CN107076748A - 评估乳腺癌的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于评估哺乳动物受试对象的乳腺癌的代谢生物标志物集。特别地，本发明涉及一种用于筛选和/或诊断乳腺癌的代谢生物标志物集，该代谢生物标志物集至少包括：(a)一种选自谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸中的氨基酸以及一种脂质，或(b)谷氨酰胺和谷氨酸。进一步，本发明涉及一种用于预测对乳腺癌新辅助化疗的治疗应答的代谢生物标志物集。进一步，本发明涉及一种用于评估乳腺癌肿瘤活动的生物化学反应的代谢生物标志物集。进一步，本发明涉及一种用于对固有乳腺癌肿瘤亚型进行次级分类的代谢生物标志物集。而且，本发明涉及一种评估乳腺癌的方法，其包括：从哺乳动物对照中获取生物化学样品，优选为血液；测定该生物化学样品中代谢物的含量和/比例。通过采用特定的生物标志物以及本发明的方法，可以更准确更可靠地评估乳腺癌。

Description

评估乳腺癌的生物标志物
技术领域
本发明涉及一种用于评估乳腺癌的新的生物标志物。特别地，本发明提供了在以下方面使用的新的生物标志物:筛查和/或诊断患者的乳腺癌、预测对乳腺癌新辅助化疗的治疗反应，评估乳腺癌肿瘤活性的生化反应，和根据乳腺癌肿瘤固有亚型对乳腺癌肿瘤其进行分类。此外，本发明涉及一种用于评估哺乳动物受试对象的乳腺癌的方法，以及涉及一种实施该方法的试剂盒。此外，本发明涉及一种评估乳腺癌的方法，该方法包括:从哺乳动物受试对象获得生物样品(优选血液)，并测定所述生物样品中代谢物的量和/或比率。通过使用本发明的特异性生物标志物和方法，可以更恰当、可靠地评估乳腺癌。
背景技术
代谢组学
代谢组学是一种系统覆盖关键代谢物的低分子量化合物的综合性定量测量，它代表了中间代谢途径的整个范围。对代谢物大阵列的分析能力可提取反映明显的生物学事件的真正功能端点的生物信息，而其它功能基因组学技术(例如:转录组学和蛋白质组学)，尽管具有很高的实用价值，但仅仅表明表型反应的潜在原因。因此，它们不一定能在表型水平预测药物作用、毒性反应或疾病状态，除非添加功能验证。
代谢组学通过特别描述这样的功能信息来弥合这种信息缺口，这是因为生物体液和组织中的代谢物的差异提供了与各种表型反应最密切的关系。不用说，一旦合适的技术允许这种信息的经济有效的挖掘和整合，这种生化表型方面的变化对制药、生物技术和健康产业是有直接意义的。
通常，表型不一定由基因型预测。基因型和表型之间的差距被许多生化反应所跨越，每种生化反应都具有对各种影响(包括:药物、营养和环境因素)的个体依赖性。从基因到表型的这条生物分子链中，代谢物是与表型联系最紧密的可量化分子。许多表型和基因型状态(例如:对药物或疾病流行性的毒性反应)是通过生物流体和组织内功能性相关代谢物的浓度差异进行预测。
乳腺癌
乳腺癌是一种源于乳腺组织的癌症，最常见地是来自乳腺导管的内膜(innerlining)或向乳腺导管提供乳汁的小叶。在世界范围内，乳腺癌占所有女性癌症(不包括非黑色素瘤皮肤癌)的22.9％。2012年，约226870名美国女性被诊断为乳腺癌，占所有新诊断的女性癌症患者的29％，导致2011年在美国有超过39000例死亡，被列为女性癌症死亡的第二大原因。早期诊断可显著提高乳腺癌的长期存活率，目前乳房X线照相是用于检测乳腺癌的最易接受且有效的筛查程序，并且由美国预防服务工作组(USPSTF)向40岁以上的女性推荐。然而，由于这种筛查假阳性率高，因此USPSTF在2009年将其推荐修改为降低乳房X线照相筛查的频率。其它成像技术，例如超声和磁共振成像也已经用于乳腺癌筛查。不幸的是，即使把这些成像技术包括在内，仍然有约20％的乳腺癌患者不能被检测到。
用于筛查和诊断的新方法会非常有帮助，尤其在具有大陆规模(continentaldimensions)的发展中国家，在这些国家，乳房X线照相专业化服务不向每个40岁以上的女性提供。例如，仅在巴西，每年约有3000万女性有资格接受乳腺检查，但是，不到50％的女性可以接受这项检查。结果是，在52000新病例/年中，超过60％的病例相当于晚期病例，其将需要术前化疗以减少不成比率的大肿瘤的体积从而有可能进行手术。
因此，本领域迫切需要新的筛查程序，其可以容易地进行，即不需要专门的设备或资源。此外，迫切需要提供具有高准确度地、更可靠和有效地诊断乳腺癌的方法，以及用于预测疾病进展和化疗反应的方法。
