CN113249484B - 一组基因的突变数量作为前列腺癌生物标志物的检测应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组基因的突变数量作为前列腺癌生物标志物中的检测应用。本发明发现血浆cfDNA中TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1、FGFR2、PIK3CA、SPOP、AKT1、ARAF、ARID1A、BRAF、BRCA1、C11orf65、GNAS、IDH1、KRAS、MET、MYD88、NTRK1、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4基因中突变基因的数量与前列腺癌转移状态和分期相关，可以通过检测该组基因中突变基因的数量评估患者的前列腺癌转移状态和分期。本发明相比于组织活检诊断具有非侵入性、便捷迅速的优点，为前列腺癌的临床诊断提供了一种全新的手段。

Description

一组基因的突变数量作为前列腺癌生物标志物的检测应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及一组基因的突变数量作为前列腺癌生物标志物的检测应用。
背景技术
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一。美国癌症协会估计，到2020年，新诊断的前列腺癌病例为191,930例，占男性肿瘤的20％，在男性癌症中排名第一；死亡33,330例，在男性癌症中排名第二。前列腺癌通常在早期是无症状的，并且大多通过PSA的血液测试来诊断，并结合磁共振成像(magnatic resonance imaging,MRI)和直肠指检。PSA是一种已广泛使用20多年的生物标志物，但是，血清PSA是器官特异性而不是癌症特异性，并且PSA水平也会随着良性前列腺增生和前列腺炎而升高。据报道，检测前列腺癌的特异性仅约30％。另外，用于分析原发性和转移性病变的组织活检是有效的，但具有侵入性，并且受单个病变异质性的限制。因此，迫切需要用于前列腺癌的早期诊断、预防和治疗的替代生物标志物。
作为组织活检的替代方法，1974年首次描述了液态活检，以研究关节腔中滑液对滑膜炎的诊断价值。近年来，液态活检已通过分析血液样本中的循环的肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)来预测治疗的反应性、耐药性和疾病复发。通常，肿瘤细胞会不断脱落在患者体内，释放出可能进入血液循环的DNA和蛋白质等细胞成分。因此，来自肿瘤患者的外周血可能含有ctDNA和携带肿瘤基因组信息的循环肿瘤细胞(circulatingtumor cell,CTC)，这些信息可能反映了肿瘤的负荷和进展。
先前的研究表明，原发组织和ctDNA具有相同的体细胞变化，这表明ctDNA可用于转移性去势敏感性前列腺癌的分子亚型分析。此外，据报道，在大多数转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)病例中，ctDNA分析足以识别匹配组织中出现的所有驱动程序DNA改变，这表明仅基于ctDNA分析即可指导mCRPC患者的治疗。一般来说，在实践中，液态活检分析可以指导雄激素受体(androgen receptor,AR)靶向治疗的使用。最有趣的是，还可以在尿液中检测到DNA片段。尿液上清液中Y染色体SRY基因片段的检测最早报道于1999年，这表明了基于尿液的DNA生物标记物的潜在用途。十年后，在肾脏中从尿液中检测出经肾脏过滤的经肾DNA(transrenal DNA,tr-DNA)，并确认其为无细胞DNA(cell-free DNA,cfDNA)。由于采集尿液分析肿瘤DNA是无创的，因此对患者更加友好。
液态活检已越来越多地用于临床。但是，基于血液的ctDNA和尿ctDNA的诊断价值尚未得到充分验证。也未能确定循环核酸是否可以用作一般性前列腺癌的生物标志物。更未见利用如本申请所述的一组循环核酸基因作为前列腺癌生物标志物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一组基因的突变数量作为前列腺癌生物标志物的检测应用。
第一方面，本发明提供了一组试剂在制备评估前列腺癌转移状态的试剂盒中的应用，所述试剂用于检测血浆cfDNA中TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1、FGFR2、PIK3CA、SPOP、AKT1、ARAF、ARID1A、BRAF、BRCA1、C11orf65、GNAS、IDH1、KRAS、MET、MYD88、NTRK1、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4基因中发生突变的位点的数量，其中，当基因存在以下任一或几种突变时被认为所述基因的位点发生了突变：
