CN101238373A - 内质蛋白片段及其衍生物作为结肠直肠腺瘤和/或癌的生物标记的用途;用于检测的方法和测试系统 - Google Patents
内质蛋白片段及其衍生物作为结肠直肠腺瘤和/或癌的生物标记的用途;用于检测的方法和测试系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101238373A CN101238373A CNA2005800513317A CN200580051331A CN101238373A CN 101238373 A CN101238373 A CN 101238373A CN A2005800513317 A CNA2005800513317 A CN A2005800513317A CN 200580051331 A CN200580051331 A CN 200580051331A CN 101238373 A CN101238373 A CN 101238373A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- colorectal
- derivatives
- level
- endoplasmin fragment
- colorectal cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法,其包括步骤为:a)提供从个体采集的分离的样品材料,b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。本发明还涉及用于区分结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的方法,并且涉及用于监测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的发展和/或过程的方法,和/或用于治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法。而且,本发明涉及在这些方法中使用的测试系统和阵列。此外,本发明涉及内质蛋白片段用作在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的生物标记的用途。更多的,本发明涉及用于确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的有效性的方法。
Description
技术领域
本发明涉及检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测领域。
背景技术
结肠直肠癌是全世界第三高频率诊断出的癌症(9.4%)。在2003年,全世界诊断出近乎945000例新的结肠直肠癌病例,且约492000人死于此疾病。结肠直肠癌的发生在增加,而其死亡率在下降。结肠直肠癌的发生随年龄增长,在40岁左右开始,并且其发生在男性中高于女性(每年每100000人中40.6为男性相对30.6为女性)(世界癌报道,2003,BW.Stewart和P.Kleihues编辑.IARC Press,Lyon)。
在大多数患者中,结肠直肠癌的发展从恶化前的腺瘤到具有转移倾向的侵入性恶性肿瘤按照多级进程进行。
迄今为止,仅令人不愉快的结肠直肠筛选测试,例如结肠镜检查显示能够检测早期结肠直肠癌及其先兆。然而,已观察到扁平肿瘤病变和小于10毫米直径的息肉样损害具有高的假阴性率(Kudo S.(1997)Gastrointest.Endosc.Clin.N.Am.7:87-98)。因此,期望有测试系统使能够进行结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的早期诊断以及在不同肿瘤阶段之间的特异性辨别。这也使能够特异性的适应治疗。
目前已知的筛选测试基于在血样中对肿瘤标记的检测,其缺少需要的敏感性和特异性。例如,已经使用血样中CEA-(癌胚抗原)-水平来检测结肠癌。然而,CEA水平并非在结肠癌中特异性升高,已经显示也发现在患有其他恶性疾病(例如,胃癌、胰腺瘤、乳腺瘤和肺癌)和具有多种非恶性情况(例如,酒精性肝病、炎性肠病、重度吸烟、慢性支气管炎和胰腺炎)的患者中升高。(Posner MR,Mayer RJ:The use of serologic tumormarkers in gastro intestinal malignancies.Hematol Oncol CNn North Am8:533,1994)。此外,CEA-水平在结肠腺瘤中并未升高。而且CEA-水平不适用于区分结肠直肠腺瘤与结肠直肠癌或不同的肿瘤阶段。
本发明的目标是提供方法,使能够早期检测结肠腺瘤和/或结肠癌和/或能够区分不同肿瘤阶段。
另外的目标是提供生物标记,可以将其用于检测结肠直肠腺瘤和/或癌,和/或用于区分不同的肿瘤阶段。
本发明的另一目标是提供检测系统用于检测结肠直肠腺瘤和/或癌,和/或用于区分不同的肿瘤阶段,该系统是有效的且可以被广泛应用。
此外,该测试系统应该是容易操作的。
本发明的另一目标是提供筛选系统用于检测化合物的效果,所述化合物对于由肿瘤的特定阶段而决定的腺瘤和/或癌的治疗是特异性的。
本发明的根本目标是通过使用内质蛋白片段或其衍生物作为用于检测在个体中的结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或用于区分不同肿瘤阶段的生物标记来获得解决。该检测可以在体内和体外进行。依照优选的实施方案,在体外进行该检测。
还通过用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法解决这些目标,其包括步骤为:
a)提供从个体中采集的分离的样品材料,
b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
还通过用于区别结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌,和/或用于区别另外的肿瘤状态的方法解决本发明的目标,其包括步骤为:
a)提供从个体中采集的分离的样品材料,
b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
还通过用于监测结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的发展和/或过程和/或治疗的方法解决本发明的目标,其包括步骤为:
a)提供从个体中采集的分离的样品材料,
b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
在优选的实施方案中,控制手术或治疗操作的效果以决定关于是否将结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌彻底除去。在另一实施方案中,通过用一种或多种化学物质、抗体、蛋白质、肽、小分子药物、反义-RNA、放射,例如X-射线,或其组合来治疗患者,控制对结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌患者的治疗以控制治疗的有效性。
通过提供用于在个体样品中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或用于区分不同肿瘤阶段的测试系统解决本发明的目标,其包括:
a)结合于内质蛋白片段或其衍生物的表位的抗体或受体,
b)支持所述抗体或受体的固体支持物,
c)用于检测内质蛋白片段或其衍生物的所述表位与所述抗体或受体的结合的试剂。
还通过提供阵列来解决本发明的目标,其包含用于在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或用于区分不同肿瘤阶段的检测分子,其包括以下作为检测分子:
a)固定于固体支持物的用于结合和检测编码内质蛋白片段或其衍生物的核酸探针,或
b)固定于固体支持物的用于结合和检测内质蛋白片段或其衍生物的表位的抗体,或
c)固定于固体支持物的用于结合和检测内质蛋白片段或其衍生物的表位的受体,