在诊断乳腺癌的方法中，一种很有希望的筛查方法是使用生物标志物，例如，血浆(或血清)生物标志物(例如抗原和蛋白质图谱)。然而，这些方法进行临床使用仍然遥远。一些肿瘤标志物，例如CA15.3和CA27.29，仅被推荐用于疗效监测，而不是筛查。
因此，迫切需要新的有效的生物标志物用于乳腺癌筛查和诊断，这些标记物可以单独使用或与其它现有方法组合使用。
最近，已经发现癌细胞的代谢特性与正常细胞的代谢特性不同，这是因为它依赖于有氧糖酵解、脂肪酸合成和谷氨酰胺分解(glutaminolysis)来进行增殖。例如，增强的脂肪酸合成为快速增殖的肿瘤细胞提供用于膜的生物发生的脂质，赋予生长和存活优势。类似地，癌细胞对谷氨酰胺匮乏非常敏感，并且在没有它的培养基中不能增殖。“谷氨酰胺依赖”导致快速增殖的细胞所必需的副产物(例如，氨基酸前体)的产量增加，因此，细胞代谢失调也与癌症治疗中的耐药性相关。事实上，脂肪酸合成酶(FASN)是催化脂肪酸合成的关键复合物，其与乳腺癌中后天获得的紫杉醇/曲妥珠单抗/阿霉素抗性或胰腺癌中固有的吉西他滨(gemcitabine)和辐射抗性有关。最后，谷氨酰胺分解通过激活胃癌中转导信号的哺乳动物雷帕霉素复合物1靶标(mTORC1)，从而与顺铂耐药性相关。
乳腺癌通常用手术治疗，其后可能是化疗或放射治疗，或这两者都进行。新辅助化疗主要用于帮助治疗局部晚期乳腺癌，尤其是那些在首次就诊时被认为不能动手术的乳腺癌。然而，在最近几年中，这种方治疗式已经越来越多地被用于较小且可动手术的肿瘤，以便剩下并保留更多部分的乳腺组织，否则这些乳腺组织将在初次手术中切除。该治疗方法的另一个特点是它提供了独特的机会准确定量(通过临床检查和/或放射学检查)对所采用的化疗方案反应的肿瘤的体积变化。
此外，治疗类型、药物选择和药物用量方案通常仅通过确定肿瘤的尺寸来设定。然而，肿瘤大小不反映其生化活性和代谢活性，因此也不反映肿瘤是否具有高度侵袭性或无活性。因此，本领域中常规使用的工具不足以恰当地限定患者乳腺癌的治疗。
在本发明中使用有关乳腺癌肿瘤的代谢物组学活性的有价值的信息，不仅为了在观察到对化疗的反应最小或无反应时而指出替代方案，也为了鉴定那些实现了完全病理应答(complete pathologic response,pCR)的患者，因此，具有更为有利的结果。
本领域的主要努力一直针对开发预测工具，这种工具能够协作鉴定具有更高的机会达到pCR(由ypT0/ypN0定义)的患者。此外，疾病进展的发生也是使用新辅助化疗的关注重点，并且尽管许多研究人员试图确定pCR的临床预测因子和分子预测因子，但是很少报道进展预测因子。
Wei，S.等人(Metabolomics approach for predicting response tonewadjuvant chemotherapy for breast cancer，Molecular Oncology(2012))，通过组合NMR和MS衍生的代谢物，开发了一种预测模型，其正确鉴定了80％的其肿瘤对化疗没有显示完全反应的患者。四种代谢物的组合(三种代谢物通过NMR(苏氨酸谷氨酰胺和异亮氨酸)进行检测，一种代谢物通过MS进行检测(亚麻酸))可以区分没有反应，部分反应或完全反应的患者组。然而，80％的被正确鉴定的患者的数量仍然不能令人满意。
Qiu，Y.等人(Mass Spectrometry-Based Quantitative Metabolomics Revealeda Distinct Lipid Profile in Breast Cancer Patients,Int.J.Mol.Sci.2013)开发了基于三种代谢物(lysoPC a C16:0，PC ae C42:5和PC aa C34:2)的诊断方程，成功地将乳腺癌患者与健康对照组分开，灵敏度为98.1％，特异性为96.0％。然而，该作者不能对化疗反应产生预测结果，以及不能产生可根据乳腺癌肿瘤固有亚型对乳腺癌肿瘤进行分类的任何结果。因此，不仅对于灵敏度和特异性的改进而且对于模型的适用性的显著扩展，仍然存在着空间。
因此，本领域迫切需要开发新的筛查技术和诊断技术，以适用于以高准确性和可靠性鉴定乳腺癌患者、鉴定肿瘤亚型及其活性状态、预测乳腺癌进展、疾病结果以及患者对化疗的治疗反应。
发明内容
【技术问题】
基于这些癌症特异性代谢变化，本发明人旨在鉴定新的血液代谢标记物，即，可能有助于乳腺癌的群体筛查以及用于诊断受试对象中乳腺癌的新的生物标志物。此外，旨在鉴定用于预测疾病进展以及预测患者对化疗的治疗反应的血液代谢标记物。
