TW201321566A - 用於確定人體具有異常狀態的系統和方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了用於確定人體具有異常狀態的系統和方法。其中，確定人體具有異常狀態的方法包括：提供人體樣本的核酸序列訊息，該人體樣本的核酸序列訊息是基於對人體樣本進行檢測而獲得的；以及基於人體樣本的核酸序列訊息，確定人體是否具有異常狀態。

Description

用於確定人體具有異常狀態的系統和方法
本發明涉及生物醫學領域。更具體地，本發明涉及用於確定人體具有異常狀態的系統和方法。
HBV是一種全球性的慢性病毒感染性疾病。我國的B肝病毒感染率約60%-70%，而B肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18%，以此計算，全國約有9300萬人攜帶B肝病毒，其中B肝患者大約有3000萬。在全世界，大約有45%的人群生活在慢性HBV感染的高發區，43%的人群生活在慢性HBV感染的中發區，並且HBV為已知的引起肝硬化以及肝癌的主要原因，現已知HBV基因組與人類基因組整合為肝癌的主要誘因之一。EBV現已知為鼻咽癌的主要誘因，初發症狀到死亡的自然病程從3~13個月不等，放射治療後5年生存率為8%~62%。幽門螺旋杆菌為胃癌的主要誘因，並且慢性胃炎患者的胃粘膜活檢標本中幽門螺杆菌檢出率可達80%~90%，而消化性潰瘍患者更高，可達95%以上，甚至接近100%。胃癌由於局部上皮細胞已發生異化，因此檢出率高低不一。以上病原體，包括HBV，HCV，HIV，EBV，幽門螺旋杆菌等，均能夠與宿主基因組進行整合，並且與引起的相關病症直接相關，能夠對感染者造成持久和高危性的危害，是高致病性，高致癌性的高危型病原微生物。因此，建立一種無創 的診斷及病程追踪監測手段，既能夠免除對病原體感染患者進行病理組織取樣的傷害，同時可以定期跟踪檢測感染者感染程度以及治療效果，提高感染患者的治癒率以及有利於及時地指導用藥，對於由病原體引起的腫瘤晚期病人也可進行及時檢測判斷治癒效果以及復發的可能性，能夠及時有效地對患者進行病情隨訪並給出最佳建議。
然而，現有技術並不能滿足上述要求。
本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種具有能夠有效確定人體異常狀態的方法。本發明的另一目的在於提出一種能夠有效確定人體異常狀態的系統。
本發明是基於發明人的下列發現而完成的：在人體樣本的檢測過程中，對於蛋白質的檢測，通常由於實驗條件的限制，無法早期獲得人體的狀態訊息。而利用核酸序列的特性，則可以通過對於離體的人體樣本進行核酸分析，盡可能早期地對人體狀態進行分析。
在本發明的一個方面，本發明提出了一種確定人體具有異常狀態的方法。根據本發明的實施例，該方法包括：提供人體樣本的核酸序列訊息，所述人體樣本的核酸序列訊息是基於對所述人體樣本 進行檢測而獲得的；以及基於所述人體樣本的核酸序列訊息，確定所述人體是否具有異常狀態。根據該實施例的方法，通過對人體樣本的核酸序列訊息進行分析，可以根據核酸序列中所包含的訊息確定人體是否具有異常狀態。由於核酸序列訊息與原位狀態的核酸訊息保持一致，因而可以有效地確定人體是否具有異常狀態。
另外，根據本發明上述實施例，上述確定人體具有異常狀態的方法，還可以具有如下附加的技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述人體樣本的核酸序列訊息是基於對所述人體樣本進行核酸序列檢測而獲得的。由此，可以通過核酸序列檢測方法，容易地獲得人體樣本的核酸序列訊息，從而提高了確定人體具有異常狀態的效率。根據進一步的實施例，所述核酸序列檢測是借助第二代測序技術或第三代測序技術進行的。由此，可以高效地對人體樣本進行核酸序列進行檢測，並且能夠實現高通量深度測序。本發明的發明人發現基於第二代測序技術和第三代測序技術的高效、高精度的性質，可以實現對人體樣本核酸序列訊息的高效、高精度檢測，能夠非常靈敏地對人體樣本中痕量的核酸進行檢測。
根據本發明的一個實施例，所述樣本為所述人體的細胞、組織、血液、體液、尿液、排泄物或其組合。由此，根據本發明的實施例的確定人體具有異常狀態的方法能夠應用於各種人體樣本，並且能 夠根據不同的人體樣本的特點，確定多種異常狀態。
根據本發明的一個實施例，所述人體樣本為血漿或者血清。根據該實施例，可以利用常規的方法獲得人體的血漿和血清樣本，並對其進行核酸序列分析，可以直接對人體的異常狀態進行確定。
根據本發明的一個實施例，所述核酸序列訊息包括所述人體樣本中游離核酸的序列訊息。由此，可以根據游離核酸的序列訊息，對人體的異常狀態進行確定。並且基於游離核酸的序列訊息與人體正常的核酸序列或者病原體的核酸序列進行比對分析後，可以獲得多種人體的異常狀態。
根據本發明的一個實施例，所述人體樣本中游離核酸的序列訊息是通過除去所述人體樣本中的細胞後，進行測序檢測而獲得的。由此，可以提高游離核酸的測序檢測的精度和準確度，從而能夠進一步有效地確定人體具有異常狀態。
根據本發明的一個實施例，所述異常狀態選自疾病的發生、疾病的發展階段、疾病的療效和預後的至少一種。由此，可以確定與人體密切相關的疾病的發生、發展、療效以及預後，從而有利於制定有效的治療方案。根據本發明進一步的實施例，所述疾病是腫瘤性疾病、免疫性疾病、遺傳性疾病的至少一種。根據本發明的實施例的確定人體異常狀態的方法，能夠有效地確定人體是否患有腫瘤 性疾病、免疫性疾病、遺傳性疾病。根據具體的示例，所述腫瘤性疾病是選自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、腦膠質瘤的至少一種。根據更進一步的示例，如果所述核酸序列訊息包含選自下列至少一種的核酸片段序列：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，則確定所述人體患有子宮頸癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌的至少一種。由此，根據本發明的實施例的確定人體具有異常狀態的方法，可以基於所檢測的核酸序列訊息，有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。
根據本發明的一個實施例，對核酸進行測序檢測之前，可以利用探針去除含有特定序列的核酸，然後對所述去除後剩餘的核酸進行測序檢測。由此，可以通過探針除去具有特定序列的核酸，從而能夠提高對剩餘材料進行序列檢測的精度和準確性。根據本發明的具體示例，用於去除特定序列的核酸的探針可以結合人體基因組中的共有序列，或者為可以結合人體基因組中甲基化位點的抗體或蛋白。由此，可以進一步提高檢測的精度和準確性。
根據本發明的實施例，對所述核酸進行測序檢測之前，還可以利用探針捕獲含有特定序列的核酸，然後對所述含有特定序列的核酸進行測序檢測。由此，可以通過探針，預先對進行核酸序列分析的核酸進行篩選，從而能夠進一步提高確定人體具有異常狀態的方法的效率。根據進一步的實施例，所述探針對於選自下列的至少一 種是特異性的：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，由此，可以有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。
因此，在本發明的另一方面，本發明還提供了一種核酸探針集。根據本發明的實施例，該核酸探針集包括多個探針，且具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在核酸探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)核酸探針集的全部核酸序列覆蓋對應選自HBV、HPV、EBV和幽門螺旋杆菌的至少一種病毒的基因組序列的70%-100%。
在另一較佳實施例中，本發明的核酸探針集具有1-20000個核酸探針；較佳地，核酸探針集具有1000-5000個核酸探針；更佳地，核酸探針集具有2500個核酸探針。
在另一較佳實施例中，生物素標記的dNTP在核酸探針集中的豐度為1：4。
在另一較佳實施例中，核酸探針集中，探針之間具有部分重疊。
在另一較佳實施例中，核酸探針集(在本文中有時也稱為「探針集」)中的探針長度為100-500 bp；較佳地，探針長度為200-300 bp；更佳地，探針長度為250 bp。
在另一較佳實施例中，探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得的，較佳地，擴增模板為B型肝炎病毒(HBV)基因組、C型肝炎病毒(HCV)基因組、愛滋病病毒(HIV)基因組、乳頭瘤病毒(HPV)基因組，或其組合；更佳地，擴增模板為B型HBV基因組和/或C型HBV基因組。
進一步，在本發明的又一方面，還提供了一種表面固定有本發明的核酸探針集的核酸晶片。
在本發明的再一方面，還提供了本發明的核酸探針集和核酸晶片的用途，用於檢測病毒在待測樣本中的整合方式；較佳地，整合方式選自下組：重排、異位、插入、替換，或其組合。
在本發明的另一方面，還提供了一種製備本發明的核酸探針的方法，包括步驟：a.獲得探針來源樣本；b.對步驟(a)獲得的樣本進行PCR擴增，PCR擴增體系的dNTP為生物素標記的dNTP，以便獲得帶有生物素標記的PCR擴增產物；c.對步驟(b)獲得的生物素標記的PCR擴增產物進行打斷，得到片段化的生物素標記的PCR擴增產物，即為探針。
在另一較佳實施例中，步驟(a)所述樣本具有以下特徵：樣本為含有核酸的病毒樣本；和/或 樣本為病毒粒子、血清、血液、組織樣本、脫落細胞，上皮細胞，或其組合；和/或樣本選自下組：B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、愛滋病病毒(HIV)、乳頭瘤病毒(HPV)，或其組合；和/或樣本為B型HBV和/或C型HBV。
在另一較佳實施例中，步驟(b)具有以下特徵：步驟(b)所述的擴增為對樣本中病毒DNA全長進行擴增；和/或步驟(b)所述標記的dNTP為biotin-dNTP，且標記的dNTP能夠與鏈黴素親和磁珠結合；和/或步驟(b)所述標記的dNTP與非標記dNTP的比例為1：2-8；優選比例為1：3-6；更佳地比例為1：4。