其中,优选将不同量的检测分子固定于固体支持物上以增加定量的精确性。
核酸探针是例如选自由单链或双链DNA或RNA、适配体及其组合组成的组。适配体为单链寡核苷酸,其被假定为特异性的、序列依赖形状的且以高度的特异性和亲和力与蛋白质靶标结合。使用SELEX过程鉴定适配体(Tuerk C.和Gold L.(1990)Science 249:505-510;Ellington AD.和Szostak JW(1990)Nature 346,818-822)。
还通过用于确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中和/或用于区分不同肿瘤阶段中是否有效的方法来解决这些目标,其包括步骤为:
a)用化合物治疗结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌患者,
b)确定在所述患者的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,和
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
优选的实施方案在从属权利要求中进行详细说明。
根据本发明,术语“样品材料”也被称为“样品”。
依照本发明,术语“生物标记”意指蛋白质或蛋白质片段或核酸,其指示结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的发生。这意味着使用“生物标记”作为检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法。
术语“个体”意指哺乳动物。优选的,哺乳动物是人,例如患者。
术语“健康个体”意指未患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的个体。即术语“健康个体”仅关于结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的病理状态方面,且不排除患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌之外的其他疾病的个体。
根据本发明的术语“不同肿瘤阶段的区分”意指区分结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌,和/或区分不同的肿瘤阶段,例如TNM I、II、III和IV。
术语“其衍生物”意指描述在DNA、mRNA或蛋白质水平的任何修饰,包括例如截短的基因、所述基因的片段、突变的基因、或修饰的基因,或其各自的基因产物。术语“其衍生物”包括核酸序列,例如DNA、RNA、mRNA或蛋白质序列或肽序列。衍生物可以是修饰,其为在基因中的缺失、取代或插入的结果。该基因修饰可以是天然发生的基因可变性的结果。术语“天然发生的基因可变性”意指非基因工程结果的修饰。衍生物可以是在体内的基因或基因产物的加工结果和/或降解产物。在蛋白质水平的修饰可以出于体内的酶修饰或化学修饰。例如,该修饰可以是糖基化或磷酸化或法尼基化。
在本发明中使用的术语“内质蛋白片段或其衍生物”也包括突变的内质蛋白片段或修饰的内质蛋白片段或修饰的内质蛋白的片段。“内质蛋白片段”的修饰可以由于酶修饰或化学修饰。
术语“肿瘤”和“癌”被可互换的使用并且具有相同的含义。
在一个实施方案中,内质蛋白片段或其衍生物为包含内质蛋白的N-末端片段或C-末端片段的蛋白质。术语N-末端片段或C-末端片段不被理解为这些序列包含内质蛋白的完整的N-末端或C-末端,而是该片段从内质蛋白的N-末端或C-末端区域产生。
该片段也可以从内质蛋白的蛋白质序列的中间部分产生。
内质蛋白(SEQ ID NO.1)的片段的序列长度必须是充分长从而对于内质蛋白特异性的。已经显示内质蛋白的片段包含内质蛋白序列(SEQ ID NO.1)的至少7个连续的氨基酸,优选至少8个连续的氨基酸,其对内质蛋白是高度特异性的。根据本发明的优选的实施方案,该片段包含内质蛋白(SEQ ID NO.1)的至少9个连续的氨基酸。
全长内质蛋白(SEQ ID NO.1)(其也被称为grp94)的特异性切割,产生约10-14kDa和80kDa的两个片段。假定该内质蛋白-切割是由(需)钙蛋白酶引起(图4)。
在本发明的一个实施方案中,内质蛋白片段包含具有分子量约为80kDa的C-末端片段或具有分子量约为10-14kDa的N-末端片段。根据本发明的另一实施方案,具有分子量约为10-14kDa或约为80kDa的片段由(需)钙蛋白酶切割引起。
在本发明的实施方案中,内质蛋白片段包含序列SEQ-ID-NO.1的部分。在本发明的优选的实施方案中,内质蛋白片段包含N-末端片段。优选该片段包含肽序列SEQ ID-NO.2和/或肽序列SEQ-ID NO.3。依照本发明的另一实施方案,该片段包含肽序列SEQ-ID NO.4。
在本发明的另一实施方案中,内质蛋白片段具有10至14kDa,更优选10.3kDa的分子量。
在本发明的另一实施方案中,内质蛋白片段是肽或蛋白质,其为或包括氨基酸序列,所述序列与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4(图1)具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%的序列同一性,且其能够特异性检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌。
依照本发明的另一实施方案,内质蛋白片段具有的氨基酸序列与基于SEQ ID NO.1的序列片段有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%的序列同一性。
葡萄糖相关蛋白(grp)是在胁迫诱导后合成的一组高度保守的蛋白质。Grp作为分子监控蛋白类起作用,帮助转运、折叠和加工其各自的靶标蛋白质。免疫组织化学染色检测grp94主要在细胞质。Grp94也被称为内质蛋白。Grp94(内质蛋白)呈现腔蛋白质和整合蛋白质的双重性质,说明其以两种不同的形式在内质网中存在。
术语“表位”意指蛋白质或肽的任何结构元素或蛋白质性质的结构,其使能够特异性结合抗体、抗体片段、蛋白质或肽结构或受体。
使用已经从人体分离的样品材料,例如体液或组织样品执行本发明的方法。优选样品材料是组织样品。接着可以分级和/或纯化样品材料。例如,可能将待检测的样品材料贮存于冷冻库和在融化各个样品材料的适当的时间点执行本发明的方法。
已经由本发明人令人惊讶的发现可以使用内质蛋白片段或其衍生物作为生物标志,优选作为早期生物标志用于检测结肠直肠腺瘤和/或癌。
发明人目前惊讶的发现在样品材料,例如组织样品或体液中的内质蛋白片段的蛋白质水平或其衍生物在患有结肠直肠腺瘤和/或癌的个体中升高。此外,发明人已经惊讶的发现可以使用在组织样品或体液中内质蛋白片段的蛋白质水平或其衍生物区分健康人与患有结肠直肠腺瘤和/或癌的患者,以及区分结肠直肠腺瘤与结肠直肠癌。另外,可以使用内质蛋白片段的水平区分不同的肿瘤阶段,例如TNM I、II、III和/或IV。内质蛋白片段是特异性的生物标志,可以使用其区分结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌和/或不同的肿瘤阶段。不同的肿瘤阶段可以是例如TNM I、II、III和/或IV。内质蛋白片段是选择性和特异性的标志,可以使用其确认由组织病理学获得的诊断。
然而,发明人还发现在例如组织或生物液,例如血清或血浆的样品材料中完整内质蛋白的升高的水平是对结肠直肠腺瘤特异性的。因此,完整内质蛋白的升高的水平也是结肠直肠腺瘤的指示。由此考虑,以上或以下给出的全部说明分别应用于完整的内质蛋白。
然而,发明人还惊讶的发现,在样品材料,例如组织或体液中内质蛋白片段的升高的水平是结肠直肠腺瘤和/或癌的更加特异和敏感的生物标志。
依照本发明,样品材料可以是组织、细胞或体液。样品材料可以是体液,例如血液、血浆、血清、骨髓、粪便、滑液、淋巴液、脑脊髓液、唾液、尿液、母乳、精液、渗出液及其混合物。在本发明的实施方案中,通过色谱法分离体液。
优选的,在执行本发明的方法之前已经分离体液。本发明的方法优选通过实验室技术人员在体外进行。