鉴于本领域存在的上述问题，本发明的目的是提供用于评估乳腺癌的新的生物标志物，所述标志物允许在疾病进展的早期阶段中筛查和诊断乳腺癌，并且具有高精度和可靠性。最佳地，应当在生物样品(例如，血液中)容易检测出标记物，并且所述标记物的水平应当与乳腺癌的阶段始终有关。此外，本发明的目的是提供一种用于评估生物样品中乳腺癌的方法，所述方法允许实现快速、方便和高流通量的(throughput)性能。此外，新的生物标志物应当适合于预测乳腺癌进展、疾病的结果以及患者对化疗的治疗反应。
为了解决本发明的目的，发明人基于其对代谢组学的研究，因为它可以洞察乳腺癌发展过程中发生的生物化学变化，并提供几种新颖和可能更好的生物标志物。本发明人发现，当使用随着乳腺癌的发展而变化的一组代谢物而不采用本领域进行的筛查技术(例如乳房X射线照相或其它成像技术)时，可以给出涉及乳腺癌的所有代谢组学途径和机制的更为全面的图片(picture)。
【本发明的总结】
因此，如所附的权利要求中所定义，本发明提供了适合于评估乳腺癌的新的生物标志物(即新的生物标志物集)，尤其适用于在疾病的早期阶段评估乳腺癌。此外，本发明还提供了一种基于本文所述的生物标志物和生物标志物集来评估哺乳动物受试对象中乳腺癌患者的方法，以及一种适于实施该方法的试剂盒。
附图说明
在说明书中，参考图1～15，这些图证实了乳腺癌发展过程中代谢生物标志物增加或减少的实施例。
图1A：通过使用两种代谢物谷氨酰胺(Gln)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:1(PC aeC42:1)，在训练集(Training Set)期间获得的ROC曲线分析。
图1B：通过使用两种代谢物谷氨酰胺(Gln)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:1(PC aeC42:1)，在验证集(Validation Set)期间获得的ROC曲线分析。
图2A：通过使用两种代谢物谷氨酰胺(Gln)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:1(PC aeC38:1)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图2B：通过使用两种代谢物谷氨酰胺(Gln)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:1(PC aeC38:1)，在验证集期间获得的ROC曲线分析。
图3A：通过使用两种代谢物丝氨酸(Ser)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:1(PC aeC38:1)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图3B：通过使用两种代谢物丝氨酸(Ser)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:1(PC aeC38:1)，在验证集期间获得的ROC曲线分析。
图4A：通过使用两种代谢物丝氨酸(Ser)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:1(PC aeC42:1)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图4B：通过使用两种代谢物丝氨酸(Ser)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:1(PC aeC42:1)，在验证集期间获得的ROC曲线分析。
图5A：通过使用两种代谢物谷氨酸(Glu)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C28:1(PC aeC28:1)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图5B：通过使用两种代谢物谷氨酸(Glu)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C28:1(PC aeC28:1)，在验证集期间获得的ROC曲线分析。
图6A：通过使用两种代谢物谷氨酸(Glu)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:1(PC aeC42:1)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图6B：通过使用两种代谢物谷氨酸(Glu)和磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:1(PC aeC42:1)，在验证集期间获得的ROC曲线分析。
