KR20180082588A - 조직 샘플에서의 약물 결합 분석 방법 - Google Patents

조직 샘플에서의 약물 결합 분석 방법 Download PDF

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Abstract

치환 경쟁 억제를 이용하여 샘플의 결합 부위에 가역적으로 결합하는 리간드의 특이적 결합을 측정하는 방법이 기재된다. 방법은 제1 조직 표본 상에 표지화된 리간드의 부재 하에 리간드(표지화되지 않음)를 배양하는 단계, 제2 조직 표본 상에 표지화된 리간드의 존재 하에 리간드(표지화되지 않음)를 배양하는 단계를 포함하되, 제1 및 제2 조직 표본은 표본의 인접한 절편이다. MALDI 이미징 질량 분광법은 후속적으로 각각 제1 및 제2 조직 표본을 사용하여 결합된 리간드 국소화를 시각화하는데 사용된다.

Description

조직 샘플에서의 약물 결합 분석 방법
본 발명은 일반적으로 질량 분광 이미징의 분야에 관한 것이다. 더 특히 방법은 약물 특이성 및 약물 선택성을 분석하는 능력에 관한 것이고, 특히, 본 발명은 질량 분광 이미징에 의한 환자 샘플에서 약물 및 대사물질(들)의 존재 및 국소화(localization)를 측정할 수 있는 다중모드 방법을 기술한다.
건강관리에서 끝없이 증가하는 요구는 현재 개선된 비용 효율과 함께 임상 결과를 개선시킬 수 있는 새로운 해결책을 확립하고 찾는 연구 단체에 대한 높은 전망 및 요구에 대한 자세를 취하는 것으로 알려져 있다.
이들 문제점에 대응하여, 현대 건강관리는 환자에게 더 효율적이며 동시에 유리할 뿐만 아니라 더 많은 비용 절감으로 환자를 치료하는 방법을 모색하고 있다. 예를 들면, 더 안전하며 더 낮은 사망률 및 효능의 빠른 개시를 갖는 약물을 예상하는 암 환자로부터의 요구를 만족시키는 것을 가능하게 하기 위하여, 규제 지침의 도입은 우리의 연구 단체에 중심이 된다.
따라서, 의사가 질환을 진단하는 것 및 치료법에 대한 환자 반응의 나타내는 것 둘 다를 가능하게 하는, 신규한 진단 방법에 대한 요구가 존재한다.
국립 암 연구소, NIH 및 지역 임상의 및 과학자와 함께, 단백질 바이오마커 발견 및 확인 전략을 고안하고 제공하도록 만들어진 비싼 과정이 존재하였다. 이들 규제 지침은 건강, 질환, 치료법에 대한 반응의 고품질의 표준화되고 민감하고 특이적이며 정량적이고 용이하게 접근 가능한 단백질, 펩타이드, 또는 다른 바이오마커를 규제 기관(예를 들면, 미국 식품의약품국: FDA)의 승인 절차로 제공한다. 이들 개발은 약물 작용 메커니즘의 이해 방식에 의한 진단을 개선시키고, 초기 단계에서 암을 검출하고, 암 재발의 가능성을 확인하고, 차등적인 생존으로 단계를 계층화시키기 위하여 건강관리 전문가에게 필수적이다.
암은 또한 악성 신생물 또는 병리적인 악성 종양 발달로도 알려져 있다. 암 질환 메커니즘은 신체 내의 기관 및 부위의 다른 부분으로의 이들 암 세포의 침윤 및 가장 가능한 확산을 야기할 것인 비정상 세포 성장을 포함한다. 증상의 가장 흔한 징후는 일반적으로 비정상 출혈, 및/또는 너무 긴 기침, 예상되지 않은 체중 손실 및 장 운동의 변화를 포함하고, 이들 증상은 암을 지시할 수 있고, 이들은 또한 다른 조직으로 인하여 발생할 수 있고, 인간이 걸린 다른 공지된 수백 종의 암이 존재할 수 있다.
암 사망의 약 22%의 원인이 담배 사용으로 인한 것이라는 것은 잘 알려진 사실이다. 또 다른 10%는 과체중 및 비만, 불량한 식단, 및 종종 육체적 운동 및 알코올 소비로 인한 것이다. 다른 인자는 특정한 감염 및/또는 감염 및 환경 오염물질에 대한 노출을 포함한다. 개발도상국에서 암의 약 20%는 감염, 예를 들면, B형 간염, C형 간염 및 인간 유두종 바이러스로 인한 것이다. 이들 인자는, 적어도 부분적으로, 세포의 유전자 및 단백질의 변화에 의하여 작용한다. 전형적으로 많은 이러한 유전적 변화는 암이 발달하기 전에 필요하다. 통계적으로, 암의 약 5-10%는 사람의 부모로부터 유전된 유전적 결함으로 인한 것이다.
암 확산 및 질환의 초기 단계는 특정한 징후 및 증상 또는 진단 시험에 의해 검출될 수 있다. 그 다음, 이는 전형적으로 다양한 유형의 의학적 이미징 플랫폼, 예를 들면, X선, CT, PET, MRI 또는 질량 분광 이미징에 의해 추가로 조사되고, 생검의 병리학적 진단에 의해 확인된다. 유방암에서 스크리닝의 이득은, 여성 및 유방암뿐만 아니라 전립선암을 갖는 남성의 치료에 의해 입증된 바와 같이, 환자뿐만 아니라 우리 사회에도 가치가 있고, 여기서 두 질환 모두에서 진단 개발은 지난 10년간 유의미하게 감소된 사망률을 갖는다.
암은 종종 방사능 요법, 수술 및/또는 화학요법의 몇몇 조합에 의해 치료된다. 최근에, 표적 요법이 매우 효율적인 것으로 입증되었다. 생존 가능성은 암의 유형 및 임의의 유형의 치료법 치료의 시작 시 질환의 정도에 따라 좌우된다. 암의 전세계적인 통계는 임의의 국가에서 건강관리 부분에 대한 도전이다. 2012년에 전세계적으로 약 14,000,000명의 새로운 암 환자가 발생하였다는 것이 확인되었고, 이들 데이터는 피부암 및 다른 유형의 악성 흑색종을 갖는 환자를 포함하지 않는다. 이는 전세계적으로 약 8,200,000명의 사망 또는 전체 사망률의 14.6%를 야기하였다.
남성에서 가장 흔한 암 유형은 폐암, 전립선암, 대장암 및 위암이다. 여성에서 가장 빈번한 사례는 유방암, 대장암, 폐암 및 자궁경부암이다. 그러나, 누군가 피부 및 모든 유형의 악성 흑색종을 포함하는 경우, 이는 사례의 약 40%를 차지할 것이다. 소아와 관련하여, 암 유형은 다양하고, 가장 흔한 것은 급성 림프모구 백혈병 및 뇌 종양이다. 그러나 아프리카에서 가장 흔한 암 질환은 비호지킨성 림프종이다. 암의 금융 비용은 2010년 년간 1.16조 미국 달러로 추정되었다.
개인맞춤 의약은 개인 환자에게 맞춰진 의학적 치료 모델이다. 개인맞춤 의약에서 최적 요법은 종종 환자의 성별 내용 또는 다른 분자 또는 세포 분석의 맥락을 기반으로 적절한 치료를 선탁하기 위하여 사용된다.
유전자 정보, 약물유전체학의 사용은 개인맞춤 의약의 특정한 관점에서 중요한 역할을 하였고, 용어는 이것이 모든 종류의 표적화된 개인 판독 진단 시험을 포함할 정도로 광범위함에도 불구하고 유전학의 맥락에서 처음 만들어졌다.