根据本发明优选的实施方案,测量在血浆、血清或尿液中的内质蛋白片段的水平。可以通过从要医学检查的个体采集血液和从凝块的血液分离上清容易的获得血清。
随着结肠直肠腺瘤形成的进程,内质蛋白片段或其衍生物的水平升高。结肠直肠腺瘤是可以变成恶性的良性瘤。当从良性结肠直肠腺瘤发展为结肠直肠癌时,在体液中,优选血清中内质蛋白片段或其衍生物的水平进一步增加。
在结肠直肠腺瘤转化为结肠直肠癌之后,患病个体的病理情况可以通过形成转移而进一步恶化。内质蛋白片段的更高水平与结肠直肠腺瘤和/或癌和/或转移的发生相关。
本发明提供早期的生物标志,其使能够检测在早期和/或仍然为良性期和/或肿瘤早期检测肿瘤性疾病。早期检测使医生能够及时移除结肠直肠腺瘤和大大增加个体存活的机会。
此外,本发明使能够在延长的时间,例如数年,监测在体液中,例如血清中内质蛋白片段或其衍生物的水平。
长期监测使能够区分在结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌之间的不同。可以常规的检查体液中内质蛋白片段或其衍生物的水平,例如,一年一次或两次。如果检测到内质蛋白片段或其衍生物水平的增加,这可能指示结肠直肠腺瘤。然后,内质蛋白片段或其衍生物的进一步增加可能指示向恶性结肠直肠癌转移。
此外,可以监控疾病和/或治疗的过程。如果内质蛋白片段或其衍生物的水平进一步增加,例如在移除结肠直肠腺瘤之后,这可以是病理情况恶化的指示。
这意味着,内质蛋白片段或其衍生物的水平是检测和监测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的有价值的临床参数。在结肠直肠腺瘤发生之后,体液中内质蛋白片段或其衍生物水平增加。因此,内质蛋白片段或其衍生物的水平是使能够进行早期诊断的重要临床参数,并且因而能够对疾病进行早期治疗。此外,可以使用内质蛋白片段的水平检查手术和/或其他治疗的有效性。
用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或用于区分不同肿瘤阶段的本发明的方法包括步骤为:提供从个体提取的分离的样品材料,接着确定在分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,和最后将内质蛋白片段或其衍生物的确定的水平与一个或多个参考值进行比较。在一个实施方案中,另外检测从个体采集的分离的样品材料中的一种或多种生物标志,并且与一个或多个参考值进行比较。
可以按照在多个健康个体或患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌个体中分离的样品中确定的内质蛋白片段或其衍生物的平均水平计算参考值。这一参考值可以是从健康人建立,被认为覆盖正常范围,或从患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌患者建立,被认为是升高的范围。通常,作为参考值的范围给出参考值。因此,在本发明中使用的术语参考值和参考值的范围被定义为具有相同的含义。
接着,在参考值范围内的特定值可能指示结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的健康情况或病理情况。可以通过采集健康个体和患有结肠腺瘤和/或结肠癌的个体的统计相关数目的组织样品或体液样品,例如血清样品,如对任何其他医学参数范围,例如血糖所做的来建立参考值的范围。也可以从结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠肿瘤患者的健康组织获得对于健康状况的参考值。
优选的,计算两种参考值,其被指定为阴性对照和阳性对照1。从健康个体或结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠肿瘤患者的健康组织计算阴性对照的参考值,并且从患有结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌的个体计算阳性对照。更优选的,计算三种参考值,其被指定为阴性对照和阳性对照1以及阳性对照2。阳性对照1可以从患有结肠直肠癌的个体计算,且阳性对照2可以从结肠直肠腺瘤计算。
在本发明的另一实施方案中,参考值可以是个体参考值,计算为在长期从个体采集的多个分离样品中确定的内质蛋白片段或其衍生物的平均水平。
当在延长的期间,例如数月或数年监测内质蛋白片段或其衍生物的水平时,可能建立个体平均水平。当测量血糖时,可以(例如从相同的血清样品)测量内质蛋白片段或其衍生物的水平,并且可以用于建立个体校准曲线使能够特定的检测任何个体的内质蛋白片段或其衍生物水平的增加。
也可以如所述用于内质蛋白的相同方式计算更多生物标记的参考值。内质蛋白片段的平均水平或更多的生物标记可以是平均值或中间水平。
另一方面,本发明还提供了用于在个体的分离的样品材料中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的测试系统。该测试系统是基于抗体或受体对特异结合的内质蛋白片段或其衍生物的表位或合适的结构元件的特异性。受体可以是能够特异结合内质蛋白片段或其衍生物的任何结构。该受体可以是,例如,抗体片段,例如Fab或F(ab′)2片段或能够特异结合内质蛋白或其衍生物的任何其他蛋白质或肽结构。该受体也可以是特异结合内质蛋白片段或其衍生物的适配体。
抗体、抗体片段或受体结合于固体支持物,例如塑料表面或珠子,使能够结合和检测内质蛋白片段或其衍生物。例如,可以使用常规的微量滴定板作为塑料表面。例如,通过使用以可检测的基团标记的第二抗体可以有效进行内质蛋白片段或其衍生物的结合的检测。可检测的基团可以是,例如,放射性的同位素或酶,如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶(其可以通过加入合适的底物产生,例如颜色或荧光信号)。
测试系统可以是免疫测定,例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)或发光免疫测定(LIA)。然而,可以使用任何使用抗体或抗体片段的任何其他免疫测试,例如蛋白质印迹法或免疫沉淀法。
本发明还提供包含用于在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测分子的阵列,其中检测分子可以是固定于固体支持物的核酸探针,其被用于结合和检测编码内质蛋白片段、突变、变体或其衍生物的mRNA,或固定于固体支持物的抗体,其被用于结合和检测内质蛋白片段或其衍生物的表位,或固定于固体支持物的受体,其被用于结合和检测内质蛋白片段或其衍生物的表位。优选的,该阵列还包括用于检测结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌的生物标记的更多的检测分子。优选的,核酸探针包含选自对应于SEQ-ID-NO.2和/或SEQ-ID-NO.3或SEQ-ID-NO.4的核酸序列组成的组的核酸序列。
备选的,本发明还包括包含固定于固体支持物的患者样品的反阵列(inverse array),其可以通过以上定义的检测分子被检测。
优选的,该阵列包含固定在固体表面可识别位置上的检测分子。
在本发明中使用的术语“阵列”指分类(grouping)或排列,而不需要是规则的排列。阵列优选的包括至少2个,更优选5个,最优选10个不同组的检测分子。优选的,本发明的阵列包括至少50组检测分子,更优选至少100组检测分子。依照本发明的另一实施方案,本发明的阵列包含至少500组检测分子。检测分子可以是,例如如上所述的核酸探针或抗体或受体。
核酸探针可以是任何天然产生的或合成的寡核苷酸、适配体以及cDNA、cRNA等等。
所述阵列可以在根据本发明的测试系统中使用。在本发明中使用的术语“阵列”同时涉及大阵列(macroarray)和微阵列(microarray)。
依照本发明的另一实施方案,通过质谱法确定内质蛋白片段或其衍生物的水平。
质谱法使能够经由其分子量特定的检测内质蛋白片段或其衍生物和非常容易的定量内质蛋白片段或其衍生物的量。