Figure BDA0003128901550000021
Figure BDA0003128901550000031
优选地，所述试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片、蛋白质芯片或其组合。
第二方面，本发明提供了一组试剂在制备评估前列腺癌分期的试剂盒中的应用，所述试剂用于检测血浆cfDNA中TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1、FGFR2、PIK3CA、SPOP、AKT1、ARAF、ARID1A、BRAF、BRCA1、C11orf65、GNAS、IDH1、KRAS、MET、MYD88、NTRK1、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4基因中发生突变的位点的数量，其中，当基因存在以下任一或几种突变时被认为所述基因的位点发生了突变：
Figure BDA0003128901550000032
Figure BDA0003128901550000041
优选地，所述试剂选自下组：抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片、蛋白质芯片或其组合。
第三方面，本发明提供了一种评估前列腺癌转移状态或分期的试剂盒，所述试剂盒包含检测血浆cfDNA中TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1、FGFR2、PIK3CA、SPOP、AKT1、ARAF、ARID1A、BRAF、BRCA1、C11orf65、GNAS、IDH1、KRAS、MET、MYD88、NTRK1、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4基因中发生突变的位点的数量，其中，当基因存在以下任一或几种突变时被认为所述基因的位点发生了突变：
Figure BDA0003128901550000042
Figure BDA0003128901550000051
本发明优点在于：
本发明证实了循环核酸可以用作一般性前列腺癌的生物标志物，并进一步发现血浆cfDNA中TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1、FGFR2、PIK3CA、SPOP、AKT1、ARAF、ARID1A、BRAF、BRCA1、C11orf65、GNAS、IDH1、KRAS、MET、MYD88、NTRK1、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4基因中突变位点的数量与前列腺癌转移状态和分期相关，可以通过检测该组基因中突变位点的数量评估患者的前列腺癌转移状态和分期。本发明相比于组织活检诊断具有非侵入性，对患者更加友好，而且更加便捷迅速，提高了诊断的效果。相比于目前的前列腺癌临床诊断方式，是一种全新的诊断方法。
附图说明
图1-3，6：血浆cfDNA突变概况以及血浆cfDNA中检测到的突变数与前列腺癌的临床特征之间的关系。(图1)前列腺癌和前列腺增生的cfDNA突变图。黑色表示突变；灰色表示热点突变，即COSMIC数据库中定义为发生次数大于20的突变。(图2)前列腺癌和良性前列腺增生中的突变数。(图3)前列腺癌和良性前列腺增生中的突变等位基因频率。(图6A)突变数量和转移状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算p值。(图6B)突变数量与肿瘤分期的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(图6C)突变数量与未治疗状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(图6D)突变数量与PSA的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。(图6E)突变数与Gleason评分的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(图6F)突变数量和年龄的关联。通过Spearman的等级相关系数计算p值。每个点表示一个样本。
