TW201321519A - 檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針及其製備方法和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針及其製備方法和應用，具體地，所述探針至少具有以下一個特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；(2)生物素標記的dNTP在探針集中的豐度為1：6-1：2；(3)所述探針集的全部核酸序列覆蓋對應病毒基因組序列的70%-100%。用所述探針對捕獲的樣本核酸片段進行序列分析，即得到病毒在待測樣本中整合方式的有關訊息。本發明還提供了一種檢測病毒在待測樣本中整合方式的試劑盒。

Description

檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針及其製備方法和應用
本發明屬於生物技術領域，具體地，本發明涉及一種檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針及其製備方法和應用。
B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種全球性的慢性病毒感染性疾病。我國的B肝病毒感染率約60%-70%；而B肝表面抗原攜帶率約占總人口的7.18%，以此計算，全國約有9300萬人攜帶B肝病毒，其中B肝患者大約有3000萬。在全世界，大約有45%的人群生活在慢性HBV感染的高發區，43%的人群生活在慢性HBV感染的中發區，另有12%的人群生活在慢性HBV感染低發區。在慢性HBV感染的高發區，HBV感染的危險性>60%，絕大多數HBV感染是通過母嬰垂直傳播；在慢性HBV感染中發地區，HBV感染的危險性為20%-60%；在慢性HBV感染的低發區，HBV感染的危險性<20%。
在慢性HBV感染的過程中，一定比例的HBV感染發展成肝硬化與肝細胞癌，還有一部分由於肝病變的惡化而發生肝衰竭。因此，在慢性HBV感染的自然過程中，不少患者會因肝硬化、肝細胞癌，以及肝功能衰竭而導致死亡，給社會和家庭帶來巨大的經濟損失。
B肝病毒基因組是一個有部分單鏈的環狀雙鏈DNA分子，兩條單鏈長度不同，HBV病毒具有多種基因型，常見基因型有八種， 分別為A-H。A型分布於北歐與西歐；B，C型分布於東南亞；D型分布於南歐，印第安；E型分布於西非與南非；F，H型分布中美，南美；G型分布法國，美國。
現今關於肝癌與HBV基因組整合研究，發現HBV-DNA整合入肝癌細胞基因組中。採用單克隆方法發現HBV基因整合入人類基因組位點周圍，發生重排、缺失。HBV攜帶者轉變為肝癌，研究發現有以下三個途徑：(1)HBV整合入基因組引起染色體不穩定，造成多位點缺失；(2)HBV片段插入特定位點引起基因插入缺失，活化原癌基因，例如細胞增殖分化基因，與端粒逆轉錄酶基因；(3)表達的病毒蛋白可調控肝癌細胞增殖。
HBV病毒基因組整合入人類基因組破壞基因組穩定性引起非正常易位，DNA重排，刪除，雜合丟失，以及活化抑製相關基因，從而誘導肝細胞癌(HCC)的發生。現已知在14號、15號、18號、19號和Y染色體上，HBV DNA的整合位點附近有一些與癌症相關的基因，如BCL2L2基因與細胞凋亡相關，SMOC1、Calmodulin-1基因與鈣通道相關，FBLN5基因與血管生長相關，NOTCH3與細胞訊號轉導途徑相關。HCC組織中可以存在多個整合位點，HBV在整合的基礎上還可以發生再次整合。如在肝癌患者的肝組織中有時能檢測到HBV DNA整合位點兩端發生17號和18號染色體的易位，同時18號染色體在整合位點處有至少1.3 kb的鹼基缺失。通過對肝癌患者的肝組織HBV整合的研究發現：有的病例中人基因組序列各有5bp和19bp的缺失；在3例病例中檢測到HBV整合片段 兩側的人染色體雖然是同一染色體，但是方向相反，發生了重排。
HBV基因組整合入宿主基因組的研究方法目前主要為Southern Blot、探針同位素標記、單克隆測序、ALU-PCR、寡聚核苷酸探針等。目前這些方法存在很多問題，主要體現在：1.對於高通量測序來說常規探針定製的供應商主要為Agilent和imblegene，定製價格較高，一般為幾百美元/反應；2.尚未做過整合方面的嘗試。
目前本領域還沒有一種經濟簡單快速的HBV基因組整合入宿主基因組的研究方法。因此本領域迫切需要開發新的HBV基因組整合入宿主基因組的檢測方法，為研究HBV以及肝臟相關疾病提供方便廉價的研究方法與手段。
本發明的目的是提供一種用於檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針。
本發明的另一目的是提供所述探針的製備方法和應用。
本發明的另一目的是提供一種檢測病毒在待測樣本中整合方式的方法。