可以使用在质谱法领域已知技术中的任何合适的电离法来电离内质蛋白片段或其衍生物分子、片段、突变、变体或其衍生物。电离法包括电子撞击(EI)、化学电离(CI)、场电离(FDI)、电喷射离子化(ESI)、激光解析电离(LDI)、矩阵辅助的激光解析电离(MALDI)和表面增强的激光解析电离(SELDI)。
可以使用在质谱法领域已知技术中的任何合适的检测方法来确定内质蛋白片段或其衍生物的分子量。检测方法包括四级质谱法(QMS)、傅立叶变换质谱法(FT-MS)和飞行时间质谱法(TOF-MS)。
优选的,该质谱法是表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱法(SELDI-TOF-MS)。在执行SELDI-TOF-MS之前,在分离的样品中的内质蛋白片段或其衍生物优选固定于芯片或具有活性表面的固体支持物上。活性表面优选包括被固定的针对内质蛋白或其衍生物的抗体,例如兔多克隆抗体。在内质蛋白片段或其衍生物与抗体结合之后,在SELDI-TOF质谱仪进行飞行时间分析,其传递强信号用于确定内质蛋白片段或其衍生物的水平。
此外,质谱法使能够同时检测与结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测有关联的其他蛋白质。
在本发明的实施方案中,通过另外的检测一个或多个更多的生物标记来增强对结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌检测的敏感度和/或特异性。
优选的,通过检测内质蛋白片段及其衍生物以及α-防卫素1、2或3或其衍生物的组合增加根据本发明的方法、阵列、测试系统和用途的敏感度和特异性。
在本发明中使用的术语“α-防卫素1、2或3或其衍生物”也包括截短的α-防卫素1、2或3,α-防卫素1、2或3的片段,突变的α-防卫素1、2或3,或修饰的α-防卫素1、2或3。“α-防卫素1、2或3”的修饰可以由于酶或化学的修饰,α-防卫素1、2和3也被分别称为人中性粒细胞肽类(HNP)1、2和3。三种肽具有质量/电荷比率(m/z)为3445±10、3374±10和3489±10。
HNP 1-3肽是肽的防卫素家族部分,其为免疫系统的基本成分并且具有杀死/灭活广泛病原体的能力。还已知防卫素也作为先天免疫系统和适应免疫系统的调节物起作用。
先前的研究显示HNP 1-3在肿瘤中的表达主要来自肿瘤入侵嗜酸细胞和中性白细胞。然而,其也由癌细胞产生(例如,膀胱癌细胞)。
(Albrethsen J,Bogebo R,Gammeltoft S,Olsen J,Winther B,RaskovH.Upregulated expression of human neutrophil peptides 1,2和3(HNP 1-3)in colon cancer serum and tumours:a biomarker study.BMC Cancer.2005,5:8.)
在本发明的另一实施方案中,可以通过将内质蛋白片段的检测与一种或多种其他的生物标志组合以增强对结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测和/或对不同肿瘤阶段区分的敏感度和/或特异性,所述生物标志选自由α-防卫素1、2或3、运甲状腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白(β-Catenin)、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆及其衍生物;和在E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突变;和MHL1或MSH2的微卫星不稳性;以及SNP(单核苷酸多态性)及其组合组成的组。
结肠直肠腺瘤和/或癌的另一生物标志可以包括蛋白质或多肽,其具有分子量为4,838±25Da,优选4,838±10Da。在优选的实施方案中,同时使用内质蛋白片段和具有分子量为4,838+25Da,优选为4,838±10Da的蛋白质和多肽来检测结肠直肠腺瘤和/或癌。
在一个实施方案中,将内质蛋白或其衍生物的片段与C3a或其衍生物和/或运甲状腺素蛋白或其衍生物组合用作生物标志来检测结肠直肠腺瘤和/或癌和/或来区分不同的肿瘤阶段。
在本发明中使用的术语“运甲状腺素蛋白”或其衍生物也包括截短的运甲状腺素蛋白、运甲状腺素蛋白的片段、突变的运甲状腺素蛋白或修饰的运甲状腺素蛋白。“运甲状腺素蛋白”的修饰可以出于酶或化学修饰。而且,术语“运甲状腺素蛋白”也被用于指定运甲状腺素蛋白的单体或多聚体形式。例如,术语“运甲状腺素蛋白”特别覆盖单体蛋白质链,其通常是同源四聚体蛋白质运甲状腺素蛋白的部分。
运甲状腺素蛋白也被命名为前白蛋白。运甲状腺素蛋白是分子量为约54000Da的四聚体蛋白质,其主要在肝脏中合成。运甲状腺素蛋白通常为同源四聚体,包含四个蛋白质链,各自具有约14000Da的分子量。发明人已经使用质谱法检测到运甲状腺素蛋白的多种变体,尤其是具有分子量13776Da、13884Da或14103Da。发明人已经发现,在发生结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的情况下,在体液例如血清中特别是具有分子量为13776Da和13884Da的运甲状腺素蛋白的分子变体的水平降低。
在本发明中使用的术语“C3a或其衍生物”还包括截短的C3a、C3a的片段、突变的C3a、修饰的C3a或前体C3(图2,SEQ ID NO.5)或C3的片段。在一个实施方案中,衍生物具有或包含蛋白质序列,该序列与序列SEQ-ID-NO.6(图3A,SEQ ID NO.6)具有至少80%,优选至少90%,更优选至少98%的同一性。
“C3a”的修饰可以由于酶或化学修饰。具体的,术语C3a或其衍生物特别包括截短的C3a蛋白质,其优选具有分子量在8950±25Da的范围;更优选在8950±20Da的范围。在优选的实施方案中,截短的C3a蛋白质具有8939Da的分子量。优选的,该C3a蛋白质没有C-末端的精氨酸且任选的分子量在8950±20Da的范围。在一个实施方案中,C3a衍生物是C3a-desArg(图3B,SEQ ID NO.7)。在一个实施方案中,通过肥大细胞-类胰凝乳蛋白酶切割C3a获得C3a衍生物。在另一实施方案中,通过C3-转化酶切割C3获得C3a。本发明也包括上述实施方案的组合。
C3a属于过敏毒素类。C3a、C4a和C5a是补体系统的丝氨酸蛋白酶的蛋白水解产物。C3a(SEQ-ID-NO.6)在补体激活过程中衍生自血液补体系统的第三元件(C3)(SEQ-ID-NO.5)。C3a是具有局部效应的激素。在C3a中约40%的氨基酸残基涉及螺旋构象。血清过敏毒素参与多种细胞免疫应答,还是有力的促炎物质。C3a对血管壁、平滑肌收缩和血管通透性的增加产生有力的效应。在C3a的C-末端精氨酸是其生物活性的重要基础。过敏毒素由羧肽酶N(过敏毒素灭活剂)调节,其在数秒内移除羧端精氨酸。这一机制将完整的过敏毒素转化为低活性的C3a-desArg形式(SEQ IDNO.7)。
这使结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的检测具有增加的敏感度和/或特异性,和/或区分不同的肿瘤阶段。此外,由于这些方法不象结肠镜检查一样令人不适,本发明的方法将被患者更好的接受。依据本发明,用本发明的方法筛选从个体分离的样品材料,其可以为组织样品或生物液,例如血浆或血清。可以例如通过采集血液或通过活组织检查获得样品材料。
敏感度和特异性被定义如下:
敏感度是相对于全部患者数(100%)检测到的真正阳性患者的数值(%)。患者可以是患有结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的个体。
特异性是相对应全部健康个体数(100%)检测到的真正阴性个体的数值(%)。
可以通过下列公式可选择的定义敏感度和特异性:
TP:真正阳性(检测阳性,诊断正确);
FP:假阳性(检测阳性,诊断不正确);
TN:真正阴性(检测阴性,诊断正确);
FN:假阴性(检测阴性,诊断不正确);
通过以下公式计算敏感度:
