的方法被应用，例如探测血液中LPC等脂分子水平。这种方法具有如下优点：

1.高精确性和可重复性。

2.不需要薄层层析。

3.检测仅需要20uL血浆样本。

4.血浆和血清样本都可以被应用。

5.紫外探测可以被用作两种LPC分子的定量。高效液相色谱(HPLC)的仪器，费用大约是质谱(MS)的10-15％。因此这项检测的成本可以进一步降低。除此以外，HPLC的操作步骤比较简单。

这里介绍的方法在多种形式的溶血磷脂的定量分析上具有高度精确性、可重复性和敏感性。这种方法在具体样本中可以被具体化为测定脂类分子的水平。因此这项发明可以直接应用于诊断结直肠癌。

可以定性和/或定量分析一个或多个个体中某一样本的脂类分子水平。在一个具体的实例中，被测试个体的脂类分子水平可以与一个对照中的脂类分子水平相比较。例如，当某一个体样本的脂类分子水平低于对照(比如说对照个体或对照样本)时，则该个体有患结直肠癌的可能性。可以使用任何合适的对照样本，用作检测脂类分子水平的对照样本的个体(一个或多个)没有结直肠癌(例如，来自于一个或多个健康个体的脂类分子水平用于对照)。比如说，一个合适的对照值可以利用大量没有结直肠癌的个体样本，利用数据模型从而获得一个对照值(标准值)来确定。比如说，Knapp，R.G.& Miller M.C.(1992)ClinicalEpidemiology&Biostatistics，William and Wilkins，Harual Publishing Co.Malvern，PA，的模型可以作为参考。

为了鉴别结肠癌病人血浆中可能的生物标记，利用基于电子喷雾离子质谱(ESI-MS)的方法(Xiao，Y，etal.，Evaluation of plasma lysophosph01ipids for diagnostic usingelectrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS)analyses.Ann.NY Acad.Sci.2000.905：242-259.XiaoY.J.，etal.，Electrospray ionization mass spectrometry analysis oflysophpospholipids in human ascetic fluids：comparison of the lysophospholipid contents inmalignant VS nonmalignant ascetic fluids.A nalBiochem.2001.290,302-13.)分析了169个结直肠癌患者以及172个健康对照体内的脂类分子。来源于健康对照组和结直肠癌患者的血浆样本在双盲的情况下获得，以作为分析之用，用基于电子喷雾离子质谱(ESI-MS)的方法分析了13个种不同的脂分子。其中9种脂分子在健康对照组与结直肠癌患者组血浆中的含量存在显著差异，而经过数学模型分析，我们发现利用年龄、SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731为标记，在结直肠癌的鉴定中灵敏度达到了大约86.98％，特异度达到大约85.47％。

目前的发明部分基于四种脂类分子(SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731)作为结直肠癌的标记，此外，除了诊断试剂盒中四种分子的检测分析，年龄因素的影响也作为一个变量影响诊断结果。

在一个具体的例证中，来自于个体或样本中的脂类分子含量水平可以用作检测被试个体或样本是否患有结直肠癌。例如，在某些具体情况下，如果某一个体中SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731结合年龄的计算水平低于正常健康组，则表明该个体有患结直肠癌的可能性。

正常组内各种脂类分子含量的平均水平(μmol/l)如表1：

表1

 

种类	SPC	14:0LPC	LPAF	16:0LPC	18:1LPC	18:0LPC	20:0LPC	22:0LPC	SM703	SM731	18:2LPC	20:4LPC	22:6LPC
														均值	0.0509	1.134	0.9471	1427	33.93	65.18	0.7722	0.6471	1733	32.49	76.71	0.2362	5.203
标准差	0.0732	0.5207	0.3361	41.79	11.92	22.29	0.7791	0.7999	44.24	9.962	32.08	0.0989	2.131

结直肠癌(CRC)组内各种脂类分子含量的平均水平(μmol/l)如表2：

表2

 

种类	SPC	14:0LPC	LPAF	16:0LPC	18:1LPC	18:0LPC	20:0LPC	22:0LPC	SM703	SM731	18:2LPC	20:4LPC	22:6LPC
														均值	0.0381	1.106	0.7427	109.2	24.64	49.86	0.6124	0.4428	166.8	32.46	45.14	0.1826	3.987
标准差	0.0182	0.6954	0.2414	36.21	9.462	18.92	0.3263	0.2770	40.90	10.40	21.80	0.0729	1.827