在另一較佳實施例中，步驟(c)所述打斷為超音波法打斷。
在另一較佳實施例中，還包括步驟(d)：對步驟(c)獲得的探針進行純化和/或定量。
在另一較佳實施例中，根據本發明的製備核酸探針的方法製備的探針，其長度為100-500 bp；較佳地，探針的長度為200-300 bp，更佳地，探針的長度為250 bp。
在本發明的又一方面，本發明還提供了一種檢測病毒在待測樣本中基因整合方式的方法，包括步驟：(i)獲得待測樣本；(ii)對步驟(i)獲得的樣本進行庫構建；(iii)將本發明的探針與步驟(ii)獲得的庫進行雜交，捕獲與病毒基因整合有關的核酸序列；(iv)對步驟(iii)捕獲的核酸序列進行擴增，獲得與病毒整合有關的擴增產物；(v)對步驟(iv)獲得的擴增產物進行測序，獲得與病毒整合方式有關核酸訊息。
在另一較佳實施例中，步驟(i)具有以下特徵：所述待測樣本為組織、血液、脫落細胞，上皮細胞；和/或所述待測樣本來源於人或非人哺乳動物，較佳地來源於人；和/或所述待測樣本來源於HBV感染者或肝癌患者。
在另一較佳實施例中，步驟(iii)具有以下特徵：所述探針為變性的單鏈DNA；和/或在雜交液中加入接頭封閉分子和標簽封閉分子；和/或所述接頭封閉分子的序列如SEQ ID NO：8所示；和/或所述標簽封閉分子的序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
在另一較佳實施例中，在步驟(v)中，將所述的擴增產物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；然後對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，從而得到與病毒整合方式有關核酸訊息。
在另一較佳實施例中，在步驟(ii)中，所述的庫構建為：對打斷的基因組DNA進行末端修復，加入接頭，對具有接頭的片段進行擴增，獲得的帶有接頭的擴增混合物即為樣本庫。
在另一較佳實施例中，所述的接頭具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列；和/或，所構建的庫具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的標簽序列。
在本發明的又一方面，本發明還提供了一種可用於本發明前面所述方法的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內前面所述的核酸晶片，或本發明前面所述的探針；(2)第二容器以及位於容器內的用於構建樣本庫的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的接頭封閉分子；(4)第四容器以及位於容器內的標簽封閉分子；(5)檢測說明書。
在另一較佳實施例中，所述試劑盒還包括選自下組的試劑：用於進行PCR擴增所需的試劑、 用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、用於進行測序反應所需的試劑、或其組合。
在本發明的另一方面，本發明還提供了一種可用於本發明前面所述方法的試劑盒，所述試劑盒包括：前面所述的核酸晶片或前面所述的探針；接頭；接頭封閉分子；以及標簽封閉分子。
根據本發明的實施例，在該試劑盒中，所包含的成分被設置在不同的容器中，由此，可以方便使用。根據本發明的實施例，該試劑盒還包括選自下組的試劑：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、用於進行測序反應所需的試劑、或其組合。
在本發明的另一方面，本發明還提供了一種用於確定人體具有異常狀態的系統。根據本發明的實施例，該系統包括：核酸序列訊息接收器，所述核酸序列訊息接收器接收人體樣本的核酸序列訊息；以及核酸序列訊息分析器，所述核酸序列訊息分析器與所述核酸序列訊息接收器相連，並基於所述人體樣本的核酸序列訊息，確定所述人體是否具有異常狀態。利用該系統，可以有效地實施根據本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方案，其具有本發明實施 例的確定人體具有異常狀態的方法的全部優點，在此不再贅述。
另外，根據本發明上述實施例，上述確定人體具有異常狀態的系統，還可以具有如下附加的技術特徵：根據本發明的一個實施例，所述核酸序列訊息分析器內預存有選自下列的至少一種：人體正常狀態的基因組序列、病原體的基因組序列、正常人群的基因組序列。從而可以有效地對核酸序列進行分析，提高了用於確定人體具有異常狀態的系統的效率。根據進一步的實施例，所述病原體為選自HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌的至少一種。由此，可以有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。
根據本發明的一個實施例，進一步包括核酸序列檢測裝置，所述核酸序列檢測裝置與所述核酸序列訊息接收器相連，用於對所述人體樣本進行核酸序列檢測獲得所述核酸序列訊息並輸送至所述核酸序列訊息接收器。由此，可以直接對核酸進行序列檢測，並且輸送至核酸序列接收器，進而進行核酸序列分析，從而確定人體是否具有異常狀態從而提高了確定人體具有異常狀態的效率。根據進一步的實施例，所述核酸序列檢測裝置借助第二代測序技術或第三代測序技術。由此，可以高效地對人體樣本進行核酸序列進行檢測，並且能夠實現高通量深度測序。本發明的發明人發現基於第二代測序技術和第三代測序技術的高效、高精度的性質，可以實現對人體樣本核酸序列訊息的高效、高精度檢測，能夠非常靈敏地對人體樣 本中痕量的核酸進行檢測。
根據本發明的一個實施例，進一步包括游離核酸捕獲裝置，所述游離核酸捕獲裝置與所述核酸序列檢測裝置相連，其中，所述游離核酸捕獲裝置設置有探針，所述探針適於捕獲含有特定序列的核酸，並且將所述含有特定序列的核酸輸送至所述核酸序列檢測裝置進行核酸序列檢測；或者所述探針適於除去含有特定序列的核酸，並且將經過所述除去的核酸輸送至所述核酸序列檢測裝置進行核酸序列檢測。由此，對所述核酸進行測序檢測之前，利用探針捕獲含有特定序列的核酸，然後對所述含有特定序列的核酸進行測序檢測。由此，可以通過探針，預先對進行核酸序列分析的核酸進行篩選，從而能夠進一步提高確定人體具有異常狀態的方法的效率。根據進一步的實施例，所述探針對於選自下列的至少一種是特異性的：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，其來源於前面所述的本發明的核酸探針集，具有其全部優點，在此不再贅述。由此，可以有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。或者，可以通過探針除去具有特定序列的核酸，從而能夠提高對剩餘材料進行序列檢測的精度和準確性。根據本發明的具體示例，用於去除特定序列的核酸的探針可以結合人體基因組中的共有序列，或者為可以結合人體基因組中甲基化位點的抗體或蛋白。由此，可以進一步提高檢測的精度和準確性。
本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將 從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐瞭解到。
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在圖式中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過圖式描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
在本發明的描述中，需要說明的是，除非另有明確的規定和限定，術語「相連」、「連接」應做廣義理解，例如，可以是固定連接，一體地連接，也可以是可拆卸連接；可以是機械連接或電連接，也可以是兩個元件內部的連通；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，對於本領域的具有通常知識者而言，可以根據具體情況理解上述術語的具體含義。
本發明是基於本發明的下列發現而完成的：在人體樣本的檢測過程中，對於蛋白質的檢測，通常由於實驗條件的限制，無法直接對應其原位狀態的訊息，而核酸序列由於其自身性質比較穩定，因而在對於離體的人體樣本進行核酸分析的結果可以直接對應其原位狀態的訊息，進而可以有效地對人體的狀態進行分析。
下面參考圖式，首先對根據本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方法進行詳細描述。
參考第1圖，根據本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方法包括以下步驟：步驟100：提供人體樣本的核酸序列訊息；以及步驟200：基於人體樣本的核酸序列訊息，確定人體是否具有異常狀態。
根據該實施例的方法，通過對人體樣本的核酸序列訊息進行分析，可以根據核酸序列中所包含的訊息確定人體是否具有異常狀態。由於核酸序列訊息與原位狀態的核酸訊息保持一致，因而可以有效地確定人體是否具有異常狀態。
在本發明中，術語「人體」應作廣義理解，其並不限於人，其可以是任何能夠通過核酸訊息預測異常狀態的生命體。在本發明中，術語「核酸」可以是任何包含去氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限於經過修飾的或者未經修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。在本發明中，術語「核酸序列訊息」，是指核酸序列所包含的所有訊息，包括但不限於核酸的鹼基序列、是否被修飾等訊息。在本發明中，術語「人體樣本」的含義不受特別限制，可以應用於本發明實施例的人體樣本的類型，包括但不限於人體的細胞、組織、血液、體液、尿液、排泄物或其組合，更具體的示例包括血漿或血清。更進一步的示例中，採用血漿作為人體樣本。本申請的發明人發現選擇血漿作為研究樣本，背景噪音會較小，檢測結果精度高。本領域具有通常知識者可以根據需要選擇進行檢 測和分析的樣本類型。由此，根據本發明的實施例的確定人體具有異常狀態的方法能夠應用於各種人體樣本，並且能夠根據不同的人體樣本的特點，確定多種異常狀態。