TP/(TP+FN)
且通过以下公式计算特异性:
TN/(TN+FP)
对多个分离的样品计算选自TP、FP、TN、FN的各个分析组的结果,所述样品选自健康个体、结肠直肠腺瘤患者和/或结肠直肠癌患者组成的组。TP、FP、TN、FN涉及分别与真正阳性、假阳性、真正阴性、假阴性状态相关的个体的数量。
可以将本发明的方法与其他用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的诊断方法组合执行以增加整体敏感度和/或特异性。内质蛋白片段的检测允许非常早期的检测结肠直肠腺瘤和因而能够用作非常早期的生物标记。此外,内质蛋白片段的检测使能够区分不同的肿瘤阶段。
优选的,执行本发明的方法作为早期检测和/或监测方法。如果本发明方法的结果指示在体液样品中发生结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠腺瘤,可以进行进一步的检查,例如结肠镜检查。如果通过组织化学用组织样品获得的结果指示发生结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠腺瘤,应该分析内质蛋白片段的水平任选的与另一生物标志组合,以区分不同的肿瘤阶段。
本发明还提供用于区分化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌中是否有效的方法。此外,本发明提供方法用于选择治疗特殊肿瘤阶段的特殊化合物。
优选的,用于确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或用于治疗特殊肿瘤阶段中是否有效的方法包括步骤为:
a)用化合物治疗结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌患者
b)确定在所述患者的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
在本申请中使用的术语“患者”包括人以及非人,例如动物。优选动物选自啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠)和其他动物(例如荷兰猪、兔、野兔、狗和猪)组成的组。
可以使用这些动物特异性的诱导某疾病状态,例如结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌用于研究。可以例如通过用放射性或化学的物质处理动物起作用来诱导所述疾病状态,所述物质已知诱导结肠直肠癌或结肠直肠腺瘤疾病状态。也可能使用病毒转染系统诱导疾病状态。也可能使用基因修饰的动物,其中一个或多个特定的基因功能已经被改变,或敲除动物,例如其中特定基因功能已经被缺失的敲除小鼠。
用于治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的化合物可以是一种或多种化学物质、抗体、蛋白质、肽、小分子药物或反义mRNA。备选的,可以单独使用放射代替一种或多种化合物或与一种或多种化合物组合。
通过上述检测技术可以确定在所述患者的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平。
给出下列图和实施例仅意在说明。本发明不应被解释为局限于以下实施例。
附图说明
图1在图1A中显示内质蛋白的蛋白质序列(SEQ-ID NO.1),和在图1B中显示三个肽序列,其为N-末端内质蛋白片段的各个部分(SEQ ID NO.2、3和4)。
图2显示C3蛋白质序列(SEQ ID NO.5)。
图3在图3A中显示C3a蛋白质序列(SEQ ID NO.6),和在图3B中显示C3a-desArg蛋白质序列(SEQ ID NO.7)。
图4显示由(需)钙蛋白酶对内质蛋白的推定的切割位点,其产生约80kDa和约14kDa的片段。
图5显示来自正常结肠、腺瘤和肿瘤组织的裂解物的SELDI-TOF-MS蛋白质谱。在从健康到腺瘤到癌患者的组织中,p10.3(内质蛋白的N-末端部分,10300Da)的强度显著增加。
图6显示通过SELDI-TOF-MS对内质蛋白片段p10.3的分析。对来自结肠癌的30个样品和来自腺瘤组织的29个样品以及相应的正常健康结肠组织进行分析。在腺瘤组(A)和或癌组(T)中内质蛋白片段p10.3的平均浓度显著高于在健康组(N)中的浓度。
图7显示通过SELDI-TOF-MS检测在不同癌类型中的p10.3。与不同的结肠癌阶段相比,在胃、食道、肺、前列腺和乳腺癌的分析的样品中,p10.3的表达水平显著更低。在SAX蛋白质芯片_阵列分析裂解物。在正常和肿瘤组织之间p10.3表达水平的差异是统计显著性的。N=正常组织,T=癌组织。
图8显示来自正常结肠、腺瘤和癌组织的裂解物的SELDI-TOF-MS蛋白质谱。在来自结肠直肠腺瘤到癌患者的组织中,p3489(α-防卫素家族成员,p3.4)的峰强度显著增加。N=正常组织,A=腺瘤组织,T=癌组织。
图9显示来自正常结肠、腺瘤和癌组织的裂解物的SELDI TOF MS蛋白质谱。与健康对照和结肠直肠癌组织相比,在来自结肠直肠腺瘤患者的组织中,p4838(p4.8)的峰强度显著上升。N=正常组织,A=腺瘤组织,T=癌组织。
图10显示两种标记的组合(p10.3和p4.8或p10.3和p3.4)在异源患者群中提高对腺瘤和癌组织的敏感度和特异性。A)如果基于p 10.3和p4.8的组合,获得对癌组织的敏感度为90%(对腺瘤为79%)且特异性为90%。B)使用p10.3和α-防卫素家族成员p3.4的组合,相应数值为对于癌样品为70%(对于腺瘤为82%),具有90%的特异性。N=正常结肠粘膜,T=癌组织,A=腺瘤组织。在字母前的数值指定分离的个体的数值。另一数值指截断值(Cut-off value)。
实施例
除非另外声明,按照分析系统的制造商操作手册执行全部方法。
实施例1:
样品制备
组织样品对来自腺瘤和结肠直肠癌患者(TNM III期)的肿瘤组织以及相匹配的来自各个患者的正常结肠组织进行分析。患者:对伦理指导和患者的保密性有严格的保证,并且全部患者签字同意参与此研究。所有患者拥有相当的术前准备,例如禁食时间和在外科手术时的药物处理。
组织提取物的制备来自新鲜冷冻的肿瘤和正常组织的冷冻切片(5μm)用苏木精/曙红染色来对照肿瘤/基质的组织病理学和量。用超过50%的肿瘤内容物或腺瘤内容物封闭组织,并且将正常组织切为切片(8×20μm)和立即转移至500μl Dulbeccos磷酸盐缓冲液盐水缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、6.5mM Na2HPO4·12H2O、1.5mM KH2PO4,pH 7.4)。将这些切片于4℃以13200rpm离心10分钟。沉淀用150μl裂解缓冲液(20mMTris、50mM NaCl、0.5%吐温pH 7.2、0.1%complete_(Roche,Mannheim,德国))在冰上提取10分钟。在剧烈涡旋之后,以13200rpm离心裂解物10分钟。通过BCA测定(BCA测定,Pierce,Rockford,IL,美国)来测量上清液的蛋白质浓度并且用裂解缓冲液调整每个样品浓度至5μg/50μl。
实施例2
Ciphergen蛋白质芯片_阵列制备。在强阴离子交换器阵列(SAX;Ciphergen Biosystems,Femont,CA,美国)分析蛋白质裂解物。SAX蛋白质阵列(强阴离子交换器)是在生物处理器(Ciphergen Biosystems,Inc)中处理。芯片用结合缓冲液(0.1M Tris/HCl,pH 7.5)平衡2×5分钟并且接着在每个点用50μl蛋白质裂解液孵育。45分钟之后,移去未结合的材料并且用缓冲液洗芯片3次和用水洗2次。干燥之后,加入2份应用芥子酸(2applications of sinapinic acid)(1.0μl)并且用Ciphergen蛋白质芯片读取仪(模型PBSII)分析芯片。为了最小化数据变异性,在两天内使用随机分布在芯片上的来自全部患者组的样品进行测量。作为标准化的标准对照,对于全部测量平行使用来自一名癌患者的一份组织提取物。