图4-5：血浆cfDNA中检测到的突变等位基因频率(MAF)与前列腺癌的临床特征之间的关联。(图4A)MAF与转移状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(图4B)MAF和未接受过治疗的状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(图5A)MAF和Gleason评分的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(图5B)MAF与肿瘤分期的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(图5C)MAF和PSA的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。(图5D)MAF和年龄的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。每个点表示一个样本。
图7：PSA与前列腺癌临床特征的关联。(A)PSA在前列腺癌和前列腺增生中的作用。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(B)PSA与转移状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(C)PSA与未治疗状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算p值。(D)PSA和Gleason评分的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(E)PSA与肿瘤分期的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(F)PSA与年龄的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。每个点表示一个样本。
图8：本研究中血浆cfDNA样本和MSK-IMPACT临床测序队列中前列腺癌组织样本基因突变发生率的检测。
图9：在治疗过程中血浆样品中突变等位基因频率的动态变化。(A)病例1患者的血浆样本。(B)来自病例2患者的血浆样品。基线表示治疗前从患者收集的血浆样品。
图10：尿液中前列腺癌的突变情况。(A)前列腺癌和前列腺增生中的突变数。(B)前列腺癌和增生中的突变等位基因频率。每个点表示一个样本。
图11：尿液cfDNA中检测到的突变数与前列腺癌的临床特征之间的关联。(A)突变数目和转移状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(B)突变数量与未治疗状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(C)突变数和Gleason评分的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(D)突变数量与肿瘤分期的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(E)突变数量与PSA的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。(F)突变数目和年龄的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。每个点表示一个样本。
图12：尿cfDNA中检测到的突变等位基因频率(MAF)与前列腺癌的临床特征之间的关联。每个点表示一个样本。(A)MAF与转移状态的关联。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(B)MAF和未接受过治疗的状态。通过Mann-Whitney U检验计算P值。(C)MAF和Gleason评分的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(D)MAF与肿瘤分期的关联。通过Kruskal-Wallis检验计算P值。(E)MAF和PSA的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。(F)MAF和年龄的关联。通过Spearman的等级相关系数计算P值。每个点表示一个样本。
图13：本研究中尿液cfDNA样本和MSK-IMPACT临床测序队列中前列腺癌组织样本中的基因突变患病率。
图14-16：尿液和血浆中cfDNA的比较。(图14)来自前列腺癌患者的尿液(左)和血浆(右)样品的突变情况。一些仅具有一个突变的基因未在图中显示。(图15A)在患有前列腺癌的患者的成对的尿液和血浆样品中检测到的突变等位基因频率。(图15B)在成对的尿液和血浆样品中检测到的匹配突变的突变等位基因频率。(图16)前列腺癌(前列腺癌)和良性前列腺增生(良性前列腺增生)患者尿液和血浆样品中突变的情况。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
1材料和方法
1.1临床标本
从2017年3月至2018年11月在复旦大学金山医院共收集了33例前列腺癌患者和15例良性前列腺增生患者的样本。患者的随访时间为2017年3月至2020年12月。本研究已获得金山医院伦理委员会批准(批准编号IEC-2020-S27)。