通过对所有样本的总LPC含量、饱和LPC、不饱和LPC、SPC、SM、L-PAF含量进行T-test分析，得到下列结论：

总LPC含量比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)<0.001，即正常组与CRC组之间在总LPC含量上存在极其显著的差异；

总饱和LPC含量比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)<0.001，即正常组与CRC组之间在总饱和LPC含量上存在极其显著的差异；

总不饱和LPC含量比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)<0.001，即正常组与CRC组之间在总不饱和LPC含量上存在极其显著的差异；

SPC含量比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.078，即正常组与CRC组之间在SPC含量上存在差异，未达到显著差异。

总SM含量比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.245，即正常组与CRC组之间在总SM含量上不存在显著差异；

L-PAF含量比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)<0.001，即正常组与CRC组之间在L-PAF含量上存在极其显著的差异。

据此，我们得知来自于个体或样本中的总LPC水平、总饱和LPC水平、总不饱和LPC水平、L-PAF水平在健康人与结直肠癌患者之间存在显著的差异。

除此之外，通过总饱和LPC/总不饱和LPC的比较：正常组与CRC组相互作用P(Sig.2-tailed)<0.001，即正常组与CRC组之间在总饱和LPC/总不饱和LPC比值上存在极其显著的差异。

上述各大类脂分子在两组间的变化幅度(μmol/l)如表3：

表3

 

	总LPC	总饱和LPC	总不饱和LPC	L-PAF	总饱和LPC/总不饱和LPC
						正常组	326.4822±103.0654	210.4004±3.8429	116.0818±44.3936	0.9471±0.3361	1.9188±0.4224
CRC组	235.1995±82.6056	161.2553±54.4943	73.9443±31.6099	0.7427±0.2414	2.3203±0.5319

得到这些结果后，我们通过建立数学模型发明了一种通过检测血液中脂类分子水平判断被检测个体是否可能患有结直肠癌的方法，如果脂类分子水平低于对照则表明个体可能患有结直肠癌。

在一个具体的例证下，此发明是综合利用SPC、14:0LPC、18:2LPC和SM731。将4种脂类分子的含量及年龄代入公式I，通过计算可确定其患结直肠癌可能性：

$\log \left(\frac{{\mathrm{\&pi;}}_2}{{\mathrm{\&pi;}}_0}\right)=0.1259\&times;x_2-20.0514\&times;x_3-0.6517\&times;x_4-0.0314\&times;x_{12}-0.0632\&times;x_{13}$

公式I

其中记π₀是样本为正常人的概率，π₂是样本患CRC的概率。变量x₂表示年龄、x₃表示血液中的SPC值、x₄表示血液中14:0LPC值、x₁₂表示血液中SM731值、x₁₃表示18:2LPC值。将公式I右侧值大于0判别为CRC，小于0判别为正常。

在模型建立的过程中用x₁到x₁₅分别表示检测对象的性别、年龄、血液中的SPC值、14:0LPC值、L-PAF值、16:0LPC值、18:1LPC值、18:0LPC值、20:0LPC值、22:0LPC值、SM703值、SM731值、18:2LPC值、20:4LPC值、22:6LPC值，通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)进行变量的选择，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据。随机选85％的数据用于建立模型(即训练集中有146个正常人和144个CRC患者)，15％的数据用于检验模型(即验证集中有26个正常人和25个CRC患者)。对正常和CRC数据利用二分类的logistic模型研究筛选出上述5个变量(4种脂类分子，1个年龄因素)得到上述模型，该过程训练集特异度为83.56％，灵敏度为86.80％；验证集特异度为88.46％，灵敏度为88.00％，总的特异度为85.47％，灵敏度为86.98％。

本模型除了包括LPC分子，还包括SPC和SM分子，从一个崭新的角度找到与结直肠癌密切相关的脂类分子。除此以外，本模型还充分考虑了年龄因素对受试者体内脂类分子含量的影响，排除了年龄增长变化过程中血浆脂类分子含量自然变化的影响。而性别作为另一个可能影响血浆脂类分子变化的因素在模型中被排除，这是因为在数据的分析过程中发现性别因素对脂类分子含量和结直肠癌的诊断微乎其微，因此没有将其放入模型。而其他各种不同的脂类分子尽管含量在正常组与CRC组具有明显差异，但在综合分析中也未被逐步回归筛选进入模型，这并不代表其他脂类分子在两组之间的差异没有意义，而仅在本模型中不能使灵敏度与准确度达到最佳效果，故而未采用。

