CN104711368A - 基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒 - Google Patents

基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒 Download PDF

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CN104711368A CN201510172505.0A CN201510172505A CN104711368A CN 104711368 A CN104711368 A CN 104711368A CN 201510172505 A CN201510172505 A CN 201510172505A CN 104711368 A CN104711368 A CN 104711368A
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张利清
官民晓
刘蕊芳
焦淑静
王弢
何素莉
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Yufeng Biomedical Science And Technology (beijing) Co Ltd
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Abstract

本发明公开了基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括SEQ NO：1～SEQ NO：272的引物。本发明能够检测肠癌相关10个基因245个易感SNP位点，对肠癌相关易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对肠癌易感人群，尤其是具有肠癌家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。

Description

基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及高发遗传性肠癌易感基因无创检测的试剂盒。
背景技术
近年来，我国恶性肿瘤的发病率呈现明显的上升趋势，相比于70年代中期增加了83.1％。统计数据显示，我国平均的患癌率为286/10万人，死亡数达到181/10万人，这就意味着我国每年新发的癌症病例达235万人，每分钟就有6个人被诊断为癌症。研究表明，癌症的形成与外界环境、生活习惯以及自身遗传等多个因素有关，其中遗传因素约占到癌症发病人群的10％左右。遗传性的癌症主要分为两类，一种是将癌症遗传给下一代，常见的有肾母细胞瘤、视网膜母细胞瘤，它们都属遗传性疾病，由异常的基因决定，80％～90％带有这些异常基因的后代将患这类癌症；另一种是将患癌的风险遗传给下一代，对于这种情况，子女携带的突变基因意味患某种肿瘤风险和可能性相比于不携带突变基因的正常人大大增加。肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，肠癌的发病率男女均处于恶性肿瘤的第3位，其中在西方发达国家，肠癌的发病率处于第2位。根据国际癌症研究组织(IARC)2005年提供的数据显示，在一些相对发达的西亚国家，肠癌的发病率呈现快速增长趋势，其肠癌的发病率与西方国家非常接近。在日本男性肠癌年龄标准化发病率为49.3/10万，韩国为24.7/10万，新加坡为35.1/10万，而在北美和西欧则分别为44.4/10万和42.9/10 万。在我国，随着生活水平的不断提高，饮食习惯的改变，肠癌的发病率呈上升态势，排在恶性肿瘤和致死因素的第4位，并且中国的结直肠癌每年发病递增速度为世界平均数的两倍。我国肠癌的高发区主要是长江三角洲地区、珠江三角洲地区以及港澳台地区，苏浙沪三地是最高发区。在发病年龄上，我国肠癌的平均发病年龄逐渐增大，已从20世纪60年代的48岁上升到90年代的55岁，这可能与中国社会的人口老龄化有关。已发现达到50岁者，其罹患肠癌的风险明显增加，并且每增长10岁其风险增加1倍。然而，青年患者中恶性程度较高的黏液腺癌和印戒细胞癌的比例显著高于老年患者。
结肠癌的发生是遗传和环境因素长期相互作用的结果，是由结肠粘膜的病变(非典型增长腺瘤等)演变而来。研究表明，结肠癌的形成可能需要10年的时间，仅从内镜下可辨认的腺瘤发展成侵袭性癌就需要5年左右的时间。早期结肠癌可无症状，但早期的结肠癌是可以治愈的，而进展期的结肠癌则预后较差，术后5年生存率仅60％左右。结肠癌的早期诊断已不再是仅仅发现体积较小的癌肿，而是可以诊断刚形成或发生癌变的结肠癌。及时发现可治愈的癌前病变或早期癌具有相当重要的临床意义。
目前，基因诊断技术的发展为大肠癌早期诊断提供了可能性。分子生物学研究显示：大肠癌的发生涉及多种癌基因的激活及抑癌基因的失活，在肿瘤克隆形成过程中，基因改变早于形态改变，对这些基因及其产物进行检查，将有助于早期诊断。在人群普查开展得比较好的国家，结直肠癌死亡率相对较低，例如英国、丹麦、瑞典等国家。提高早期诊断率是提高结直肠癌患者存活率的关键。此外高危人群应视为结直肠癌筛查的重点人群，但自然人群普查是发现早期结直肠癌 的最有效的方法之一，既可以提高患者的长期生存率，又可以降低发病率。