SELDI-TOF-MS分析。通过使用195个激光点的平均值以激光强度为180来产生蛋白质质谱。以敏感度为6运行检测器。为了数据采集,检测大小范围在2000和40000Da之间。激光聚焦在10000Da。使用蛋白质芯片数据分析程序(版本3.1,Ciphergen Biosystems)和使用生物标记Wizard程序(版本3.1,Ciphergen Biosystems)分析数据。将峰强度标准化为总的离子流。
实施例3
数据的统计评估
对于三个患者组,通过C&RT(CART)算法基于决策树分析(Breiman,L.,Friedman,J.H.,Olshen,R.A.,& Stone,C.J.(1984)分类和退化树。Monterey,CA:Wadsworth & Brooks/Cole Advanced Books & Software)来计算截断值。计算截断值以选择和说明在不同分析组之间的极限值。用来自统计软件公司(STATSOFT INC)的STATISTICA软件Vs 7.1进行评估,用Data-Miner模数子程序标准分类树(CAndRT)(统计软件公司(2005)STATISTICA(数据分析软件系统),版本7.1.www.statsoft.com.)进行决策树分析。
基于平均值和标准差评估统计数据。此外,图6、8和9显示平均值±0.95的置信区间,说明找到希望患者组的真实平均值具有95%可能性在此置信区间内。通过T-检验(表1)进行统计评估。该检测被认为具有p-水平<0.05的显著性。whiskers盒图显示标准差。
实施例4
根据实施例1和2制备和分析来自一例腺瘤和一例结肠直肠癌患者(TNM II期)的肿瘤组织以及正常结肠组织的蛋白质样品。图5显示裂解物的SELDI-TOF蛋白质谱,所述裂解物来自正常结肠、腺瘤和肿瘤组织。在从健康到癌患者的组织中p10.3的强度显著增加。
图6显示在正常、腺瘤和结肠癌组织中p10.3(内质蛋白片段)的平均强度。根据实施例1到3分析30例结肠癌和29例腺瘤组织样品以及相应的正常结肠组织。在正常和结肠肿瘤组织中以及在正常和腺瘤组织中p10.3的平均强度的差异是统计显著的。对于肿瘤样品的区分,获得的特异性为97%和敏感度为93%。腺瘤样品的特异性为90%,具有86%的敏感度。
图8显示在相同患者群中鉴定的α-防卫素家族成员之一(峰3489)的平均强度。与正常结肠组织水平相比,在腺瘤和结肠癌组织中的平均强度显著升高。对腺瘤样品的区分获得的敏感度为52%和特异性为90%。区分肿瘤样品的各自的值为90%和89.6%。
图9显示在腺瘤组样品中峰4838的特异性升高的水平。腺瘤样品可以区别于肿瘤和正常患者样品,具有76%的敏感度和100%的特异性。
表1总结了在患者组中峰10324、4838和防卫素家族成员峰3375、3445和3489的检测的峰强度。
表1:
变量(m/z) | 有效nN | 有效nA | 有效nT | 有效nA+T | 平均值±标准误差N | 平均值±标准误差A | 平均值±标准误差T | 平均值±标准误差A+T | p-值N相对A | p-值N相对T | p-值N相对A+T | p-值A相对T |
3375 | 29 | 29 | 30 | 59 | 3.155±3.476 | 6.54±4.73 | 20.98±12.89 | 13.88±12.4 | 0.0029 | 0.0000001 | 0.000011 | 0.0000001 |
3445 | 29 | 29 | 30 | 59 | 2.66±3.28 | 5.86±5.1 | 19.79±13.26 | 12.85±12.3 | 0.01 | 0.0000001 | 0.000034 | 0.000002 |
3489 | 29 | 29 | 30 | 59 | 1.14±1.06 | 2.39±2.32 | 14.96±13.39 | 8.78±11.5 | 0.01 | 0.000001 | 0.00061 | 0.000006 |
4838 | 29 | 29 | 30 | 59 | 0.619±0.166 | 1.68±1.026 | 0.58±0.21 | 1.12±0.91 | 0.000001 | 0.49 | 0.0040 | 0.0000001 |
10324 | 29 | 29 | 30 | 59 | 0.95±0.38 | 2.37±1.24 | 3.44±1.57 | 2.91±1.5 | 0.0000001 | 0.0000001 | 0.0000001 | 0.00531 |
n:患者数
N:正常组织
A:腺癌组织
T:癌组织
在表I中的全部数据通过SELDI-TOF-MS获得
实施例5
在不同组织中p10.3的表达
为了鉴定p10.3作为结肠特异性生物标记,根据实施例1和2制备不同肿瘤组织的细胞提取物并且通过质谱法进行分析,所述不同肿瘤组织为乳腺、胃、食道、肺和前列腺。如在图7和表2中所示,可以在结肠直肠癌(I期和III期)中发现p 10.3的最高强度。但是,在食道、肺和前列腺癌以及正常组织中,内质蛋白片段以较低水平表达。
表2:在不同癌类型中p10.3的强度。裂解物在SAX蛋白质芯片_阵列上进行分析。
组织类型 | p10.3的强度 | |
乳腺 | 正常肿瘤 | 1.0020.672 |
肺 | 正常肿瘤 | 1.4311.907 |
胃 | 正常肿瘤 | 1.8491.629 |
食道 | 正常肿瘤 | 0.5060.944 |
前列腺 | 正常肿瘤 | 0.9330.852 |
结肠(I期) | 正常肿瘤 | 0.9482.830 |
结肠(III期) | 正常肿瘤 | 1.0353.283 |
从图7可见,内质蛋白片段,特别是具有表观分子量为10300Da的蛋白质片段(p10.3),是对于结肠癌高度特异性的。与乳腺、肺、胃、食道或前列腺的肿瘤相反,在健康和疾病患者之间p10.3的水平有显著不同。而且,p10.3的水平随着癌阶段(I期相对III期)而增加。
实施例6
如实施例1至3所述,分离和分析30例结肠癌和29例腺瘤组织样品以及相应的正常结肠组织,除了第二标记是使用分子量为4838Da(p4.8)或分子量为3489Da(p3.4)的蛋白质与内质蛋白片段峰组合。与第二标记蛋白质,例如4838Da(p4.8)或3489Da(p3.4)组合,实现同时从腺瘤和/或癌组织分离正常组织。使用p10.3作为第一标记和p4.8作为第二标记,29个正常组织样品中的26个(特异性90%),29个腺瘤样品中的23个(敏感度79%),以及30个癌样品中的27个(敏感度90%)被正确分离(图10A)。与峰3489组合,实现90%的特异性和对于腺瘤样品82%的敏感度且对于肿瘤样品为70%(图10B)。
结果
如在图6所示,在三组之间的内质蛋白片段的量显著不同(N=正常;A=腺瘤;T=癌)。从健康个体到结肠直肠腺瘤患者到结肠直肠癌患者,内质蛋白片段水平增加。
这些数据显示,内质蛋白片段(任选的与其他生物标记组合,例如具有分子量为4838Da(p4.8)或为3489Da(p3.4)的蛋白质)是用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的极好生物标记。
与已知的生物标记CEA和CA19-9相比,区分健康个体和腺瘤患者是可能的。此外,可能区分腺瘤患者和结肠直肠癌患者。内质蛋白片段测试具有高的敏感度和特异性,并且使能够进行腺瘤的早期特异性检测以及区分不同的肿瘤阶段。
Claims (26)
1.用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的方法,其包括步骤为:
a)提供从个体采集的分离的样品材料,
b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
2.用于区分结肠直肠腺瘤和结肠直肠癌或更多的肿瘤状态的方法,其包括步骤为:
a)提供从个体采集的分离的样品材料,
b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
3.用于监测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的发展和/或过程和/或治疗的方法,和/或用于区分不同肿瘤阶段的方法,其包括步骤为:
