CN102147396B

CN102147396B - 人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠腺瘤诊断试剂盒制备与应用

Info

Publication number: CN102147396B
Application number: CN201010107951.0A
Authority: CN
Inventors: 桑建利; 张俊杰; 徐燕; 赵克
Original assignee: 桑建利
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CN102147396A

Abstract

人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠腺瘤诊断试剂盒制备与应用本发明提供了一种作为生物标记物的脂类分子组合，将其制备成试剂盒，以人体血液为样本，对试剂盒中选定的脂类标记分子的含量进行测定和综合分析，根据分析结果确定所测个体患有结直肠腺瘤的可能性，以此进行结直肠腺瘤的早期检测，使患者及时得到诊治。

Description

人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠腺瘤诊断试剂盒制备与应用

技术领域

本发明提供了一种脂类分子的生物标记组合，将其制备成试剂盒，以人体血液为样本，根据脂类标记分子的含量测定和综合分析，确定个体患有结直肠腺瘤的可能性，以此进行结直肠腺瘤的早期检测。这些脂类分子包括：溶血磷脂酰胆碱(LPC)的几种亚型(20∶0LPC、22∶0LPC、20∶4LPC，采用不饱和有机化合物的阿拉伯数字编号定位，冒号后数字表示双键位置)、神经鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)、鞘磷脂(SM703，其中703是指这种SM亚型的分子量)。

背景技术

1.定义和概念：

结直肠腺瘤(CRA)是一种具有癌变潜能的良性病变，是结直肠息肉的一种。结直肠息肉为一临床诊断名词，是指高出于黏膜、突向肠腔的赘生物，可以有蒂，也可以为广基无蒂。临床诊断的结直肠息肉在病理学上包括肿瘤性息肉和非肿瘤性息肉，而结直肠腺瘤则属于肿瘤性息肉。

根据WHO关于结直肠癌定义的新阐述，结直肠腺瘤也可称为结直肠上皮内瘤变，指结直肠黏膜上皮具有组织结构和细胞学上的异型性，但这种改变未突破黏膜肌层，一旦突破黏膜肌进入黏膜下层，则为结直肠癌(CRC)。临床上大多数结直肠癌(＞80％)来自结直肠腺瘤性息肉恶变。结直肠腺瘤作为大肠癌(CRC)的癌前病变已被认可，腺瘤-癌序贯学说已被广泛接受。文献报道(周中银，脂类代谢与结直肠腺瘤[J].国外医学消化系疾病分册.2002.22(1)：34.3)在一些腺瘤发病率较高的国家结直肠癌发病率也较高，及时发现腺瘤并加以摘除可使结直肠癌的发生率降低85％。另一些文献报道，全面筛查并切除5mm以上腺瘤的人群，其结直肠癌(CRC)发病率降低76％-90％，正确认识并处理结直肠腺瘤具有重要的临床意义。

2.结直肠腺瘤的种类

根据腺瘤的形状、种类可以分为：①管状腺瘤(管状结构大于80％)。此型最多，约占80％；②绒毛状腺瘤(绒毛状结构大于80％)；③管状绒毛状腺瘤(或称混合性腺瘤，管状和绒毛状结构均小于80％；④锯齿状腺瘤。根据所构成腺窝数量的多少分为单腺窝腺瘤(unicryptal adenoma)和寡腺窝腺瘤(oligocryptal adenoma)。

异。

上述各大类脂分子在两组间的变化幅度(μmol/l)如表3：

表3

总LPC

总饱和LPC

总不饱和LPC

SPC

SM

L-PAF

总饱和LPC/总不饱和LPC

正常组

326.4822±103.0654

210.4004±3.8429

116.0818±44.3936

0.05098±0.07321

205.7505±51.57

0.9471±0.3361

1.9188±0.4224

CRA组

307.7707±101.0249

205.4017±72.4767

102.3690±35.6036

0.07862±0.05871

147.6057±56.2504

1.0785±0.4927

2.0606±0.4955

得到这些结果后，我们通过建立数学模型发明了一种通过检测血液中脂类分子水平判断被检测个体是否可能患有结直肠腺瘤的方法，如果脂类分子结合年龄的计算水平符合一定条件，则表明个体可能患有结直肠腺瘤。

在一个具体的例证下，此发明是综合利用SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703和20∶4LPC。将5种脂类分子的含量及年龄代入公式I，通过计算可确定其患结直肠腺瘤可能性：

\log (\frac{π_{1}}{π_{0}}) = 0.0989 \times x_{2} + 5.3819 \times x_{3} - 2.5322 \times x_{9} + 2.0733 \times x_{10} - 0.0673 \times x_{11} + 14.0863 \times x_{14}

公式I

其中记π₀是样本为正常人的概率，π₁是样本患CRA的概率。变量x2表示年龄、x3表示血液中的SPC值、x9表示血液中20∶0LPC值、x10表示血液中22∶0LPC值、x11表示血液中SM703值、x14表示20∶4LPC值。将公式I右侧值大于0判别为CRA，小于0判别为正常。

在模型建立的过程中用x₁到x₁₅分别表示检测对象的性别、年龄、血液中的SPC值、14∶0LPC值、L-PAF值、16∶0LPC值、18∶1LPC值、18∶0LPC值、20∶0LPC值、22∶0LPC值、SM703值、SM731值、18∶2LPC值、20∶4LPC值、22∶6LPC值，通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)进行变量的选择，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据。随机选85％的数据用于建立模型(即训练集中有146个正常人和41个CRA患者)，15％的数据用于检验模型(即验证集中有26个正常人和7个CRA患者)。对正常和CRA数据利用二分类的logistic模型研究筛选出上述6个变量(5种脂类分子，1个年龄因素)得到上述模型，该过程训练集有6个正常人被误判为腺瘤，6个腺瘤患者被误判为正常，特异度为95.89％，灵敏度为85.37％。验证集全部判断正确。总的特异度为96.51％，灵敏度为8.50％。