1.2组织样本的病理学检查
基于PSA水平、经直肠前列腺穿刺活检和组织病理学检查对前列腺癌作出诊断。所有前列腺组织标本均在金山医院病理科接受病理检查。根据世界卫生组织(WHO)分类和美国癌症联合委员会(AJCC)手册(第八版)，由经验丰富的病理学家和泌尿科医师进行包括组织学等级和TNM分期在内的临床诊断。
1.3液体样品制备和无细胞DNA提取
将外周血收集在EDTA真空管中，并在2小时内进行处理。以1000×g的速度离心15分钟，收集血浆并在-80℃下保存，然后再进行cfDNA提取。为了收集尿液样本，开发了一种尿液收集套件，以维护尿液cfDNA的完整性并促进尿液样本的运输。通过尿液收集杯收集晨尿，并将其转移到四个真空管中，在此处将尿液样品与预填充的保存缓冲液充分混合。
1.4基于下一代测序(NGS)的液态活检
cfDNA测序和生物信息学分析是根据以前发表的方法进行的(Fettke H,Kwan EM,Docanto MM,Bukczynska P,Ng N,Graham LK,et al.Combined Cell-free DNA and RNAProfiling of the Androgen Receptor:Clinical Utility of a Novel MultianalyteLiquid Biopsy Assay for Metastatic Prostate Cancer.Eur Urol 2020；78:173-80；Kohli M,Tan W,Zheng T,Wang A,Montesinos C,Wong C,et al.Clinical and genomicinsights into circulating tumor DNA-based alterations across the spectrum ofmetastatic hormone-sensitive and castrate-resistant prostatecancer.EBioMedicine 2020；54:102728)。使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)分别从血浆和尿液样品中提取血浆和尿cfDNA。最多使用20ng提取的cfDNA或40ng片段化的gDNA进行文库构建，然后对扩增的文库进行基于氢化物的靶标板(PredicinePLUS，室内板)捕获。将该文库加载到Illumina HiSeqX 10中，进行2×150bp的双末端测序。
测序数据通过内部标准进行突变分析。“突变”的标准被定义为：血浆标本中，突变的等位基因占比大于所有测序读数的0.1％并且有至少4个不同的单独读数；尿液标本中，突变的基因占比大于所有测序读数的0.5％并且有至少4个不同的单独读数。
1.5MSK-IMPACT数据集
MSK-IMPACT(Zehir A,Benayed R,Shah RH,Syed A,Middha S,Kim HR,etal.Mutational landscape of metastatic cancer revealed from prospectiveclinical sequencing of10,000patients.Nature medicine 2017；23:703-13)数据库中含有504名前列腺癌患者的数据，可以在网站上下载。
1.6PSA、血红蛋白、肌酐、白蛋白、葡萄糖的血液检查
使用Access Hybritech PSA试剂盒测试血清PSA水平。PSA的正常浓度为0到4ng/mL。使用月桂基硫酸钠-血红蛋白(SLS-Hb)方法测定血红蛋白水平。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测肌酐水平。使用溴甲酚绿测试白蛋白水平。使用己糖激酶紫外比色法测试葡萄糖水平。
1.7镜下血尿
当尿液外观没有明显变化，且离心后在显微镜每个高倍视野中沉淀的细胞样品有3个以上的红细胞时，可诊断为显微镜下血尿。
1.8计算机断层扫描(CT)扫描
使用64探测器行扫描仪进行CT扫描。截面的厚度为1mm。
1.9统计分析
使用R语言软件(4.0版)(https://www.r-project.org/)或Prism 8进行统计分析。患者组之间基因突变等位基因频率(MAF)的差异通过双侧Fisher精确检验进行了检验。MAF和分类的临床特征之间的关联性通过Mann-Whitney U检验(两个类别)和Kruskal-Wallis检验(大于两个类别)进行检验。通过Spearman的相关性评估了MAF与连续临床特征之间的关联。
使用卡方检验和Wilcoxon配对配对有秩检验对前列腺患者癌突变数与临床病理特征之间的关联进行分析。分别使用t检验和ANOVA进行了两组和多组数据的分析比较。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