개인맞춤 의약에서 일부 현대적인 발전은 질환의 확인을 초기에 확인하기 위하여 DNA/RNA 및/또는 단백질의 맵핑에 의한 환자의 기초 생물학을 확인하는 "OMICS" 기술(-omics로 끝나는 생물학 연구 분야, 예를 들면, 유전체학(genomics), 단백체학(proteomics) 또는 대사체학(metabolomics))에 기반한다. 4P 의약의 개념은 이들 OMICS 플랫폼을 이용하고, 오늘날 현재 건강관리에서 의무적인 역할을 하고, 여기서 오바마(Obama) 건강관리 시스템은 이의 발달에 대한 유의미한 자원을 투자한다.
지원적인 생체분자 분석에 의해, 정해진 질환 돌연변이 및 특정한 질환과 연결될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 연구자는 종종 GWAS, 유전체 다형 분석으로 지칭되는 연구를 수행한다. GWAS 연구는 하나의 질환을 살필 것이고, 그 다음, 유전체에서 공유된 돌연변이를 찾기 위하여 그 특정한 질환을 갖는 많은 환자의 유전체의 서열을 살필 것이다.
그 다음, GWAS 분석에 의해 질환과 관련된다고 결정되는 특이적인 체세포 또는 점 돌연변이는 동일한 돌연변이를 찾기 위하여 이들 유전체 서열을 살핌으로써, 특이적인 질환 유전형 및 가능하게는 표현형을 진단하는데 사용될 수 있다.
다중 유전자는 총체적으로 많은 흔하고 복잡한 질환의 발달의 가능성에 영향을 준다. 그 결과, 개인맞춤 의약에서 발전은 개인 및 이들의 유전체 특징에 특이적인 것으로 입증된 치료 접근의 유의미한 다양화를 생성할 것이다. 개인맞춤 의약은 더 우수한 진단 발달을 제공함으로써 효능을 개선시킬 것이고, 이는 더 빠른 개입 및 더 효율적인 약물 개발 및 치료법을 야기한다.
개인 기반으로 각각 및 모든 환자를 조사할 수 있는 것은 더 정확한 진단 및 개인맞춤 치료 계획을 가능하게 할 것이다. 현대 유전형 분석은 개인의 DNA 서열의 상세한 설명을 제공하고; 이들의 유전체는 가능한 질환 상태를 설명할 수 있는 기존의 유전적 변이를 평가하기 위하여 참조 유전체와 비교될 수 있다.
정확한 치료 이외에, 개인맞춤 의약은 예방적 관리의 발달에서 크게 도움이 될 수 있다. 이는 수년간 입증되었고, 여기서 여성은 각각 BRCA1 및 BRCA2 유전자에서 특정한 돌연변이가 있는 유전형인 경우, 유방암 또는 난소암의 가족력으로 인한 소인을 조사한다.
유전체 내에 존재하는 돌연변이에 따라 맵핑된 진단 표시의 다수의 공급원의 확인은 이들이 개인에서 확인될 수 있는 더 용이할수록 성공적인 치료에 대한 더 우수한 기회가 있다는 것이 지시한다.
개인의 유전적 내용을 갖는 것은 질환의 공급원을 결정하고 따라서 이를 치료하거나 이의 발달을 예방하는데 더 우수한 안내된 결정을 허용할 것이다.
동반 진단학은 표적화된 환자군 또는 하위군에 특이적인 약물의 효능 및 안전성을 시험하는데 사용되는 정의이다. 많은 경우에 동반 진단학 검정은 치료학적 치료 효능을 개선시키는 것을 돕는다.
오늘날, 현대 건강관리에서, 의사는 종종 이들이 이들의 환자에게 가장 효율적인 치료법을 찾을 때까지 시행착오 전략을 사용하는 것이 흔하다.
개인맞춤 의약과 관련하여, 이들의 유전체 및 최종 발현된 단백질에 의한 후속적인 전사를 기반으로 작용할 것인 경우, 이들 치료는 개인에게 더 특이적으로 맞춰지고 이들의 신체가 약물에 반응하는 방식에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.
최근에, 암 분야는 전통적인 질환 병리학에 나타난 암 유형의 유전적 다양성에 대하여 많은 것을 발견하였다. 암 환자 중에서 종양 이종성의 정의는 단일 종양 내의 유전적 다양성이다. 다른 예상 중에서, 이들 발견은 확인의 가능성을 증가시키고, 그 약물은 일반적인 집단에 적용된 불량한 결과를 갖지만 특정한 유전적 프로파일을 갖는 경우의 집단에 대해서는 성공적일 수 있다.
문헌[Ho Jeong Kwon et.al.(Arch. Pharm. Res.(2015) 38:1718-1727)]에서, MALDI 질량 분광 이미징(MSI)은 조직 샘플의 이차원 공간 내의 표지화되지 않은 소분자의 정확한 시각화를 허용하는 기술 플랫폼을 제공하는 것으로 나타났다. BRAF 돌연변이 단백질을 표적으로 하는 단백질 키나제 억제제인 베무라페닙(Vemurafenib)이 투여된 환자에서 악성 흑색종과 같은 다양한 암에서 질량 분광 이미징 데이터가 또한 제공된다.
그러므로, 개인을 고려하여 개선된 치료 방법은 매우 복잡한 질환 생물학에서 치료의 지침을 보조할 수 있는 신규한 방법과 함께 유리할 것이다.
따라서, 본 발명은 바람직하게는 치환 경쟁 억제(displacement competitive inhibition)를 이용하는 조직 샘플에서 결합 부위에 가역적으로 결합하는 리간드의 특이적 결합을 측정하는 방법을 제공함으로써 당해 분야에서 상기 확인된 결핍 중 하나 이상의 경감시키거나 완화시키거나 제거하는 것을 추구한다. 방법은 제1 조직 표면 상에 표지화된 리간드의 부재 하에 리간드를 배양하는 단계, 제2 조직 표면 상에 표지화된 리간드의 존재 하에 리간드를 배양하는 단계를 포함하고, 제1 및 제2 조직 표본은 표본의 인접한 부분이다. MALDI 이미징 질량 분광법은 후속적으로 각각 제1 및 제2 조직 표본을 사용하여 결합된 리간드 국소화를 시각화하는데 사용된다.