3.结直肠腺瘤的癌变

腺瘤具有恶变潜能。1981年全国大肠癌病理研究规范的标准进行诊断和分型。诊断腺瘤癌变的标准为：癌组织内或表面找到残留的腺瘤结构称为腺瘤癌变，癌变的主要特征是腺管排列不规则，细胞增生异型性明显，极向消失并向间质浸润性生长。诊断腺瘤非典型增生的标准为：①轻度非典型增生：细胞高柱状，核位于基底膜上1/2以内，极向存在。②中度非典型增生：管状结构，背靠背，核椭圆形，极向紊乱。③重度非典型增生：腺管不规则，大小不等，筛状结构，核极向紊乱。小于1cm的单纯管状腺瘤很常见，一般不恶变；但其中少数将获得额外的基因突变，使之生长发展为进展性腺瘤(advanced adenomas)。进展性腺瘤指：≥1cm，或含有适量绒毛成分，或高级别的上皮内瘤变。有研究对在436例大肠息肉患者进行检验后统计发现：单发腺瘤占81.1％，多发腺瘤占19.3％；腺瘤癌变率为10.8％，腺瘤合并癌占5.2％；绒毛状腺瘤癌变率27.5％，混合型腺瘤癌变率16.2％，管状腺瘤癌变率7.1％。腺瘤发生部位以直肠居多，其次为乙状结肠。目前对结直肠癌的主要控制措施就是在进展性腺瘤癌变前发现并将其切除。

另外，以下被认为是结直肠息肉与癌变有关的因素：①息肉大小。癌变机会随体积增大而增加，瘤径小于10mm、10～20ram、大于20mm的癌变率分别为0％-3％、2％-11％和10％-50％；②息肉数目。数目越多，越密布，癌变率越高。有统计表明，息肉数目少于3枚，癌变率为12.5％-29.7％，等于或超过3枚，癌变率增至66.7％；③病理类型。资料表明，腺瘤的绒毛成分越多，越易恶变，管状腺瘤是大肠中最常发现的肿瘤性息肉，随着腺瘤体积增大，管状结构减少，绒毛状结构增加；④息肉外形。带蒂腺瘤的癌变率较低，为4.5％，而广基腺瘤为10-2％。⑤此外，患者的年龄(特别是50岁以上)及体重也是大肠腺瘤恶变的主要危险因裹。日本东京大学的Yutaka Yamaji及其同事在Am J Gastroenrol上报道，肥胖或腹型肥胖与大肠腺瘤的发生存在显著相关性，但体重减轻能使风险降低。肥胖男性的患病风险明显大于女性；患大肠腺瘤肥胖人群的腺瘤组织中存在一些异常表达的因子，研究者的资料及以前的报告显示，癌前病变也与肥胖相关。

研究已经发现很多基因可能参与结直肠腺瘤的发生与癌变过程：APC异常表达、Cox-2和c-myc的过表达以及Wntl、β-catenin、PTEN异常表达很可能参与结直肠腺瘤的发生；ras、p21、p16、p21、p27、p53、p73、bcl-2、Cyclin D1、PCNA、VEGF、WISP、锌指转录因子Snail等可能与早期癌变与转移有关。

4.结直肠腺瘤的治疗

腺瘤性息肉是癌前病变，不论大小、组织学类型，一经发现皆应予切除。除腺瘤超过2cm、数量过多或因合并症和已癌变等需要手术治疗外。所有有蒂类腺瘤和＜2cm无蒂腺瘤都可经结肠镜行高频电灼摘除术。多发腺瘤也可分期分批摘除。是否补充外科手术治疗可根据连续切片病理诊断结果决定：①病理诊断为高级别上皮内瘤变，不需要再补充手术切除；②病理诊断为浸润性早期癌者癌细胞已浸润至黏膜下层，应做手术切除，按以下原则处理：管状腺瘤癌变限于粘膜下层者，淋巴结转移率4％，如切缘干净，无血管淋巴管侵犯，可做局部(肠段)切除的小手术；绒毛状腺瘤癌变局限于粘膜下层。淋巴结转移率29％～44％，需根治性手术；混合型腺瘤有蒂者同管状腺瘤。广基的同绒毛状腺瘤。增生性息肉如前述，癌变率较高，应切除。对于一些较大的、无蒂的息肉经内镜切除困难者，距肛缘8cm以内的，可经肛门手术切除；其它部位的息肉可开腹手术切除。开腹手术的指征是：①较大息肉充满大半肠腔，蒂部显示不清；②广基，基底＞2cm；③多发集中于一处肠段；④癌变，经腹切除息肉寻找确定息肉部位有困难时，开腹后可经肛门插入结肠镜，标记出息肉位置。对于家族性腺瘤性息肉病，如不经治疗几乎100％恶变，可采用全结肠切除、回肠贮袋肛管吻合术，效果较好。

另外，大量证据表明非甾体类抗炎药对结直肠肿瘤具有化学预防甚至治疗作用，有报道称口服非甾体类抗炎药能导致家族性腺瘤性息肉病的腺瘤消退。一些学者的研究结果显示，结肠多发腺瘤患者在息肉切除术后服用肠溶阿司匹林和塞来昔布均可显著减低息肉的再发生率。

最近，大量临床和动物实验均已证实COX-2与结直肠腺瘤和结直肠癌的关系十分密切，但因为其潜在的心血管疾病等风险，尚不可作为常规用药。新的环氧化酶-2(COX-2)抑制剂已经被美国FDA批准用于家族性腺瘤性息肉病患者的辅助治疗。

5.结直肠腺瘤的筛查诊断

结直肠腺瘤与结直肠癌在临床上的常用筛查方法：

①粪便潜血检查

常用方法，诊断CRC和息肉的敏感性为37.1％~79.4％，特异性为87.5％。进食维生素C 250mg或酸性水果可致假阴性。隐血试验阳性者应接受肠镜检查，阴性者仍须每年复查1次。肛门指检标本不适用于潜血检查。

②粪便免疫化学检查

特异性更好，不受摄入维生素C干扰。3次测定诊断粪便中血红蛋白的阈值是75ng/ml，诊断CRA的敏感性是94.1％，特异性是87.5％。阳性者应接受肠镜检查。

③粪便DNA测定

该技术是检查粪便中腺瘤和CRC脱落细胞的DNA。现有测定试剂盒包括20多种变异的DNA，如K-ras等。但没有一种单独的基因变异可见于所有的腺瘤和CRC，所以商品化的试剂盒并不能诊断全部腺瘤和CRC。

