CN102839211A - 用于确定人体具有异常状态的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种确定人体具有异常状态的方法，包括：提供人体样本的核酸序列信息，所述人体样本的核酸序列信息是基于对所述人体样本进行检测而获得的；以及基于所述人体样本的核酸序列信息，确定所述人体是否具有异常状态。本发明还提供了一种确定人体具有异常状态的系统。利用本发明的方法和系统，能够有效地确定人体是否具有异常状态。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域。更具体地，本发明涉及用于确定人体具有异常状态的系统和方法。
背景技术
肿瘤是我国危害最大的高发疾病。我国2008年新诊断肿瘤病例281万，死亡病例196万；同时肿瘤的死亡率提升很快，1990年后上升25.51％。肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症类型，分别占中国癌症总患者人数的18.5％和23.1％。如何有效控制是当务之急，临床上对其提倡“三早”原则，即早期发现、早期诊断及早期治疗，其中早期诊断是关键，即在患者癌细胞发生浸润和转移前得以确诊癌症，从而得到及时治疗。同时，个体化诊疗已经成为医学界在肿瘤诊疗上的共识，而肿瘤用药指导，治疗的预后判断是个体化治疗中最关键的组成部分。有研究表明，在病理进程的各个阶段对肿瘤患者基因突变情况进行检测，对于肿瘤病人个体化治疗是非常必要的。一种无创的诊断及病程追踪监测手段，对于免除肿瘤患者进行病理组织取样的伤害，提高无法实施手术的肿瘤晚期病人生存期和生存质量，及时有效对患者病情随访都有着非常重要的意义。
然而，目前现有技术不能满足上述需求。
发明内容
本发明旨在至少解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有能够有效确定人体异常状态的方法。本发明的另一目的在于提出一种能够有效确定人体异常状态的系统。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：在人体样本的检测过程中，对于蛋白质的检测，通常由于实验条件的限制，无法早期获得人体的状态信息。而利用核酸序列的特性，则可以通过对于离体的人体样本进行核酸分析，尽可能早期地对人体状态进行分析。
在本发明的一个方面，根据本发明的实施例，提出了一种确定人体具有异常状态的方法，包括：提供人体样本的核酸序列信息，所述人体样本的核酸序列信息是基于对所述人体样本进行检测而获得的；以及基于所述人体样本的核酸序列信息，确定所述人体是否具有异常状态。根据该实施例的方法，通过对人体样本的核酸序列信息进行分析，可以根据核酸序列中所包含的信息确定人体是否具有异常状态。由于核酸序列信息与原位状态的核酸信息保持一致，因而可以有效地确定人体是否具有异常状态。
另外，根据本发明上述实施例，上述确定人体具有异常状态的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述人体样本的核酸序列信息是基于对所述人体样本进行核酸序列检测而获得的。由此，可以通过核酸序列检测方法，容易地获得人体样本的核酸序列信息，从而提高了确定人体具有异常状态的效率。根据进一步的实施例，所述核酸序列检测是借助第二代测序技术或第三代测序技术进行的。由此，可以高效地对人体样本进行核酸序列进行检测，并且能够实现高通量深度测序。本发明的发明人发现基于第二代测序技术和第三代测序技术的高效、高精度的性质，可以实现对人体样本核酸序列信息的高效、高精度检测，能够非常灵敏地对人体样本中痕量的核酸进行检测。
根据本发明的一个实施例，所述样本为所述人体的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合。由此，根据本发明的实施例的确定人体具有异常状态的方法能够应用于各种人体样本，并且能够根据不同的人体样本的特点，确定多种异常状态。
根据本发明的一个实施例，所述人体样本为血浆或者血清。根据该实施例，可以利用常规的方法获得人体的血浆和血清样本，并对其进行核酸序列分析，可以直接对人体的异常状态进行确定，
根据本发明的一个实施例，所述核酸序列信息包括所述人体样本中游离核酸的序列信息。由此，可以根据游离核酸的序列信息，对人体的异常状态进行确定。并且基于游离核酸的序列信息与人体正常的核酸序列或者病原体的核酸序列进行比对分析后，可以获得多种人体的异常状态。
根据本发明的一个实施例，所述人体样本中游离核酸的序列信息是通过除去所述人体样本中的细胞后，进行测序检测而获得的。由此，可以提高游离核酸的测序检测的精度和准确度，从而能够进一步有效地确定人体具有异常状态。