研究表明大肠癌是一种遗传倾向比较明显的恶性肿瘤，其发病既受遗传因素的影响又受环境因素的控制。遗传性非息肉病性大肠癌(HNPCC)主要与遗传因素有关，呈常染色体显性遗传，外显率高达70％-80％。它发病的分子遗传学基础是一系列错配修复(MMR)基因的种系突变所致，其中hMLH1和hMSH2在HNPCC的发病中起主要作用，占所有突变的90％。该基因的表达产物错配修复蛋白是一种核酸水解酶，可以水解DNA复制过程中错配的碱基对以及可能出现的小片段的碱基插入和缺失，从而保证DNA复制的准确无误，使人类遗传的稳定性和保守性得以实现。此种基因一旦发生突变，错配修复蛋白的表达量就会减少或缺失，结果使DNA复制过程中错配的碱基对增加，表现为DNA简单重复序列的扩增或缺失，即微卫星不稳定性(MSI)，从而导致肿瘤的发生。MSI可以说是MMR基因突变的表现型，hMLH1和hMSH2的蛋白表达和MSI可以间接地反映MMR基因突变情况。我国每年有近数十万人被诊断出遗传性癌症，其中大多数人被诊断出时已经是癌症晚期，错过了最佳的治疗时间，因此，对遗传性癌症的早发现和早治疗是提高肿瘤患者生存率的最重要的途径，其中早期诊断是关键，是提高肿瘤患者的治愈率，延长生存期的首要环节。
目前，市场上对于遗传性肿瘤的诊断方法多数停留在单个肿瘤单个或几个位点的检测水平，检测方法多为荧光PCR、芯片法等方法，这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、引物或探针设计复杂、结果不易判读、重复性差、假阳性和假阴性多，联合基因数目较少、 通量低等问题，难以满足目前检测样本数量大，检测位点多、分布广、检测准确性高等检测要求，因此急需一种新型的检测手段以满足市场和医疗的需求。
发明内容
本发明提供了一种基于Life Technologies公司的IonTorrent PGM二代测序平台对国内发病率较高的遗传性肠癌的10个易感基因热点SNP位点无创检测的试剂盒，该试剂盒检测通量高、灵敏度高、特异性强，一次检测能够覆盖245个热点SNP位点。
为实现上述技术目标，本发明的技术方案是基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括SEQ NO：1～SEQ NO：272的引物；
所述SEQ NO：1～SEQ NO：272的引物见表1。
所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括：Master Mix 11μl、包含所述SEQ NO：1～SEQ NO：272引物的引物panel 5.5μl、待测DNA样品4.5μl。
所述SEQ NO：1～SEQ NO：272引物在引物panel的浓度均为100nM。
优选的，所述Master Mix组成为：PCR buffer(5×)4μl、MgCl2 1.5μl、Taq酶1.5μl、ddH2O 4μl。
优选的，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒的PCR反应条件为：首先92～97℃预变性3～10分钟；然后聚合酶链式反应扩增阶段：92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～ 30s，70～75℃延伸10～20s，并进行10～15个循环。
本发明的检测基因为MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、MUTYH、TP53、STK11、CDH1和CHEK2基因，包括其外显子和内含子中热点SNP位点，例如MLH1基因chr3：63751244(rs37083760)，MUTYH基因位点chr1：45797202(rs121908382)，APC基因chr5：112173656(398123117)等245个易感SNP位点(见表2)。
本发明用于测序和文库构建的步骤为：待测DNA样品采用多重PCR酶进行扩增后构建文库与阴性样品、质控品一起进行大规模平行测序(二代测序)，仪器获得的结果经数据处理和生物信息学分析，得出样本中含有的SNP位点等信息。
质控品为加入的1％control particles，是一种商品化试剂，包含在上机测序的试剂盒PGM Sequencing OT2kit中，作为上机测序实验的内参，对测序情况进行评估和质控，如果测序结果中不包含1％的control particles结果，说明上机实验失败，结果不可靠。
待测DNA样品为人类基因组DNA，包括人类细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。
多重PCR过程同时进行阴性对照实验，所用阴性样本为正常人基因组DNA。