④乙状结肠镜检查

最简便，但检查不全面，较少应用。

⑤大肠镜检查

目前应用最多，且会持续增加。肠镜可看到全部结直肠黏膜并可摘除息肉。但肠镜并非完美无缺的，＞10mm腺瘤漏诊率可达6％~12％，癌漏诊率约5％。一般人群中应每10年查1次。

⑥双重气钡造影

可检查全部结直肠，诊断CRA敏感性为85％~97％。

现主要用于无肠镜的地区及有肠镜检查禁忌证者，如既往肠镜检查不成功或有盆腔手术史者。每5年应查1次。

⑦CT结肠断层造影(CTC)

检出＞6mm腺瘤的敏感性是89％。整个检查只需10分钟，创伤极小。每5年应查1次。但该法有放射性暴露，对于50岁受检者，结肠放射性剂量约7~13mSv，可使终身结肠癌危险增加0.044％。而70岁老人因年龄增大对放射性敏感性降低，同样检查的暴露剂量则减半。

目前的共识是，对所有检出≥10mm、或3个以上≥6mm息肉者，均应建议进行肠镜检查和治疗。

6.结直肠腺瘤与脂分子代谢

血脂代谢异常与很多疾病有关，近来研究发现高脂饮食和血脂异常与腺瘤的发生、发展和恶变有一定关系。有研究显示，饮食中高胆碱可能增加女性患远端结直肠腺瘤的风险。一项研究采用氧化酶法测定血中胆固醇(TC)，GPO-PAP法测定甘油三酯(TG)，化学修饰酶法测定高密度脂蛋白(HDL-C)，免疫比浊法测定载脂蛋白B(ApoB)，低密度脂蛋白(LDL-C)值按Friedwala公式LDL-C＝总胆固醇-(TG/5+HDL-C)计算，得到结果如下：

LDL-C、ApoB、HDL-C与腺瘤的发生有关，而TC、TG不仅与腺瘤发生有关，还与腺瘤向恶性化发展密切相关，是腺瘤发生、发展的重要因素。

由此可知，血脂分子的代谢在结直肠腺瘤的发生发展中具有重要的作用。

发明内容

1.发明概述

采用简便准确的方法对来自临床的人血液样本中多种脂类分子进行了抽提检测，在获得样本中脂类分子的含量数据后，通过逐步回归方法进行了变量筛选，最后确定SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC值可以作为结直肠腺瘤的生物标记应用于试剂盒组成，同时加入年龄因素与试剂盒中几种脂类分子含量共同确定样本提供者患结直肠腺瘤的可能性。从而确定了SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC，在制备通过检测人个体样本中脂分子的水平来预测患有结直肠腺瘤的试剂盒中的应用。

在对全部样本的172个正常人，48个结直肠腺瘤(CRA)患者的鉴定过程中有着87.50％的灵敏度和96.51％的特异度。这种发明可应用于利用血液样本来检测个体中多种标记物，通过检测出的个体中脂类分子水平来直接预测患有结直肠腺瘤的可能性。

当个体血液中所选定的脂类分子水平偏离对照组过多时，即表明该个体患有结直肠腺瘤的可能性很大。而所谓对照组的脂类分子水平，即已知未患有结直肠腺瘤的健康个体群体中检测到的SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC含量水平。对受试样品检测到的脂类分子(SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC)的含量水平进行计算，其结果与正常水平相比偏离较大，就可预测该接受检测者可能患有结直肠腺瘤。该方法可以检测无临床症状的结直肠腺瘤个体。其具体的判断方法依据公式：

\log (\frac{π_{1}}{π_{0}}) = 0.0989 \times x_{2} + 5.3819 \times x_{3} - 2.5322 \times x_{9} + 2.0733 \times x_{10} - 0.0673 \times x_{11} + 14.0863 \times x_{14}

公式I

这个发明包含有检测个体中血液样本脂类分子种类和水平的试剂盒，包括可以检测某一样本中SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC以及综合检测它们的化合物。其中还进一步包括一种检测样本中脂类分子水平的方法；和/或一种比较样本脂类分子水平和对照脂类水平的方法。

另外，本发明还可应用于预测结直肠腺瘤的化合物的筛选，该方法包括：当受试化合物应用于临床阶段时，可将脂类分子的含量水平变化作为一种检测效果的参考指标。

采用所发明的试剂盒中的脂类分子(SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC)对血液进行检测，筛查结直肠腺瘤患者比起结肠镜更为简便快速，成本较低，痛苦很小，且灵敏度、准确度较高，并可进行大规模的筛查。

2.发明详述

近年来，有研究表明脂类分子中的溶血磷脂是重要的细胞信号转导分子。溶血磷脂分子，如LPA(Lysophosphatidic Acid)、S1P(Sphingosine-1-phosphate)、LPC(Lysophosphatidylcholine)和SPC(Sphingosylphosphorylcholine)等可以由细胞产生并分泌到胞外，作为胞外信号分子广泛地参与各类生物活动，因此被称为生物活性脂类分子。这些生物活性脂类分子的代谢又与一些生物活性因子如血小板活化因子紧密相关。LPA是人们近些年来研究得最多的生物活性脂类分子。LPA参与多种生理活动，如脑的发育、血压的调节、伤口的愈合和嗅觉，以及免疫和生殖系统的功能等，同时LPA又与一些疾病密切相关，特别是它在肿瘤发生和发展中的作用备受关注。1994年XuY.等从卵巢癌病人的腹水中纯化鉴定出卵巢癌细胞激活因子(OCAF)，并进一步发现OCAF由生物活性脂类分子LPA组成，从而首先揭示了LPA对卵巢癌的发生和发展有直接的作用。LPA作为一个自分泌生长因子，能刺激卵巢癌细胞的增殖、黏附以及迁移(Xu Y.et al，Characterization of an Ovarian CancerActivating Factor(OCAF)in Ascites from Ovarian Cancer Patients，Clinical CancerRes.1995.1：1223-1232.；Xu Y.et al.Lysophospholipids Activate Ovarian and Breast Cancer Cells.Biochem.J.1995.309：933-940.；Baudhuin L.M.，et al，Activation induced by LPA andS1P requires both MEK and p38 MAP kinase and is cell-line specific，Mol PharmacoL2002.62：660-671.；Sengupta S.，et al.，A novel laminin-induced LPA autocrine loopin the migration of ovarian cancer cell，FASEB J.2003.17：1570-1572.)。在卵巢癌发生的早期，从卵巢癌患者的腹水和血液中就可以检测到LPA水平的升高。LPA不仅是卵巢癌患者腹水中促进癌细胞生长的因子，还具有抗凋亡和诱导癌细胞迁移的作用。随后的研究初步显示，LPA也在肝癌、前列腺癌、肺癌和直肠癌的发生和发展中发挥作用，可以诱导上述多种癌细胞的增殖和迁移。在卵巢癌和其它一些妇科癌症中，LPA水平在病人的血浆样本中明显升高，但是在乳腺癌和白血病中LPA的水平并没有提高(XuY et al，Lysophosphatidic acid asa potential biomarker for ovarian and other gynecologic cancers.JAMA1998.280：719-723.；Sutphen R et al.Lysophospholipids are potemial biomarkers forovarian cancer.Cancer Epidemiol Biomarkers Prey.，2004.13：1185-1191.)。