图7A：通过使用两种代谢物谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图7B：通过使用两种代谢物谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln)，在训练集期间获得的ROC曲线分析。
图8A和图8B:具有乳腺癌的最终验证集相比于控制组。
图9A：通过使用总DMA，PC ae C42:0，谷氨酰胺(Gln)和十二烷基二酰肉碱(C12-DC)，在训练集期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和具有35-78％反应的患者。
图9B：通过使用总DMA，PC ae C42:0，谷氨酰胺(Gln)和十二烷基二酰肉碱(Dodecanedioylcarnitine)(C12-DC)，在验证集期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和病情稳定/进展稳定的患者。
图10A：通过使用总DMA，PC ae C30:0，谷氨酰胺(Gln)和C12-DC，在训练集期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和具有35-78％反应的患者。
图10B：通过使用总DMA，PC ae C30:0，谷氨酰胺(Gln)和C12-DC，在验证组期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和病情稳定/进展稳定的患者。
图11A：通过使用总DMA，PC ae C42:0，丝氨酸(Ser)和C12-DC，在训练集期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和低反应的患者。
图11B：通过使用总DMA，PC ae C42:0，丝氨酸(Ser)和C12-DC，在验证集期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和病情稳定/进展稳定的患者(SDPR)。
图12A：通过使用总DMA，PC ae C32:2，丝氨酸(Ser)和C12-DC，在训练集期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和具有80-92％反应的患者。
图12B：通过使用总DMA，PC ae C32:2，丝氨酸(Ser)和C12-DC，在验证组期间获得的ROC曲线分析，比较了具有完全病理应答的患者和病情稳定/进展稳定的的患者。
图13：使用表11中描述的代谢物鉴定乳腺癌的特定亚型。ROC曲线分析显示了具有管腔肿瘤A/B的患者和具有三阴性和HER2-阳性的患者的鉴定结果。
图14：使用表12中描述的代谢物鉴定乳腺癌的特定亚型。ROC曲线分析显示了具有HER2肿瘤(LumB-HER2+HER2)的患者和具有三阴性和管腔肿瘤A/B的患者的鉴定结果。
图15：使用表13中描述的代谢物鉴定乳腺癌的特定亚型。ROC曲线分析显示了患有三阴性的患者和具有HER2-阳性/Luminals A/B的患者的鉴定结果。
具体实施方式
通过使用本发明所述的特定生物标志物(或生物标志物集)和方法，以提高的准确性和可靠性来评估乳腺癌已成为可能。
在本发明意义上的“评估”是指筛查可能患有乳腺癌的受试对象、诊断受试对象中的乳腺癌并监测疾病的进展，尤其是指检测和标记处于不同阶段的疾病和/或对肿瘤进行次级分类。此外，“评估”包括预测患有乳腺癌的患者是否可能对化疗(尤其是新辅助化疗)有反应。此外，“评估”涉及乳腺癌肿瘤活性的生化反应的测定和表征。此外，在本发明意义上的“评估”是指在明确地鉴定患者中的乳腺癌肿瘤亚型并根据其固有亚型区分某些乳腺癌肿瘤的可能性。
令人惊讶地是，通过测定受试对象的样品(例如:血液样品)中的某些代谢物的量和/或比率，在本发明中已经实现了提供生物标志物或生物标志物集，从而使以一种改进的方式并在疾病的早期阶段筛查和诊断乳腺癌成为可能，并且允许更准确和可靠地预测患有乳腺癌的患者是否可能对化学疗法(例如：新辅助化疗)有反应。特别地，本发明的生物标志物和生物标志物集使得有可能预测患者是否可能对化疗达到完全病理应答(pCR)或稳定疾病和/或发展(stable disease and/or progression，SDPR)。此外，在本发明中令人惊讶地发现，基于其特异性代谢物特征可以区分乳腺癌肿瘤的亚型。