本发明组合物中的引物是针对国内发病率较高的遗传性肠癌10个易感基因热点SNP位点的特定序列进行设计。引物偏向性扩增的程度低，各引物之间相互干扰性小，特异性强，扩增效果好。这些引物以混合物形式溶解于一管中，在实验中同时加入。
测序反应体系的组成为：DNA模板多重PCR反应、模板文库构建、上机模板准备和富集反应、上机测序反应和测试数据处理分析。
上机模板准备和富集反应过程包括模板油包水扩增和阳性模板富集，所述两个过程中试剂组成包括Ion PGM Beads、PGM Template OT2 Solutions、1％control particle等、仪器组成主要包含Ion OneTouch和Ion OneTouch ES。上机模板准备和上机过程中用到的试剂和耗材与Ion Torrent二代测序平台相配套，包括PGM Template OT2 kit、PGM Sequencing OT2 kit、Ion 318chip等部分。上机反应获得的数据结果通过序列筛选、拼接和比对等方法以及生物信息学分析，最终获得测试样本的SNP位点信息。
上机测序反应过程包括PGM测序反应过程，其原理是利用半导体技术来检测合成过程中核苷酸掺入时释放的质子，以此测定DNA的碱基序列。
模板文库构建过程包括末端补平修复、末端连接测序接头、模板扩增和纯化，所述反应体系中包含0.2-1U末端补平酶、0.2-1U连接酶、0.2-1U扩增Taq酶、10-50mM测序接头A和P1、10-20mM测序接头A和P1通用引物、1-10×Buffer和0.2-1.8×Ampure纯化磁珠等试剂。
所述检测结果数据处理、生物信息学分析得出检测基因的特定SNP位点情况。
测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过数据的处理最终获得检测样本SNP位点的信息。
本发明具备检测通量高、灵敏度高、特异性高的特性，灵敏度可以达到0.01％，样本的DNA浓度可以低至0.1-1ng/μl。
SEQ NO：1～SEQ NO：272的引物序列如表1所示。
表1 10个基因易感SNP位点检测引物序列
测试数据处理分析包括测序数据的转换、拼接、质控和突变位点分析等过程，通过数据的处理最终获得检测样本SNP位点的信息。
本发明待检测易感SNP位点如下： 
表210个基因的易感SNP位点
Gene RS_ID location Gene RS_ID location Gene RS_ID location
MUTYH 587776618 chr1：45796869 MLH1 63750489 chr3：37061817 MSH6 267608055 chr2：48026421
MUTYH 36053993 chr1：45797228 MLH1 63750796 chr3：37061871 MSH6 63751405 chr2：48026426
MUTYH 77542170 chr1：45797760 MLH1 63750710 chr3：37061902 MSH6 63750741 chr2：48026468
MUTYH 140342925 chr1：45798117 MLH1 63750533 chr3：37061910 MSH6 63750854 chr2：48026543
MUTYH 200495564 chr1：45798118 MLH1 63750434 chr3：37061923 MSH6 63750909 chr2：48026566
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TP53 121912664 chr17：7574017 MLH1 63751715 chr3：37061954 MSH6 63751234 chr2：48026724
TP53 149633775 chr17：7577091 MLH1 63749965 chr3：37067239 MSH6 267608049 chr2：48026736
TP53 28934574 chr17：7577094 MLH1 63750760 chr3：37067242 MSH6 267608064 chr2：48026754
TP53 28934574 chr17：7577094 MLH1 63750749 chr3：37067279 MSH6 63749874 chr2：48026756
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STK11 137853080 chr19：1207057 MLH1 63750899 chr3：37090053 MSH2 267607694 chr2：47698109
STK11 137854584 chr19：1207081 MLH1 63750610 chr3：37090054 MSH2 63750633 chr2：47698118
STK11 398123404 chr19：1207081 MLH1 281864938 chr3：37090057 MSH2 63750406 chr2：47698125
STK11 397518441 chr19：1207109 MLH1 63751301 chr3：37090064 MSH2 63750737 chr2：47698138