除LPA以外，S1P(Sphingosine-1-phosphate)和SPC也与肿瘤的发生、肿瘤发展过程中血管的生成等有关。生物活性脂类分子之间是可以相互转化的，新近发现一个被称为Autotaxin(ATX)的蛋白是生物活性脂类代谢中关键的酶。ATX(也被称为NPP2)具有lysoPLD的作用，可以催化LPC和SPC分别生成LPA和S1P(Umezu-Goto，M.，et al.，Autotaxin haslysophospholipase D activity leading to tumor cell growth and motility bylysophosphatidic acid production.J Cell Biol，2002.158(2)：p.227-33.；Tokumura，A.，et al.，Identification of human plasma lysophospholipase D，a lysophosphatidicacid-producing enzyme，as autotaxin，a multifunctional phosphodiesterase.J BiolChem，2002.277(42)：p.39436-42.；Clair，T.，et al.，Autotaxin hydrolyzessphingosylphosphorylcholine to produce the regulator of migration.sphingosine-1-phosphate.Cancer Res，2003.63(17)：p.5446-53.)，而LPA和S1P是与癌症发生和发展相关的脂类分子(Xu，Y.，et al.，Unfolding the pathophysiological role ofbioactive lysophospholipids.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2003.3(1)：p.23-32.；Xu，Y.，et al.，Lysophospholipids activate ovarian and breast cancercells.Biochem J，1995.309(Pt 3)：p.933-40.；Sengupta，S.，Y.J.Xiao，and Y.Xu，A novel laminin-induced LPA autocrine loop in the migration of ovarian cancer cells.Faseb J，2003.17(11)：p.1570-2.；Jemal，A.，et al.，Cancer statistics，2004.CACancer J Clin，2004.54(1)：p.8-29.；CHI Zhao-chun Update on management of patientswith colon-rectal cancer Current status and new strategy of screen test for patientswith colon-rectal cancer，2006.Chinese Journal of postgraduates of medicine，2006Vol.29No.13P.1-2.；Smart，C.R.，The impact of the U.S.Preventive Services TaskForce guidelines on cancer screening：perspective from the National Cancer Institute.J Gen Intern Med，1990.5(5 Suppl)：p.S28-33.)。更为重要的是，ATX在许多肿瘤细胞和肿瘤组织中，甚至肿瘤发生的早期出现高表达。这些研究结果进一步揭示了生物活性脂类分子代谢与肿瘤发生之间的关系。

肿瘤发生早期生物活性脂类分子代谢的异常可以从人的体液(血清/血浆)中直接检测到。与之相比，传统的组织样本检测不仅创伤大，而且对肿瘤难以做到早期诊断。与基因和蛋白标记物相比，作为代谢标记物生物活性脂类分子的检测更方便、快捷，适于临床推广。因此，建立灵敏、准确和高效的生物活性脂类分子方法，筛选针对不同肿瘤特异的生物活性脂类分子标记物，对肿瘤早期诊断具有重要的意义。

典型来说，脂类分子的水平可以在从个体获得的样本(比如整个血液、血浆、血清、淋巴和组织)中进行测定，检测可使用液相层析-质谱(LC.MS)的方法、紫外(UV)法、免疫分析方法(免疫共沉淀、免疫荧光)、酶学分析(比色法)和/或综合的方法。

液相层析-质谱(LC-MS)的方法被应用，例如探测血液中LPC等脂分子水平。这种方法具有如下优点：

①高精确性和可重复性。

②不需要薄层层析。

③检测仅需要20μL血浆样本。

④血浆和血清样本都可以被应用。

这里介绍的方法在多种形式的溶血磷脂的定量分析上具有高度精确性、可重复性和敏感性。这种方法在具体样本中可以被具体化为测定脂类分子的水平。因此这项发明可以直接应用于诊断结直肠腺瘤。

该法可以定性和/或定量分析一个或多个个体中某一样本的脂类分子水平。在一个具体的实例中，被测试个体的脂类分子水平可以与一个对照中的脂类分子水平相比较。例如，当某一个体样本的脂类分子组合水平符合一定条件时，则该个体有患结直肠腺瘤的可能性。可以使用任何合适的对照样本，用作检测脂类分子水平的对照样本的个体(一个或多个)没有结直肠腺瘤(例如，来自于一个或多个健康个体的脂类分子水平用于对照)。比如说，一个合适的对照值可以利用大量没有结直肠腺瘤的个体样本，利用数据模型从而获得一个对照值(标准值)来确定。