2结果
2.1前列腺癌患者的临床病理特征
本研究共纳入33位前列腺癌患者和15位良性前列腺增生患者。与良性前列腺增生相比，前列腺癌与年龄和PSA浓度呈正相关。我们发现前列腺癌患者年龄较大(P＝0.016)，PSA水平较高(P＝0.002)(表1)。各样本检测的cfDNA中相关基因变异情况如表2所示。接下来，我们比较了前列腺癌患者中变异的数量(<2vs.≥2)。19例前列腺癌患者的变异基因数量小于2，14例前列腺癌患者的变异基因数量≥2。变异基因数量≥2的与M1期前列腺癌有关联(P＝0.035)(表3)。
2.2前列腺癌患者血浆中的突变等位基因频率明显更高，并且与转移有关
接下来，我们比较了血浆DNA测序中前列腺癌和良性前列腺增生之间的MAF。我们观察到趋势，尽管没有达到统计学显著性(P＝0.10)，但前列腺癌患者的MAF更高(图1和图2)。此外，统计分析表明前列腺癌和良性前列腺增生之间的MAF没有差异(P＝0.27；图3)。
进一步的分析表明，MAF与转移状态有关。转移性前列腺癌中的MAF显著较高(P＝0.02)，未接受过治疗的前列腺癌患者中的MAF较低(P＝0.03；图4A和B)。MAF与Gleason评分(P＝0.40)、肿瘤分期(P＝0.17)、PSA(P＝0.18)或年龄(P＝0.32)不相关(图5A-D)。处于IV期的前列腺癌患者倾向于具有更高的MAF(图5B)。
此外，我们发现突变的数量与转移状态和肿瘤分期有关。转移性前列腺癌中的突变数量明显更高(P<0.01；图6A)。此外，突变的数量与肿瘤的分期显着相关(P<0.05；图6B)，在IV期的前列腺癌患者中突变频率最高。但是，突变的数量与未接受过治疗的状态(P＝0.53)、PSA(P＝0.16)、Gleason评分(P＝0.61)和年龄(P＝0.32；图6C-F)不相关。
2.3PSA水平与转移状态无关
我们发现前列腺癌患者的血浆PSA水平高于良性前列腺增生患者(图7A)。前列腺癌的血清PSA明显高于良性前列腺增生患者(P<0.01)。但是，PSA浓度与MAF(P＝0.18；图5C)、突变数量(P＝0.16；图6D)、转移状态(P＝0.14；图7B)、治疗状态(P＝1.00；图7C)、Gleason评分(P＝0.33；图7D)、肿瘤分期(P＝0.48；图7E)和年龄(P＝0.49；图7F)没有关联。
2.4样品之间的血浆cfDNA基因组改变
在前列腺癌患者中检测到一些基因的改变，包括TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1和SPOP等(图1和图8)。在良性前列腺增生中，几个基因发生了改变，包括TP53、PIK3CA、GNAS、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4(图1)。一名患者携带PIK3CA p.Arg108His热点突变。我们研究中的变化谱几乎相同，并且与MSK-IMPACT数据库中的临床序列队列相关(37个对504个样本；图8)。
2.5前列腺癌患者治疗后突变等位基因频率发生改变
观察到血浆样品中MAF的动态变化。例如，在1例患者中，治疗6或12个月后，我们观察到SPOP、BRAF、ATM、ESR1和AR中MAF的变化(图9A)。该患者为66岁的男性，其前列腺活检显示前列腺腺癌的Gleason评分为7(3+4)。首次确诊时，CT扫描未见骨转移，液态活检显示BRAF和SPOP突变(图9A)。使用比卡鲁胺和亮丙瑞林口服治疗4个月后，CT扫描显示有多处骨转移。连续治疗6个月后，液态活检显示ATM和ESR1突变的存在以及BRAF和SPOP突变的消失。治疗12个月后，液态活检显示ATM、ESR1和AR突变(图9A)。经过长达41个月的治疗并随访至2020年8月，CT扫描仍显示出多处骨转移。病例2患者是一名83岁的男性，其前列腺活检显示前列腺腺癌的Gleason评分为10(5+5)。在诊断时，CT扫描未显示转移，液态活检未显示任何基因突变(图9B)。随后，该患者接受了双侧睾丸切除术并接受了比卡鲁胺口服治疗。治疗5个月后，液态活检显示CDH1突变(图9B)。经过25个月的治疗并一直随访到2019年4月，CT扫描显示癌症复发和盆腔淋巴结转移。这些数据表明MAF的动态变化可能与转移有关。
2.6前列腺癌患者尿液中检测到的突变数和突变等位基因频率
在尿cfDNAs研究中，前列腺癌中的突变数量和突变等位基因的频率往往高于良性前列腺增生(P＝0.25和P＝0.06；图10A和B)，表明尿液可能是替代来源用于前列腺癌的诊断。尿液中的突变数量与转移状态(P＝0.74)、初始治疗状态(P＝0.95)、Gleason评分(P＝0.31)、分期(P＝0.39)、PSA水平(P＝0.44)和年龄(P＝0.66)无关(图11)。MAF与年龄呈正相关(P＝0.03)，但与转移状态(P＝0.80)、未治疗状态(P＝0.42)、Gleason评分(P＝0.23)、肿瘤分期(P＝0.43)和PSA水平(P＝0.69)不相关(图12)。