在本发明的上下文中，完全病理应答(pCR)被定义为乳腺或淋巴结中没有侵入性残留或非侵入性残留(ypT0ypN0)，这意味着完成化疗后肿瘤完全消失，乳腺和淋巴结中没有残留的癌症信号。pCR是合适的替代终点，特别是对于具有腔管B/HER2-阴性，HER2阳性或三阴性疾病的患者。因此，本发明有可能鉴定具有更高机会达到如ypT0ypN0的pCR的患者。
在本发明的上下文中，根据美国国立卫生研究院的美国国家癌症研究所定义稳定疾病和/或发展(SDPR)。因此，术语“稳定疾病”和“发展”分别表示程度或者严重程度既不降低也不增加的癌症，或表示变得严重或在体内扩散的癌症。这两种情况都不是所期望的，尤其是在面对几个月的高毒性化疗方案之后；因此仅在一组(SDPR)中组合这两种可能性以便预测这些不利的结果。
事实上，本发明所述的生物标志物在生物样品中易于检测，尤其是在血液中易于检测，并且它们的水平始终与乳腺癌的程度相关。
通常，由于生物标志物可能将两种或更多种生物状态彼此区分，因此它是一种有价值的工具，作为正常生物过程、致病过程的指示物或作为药物干预的反应。代谢物是低分子化合物(<1kDa)，小于大多数蛋白质、DNA和其它大分子。蛋白质活性的小变化导致生化反应及其代谢物(＝代谢生物标志物，着眼于身体的代谢)的巨大变化，其浓度、流量和转运机制对疾病和药物干预敏感。这可能获得反映遗传学和环境因素(例如:营养、身体活动、肠微生物和药物)的生理物质和病理生理物质的个体概况。因此，与如作为生物标志物而不是代谢生物标志物的蛋白质或激素相比较，代谢生物标志物提供了更全面的信息。
鉴于此，本文使用的术语“代谢生物标志物”或短的“生物标志物”被定义为适合作为乳腺癌存在和状态的指标以及肿瘤亚型的指标的化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。术语“生物标志物”和“代谢生物标志物”通常在本发明的上下文中同义使用，并且通常是指一种代谢物的量或两种或更多种代谢物的比率。因此，术语代谢生物标志物或生物标志物也包括两种或更多种代谢物之间的比率。
术语“量”通常是指样品(例如：血液样品)中代谢物的浓度，通常以mol/L给出，但也可用本领域通常使用的其它单位计量，例如g/L，mg/L或其他。术语“总和”通常是指在各个实施例中特定的所有代谢物的量的总和。术语“比率”通常是指各个实施方案中指定的代谢物的量的比率。
本发明所测定的代谢生物标志物(组)可以包括氨基酸和生物胺、酰基肉碱、己糖、鞘脂类和甘油磷脂(如下表1至5中所列)这些类别的代谢物(即分析物)。这些类别的定义是本领域技术人员已知的，然而，这些类别的优选成员在下文的表1至5中进行了总结。此外，下表1的生物胺被理解为通过天然氨基酸的酶催脱羧得到的一组天然存在的生物活性化合物。生物源物质是一种通过生命过程所提供的物质，而所述生物胺含有胺基。
优选地，根据本发明所测定的代谢生物标志物(组)包括权利要求中指定的生物标志物的组合。
令人惊讶地，已经发现测定包含这些类型的代谢物的一组生物标志物，即测定某些指示性代谢物的量和/或比率，可以以一种改进的方式和在早期阶段筛查和/或诊断乳腺癌、可以预测对乳腺癌新辅助化疗的治疗反应、可以评估乳腺癌肿瘤活性的生物化学反应以及可以在固有乳腺癌肿瘤亚型之间进行次级分类。
如果遗漏了各自生物标志物集合所指定的一种代谢物或一类代谢物，或如果其数量减少，则乳腺癌的评估变得较不敏感和较不可靠。这对于使用已知的生物标志物而根据已知方法根本不能可靠检测的疾病的早期阶段特别适用。事实上，测定同时包含在各生物标志物集中的代谢物可以更准确和更可靠地评估乳腺癌，通常具有优选大于80％的灵敏度，更优选大于90％，进一步更优选大于98％，最优选100％。这样的事实既没有在现有技术中描述也没有从现有技术中显而易见。
此外，如本文所述的本发明的生物标志物和生物标志物集允许以大于80％的特异性对乳腺癌进行更为可靠和准确的评估，更优选大于85％，进一步更优选大于90％，最优选100％。
此外，如本文所述的本发明的生物标志物集允许以大于40％阳性预测值(PPV)对乳腺癌进行更为可靠的评估，更优选大于50％，进一步更优选大于60％，最优选大于80％。
此外，如本文所述的本发明的生物标志物集允许以大于80％的阴性预测值(NPV)对乳腺癌进行更为可靠的评估，更优选大于90％，进一步更优选大于98％，最优选100％。