在本發明的第一方面，提供了一種核酸探針集，包括多個探針，所述探針集具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)所述探針集的全部核酸序列覆蓋對應病毒基因組序列的 70%-100%。
在另一較佳例中，所述探針集具有1-20000個核酸探針；較佳地，所述探針集具有1000-5000個核酸探針；更佳地，所述探針集具有2500個核酸探針。
在另一較佳例中，所述生物素標記的dNTP在所述探針集中的豐度為1：4。
在另一較佳例中，所述探針之間具有部分重疊。
在另一較佳例中，所述探針長度為100-500bp；較佳地，所述探針長度為200-300bp；更佳地，所述探針長度為250bp。
在另一較佳例中，所述探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得，較佳地，所述擴增模板為B型肝炎病毒(HBV)基因組、C型肝炎病毒(HCV)基因組、愛滋病病毒(HIV)基因組、乳頭瘤病毒(HPV)基因組，或其組合；更佳地所述樣本為B型HBV基因組和/或C型HBV基因組。
在本發明的第二方面，提供了一種表面固定有本發明第二方面所述探針集的核酸晶片。
在本發明的第三方面，提供了本發明的第一方面所述核酸探針集和本發明的第二方面所述核酸晶片的用途，用於檢測病毒在待樣本中的整合方式；較佳地，所述的整合方式選自下組：重排、異位、插入、替換，或其組合。
在本發明的第四方面，提供了一種製備本發明的第一方面所述核酸探針的方法，包括步驟：a.獲得探針來源樣本； b.對步驟(a)獲得的樣本進行PCR擴增，PCR擴增體系的dNTP為生物素標記的dNTP，獲得帶有生物素標記的PCR擴增產物；c.對步驟(b)獲得的生物素標記的PCR擴增產物進行打斷，得到片段化的生物素標記的PCR擴增產物，即為探針；在另一較佳例中，步驟(a)所述樣本具有以下特徵：樣本為含有核酸的病毒樣本；和/或所述樣本為病毒粒子、血清、血液、組織樣本、脫落細胞，上皮細胞，或其組合；和/或所述樣本選自下組：B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、愛滋病病毒(HIV)、乳頭瘤病毒(HPV)，或其組合；和/或所述樣本為B型HBV和/或C型HBV。
在另一較佳例中，步驟(b)具有以下特徵：步驟(b)所述的擴增為對樣本中病毒DNA全長進行擴增；和/或步驟(b)所述標記的dNTP為biotin-dNTP，且所述標記的dNTP能夠與鏈黴素親和磁珠結合；和/或步驟(b)所述標記的dNTP與非標記dNTP的比例為1：2-8；較佳比例為1：3-6；更較佳比例為1：4。
在另一較佳例中，步驟(c)所述打斷為超音波法打斷。
在另一較佳例中，還包括步驟(d)：對步驟(c)獲得的探針進行純化和/或定量。
在另一較佳例中，所述探針的長度為100-500bp；較佳地，所 述探針的長度為200-300bp，更佳地，所述探針的長度為250bp。
在本發明的第五方面，提供了一種檢測病毒在待測樣本中基因整合方式的方法，包括步驟：(i)獲得待測樣本；(ii)對步驟(i)獲得的樣本進行庫構建；(iii)將本發明第一方面所述的探針與步驟(ii)獲得的庫進行雜交，捕獲與病毒基因整合有關的核酸序列；(iv)對步驟(iii)捕獲的核酸序列進行擴增，獲得與病毒整合有關的擴增產物；(v)對步驟(iv)獲得的擴增產物進行測序，獲得與病毒整合方式有關核酸訊息。
在另一較佳例中，步驟(i)具有以下特徵：所述待測樣本為組織、血液、脫落細胞，上皮細胞；和/或所述待測樣本來源於人或非人哺乳動物，較佳地來源於人；和/或所述待測樣本來源於HBV感染者或肝癌患者。
在另一較佳例中，步驟(iii)具有以下特徵：所述探針為變性的單鏈DNA；和/或在雜交液中加入接頭封閉分子和標簽封閉分子；和/或所述接頭封閉分子的序列如SEQ ID NO：7所示；和/或所述標簽封閉分子的序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
在另一較佳例中，在步驟(v)中，將所述的擴增產物與固相載 體上固定的測序探針進行雜交，進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；然後對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，從而得到與病毒整合方式有關核酸訊息。
在另一較佳例中，在步驟(ii)中，所述的庫構建為：對打斷的基因組DNA進行末端修復，加入接頭，對具有接頭的片段進行擴增，獲得的帶有接頭的擴增混合物即為樣本庫。
在另一較佳例中，所述的接頭具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列；和/或，所構建的庫具有如SEQ ID：3和SEQ ID：4所示的標簽序列。