在本發明中，術語「異常狀態」是指人體與正常狀態不同的狀態，包括但不限於生理狀態、心理狀態，例如病理狀態。根據本發明的一個實施例，異常狀態選自疾病的發生、疾病的發展階段、疾病的療效和預後的至少一種。由此，可以確定與人體密切相關的疾病的發生、發展、療效以及預後，從而有利於制定有效的治療方案。根據本發明進一步的實施例，疾病是腫瘤性疾病、免疫性疾病、遺傳性疾病的至少一種。由此，根據本發明的實施例的確定人體異常狀態的方法，能夠有效地確定人體是否患有腫瘤性疾病、免疫性疾病、遺傳性疾病。根據具體的示例，所述腫瘤性疾病是選自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、腦膠質瘤的至少一種。根據更進一步的示例，如果所述核酸序列訊息包含選自下列至少一種的核酸片段序列：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，則確定所述人體患有子宮頸癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌的至少一種。由此，根據本發明的實施例的確定人體具有異常狀態的方法，可以基於所檢測的核酸序列訊息，有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。
根據本發明的實施例，人體樣本的核酸序列訊息的來源並不受 特別限制。根據本發明的一個實施例，人體樣本的核酸序列訊息是基於對人體樣本進行檢測而獲得的。根據本發明的實施例，檢測人體樣本而獲得人體樣本的核酸序列訊息的方法並不受特別限制，可以直接對人體樣本進行核酸序列測序分析而獲得，也可以通過其他方法例如質譜等。根據本發明的一些示例，可以基於對人體樣本直接進行核酸序列檢測而獲得人體樣本的核酸序列訊息。即，如第2圖所示，根據本發明實施例，進一步包括步驟300：對核酸序列進行檢測。由此，可以通過核酸序列檢測方法，容易地獲得人體樣本的核酸序列訊息，從而提高了確定人體具有異常狀態的效率。根據更具體的示例，可以借助第二代測序技術或第三代測序技術進行核酸序列檢測。由此，以邊合成邊測序方法為代表的第二代測序技術，以及以單分子測序為代表的第三代測序方法可以高效地對人體樣本進行核酸序列進行檢測，並且能夠實現高通量深度測序。本發明的發明人發現基於第二代測序技術和第三代測序技術的高效、高精度的性質，可以實現對人體樣本核酸序列訊息的高效、高精度檢測，能夠非常靈敏地對人體樣本中痕量的核酸進行檢測，從而進一步提高確定人體存在異常狀態的效率。這裏所使用的術語「高通量」是指可以同時對大量的核酸進行測序檢測，術語「深度」是指可以對核酸進行重複多次檢測，例如在實施例1中可以進行100輪測序檢測，當然根據樣本的不同，重複的次數也可以根據需要進行選擇。當然，本領域具有通常知識者能夠預見的是，未來可以採用其他更先進的測序技術。目前可以利用的第二代測序技術包括但不限於Illumina/HiSeq 2000、Roche/454、ABI/SOLiD。在本發明的一個實 施例中，所採用的測序方法為Illumina/HiScq 2000。
根據本發明的實施例，對核酸序列訊息進行分析，從而確定異常狀態的方法，不受特別限制。可以是在獲得核酸序列訊息後，與人體的正常基因組訊息或者病原體的基因組訊息進行比對，得到比對結果後，進行判斷人體是否具有異常狀態。也可以基於，核酸序列在樣本中的含量來判斷，人體的異常狀態。根據本發明的實施例，可以通過分析人體樣本中，游離核酸的含量，來確定人體是否存在異常狀態。如實施例1所示，本發明的發明人發現，在癌症患者的外周血中，游離核酸的含量遠高於正常人外周血中游離核酸的含量(為至少大約10倍)。根據本發明另外的實施例，可以分析人體樣本中，游離核酸序列中是否存在突變位點或者經修飾的位點例如甲基化位點，從而判斷個體是否存在某些特定的異常狀態。具體地，可以採用常用的比對軟體進行操作，根據本發明的一個示例，採用SOAP軟體包進行比對分析，由此，能夠高效地對核酸序列訊息進行分析，並得到準確和精確的結果。
根據本發明的實施例，可以用於本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方法的核酸類型不受特別限制，根據本發明的一個實施例，所採用的核酸序列訊息包括人體樣本中游離核酸的序列訊息。由此，可以根據游離核酸的序列訊息，對人體的異常狀態進行確定。並且基於游離核酸的序列訊息與人體正常的核酸序列或者病原體的核酸序列進行比對分析後，可以獲得多種人體的異常狀態。為了方 便理解，下面對游離核酸進行詳細描述。
在本發明中，所使用的術語「游離核酸」是指在細胞外的游離狀態的核酸，可以是DNA、RNA或者其他類型的核酸。本發明的發明人發現，正常狀態下，會有少量的核酸由於代謝而進入到外周血中而成為游離核酸，而在異常狀態下，例如癌症病人體內，游離核酸的含量大大高於正常狀態下的游離核酸含量。發明人發現，在癌症病人體內，游離核酸(如游離DNA)的含量取決於腫瘤的生物學特性，即與腫瘤細胞的惡性程度、侵襲程度、是否發生轉移、疾病進程等相關。因而，可以通過分析人體樣本中游離核酸的含量，來確定人體是否存在異常狀態，例如患有腫瘤性疾病，以及確定腫瘤性疾病的進展階段，侵襲程度等。從而，為選擇有效的治療方案，提供有利的訊息。另外，對於某些由於病原體引起的疾病，在人體樣本中，可能會存在這樣的游離核酸，即，它屬於病原體基因組序列的一部分，這樣可以確定人體已經被這些病原體侵染並且處於疾病的發生階段。甚至有些個體樣本中的游離核酸既包含病原體基因組的一部分序列，也包含人體基因組的某些序列，這樣可以確定這些病原體基因組已經與人體基因組發生了整合重組。由此，可以判斷個體的異常狀態的階段。根據本發明的一個實施例，人體樣本中游離核酸的序列訊息是通過除去人體樣本中的細胞後，進行測序檢測而獲得的。由此，可以提高游離核酸的測序檢測的精度和準確度，從而能夠進一步有效地確定人體具有異常狀態。
另外，根據本發明的實施例，對所述核酸進行測序檢測之前，還可以包括步驟400，如第3圖所示，即利用探針捕獲含有特定序列的核酸，然後對含有特定序列的核酸進行測序檢測。由此，可以通過探針，預先對進行核酸序列分析的核酸進行篩選，從而能夠進一步提高確定人體具有異常狀態的方法的效率。另外，本發明的發明人驚奇地發現，通過此步驟，可以提高檢測到與人體基因組發生整合的游離核酸的效率。
本領域具有通常知識者能夠理解，所使用的探針類型可以根據檢測的目的進行改變，即可以根據所期望的特定序列來選擇所使用的探針類型。根據本發明的實施例，特定序列可以是外源核酸序列，也可以是含有突變位點的人基因組部分序列，也可以是含有修飾位點例如甲基化的人基因組部分序列。根據進一步的實施例，所述探針對於選自下列的至少一種是特異性的：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，其可以以包括多個探針的核酸探針集的形式提供，並且其具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在核酸探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)核酸探針集的全部核酸序列覆蓋對應選自HBV、HPV、EBV和幽門螺旋杆菌的至少一種病毒的基因組序列的70%-100%。在另一較佳實施例中，本發明的核酸探針集具有1-20000個核酸探針；較佳地，核酸探針集具有1000-5000個核酸探針；更佳地，核酸探針集具有2500個核酸探針。在另一較佳實施例中，生物素標記的dNTP在核酸探針集中的豐度為1：4。在另一較佳實施 例中，核酸探針集中，探針之間具有部分重疊。在另一較佳實施例中，核酸探針集(在本文中有時也稱為「探針集」)中的探針長度為100-500 bp；較佳地，探針長度為200-300 bp；更佳地，探針長度為250 bp。在另一較佳實施例中，探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得的，較佳地，擴增模板為B型肝炎病毒(HBV)基因組、C型肝炎病毒(HCV)基因組、愛滋病病毒(HIV)基因組、乳頭瘤病毒(HPV)基因組，或其組合；更佳地，擴增模板為B型HBV基因組和/或C型HBV基因組。由此，可以有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。
另外，根據本發明的實施例，可以在對核酸進行測序之前，通過使用特定的探針除去某些含有特定序列的核酸，例如人類基因組中的共有序列，從而提高確定人類具有異常狀態的方法的準確性。具體地，可以在對所述核酸進行測序檢測之前，利用探針去除含有特定序列的核酸，然後對所述去除後剩餘的核酸進行測序檢測。這些用於除去含有特定序列的核酸的探針如同用於捕獲含有特定序列的核酸的探針一樣，它們的類型不受特別限制，可以為核酸、蛋白質以及任何小分子，只要其能夠特異性地結合特定的序列即可。另外，為了除去含有特定序列的核酸，所採用的探針能夠結合人體基因組中的共有序列，或者也可以是能夠結合人體基因組中甲基化位點的抗體或者蛋白。可以根據具體的情況對所採用的探針的類型，以及是需要對樣本進行核酸捕獲，還是需要進行特異性去除。
在本發明的另一方面，本發明提供了一種用於確定人體具有異常狀態的系統，其可以有效地實施上述根據本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方法。根據本發明的實施例，參考第4圖，該系統包括：核酸序列訊息接收器500、以及核酸序列訊息分析器600。其中，核酸序列訊息接收器500接收人體樣本的核酸序列訊息，核酸序列訊息分析器600與核酸序列訊息接收器500相連，並基於人體樣本的核酸序列訊息，確定人體是否具有異常狀態。利用該系統，可以有效地實施根據本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方案，其具有本發明實施例的確定人體具有異常狀態的方法的全部優點，在此不再贅述。