STK11 137853077 chr19：1207112 MLH1 63750726 chr3：37090072 MSH2 63751149 chr2：47698141
STK11 137853075 chr19：1221236 MLH1 63750115 chr3：37090082 MSH2 63750474 chr2：47698142
 
STK11 587776659 chr19：1221311 MLH1 63751310 chr3：37090086 MSH2 63750393 chr2：47698147
STK11 587776656 chr19：1221320 MLH1 63750131 chr3：37090086 MSH2 281864941 chr2：47698147
STK11 398123405 chr19：1221962 MLH1 267607879 chr3：37090101 MSH2 267607974 chr2：47698159
STK11 587776661 chr19：1221976 MLH1 267607879 chr3：37090101 MSH2 63751298 chr2：47698162
STK11 587776660 chr19：1221993 MLH1 267607879 chr3：37090101 MSH2 63751299 chr2：47698162
STK11 398123406 chr19：1222983 MSH6 63750342 chr2：48018231 MSH2 63751411 chr2：47698180
STK11 397518443 chr19：1222999 MSH6 267608036 chr2：48018264 MSH2 63751140 chr2：47698201
STK11 59912467 chrl9：1223125 MSH6 267608035 chr2：48023032 MSH2 267607976 chr2：47698203
CHEK2 200432447 chr22：29083962 MSH6 63749873 chr2：48023042 MSH2 267607976 chr2：47698203
CHEK2 121908701 chr22：29121015 MSH6 267608037 chr2：48023097 MSH2 63750103 chr2：47702164
CHEK2 137853010 chr22：29121016 MSH6 193922344 chr2：48023128 MSH2 63750844 chr2：47702168
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CHEK2 17879961 chr22：29121087 MSH6 1800937 chr2：48025764 MSH2 63750200 chr2：47702181
CHEK2 121908698 chr22：29121230 MSH6 1800937 chr2：48025764 MSH2 63750113 chr2：47702183
CHEK2 137853007 chr22：29121242 MSH6 63750955 chr2：48025773 MSH2 267607691 chr2：47702185
CHEK2 28909982 chr22：29121326 MSH6 63750996 chr2：48025828 MSH2 63749831 chr2：47702190
CHEK2 17883862 chr22：29130456 MSH6 63750019 chr2：48025840 MSH2 63750495 chr2：47702192
CHEK2 141568342 chr22：29130520 MSH6 267608066 chr2：48025852 MSH2 63750047 chr2：47702205
CHEK2 137853008 chr22：29130661 MSH6 63749980 chr2：48025864 MSH2 267607985 chr2：47702212
MLH1 111052004 chr3：37035040 MSH6 267608048 chr2：48025877 MSH2 63751129 chr2：47702213
MLH1 63751131 chr3：37035082 MSH6 267608072 chr2：48025884 MSH2 63750493 chr2：47702239
MLH1 267607712 chr3：37038108 MSH6 63750552 chr2：48025936 MSH2 267607984 chr2：47702257
MLH1 267607713 chr3：37038114 MSH6 63750439 chr2：48026312 MSH2 63750312 chr2：47702261