在本發明的第六面，提供了一種可用於本發明第四方面所述方法的試劑盒，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內本發明第二方面所述的核酸晶片，或本發明第一方面所述的探針；(2)第二容器以及位於容器內的用於構建樣本庫的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的接頭封閉分子；(4)第四容器以及位於容器內的標簽封閉分子；(5)檢測說明書；在另一較佳例中，所述試劑盒還包括選自下組的試劑：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、用於進行測序反應所需的試劑、或其組合。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或較佳的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
本發明的特徵可首先參考第4圖以及第5圖，其中第4圖顯示了本發明檢測HBV在待測樣本基因整合方式的流程，第5圖顯示了本發明檢測HBV在待測樣本基因整合方式的訊息分析流程。
本發明人經過廣泛而深入的研究，首次構建了一種用於檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針及其應用，具體地，所述探針集具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)所述探針集的全部核酸序列覆蓋對應病毒基因組序列的70%-100%。
在本發明的一個較佳例中，所述探針集具有1-20000個核酸探針；較佳地，所述探針集具有1000-5000個核酸探針；更佳地，所述探針集具有2500個核酸探針。
在另一較佳例中，所述探針集還具有以下特徵：(i)所述生物素標記的dNTP在所述探針集中的豐度為1：4；和/或(ii)所述探針之間具有部分重疊；和/或 (iii)所述探針長度為100-500bp；較佳地，所述探針長度為200-300bp；更佳地，所述探針長度為250bp；和/或(iv)所述探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得，較佳地，所述擴增模板為B型肝炎病毒(HBV)基因組、C型肝炎病毒(HCV)基因組、愛滋病病毒(HIV)基因組、乳頭瘤病毒(HPV)基因組，或其組合；更佳地所述樣本為B型HBV基因組和/或C型HBV基因組。
本發明還提供了所述探針的製備方法及其應用。在此基礎上完成了本發明。
術語
如本文所用，術語「含有」包括「具有(comprise)」、「基本上由...構成」和「由...構成」。
如本文所用，術語「以上」和「以下」包括本數，例如「80%以上」指80%，「2%以下」指2%。
豐度
如本文所用，術語「豐度」指的生物素標記的dNTP數量在整個探針集中所占的比例。在本發明的一個較佳例中，生物素標記的dNTP在探針集中的豐度為1：6-1：2；更加地，生物素標記的dNTP在所述探針集中的豐度為1：4。
引子
如本文所用，術語「引子」指的是能與模板互補配對，在DNA聚合酶的作用合成與模板互補的DNA鏈的寡聚核苷酸的總稱。引子可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，引 子甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
引子「大致上」(或「基本上」)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引子必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引子的序列不必與模板的序列完全互補。比如，在一個3’端與模板互補的引子的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引子仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引子能與模板充分的結合，非完全互補的引子也可以與模板形成引子-模板複合物，從而進行擴增。
探針及其製備方法
如本文所用，「探針」一詞是指能夠檢測互補核酸序列的簡單DNA或RNA分子。探針必須是純淨的，而且不受其他不同序列核酸的影響。典型的探針是克隆的DNA序列或通過PCR擴增獲得的DNA，人工合成的寡核苷酸或從體外轉錄克隆DNA序列後獲得的RNA，也可以作為探針。探針長度可以從20-500mer，較佳地50-300mer，更佳地250mer。探針設計和合成方法為本領域具有通常知識者所熟知可以使用人工化學合成法合成探針或使用市售探針。
本發明提供了一種用於檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針，所述探針集具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在探針集中的豐度為1：6-1：2；和/或(3)所述探針集的全部核酸序列覆蓋對應病毒基因組序列的70%-100%。