在一个优选的实施例中，如本文所述的本发明的生物标志物集允许以100％的灵敏度和100％的NPV对乳腺癌进行更为可靠的评估。
术语“灵敏度”，“特异性”，“阳性预测值”和“阴性预测值”的含义通常是本领域已知的，并且根据“预测值理论”(由美国爱荷华大学建立)在本发明的上下文中进行了定义。
在这个理论中，程序的诊断价值由其灵敏度、特异性、预测值和效率来定义。公式总结如下。
测试的灵敏度是具有阳性测定结果的所有患有疾病的患者的百分比。TP＝测定为阳性；FN＝假阴性
(TP/(TP+FN))×100＝灵敏度(％)
测试的特异性是具有阴性测定结果的所有没有患病的患者的百分比。TN＝测定为阴性；FP＝假阳性。
(TN/(FP+TN))×100＝特异性(％)
测试的预测值是阳性值或阴性值相对于真实值的比例(％)，即，为真阳性的所有阳性测试的百分比是阳性预测值。
(TP/(TP+FP))×100＝阳性结果的预测值(％)
(TN/(FN+TN))×100＝阴性结果的预测值(％)
生物标志物的性能可以通过在统计单变量分析(Statistical UnivariateAnalysis)过程中确定本文使用的阳性和阴性似然比(LR)进一步评估。
LR 解释
>10 疾病的可能性大且通常是决定性的增加
5-10 疾病的可能性中度增加
2-5 疾病的可能性小幅增加
1-2 疾病的可能性最小化增加
1 疾病的可能性不变
0.5-1.0 疾病的可能性最小化减小
0.2-0.5 疾病的可能性小幅减小
0.1-0.2 疾病的可能性中度减小
<0.1 疾病的可能性是大幅减小且通常是决定性的减小
在更优选的实施例中，如本文所述的本发明的生物标志物集允许以100％的灵敏度、85％或更高的特异性和100％的NPV对乳腺癌进行更为可靠的评估。
在更优选的实施例中，如本文所述的本发明的生物标志物集允许以100％的灵敏度、90％或更高的特异性、80％或更高的PPV以及100％的NPV对乳腺癌进行更为可靠的评估。
在最优选的实施例中，如本文所述的本发明的生物标志物集物允许以100％的灵敏度、100％的特异性、100％的PPV和100％的NPV对乳腺癌进行更为可靠的评估。
如上所述，待评估的疾病是乳腺癌。优选地，所述乳腺癌是I，II，III或IV期的乳腺癌，更优选地是III期的乳腺癌，例如IIIa期，IIIb或IIIc期。乳腺癌的医学阶段的定义由在美国国家卫生研究所的美国国家癌症研究所的美国国家癌症研究所美国癌症联合委员会(AJCC)定义(参见Breast.In:Edge SB，Byrd DR，Compton CC,et al.,eds:AJCC CancerStaging Manual.7th ed.New York，NY:Springer，2010，pp 347-76)。分期系统提供了针对预后将患者分组的策略。制定治疗决定是部分根据分期类别，但主要根据患者的肿瘤大小、淋巴结状态、肿瘤组织中的雌激素受体和孕酮受体水平、人表皮生长因子受体2(HER2/neu)状态、绝经状态和患者的一般健康。
生物样品取自哺乳动物，优选为小鼠，大鼠，豚鼠，狗，小型猪或人，最优选为人，进一步优选为女性。生物样品优选是血液，然而，允许根据本发明进行测定的本领域技术人员已知的任何其他生物样品也是合适的。血液样品通常是全血，血清或血浆，其中，优选血浆。纸过滤器收集的干燥样品也可接受。因此，本发明所述的方法通常是体外测定方法。
对于测定生物样品中代谢物浓度，使用定量分析方法，例如色谱法、光谱法和质谱法，而质谱法是特别优选的。色谱可以包括GC，LC，HPLC和UHPLC；光谱可包括UV/Vis，IR和NMR；质谱分析器/光谱可以包括ESI-QqQ，ESI-QqTOF，MALDI-QqQ，MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。更优选地，质量分析器/光谱分析包括四极杆质量分析器，离子阱质谱分析器，TOF(飞行时间)质量分析器、轨道阱质量分析器、磁式扇形质量分析器、静电场扇形质量分析器(Electrostatic Sector Mass Analyzer)、离子回旋共振(ICR)以及质量分析器的组合(包括单四极杆(Q)和三重四极杆(QqQ)，QqTOF，TOF-TOF，Q轨道阱)。优选是使用FLA-和HPLC-串联质谱法。