为了鉴别结肠腺瘤病人血浆中可能的生物标记，利用基于电子喷雾离子质谱(ESI-MS)的方法(Xiao，Y，et al.，Evaluation of plasma lysophosph01ipids for diagnostic usingelectrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS)analyses.Ann.NYAcad.Sci.2000.905：242-259.XiaoY.J.，et al.，Electrospray ionization massspectrometry analysis of lysophpospholipids in human ascetic fluids：comparison ofthe lysophospholipid contents in malignant VS nonmalignant ascetic fluids.AnalBiochem.2001.290，302-13.)分析了48个结直肠腺瘤患者以及172个健康对照体内的脂类分子。来源于健康对照组和结直肠腺瘤患者的血浆样本在双盲的情况下获得，以作为分析之用，用基于电子喷雾离子质谱(ESI-MS)的方法分析了13个种不同的脂分子。其中8种脂类分子在健康对照组与结直肠腺瘤患者组血浆中的含量存在显著差异，而经过数学模型分析，我们发现利用年龄、SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC)为标记，在结直肠腺瘤的鉴定中灵敏度达到了大约87.50％，特异度达到大约96.51％。

目前的发明部分基于五种脂类分子(SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC)作为结直肠腺瘤的标记，此外，除了试剂盒中五种分子的检测分析，年龄因素的影响也作为一个变量影响诊断结果。

在一个具体的例证中，来自于个体或样本中的脂类分子含量水平可以用作检测被试个体或样本是否患有结直肠腺瘤。例如，在某些具体情况下，如果某一个体中SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC结合年龄的计算水平符合一定条件，则表明该个体有患结直肠腺瘤的可能性。

正常组内各种脂类分子含量的平均水平(μmol/l)如表1：

表1

种类	SPC	14∶0LPC	LPAF	16∶0LPC	18∶1LPC	18∶0LPC	20∶0LPC	22∶0LPC	SM703	SM731	18∶2LPC	20∶4LPC	22∶6LPC
														均值	0.051	1.134	0.947	142.7	33.93	65.18	0.772	0.647	173.3	32.49	76.71	0.236	5.203
标准差	0.073	0.521	0.336	41.79	11.92	22.29	0.779	0.799	44.24	9.962	32.08	0.099	2.131

结直肠腺瘤(CRA)组内各种脂类分子含量的平均水平(μmol/l)如表2：

表2

种类	SPC	14∶0LPC	LPAF	16∶0LPC	18∶1LPC	18∶0LPC	20∶0LPC	22∶0LPC	SM703	SM731	18∶2LPC	20∶4LPC	22∶6LPC
														均值	0.079	1.338	1.078	139.1	30.72	62.31	1.175	1.509	124.6	22.95	65.79	0.3265	5.526
标准差	0.059	0.558	0.493	48.52	10.60	22.54	0.982	2.246	47.86	9.117	24.94	0.123	2.427

通过对所有样本的总LPC含量、饱和LPC、不饱和LPC、SPC、SM、L-PAF含量进行T-test分析，得到下列结论：

总LPC含量比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.226，即正常组与CRA组之间在总LPC含量上不存在显著差异；

总饱和LPC含量比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.617，即正常组与CRA组之间在总饱和LPC含量上不存在显著差异；

总不饱和LPC含量比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.082，即正常组与CRA组之间在总不饱和LPC含量上不存在显著差异；

SPC含量比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.023，即正常组与CRA组之间在SPC含量上存在显著差异；

总SM含量比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＜0.001，即正常组与CRA组之间在总SM含量上存在极其显著的差异；

L-PAF含量比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.239，即正常组与CRA组之间在L-PAF含量上不存在显著差异。

据此，我们得知来自于个体或样本中的总LPC水平、总饱和LPC水平、总不饱和LPC水平、L-PAF水平在健康人与结直肠腺瘤患者之间不存在显著差异。而SM和SPC的水平则在两组间具有显著差异。

除此之外，通过总饱和LPC/总不饱和LPC的比较：正常组与CRA组相互作用P(Sig.2-tailed)＝0.072，即正常组与CRA组之间在总饱和LPC/总不饱和LPC比值上不存在显著差异。

上述各大类脂分子在两组间的变化幅度(μmol/l)如表3：

表3

总LPC

总饱和LPC

总不饱和LPC

SPC

SM

L-PAF

总饱和LPC/总不饱和LPC

正常组

326.4822±103.0654

210.4004±3.8429

116.0818±44.3936

0.05098±0.07321

205.7505±51.57

0.9471±0.3361

1.9188±0.4224

CRA组

307.7707±101.0249

205.4017±72.4767

102.3690±35.6036

0.07862±0.05871

147.6057±56.2504

1.0785±0.4927

2.0606±0.4955

\log (\frac{π_{1}}{π_{0}}) = 0.0989 \times x_{2} + 5.3819 \times x_{3} - 2.5322 \times x_{9} + 2.0733 \times x_{10} - 0.0673 \times x_{11} + 14.0863 \times x_{14}

公式I

在模型建立的过程中用x₁到x₁₅分别表示检测对象的性别、年龄、血液中的SPC值、14∶0LPC值、L-PAF值、16∶0LPC值、18∶1LPC值、18∶0LPC值、20∶0LPC值、22∶0LPC值、SM703值、SM731值、18∶2LPC值、20∶4LPC值、22∶6LPC值，通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)进行变量的选择，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据。随机选85％的数据用于建立模型(即训练集中有146个正常人和41个CRA患者)，15％的数据用于检验模型(即验证集中有26个正常人和7个CRA患者)。对正常和CRA数据利用二分类的logistic模型研究筛选出上述6个变量(5种脂类分子，1个年龄因素)得到上述模型，该过程训练集有6个正常人被误判为腺瘤，6个腺瘤患者被误判为正常，特异度为95.89％，灵敏度为85.37％。验证集全部判断正确。总的特异度为96.51％，灵敏度为87.50％。

本模型除了包括LPC分子，还包括SPC和SM分子，从一个崭新的角度找到与结直肠腺瘤密切相关的脂类分子。除此以外，本模型还充分考虑了年龄因素对受试者体内脂类分子含量的影响，排除了年龄增长变化过程中血浆脂类分子含量自然变化的影响。而性别作为另一个可能影响血浆脂类分子变化的因素在模型中被排除，这是因为在数据的分析过程中发现性别因素对脂类分子含量和结直肠腺瘤的诊断微乎其微，因此没有将其放入模型。而其他单种不同的脂类分子尽管含量在正常组与CRA组之间存在显著差异，在综合分析中也未被逐步回归筛选纳入模型，而使本模型的灵敏度与准确度达到最佳效果。