在本發明的一個較佳例中，所述探針集具有1-20000個核酸探針；較佳地，所述探針集具有1000-5000個核酸探針；更佳地，所述探針集具有2500個核酸探針。
在另一較佳例中，所述探針集還具有以下特徵：(i)所述生物素標記的dNTP在所述探針集中的豐度為1：4；和/或(ii)所述探針之間具有部分重疊；和/或(iii)所述探針長度為100-500bp；較佳地，所述探針長度為200-300bp；更佳地，所述探針長度為250bp；和/或(iv)所述探針是以病毒基因組作為模板，PCR法擴增獲得，較佳地，所述擴增模板為B型肝炎病毒(HBV)基因組、C型肝炎病毒(HCV)基因組、愛滋病病毒(HIV)基因組、乳頭瘤病毒(HPV)基因組，或其組合；更佳地所述樣本為B型HBV基因組和/或C型HBV基因組。
本發明還提供了一種所述探針的製備方法，在一個較佳例中，所述方法包括步驟：a.獲得病毒樣本；b.獲得樣本進行擴增，擴增中引入標記的dNTP，獲得標記的PCR擴增產物，標記的dNTP較佳為biotin-dNTP，標記的dNTP能夠與鏈黴素親和磁珠結合；c.對標記的PCR擴增產物進行片段化，即為探針；d.對獲得的探針進行純化和/或定量。
本發明所述探針的長度為100-500bp，較佳地，所述探針的長 度為200-300bp，更佳地所述探針的長度為250bp。
晶片
如本文所用，「晶片」一詞是指可以採用微加工技術在晶片的基底材料上加工出各種微細結構，施加必要的生物化學物質並進行表面處理，將各種探針分子與表面固定化，製得含有大量探針的材料。
本領域具有通常知識者可以使用通用的方法獲得晶片。DNA晶片製備方法通常有4種。第1種是光引導原位合成法，在微加工技術中用微影工藝與光化學合成法相結合。第2種方法是化學噴射法，將合成好的寡核苷酸探針定點噴射到晶片上並加以固定化來製作DNA晶片。第3種方法是接觸式點塗法，通過高速精密機械手的精確移動讓移液頭與玻璃晶片接觸而將DNA探針塗敷在晶片上。第4種方法是使用4支分別裝有A，T，G，C核苷的壓電噴頭在晶片上並行合成出DNA探針。
本發明提供了一種表面固定有用於檢測病毒基因整合方式的晶片。在一個較佳例中，所述病毒為HBV，較佳地，為B型HBV和C型HBV。本發明的晶片用於檢測病毒在待測宿主中的基因整合方式。
DNA庫及其製備
如本文所用，「DNA庫製備」一詞是指對基因組的目的片段進行打斷，獲得一組具有一定大小的DNA片段混合物。
樣本庫的製備方法為本領域具有通常知識者所熟知，包括(但不局限於)步驟： 對打斷的基因組DNA末端修復，使之具有平末端；加入接頭，對具有接頭的片段進行擴增，獲得的帶有接頭的混合物為庫。
在一個較佳例中，所述的接頭具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列。
在一個較佳例中，所構建的庫具有如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的標簽序列。
在一個較佳例中，還可以對打斷產物、末端修復產物、接頭產物和富集產物進行純化。純化條件及參數為本領域具有通常知識者所熟知，對反應的條件進行一定的變化或優化也在本領域具有通常知識者能力範圍之內。
高通量測序
新一代測序技術(NGS)改變了以往對DNA/RNA樣本的分析模式，幾乎成為所有研究領域中必不可少的研究工具。新一代測序技術是通過對上百萬條DNA短片段的同時的平行測序，使得在短時間內就能夠完成每個鹼基的測序，且成本大幅度降低。NGS技術在很多方面得到應用，如基因組學、轉錄組學、表觀基因組學、臨床診斷等。
本領域具有通常知識者通常可以採用多種第二代測序平臺進行高通量測序：包括但不限於illumina公司的Hiseq2000，454 FLX(Roche公司)、Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems公司的SOLID等。這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對於傳統測序的96道毛細管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列，根據平臺的不同，讀取長度從25bp到450bp不等， 因此不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取1G到14G不等的鹼基數。其中，Solexa高通量測序包括DNA簇形成和上機測序兩個步驟：PCR擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，並進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用「邊合成-邊測序法」進行測序。