根据本发明的一个实施例，所述异常状态选自疾病的发生、疾病的发展阶段、疾病的疗效和预后的至少一种。由此，可以确定与人体密切相关的疾病的发生、发展、疗效以及预后，从而有利于制定有效的治疗方案。根据本发明进一步的实施例，所述疾病是肿瘤性疾病、免疫性疾病、遗传性疾病的至少一种。根据本发明的实施例的确定人体异常状态的方法，能够有效地确定人体是否患有肿瘤性疾病、免疫性疾病、遗传性疾病。根据具体的示例，所述肿瘤性疾病是选自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、脑胶质瘤的至少一种。根据更进一步的示例，如果所述核酸序列信息包含选自下列至少一种的核酸片段序列：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌，则确定所述人体患有宫颈癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌的至少一种。由此，根据本发明的实施例的确定人体具有异常状态的方法，可以基于所检测的核酸序列信息，有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。
根据本发明的实施例，对所述核酸进行测序检测之前，利用探针捕获含有特定序列的核酸，然后对所述含有特定序列的核酸进行测序检测。由此，可以通过探针，预先对进行核酸序列分析的核酸进行筛选，从而能够进一步提高确定人体具有异常状态的方法的效率。根据进一步的实施例，所述探针对于选自下列的至少一种是特异性的：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌。由此，可以有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。根据本发明的一个实施例，对所述核酸进行测序检测之前，利用探针去除含有特定序列的核酸，然后对所述去除后剩余的核酸进行测序检测。由此，可以通过探针除去具有特定序列的核酸，从而能够提高对剩余材料进行序列检测的精度和准确性。根据本发明的具体示例，用于去除特定序列的核酸的探针可以结合人体基因组中的共有序列，或者为可以结合人体基因组中甲基化位点的抗体或蛋白。由此，可以进一步提高检测的精度和准确性。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于确定人体具有异常状态的系统，包括：核酸序列信息接收器，所述核酸序列信息接收器接收人体样本的核酸序列信息；以及核酸序列信息分析器，所述核酸序列信息分析器与所述核酸序列信息接收器相连，并基于所述人体样本的核酸序列信息，确定所述人体是否具有异常状态。利用该系统，可以有效地实施根据本发明实施例的确定人体具有异常状态的方案，其具有本发明实施例的确定人体具有异常状态的方法的全部优点，在此不再赘述。
另外，根据本发明上述实施例，上述确定人体具有异常状态的系统，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的一个实施例，所述核酸序列信息分析器内预存有选自下列的至少一种：人体正常状态的基因组序列、病原体的基因组序列、正常人群的基因组序列。从而可以有效地对核酸序列进行分析，提高了用于确定人体具有异常状态的系统的效率。根据进一步的实施例，所述病原体为选自HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌的至少一种。由此，可以有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。
根据本发明的一个实施例，进一步包括核酸序列检测装置，所述核酸序列检测装置与所述核酸序列信息接收器相连，用于对所述人体样本进行核酸序列检测获得所述核酸序列信息并输送至所述核酸序列信息接收器。由此，可以直接对核酸进行序列检测，并且输送至核酸序列接收器，进而进行核酸序列分析，从而确定人体是否具有异常状态从而提高了确定人体具有异常状态的效率。根据进一步的实施例，所述核酸序列检测装置借助第二代测序技术或第三代测序技术。由此，可以高效地对人体样本进行核酸序列进行检测，并且能够实现高通量深度测序。本发明的发明人发现基于第二代测序技术和第三代测序技术的高效、高精度的性质，可以实现对人体样本核酸序列信息的高效、高精度检测，能够非常灵敏地对人体样本中痕量的核酸进行检测。