目前的发明提供了利用SPC、14:0LPC、18:2LPC和SM731分子的水平作为结直肠癌预先检测的标记。具体来说，这种方法提供了检测个体成为结直肠癌患者的风险。一个个体可以进行定期(例如每六月一次，一年一次，两年一次)检查LPC等脂类分子的水平，观测是否随时间发生变动(降低或者升高)。当个体脂类分子水平随着时间而降低则表明该个体有患结直肠癌的风险，或者已经患有结直肠癌。

目前的发明可以用作检测个体某一样本中脂类分子的工具。例如，这一工具试剂盒可以包含一种标记复合物或者因子(例如一种抗体、一种酶)，它具有检测SPC、14:0LPC、18:2LPC和SM73l或者这几种物质的能力；检测样本中含量的方法；对比样本中的含量与标准对照的含量的方法；一个合理的对照。这些成分可以被包装于一个合适的试剂盒内。

附图说明

图1，健康正常组中各种脂类分子所占的比例

图2，健康正常组中各种LPC占总LPC的比例

图3，健康正常组中各种饱和LPC占总饱和LPC的比例

图4，健康正常组中各种不饱和LPC占总不饱和LPC的比例

图5，CRC组中各种脂类分子所占的比例

图6，CRC组中各种LPC占总LPC的比例

图7，CRC组中各种饱和LPC占总饱和LPC的比例

图8，CRC组中各种不饱和LPC占总不饱和LPC的比例

具体实施方式

例1LPC等脂类分子在样本血浆中的含量测定。

1.材料和方法

血样来源于169个结直癌患者和172个健康的对照。所有的病人都经过了结直肠癌的病理检测。没有其它特殊的条件限制，除非病人拒绝参与。所有病人血样的采集都是在手术之前。

所有血样按照如下程序收集：所有血液样本(4ml)收集在符合国家GB15980-1995标准的含有EDTA的试管中，1,750g在室温下离心15分钟。血浆样本分装(100μl/管)在硅化处理的离心管中并冻存在-80℃待用。

2.脂类提取以及磷脂分析

2.1标准曲线建立

血浆中脂类(LPC、LPA等)的浓度与经过质谱(MS)所得到的离子强度成正比例关系，即：I＝KC。

因此，I_S/I_IS＝K_S/K_IS×C_S/C_IS，也就是C_S＝(K_IS/K_S×I_S/I_IS)C_IS(其中下标S表示sample，IS表示内标inter standard)。从上式可以看出，只要求出K_IS/K_S，再加上已知的C_IS，以及经质谱给出的I_S/I_IS，即可得到待测物质的C值。

欲求K_IS/K_S，必须通过建立标准曲线。已知I_S/I_IS＝K_S/K_IS×C_S/C_IS成立，通过配制一系列浓度的标准样品溶液和一固定浓度的内标溶液，然后经MS检测得到I_S和I_IS，即可得I_S/I_IS—C_S/C_IS的一元关系曲线，通过曲线即可得到K值。

测定流程如下：

标准样品溶液配制→质谱分析方法建立(DP，CE，EP，CXP，CEP条件摸索，获得最佳灵敏度)→标准曲线建立→脂类抽提→质谱检测→结果定量分析

2.1.1 标样配制

LPC：12:0，14:0，16:0，18:0，20:0，22:0，18:1，18:2，20:4，22:6

SPC

L-PAF

SM(731.09)SM(703.03)

标样浓度：

液体10mg/ml，固体2.5mg，用2：1的氯仿/甲醇溶解，加1.8ml氯仿，0.9ml甲醇得到10mg/ml样品溶液。(溶解过程中，难溶的样品可补加氯仿，并以45℃水浴助溶，由于刚溶解后可能又会变混浊，因此要迅速取样稀释。)

标样稀释：

10mg/ml→10mM→1mM→0.1mM均用9：1的甲醇/水稀释

标样配制：

9种LPC+SPC+2种SM+L-PAF

从0.1mM稀释至100fmol/μl，即由0.1M稀释到10^-7M。各取10μl0.1mM的对应9种标样，再补充9：1的甲醇/水至终体积为10ml。(之所以上述方式组合，是因为酸碱性不同的样品通常在MS检测过程中采用不同的离子模式，如LPC采用正离子模式，LPA采用负离子模式。实际上，SM和L-PAF等可与LPC系列混在一起。)