본 발명이 사용할 수 있는 이들 및 다른 양태, 특징 및 이점은, 첨부된 도면을 참조하여, 본 발명의 실시형태의 하기 설명으로부터 명백하고 확실해질 것이고, 여기서
도 1은 (A) 조직학적으로 염색된(H&E) 조직 절편, (B) 매트릭스(MS 매트릭스)와 함께 함침된 조직 절편, (C) MS 실험으로부터의 약물로부터의 이온 신호 및 (D) 조직학 부분과 이온 채널의 오버레이를 보여주는 MSI 실험 절차의 도면이고;
도 2는 방법의 약물 정량 원리 및 (B 및 C) 질량 분광 이미징에 의한 약물 농도 및 신호 반응 사이의 (A) 선형 관계의 도면이고;
도 3은 (A) 종양 조직 전반에서 각각의 조직 절편 사이의 10 마이크로미터의 조직학 부분의 이미지, 및 (B) 약물 화합물의 질량 분광 조직 이미징 및 이의 특이적인 국소화를 보여주고;
도 4는 (A) 약물 베무라페닙의 분자 구조 및 (B) 동위원소 표지화된 13C-베무라페닙의 분자 구조를 도시하고, 여기서 별표는 탄소-13 동위원소를 나타내고;
도 5는 흑색종 암 종양으로부터 발생된 MSI 이미지를 보여주고, 여기서 (A) 베무라페닙 신호 반응은 MS-모드(m/z 490.078)로 나타나고, (B) 모 이온으로부터 발생된 단편 이온을 보여주고(MS/MS, (m/z 383.1)), (C) 베무라페닙 화합물 신호로부터의 제2 단편 이온을 보여주고(MS/MS, (m/z 262.1)), (D) 모든 3개의 신호의 오버레이를 보여주고;
도 6은 암 환자의 조직 절편으로부터의 이미지 캡처를 보여주고, 여기서 단일 세포 배치 형태학이 도시되고;
도 7은 (B) 100nM 베무라페닙이 조직 내에 투여된 암 환자의 조직 절편으로부터의 이미지 캡처를 상응하는 조직학 이미지(A)와 함께 보여주고, 그 다음, (C) 100 mM 13C-베무라페닙의 경쟁적 결합 후, 베무라페닙(m/z 383.1)을 살피기 위한, 100 mM 13C-베무라페닙(m/z 389.1) 및 100nM 베무라페닙(m/z 383.1)이 조직 내에 투여되는 실험을 상응하는 조직학 이미지(D)와 함께 보여주고;
도 8은 (A) 100nM 베무라페닙이 투여된 BRAF 표적 단백질에 V600E 돌연변이가 결핍된 환자로부터의 조직 절편으로부터의 베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고(음성 대조군), (B) 100nM 베무라페닙이 BRAF 표적 단백질에 V600E 돌연변이를 갖는 환자로부터의 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고, (C) 100nM 베무라페닙 및 1μM 13C-베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 13C-베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고;
도 9는 (A) 베무라페닙(100nM)이 BRAF 표적 단백질에 V600E BRAF 돌연변이를 갖는 환자로부터의 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고, (B) 베무라페닙이 BRAF 표적 단백질에 V600E BRAF 돌연변이가 결핍된 환자로부터의 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고, (C) 100nM 베무라페닙 및 1μM 13C-베무라페닙이 BRAF 표적 단백질에 V600E BRAF 돌연변이를 갖는 환자에게 투여된 조직 절편의 세포로부터의 13C-베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고;
도 10 (A) 내지 (D)는 공동-배양 적정 실험에 대한 이미지 캡처를 보여주고, 여기서 고정된 농도의 베무라페닙이 조직 샘플로 투여되고, 13C-베무라페닙이 각각 (A) 내지 (D)로부터의 증가하는 일련의 적정 농도, 100nM, 1μM, 10μM, 100μM로 첨가되고, 배양 후, 13C-베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 389.1)이 측정된다.
하기 설명은 조직 샘플에서 약물 특이성 및 약물 선택성을 측정하는 질량 분광 방법 및, 특히 질량 분광 이미징에 의한 환자 샘플에서 단일 또는 다중 약물(들) 및 대사물질(들)의 존재를 스크리닝할 수 있는 다중모드 검정, 및 환자 조직 샘플과 약물 상호작용 성질을 특성화하는 방법에 적용 가능한 본 발명의 실시형태에 중점을 둔다. 그러나, 본 발명은 이 적용으로 제한되지 않지만, 조직 샘플에서 분자 성질 및 상호작용의 측정의 다른 응용에 적용될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
질량 분광법(Mass spectrometry: MS)은 임의의 정해진 분자의 내재적 성질, 이의 질량을 매우 높은 민감성으로 측정하기 때문에 가치있는 분석 기술이다. MS는 그러므로 광범위한 분자 유형 및 광범위한 샘플 유형/생물학적 물질을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 이온화 공정에서, 전구체 이온은 이에 의해 일부 형성된 단편 이온이 트랩 내에서 불안정한 조건하에 질량-선택적 선형 이온 트랩으로의 가속화에 의해 활성화된다. 시간 지연 후 이온 트랩의 안정성 파라미터는 이전에 불안정했던 단편의 캡처를 허용하도록 변한다. 결과는 변형된 내부 에너지 분포를 갖는 전구체 이온으로부터 기원한 생성물 이온 스펙트럼이다. 전구체 이온의 선형 이온 트랩으로의 입장 후 수 밀리초 동안 전구체 내부 에너지 분포의 발전이 뒤따르는 것이 가능하다. 시간-지연된 단편화 생성물 이온 스펙트럼은 전형적으로 더 용이하게 해석되는 스펙트럼을 야기하는 감소된 순차적 단편화 생성물을 나타낸다. 시간-지연된 단편화에 중요한 몇몇 중요한 실험 파라미터가 확인되었고, 기술은 작은 전구체 이온 및 다중 변화된 분자 둘 다에 대한 적용을 갖는다.
탠덤 질량 분광법(MS/MS)은 착물 혼합물의 현대 질량 분광 조사에서 가장 핵심에 있다. 단편화는 표적 기체와의 충돌을 통해 전구체 이온의 활성화를 포함하고, 변화된 및 중성 단편을 생성할 수 있다. 단편 이온의 성질뿐만 아니라 이들의 강도는 종종 전구체 이온의 구조를 나타내고, 따라서 미지의 분석물의 확인을 위한 유용한 정보를 제공할 수 있을 뿐만 아니라 상이한 부류의 분석물에 대하여 유용한 스크리닝 기술을 제공한다. 다중 충돌을 통한 활성화는 활성화 시간을 연장하고 더 높은 에너지를 전구체 이온으로 배치되도록 한다. 더 높은 충돌 기체 압력은 또한 더 높은 충돌 이완 비율을 암시한다.
매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화(matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI)는 질량 분광법에서 사용되는 소프트 이온화 기술이다. 전통적인 MALDI는 세 단계 공정이고, 여기서 샘플을 적합한 매트릭스 물질과 혼합하고 샘플 금속 플레이트에 적용한다. 맥동형 레이저로 샘플을 조사하고, 분석물 분자를 용제된 기체의 핫 플럼에서 양자화 또는 탈양자화됨으로써 이온화시킨 다음, 분석을 위하여 질량 분광기로 가속화될 수 있다.
MALDI 질량 분광 이미징은 질량 분광 이미징 기술을 갖는 매트릭스 보조 레이저 탈착(MALDI-MSI)의 사용으로서 정의되고, 여기서 샘플은 얇은 조직 절편으로 구성된다. 조직 절편 샘플의 제조는 MSI에서 필수적인 단계이다. MALDI 매트릭스는 전도성 현미경 슬라이드에 삽입된 얇은 조직 슬라이스에 첨가된다. 매트릭스 성분은 반드시 레이저 파장에서 흡수되어야 하며 분석물을 이온화시켜야 한다. 매트릭스 선택 및 용매 시스템은 이미징에서 목적하는 분석물 분류에 따라 크게 좌우된다. 분석물은 매트릭스를 혼합하고 재결정화시키기 위하여 반드시 용매 중에 용해성이어야 한다. 매트릭스는 민감성, 강도, 및 샷 간의 재현성을 증가시키기 위하여 반드시 균질한 코팅을 가져야 한다. 최소 용매는 비국소화를 피하기 위하여 매트릭스에 적용시 사용된다.
이러한 단계 후, 현미경 슬라이드를 MALDI 질량 분광기에 삽입한다. 장치는 분자 종, 예를 들면, 약물 화합물, 및 대사물질 약물 분자의 공간적 분포를 기록할 것이다. 그 후, 적합한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 시각화 및 샘플의 광학 이미지와의 비교를 허용하기 위하여 질량 분광기로부터 데이터를 들여오기(import)할 수 있다.
조직 절편은 또한 MSI 조사가 완료된 후 조직학 염색을 겪을 수 있다. 이는 흥미있는 면적을 표적화하기 위하여 수행되고, 흥미있는 분자를 억제하는 종을 제거하기 위하여 세척으로 전처리된다.