a)提供从个体采集的分离的样品材料,
b)确定在所述分离的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,
c)将内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
4.根据权利要求1至3的任一项的方法,其中在从结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌患者采集的所述样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平相对于健康个体的样品材料升高。
5.根据权利要求1至4的任一项的方法,其中在第一个样品材料中内质蛋白片段或其衍生物水平的第一次增加指示结肠直肠腺瘤,和其中在第二个样品材料中内质蛋白片段或其衍生物水平的第二次增加指示结肠直肠癌,条件是所述第二次增加强于所述第一次增加,所述第二个样品材料在晚于所述第一个样品材料的时间点从所述个体分离。
6.根据权利要求1至5的任一项的方法,其中在步骤(b)中在所述分离的样品材料中确定用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个更多的生物标记,和其中在步骤(c)中将确定的所述生物标记的水平与各自的一个或多个参考值进行比较。
7.根据权利要求1至6的任一项的方法,其中所述用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的更多的生物标记选自以下组成的组:
具有分子量为4838±25Da的蛋白质,
α-防卫素1、2或3、运甲状腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆及其衍生物;和
在E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因中的突变;和
MHL1或MSH2的微卫星不稳性;以及
SNP及其组合。
8.根据权利要求1至7的任一项的方法,其中内质蛋白片段和/或其衍生物的参考值和任选的更多生物标记和/或其衍生物的参考值被计算为在各个个体组的多个分离的样品中内质蛋白片段和/或其衍生物的平均水平以及任选的更多生物标记和/或其衍生物的平均水平,其中个体组是健康个体、结肠直肠腺瘤患者和/或结肠直肠癌患者。
9.根据权利要求1至7的任一项的方法,其中参考值是个体参考值,其被计算为在一段时间内从所述个体采集的多个分离的样品材料中确定的内质蛋白片段和任选的更多生物标记和/或其衍生物的平均水平。
10.根据前述权利要求的任一项的方法,其中分离的样品材料是体液或组织,并且其中体液是任选的选自血液、血浆、血清、骨髓、粪便、滑液、淋巴液、脑脊液、唾液、尿液、母乳、精液、渗出液及其混合物组成的组。
11.根据前述权利要求的任一项的方法,其中是在DNA、mRNA和/或蛋白质水平确定在所述样品材料中内质蛋白片段和/或其衍生物和任选的更多的生物标记的水平。
12.根据前述权利要求的任一项的方法,其中通过核酸杂交技术、免疫学方法或蛋白质组学技术和/或质谱法确定在所述样品材料中内质蛋白片段和/或其衍生物以及任选的更多生物标记的水平。
13.根据前述权利要求的任一项的方法,其中将该方法与用于结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的其他诊断方法组合执行以增加敏感度和/或特异性。
14.内质蛋白片段或其衍生物作为生物标记的用途,所述用途用于在个体中或在个体的分离的样品中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或区分不同的肿瘤阶段。
15.根据权利要求14的用途,其用于在个体的分离的样品中对结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的早期检测和/或区分不同的肿瘤阶段。
16.根据权利要求14或15的任一项的用途,其与结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个更多的生物标记组合以增加敏感度和/或特异性。
17.根据权利要求16的用途,其中所述至少一个更多的生物标记选自以下组成的组:
具有分子量为4838±25Da的蛋白质,
α-防卫素1、2或3、运甲状腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆及其衍生物;和
在E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突变;和
MHL1或MSH2的微卫星不稳性;以及
SNP及其组合。
18.用于在个体分离的样品材料中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或区分不同的肿瘤阶段的检测系统,其包括:
a)结合至内质蛋白片段或其衍生物的表位的抗体或受体,
b)支持所述抗体或受体的固体支持物,
c)用于检测内质蛋白片段或其衍生物的所述表位与所述抗体或受体的结合的试剂。
19.依照权利要求18的测试系统,其中所述测试系统包括一个或多个抗体或受体,其被用于结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个更多的生物标记的检测。
20.根据权利要求18或19的测试系统,其中所述至少一个更多的生物标记选自以下组成的组:
具有表观分子量为4838±25Da的蛋白质,
α-防卫素1、2或3、运甲状腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆及其衍生物;和
在E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突变;和
MHL1或MSH2的微卫星不稳性;以及
SNP及其组合。
21.包含检测分子的阵列,用于在个体中检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或区分不同的肿瘤阶段,其包含以下作为检测分子:
a)固定于固体支持物的核酸探针,其被用于结合和检测编码内质蛋白片段或其衍生物的mRNA,或
b)固定于固体支持物的抗体,其被用于结合和检测内质蛋白片段或其衍生物的表位,或
c)固定于固体支持物的受体,其被用于结合和检测内质蛋白片段或其衍生物的表位,
其中优选将不同量的检测分子固定于固体支持物以增加定量的精确度。
22.依据权利要求21的阵列,其中所述测试系统包含一个或多个抗体或受体用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌的一个或多个更多的生物标志。
23.根据权利要求22的阵列,其中所述至少一个更多的生物标记选自以下组成的组:
具有表观分子量为4838±25Da的蛋白质,
α-防卫素1、2或3、运甲状腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆及其衍生物;和
在E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突变;和
MHL1或MSH2的微卫星不稳性;以及
SNP及其组合。
24.用于确定化合物在治疗结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或特异性的肿瘤阶段是否有效的方法,其包括步骤为:
a)用化合物治疗结肠直肠腺瘤或结肠直肠癌患者,
b)确定在所述患者的样品材料中内质蛋白片段或其衍生物的水平,和
c)将确定的内质蛋白片段或其衍生物的水平与一个或多个参考值进行比较。
25.根据权利要求24的方法,其中在步骤(b)中在所述分离的样品材料中确定用于检测结肠直肠腺瘤和/或结肠直肠癌和/或用于区分不同的肿瘤阶段的一个或多个更多的生物标记,和其中在步骤(c)中将确定的所述生物标记的水平与一个或多个分别的参考值进行比较。
26.根据权利要求25的方法,其中所述至少一个更多的生物标记选自以下组成的组:
具有分子量为4838±25Da的蛋白质,