建立标准曲线所需的一系列浓度标样：

LPC系列

A.9种LPC(无12：0)+SPC+L-PAF+2种SM，分别配制30μM，20μM，10μM，5μM，2μM浓度的标准液各1ml。

B.12:0LPC内标：10μM1ml。

2.1.2 通过测定上述标样和内标，得到1/K值如下表4：

表4

 

脂类	IS	SPC	14:0LPC	L-PAF	16:0LPC	18:1LPC	18:0LPC
								1/K	0	0.6284	1.357	1.068	1.2987	1.2525	1.4522
脂类	20:0LPC	22:0LPC	SM703	SM731	18:2LPC	20:4LPC	22:6LPC
								1/K	1.6543	1.8822	1	1	1.2525	1.6543	1.8822

2.2 LPC的提取

①内标溶液的配制5ml PBS+100μl12:0-LPC(0.1mM)，充分混匀。(现配现用)

②在离心管中加0.5ml上述内标溶液。

③加3ml 2:1甲醇/氯仿

④加10μl血浆样品，立即混匀，冰上放置10min。

⑤加1ml氯仿，再加1.3ml H₂O(普通蒸馏水即可)，充分混匀。

⑥10℃，3600rpm，离心10分钟。

⑦取下层有机相到试管中。(尽量不要吸到上层水相和中间蛋白层)

⑧N₂吹仪干燥。

⑨1ml 9：1甲醇/水溶解，稍振荡混匀。

⑩取200μl到上样瓶，上机检测。(若不立即检测的话，事先不要溶解，将试管装入15ml离心管中-200C保存。)

3.利用液相层析-质谱(LC-MS)技术分析LPC

仪器型号：美国AB公司API3200和3200QTRAP以上级别仪器

色谱条件：

色谱柱：不使用色谱柱

流动相：MeOH/water/NH4OH(90:10:0.1，v/v/v)甲醇/水/氨水

柱温箱：20℃

进样量：10uL

等度洗脱流速：200uL/min

质谱条件：

离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电压：5500V；温度：500℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：30pis；气体2(GS2，N₂)压力：40pis；气帘气体(N₂)压力：15pis；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：常压。3200 QTRAP仪器下各参数设置如表5：

表5

 

名称	母离子(amu)	子离子(amu)	Dwell(msec)	解簇电压DP(V)	碰撞电压CE(eV)
						12:0LPC	440.50	184.10	100	55	33
SPC	465.50	184.10	100	45	32
						14:0LPC	468.50	184.10	100	60	33
L-PAF	482.50	104.10	100	50	38
						16:0LPC	496.50	184.10	100	50	35
18:1LPC	522.50	184.10	100	50	35
						18:0LPC	524.50	184.10	100	60	35
20:0LPC	552.50	184.10	100	70	38
						22:0LPC	580.50	184.10	100	65	35
SM	703.90	184.10	100	52	35
						SM	731.90	184.10	100	58.00	35.00
18:2LPC	520.50	184.10	100	50	35
						20:4LPC	540.50	184.10	100	70	38
22:6LPC	568.50	184.10	100	65	35

4.数据分析

脂类水平分析首先利用非参数检验的方法。种间关联分析利用斯皮尔曼等级相关分析方法。逻辑斯蒂回归方程用于分析通过磷脂分子来区分结直肠癌病人和正常人的特异性和灵敏性。所有的统计学显著性分析都是双向的，不包含多项参数比较的调整。所有数据分析利用SAS(Statistical Analysis Software.Version6.12，SAS Institute，Inc.)以及SPSS11.5。

5.结果

研究工作使用了169个结直肠癌患者样本和172个健康的对照样本。总共221个(64.8％)受试者为男性，120个(35.2％)受试者为女性。对来源于患者血液样本和对照血液样本中溶血磷脂酰胆碱((lysophosphatidylcholine，LPC)的各种亚型(14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC、22:0LPC、18:1LPC、18:2LPC、20:4LPC、22:6LPC)、神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)、血小板活化因子(L-PAF)，鞘磷脂(sphingomyelin，SM，包括SM703和SM731)进行了分析。上述每种脂类分子在正常人与CRC患者体内的平均含量如前表1和表2。