DNA簇的形成是使用表面連有一層單鏈引子(primer)的測序晶片(flow cell)，單鏈狀態的DNA片段通過接頭序列與晶片表面的引子通過鹼基互補配對的原理被固定在晶片的表面，通過擴增反應，固定的單鏈DNA變為雙鏈DNA，雙鏈再次變性成為單鏈，其一端錨定在測序晶片上，另一端隨機和附近的另一個引子互補從而被錨定，形成「橋」；在測序晶片上同時有上千萬個DNA單分子發生以上的反應；形成的單鏈橋，以周圍的引子為擴增引子，在擴增晶片的表面再次擴增，形成雙鏈，雙鏈經變性成單鏈，再次成為橋，稱為下一輪擴增的模板繼續擴增；反復進行了30輪擴增後，每個單分子得到1000倍擴增，稱為單克隆的DNA簇。
DNA簇在Solexa測序儀上進行邊合成邊測序，測序反應中，四種鹼基分別標記不同的螢光，每個鹼基末端被保護鹼基封閉，單次反應只能加入一個鹼基，經過掃描，讀取該次反應的顏色後，該保護集團被除去，下一個反應可以繼續進行，如此反復，即得到鹼基的精確序列。在Solexa多重測序(Multiplexed Sequencing)過程中會使用INDEX(標簽或BARCODE)來區分樣品，並在常規測序完成後，針對INDEX部分額外進行7個循環的測序，通過INDEX的識別，最多可以在1條測序甬道中區分12種不同的樣品。
檢測方法
本發明還提供了一種檢測病毒在宿主細胞中基因整合方式的方法，以HBV病毒為例，在本發明的一個較佳例中，所述方法主要包括以下步驟：
1. HBV探針製作
對HBV全長基因組進行PCR，其中PCR過程中引入標記的dNTP；在一個較佳例中，所述標記dNTP為biotin-dNTP，biotin-dNTP與普通dNTP的比例是1：4，總濃度為2.5mM；
2.對HBV全長產物進行純化
在一個較佳例中，採用1.5倍體積AMPURE磁珠純化，後採用QIAGEN的250MinElute PCR Purification Kit純化；
3.對HBV全長產物進行片段化
將DNA轉移至緩衝液中，進行超音片段化；
4.探針與樣本雜交
樣品來源可為HBV患者或肝癌患者的血漿或組織，根據Illumina公司Paired-End Sample Preparation Guide(操作流程)進行庫構建；將探針與庫混合，捕獲特異性的樣本核酸片段。
5.洗脫
將捕獲到的核酸片段洗脫下來；
6.將上述洗脫下來的DNA進行PCR擴增和純化、定量；
7.上機測序系統及訊息分析
將上述純化後的PCR產物經進行高通量測序，測序平臺採用 ILLUMINA公司的HISEQ2000，對於測序長度不限於PEI101，也可採用PEI91。將下機數據除去重複和被接頭污染的reads，統計下機數據的基本訊息(例如：庫長度；reads長度；reads條數；鹼基數；重複率等)；分別截取PE的兩條reads前面的50bp鹼基，形成一對長為50bp新reads，即PE50reads。將新的PE50 reads運用soap比對軟體(-r 1 -v 2)分別與人的參考序列(hg19)和HBV各種參考序列進行比對，從比對結果中挑選出一條read比到人的參考序列並且另一條比對到HBV參考序列的一對reads；這樣的reads很有可能跨過HBV插入的位點；統計這部分reads比對訊息，找到在人類基因組的插入熱點區域。第5圖顯示了本發明檢測HBV在待測樣本基因整合方式的訊息分析流程。
試劑盒
本發明還提供了一種用於檢測病毒在宿主中整合方式的試劑盒，主要包括以下組分：(1)第一容器以及位於容器內的檢測晶片或探針集；(2)第二容器以及位於容器內的用於構建樣本庫的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的接頭封閉分子；(4)第四容器以及位於容器內的標簽封閉分子；(5)檢測說明書。
在另一較佳例中，所述試劑盒還包括選自下組的試劑：用於進行PCR擴增所需的試劑、用於進行封閉反應所需的試劑、用於進行雜交反應所需的試劑、用於進行測序反應所需的試劑、或其組合。
本發明的主要優點包括：
1.採用本發明製備探針所需的價格僅為現有技術製備價格的1%-5%；2.本發明在製作探針過程中形式靈活，可以按自身需要設計，比例加入HBV種類以及數量；3.製作探針過程簡單，通過PCR以及打斷純化即可得到探針，無須合成；4.本發明的探針為雙鏈探針，能夠降低因PCR原因引起的訊息錯誤及丟失；5.本發明的檢測方法可以與建庫技術聯合使用起到富集HBV片段的作用；具有廣泛的適用性。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限製本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
儀器和試劑
本方面用到的儀器和試劑見表1。
實施例1 樣本庫製備
1.樣本來源
樣品的來源為同一患者的肝癌組織，且此患者肝癌組織有全基因組測序訊息。
2.樣本庫製備
庫構建按照Illumina公司的標準庫製備流程說明書(Paired-End Sample Preparation Guide)進行構建，具體方法如下：採用Covaris s2打斷基因組DNA，末端補平修復，末端加A， 加入接頭，建庫過程所用的接頭為：SEQ ID NO：1 5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3’；SEQ ID NO：2 5’-TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