도 1은 MSI 실험적 절차를 도시한다. 조직은 조직학 염색에 의해 특성화된다. MSI 실험은 매트릭스 침착에 의해 만들어지고, MSI 실험 후, 약물 분석의 제공에 의해 수행된다. 조직학 부분 이미지 및 이온 신호는 과장될 수 있고 두 이미지를 겹치고 공통적인 공동-국소화를 확인함으로써 가장 오른쪽 이미지 캡처로 나타낼 수 있다. 오버레이는 조직 내의 종양 세포 국소화 약물의 공동-국소화의 증거를 제공한다. 이미지는 샘플로부터의 데이터의 상대적인 위치에 대하여 이온 강도를 플롯팅함으로써 구성되고, 여기서 공간 해상도는 분석으로부터 수득된 분자 정보에 크게 영향을 미친다.
생물학적 연구에 대한 이 기술의 적용은 이의 도입 이후로 유의미하게 증가하였다. MALDI-MSI는 질환의 이해, 진단의 개선, 및 약물 전달에 중대한 기여를 제공하고 있다. MALDI-MSI는 약물과 대사물질을 구별하고 암 연구에서 조직학 정보를 제공할 수 있었고, 이는 이를 신규한 단백질 바이오마터를 찾는 유망한 도구로 만든다. 질량 분광 이미징(MSI) 기술은 현재 약제학 산업에서 약물 발견뿐만 아니라 약물 개발 과정에서 이용된다.
약물 특성화와 관련하여, MSI 기술은 주요 기관에서 약물 분포를 조사하기 위하여 산업에서 이용되어 왔다. 가능한 약물 독성 및 약물 대사작용과 함께 ADME 약동학적 성질은 신규한 약물 독립체를 승인하기 위하여 FDA 및 EMEA 기관이 요구하는 주요 규제 고려사항이고, 여기서 동물 모델이 흔히 사용된다. 요즘에는, MALDI 플랫폼은 약물공학 및 생명공학 산업뿐만 아니라 국립 연구원 및 학계에서 적용되는 가장 흔한 질량 분광법 기술이다.
조직 내의 마이크로-이질성은 매트릭스 내부 표준을 사용함으로써 보정될 수 있고, 그 후 데이터 및 정량 정규화를 위하여 사용된다. 조직 표면 위의 매트릭스 결정의 균일한 얇은 층에 의한 내부 표준이 (있거나 없는) 매트릭스의 전체 조직 범위는 재현 가능한 고품질의 데이터를 제공하기 위하여 의무적으로 중요하다.
약물의 정량은 MALDI/MSI에 의해 만들어질 수 있으며 수년간 개발되어 왔고, 예시는 도 2(C)에 도시된다. 약물 정량은 약물 용액 제조의 공지된 농도를 적용함으로써 달성될 수 있고, 이를 조직 표면에 적용한다(B). 그 다음, 다양한 수준의 약물 용액을 MALDI 이미징 실험에 의해 분석한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 수득된 신호 반응 강도를 약물 농도에 대하여 플롯팅할 수 있고, 선형 관계를 교정 실험(A)에서 확립할 수 있다.
MALDI/MSI는 표지-무함유이고, 천연 약물 구조 및 임의의 조직 환경에서 이의 대사물질에 적용될 수 있다. 약물 확산이 기관을 통해 발생함에 따라, 농도 구배가 다양한 세포 층을 통해 발생할 것이다. 조직 전반에서 세포간 또는 세포 내에 편재된 이러한 약물 및 대사물질(들) 배치는 조직의 미세환경뿐만 아니라 정해진 약물 구조에 대한 약동학적 변수에 따라 좌우될 것이다. 조직 구조 및 형태학 전반에서 농도 구배에서 약물의 확인된 공간 분포는 도 3A-B에 나타내고, 이는 약물 수준을 정렬하고 이것과 조직 형태학의 관련성을 보여주는 것을 가능하게 만든다. 도 3에서, 여기서 인접한 부분에서 정렬된 조직의 조직학 이미지(도 3A)는 종양의 구조 및 형태학을 설명한다. 종양 환경은 베무라페닙(MS m/z 490.078)을 분석하는 약물 이미지 데이터(MSI 실험, 도 3B에 도시됨)를 위한 구조물로서 사용된다. 볼 수 있는 바와 같이, 상이한 조직 구조 원소는 베무라페닙 신호와 공동-국소화된다.
다수의 상이한 MS-기반 정량 방법이 지난 10년간 개발되었고, 이는 일반적으로 이와 비교되는 표준의 일부 종류를 포함하는 적은 수의 기초 기술을 기반으로 한다.
상대적인 정량 약물 이미징 방법은 둘 이상의 샘플 사이의 상대적인 존재비를 측정하고, 표지-기반과 표지-무함유 방법으로 나눌 수 있다. 상이한 기술은 상이한 이점을 제공하고; 예를 들면, 일부 샘플(예를 들면, 인간 조직)에 대하여 종종 비현실적임에도 불구하고, 잠재적으로 하나의 세포의 모든 분자를 표지화는 생체내 표지화는 더 효율적인 반면, 시험관내 방법은 원칙적으로 임의의 유형의 샘플에 적용할 수 있다. 모든 경우에, 약물 분자 수준에서 정량적 값을 계산하기 위한 공통적인 어려움이 존재한다.
MS-기반의 이미징 정량 방법은 절대적인 정량, 및/또는 상대적인 정량의 두 군으로 분류될 수 있다.
표지 무함유 약물 분자는 하나의 신호 반응을 또 다른 것에 각각의 신호 판독 신호로 관련짓는 상대적인 분석 방법에 의해 정량될 수 있다. 피크 강도를 측정하고 상이한 실험에서 일치된 분자에 대하여 비를 계산한다.
절대적인 정량은 어려운 것으로 입증되었고, 전략은 종종 약물 분자의 표지화된 버전의 사용을 포함한다. 약물 화합물은 일반적으로 구조 내에 안정한 동위원소를 도입하고, 이로써 예측 가능한 반식으로 임의의 정해진 샘플에서 모든 다른 분자의 질량을 변경함으로써 구별될 수 있다(도 4에 도시된 바와 같음). 이들 안정한 동위원소는 생체내에서, 모든 약물 화합물 분자로 (이상적으로) 대사작용적으로 도입될 수 있거나, 화학 시약은 시험관내에서 표지화에 사용될 수 있다. 동위원소 표지화된 약물은 비표지화된 약물로서 정확하게 동일한 물리-화학적 성질을 갖는다.
암 질환을 갖는 환자에 있어서 적은 수의 치료학적 선택권이 현재 존재하고, 이 치명적인 질환의 발병에 대한 새로운 통찰력이 긴급하게 필요하다. 설치류에서 질환 모델과의 조합으로서 예비 조사에서 환자 연구는 우리 연구팀이 수년간 취해 온 전략이었다. 추가로, 한편으로는 정해진 설치류 모델과 투여된 약물 사이의 상관관계 및 온전한 종양 환경과 단리된 기관으로부터의 조직 절편에 대한 제어된 투여를 이용하는 능력은 질환 모델에서 약물 특성화를 위한 가치있는 도구이다.
본 발명의 근본적인 연구에서, 후기 흑색종의 치료를 위한 베무라페닙, BRAF 효소 억제제는 약물-종양 상호작용을 연구하는데 사용된다. 베무라페닙은 B-Raf/MEK/ERK 경로에서 B-Raf/MEK 단계를 방해함으로써 흑색종 세포주에서 프로그래밍된 세포 사멸을 유발하는 것으로 나타났다. 도 4A는 약물 베무라페닙의 분자 구조를 나타낸다(여기서, 별표는 13C 동위원소를 나타냄). 표지화된 13C-베무라페닙에서 탄소-13 동위원소의 도입을 제외하면 구조는 동일하다. 흥미로운 점은 베무라페닙은 BRAF가 흔한 V600E 돌연변이 또는 더 희귀한 유형의 BRAF V600K 돌연변이를 갖는 경우에만 유효하다는 것이다. 흑색종의 약 60%는 이들 돌연변이를 갖지만, 이들 돌연변이가 없는 흑색종 세포는 베무라페닙에 의해 억제되지 않는다.