在正常组人群中各种脂类分子在总脂类中的相对含量由大到小依次为：

总LPC>SM703>SM731>L-PAF>SPC，见图1。

选择LPC进行进一步统计分析，得到LPC各亚类(μmol/l)占总LPC(μmol/l)的比例如表6：

表6

 

亚类	14:0LPC比例	16:0LPC比例	18:0LPC比例	20:0LPC比例	22:0LPC比例	18:1LPC比例	18:2LPC比例	20:4LPC比例	22:6LPC比例
										均值	0.3702％	44.29％	19.93％	0.2369％	0.2043％	10.33％	22.94％	0.0735％	1.625％
标准差	0.2158％	3.962％	2.262％	0.1534％	0.1857％	1.186％	4452％	0.0238％	0.4660％

由此可见，在正常组人群中16:0LPC占总LPC比例最高，20:4LPC的含量最低，LPC各亚类在总LPC中的相对含量由大到小依次为：

16:0LPC>18:2LPC>18:0LPC>18:1LPC>22:6LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC>20:4LPC见图2

其中，饱和LPC/不饱和LPC＝1.919±0.422

进一步分析饱和LPC内部的情况，得到饱和LPC各亚类(μmol/l)占总饱和LPC(μmol/l)比例如表7：

表7

 

亚类	14:0LPC比例	16:0LPC比例	18:0LPC比例	20:0LPC比例	22:0LPC比例
						平均值	0.5621％	68.10％	30.66％	0.3622％	0.3114％
标准差	0.3006％	2.827％	2.804％	0.2121％	0.2651％

由此可见正常组人群中饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：

16:0LPC>18:0LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC，见图3。

而进一步分析不饱和LPC内部的情况，得到不饱和LPC各亚类(μmol/l)占总不饱和LPC(μmol/l)比例如表8：

表8

 

亚类	18:ILPC比例	18:2LPC比例	20:4LPC比例	22:6LPC比例
					平均值	29.8935％	65.1689％	0.2168％	4.7209％
标准差	3.8613％	4.4698％	0.0828％	1.4861％

由此可见正常组人群中不饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：

18:2LPC>18:1LPC>22:6LPC>20:4LPC，见图4。

对CRC组也作了相应的分析，通过对各种脂类分子进行提纯和含量测定，得到总LPC，SPC，L-PAF，SM703，SM731的含量(μmol/l)占所有脂类分子总含量(μmol/l)的百分比例如表9：

表9

 

种类	总LPC比例	SPC比例	L-PAF比例	SM703比例	SM731比例
						均值	52.89％	0.00905％	0.1692％	39.25％	7.686％
标准差	10.34％	0.004.2％	0.0344％	8.459％	2.448％

由上可知，在CRC组人群中各种脂类分子在总脂类中的相对含量由大到小依次为：总LPC>SM703>SM731>L-PAF>SPC，见图5。

由上分析可知CRC组人群中总LPC的含量相对于其它脂类分子最高，因此选择LPC进行进一步统计分析，得到LPC各亚类占总LPC的比例如表10：

表10

 

亚类	14:0LPC比例	16:0LPC比例	18:0LPC比例	20:0LPC比例	22:0LPC比例	18:1LPC比例	18:2LPC比例	20:4LPC比例	22:6LPC比例
										均值	0.5161％	46.93％	21.18％	0.2734％	0.2165％	10.52％	18.57％	0.079％	1.715％
标准差	0.3907％	3.719％	2.651％	0.1394％	0.1909％	1.778％	4.180％	0.02235％	0.5035％

由此可见，在CRC组中16:0LPC占总LPC比例最高，20:4LPC的含量最低，LPC各亚类在总LPC中的相对含量由大到小依次为：

16:0LPC>18:0LPC>18:2LPC>18:1LPC>22:6LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC>20:4LPC见图6。

其中，饱和LPC/不饱和LPC＝2.320±0.532。

进一步分析饱和LPC内部的情况，得到饱和LPC各亚类(μmol/l)占总饱和LPC(μmol/l)比例如表11：

表11

 

亚类	14:0LPC比例	16:0LPC比例	18:0LPC比例	20:0LPC比例	22:0LPC比例
						平均值	0.7397％	67.92％	30.63％	0.3951％	0.3113％
标准差	0.5341％	2.999％	2.964％	0.1958％	0.2687％

由此可见CRC组人群中饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：

16:0LPC>18:0LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC，见图7。

进一步分析不饱和LPC内部的情况，得到不饱和LPC各亚类(μmol/l)占总不饱和LPC(μmol/l)比例如表12：

表12

 