如前所述，根據本發明實施例，對核酸序列訊息進行分析的方法不受特別限制，根據具體地示例，可以通過將核酸序列訊息與人體正常狀態的基因組序列、病原體的基因組序列、正常人群的基因組序列進行比對而確定人體是否具有異常狀態。人體正常狀態的基因組序列、病原體的基因組序列、正常人群的基因組序列的存放位置不受特別限制，可以存儲在遠程的數據庫中。根據本發明的一個實施例，核酸序列訊息分析器500內可以預存有選自下列的至少一種：人體正常狀態的基因組序列、病原體的基因組序列、正常人群的基因組序列。由此，從而可以有效地對核酸序列進行分析，提高了用於確定人體具有異常狀態的系統的效率。根據進一步的實施例，所述病原體為選自HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌的至少一種。由此，可以有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌 或胃癌。通過將核酸序列訊息與人體正常狀態的基因組序列(即將同一身體在不同狀態下的基因組訊息)進行比對，可以確定人體在一段時間內的狀態變化。另外，通過將人體樣本的核酸序列訊息與正常人群的基因組序列訊息進行比對，可以獲知與正常人相比的異常狀態。
根據本發明的實施例，進行分析的核酸序列訊息的來源不受特別限制。根據本發明的一個實施例，參考第5圖，本發明的用於確定人體具有異常狀態的系統可以進一步包括核酸序列檢測裝置700。該核酸序列檢測裝置700與核酸序列訊息接收器500相連，用於對述人體樣本進行核酸序列檢測獲得核酸序列訊息並輸送至核酸序列訊息接收器500，進而進行分析和確定人體是否存在異常狀態。由此，可以直接對核酸進行序列檢測，並且輸送至核酸序列接收器500，進而進行核酸序列分析，從而確定人體是否具有異常狀態從而提高了確定人體具有異常狀態的效率。根據進一步的實施例，所述核酸序列檢測裝置借助第二代測序技術或第三代測序技術。由此，可以高效地對人體樣本進行核酸序列進行檢測，並且能夠實現高通量深度測序。本發明的發明人發現基於第二代測序技術和第三代測序技術的高效、高精度的性質，可以實現對人體樣本核酸序列訊息的高效、高精度檢測，能夠非常靈敏地對人體樣本中痕量的核酸進行檢測。
根據本發明的一個實施例，參考第6圖，本發明的用於確定人 體具有異常狀態的系統還可以進一步包括游離核酸捕獲裝置800，該游離核酸捕獲裝置800與核酸序列檢測裝置700相連，並且游離核酸捕獲裝置800設置有探針，這些探針適於捕獲含有特定序列的核酸，並且將含有特定序列的核酸輸送至核酸序列檢測裝置700進行核酸序列檢測。由此，對所述核酸進行測序檢測之前，利用探針捕獲含有特定序列的核酸，然後對所述含有特定序列的核酸進行測序檢測。由此，可以通過探針，預先對進行核酸序列分析的核酸進行篩選，從而能夠進一步提高確定人體具有異常狀態的方法的效率。另外，本發明的發明人驚奇地發現，通過此步驟，可以提高檢測到與人體基因組發生整合的游離核酸的效率。
本領域具有通常知識者能夠理解，所使用的探針類型可以根據檢測的目的進行選擇，即可以根據所期望的特定序列來選擇所使用的探針類型。根據本發明的實施例，特定序列可以是外源核酸序列，也可以是含有突變位點的人基因組部分序列，也可以是含有修飾位點例如甲基化的人基因組部分序列。根據進一步的實施例，所述探針對於選自下列的至少一種是特異性的：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，其可以以包括多個探針的核酸探針集的形式提供，並且其具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在核酸探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)核酸探針集的全部核酸序列覆蓋對應選自HBV、HPV、EBV和幽門螺旋杆菌的至少一種病毒的基因組序列的70%-100%。在另一較佳實施例中，本發明的核酸探針集具有1-20000 個核酸探針；較佳地，核酸探針集具有1000-5000個核酸探針；更佳地，核酸探針集具有2500個核酸探針。在另一較佳實施例中，生物素標記的dNTP在核酸探針集中的豐度為1：4。在另一較佳實施例中，核酸探針集中，探針之間具有部分重疊。在另一較佳實施例中，核酸探針集(在本文中有時也稱為「探針集」)中的探針長度為100-500 bp；較佳地，探針長度為200-300 bp；更佳地，探針長度為250 bp。在另一較佳實施例中，探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得的，較佳地，擴增模板為B型肝炎病毒(HBV)基因組、C型肝炎病毒(HCV)基因組、愛滋病病毒(HIV)基因組、乳頭瘤病毒(HPV)基因組，或其組合；更佳地，擴增模板為B型HBV基因組和/或C型HBV基因組。由此，可以有效地確定人體是否患有肝癌、子宮頸癌、鼻咽癌或胃癌。根據本發明的具體實施例，可以採用HPV的E1基因區域的特異性序列作為探針。由此，能夠高效準確地確定患者體內的HPV是否已經與患者體內的基因組發生整合，從而判斷個體是否患有子宮頸癌。根據本發明的一些具體示例，可以採用HPV的全長序列作為探針，由此，能夠高效地準確地確定患者體內的HPV是否已經與患者體內的基因組發生整合，從而判斷個體子宮頸病變程度。另外，根據本發明的具體示例，可以採用HBV的X基因和/或C基因中的特異性序列作為探針，由此，能夠高效地準確地確定患者體內的HBV是否已經與患者體內的基因組發生整合，從而判斷個體是否患有肝癌。根據本發明的一些實施例，可以採用HBV的全長基因區域的特異性序列作為探針，由此，能夠高效地準確地確定患者體內的HBV是否已經與患者體內的基 因組發生整合，從而判斷個體肝炎病變程度。
另外，根據本發明的實施例，還可以採用這樣的探針，其能夠除去含有特定序列的核酸，從而可以在對核酸進行測序之前，通過使用特定的探針除去某些含有特定序列的核酸，例如人類基因組中的共有序列，從而提高確定人類具有異常狀態的方法的準確性。具體地，可以在對所述核酸進行測序檢測之前，利用探針去除含有特定序列的核酸，然後對所述去除後剩餘的核酸進行測序檢測。這些用於除去含有特定序列的核酸的探針如同用於捕獲含有特定序列的核酸的探針一樣，它們的類型不受特別限制，可以為核酸、蛋白質以及任何小分子，只要其能夠特異性地結合特定的序列即可。另外，為了除去含有特定序列的核酸，所採用的探針能夠結合人體基因組中的共有序列，或者也可以是能夠結合人體基因組中甲基化位點的抗體或者蛋白。可以根據具體的情況對所採用的探針的類型，以及是需要對樣本進行核酸捕獲，還是需要進行特異性去除。
為了方便理解，下面提供具體的實施例，對本發明的技術方案進行解釋，需要說明的是，這些實施例僅僅是為了說明目的，而不以任何方式限制本發明的範圍。除非特別說明，實施例中未注明具體條件的，均為按照常規條件或製造商建議的條件進行。下列實施例中，所用試劑或儀器未注明生產廠商的，均為可以通過市購獲得的常規產品。所使用的測序用的接頭和標簽序列(Index)來源於Illumina公司的Multiplexing Sample Preparation Oligonutide Kit。
實施例1： 1.樣本庫製備 1.1樣本來源
樣品的來源為同一患者的肝癌組織，且此患者肝癌組織有全基因組測序訊息。
1.2樣本庫製備
庫構建按照Illumina公司的標準庫製備流程說明書(Paired-End Sample Preparation Guide)進行構建，具體方法如下：採用Covaris s2打斷基因組DNA，末端補平修復，末端加A，加入接頭，建庫過程所用的接頭序列為：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’(SEQ ID NO：1)；5’-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO：2)；對加入接頭的片段進行PCR，得到樣本庫，所構建的庫帶有Index標簽序列，其中Index序列如下：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO：3)；5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(SEQ ID NO：4)。
將樣本分別做成兩種片段大小庫，對構建庫片段進行片段大小檢測，主帶為170 bp左右和800 bp左右。
2.製備HBV探針 2.1引子設計
本實施例中，所設計的引子為：P1：TTTTTCACCTCTGCCTAATCA(SEQ ID NO：5)；P2：AAAAAGTTGCATGGTGCTGG(SEQ ID NO：6)；
2.2 PCR反應體系
PCR反應體系見表1。
(注：dNTP中biotin-dNTP與普通dNTP的比例是1：4，總濃度為2.5 mM)
2.3 PCR反應條件
PCR反應在AB-9700PCR儀上進行，反應程序見表2。
表2
2.4 PCR產物純化及電泳檢測
反應結束後，採用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，並用1.2-1.5倍體積AMPURE BEADS純化，採用80 μl水溶解。然後採用250MinElute PCR Purification Kit純化，採用60 μl水溶解。其中，PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見第7圖，結果表明，擴增並純化出了大小約3.2 K的HBV的片段。