目前的发明提供了利用SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、20∶4LPC和SM703分子的水平作为结直肠腺瘤预先检测的标记。具体来说，这种方法提供了检测个体成为结直肠腺瘤患者的风险。一个个体可以进行定期(例如每半年一次，一年一次，两年一次)检查LPC等脂类分子的水平，观测是否随时间发生变动(降低或者升高)。由于结直肠腺瘤往往是结直肠癌前的早期病变，因此，结直肠腺瘤的早期检测对于结直肠癌的预防更具有前瞻性、预防的重大意义。

目前的发明可以用作检测个体患有结直肠腺瘤风险的工具。例如，这一工具试剂盒可以包含一种标记复合物，它具有检测SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、20∶4LPC和SM703或者这几种物质的能力；检测样本中含量的方法；对比样本中的含量与标准对照的含量的方法；一个合理的对照。

附图说明

图1.健康正常组中几种脂类分子所占的比例

图2.健康正常组中几种LPC占总LPC的比例

图3.健康正常组中几种饱和LPC占总饱和LPC的比例

图4.健康正常组中几种不饱和LPC占总不饱和LPC的比例

图5.CRA组中几种脂类分子所占的比例

图6.CRA组中几种LPC占总LPC的比例

图7.CRA组中几种饱和LPC占总饱和LPC的比例

图8.CRA组中几种不饱和LPC占总不饱和LPC的比例

具体实施方式

例1 LPC等脂类分子在样本血浆中的含量测定。

1.材料和方法

血样来源于48个结直肠腺瘤患者和172个健康的对照。所有的病人都经过了结直肠腺瘤的病理检测。没有其它特殊的条件限制，除非病人拒绝参与。所有病人血样的采集都是在手术之前。

所有血样按照如下程序收集：所有血液样本(4ml)收集在符合国家GB15980-1995标准的含有EDTA的试管中，1750g在室温下离心15分钟。血浆样本分装(100μl/管)在硅化处理的离心管中并冻存在-80℃待用。

2.脂类提取及分析

2.1标准曲线建立

血浆中脂类(LPC、LPA等)的浓度与经过质谱(MS)所得到的离子强度成正比例关系，即：I＝KC。

因此，I_S/I_IS＝K_S/K_IS×C_S/C_IS，也就是C_S＝(K_IS/K_S×I_S/I_IS)CIS(其中下标S表示sample，IS表示内标inter standard)。从上式可以看出，只要求出K_IS/K_S，再加上已知的C_IS，以及经质谱给出的I_S/I_IS，即可得到待测物质的C值。

欲求K_IS/K_S，必须通过建立标准曲线。已知I_S/I_IS＝K_S/K_IS×C_S/C_IS成立，通过配制一系列浓度的标准样品溶液和固定浓度的内标溶液，然后经MS检测得到I_S和I_IS，即可得I_S/I_IS-C_S/C_IS的一元关系曲线，通过曲线即可得到K值。

测定流程如下：

标准样品溶液配制→质谱分析方法建立(DP，CE，EP，CXP，CEP条件摸索，获得最佳灵敏度)→标准曲线建立→脂类抽提→质谱检测→结果定量分析

2.1.1标样配制

LPC：12∶0，14∶0，16∶0，18∶0，20∶0，22∶0，18∶1，18∶2，20∶4，22∶6

SPC

L-PAF

SM(731.09)SM(703.03)

标样浓度：

液体10mg/ml，固体2.5mg，用2∶1的氯仿/甲醇溶解，加1.8ml氯仿，0.9ml甲醇得到10mg/ml样品溶液。(溶解过程中，难溶的样品可补加氯仿，并以45℃水浴助溶，由于刚溶解后可能又会变混浊，因此要迅速取样稀释。)

标样稀释：

10mg/ml→10mM→1mM→0.1mM均用9∶1的甲醇/水稀释

标样配制：

9种LPC+SPC+2种SM+L-PAF

从0.1mM稀释至100fmol/μl，即由0.1M稀释到10^-7M。各取10μl 0.1mM的对应9种标样，再补充9∶1的甲醇/水至终体积为10ml。(之所以上述方式组合，是因为酸碱性不同的样品通常在MS检测过程中采用不同的离子模式，如LPC采用正离子模式，LPA采用负离子模式。实际上，SM和L-PAF等可与LPC系列混在一起。)

建立标准曲线所需的一系列浓度标样：

LPC系列

A.9种LPC(无12∶0)+SPC+L-PAF+2种SM，分别配制30μM，20μM，10μM，5μM，2μM浓度的标准液各1m1l。

B.12∶0LPC内标：10μM 1ml。

2.1.2通过测定上述标样和内标，得到1/K值如下表4：

表4

脂类	IS	SPC	14∶0LPC	L-PAF	16∶0LPC	18∶1LPC	18∶0LPC
								1/K	0	0.6284	1.357	1.068	1.2987	1.2525	1.4522
脂类	20∶0LPC	22∶0LPC	SM 703	SM 731	18∶2LPC	20∶4LPC	22∶6LPC
								1/K	1.6543	1.8822	1	1	1.2525	1.6543	1.8822

2.2 LPC的提取

①内标溶液的配制5ml PBS+100μl 12∶0-LPC(0.1mM)，充分混匀。(现配现用)

②在离心管中加0.5ml上述内标溶液。

③加3ml 2∶1甲醇/氯仿

④加10μl血浆样品，立即混匀，冰上放置10min。

⑤加1ml氯仿，再加1.3mlH₂O(普通蒸馏水即可)，充分混匀。

⑥10℃，3600rpm，离心10分钟。

⑦取下层有机相到试管中。(尽量不要吸到上层水相和中间蛋白层)

⑧N₂吹仪干燥。

⑨1ml 9∶1甲醇/水溶解，稍振荡混匀。

⑩取200μl到上样瓶，上机检测。(若不立即检测的话，事先不要溶解，将试管装入15ml离心管中-20℃保存。)