缩写如下:GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV-Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振，ESI＝电子喷雾电离，MALDI＝基质辅助激光解吸/电离，TOF＝飞行时间，APCI＝大气压化学电离，QqQ＝三重四极杆配置(也称为Qlq2Q3(Q1和Q3四极杆是质量过滤器，q2是无质量分辨四极杆(no mass-resolving quadrupole)))。
对于测定代谢物的量，目标代谢组学被用于量化生物样品中的代谢物，所述生物样品中的代谢物包括氨基酸、生物胺、酰基肉碱、己糖、鞘脂类和甘油磷脂的这些分析物类别。定量是在同位素标记的内标的存在下进行，并通过上述方法确定。在下表中指出了适合作为本发明待测定的代谢物的分析物列表，包括它们的缩写(BC代码)。
表1:氨基酸和生物胺(μM)
表2:酰基肉碱(μM)
表3:己糖(mM)
BC代码 分析物
H1 己糖
表4:鞘脂类(mM)
BC代码 分析物
SM(OH)C14:1 具有酰基残基总和C14:1的羟基鞘磷脂
SM(OH)C16:1 具有酰基残基总和C16:1的羟基鞘磷脂
SM(OH)C22:1 具有酰基残基总和C22:1的羟基鞘磷脂
SM(OH)C22:2 具有酰基残基总和C22:2的羟基鞘磷脂
SM(OH)C24:1 具有酰基残基总和C24:1的羟基鞘磷脂
SM C16:0 具有酰基残基总和C16:0的鞘磷脂
SM C16:1 具有酰基残基总和C16:1的鞘磷脂
SM C18:0 具有酰基残基总和C18:0的鞘磷脂
SM C18:1 具有酰基残基总和C18:1的鞘磷脂
SM C120:2 具有酰基残基总和C20:2的鞘磷脂
SM C22:3 具有酰基残基总和C22:3的鞘磷脂
SM C24:0 具有酰基残基总和C24:0的鞘磷脂
SM C24:1 具有酰基残基总和C24:1的鞘磷脂
SM C26:0 具有酰基残基总和C26:0的鞘磷脂
SM C26:1 具有酰基残基总和C26:1的鞘磷脂
表5:甘油磷脂(mM)
下文中描述本发明的其它优选实施例。然而，无意于排除它们与上面进一步描述的特征的组合。
乳腺癌的筛查和/或诊断
在第一实个施例中，本发明的生物标志物和生物标志物集用于筛查可能患有乳腺癌的受试对象(例如:人类患者)并诊断这些受试对象的乳腺癌。令人惊讶的是，在本发明中已经发现，本文中所述的生物标志物和生物标志物集尤其适用于快速、简单且高通量地筛查大量的受试对象(例如:病人)，并以提高的结果准确性，从这些受试对象的血液样本诊断乳腺癌。因此，在本实施例中，“评估”包括筛查和/或诊断哺乳动物受试对象的，优选是人的乳腺癌。
因此，本发明涉及代谢物的组合作为筛查和/或诊断乳腺癌的生物标志物集的用途，所述代谢物的组合至少包括:
(a)选自谷氨酰胺、谷氨酸和丝氨酸中的一种氨基酸，和一种脂质，或
(b)谷氨酰胺和谷氨酸。
本发明还涉及用于筛查和/或诊断哺乳动物受试对象或哺乳动物受试对象群体中乳腺癌的方法，所述方法包括测定从受试对象获取的血液样品中至少以下物质的含量:
(a)选自谷氨酰胺、谷氨酸和丝氨酸中的一种氨基酸，和一种脂质，或
(b)谷氨酰胺和谷氨酸。
尽管通过使用上述特定的生物标志物集合，通过特异性、灵敏度、PPV和NPV中的一个或多个的参数所确定的筛查和/或诊断的准确性和可靠性已经相对于现有技术(如乳房X线照相)极大地提高了，但是，通过使用一种或多种(优选两种或更多种，更优选三种或更多种)额外的代谢物，可以进一步提高准确度和可靠性。
因此，在一个优选的实施例中，所述生物标志物集进一步包含一个或多个额外的氨基酸，例如表1中所包括的那些氨基酸。优选地，所述额外的氨基酸选自生糖氨基酸/生酮氨基酸，例如，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，最优选为天冬酰胺和天冬氨酸。
此外，优选地，脂质选自鞘脂类和甘油脂(例如甘油磷脂)，例如，在表4和表5中所包括的脂质中的一个或者多个。更优选地，所述脂质是花生四烯酸衍生的，优选花生四烯酸衍生的含有38个或更多个碳原子的脂质，并且最优选的是选自：花生四烯酸多不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基，花生四烯酸单不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基和花生四烯酸饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基。
在另一个优选的实施例中，代谢物的组合进一步包括鞘磷脂和戊烯二酰肉碱中的一种或多种。