其中，HBV基因組序列(Hepatitis B virus serotype adr,complete genome)如下：CTCGAGGACTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGAGCACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCAT GCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTACCACAGGAACATATTGTATTAAAACTCAAGCAATGTTTTCGAAAACTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGCTATCCTGCCTTGATGCCTTTGTATGCATGTATACAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTGTGTCAACAATACCTGCACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCCATAGGCCATCGGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGTTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCGACCGGTCTGGAGCAAAACTTATCGGGACTGACAACTCGGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTCCCATGGCTGCTCGGGTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCGTCTCGGGGCCGTTTGGGCCTCTACCGTCCCTTGCTTTCTCTGCCGTTCCAGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGGCCACCAGGTCT TGCCCAAGCTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACAACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATTTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCCAGGGAATTAGTAGTCAGCTATGTCAATGTTAATATGGGCCTAAAAATCAGACAACTATTGTGGTTTCATATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCCGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACTGGGCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCCTTAATCCTGAGTGGCAAACTCCCTCCTTTCCTAACATTCATTTACAGGAGGACATTATTAATAGATGTCAACAATATGTGGGCCCTCTTACAGTTAATGAAAAAAGGAGATTAAAATTAATTATGCCTGCTAGGTTCTATCCTAACCTTACCAAATATTTGCCCTTGGATAAAGGCATTAAACCTTATTATCCTGAACATGCAGTTAATCATTACTTCAAAACTAGGCATTATTTACATACTCTGTGGAA GGCTGGCATTCTATATAAAAGAGAAACTACACGCAGCGCTTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACGGCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGACAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCGTTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCAACAAGGATCACTGGCCAGAGGCAATCAAGGTAGGAGCGGGAGACTTCGGGCCAGGGTTCACCCCACCACACGGCGGTCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACAACAGTGCCAGCAGCGCCTCCTCCTGTTTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAACTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGTCTCACCCATATCGTCAATCTT(SEQ ID NO：7)。
2.5 PCR產物片段化
將經過純化的PCR產物全部轉移至Covaris打斷小管並補加TE緩衝液至總體積為80 μl(Nanodrop檢測其總量為5 μg)，Covaris S2儀器(基因有限公司)進行打斷，由此，獲得片段化產物，其中打斷條件見表3。
2.6片段化產物電泳檢測
2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段化產物的大小，結果見第8圖，結 果顯示片段化產物的主帶在250-300 bp，表明所獲得的片段化產物即可用作雜交的探針。
2.7探針保存
使用MinElute PCR Purification Kit純化片段產物，溶於40 μl緩衝液中，用Nanodrop儀檢測探針DNA的濃度，使得探針的濃度為120 ng/μl左右。得到的探針可以保存在-20℃或-80℃。
3. HBV探針與樣本庫進行雜交 3.1探針變性
探針使用前必須95℃變性10分鐘，然後迅速放於冰上冷卻形成單鏈。
3.2選用已確定的整合庫，庫用量為1 μg，探針用量為600 ng(Nanodrop定量)，加入接頭封閉分子，接頭封閉分子的量與庫量的比值為1 nmol：1 μg，標簽封閉分子與庫量的比值為1 nmol：1 μg。
接頭封閉分子序列為：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO：8)；標簽封閉分子序列為：5'-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO：9)；5'-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO：10)。
在一個1.5 mL的EP管中加入1 μg的待雜交庫，1 nmol接頭封 閉分子，1 nmol標簽封閉分子，5 μg Cot DNA。蓋好管蓋，用乾淨的50 ml注射器針在分裝的EP管蓋上戳一個孔，然後置於60℃旋蒸儀中蒸乾。使用新的離心管管蓋替換戳孔的管蓋，並做好標記。EP管中分別加入EZ雜交系統中的兩種試劑：2×SC Hybridiation Buffer雜交緩衝液7.5 μl和1×SC Hybridiation Component A 3 μl，然後95℃變性10分鐘，在上述雜交混合物加入自製探針600 ng，探針體積共5 μl。震盪混勻後置於離心機上全速離心10秒，並將樣品全部轉移到200 μl PCR小管中。
雜交混合物中含有的成分見表4。
將200 μlPCR小管放置於PCR儀上，47℃條件下雜交24 h。
4.雜交後洗脫 4.1準備鏈黴親和素磁珠(Invitrogen M280)
提前從冰箱中拿出鏈黴親和素磁珠；漩渦震盪磁珠1 min，使其 充分混勻；在1.5 mL的EP管中加入100 μl磁珠；將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；保持EP管在磁力架上，加入200 μl(2倍體積)的結合緩衝液(購於Agilent公司)；從磁力架上取下EP管，漩渦震盪10 s，使其混勻；將EP管重新放回磁力架至液體澄清，用移液器小心地去除上清；重複清洗兩次；用100 μl的Agilent結合緩衝液r懸浮磁珠；將其轉入0.2 ml的小管中；用磁力架結合磁珠(將小管靠到磁力架上)，直到液體澄清，用移液器小心去除上清；現在磁珠可以用來結合捕獲的DNA了。
4.2將捕獲到的DNA結合到鏈黴素磁珠上
將雜交混合物吸出來，加到上步準備好的磁珠中；用移液器吹打10次混勻；將小管放在PCR儀上47℃孵育45 min(每隔15 min拿出來漩渦震盪3 s以防止磁珠沉澱)；孵育45 min後，將混合物從0.2 mL的小管中轉入1.5 mL的EP管中。
4.3洗滌結合了捕獲DNA的鏈黴親和素磁珠
1)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；2)加100 μL預熱到47℃的1×清洗緩衝液I；3)漩渦震盪10 s，使其混勻；4)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；5)從磁力架上取下EP管，加入200 μl預熱到47℃的1×嚴謹清洗緩衝液，用移液器吹打混勻10次(該步操作應迅速以儘量使管中液體溫度不低於47℃)； 6)47℃孵育5 min；7)重複步驟5)-7)，總共用1×嚴謹清洗緩衝液洗兩次；8)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；9)加200 μL室溫下放置的1×清洗緩衝液I(不用47℃預熱的)，漩渦震盪2 min，使其混勻；10)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；11)加200 μL室溫下放置的1×清洗緩衝液II，漩渦震盪1 min，使其混勻；12)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清；13)加200 μL室溫下放置的1×清洗緩衝液III，漩渦震盪30 s，使其混勻；14)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；15)從磁力架上取下EP管，加入76 μl超純水(不用將DNA從磁珠上洗脫下來，可以直接進行PCR，取樣35 μl進行後面的PCR反應)。
5. PCR反應
預先從-20℃保存的試劑盒中取出PFX聚合酶(購於Invirttogen公司)，PFX反應緩衝液(10×)，dNTP(10 mM)。引子序列為： PCR Flowcell-Primer F(10 pm/μl)：AATGATACGGCGACCACCGAGATC(SEQ ID NO：11)；PCR Flowcell-Primer R(10 pm/μl)：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：12)。
在PCR小管上，每孔按照表格5配置PCR反應體系。
反應條件見表6。
PCR結束後，每個樣品都用1.5倍體積的Amprue Beads純化，回收的PCR產物溶於30 μl超純水中，Nanodrop1000測濃度。