根据本发明的一个实施例，进一步包括游离核酸捕获装置，所述游离核酸捕获装置与所述核酸序列检测装置相连，其中，所述游离核酸捕获装置设置有探针，所述探针适于捕获含有特定序列的核酸，并且将所述含有特定序列的核酸输送至所述核酸序列检测装置进行核酸序列检测；或者所述探针适于除去含有特定序列的核酸，并且将经过所述除去的核酸输送至所述核酸序列检测装置进行核酸序列检测。。由此，对所述核酸进行测序检测之前，利用探针捕获含有特定序列的核酸，然后对所述含有特定序列的核酸进行测序检测。由此，可以通过探针，预先对进行核酸序列分析的核酸进行筛选，从而能够进一步提高确定人体具有异常状态的方法的效率。根据进一步的实施例，所述探针对于选自下列的至少一种是特异性的：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌。由此，可以有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。或者，可以通过探针除去具有特定序列的核酸，从而能够提高对剩余材料进行序列检测的精度和准确性。根据本发明的具体示例，用于去除特定序列的核酸的探针可以结合人体基因组中的共有序列，或者为可以结合人体基因组中甲基化位点的抗体或蛋白。由此，可以进一步提高检测的精度和准确性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的确定人体具有异常状态的方法的流程示意图；
图2是根据本发明另一个实施例的确定人体具有异常状态的方法的流程示意图；
图3是根据本发明又一个实施例的确定人体具有异常状态的方法的流程示意图；
图4是根据本发明一个实施例的用于确定人体具有异常状态的系统的示意图；
图5是根据本发明另一个实施例的用于确定人体具有异常状态的系统的示意图；以及
图6是根据本发明又一个实施例的用于确定人体具有异常状态的系统的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，一体地连接，也可以是可拆卸连接；可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
本发明是基于本发明的下列发现而完成的：在人体样本的检测过程中，对于蛋白质的检测，通常由于实验条件的限制，无法直接对应其原位状态的信息，而核酸序列由于其自身性质比较稳定，因而在对于离体的人体样本进行核酸分析的结果可以直接对应其原位状态的信息，进而可以有效地对人体的状态进行分析。
下面参考附图，首先对根据本发明实施例的确定人体具有异常状态的方法进行详细描述。
参考图1，根据本发明实施例的确定人体具有异常状态的方法包括以下步骤：
步骤100：提供人体样本的核酸序列信息；以及
步骤200：基于人体样本的核酸序列信息，确定人体是否具有异常状态。
根据该实施例的方法，通过对人体样本的核酸序列信息进行分析，可以根据核酸序列中所包含的信息确定人体是否具有异常状态。由于核酸序列信息与原位状态的核酸信息保持一致，因而可以有效地确定人体是否具有异常状态。
在本发明中，术语“人体”应作广义理解，其并不限于人，其可以是任何能够通过核酸信息预测异常状态的生命体。在本发明中，术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。在本发明中，术语“核酸序列信息”，是指核酸序列所包含的所有信息，包括但不限于核酸的碱基序列、是否被修饰等信息。在本发明中，术语“人体样本”的含义不受特别限制，可以应用于本发明实施例的人体样本的类型，包括但不限于人体的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合，更具体的示例包括血浆或血清。更进一步的示例中，采用血浆作为人体样本。本申请的发明人发现选择血浆作为研究样本，背景噪音会较小，检测结果精度高。本领域技术人员可以根据需要选择进行检测和分析的样本类型。由此，根据本发明的实施例的确定人体具有异常状态的方法能够应用于各种人体样本，并且能够根据不同的人体样本的特点，确定多种异常状态。
在本发明中，术语“异常状态”是指人体与正常状态不同的状态，包括但不限于生理状态、心理状态，例如病理状态。根据本发明的一个实施例，异常状态选自疾病的发生、疾病的发展阶段、疾病的疗效和预后的至少一种。由此，可以确定与人体密切相关的疾病的发生、发展、疗效以及预后，从而有利于制定有效的治疗方案。根据本发明进一步的实施例，疾病是肿瘤性疾病、免疫性疾病、遗传性疾病的至少一种。由此，根据本发明的实施例的确定人体异常状态的方法，能够有效地确定人体是否患有肿瘤性疾病、免疫性疾病、遗传性疾病。根据具体的示例，所述肿瘤性疾病是选自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、脑胶质瘤的至少一种。根据更进一步的示例，如果所述核酸序列信息包含选自下列至少一种的核酸片段序列：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌，则确定所述人体患有宫颈癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌的至少一种。由此，根据本发明的实施例的确定人体具有异常状态的方法，可以基于所检测的核酸序列信息，有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。