α-防卫素1、2或3、运甲状腺素蛋白、p53、C3a、CEA(癌胚抗原)、CA 19-9、CA 15-3、CA-125、Kras、β-联蛋白、Her-2/neu、C-反应蛋白血浆及其衍生物;和
在E-钙黏着蛋白、MSH2、MSH3、MLH1、PMS1、PMS2、MSH6基因的突变;和
MHL1或MSH2的微卫星不稳性;以及
SNP及其组合。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2005800513317A CN101238373A (zh) | 2005-08-19 | 2005-08-19 | 内质蛋白片段及其衍生物作为结肠直肠腺瘤和/或癌的生物标记的用途;用于检测的方法和测试系统 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2005800513317A CN101238373A (zh) | 2005-08-19 | 2005-08-19 | 内质蛋白片段及其衍生物作为结肠直肠腺瘤和/或癌的生物标记的用途;用于检测的方法和测试系统 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101238373A true CN101238373A (zh) | 2008-08-06 |
Family
ID=39921152
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2005800513317A Pending CN101238373A (zh) | 2005-08-19 | 2005-08-19 | 内质蛋白片段及其衍生物作为结肠直肠腺瘤和/或癌的生物标记的用途;用于检测的方法和测试系统 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101238373A (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102147396A (zh) * | 2010-02-10 | 2011-08-10 | 桑建利 | 人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠腺瘤诊断试剂盒制备与应用 |
CN102636648A (zh) * | 2011-02-12 | 2012-08-15 | 贝勒研究院 | Msh3的表达状态决定癌细胞对使用parp抑制剂和铂药物的化学疗法治疗的响应性 |
CN104711368A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-06-17 | 玉峰惠仁生物医药科技(北京)有限公司 | 基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒 |
WO2016127278A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 张曼 | 尿液补体c3蛋白的应用 |
CN107110865A (zh) * | 2014-08-22 | 2017-08-29 | 雅培制药有限公司 | 用于结肠直肠癌的早期检测的方法 |
-
2005
- 2005-08-19 CN CNA2005800513317A patent/CN101238373A/zh active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102147396A (zh) * | 2010-02-10 | 2011-08-10 | 桑建利 | 人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠腺瘤诊断试剂盒制备与应用 |
CN102147396B (zh) * | 2010-02-10 | 2014-01-01 | 桑建利 | 人血液样本中脂类分子含量测定及其结直肠腺瘤诊断试剂盒制备与应用 |
CN102636648A (zh) * | 2011-02-12 | 2012-08-15 | 贝勒研究院 | Msh3的表达状态决定癌细胞对使用parp抑制剂和铂药物的化学疗法治疗的响应性 |
CN107110865A (zh) * | 2014-08-22 | 2017-08-29 | 雅培制药有限公司 | 用于结肠直肠癌的早期检测的方法 |
CN107110865B (zh) * | 2014-08-22 | 2020-01-10 | 雅培制药有限公司 | 用于结肠直肠癌的早期检测的方法 |
WO2016127278A1 (zh) * | 2015-02-10 | 2016-08-18 | 张曼 | 尿液补体c3蛋白的应用 |
CN104711368A (zh) * | 2015-04-13 | 2015-06-17 | 玉峰惠仁生物医药科技(北京)有限公司 | 基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4592753B2 (ja) | 結腸直腸腺腫及び/又は癌腫に対するバイオマーカーとしてのC3a及びその誘導体の使用;検出方法及び試験システム | |
JP6630766B2 (ja) | 膵臓癌診断用組成物およびこれを用いた膵臓癌診断方法 | |
WO2012019300A1 (en) | Endometrial cancer biomarkers and methods of identifying and using same | |
AU2015360420B2 (en) | Methods for detection and treatment of colorectal cancer | |
US20160313343A1 (en) | SRM Assay for PD-L1 | |
CN101238373A (zh) | 内质蛋白片段及其衍生物作为结肠直肠腺瘤和/或癌的生物标记的用途;用于检测的方法和测试系统 | |
US8580489B2 (en) | Use of an endoplasmin fragment and derivatives thereof as biomarker for colorectal adenoma and/or carcinoma; method for detection and test system | |
KR102330205B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102499664B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102316892B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102325731B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102280360B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102280672B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102433983B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
KR102325742B1 (ko) | 암의 진단용 조성물 | |
US20230074311A1 (en) | Composition for cancer diagnosis | |
US20190219549A1 (en) | SRM/MRM Assay For The Tubulin Beta-3 Chain (TUBB3) Protein | |
KR20210109725A (ko) | 암의 진단용 조성물 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080806 |