 本发明具有以下优点：(1)特异性强：针对特定SNP设计引物，获得10个基因特定位置附近的全部碱基序列，特异性极强；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.01％；(3)检测通量高，一次反应可以检测254个易感位点；(4)结果判读明确客观，检测结果直接反映碱基序列，判读结果更直观明确；(5)安全，整个体系不包含有毒有害物质，对试验人员以及环境都无危害。
本发明综合了对肠癌具有检测意义的10个基因上的易感SNP位点，对各引物的序列以及实验反应体系进行优化，显示出检测能力的强大优势，不仅使得检测简单易行，而且具有较高的准确度、特异性以及可重复性，对肠癌相关易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对肠癌易感人群，尤其是对具有肠癌家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。
附图说明
图1是样本文库构建完整性分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1：肠癌病人热点基因突变筛选
一、实验材料 
1.本实验中涉及的20例临床血液样本来自浙江大学医学院附属第一医院。样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。
2.所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。
3.所有试剂购买自正规厂家：多重PCR酶(KAPA公司)、Ampure磁珠(Beckm an Coulter公司)、PGM Template OT2 kit、PGM Sequencing OT2 kit(Life Technologies公司)。
二、主要仪器 
IonTorrent PGM测序仪、Qubit2.0荧光定量仪、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。
三、实验设计 
检测15例正常人血液样本和5例有肠癌家族史患者易感SNP位点，根据检测结果确定SNP位点的类型。 
四、反应体系及程序
1.根据实验室现有实验基础和经验研究，及参考IonTorrent PGM上机测试的操作规程和多重PCR扩增要求，制定的多重反应体系如下：Master Mix 11μl、包含SEQ NO：1～SEQ NO：272引物的引物panel 5.5μl、待测基因4.5μl。
Master Mix组成为：PCR buffer(5×)4μl、MgCl2 1.5μl、Taq酶1.5μl、ddH2O 4μl。
2.根据以上反应体系进行多重PCR扩增反应程序：95℃预变性3分钟，聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性15s，60℃退火30s， 72℃延伸20s，并进行13个循环。实验完成后，对实验结果进行数据处理与分析。
3.多重反应完成后进行文库构建和上机测试，模板文库构建过程包括末端补平修复、末端连接测序接头、模板扩增和纯化，所述反应体系中包含0.2-1U末端补平酶、0.2-1U连接酶、0.2-1U扩增Taq酶、10-50mM测序接头A和P1、1-10×Buffer和0.2-1.8×Ampure纯化磁珠等试剂。
文库构建过程中使用的Ampure磁珠用量为：末端补平后进行纯化的磁珠为70μl体系中加入120μl的Ampure磁珠；连接接头后的纯化步骤，70μl反应体系中加入70μl的Ampure磁珠；两步法片段选择过程中，第一步200bp左右的片段及100μl反应体系中加入90μl的Ampure磁珠，第二步产物中加入20μl的Ampure磁珠；扩增后纯化步骤中，50μl的体系加入70μl的Ampure磁珠。纯化后的产物按照操作规程进行上机测试。
文库构建具体步骤如下：
1.末端补平修复：末端补平酶混合物20μl和DNA模板50μl混合后20℃孵育30min；
2.末端补平后纯化步骤：加入120μl Ampure纯化磁珠吸附DNA片段，80％乙醇洗两次后晾干加水溶解；
3.测序接头连接步骤：测序接头A和P1各10μl与20μl补平后的产物混合，20℃孵育15min，随后65℃孵育5min；
4.连接完成后采用不同浓度的Ampure磁珠进行纯化和片段选择；
5.模板扩增：在体系中加入纯化后的产物20μl，扩增Taq酶混合物25μl，通用引物5μl进行PCR扩增。反应程序为95-98℃30-45s 预变性；95-98℃ 10-15s，60-65℃ 20-40s，68-72℃ 20-45s循环8-12次扩增；68-72℃ 50-60s，4℃保存；
6.扩增后纯化：扩增产物中加入70μl Ampure磁珠进行吸附，80％乙醇洗两次后晾干加水溶解。