6. PCR產物上機測序
上述純化後的PCR產物經2100 Bioanalyzer(Agilent)確定大小及插入片段大小見第9圖和第10圖，純化產物大小分別為271 bp和876 bp，QPCR精確定量後上機測序。在本實施例中，上機測序按照Illumina/Solexa官方公布的c-Bot和HISEQ2000Hiseq 2000說明書進行操作。
7.訊息分析
將下機數據除去重複和被接頭污染的reads，統計下機數據的基本訊息(庫長度；reads長度；reads條數；鹼基數；重複率等)；分別截取PE的兩條reads前面的50 bp鹼基，形成一對長為50 bp新reads，即PE50 reads。將新的PE50 reads運用soap比對軟體(-r 1-v 2)分別與人的參考序列(hg19)和HBV各種參考序列進行比對，從比對結果中挑選出一條read比到人的參考序列並且另一條比對到HBV參考序列的一對reads；這樣的reads很有可能跨過HBV插入的位點；統計這部分reads比對訊息，找到在人類基因組的插入熱點區域。
雜交結果見表7。
表7
表7的結果為採用上機數據得到結果，樣本L-170，L-800，Genome均來自同一肝癌樣本，L-170為插入片段170 bp，L-800為800bp庫，genome為全基因組測序。從表7中可以得出自製探針對於捕獲基因片段的準確性，以及片段長度的影響。通過本發明的方法完全可以得到穩定以及可靠的位點，且所需數據量僅為全基因組測序數據的1%左右。
實施例2：對子宮頸癌患者外周血樣品進行全基因組分析 1、DNA提取及測序
根據常規方法，對子宮頸癌患者進行靜脈取血，得到子宮頸癌患者的外周血樣本，通過離心得到血漿樣本。按照Tiangen Micro Kit(DP316)微量基因組操作流程從血漿樣本提取DNA，分別用Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量，所提取的DNA總量分別為5~50 ng。
將所提取到的DNA，分別按照製造商提供的標準建庫規程(參見http：//www.illumina.com/提供的Illumina標準建庫說明書)建立DNA庫。簡言之，在DNA分子兩端加上測序用的接頭，並被加上不同的標簽序列，然後與測序晶片表面互補接頭雜交，使核酸分子成簇生長，然後在Illumina HiSeq 2000上通過100輪深度測序循環，得到長度為100bp的DNA片段序列。本實施例中，對於獲自腫瘤病人外周血的DNA樣本分批按照製造商提供的操作說明書(參見Illumina官方公布說明書)進行上機測序操作。
2、數據分析
根據製造商Illumina提供的Pipeline操作說明書(參見http：//www.illumina.com/提供的Pipeline方法說明書)，將步驟DNA測序部分中測得的序列訊息經過圖形轉化獲得測序序列訊息，去掉測序質量低的序列之後最終可以獲得針對NCBI版本36的人類基因組參考序列的ELAND比對結果。
將獲得的數據使用SOAP軟體包進行比對分析，使用兩個末端測序訊息進行比對時去除兩個末端均比對至人基因組的序列，保留其中一條鏈比對至人基因組的序列，將另一末端序列比對至HPV基因組序列中，獲得HPV在人基因組重組訊息，包括人基因組中重組位置以及HPV類型。
3、分析結果：
根據數據分析部分中的數據分析流程，通過使用高通量測序平 臺對子宮頸癌樣品進行深度測序以及數據分析，共檢測到45個超過10條測序序列支持的HPV整合基因，發生整合HPV區域均為E1區，發生整合的HPV型別為HPV16型。
本實施例表明通過由於第二代測序技術能夠對腫瘤樣品進行深度測序，從而能夠快速地對病毒與人體基因的整合進行檢測，並且能準確提供被整合的人基因組區域訊息以及整合外源序列訊息。
實施例3：對肝癌樣品外周血通過目標區域分析 實驗方法： 1、DNA提取及庫構建：
外周血DNA提取和庫製備方法與實施例2相同，只是樣品來源為多名肝癌患者。
2、捕獲游離核酸：
本實施例中將使用核酸探針晶片(Nimblegen)對含有外源序列區域的核酸片段進行捕獲。實驗流程如下：
a.樣品準備：
其中，核酸探針是以具有SEQ ID NO：7所示的核酸序列的HBV基因組(Hepatitis B virus serotype adr,complete genome)為模板，以60 bp為一個探針長度，每間隔5 bp設置一個探針，進行設計得到的。
PE Block 1.0：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO：13)；PE Block 2.0：5'-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO：14)。
b.將準備好的樣品置於SpeedVac中60℃蒸乾，然後加入11.2 μL超純水溶解樣品。
c.全速離心樣品30秒，分別加入以下兩種試劑：18.5 μL的2×SC Hybridiation Buffer(Roche NimbleGen公司)和7.3 μL的SC Hybridiation ComponentA(Roche NimbleGen公司)。震盪混勻後置於離心機上全速離心30秒，然後於95℃使DNA變性10分鐘。
d.根據製造商提供的說明書，將帶有相應探針的晶片固定在雜 交儀(Roche NimbleGen公司)上，將變性後的樣品加入晶片中並封閉晶片，然後設定雜交程序，於42℃雜交64-72小時。
e.晶片洗滌與樣品洗脫：
f.將NaOH洗脫液回收，並用32 μL 20%冰醋酸中和，得到中和液。
g.將上述中和液用Qiagen MinElute PCR Purification Kit純化，捕獲後的樣品最後溶解於138 μL純水中。
h. PCR擴增捕獲的DNA庫，分為6管50 μL反應進行PCR， PCR的反應物組成如下：
其中，PE Post Primer 1.0：AATGATACGGCGACCACCGAGATC(SEQ ID NO：15)；PE Post Primer 2.0：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：16)。
PCR的反應條件如下：
(a).98℃ 30 s
(b).98℃ 15 s
(c).62℃ 30 s
(d).72℃ 30 s
(e).重複(b)-(d)步驟11-19次(共擴增12-20次)
(f).72℃ 5 min
(g).4℃ 靜置
i.用Qiagen QIAquick PCR Purification Kit純化PCR產物，最後溶於30 μL純水中。
3、高通量測序
本實施例中，對於獲自腫瘤病人外周血DNA樣本分批按照製造商提供的操作說明書(參見Illumina/Solexa官方公布的cBot)進行上機測序操作。通過100輪測序循環，得到長度為100 bp的DNA片段序列。
4、數據分析
根據製造商Illumina提供的Pipeline操作說明書(參見http：//www.illumina.com/提供的Pipeline方法說明書)，將步驟高通量測序部分中測得的序列訊息經過圖形轉化獲得測序序列訊息，去掉測序質量低的序列之後最終可以獲得針對NCBI版本36的人類基因組參考序列的ELAND比對結果。
獲得的數據使用SOAP軟體包進行比對分析，使用兩個末端測序訊息進行比對時去除兩個末端均比對至人基因組的序列，保留其中一條鏈比對至人基因組的序列，將另一末端序列比對至HBV基因組序列中，獲得HBV在人基因組重組訊息，包括人基因組中重組位置以及HBV類型。
5、數據結果
上述結果表明通過表明本發明的用於確定人體具有異常狀態方法能夠準確有效地檢測到肝癌樣品中HBV病毒整合訊息，即一段733 bp HBV序列整合至1號染色體區域。
實施例4：對肝癌樣品外周血及組織通過目標區域捕獲分析 實驗方法： 1、DNA提取及測序
根據常規方法，對肝癌患者進行靜脈取血，得到患者的外周血樣本，通過離心得到血漿樣本。按照Tiangen Micro Kit(DP316)微量基因組操作流程從血漿樣本提取DNA，並分別用Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量，所提取的各樣本的DNA總量均為5~50 ng。
根據常規方法，取肝癌患者，癌組織樣本對組織樣本進行全基因組提取，取3微克進行常規建庫，庫插入片段主帶為170bp。
將所提取到的DNA，分別按照製造商提供的標準建庫規程(參見http：//www.illumina.com/提供的Illumina標準建庫說明書)建立DNA庫。簡言之，在DNA分子兩端加上測序用的接頭，並被加上不同的標簽序列，然後與測序晶片表面互補接頭雜交，使核酸分子 成簇生長，然後在Illumina HiSeq 2000上測序PE101，得到長度為100bp的DNA片段序列。
2、捕獲游離核酸
本實施例中將使用HBV(Nimblegen)核酸探針晶片對含有外源序列區域的核酸片段進行捕獲。實驗流程如下：
a.樣品準備：
其中，HBV核酸探針是由HBV的A，B，C，D，E，F，G，H八個型別的基因組進行設計得到的，各基因組序列具體可見公知數據庫中的HBV基因組序列。具體地，按照HBV基因組長度，每次在基因組上10 bp滑動移動一次，合成60-90 bp長度且帶Bio-tin標記的探針。具體探針是委托相應的公司合成的。
b.將準備好的樣品置於SpeedVac中60℃蒸乾。
c.全速離心樣品30秒，分別加入以下兩種試劑：7.5 μL的2×SC Hybridiation Buffer(Roche NimbleGen公司)和3.0 μL的SC Hybridiation Component A(Roche NimbleGen公司)。震盪混勻後置 於離心機上全速離心30秒，然後於95℃使DNA變性10分鐘，而後加入探針4.5 μl於47℃雜交24小時。
d.晶片洗滌與樣品洗脫：按照標準的EZ洗脫流程進行洗脫，回收。
e.預先從-20℃保存的試劑盒中取出Pfx酶(Invirtogen)，Pfx buffer(10*)，dNTP(10 mM)，PCR Primer F(10 pm/μl)，PCR Primer R(10 pm/μl)。
在PCR小管上，每孔按照下面的表格配置PCR反應體系：