對加入接頭的片段進行PCR，得到樣本庫，所構建的庫帶有INDEX標簽序列。INDEX序列如下：SEQ ID NO：3 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’；SEQ ID NO：4 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’。
將樣本分別做成兩種片段大小庫，對構建庫片段進行片段大小檢測，主帶為170bp左右和800bp左右。
實施例2 製備HBV探針
1.引子設計
本實施例中，所設計的引子為：
P1(SEQ ID NO：5)：TTTTTCACCTCTGCCTAATCA
P2(SEQ ID NO：6)：AAAAAGTTGCATGGTGCTGG
2. PCR反應體系
PCR反應體系見表2。
表2
(注：dNTP中biotin-dNTP與普通dNTP的比例是1：4，總濃度為2.5mM)
3. PCR反應條件
PCR反應在AB-9700PCR儀上進行，反應程序見表3。
4. PCR純化及電泳檢測
反應結束後，採用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，並用1.2-1.5倍體積AMPURE BEADS純化，採用80ul水溶解。然後採 用250MinElute PCR Purification Kit純化，採用60μl水溶解。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物是否已經純化乾淨檢測結果見第1圖。
結果表明，擴增並純化出了大小約3.2K的HBV的片段。
5. PCR產物片段化
純化完成後，將DNA全部轉移至Covaris打斷小管並補加TE緩衝液至總體積為80μl(Nanodrop檢測其總量為5μg)，Covaris S2儀器(基因有限公司)打斷，打斷條件見表4。
6.片段化產物電泳檢測
2%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段的大小，結果表明，片段主帶在250-300bp(第2圖)。所獲得的片段化的產物即可用作雜交的探針。
7.探針保存
使用MinElute PCR Purification Kit純化片段產物，溶於40μl緩衝液中，用Nanodrop儀檢測探針DNA的濃度，使得探針的濃度為120ng/μl左右。得到的探針可以保存在-20℃或-80℃。
實施例3 HBV探針與樣本庫進行雜交
1.探針變性
探針使用前必須95℃變性10分鐘，然後迅速放於冰上冷却形成單鏈。
2.選用已確定的整合庫，庫用量為1μg，探針用量為600ng (Nanodrop定量)，加入接頭封閉分子，接頭封閉分子的量與庫量的比值為1nmol：1μg，標簽封閉分子與庫量的比值為1nmol：1μg。
接頭封閉分子序列為：SEQ ID NO：7 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
標簽封閉分子序列為：SEQ ID NO：8 5'-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'；SEQ ID NO：9 5'-AAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3'。
在一個1.5mL的EP管中加入1μg的待雜交庫，1nmol接頭封閉分子，1nmol標簽封閉分子，5μg Cot DNA。蓋好管蓋，用乾淨的50ml注射器針在分裝的EP管蓋上戳一個孔，然後置於60℃旋蒸儀中蒸乾。使用新的離心管管蓋替換戳孔的管蓋，並做好標記。EP管中分別加入EZ雜交系統中的兩種試劑：2×SC Hybridiation Buffer雜交緩衝液7.5 μl和1×SC Hybridiation Component A 3 μl，然後95℃變性10分鐘，在上述雜交混合物加入自製探針600ng，探針體積共5μl。震盪混勻後置於離心機上全速離心10秒，並將樣品全部轉移到200μl PCR小管中。
雜交混合物中含有的成分見表5。
將200μlPCR小管放置於PCR儀上，47℃條件下雜交24h。
實施例4 雜交後洗脫
1.準備鏈黴親和素磁珠(Invitrogen M280)
提前從冰箱中拿出鏈黴親和素磁珠；漩渦震盪磁珠1min，使其充分混勻；在1.5mL的EP管中加入100μl磁珠；將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；保持EP管在磁力架上，加入200 μl(2倍體積)的結合緩衝液(購於Agilent公司)；從磁力架上取下EP管，漩渦震盪10s，使其混勻；將EP管重新放回磁力架至液體澄清，用移液器小心地去除上清；重複清洗兩次；用100 μl的Agilent結合緩衝液懸浮磁珠；將其轉入0.2 ml的小管中；用磁力架結合磁珠(將小管靠到磁力架上)，直到液體澄清，用移液器小心去除上清；現在磁珠可以用來結合捕獲的DNA了。