3.利用液相层析-质谱(LC-MS)技术分析LPC

仪器型号：美国AB公司API3200和3200QTRAP以上级别仪器

色谱条件：

色谱柱：不使用色谱柱

流动相：MeOH/water/NH4OH(90∶10∶0.1，v/v/v)甲醇/水/氨水

柱温箱：20℃

进样量：10μl

等度洗脱流速：200μl/min

质谱条件：

离子源：电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测；离子喷射电压：5500V；温度：500℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：30pis；气体2(GS2，N₂)压力：40pis；气帘气体(N₂)压力：15pis；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：常压。

3200QTRAP仪器下各参数设置如表5：

表5

名称	母离子(amu)	子离子(amu)	Dwell(msec)	解簇电压DP(V)	碰撞电压CE(eV)
						12∶0LPC	440.50	184.10	100	55	33
SPC	465.50	184.10	100	45	32
						14∶0LPC	468.50	184.10	100	60	33
L-PAF	482.50	104.10	100	50	38
						16∶0LPC	496.50	184.10	100	50	35
18∶1LPC	522.50	184.10	100	50	35
						18∶0LPC	524.50	184.10	100	60	35
20∶0LPC	552.50	184.10	100	70	38
						22∶0LPC	580.50	184.10	100	65	35
SM	703.90	184.10	100	52	35
						SM	731.90	184.10	100	58.00	35.00
18∶2LPC	520.50	184.10	100	50	35
						20∶4LPC	540.50	184.10	100	70	38
22∶6LPC	568.50	154.10	100	65	35

4.数据分析

脂类水平分析首先利用非参数检验的方法。种间关联分析利用斯皮尔曼等级相关分析方法。逻辑斯蒂回归方程用于分析通过磷脂分子来区分结直肠腺瘤病人和正常人的特异性和灵敏性。所有的统计学显著性分析都是双向的，不包含多项参数比较的调整。所有数据分析利用SAS(Statistical Analysis Software.Version6.12，SAS Institute，Inc.)以及SPSS 11.5。

5.结果

研究工作使用了48个结直肠腺瘤患者样本和172个健康的对照样本。总共154个(70％)受试者为男性，66个(30％)受试者为女性。对来源于血液样本和对照血液样本中溶血磷脂酰胆碱((lysophosphatidylcholine，LPC)的各种亚型(14∶0LPC、16∶0LPC、18∶0LPC、20∶0LPC、22∶0LPC、18∶1LPC、18∶2LPC、20∶4LPC、22∶6LPC)、神经鞘氨醇磷酸胆碱(sphingosylphosphorylcholine，SPC)、血小板活化因子(L-PAF)，鞘磷脂(sphingomyelin，SM，包括SM703和SM731)进行了分析。上述每种脂类分子在正常人与CRA患者体内的平均含量如前表1和表2。

在正常组人群中各种脂类分子在总脂类中的相对含量由大到小依次为：总LPC＞SM703＞SM731＞L-PAF＞SPC，见图1。

选择LPC进行进一步统计分析，得到LPC各亚类(μmol/l)占总LPC(μmol/l)的比例如表6：

表6

亚类

14∶0LPC比例

16∶0LPC比例

18∶0LPC比例

20∶0LPC比例

22∶0LPC比例

18∶1LPC比例

18∶2LPC比例

20∶4LPC比例

22∶6LPC比例

均值

0.37％

44.29％

19.93％

0.24％

0.20％

10.33％

22.94％

0.07％

1.63％

标准差

0.22％

3.96％

2.26％

0.15％

0.18％

1.19％

4.45％

0.02％

0.47％

由此可见，在正常组人群中16∶0LPC占总LPC比例最高，20∶4LPC的含量最低，LPC各亚类在总LPC中的相对含量由大到小依次为：

16∶0LPC＞18∶2LPC＞18∶0LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞14∶0LPC＞20∶0LPC＞22∶0LPC＞20∶4LPC见图2

其中，饱和LPC/不饱和LPC＝1.919±0.422

进一步分析饱和LPC内部的情况，得到饱和LPC各亚类(μmol/l)占总饱和LPC (μmol/l)比例如表7：

表7

亚类	14∶0LPC比例	16∶0LPC比例	18∶0LPC比例	20∶0LPC比例	22∶0LPC比例
						平均值	0.56％	68.10％	30.66％	0.36％	0.31％
标准差	0.30％	2.83％	2.80％	0.21％	0.26％

由此可见正常组人群中饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：16∶0LPC＞18∶0LPC＞14∶0LPC＞20∶0LPC＞22∶0LPC，见图3。

而进一步分析不饱和LPC内部的情况，得到不饱和LPC各亚类(μmol/l)占总不饱和LPC(μmol/l)比例如表8：

表8

亚类	18∶1LPC比例	18∶2LPC比例	20∶4LPC比例	22∶6LPC比例
					平均值	29.89％	65.17％	0.22％	4.72％
标准差	3.86％	4.47％	0.08％	1.49％

由此可见正常组人群中不饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：18∶2LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞20∶4LPC，见图4。

对CRA组也作了相应的分析，通过对各种脂类分子进行提纯和含量测定，得到总LPC，SPC，L-PAF，SM703，SM731的含量(μmol/l)占所有脂类分子总含量(μmol/l)的百分比例如表9：

表9

种类	总LPC比例	SPC比例	L-PAF比例	SM703比例	SM731比例
						均值	67.595％	0.017％	0.233％	27.128％	5.028％
标准差	5.722％	0.008％	0.053％	4.734％	1.263％

由上可知，在CRA组人群中各种脂类分子在总脂类中的相对含量由大到小依次为：总LPC＞SM703＞SM731＞L-PAF＞SPC，见图5。

由上分析可知CRA组人群中总LPC的含量相对于其它脂类分子最高，因此选择LPC进行进一步统计分析，得到LPC各亚类占总LPC的比例如表10：

表10

亚类

14∶0LPC比例

16∶0LPC比例

18∶0LPC比例

20∶0LPC比例

22∶0LPC比例

18∶1LPC比例

18∶2LPC比例

20∶4LPC比例

22∶6LPC比例

均值

0.44％

45.08％

20.10％

0.38％

0.46％

10.06％

21.57％

0.11％

1.82％

标准差

0.14％

3.70％

2.35％

0.21％

0.49％

1.30％

4.88％

0.02％

0.58％

由此可见，在adenoma组中16∶0LPC占总LPC比例最高，20∶4LPC的含量最低，LPC各亚类在总LPC中的相对含量由大到小依次为：

16∶0LPC＞18∶2LPC＞18∶0LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞22∶0LPC＞14∶0LPC＞20∶0LPC＞20∶4LPC见图6。