도 5는 베무라페닙 신호 반응이 MS-모드로 도시된 흑색종 암 종양으로부터 생성된 MSI 이미지를 보여주고, 상부 우측은 모 이온으로부터 생성된 단편 이온을 보여주고(MS/MS), 하부 좌측은 베무라페닙 화합물 신호로부터의 제2 단편을 보여주고(MS/MS), 하부 우측은 모든 3개의 신호의 오버레이를 보여준다. 단일 세포 해상도에서 수행되는 적용은 약물 및 대사물질(들)의 국소화가 더 높은 정밀성 및 정확성으로 만들어질 수 있기 때문에 바람직하다. 도 6은 단일 세포 배치가 조직 절편에 나타난 조직학 이미지이다. 레이저 탈착 질량 분광법(MALDI)은 환자의 암 조직에서 약물(베무라페닙) 국소화를 확인하는데 사용되고 있다. 레이저 직경은 조직 구획 내의 공간 해상도에서 30 마이크로미터의 분해능으로 이미지를 캡처한다.
전통적인 MALDI-MSI 약물 국소화에 대한 한 가지 제약은 약물 및 약물 대사물질이 조직 샘플의 관련이 없는 부분에 비특이적으로 결합하거나 부착될 수 있다는 것이다. 이는 특히 더 낮은 용해도 및 더 높은 용량의 필요성을 갖는 최적화되지 않은 약물에 대한 증거가 될 수 있다. 이를 최소화하기 위하여, 샘플을 약물 배양 후, 여기서는 PBS로 3회 세척한 다음, MilliQ 물로 연속 3회 세척한다. 그러나, 이러한 어느 정도의 세척이 비특이적 결합으로부터 야기된 MS-신호를 감소시킬 것이지만, 이는 특히 정해진 당국, 예를 들면, FDA 및 EMEA에 의해, 신규한 약물 독립체(NCE)를 승인하는 주요 기관에서 약물 분포에 관한 상세한 정보를 요구하는 문제가 제안된다.
본 발명의 방법에서, 조직 샘플에 결합된 소분자 약물인 리간드는 경쟁 억제에 의해 더 높은 농도의 표지화된 리간드에 의해 치환된다. 실제로, 환자로부터의 조직 샘플을 조직 표본의 인접한 부분에 동위원소-표지화된 리간드의 부재 또는 존재 하에 표지화되지 않은 리간드와 배양한 다음, 위치를 시각화하고, MALDI 이미징 질량 분광법을 사용하여 결합된 리간드 및/또는 표지화된 리간드를 정량한다. 비특이적인 결합이 경쟁적이지 않은 반면, 특이적 결합은 경쟁적이다. 동위원소-표지화된 리간드의 사용은 그러므로 특이적 결합과 비특이적 결합을 구분하는 것을 가능하게 한다.
하나의 실시형태에 있어서, 조직 샘플에서 결합 부위에 가역적으로 결합하는 리간드의 특이적 결합을 측정하는 방법은 치환 경쟁 억제를 사용한다. 방법은 제1 조직 표면 상에 표지화된 리간드의 부재 하에 리간드(표지화되지 않음)를 배양하고, 제2 조직 표면 상에 표지화된 리간드의 존재 하에 리간드(표지화되지 않음)를 배양하는 것을 포함하고, 제1 및 제2 조직 표본은 표본의 인접한 부분이다. 후속적으로, 리간드 국소화는 각각 제1 및 제2 조직 표본에서 MALDI 이미징 질량 분광법을 사용하여 시각화하는 것이다.
하나의 실시형태에 있어서, 리간드 및 표지화된 리간드는 결합 부위에 특이적으로 결합하는 상동체(homolog)이다. 하나의 실시형태에 있어서, 표지화된 리간드는 동위원소-표지화된 리간드, 예를 들면, 중수소 표지화된 리간드 또는 13C-동위원소 표지화된 리간드이다. 하나의 실시형태에 있어서, 리간드는 베무라페닙이고, 표지화된 리간드는 13C-베무라페닙이다. 하나의 실시형태에 있어서, 리간드 및/또는 표지화된 리간드는 MALDI 이미징 질량 분광법을 사용하여 정량된다.
상세하게, 본 발명자들은 실험 단계들을 연속하여 수행하였다;
(1) 냉동된 인간 악성 흑색종 조직의 10 마이크로미터 절편의 제조를 -20℃에서 수행하였다. 그 후, (2) 종양 절편을 천천히 해동하고 실온에서 건조시켜 샘플 제조를 수행하였다. 그 다음, 절편을 메탄올 중에 5분 동안 함침시키고 실온에서 건조시켰다. 상응하게, 림프절로부터 절제한 냉동된 인간 건강 조직을 동일한 방식으로 취급하고 음석 대조군으로 사용하였다. (3) 리간드 분자의 이의 단백질 표적에 대한 결합을 측정하기 위하여 표지화되지 않은 리간드, 여기서는 베무라페닙을 100nM(나노몰)의 농도로 사용함으로써 약물 배양을 1시간 동안 수행하였다. 공동-배양 실험을 또한 100nM 농도의 리간드, 여기서는 베무라페닙 및 과량의 안정한 동위원소 표지화된 리간드, 여기서는 13C-베무라페닙으로 환자 종양 절편과 함께 수행하였다. 적정 실험 동안, 안정한 동위원소 표지화된 베무라페닙의 농도는 각각 100nM, 1μM, 10μM 및 100μM(마이크로몰)이었다. (4) 배양 후, 절편을 PBS로 3회 세척한 다음, MilliQ 물로 연속 3회 세척하고, (5) MALDI LTQ-Orbitrap XL 장치(Thermo Scientific, 독일 소재)를 사용하여 질량 스펙트럼을 수득하였고, 화합물 신호는 오비트랩(orbitrap) 및 이온 트랩에 의해 수득하였다. 이미지 분석은 ImageQuest(Thermo Scientific, 독일 소재)를 사용하여 수행하였다. 조직학 분석을 위하여, H&E 염색 및 BRAF V600E에 대한 단일클론 항체를 사용하는 면역조직화학 분석 둘 다를 수행하였다.
실시형태에 있어서, 냉동된 조직의 절편화를 수행하고, 제1 및 제2 조직 표본을 냉동된 조직의 인접한 절편으로부터 제조한다. 하나의 실시형태에 있어서, 상기 절편을 해동하고, 건조시키고, 메탄올 중에 5분 동안 함침시킨다. 하나의 실시형태에 있어서, 리간드(즉, 약물) 배양을 1시간 동안 표지화되지 않은 리간드를 사용하여 수행하고, 공동-배양을 1시간 동안 표지화되지 않은 리간드 및 과량의 표지화된 리간드를 사용하여 수행한다. 하나의 실시형태에 있어서, 절편을 바람직게는 PBS로 3회 세척한 다음, MilliQ 물로 연속 3회 세척한다. 하나의 실시형태에 있어서, 질량 스펙트럼은 MALDI LTQ-Orbitrap 장치를 사용하여 수득하고, 신호는 오비트랩 및 이온 트랩에 의해 수득하고, 이미지 분석은 ImageQuest를 사용하여 수행한다. 하나의 실시형태에 있어서, 조직학 분석은 H&E 염색 및/또는 단일클론 항체를 사용하는 면역조직화학 분석에 의해 수득한다.