其中，Flowcell-primer-F1：AATGATACGGCGACCACCGAGATC(SEQ ID NO：17)；Flowcell-primer-R1：CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO：18)。
程序如下：94℃ 2min；94℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 30s，14個循環；72℃ 5min，4℃ ∞。
PCR結束後，每個樣品都用1.5倍體積的Amprue Beads純化，回收的PCR產物溶於30 μl超純水中，Nanodrop1000測其濃度為10 ng/μl。
3、高通量測序
本實施例中，對於獲自腫瘤病人外周血DNA樣本分批按照製造商提供的操作說明書(參見Illumina/Solexa官方公布的cBot)進行上機測序操作。
4、數據分析
將下機數據除去重複和被接頭污染的reads，統計下機數據的基本訊息(庫長度；reads長度；reads條數；鹼基數；重複率等)；分別截取PE的兩條reads前面的50bp鹼基，形成一對長為50bp新reads，即PE50 reads。將新的PE50 reads運用soap比對軟體(-r 1-v 2)分別與人的參考序列(hg19)和HBV各種參考序列進行比對，從比對結果中挑選出一條read比到人的參考序列並且另一條比對到HBV參考序列的一對reads；這樣的reads很有可能跨過HBV插入的位點；組裝這部分reads，採用BWA比對找到在人類基因組的插 入熱點區域。
5、數據結果
A患者組織DNA，經過雜交後1G(鹼基)數據量結果如下：
A患者血漿DNA，經過雜交後5G(鹼基)數據量結果如下：
採用上述方法對同一患者的血漿與肝癌組織中的整合狀態進行查找，發現組織中存在的支持數最高的位置，在血漿中同樣存在，此方法不僅證明組織與血漿游離DNA之間的關係，並且能夠準確有效地找出血漿中的整合位置，表明本發明的用於確定人體具有異常狀態方法為能夠有效地應用於病原體引起染色體整合相關疾病的無創檢測。
實施例5：對HPV患者子子宮頸脫落細胞目標區域捕獲分析 實驗方法： 1、DNA提取及測序
根據常規方法，對HPV患者進行子子宮頸脫落細胞取樣，樣本按照Tiangen Micro Kit(DP316)微量基因組操作流程從血漿樣本提取DNA，分別用Qubit(Invitrogen，the Quant-iTTM dsDNA HS Assay Kit)定量，所提取的DNA總量分別為100~500 ng。
將所提取到的DNA，分別按照製造商提供的標準建庫規程(參見http：//www.illumina.com/提供的Illumina標準建庫說明書)建立170 bp DNA庫。簡言之，在DNA分子兩端加上測序用的接頭，並被加上不同的標簽序列，然後與測序晶片表面互補接頭雜交，使核酸分子成簇生長，然後在Illumina HiSeq 2000上測序PE101，得到長度為100 bp的DNA片段序列。
2、捕獲游離核酸
本實施例中將使用(Mygenostics公司)HPV核酸探針晶片對含有外源序列區域的核酸片段進行捕獲。實驗流程如下：
a.樣品準備：
其中，HPV核酸探針是由HPV的6，11，16，18，31，33，35，39，45，52，56，58，59，66，68，69，82型別的基因組進行設計得到的，各基因組序列具體可見公知數據庫中的HPV基因組。具體地，按照HPV基因組長度，每次在基因組上10 bp滑動移動一次，合成60-90 bp長度且帶Bio-tin標記的探針。具體探針是委托相應的公司合成的。
b.晶片洗滌與樣品洗脫：按照標準(MyGenostics)洗脫流程進行洗脫，回收，具體步驟如下：1)提前將溫浴器調至65℃；2)用漩渦混合儀劇烈震盪重懸Myone beads C1(Invitrogen)至混勻；3)每一個雜交反應取50 μl Myone beads C1磁珠於一新的1.5 mL離心管中，放於磁力架上，然後去除上清；4)洗滌磁珠：a)加入50 μL 1*結合緩衝液；b)用漩渦混合儀劇烈震盪5秒鐘重懸磁珠； c)將離心管放於磁力架上，待液體變澄清；d)去除上清液；e)重複2次「步驟a到步驟d」；5)加入80 μL(根據不同大小捕獲區域加入量不同，具體按照KIT要求加入)1*結合緩衝液重懸磁珠；6)加入64 μL 2*結合緩衝液重懸磁珠(與雜交液體積同等體積)，將液體轉移到EP1後，總體積約為200微升；7)震盪混勻後在室溫下放於ROATER上進行1小時；8)震盪混勻後將樣品放於磁力架上，去除上清；9)加入500 μl WB1，震盪混勻後旋轉混勻15分鐘，然後放於磁力架上去上清；10)加入500 μl WB3，震盪混勻後放於65度溫浴，850 rpm，10分鐘，放於磁力架上去上清；11)重複(10)5次，最後一次完全去除上清；12)加入50 μl洗脫緩衝液，震盪混勻，室溫放置10分鐘，放於磁力架上取上清轉入另一EP管(管內包含70 μl NE緩衝液)；13)採用QIAquick Minelute進行純化，最終溶解42 μl EB。
c.捕獲樣品的擴增與純化
1)從-20℃冰箱中取出2*PHUSION MASTER,Flowcell primers(10 μM)，將其置於冰上化凍並充分混勻。
2)在冰上為每個捕獲樣品配製一份Mix，另外加入一個無模板的陰性對照，按以下表格組分配製反應Mix並用移液器混勻：
3)在熱循環儀中運行下列程序：
a.98℃ 30s
b.98℃ 25 s
c.65℃ 30 s
d.72℃ 30 s
e.重複b-d步驟(共15次循環)
f.72℃ 5 min
g.4℃ Hold
PCR結束後，每個樣品都用1.5倍體積的Amprue Beads純化，回收的PCR產物溶於30 μl超純水中，Nanodrop1000測濃度，並記錄，其濃度為10 ng/μl。
3、高通量測序
本實施例中，對於獲自HPV患者的子子宮頸脫落細胞DNA樣本分批按照製造商提供的操作說明書(參見Illumina/Solexa官方公布的cBot)進行上機測序操作。通過100輪測序循環，得到長度為 100 bp的DNA片段序列。
4、數據分析
將下機數據除去重複和被接頭污染的reads，統計下機數據的基本訊息(庫長度；reads長度；reads條數；鹼基數；重複率等)；分別截取PE的兩條reads前面的50bp鹼基，形成一對長為50bp新reads，即PE50 reads。將新的PE50 reads運用Soap比對軟體(-r 1-v 2)分別與人的參考序列(hg19)和HBV各種參考序列進行比對，從比對結果中挑選出一條read比到人的參考序列並且另一條比對到HBV參考序列的一對reads；這樣的reads很有可能跨過HBV插入的位點；組裝這部分reads，採用BWA比對找到在人類基因組的插入熱點區域。
5、數據結果
HPV16型感染且子宮頸病變程度為CIN四期病人，數據量1G，結果如下：
上述方法採用子宮頸病變程度為CIN四期病人，感染的子宮頸脫落細胞進行檢測，結果準確發現高頻整合位置，證明了表明本發明的用於確定人體具有異常狀態方法具有可行性。
工業實用性
本發明的用於確定人體具有異常狀態的系統和方法，能夠有效地應用於人體疾病的無創檢測，通過對人體樣本的核酸序列訊息進行分析，可以根據核酸序列中所包含的訊息準確地確定人體是否具有異常狀態。
儘管本發明的具體實施方式已經得到詳細的描述，本領域具有通常知識者將會理解。根據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保護範圍之內。本發明的全部範圍由所附申請專利範圍及其任何等同物給出。
在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示意性實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
100‧‧‧步驟
200‧‧‧步驟
300‧‧‧步驟
400‧‧‧步驟
500‧‧‧步驟
600‧‧‧步驟
700‧‧‧步驟
800‧‧‧步驟
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：第1圖是根據本發明一個實施例的確定人體具有異常狀態的方法的流程示意圖；第2圖是根據本發明另一個實施例的確定人體具有異常狀態的方法的流程示意圖；第3圖是根據本發明又一個實施例的確定人體具有異常狀態的方法的流程示意圖；第4圖是根據本發明一個實施例的用於確定人體具有異常狀態的系統的示意圖；第5圖是根據本發明另一個實施例的用於確定人體具有異常狀態的系統的示意圖；第6圖是根據本發明又一個實施例的用於確定人體具有異常狀態的系統的示意圖；第7圖是根據本發明又一個實施例的對HBV全基因組PCR擴增後的電泳檢測結果；第8圖是根據本發明又一個實施例的對HBV全長產物打斷後的電泳檢測結果；第9圖是根據本發明又一個實施例的建庫雜交後一種庫的片斷大小檢測結果；以及第10圖是根據本發明又一個實施例的建庫雜交另一種庫的片斷大小檢測結果。
<110> 深圳華大基因科技有限公司 深圳華大基因研究院
<120> 用於確定人體具有異常狀態的系統和方法
<130> PIDC120650P
<150> CN 201110174686.2
<151> 2011-06-24
<150> PCT/CN2011/082855
<151> 2011-11-24
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 接頭
<400> 1
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 接頭
<400> 2
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 標簽
<400> 3
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 標簽
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR引子
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR引子
<400> 6