根据本发明的实施例，人体样本的核酸序列信息的来源并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，人体样本的核酸序列信息是基于对人体样本进行检测而获得的。根据本发明的实施例，检测人体样本而获得人体样本的核酸序列信息的方法并不受特别限制，可以直接对人体样本进行核酸序列测序分析而获得，也可以通过其他方法例如质谱等。根据本发明的一些示例，可以基于对人体样本直接进行核酸序列检测而获得人体样本的核酸序列信息。即，如图2所示，根据本发明实施例，进一步包括步骤300：对核酸序列进行检测。由此，可以通过核酸序列检测方法，容易地获得人体样本的核酸序列信息，从而提高了确定人体具有异常状态的效率。根据更具体的示例，可以借助第二代测序技术或第三代测序技术进行核酸序列检测。由此，以边合成边测序方法为代表的第二代测序技术，以及以单分子测序为代表的第三代测序方法可以高效地对人体样本进行核酸序列进行检测，并且能够实现高通量深度测序。本发明的发明人发现基于第二代测序技术和第三代测序技术的高效、高精度的性质，可以实现对人体样本核酸序列信息的高效、高精度检测，能够非常灵敏地对人体样本中痕量的核酸进行检测，从而进一步提高确定人体存在异常状态的效率。这里所使用的术语“高通量”是指可以同时对大量的核酸进行测序检测，术语“深度”是指可以对核酸进行重复多次检测，例如在实施例1中可以进行100轮测序检测，当然根据样本的不同，重复的次数也可以根据需要进行选择。当然，本领域技术人员能够预见的是，未来可以采用其他更先进的测序技术。目前可以利用的第二代测序技术包括但不限于Illumina/HiSeq 2000、Roche/454、ABI/SOLiD。在本发明的一个实施例中，所采用的测序方法为Illumina/HiSeq 2000。
根据本发明的实施例，对核酸序列信息进行分析，从而确定异常状态的方法，不受特别限制。可以是在获得核酸序列信息后，与人体的正常基因组信息或者病原体的基因组信息进行比对，得到比对结果后，进行判断人体是否具有异常状态。也可以基于，核酸序列在样本中的含量来判断，人体的异常状态。根据本发明的实施例，可以通过分析人体样本中，游离核酸的含量，来确定人体是否存在异常状态。如实施例1所示，本发明的发明人发现，在癌症患者的外周血中，游离核酸的含量远高于正常人外周血中游离核酸的含量(为至少大约10倍)。根据本发明另外的实施例，可以分析人体样本中，游离核酸序列中是否存在突变位点或者经修饰的位点例如甲基化位点，从而判断个体是否存在某些特定的异常状态。具体地，可以采用常用的比对软件进行操作，根据本发明的一个示例，采用SOAP软件包进行比对分析，由此，能够高效地对核酸序列信息进行分析，并得到准确和精确的结果。
根据本发明的实施例，可以用于本发明实施例的确定人体具有异常状态的方法的核酸类型不受特别限制，根据本发明的一个实施例，所采用的核酸序列信息包括人体样本中游离核酸的序列信息。由此，可以根据游离核酸的序列信息，对人体的异常状态进行确定。并且基于游离核酸的序列信息与人体正常的核酸序列或者病原体的核酸序列进行比对分析后，可以获得多种人体的异常状态。为了方便理解，下面对游离核酸进行详细描述。
在本发明中，所使用的术语“游离核酸”是指在细胞外的游离状态的核酸，可以是DNA、RNA或者其他类型的核酸。本发明的发明人发现，正常状态下，会有少量的核酸由于代谢而进入到外周血中而成为游离核酸，而在异常状态下，例如癌症病人体内，游离核酸的含量大大高于正常状态下的游离核酸含量。发明人发现，在癌症病人体内，游离核酸(如游离DNA)的含量取决于肿瘤的生物学特性，即与肿瘤细胞的恶性程度、侵袭程度、是否发生转移、疾病进程等相关。因而，可以通过分析人体样本中游离核酸的含量，来确定人体是否存在异常状态，例如患有肿瘤性疾病，以及确定肿瘤性疾病的进展阶段，侵袭程度等。从而，为选择有效的治疗方案，提供有利的信息。另外，对于某些由于病原体引起的疾病，在人体样本中，可能会存在这样的游离核酸，即，它属于病原体基因组序列的一部分，这样可以确定人体已经被这些病原体侵染并且处于疾病的发生阶段。甚至有些个体样本中的游离核酸既包含病原体基因组的一部分序列，也包含人体基因组的某些序列，这样可以确定这些病原体基因组已经与人体基因组发生了整合重组。由此，可以判断个体的异常状态的阶段。根据本发明的一个实施例，人体样本中游离核酸的序列信息是通过除去人体样本中的细胞后，进行测序检测而获得的。由此，可以提高游离核酸的测序检测的精度和准确度，从而能够进一步有效地确定人体具有异常状态。