하나의 실시형태에 있어서, 리간드 단백질 표적 위치에 대한 리간드의 결합은 공동-국소화, 예를 들면, 단백질 표적에 특이적인 단일클론 항체를 사용하는 면역조직화학 분석에 의해 확인한다.
이의 영향은 암 환자의 조직 절편으로부터의 이미지 캡처인 도 7에 나타내고, 여기서 (A)는 조직 샘플의 조직학 이미지를 보여주고, (B)는 100nM 베무라페닙을 조직 내로 투여한 후 동일한 조직 샘플의 MSI 이미지를 보여주고, 여기서 베무라페닙 신호 반응은 MS-모드로 나타낸다. 이후 암 환자의 조직 절편이 뒤따르고, 여기서 (D)는 조직 샘플의 조직학 이미지를 보여주고, (C)는 100 mM 13C-베무라페닙 및 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 샘플의 MSI 이미지를 보여주고, 여기서 베무라페닙 신호 반응은 MS-모드로 나타낸다. 선택된 검정 형식에 따라, 베무라페닙 및 13C-베무라페닙을 동시에 첨가하여 표적 단백질에 대한 결합에 대하여 역학적으로 경쟁하는 판독 방법을 제공하거나, 따로 첨가할 수 있다. 명백하게 보이는 바와 같이, 도 7(A)에서 베무라페닙 신호는 13C-베무라페닙의 경쟁 억제 후 소멸된다. 13C-베무라페닙의 수천배 더 높은 농도로 인하여, 결합된 베무라페닙은 13C-베무라페닙에 의해 경쟁에서 배제될 것이다. 조직 샘플의 부분에 대한 결합되지 않은 베무라페닙의 비특이적 부착의 경우, 이는 13C-베무라페닙에 의해 특이적으로 경쟁에서 배제되지는 않을 것이다. 따라서, 특이적으로 결합된 베무라페닙은 치환 경쟁 억제를 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게는, 표지화된 리간드는 치환 동안 표지화되지 않은 리간드보다 더 높은 농도, 예를 들면, 표지화되지 않은 리간드와 비교하여 표지화된 리간드의 5천 내지 1만배 더 높은 농도로 제제화된다. 보통, 표지화되지 않은 약물의 바람직한 농도는 나노몰 범위이고, 동위원소 표지화된 약물의 농도는 마이크로몰 범위이다.
하나의 실시형태에 있어서, 표지화된 리간드의 농도는 치환 경쟁 억제 동안 표지화되지 않은 리간드의 농도보다 더 높고, 예를 들면, 5 내지 10000배 더 높거나, 예를 들면, 10 내지 1000배 더 높다. 하나의 실시형태에 있어서, 표지화되지 않은 리간드는 나노몰 농도이고, 동위원소 표지화된 리간드는 마이크로몰 농도이다.
도 8 및 9에서, 동위원소 표지화된 화합물(i-베무라페닙)의 첨가는 베무라페닙의 i-베무라페닙으로의 경쟁적 교환을 보여주고, 치환은 특이적이고 선택적인 약물 결합의 증거를 제공한다.
도 8에서, 조직 절편은 (A) BRAF 표적 단백질에 V600E BRAF 돌연변이가 결핍된 환자로부터의 음성 대조군 및, (B) 및 (C) BRAF에 V600E 돌연변이를 갖는 환자로부터의 조직 절편을 보여준다. (A) 내지 (C)에서, 100nM 베무라페닙은 조직 내로 투여되었고, 이미지는 베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 383.1)과 함께 캡처된다. (C)에서, 1μM 13C-베무라페닙은 조직 내로 동시 투여되었고, 이미지는 13C-베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 캡처이고, 이는 100nM 베무라페닙을 경쟁에서 배제시킨다.
도 9(A) 및 (C)에서, 조직 절편은 BRAF에 V600E 돌연변이를 갖는 환자로부터 도시되고, (B)에서 BRAF 표적 단백질에 V600E BRAF 돌연변이가 결핍된 환자로부터 음성 대조군을 보여준다. (A) 내지 (C)에서, 100nM 베무라페닙은 조직 내로 투여되었고, 이미지는 베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 383.1)과 함께 캡처된다. (C)에서, 1μM 13C-베무라페닙은 조직 내로 동시 투여되었고, 이미지 13C-베무라페닙(MS/MS) 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 캡처이고, 이는 100nM 베무라페닙을 경쟁에서 배제시킨다.
대조군 조직은 베무라페닙이 V600E BRAF 돌연변이가 결핍된 조직에서 더 큰 정도로 결합되지 않는다는 것을 확인해준다. 대신에, BRAF에 V600E 돌연변이를 갖는 환자로부터의 조직 샘플은 조직 내에 편재된 세포에 대한 분명한 결합을 보여준다. 추가로, 경쟁적 결합의 분명한 컷 특이성은 암 세포 및 단백질 표적에 대한 약물 결합의 특이성을 입증한다.
현재 방법과 관련하여, 생성된 데이터는 특이적 결합 성질을 제공하고, 이는 베무라페닙 후 및/또는 i- 베무라페닙 약물 투여 후에 측정될 수 있다. 도 10(A) 내지 (D)에서, 공동-배양 적정 실험이 도시된다. 동위원소 표지화된 화합물(13C-베무라페닙) 첨가는 베무라페닙의 i-베무라페닙로의 경쟁적 교환을 보여주고, 치환은 특이적이고 선택적인 약물 결합의 증거를 제공한다.
실시형태에 있어서, 방법은 표지화되지 않은 리간드를 적어도 2개의 농도의 표지화된 리간드와 함께 조직 표본의 인접한 절편 위에서 배양하는 것을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 상이한 표지화된 리간드 농도의 적정을 사용하는 것을 포함한다.
도 10으로부터의 i-베무라페닙(여기서, 13C-베무라페닙) 동위원소 신호는 하기 표 1에 요약된다. i-베무라페닙의 경쟁적 결합은 투여 수준의 증가와 함께 증가한다는 것을 분명하게 보여준다. 질량 분광법 결과는 i-베무라페닙 약물 농도와 암 세포에 대한 결합 사이의 선형 관계를 베무라페닙의 배경과 함께 명백하게 지시한다. 추가로, 치료에 대한 약물 역학뿐만 아니라 대사물질 역학은 기재된 방법론을 사용하여 결정될 수 있다. 적정 결과를 용량 반응 곡선으로 플롯팅함으로써, 13C-베무라페닙에 의한 베무라페닙의 50% 억제에 필요한 농도인 IC50 값을 유도할 수 있다. 유사하게는, 다른 상수, 예를 들면, 리간드 해리 상수(Kd)를, 예를 들면, 쳉과 프루소프(Cheng and Prussoff) 관계를 사용하여, IC50 값으로부터 유도할 수 있다. 억제제(예를 들면, MAPK/ERK 경로에서 B-Raf/MEK 단계에서 억제제로 작용하는 베무라페닙)에 있어서, 억제 상수(Ki)를 유도할 수 있다. 표적 단백질 특성뿐만 아니라 억제 방식(즉, 경쟁, 비경쟁 또는 혼합된 억제)에 따라, 억제 상수(Ki)의 계산을 위하여 적합한 식을 사용한다. 흔히, 동일한 억제제 또는 동일한 작용 메커니즘을 갖는 2개의 상이한 억제제(I1 및 I2)의, 동일한 검정 조건하에 측정된, Ki 및 IC50는 Ki,1 / Ki,2 = IC50,1 / IC50,2로서 비교될 수 있다.
따라서 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 리간드 및/또는 대사물질 및/또는 표적 수용체에 대한 역학 결합 특성을 계산하는데 사용된다. 하나의 실시형태에 있어서, 역학 결합 특성은 Kd(해리 상수), Ki(억제제 해리 상수), IC50(절반 최대 억제 농도)이다.