<210> 7
<211> 3215
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 接頭封閉分子
<400> 8
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 標簽封閉分子
<400> 9
<210> 10
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 標簽封閉分子
<400> 10
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Flowcell-Primer F
<400> 11
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PCR Flowcell-Primer R
<400> 12
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PE Block 1.0
<400> 13
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PE Block 2.0
<400> 14
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PE Post Primer 1.0
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> PE Post Primer 2.0
<400> 16
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Flowcell-primer-F1
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Flowcell-primer-R1
<400> 18
100‧‧‧步驟
200‧‧‧步驟

Claims (27)

  1. 一種確定人體具有異常狀態的方法，其中，包含：提供人體樣本的核酸序列訊息，該人體樣本的核酸序列訊息是基於對該人體樣本進行檢測而獲得的；以及基於該人體樣本的核酸序列訊息，確定該人體是否具有異常狀態。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該人體樣本的核酸序列訊息是基於對該人體樣本進行核酸序列檢測而獲得的。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該核酸序列檢測是借助第二代測序技術或第三代測序技術進行的。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該樣本為該人體的細胞、組織、血液、體液、尿液、排泄物或其組合。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該人體樣本為血漿或者血清。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其 中，該核酸序列訊息包含該人體樣本中游離核酸的序列訊息。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該人體樣本中游離核酸的序列訊息是通過除去該人體樣本中的細胞後，進行測序檢測而獲得的。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該異常狀態選自疾病的發生、疾病的發展階段、疾病的療效和預後的至少一種。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該疾病是腫瘤性疾病、免疫性疾病、遺傳性疾病的至少一種。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該腫瘤性疾病是選自肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、腦膠質瘤的至少一種。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，如果該核酸序列訊息包含選自下列至少一種的核酸片段序列：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，則確定該人體患有子宮頸癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌的至少一種。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，對該核酸進行測序檢測之前，利用探針捕獲含有特定序列的核酸，然後對該含有特定序列的核酸進行測序檢測。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該探針對於選自下列的至少一種是特異性的：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，該探針為核酸探針集，包含多個探針，該核酸探針集具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)該生物素標記的dNTP在該探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)該探針集的全部核酸序列覆蓋對應選自HBV、HPV、EBV和幽門螺旋杆菌的至少一種病毒的基因組序列的70%-100%。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該探針集具有1-20000個核酸探針；在該探針集中，該探針之間具有部分重疊，該探針長度為100-500 bp。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中該探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得的，該模板 為選自HBV基因組、HCV基因組、HIV基因組和HPV基因組的至少一種。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，在對該核酸進行測序檢測之前，利用探針去除含有特定序列的核酸，然後對該去除後剩餘的核酸進行測序檢測。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該探針可以結合人體基因組中的共有序列，或者為可以結合人體基因組中甲基化位點的抗體或者蛋白。
  18. 一種用於確定人體具有異常狀態的系統，其中，包含：核酸序列訊息接收器，該核酸序列訊息接收器接收人體樣本的核酸序列訊息；以及核酸序列訊息分析器，該核酸序列訊息分析器與該核酸序列訊息接收器相連，並基於該人體樣本的核酸序列訊息，確定該人體是否具有異常狀態。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之用於確定人體具有異常狀態的系統，其中，該核酸序列訊息分析器內預存有選自下列的至少一種：人體正常狀態的基因組序列、病原體的基因組序列、正常人群的基因組序列。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之用於確定人體具有異常狀態的系統，其中，該病原體為選自HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌的至少一種。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之用於確定人體具有異常狀態的系統，其中，進一步包含核酸序列檢測裝置，該核酸序列檢測裝置與該核酸序列訊息接收器相連，用於對該人體樣本進行核酸序列檢測獲得該核酸序列訊息並輸送至該核酸序列訊息接收器。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之用於確定人體具有異常狀態的系統，其中，該核酸序列檢測裝置借助第二代測序技術或第三代測序技術。
  23. 如申請專利範圍第21項所述之用於確定人體具有異常狀態的系統，其中，進一步包含游離核酸捕獲裝置，該游離核酸捕獲裝置與該核酸序列檢測裝置相連，其中，該游離核酸捕獲裝置設置有探針，該探針適於捕獲含有特定序列的核酸，並且將該含有特定序列的核酸輸送至該核酸序列檢測裝置進行核酸序列檢測；或者該探針適於去除含有特定序列的核酸，並且將該去除後的核酸輸送至該核酸序列檢測裝置進行核酸序列檢測。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之確定人體具有異常狀態的方法， 其中，該適於捕獲含有特定序列的核酸的探針對於選自下列的至少一種是特異性的：HBV、HPV、EBV、幽門螺旋杆菌，該探針為核酸探針集，包含多個探針，該核酸探針集具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)該生物素標記的dNTP在該探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)該探針集的全部核酸序列覆蓋對應選自HBV、HPV、EBV和幽門螺旋杆菌的至少一種病毒的基因組序列的70%-100%。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該探針集具有1-20000個核酸探針；在該探針集中，該探針之間具有部分重疊，該探針長度為100-500 bp。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得的，該模板為選自HBV基因組、HCV基因組、HIV基因組和HPV基因組的至少一種。
  27. 如申請專利範圍第23項所述之確定人體具有異常狀態的方法，其中，該適於除去含有特定序列的核酸的探針為可以結合人體基因 組中的共有序列，或者為可以結合人體基因組中甲基化位點的抗體或者蛋白。
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