亚类	18:1LPC比例	18:2LPC比例	20:4LPC比例	22:6LPC比例
					平均值	34.46％	59.64％	0.2637％	5.635％
标准差	5.387％	6.021％	0.0902％	1.669％

因此CRC组人群中不饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：

18:2LPC>18:1LPC>22:6LPC>20:4LPC，见图8。

因此，在正常组和CRC组人群中，各大类分子的含量顺序均为：

总LPC>SM703>SM731>L-PAF>SPC

LPC各亚类占总LPC的比例比较：

正常组：

16:0LPC>18:2LPC>18:0LPC>18:1LPC>22:6LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC>20:4LPC结直肠癌组：

16:0LPC>18:0LPC>18:2LPC>18:1LPC>22:6LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC>20:4LPC从中可以看出：仅有18:0LPC在两组间的排序略有差异，因此，18:0LPC可能对CRC组人群有特殊意义，有作为标志物进行进一步研究的潜力。而正常组与CRC组饱和LPC各亚类占总饱和LPC的比例以及不饱和LPC各亚类占总不饱和LPC的比例的排序是一致的，分别为：

16:0LPC>18:0LPC>14:0LPC>20:0LPC>22:0LPC

18:2LPC>18:1LPC>22:6LPC>20:4LPC

此外，总饱和LPC含量与总不饱和LPC含量比值比较：

在正常组与CRC组人群中这一比值分别为：1.919±0.422和2.320±0.532，由前面的介绍已知，这一指标在两组人群中具有显著差异。

通过前面的介绍，我们已知总SM含量在正常组与CRC组间并不存在显著差异，SPC含量在两组间存在一定差异，而其他指标(总LPC、总饱和LPC、总不饱和LPC、L-PAF)在两组间均存在极其显著的差异。具体到LPC的每种单一亚型，t检验差异结果如表13：

表13

 

	14:0LPC	16:0LPC	18:0LPC	20:0LPC	22:0LPC	18:1LPC	18:2LPC	20:4LPC	22:6LPC	SM703	SM731
												P值	0.669	<0.001	<0.001	0.014	0.002	<0.001	<0.001	<0.001	<0.001	0.165	0.982
差异	不显著	极其显著	极其显著	显著	很显著	极其显著	极其显著	极其显著	极其显著	不显著	不显著

例2用年龄、SPC、14:0LPC、18:2LPC、SM731作为结直肠癌的标记。

以下是对几种脂类综合应用进行结直肠癌诊断的方法：

我们的模型基于实验数据的85％，即训练集，包括146个正常人，144个CRC患者，而其余15％的数据用于检验模型，包括26个正常人，和25个CRC患者。我们通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据进行变量的选择，对正常和CRC数据利用二分类的logistic模型研究得到以下模型：

$\log \left(\frac{{\mathrm{\&pi;}}_2}{{\mathrm{\&pi;}}_0}\right)=0.1259\&times;x_2-20.0514\&times;x_3-0.6517\&times;x_4-0.0314\&times;x_{12}-0.0632\&times;x_{13}$

公式I

其中记π₀是样本为正常人的概率，π₂是样本患CRC的概率。变量x₂表示年龄、x₃表示血液中的SPC值、x₄表示血液中14:0LPC值、x₁₂表示血液中SM731值、x₁₃表示18:2LPC值。将公式I右侧值大于0判别为CRC，小于0判别为正常。在模型建立的过程中用x₁到x₁₅分别表示检测对象的性别、年龄、血液中的SPC值、14:0LPC值、L-PAF值、16:0LPC值、18:1LPC值、18:0LPC值、20:0LPC值、22:0LPC值、SM703值、SM731值、18:2LPC值、20:4LPC值、22:6LPC值，通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)进行变量的选择，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据得到上述公式。

分别以训练集样本和验证集样本作为例证验证该模型，得到训练集特异度为83.56％，灵敏度为86.80％；验证集特异度为88.46％，灵敏度为88.00％，总的特异度为85.47％，灵敏度为86.98％。

Claims (38)