결합 성질은 약물 작용 방식을 설명하고 이해하기 위하여 중요하다. 약물 메커니즘은 암 환자의 치료에서 가장 핵심적이고, 가능한 독성 측면, 및 환자의 안전성에 직접적으로 관련된다. 그러므로, 본 발명의 방법은 개인 환자에 대한 상세한 약물-조직 상호작용 정보를 제공할 수 있다. 예를 들면, 약물이 종양 유형에 특이적으로 결합하는 경우, 및 약물이 모든 종양 조직에 균질하게 결합하는 경우, 따라서 개인을 고려하여 치료 방법을 개선할 수 있고, 고도로 복합적인 질환 생물학에서 치료의 안내를 보조한다.
결합 성질은 또한 한 쌍의 하나 이상의 약물 화합물(즉, 리간드)과 동위원소 화합물(즉, 표지화된 리간드)의 혼합물을 사용하여 조사할 수 있다. 이러한 약물 칵테일 혼합물은 단일 또는 다중 약물 결합의 결합 성질이 정해진 시간 경과 동안 발생하는 고유한 이미지 캡처를 제공한다. 특이적 결합 성질의 역학은 이로써 약물 결합 특이성 정보 및 상세한 데이터에 의해 측정된다.
하나의 실시형태에 있어서, 방법은 한 쌍의 리간드 및 표지화된 리간드, 즉, 적어도 하나의 제1 리간드 및 상응하는 제1 표지화된 리간드, 및 제2 리간드, 및 상응하는 제2 표지화된 리간드의 혼합물을 사용하여 치환 경쟁 억제를 이용하여 샘플의 결합 부위에 가역적으로 결합하는 제1 리간드 및/또는 제2 리간드의 특이적 결합을 측정한다.
약물(즉, 리간드) 칵테일 혼합물은 또한 다중 결합 표적에 대한 다중 약물 결합을 포함할 수 있다. 이러한 혼합물에 있어서, 모든 칵테일 성분은 종양 조직에 선택적으로 결합하는 것을 측정하고, 효과적인 약물 칵테일을 선택하는 것을 돕는데 매우 중요할 수 있거나, 특이적인 약물 칵테일을 사용하는 치료가 임상적으로 효과적이지만 강력한 부작용을 갖는 것으로 입증된 경우에, 치료를 위하여 약물 칵테일을 최적화시키는데 매우 중요할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 방법은 한 쌍 이상의 리간드와 표지화된 리간드의 혼합물, 즉, 제1 표적에 결합하는, 적어도 하나의 제1 리간드 및 상응하는 제1 표지화된 리간드, 및 제2 표적에 결합하는, 제2 리간드 및 상응하는 제2 표지화된 리간드의 혼합물을 사용한다, 치환 경쟁 억제를 이용하여 제1 리간드 및/또는 제2 리간드의 특이적 결합을 측정한다.
표지화된 리간드는 리간드-수용체 결합이 배양 후 평형시 이미 존재하거나 가까운 시스템에 첨가될 수 있다. 이러한 방식으로, 경쟁적 교환은 시간 경과 동안 모니터링될 수 있고, 이는 조직에서 약물의 확산 및 가능하게는 비평형 역학 데이터 둘 다에 정보를 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 방법은 (1) 조직 샘플을 표지화되지 않은 리간드와 함께 배양하고, 그 후, (2) 상기 조직 샘플을 표지화된 리간드와 함께 배양하는 것을 포함한다. 즉, 리간드는 조직 샘플에 먼저(한 시점에) 첨가될 수 있고, 표지화된 리간드는 나중에(제2 시점에) 첨가된다. 이러한 실험은 샘플에서 약물 침투 및 분포에 관한 더 많은 정보, 및 가능하게는 추가의 역학 정보, 예를 들면, 농도 의존적이지 않고 종종 약물 효능에 중요한 특성인 결합된 리간드의 체류 시간(tr) 및 반감기(t1/2)를 제공할 수 있다.
물질 및 방법
하기 실시예는 단지 실시예일 뿐이고 무슨 일이 있어도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 그보다, 본 발명은 첨부된 청구항에 의해서만 제한된다.
냉동된 인간 악성 흑색종 조직을 종양 조직을 구성하는 림프절로부터 절제하였다. 조직 절편은 -20℃에서 수행된 저온유지장치의 사용에 의한 10 μm(마이크로미터) 슬라이스 두께의 절편이었다. 절편화 후, 슬라이스를 천천히 해동하고 실온에서 건조시켰다. 그 다음, 절편을 메탄올에 5분 동안 함침시키고, 실온에서 건조시켰다. 상응하게, 림프절로부터 절제한 냉동된 인간 건강 조직을 음성 대조군으로서 사용하였다.
단백질 표적에 대한 약물 분자의 결합을 측정하기 위하여 표지화되지 않은 베무라페닙을 100nM(나노몰)의 농도로 사용함으로써 배양을 1시간 동안 수행하였다. 공동-배양 실험을 또한 환자 종양 절편에 대하여 100nM의 베무라페닙 농도 및 과량의 안정한 동위원소 표지화된 베무라페닙으로 수행하였다. 경쟁적 결합 동안 배양 시간은 1시간이었다. 배양 시간은 수행된 실험의 유형에 따라 다양할 수 있다. 적정 실험 동안, 안정한 동위원소 표지화된 베무라페닙의 농도는 각각 100nM, 1μM, 10μM 및 100μM(마이크로몰)이었다.
베무라페닙 및 동위원소 표지화된 13C-베무라페닙의 구조식을 도 4A 및 4B에 나타낸다.
배양 후, 절편을 PBS로 3회 세척한 다음, MilliQ 물로 연속 3회 세척하였다.
MALDI LTQ-Orbitrap XL 장치(Thermo Scientific, 독일 소재)를 사용하여 질량 스펙트럼을 수득하였다. 오비트랩 및 이온 트랩에 의해 화합물 신호를 수득하였다. ImageQuest(Thermo Scientific, 독일 소재)를 사용하여 이미지 분석을 수행하였다. 조직학 분석을 위하여, H&E 염색 및 BRAF V600E에 대한 단일클론 항체를 사용하는 면역조직화학 분석 둘 다를 수행하였다.
질량 스펙트럼 이미지로부터의 결합 면적을 확인함으로써 결합 강도를 계산하였고, 신호 및 배경 데이터로부터 장치의 ImageQuest 소프트웨어에 의해 강도 판독을 계산한다.
결과
도 6에서, MSI 실험을 위하여 처리된 인간 악성 흑색종 조직 절편의 이미지는 조직 절편 샘플의 단일 세포 배치 형태학을 보여준다. 암 조직에서 약물(베무라페닙) 국소화를 확인하기 위하여 사용된 레이저 탈착 질량 분광법은 조직 구획 내에서 공간 해상도에서 30 마이크로미터의 분해능에서 이미지를 캡처하는 레이저 직경을 갖는다.
도 5(A)는 인간 악성 흑색종 조직 절편 배양된 표지화되지 않은 베무라페닙의 MS-모드로 베무라페닙 신호 반응의 MSI 이미지를 보여준다. 베무라페닙의 모 이온으로부터 생성된 제1 및 제2 단편 이온의 신호 반응(MS/MS)은 각각 도 5(B) 및 (C)에 도시된다. 모든 신호(A-C)의 오버레이는 도 5(D)에 도시된다.