2.7尿液样本和匹配的MSK-IMPACT中的cfDNA基因组改变
在我们的检测中，尿液样本中有几个改变的基因(n＝15)，这些基因几乎相同，并且与MSK-IMPACT数据库中的临床序列队列相似(n＝504个样本)(图13)。
2.8尿液与血浆中cfDNA的比较
接下来，我们比较了使用尿cfDNA与血浆cfDNA的测序结果。比较了15例配对尿液和血浆样本的患者。有趣的是，血浆和尿液中的突变谱差异很大。尿液的突变率高于血浆，包括TP53(27％vs.20％)、APC(33％vs.7％)、KMT2D(33％vs.0％)，SPOP(20％vs.13％)、AR(20％vs.7％)、FGFR2(20％vs.7％)、ARID1A(20％vs.7％)、PIK3CA(13％vs.7％)和ARAF(20％vs.0％)(图14)。尿液中每个样品的平均突变高于血浆中的突变(5.2vs.1.3，P＝0.002)。有趣的是，通过使用相同的截断值(0.5％)，检测到血浆中的MAF显著高于尿液中的MAF(P<0.01；图15A和B)。从突变情况的比较中，我们检测到前列腺癌样品中的突变比良性前列腺增生样品多，尿液样品中的突变比血浆样品多(图16)。
表1前列腺癌与良性前列腺增生患者的临床特征
Figure BDA0003128901550000121
Figure BDA0003128901550000131
表2基因突变检测结果
Figure BDA0003128901550000132
Figure BDA0003128901550000141
表3突变数量与前列腺癌患者临床病理特征的相关性
Figure BDA0003128901550000142
Figure BDA0003128901550000151
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一组试剂在制备评估前列腺癌转移状态的试剂盒中的应用，所述试剂用于检测血浆cfDNA中TP53、AR、ATM、MYC、APC、CTNNB1、FGFR2、PIK3CA、SPOP、AKT1、ARAF、ARID1A、BRAF、BRCA1、C11orf65、GNAS、IDH1、KRAS、MET、MYD88、NTRK1、VHL、CDK4、EGFR、NF1、RB1和SMAD4基因中发生突变的位点的数量，其中，当基因存在以下任一或几种突变时被认为所述基因的位点发生了突变：
基因 突变 TP53 p.Val217Gly；p.Arg283His；p.Arg196Ter；p.Lys164Glu；p.Pro250Arg；p.Arg175His；p.Gly245Ser；p.Leu130Pro；p.Arg110Cys；p.Pro190Ser；p.Arg273His；p.Arg248Gln；p.Arg342GlufsTer3；p.Asp281Asn；p.Gln192Ter；p.Ile232Thr AR p.Ala214Asp；p.Met746Leu；p.Gly209Trp；p.Ala431Thr；p.Trp742Leu ATM p.Arg337Cys；p.Tyr123Ter；p.Gly2891Asp MYC p.Ala142Thr；p.Ser71_Ser73del；p.Pro397Ala APC p.Lys1462ArgfsTer11；p.Leu1575Gln CTNNB1 p.Ser33Phe, p.Thr41Ile；p.Ser45Pro FGFR2 p.Lys406Glu；p.Tyr207Cys PIK3CA p.Arg108His；p.Asp155_Ser158delinsGlu；p.Glu545Lys；p.Arg612Ter SPOP p.Phe133Leu；p.Trp131Ser AKT1 p.Arg76Cys ARAF p.Gln167Leu ARID1A p.Glu1726Ter BRAF p.Lys483Glu BRCA1 p.Met1652Ter C11orf65 p.Tyr95Phe GNAS p.Ser218Leu；p.Arg609Cys IDH1 p.Asp137His KRAS p.Gly12Arg MET p.Leu1116Ter MYD88 p.Leu273Pro NTRK1 p.Arg742Trp VHL p.Pro71Thr；p.Arg205His CDK4 p.Asp119Ala EGFR p.Val148Met NF1 p.Cys721Ter RB1 p.Met704Lys SMAD4 p.Gln388His
，所述试剂选自下组：引物、探针或其组合。
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