另外，根据本发明的实施例，对所述核酸进行测序检测之前，还可以包括步骤400，如图3所示，即利用探针捕获含有特定序列的核酸，然后对含有特定序列的核酸进行测序检测。由此，可以通过探针，预先对进行核酸序列分析的核酸进行筛选，从而能够进一步提高确定人体具有异常状态的方法的效率。另外，本发明的发明人惊奇地发现，通过此步骤，可以提高检测到与人体基因组发生整合的游离核酸的效率。本领域技术人员能够理解，所使用的探针类型可以根据检测的目的进行改变，即可以根据所期望的特定序列来选择所使用的探针类型。根据本发明的实施例，特定序列可以是外源核酸序列，也可以是含有突变位点的人基因组部分序列，也可以是含有修饰位点例如甲基化的人基因组部分序列。根据进一步的实施例，所述探针对于选自下列的至少一种是特异性的：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌。由此，可以有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。另外，根据本发明的实施例，可以在对核酸进行测序之前，通过使用特定的探针除去某些含有特定序列的核酸，例如人类基因组中的共有序列，从而提高确定人类具有异常状态的方法的准确性。具体地，可以在对所述核酸进行测序检测之前，利用探针去除含有特定序列的核酸，然后对所述去除后剩余的核酸进行测序检测。这些用于除去含有特定序列的核酸的探针如同用于捕获含有特定序列的核酸的探针一样，它们的类型不受特别限制，可以为核酸、蛋白质以及任何小分子，只要其能够特异性地结合特定的序列即可。另外，为了除去含有特定序列的核酸，所采用的探针能够结合人体基因组中的共有序列，或者也可以是能够结合人体基因组中甲基化位点的抗体或者蛋白。可以根据具体的情况对所采用的探针的类型，以及是需要对样本进行核酸捕获，还是需要进行特异性去除。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于确定人体具有异常状态的系统，其可以有效地实施上述根据本发明实施例的确定人体具有异常状态的方法。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸序列信息接收器500、以及核酸序列信息分析器600。其中，核酸序列信息接收器500接收人体样本的核酸序列信息，核酸序列信息分析器600与核酸序列信息接收器500相连，并基于人体样本的核酸序列信息，确定人体是否具有异常状态。利用该系统，可以有效地实施根据本发明实施例的确定人体具有异常状态的方案，其具有本发明实施例的确定人体具有异常状态的方法的全部优点，在此不再赘述。
如前所述，根据本发明实施例，对核酸序列信息进行分析的方法不受特别限制，根据具体地示例，可以通过将核酸序列信息与人体正常状态的基因组序列、病原体的基因组序列、正常人群的基因组序列进行比对而确定人体是否具有异常状态。人体正常状态的基因组序列、病原体的基因组序列、正常人群的基因组序列的存放位置不受特别限制，可以存储在远程的数据库中。根据本发明的一个实施例，核酸序列信息分析器500内可以预存有选自下列的至少一种：人体正常状态的基因组序列、病原体的基因组序列、正常人群的基因组序列。由此，从而可以有效地对核酸序列进行分析，提高了用于确定人体具有异常状态的系统的效率。根据进一步的实施例，所述病原体为选自HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌的至少一种。由此，可以有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。通过将核酸序列信息与人体正常状态的基因组序列(即将同一身体在不同状态下的基因组信息)进行比对，可以确定人体在一段时间内的状态变化。另外，通过将人体样本的核酸序列信息与正常人群的基因组序列信息进行比对，可以获知与正常人相比的异常状态。
根据本发明的实施例，进行分析的核酸序列信息的来源不受特别限制。根据本发明的一个实施例，进一步包括核酸序列检测装置700。该核酸序列检测装置700与核酸序列信息接收器500相连，用于对述人体样本进行核酸序列检测获得核酸序列信息并输送至核酸序列信息接收器500，进而进行分析和确定人体是否存在异常状态。由此，可以直接对核酸进行序列检测，并且输送至核酸序列接收器500，进而进行核酸序列分析，从而确定人体是否具有异常状态从而提高了确定人体具有异常状态的效率。根据进一步的实施例，所述核酸序列检测装置借助第二代测序技术或第三代测序技术。由此，可以高效地对人体样本进行核酸序列进行检测，并且能够实现高通量深度测序。本发明的发明人发现基于第二代测序技术和第三代测序技术的高效、高精度的性质，可以实现对人体样本核酸序列信息的高效、高精度检测，能够非常灵敏地对人体样本中痕量的核酸进行检测。根据本发明的一个实施例，用于确定人体具有异常状态的系统还可以进一步包括游离核酸捕获装置800，该游离核酸捕获装置800与核酸序列检测装置700相连，并且游离核酸捕获装置800设置有探针，这些探针适于捕获含有特定序列的核酸，并且将含有特定序列的核酸输送至核酸序列检测装置700进行核酸序列检测。由此，对所述核酸进行测序检测之前，利用探针捕获含有特定序列的核酸，然后对所述含有特定序列的核酸进行测序检测。由此，可以通过探针，预先对进行核酸序列分析的核酸进行筛选，从而能够进一步提高确定人体具有异常状态的方法的效率。另外，本发明的发明人惊奇地发现，通过此步骤，可以提高检测到与人体基因组发生整合的游离核酸的效率。本领域技术人员能够理解，所使用的探针类型可以根据检测的目的进行选择，即可以根据所期望的特定序列来选择所使用的探针类型。