1.一种通过检测人个体样本中溶血磷脂酰胆碱(LPC)及其它脂类分子的水平辅助诊断结直肠癌的试剂盒。

2.权利要求1中所述的试剂盒，其中包括4种脂分子的组合。

3.权利要求2中所述的脂分子组合，其中包括SPC。

4.权利要求2中所述的脂分子组合，其中包括14：0LPC。

5.权利要求2中所述的脂分子组合，其中包括18：2LPC。

6.权利要求2中所述的脂分子组合，其中包括SM731。

7.权利要求1所述的试剂盒进一步包含一份使用说明书，注明检测样本中脂类分子含量的方法，通过脂类分子含量进行综合分析的方法，根据分析结果可预测个体患结直肠癌的可能性。

8.权利要求7所述的方法，其中包括样本中SPC的提取和检测。

9.权利要求8所述检测的样本来源于个体的血液。

10.权利要求8所述的检测为液相层析-质谱检测法、紫外探测检测法以及上述方法的综合检测方法。

11.权利要求10所述的液相层析-质谱检测方法是一种电子喷雾离子质谱。

12.权利要求8中脂类分子检测方法，包括建立标准曲线所需的脂类分子标准样品与测定所需的内标样品。

13.权利要求12中所述方法，其中建立标准曲线所需的脂类分子标准样品应配制为一个浓度梯度30μM，20μM，10μM，5μM，2μM。

14.权利要求12中所述方法，其中测定所需的内标样品是12：0LPC，其浓度为10μM。

15.权利要求7所述的方法，其中包括样本中14：0LPC的提取和检测。

16.权利要求15所述检测的样本来源于个体的血液。

17.权利要求15所述的检测为液相层析-质谱检测法、紫外探测检测法以及上述方法的综合检测方法。

18.权利要求17所述的液相层析-质谱检测方法是一种电子喷雾离子质谱。

19.权利要求15中脂类分子检测方法，包括建立标准曲线所需的脂类分子标准样品与测定所需的内标样品。

20.权利要求19中所述方法，其中建立标准曲线所需的脂类分子标准样品应配制为一个浓度梯度30μM，20μM，10μM，5μM，2μM。

21.权利要求19中所述方法，其中测定所需的内标样品是12：0LPC，其浓度为10μM。

22.权利要求7所述的方法，其中包括样本中18：2LPC的提取和检测。

23.权利要求22所述检测的样本来源于个体的血液。

24.权利要求22所述的检测为液相层析-质谱检测法、紫外探测检测法以及上述方法的综合检测方法。

25.权利要求24所述的液相层析-质谱检测方法是一种电子喷雾离子质谱。

26.权利要求22中脂类分子检测方法，包括建立标准曲线所需的脂类分子标准样品与测定所需的内标样品。

27.权利要求26中所述方法，其中建立标准曲线所需的脂类分子标准样品应配制为一个浓度梯度30μM，20μM，10μM，5μM，2μM。

28.权利要求26中所述方法，其中测定所需的内标样品是12：0LPC，其浓度为10μM。

29.权利要求7所述的方法，其中包括样本中SM731的提取和检测。

30.权利要求29所述检测的样本来源于个体的血液。

31.权利要求29所述的检测为液相层析-质谱检测法、紫外探测检测法以及上述方法的综合检测方法。

32.权利要求31所述的液相层析-质谱检测方法是一种电子喷雾离子质谱。

33.权利要求29中脂类分子检测方法，包括建立标准曲线所需的脂类分子标准样品与测定所需的内标样品。

34.权利要求33中所述方法，其中建立标准曲线所需的脂类分子标准样品应配制为一个浓度梯度30μM，20μM，10μM，5μM，2μM。

35.权利要求33中所述方法，其中测定所需的内标样品是12：???0LPC，其浓度为10μM。

36.权利要求7所述的方法，根据脂类分子含量进行综合分析时，需结合年龄因素。

37.权利要求7中所述综合分析的方法，根据4种脂分子含量及年龄进行诊断时依据以下公式：

$\log \left(\frac{{\mathrm{\&pi;}}_2}{{\mathrm{\&pi;}}_0}\right)=0.1259\&times;x_2-20.0514\&times;x_3-0.6517\&times;x_4-0.0314\&times;x_{12}-0.0632\&times;x_{13}$

公式I

其中π₀是样本为正常人的概率，π₂是样本患CRC的概率，变量x2表示年龄，x3表示血液中的SPC值，x4表示血液中14：0LPC值，x12表示血液中SM731值，x13表示血液中18：2LPC值。

38.权利要求37中所列公式，将样本中的SPC、14：0LPC、18：2LPC、SM731值和年龄代入，公式计算出的值大于0判断为结直肠癌(CRC)，小于0判断为正常。

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