공동-배양 실험은 도 7에 도시된다. 도 7(A)는 환자의 인간 악성 흑색종 조직 절편의 조직학 이미지, 및 (B) 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 이미지 캡처를 보여준다. 도 7(D)은 또 다른 인간 악성 흑색종 조직 절편의 조직학 이미지, 및 (C) 100 mM 13C-베무라페닙 및 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 공동-배양 실험을 보여준다. 동위원소 표지화된 화합물(13C-베무라페닙)의 첨가는 베무라페닙의 i-베무라페닙으로의 경쟁적 교환을 보여주고, 치환은 특이적이고 선택적 약물 결합의 증거를 제공한다. 이러한 경우에 대조군 조직은 임의의 측정 가능한 약물 결합을 갖지 않는다(도시되지 않음).
도 8(A)는 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 베무라페닙 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여준다. 조직(A) 절편은 BRAF 표적 단백질에 V600F BRAF 돌연변이가 결핍된 환자(환자 1)로부터의 음성 대조군 조직이다. 도 8(B)는 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 베무라페닙 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는, BRAF 표적 단백질에 V600E 돌연변이를 갖는 환자(환자 2)에 대한 이미지 캡처를 보여준다. 도 8(C)는 100nM 베무라페닙 및 1μM 13C-베무라페닙이 조직 내로 투여된 환자 2(BRAF 표적 단백질에 V600E 돌연변이를 가짐)의 조직 절편으로부터의 13C-베무라페닙 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여주고, 이는 100nM 베무라페닙을 경쟁에서 배제시킨다.
유사하게는, 도 9(A)는 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편의 세포로부터의 베무라페닙 신호 반응(m/z 383.1)을 가진, BRAF 표적 단백질에 V600E 돌연변이를 갖는 환자(환자 3)에 대한 이미지 캡처를 보여준다. 도 9(B)는 BRAF 표적 단백질에 V600F BRAF 돌연변이가 결핍된 환자(환자 4)로부터의 음성 대조군 조직이고, 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편의 세포로부터의 베무라페닙 신호 반응(m/z 383.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여준다. 도 9(C)는 100nM 베무라페닙 및 1μM 13C-베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편의 세포로부터의 13C-베무라페닙 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는, BRAF 표적 단백질에 V600E 돌연변이를 갖는 환자(환자 3)에 대한 이미지 캡처를 보여주고, 이는 100nM 베무라페닙을 경쟁에서 배제시킨다.
베무라페닙의 i-베무라페닙로의 경쟁적 교환은 특이적이고 선택적인 약물 결합의 증거를 제공한다. 또한, 경쟁적 교환은 훨씬 더 많은 정보를 제공할 수 있다. 도 10(A) 내지 (D)에서, 공동-배양 적정 실험이 도시된다. 도 10(A)는 100nM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편의 세포로부터의 13C-베무라페닙 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여준다. 도 10(B)은 1μM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편의 세포로부터의 13C-베무라페닙 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여준다. 도 10(C)는 10μM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편의 세포로부터의 13C-베무라페닙 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여준다. 최종적으로, 도 10(D)은 100μM 베무라페닙이 조직 내로 투여된 조직 절편으로부터의 13C-베무라페닙 신호 반응(m/z 389.1)을 갖는 이미지 캡처를 보여준다. 동위원소 표지화된 화합물(13C-베무라페닙) 첨가는 베무라페닙의 i-베무라페닙로의 경쟁적 교환을 보여주고, 치환은 특이적으로 선택적인 약물 결합의 증거를 제공한다. 13C-베무라페닙 신호 반응은 하기 표 1에 요약된다.
13 C- 베무라페닙 대 베무라페닙의 경쟁적 결합.
농도-동위원소 동위원소 신호 배경
100μM 259400 622
10μM 29870 268
1μM 3233 323
0.1μM 326 165
13C-베무라페닙의 결합은 투여의 수준이 증가와 함께 증가한다. 이는 표 1에 나타낸 바와 같이, 베무라페닙의 배경과 함께, 13C-베무라페닙 약물 농도와 암 세포에 대한 결합 간의 선형 관계를 분명하게 지시한다. 경쟁적 결합의 분명한 컷 특이성은 암 세포 및 단백질 표적에 대한 약물 결합의 특이성을 증명하고, 신호/농도 관계는 리간드 및/또는 대사물질 및/또는 표적 수용체에 대한 역학 결합 특성을 계산하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 (하나의) 특정한 실시형태(들)를 참조하여 상기 설명되었음에도 불구하고, 본 명세서에 기재된 특정한 형태로 제한되는 것을 의도하지 않는다. 그보다, 본 발명은 첨부된 청구항에 의해서만 제한되고, 상기 특정된 것과 다른 실시형태는, 예를 들면, 상기 기재된 것들과 상이한 이들 첨부된 청구항의 범위 내에서 동일하게 가능할 수 있다.
청구항에서, 용어 "포함하다/포함하는"은 다른 요소 또는 단계의 존재를 배제하지 않는다. 추가로, 개별적으로 열거됨에도 불구하고, 복수의 수단, 요소 또는 방법 단계는, 예를 들면, 단일 유닛 또는 프로세서에 의해 시행될 수 있다. 추가로, 개별적인 특징이 상이한 청구항에 포함될 수 있지만, 이들은 가능하게는 유리하게 조합될 수 있고, 상이한 청구항에 포함된 것은 특징의 조합이 실현 가능하고/하거나 유리하지 않다는 것을 암시하지 않는다. 추가로, 단수형 지시대상은 복수형을 제외시키지 않는다. 용어 "한", "하나의", "제1", "제2" 등은 복수형을 배제하지 않는다. 청구항에서 참조 표시는 단지 실시예를 명확하게 하기 위하여 제공될 뿐이고, 어떠한 방식으로도 청구항의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (13)

  1. 치환 경쟁 억제(displacement competitive inhibition)를 이용하여 조직 샘플에서 결합 부위에 가역적으로 결합하는 리간드의 특이적 결합을 측정하는 방법으로서,
    제1 조직 표본 상에 표지화된 리간드의 부재 하에 상기 리간드(표지화되지 않음)를 배양하는 단계, 제2 조직 표본 상에 표지화된 리간드의 존재 하에 상기 리간드(표지화되지 않음)를 배양하는 단계로서, 상기 제1 및 상기 제2 조직 표본이 표본의 인접한 절편인, 상기 배양하는 단계; 및 후속적으로 각각 상기 제1 및 제2 조직 표본에서 MALDI(matrix-assisted laser desorption/ionization) 이미징 질량 분광법을 사용하여 리간드 국소화를 시각화하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표지화된 리간드가 동위원소-표지화된 리간드, 예를 들면, 중수소 표지화된 리간드, 또는 13C-동위원소 표지화된 리간드인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 표지화된 리간드의 몰 농도가 치환 경쟁 억제 동안 상기 표지화되지 않은 리간드의 몰 농도보다 더 높은, 예를 들면, 5 내지 10000배 더 높은, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화되지 않은 리간드가 나노몰 농도이고, 상기 동위원소 표지화된 리간드가 마이크로몰 농도인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드와 상기 표지화된 리간드가 상동체인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 단백질의 국소화 및 상기 동위원소 결합이 공동-국소화에 의해 확인되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드 및/또는 표지화된 리간드가 MALDI 이미징 질량 분광법을 사용하여 정량되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지화되지 않은 리간드를 적어도 2개의 상이한 농도의 표지화된 리간드와 함께 조직 표본의 인접한 절편 위에서 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법이 상이한 표지화된 리간드 농도의 적정을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 리간드 및/또는 대사물질 및/또는 표적 수용체의 역학 결합 특성이 결합 데이터로부터 계산되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 역학 결합 특성이 Kd, Ki, 및/또는 IC50인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 상기 제2 조직 샘플에 먼저(하나의 시점에서) 첨가되고, 상기 표지화된 리간드가 나중에(제2 시점에서) 첨가되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 베무라페닙이고, 상기 표지화된 리간드가 13C-베무라페닙인, 방법.
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