根据本发明的实施例，特定序列可以是外源核酸序列，也可以是含有突变位点的人基因组部分序列，也可以是含有修饰位点例如甲基化的人基因组部分序列。根据进一步的实施例，所述探针对于选自下列的至少一种是特异性的：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌。由此，可以有效地确定人体是否患有肝癌、宫颈癌、鼻咽癌或胃癌。根据本发明的具体实施例，可以采用HPV的E1基因区域的特异性序列作为探针。由此，能够高效地准确地确定患者体内的HPV是否已经与患者体内的基因组发生整合，从而判断个体是否患有宫颈癌。另外，根据本发明的具体示例，可以采用HBV的X基因和/或C基因中的特异性序列作为探针，由此，能够高效地准确地确定患者体内的HBV是否已经与患者体内的基因组发生整合，从而判断个体是否患有肝癌。另外，根据本发明的实施例，还可以采用这样的探针，其能够除去含有特定序列的核酸，从而可以在对核酸进行测序之前，通过使用特定的探针除去某些含有特定序列的核酸，例如人类基因组中的共有序列，从而提高确定人类具有异常状态的方法的准确性。具体地，可以在对所述核酸进行测序检测之前，利用探针去除含有特定序列的核酸，然后对所述去除后剩余的核酸进行测序检测。这些用于除去含有特定序列的核酸的探针如同用于捕获含有特定序列的核酸的探针一样，它们的类型不受特别限制，可以为核酸、蛋白质以及任何小分子，只要其能够特异性地结合特定的序列即可。另外，为了除去含有特定序列的核酸，所采用的探针能够结合人体基因组中的共有序列，或者也可以是能够结合人体基因组中甲基化位点的抗体或者蛋白。可以根据具体的情况对所采用的探针的类型，以及是需要对样本进行核酸捕获，还是需要进行特异性去除。
为了方便理解，下面提供具体的实施例，对本发明的技术方案进行解释，需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明目的，而不以任何方式限制本发明的范围。除非特别说明，实施例中未注明具体条件的，均为按照常规条件或制造商建议的条件进行。下列实施例中，所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市购获得的常规产品。所使用的测序用的接头和标签序列(index)来源于Illumina公司的Multiplexing Sample PreparationOligonutide Kit。
实施例1对宫颈癌患者外周血样品进行全基因组分析
1、DNA提取及测序
根据常规方法，对宫颈癌患者进行静脉取血，得到宫颈癌患者的外周血样本，通过离心得到血浆样本。按照Tiangen Micro Kit(DP316)微量基因组操作流程从血浆样本提取DNA，分别用Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量，所提取的DNA总量分别为5～50ng。
将所提取到的DNA，分别按照制造商提供的标准建库规程(参见http://www.illumina.com/提供的Illumina标准建库说明书)建立DNA文库。简言之，在DNA分子两端加上测序用的接头，并被加上不同的标签序列，然后与测序芯片表面互补接头杂交，使核酸分子成簇生长，然后在Illumina HiSeq 2000上通过100轮深度测序循环，得到长度为100-bp的DNA片段序列。本实施例中，对于获自肿瘤病人外周血的DNA样本分批按照制造商提供的操作说明书(参见Illumina官方公布说明书)进行上机测序操作。
2、数据分析
根据制造商Illumina提供的Pipeline操作说明书(参见http://www.illumina.com/提供的Pipeline方法说明书)，将步骤DNA测序部分中测得的序列信息经过图形转化获得测序序列信息，去掉测序质量低的序列之后最终可以获得针对NCBI版本36的人类基因组参考序列的ELAND比对结果。
将获得的数据使用SOAP软件包进行比对分析，使用两个末端测序信息进行比对时去除两个末端均比对至人基因组的序列，保留其中一条链比对至人基因组的序列，将另一末端序列比对至HPV基因组序列中，获得HPV在人基因组重组信息，包括人基因组中重组位置以及HPV类型。
3、分析结果：
根据数据分析部分中的数据分析流程，通过使用高通量测序平台对宫颈癌样品进行深度测序以及数据分析，共检测到45个超过10条测序序列支持的HPV整合基因，发生整合HPV区域均为E1区，发生整合的HPV型别为HPV16型。
表1、检测出来的支持数超过10的HPV整合情况
本实施例表明通过由于第二代测序技术能够对肿瘤样品进行深度测序，从而能够快速地对病毒与人体基因的整合进行检测，并且能准确提供被整合的人基因组区域信息以及整合外源序列信息。
实施例2对肝癌样品外周血通过目标区域分析
实验方法：
1、DNA提取及文库构建：
外周血DNA提取和文库制备方法与实施例1相同，只是样品来源为多名肝癌患者。
2、捕获游离核酸：