2.將捕獲到的DNA結合到鏈黴素磁珠上
將雜交混合物吸出來，加到上步準備好的磁珠中；用移液器吹打10次混勻；將小管放在PCR儀上47℃孵育45 min(每隔15 min拿出來漩渦震盪3 s以防止磁珠沉澱)；孵育45 min後，將混合物從0.2mL的小管中轉入1.5 mL的EP管中。
3.洗滌結合了捕獲DNA的鏈黴親和素磁珠
1)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；2)加100 μL預熱到47℃的1×清洗緩衝液I；3)漩渦震盪10 s，使其混勻；4)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；5)從磁力架上取下EP管，加入200 μl預熱到47℃的1×嚴謹清洗緩衝液，用移液器吹打混勻10次(該步操作應迅速以儘量使管中液體溫度不低於47℃)；6)47℃孵育5 min；7)重複步驟5)-7)，總共用1×嚴謹清洗緩衝液洗兩次；8)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；9)加200 μL室溫下放置的1×清洗緩衝液I(不用47℃預熱的)，漩渦震盪2 min，使其混勻；10)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；11)加200 μL室溫下放置的1×Wash Buffer II，漩渦震盪1 min， 使其混勻；12)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清；13)加200 μL室溫下放置的1×Wash Buffer III，漩渦震盪30 s，使其混勻；14)將EP管置於磁力架上至液體澄清，用移液器小心地去除上清；15)從磁力架上取下EP管，加入76μl超純水(不用將DNA從磁珠上洗脫下來，可以直接進行PCR，取樣35μl進行後面的PCR反應)。
實施例5 PCR反應
預先從-20℃保存的試劑盒中取出PFX聚合酶(購於Invirtogen公司)，PFX反應緩衝液(10×)，dNTP(10mM)。引子序列為：PCR Flowcell-Primer F(10pm/μl)
SEQ ID NO：10 AATGATACGGCGACCACCGAGATC
PCR Flowcell-Primer R(10pm/μl)
SEQ ID NO：11 CAAGCAGAAGACGGCATACGA
在PCR小管上，每孔按照表格6配置PCR反應體系。
反應條件見表7。
PCR結束後，每個樣品都用1.5倍體積的Amprue Beads純化，回收的PCR產物溶於30μl超純水中，Nanodrop1000測濃度。
實施例6 PCR產物上機測序
上述純化後的PCR產物經2100 Bioanalyzer(Agilent)確定大小及插入片段大小見第3圖，純化產物大小分別為271bp和876bp，QPCR精確定量後上機測序。在本實施例中，上機測序按照Illumina/Solexa官方公布的c-Bot和HISEQ2000Hiseq 2000說明書進行操作。
實施例7 訊息分析
將下機數據除去重複和被接頭污染的reads，統計下機數據的基本訊息(庫長度；reads長度；reads條數；鹼基數；重複率等)；分別截取PE的兩條reads前面的50bp鹼基，形成一對長為50bp新reads，即PE50reads。將新的PE50 reads運用soap比對軟體(-r 1 -v 2)分別與人的參考序列(hg19)和HBV各種參考序列進行比對，從比對結果中挑選出一條read比到人的參考序列並且另一條比對到HBV參考序列的一對reads；這樣的reads很有可能跨過HBV插入的位點；統計這部分reads比對訊息，找到在人類基因組的插入熱點區域。
雜交結果見表8。
表8的結果為採用上機數據得到結果，樣本L-170，L-800，Genome均來自同一肝癌樣本，L-170為插入片段170bp，L-800為 800bp庫，genome為全基因組測序。從表8中可以得出自製探針對於捕獲基因片段的準確性，以及片段長度的影響。通過本發明的方法完全可以得到穩定以及可靠的位點，且所需數據量僅為全基因組測序數據的1%左右。
實施例8 製備試劑盒
一種可用於檢測病毒在待測樣本中整合方式的試劑盒，包括以下組分：
(1)第一容器以及位於容器內核酸晶片；
(2)第二容器以及位於容器內的用於構建樣本庫的接頭；
(3)第三容器以及位於容器內的接頭封閉分子；
(4)第四容器以及位於容器內的標簽封閉分子；
(5)第五容器以及位於容器內的用於進行PCR擴增所需的試劑；