其中，饱和LPC/不饱和LPC＝2.061±0.496。

进一步分析饱和LPC内部的情况，得到饱和LPC各亚类(μmol/l)占总饱和LPC(μmol/l)比例如表11：

表11

亚类	14∶0LPC比例	16∶0LPC比例	18∶0LPC比例	20∶0LPC比例	22∶0LPC比例
						平均值	0.65％	67.90％	30.21％	0.56％	0.68％
标准差	0.18％	2.23％	2.00％	0.28％	0.66％

由此可见CRA组人群中饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：16∶0LPC＞18∶0LPC＞22∶0LPC＞14∶0LPC＞20∶0LPC，见图7。

进一步分析不饱和LPC内部的情况，得到不饱和LPC各亚类(μmol/l)占总不饱和LPC(μmol/l)比例如表12：

表12

亚类	18∶1LPC比例	18∶2LPC比例	20∶4LPC比例	22∶6LPC比例
					平均值	30.46％	63.79％	0.33％	5.42％
标准差	4.25％	4.43％	0.11％	1.42％

因此CRA组人群中不饱和LPC各亚类的含量由大到小依次为：

18∶2LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞20∶4LPC，见图8。

LPC各亚类占总LPC的比例比较：

正常组：

16∶0LPC＞18∶2LPC＞18∶0LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞14∶0LPC＞20∶0LPC＞22∶0LPC＞20∶4LPC

结直肠腺瘤组：

16∶0LPC＞18∶2LPC＞18∶0LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞22∶0LPC＞14∶0LPC＞20∶0LPC＞20∶4LPC

从排序中可以看出：仅有22∶0LPC在结直肠腺瘤的比例排序相对于正常组上升。因此，22∶0LPC可能对CRA组人群有特殊意义，有作为标志物进行进一步研究的潜力。

而正常组与CRA组不饱和LPC各亚类占总不饱和LPC的比例的排序是一致的，均为：

18∶2LPC＞18∶1LPC＞22∶6LPC＞20∶4LPC

此外，总饱和LPC含量与总不饱和LPC含量比值比较：

在正常组与CRA组人群中这一比值分别为：1.919±0.422和2.061±0.496，由前面的介绍已知，这一指标在两组人群中不具有显著差异。

通过前面的介绍，我们已知总SM含量和SPC含量在正常组与CRA组间存在显著差异，而其他指标(总LPC、总饱和LPC、总不饱和LPC、L-PAF)在两组间均不存在显著差异。具体到LPC和SM的每种单一亚型，t检验差异结果如表13：

表13

14∶0LPC

16∶0LPC

18∶0LPC

20∶0LPC

22∶0LPC

18∶1LPC

18∶2LPC

20∶4LPC

22∶6LPC

SM703

SM731

P值

0.019

0.612

0.432

0.003

0.012

0.093

0.030

＜0.001

0.369

＜0.001

差异

显著

不显著

很显著

显著

不显著

显著

极显著

不显著

极显著

例2用年龄、SPC、20∶0LPC、22∶0LPC、SM703、20∶4LPC作为结直肠腺瘤的标记。

以下是对几种脂类综合应用进行结直肠腺瘤诊断的方法：

我们的模型基于实验数据的85％，即训练集，包括146个正常人，41个CRA患者，而其余15％的数据用于检验模型，包括26个正常人，和7个CRA患者。我们通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据进行变量的选择，对正常和CRA数据利用二分类的logistic模型研究得到以下模型：

\log (\frac{π_{1}}{π_{0}}) = 0.0989 \times x_{2} + 5.3819 \times x_{3} - 2.5322 \times x_{9} + 2.0733 \times x_{10} - 0.0673 \times x_{11} + 14.0863 \times x_{14}

公式I

其中记π₀是样本为正常人的概率，π₁是样本患腺瘤的概率。变量x₂表示年龄、x₃表示血液中的SPC值、x₉表示血液中20∶0LPC值、x₁₀表示血液中22∶0LPC值、x₁₁表示SM703值、x₁₁表示20∶4LPC值。将公式I右侧值大于0判别为CRA，小于0判别为正常。在模型建立的过程中用x₁到x₁₅分别表示检测对象的性别、年龄、血液中的SPC值、14∶0LPC值、L-PAF值、16∶0LPC值、18∶1LPC值、18∶0LPC值、20∶0LPC值、22∶0LPC值、SM703值、SM731值、18∶2LPC值、20∶4LPC值、22∶6LPC值，通过逐步回归方法(变量进出模型的概率均设置为0.1)进行变量的选择，利用非参检验辅助选择，使用统计软件SAS编程处理数据得到上述公式。

分别以训练集样本和验证集样本作为例证验证该模型，该过程训练集有6个正常人被误判为腺瘤，6个腺瘤患者被误判为正常，特异度为95.89％，灵敏度为85.37％。验证集全部判断正确。总的特异度为96.51％，灵敏度为87.50％。

Claims

1.一种通过检测人个体血液样本中溶血磷脂酰胆碱及其它脂类分子的水平来预测患有结直肠腺瘤的试剂盒，所述试剂盒同时包括SPC，20：0LPC，22：0LPC，SM703，20：4LPC；测得SPC，20：0LPC，22：0LPC，SM703，20：4LPC的值，代入公式：

\log (\frac{π_{1}}{π_{0}}) = 0.0989 \times x_{2} + 5.3819 \times x_{3} - 2.5322 \times x_{9} + 2.0733 \times x_{10} - 0.0673 \times x_{11} + 14.0863 \times x_{14}

其中，变量x₂表示年龄、x₃表示样本中的SPC值、x₉表示样本中20：0LPC值、x₁₀表示样本中22：0LPC值、x₁₁表示样本中SM703值、x₁₄表示样本中20：4LPC值；

计算得到的结果作为辅助预测依据。