本实施例中将使用核酸探针芯片(Nimblegen)对含有外源序列区域的核酸片段进行捕获。实验流程如下：
a.样品准备：
b.将准备好的样品置于SpeedVac中60℃蒸干，然后加入11.2μL超纯水溶解样品。
c.全速离心样品30秒，分别加入以下两种试剂：18.5μL的2×SC Hybridiation Buffer(Roche NimbleGen公司)和7.3μL的SC Hybridiation Component A(Roche NimbleGen公司)。震荡混匀后置于离心机上全速离心30秒，然后于95℃使DNA变性10分钟。
d.根据制造商提供的说明书，将带有相应探针的芯片固定在杂交仪(Roche NimbleGen公司)上，将变性后的样品加入芯片中并封闭芯片，然后设定杂交程序，于42℃杂交64-72小时。
e.芯片洗涤与样品洗脱：
f.将NaOH洗脱液回收，并用32μL 20％冰醋酸中和，得到中和液。
g.将上述中和液用Qiagen MinElute PCR Purification Kit纯化，捕获后的样品最后溶解于138μL纯水中。
h.PCR扩增捕获的DNA文库，分为6管50μL反应进行PCR，PCR的反应物组成如下：
PCR的反应条件如下：
(a).98℃ 30s
(b).98℃ 15s
(c).62℃ 30s
(d).72℃ 30s
(e).重复(b)-(d)步骤11-19次(共扩增12-20次)
(f).72℃ 5min
(g).4℃ 静置
i.用Qiagen QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物，最后溶于30μL纯水中。
3、高通量测序
本实施例中，对于获自肿瘤病人外周血DNA样本分批按照制造商提供的操作说明书(参见Illumina/Solexa官方公布的cBot)进行上机测序操作。通过100轮测序循环，得到长度为100-bp的DNA片段序列。
4、数据分析
根据制造商Illumina提供的Pipeline操作说明书(参见http://www.illumina.com/提供的Pipeline方法说明书)，将步骤高通量测序部分中测得的序列信息经过图形转化获得测序序列信息，去掉测序质量低的序列之后最终可以获得针对NCBI版本36的人类基因组参考序列的ELAND比对结果。
获得的数据使用SOAP软件包进行比对分析，使用两个末端测序信息进行比对时去除两个末端均比对至人基因组的序列，保留其中一条链比对至人基因组的序列，将另一末端序列比对至HBV基因组序列中，获得HBV在人基因组重组信息，包括人基因组中重组位置以及HBV类型。
5、数据结果
上述结果表明通过该方法可以准确有效地检测到肝癌样品中HBV病毒整合信息，即一段733bp HBV序列整合至1号染色体区域。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。另外，在本文中所提到的产品说明书、操作规程、文献、专利，均通过参照，将其并入本文，如同在本文中详细描述其内容。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (23)
1.一种确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，包括：
提供人体样本的核酸序列信息，所述人体样本的核酸序列信息是基于对所述人体样本进行检测而获得的；以及
基于所述人体样本的核酸序列信息，确定所述人体是否具有异常状态。
2.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述人体样本的核酸序列信息是基于对所述人体样本进行核酸序列检测而获得的。
3.根据权利要求2所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述核酸序列检测是借助第二代测序技术或第三代测序技术进行的。
4.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述样本为所述人体的细胞、组织、血液、体液、尿液、排泄物或其组合。
5.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述人体样本为血浆或者血清。
6.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述核酸序列信息包括所述人体样本中游离核酸的序列信息。
7.根据权利要求6所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述人体样本中游离核酸的序列信息是通过除去所述人体样本中的细胞后，进行测序检测而获得的。
8.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述异常状态选自疾病的发生、疾病的发展阶段、疾病的疗效和预后的至少一种。