(6)第六容器以及位於容器內的用於進行封閉反應所需的試劑；
(7)第七容器以及位於容器內的用於進行雜交反應所需的試劑；
(8)第八容器以及位於容器內的用於進行測序反應所需的試劑。
(9)檢測說明書。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域具有通常知識者可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍 所做之均等變化與修飾，皆應屬本發明之涵蓋範圍。
下列圖式用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由申請專利範圍所界定的本發明範圍。
第1圖顯示了對HBV全基因組PCR擴增後的電泳檢測結果，基因組全長約為3.2K。
第2圖顯示了對HBV全長產物打斷後電泳檢測結果，打斷的片段大小集中於250bp-300bp之間。
第3圖顯示了建庫雜交後兩種庫片斷大小檢測結果，分別為271bp和876bp。
第4圖顯示了本發明檢測HBV在待測樣本基因整合方式的流程。
第5圖顯示了本發明檢測HBV在待測樣本基因整合方式的訊息分析流程。
<110> 深圳華大基因科技有限公司 深圳華大基因研究院
<120> 一種檢測病毒在待測樣本中整合方式的探針及其製備方法和應用
<130> P2011-0544
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
<210> 9
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11

Claims (11)

  1. 一種核酸探針集，包括多個探針，其中，所述探針集具有以下特徵：(1)每個探針上具有1個或多個生物素標記的dNTP；和/或(2)生物素標記的dNTP在探針集中的豐度為1：6-1：2。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的核酸探針集，其中，所述探針集具有以下特徵：所述探針集的全部核酸序列覆蓋對應病毒基因組序列的70%-100%。
  3. 一種表面固定有如申請專利範圍第1項所述核酸探針集的核酸晶片。
  4. 如申請專利範圍第1項所述核酸探針集或申請專利範圍第3項所述核酸晶片的用途，其中，用於檢測病毒在待樣本中的整合方式；所述的整合方式選自下組：重排、異位、插入、替換，或其組合。
  5. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之核酸探針集的方法，其中，包括步驟：a.獲得探針來源樣本；b.對步驟a獲得的樣本進行PCR擴增，PCR擴增體系的dNTP為生物素標記的dNTP，獲得帶有生物素標記的PCR擴增產物；以 及c.對步驟b獲得的生物素標記的PCR擴增產物進行打斷，得到片段化的生物素標記的PCR擴增產物，即為探針。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中，還包括步驟d：對步驟c獲得的探針進行純化和/或定量。
  7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中，所述探針的長度為100-500 bp。
  8. 一種檢測病毒在待測樣本中基因整合方式的方法，其中，包括步驟：(i)獲得待測樣本；(ii)對步驟(i)獲得的樣本進行庫構建；(iii)將申請專利範圍第1項所述的探針集包括的探針與步驟(ii)獲得的庫進行雜交，捕獲與病毒基因整合有關的核酸序列；(iv)對步驟(iii)捕獲的核酸序列進行擴增，獲得與病毒整合有關的擴增產物；以及(v)對步驟(iv)獲得的擴增產物進行測序，獲得與病毒整合方式有關核酸訊息。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，在步驟(v)中，將所述的擴增產物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，進行固相 橋式PCR擴增，形成測序簇；然後對所述測序簇用「邊合成-邊測序」法進行測序，從而得到與病毒整合方式有關核酸訊息。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中，在步驟(ii)中，所述的庫構建為：對打斷的基因組DNA進行末端修復，加入接頭，對具有接頭的片段進行擴增，獲得的帶有接頭的擴增混合物即為樣本庫。
  11. 一種可用於申請專利範圍第8-10中任一項所述方法的試劑盒，其中，所述試劑盒包括：(1)第一容器以及位於容器內申請專利範圍第2項所述的核酸晶片，或申請專利範圍第1項所述的核酸探針集；(2)第二容器以及位於容器內的用於構建樣本庫的接頭；(3)第三容器以及位於容器內的接頭封閉分子；以及(4)第四容器以及位於容器內的標簽封閉分子。
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