图1是文库构建完成后的片段分布图，横坐标代表片段的长度，纵坐标代表片段的浓度(含量)。由图可见，扩张产物主要集中在110-250bp左右，与预期的设计相符合。其中115bp浓度为147.94pg/ul，139bp浓度为24.88pg/ul，161bp浓度为5.3pg/ul，169bp浓度为9.24pg/ul，176bp浓度为15.96pg/ul，189bp片段浓度为60.92pg/ul，201bp片段浓度为47.67pg/ul，217bp片段浓度为33.02pg/ul，226bp片段浓度为33.43pg/ul，237bp片段浓度为10.00pg/ul。
五、实验结果与分析
实验结束以后，对获得的测序数据进行分析，根据软件分析的结果，筛选出与参考基因组hg19不同的位点。通过比对设计的引物panel和位点信息，筛选出PALB2基因上SNP位点。参考基因组hg19是人类(Homo sapiens)标准参考基因组(GRCh37/hg19)，是国际通用作为筛选目标序列突变位点或SNP位点的参考基因序列，NCBI GenBank assembly accession：GCA_000001405.1。
表3是上机测试后，经过序列剪切、拼接以及位点分析等数据分析处理，获得的初步的突变位点概况表。
表3样本上机测试数据分析表
根据收集的样本检测情况，按照阴性样本的结果去除正常的SNP位点，5例结直肠癌家族史患者在10个易感基因上共检测出11个易感SNP位点，正常人未检测出所述易感SNP位点，结果如表4所示。
表4 5例结直肠癌家族史患者检测结果
SNP位点名称 Gene RS_ID 染色体 Location
NM_000249.3(MLH1)：c.1038+1G＞C MLH1 267607816 3 37061955
NM_000249.3(MLH1)：c.210_213delAGAA(p.Glu71Ilefs) MLH1 267607723 3 37042448
NM_000251.2(MSH2)：c.484G＞A(p.Gly162Arg) MSH2 63750624 2 47637350
NM_000251.2(MSH2)：c.929T＞C(p.Leu310Pro) MSH2 63750640 2 47641544
NM_000179.2(MSH6)：c.3984_3985insATCA(p.Ser1329Ilefs) MSH6 267608124 2 48033773
NM_000179.2(MSH6)：c.3939_3957dup19(p.Ala1320Serfs) MSH6 63750767 2 48033728
NM_000038.5(APC)：c.2138C＞G(p.Ser713Ter) APC 137854570 5 112173429
NM_001128425.1(MUTYH)：c.934-2A＞G MUTYH 77542170 1 45797760
NM_001128425.1(MUTYH)：c.312C＞A(p.Tyr104Ter) MUTYH 121908380 1 45799121
NM_000546.5(TP53)：c.637C＞T(p.Arg213Ter) TP53 397516436 17 7578212
NM_000546.5(TP53)：c.844C＞G(p.Arg282Gly) TP53 28934574 17 7577094
 本发明检测的结果与临床检测结果一致，肠癌家族史患者在表中的热点SPN位点上有突变，而正常人群则没有。这也表明肠癌家族史患者患有肠癌的风险较正常人高，本发明可以较好地作为肠癌早期发现和治疗的辅助手段。
本发明对肠癌易感SNP位点具有检测通量高、特异性强、不易污染、安全性高的优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，对肠癌易感人群，尤其是对具有肠癌家族遗传史的人群有一定的辅助诊断和提示作用。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括SEQ NO：1～SEQ NO：272的引物；
所述SEQ NO：1～SEQ NO：272引物的序列如下：
2.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒包括：Master Mix 11μl、包含所述SEQ NO：1～SEQ NO：272引物的引物panel 5.5μl、待测DNA样品4.5μl。
3.根据权利要求2所述的基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒的PCR反应条件为：首先92～97℃预变性3～10分钟；然后聚合酶链式反应扩增阶段：92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～20s，并进行10～15个循环。
4.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒，其特征在于，所述基于二代测序技术的无创多基因遗传性肠癌检测试剂盒的检测基因为MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、APC、MUTYH、TP53、STK11、CDH1和CHEK2基因。
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