9.根据权利要求8所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述疾病是肿瘤性疾病、免疫性疾病、遗传性疾病的至少一种。
10.根据权利要求9所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，所述肿瘤性疾病是选自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、脑胶质瘤的至少一种。
11.根据权利要求8所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，如果所述核酸序列信息包含选自下列至少一种的核酸片段序列：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌，则确定所述人体患有宫颈癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌的至少一种。
12.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，
对所述核酸进行测序检测之前，利用探针捕获含有特定序列的核酸，然后对所述含有特定序列的核酸进行测序检测。
13.根据权利要求12所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，
所述探针对于选自下列的至少一种是特异性的：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌。
14.根据权利要求1所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，
在对所述核酸进行测序检测之前，利用探针去除含有特定序列的核酸，然后对所述去除后剩余的核酸进行测序检测。
15.根据权利要求14所述的确定人体具有异常状态的方法，其特征在于，
所述探针可以结合人体基因组中的共有序列，或者为可以结合人体基因组中甲基化位点的抗体或者蛋白。
16.一种用于确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，包括：
核酸序列信息接收器，所述核酸序列信息接收器接收人体样本的核酸序列信息；以及
核酸序列信息分析器，所述核酸序列信息分析器与所述核酸序列信息接收器相连，并基于所述人体样本的核酸序列信息，确定所述人体是否具有异常状态。
17.根据权利要求16所述的用于确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，
所述核酸序列信息分析器内预存有选自下列的至少一种：人体正常状态的基因组序列、病原体的基因组序列、正常人群的基因组序列。
18.根据权利要求17所述的用于确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，所述病原体为选自HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌的至少一种。
19.根据权利要求18所述的用于确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，进一步包括核酸序列检测装置，所述核酸序列检测装置与所述核酸序列信息接收器相连，用于对所述人体样本进行核酸序列检测获得所述核酸序列信息并输送至所述核酸序列信息接收器。
20.根据权利要求19所述的用于确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，所述核酸序列检测装置借助第二代测序技术或第三代测序技术。
21.根据权利要求19所述的用于确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，进一步包括
游离核酸捕获装置，所述游离核酸捕获装置与所述核酸序列检测装置相连，
其中，
所述游离核酸捕获装置设置有探针，
所述探针适于捕获含有特定序列的核酸，并且将所述含有特定序列的核酸输送至所述核酸序列检测装置进行核酸序列检测；或者
所述探针适于去除含有特定序列的核酸，并且将所述去除后的核酸输送至所述核酸序列检测装置进行核酸序列检测。
22.根据权利要求21所述的确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，
所述适于捕获含有特定序列的核酸的探针对于选自下列的至少一种是特异性的：HBV、HPV、EBV、幽门螺旋杆菌。
23.根据权利要求21所述的确定人体具有异常状态的系统，其特征在于，
所述适于除去含有特定序列的核酸的探针为可以结合人体基因组中的共有序列，或者为可以结合人体基因组中甲基化位点的抗体或者蛋白。
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