此外，优选地，用于筛查和/或诊断乳腺癌的方法还包括测量以下物质中的一种或多种(优选两种或多种，更优选三种或更多种)的量或量的比率:
花生四烯酸多不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和，
花生四烯酸单不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和，
花生四烯酸饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和，
花生四烯酸多不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和/花生四烯酸单不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和的比率，
花生四烯酸单不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和/花生四烯酸饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基的总和的比率，
磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:1，
磷脂酰胆碱酰基-酰基C28:1，
鞘磷脂C24:1和/或鞘磷脂C18:0，
和戊烯二酰肉碱。
可选择地，所述方法还包括，基于代谢物的量和所测定的代谢物的比率，鉴定患有乳腺癌的那些受试对象，更优选地，还包括治疗这些受试对象的乳腺癌，例如通过化疗。
由于本实施例的方法可以从血液样品进行，但是与现有技术的筛查技术(例如:乳房X射线照相)相比，该方法大大增加了受试对象的顺应性。尤其是，该方法大大提高了筛查结果的可靠性和灵敏度，特别是减少了假阳性和假阴性结果的数量，并且耗时较少，因此可以用大量患者进行。
此外，与现有技术的筛查技术(例如:乳房X线照相)相比，该方法大大增加了受试对象的顺应性。尤其是，该方法大大增加了筛查结果的可靠性和灵敏度，特别是减少了假阳性和假阴性结果的数量，并且更省时。
预测对新辅助化疗的治疗反应
在另一个实施例中，本发明的生物标志物和生物标志物集用于预测患有乳腺癌的患者是否可能对新辅助化疗有反应。新辅助治疗是作为在主要治疗之前减少肿瘤的第一步骤的治疗方式，其通常是手术。新辅助疗法的实例包括化疗(例如:环磷酰胺，紫杉醇，多柔比星)放射疗法和激素疗法(他莫昔芬，芳香酶抑制剂)。
因此，本发明进一步涉及代谢物(包含下文所述的生物标志物集)的组合用于预测患有乳腺癌的哺乳动物受试对象是否可能对新辅助化疗有反应的用途。
特别地，本发明涉及哺乳动物受试对象的血液样品中所含的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为用于预测对乳腺癌新辅助化疗的治疗反应的生物标志物集，所述代谢物的组合至少包含以下物质:
一种选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸，
甲基化精氨酸，
一种酰基肉碱和
一种脂质。
本发明进一步涉及一种用于预测哺乳动物受试对象对乳腺癌新辅助化疗的治疗反应的方法，所述方法包括测定从所述受试对象获得的血液样品中至少以下物质的量:
一种选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸，
甲基化精氨酸，
一种酰基肉碱，和
一种脂质。
虽然通过使用上述特定的生物标志物集合，通过特异性、灵敏度、PPV和NPV中的一个或多个参数确定，预测的准确性和可靠性相对于现有技术已经大大改善，但是通过使用一种或多种(优选两种或更多种，更优选三种或更多种)额外的代谢物，准确性和可靠性可以进一步改善。
优选地，甲基化精氨酸是二甲基化精氨酸(DMA)。
在优选的实施例中，所述生物标志物集还包含一个或多个额外的氨基酸，例如表1中包括的那些氨基酸。优选地，所述额外的氨基酸选自生糖/生酮氨基酸，例如甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，最优选为丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和甘氨酸。
在一个优选的实施例中，所述酰基肉碱选自表2中包括的那些肉碱，更优选地，选自戊二酰肉碱(C5-DC)、甲基戊二酰肉碱(C5-M-DC)和十二烷二酰肉碱(C12-DC)中的一种或多种。进一步优选地，代谢物的组合还包含一种或多种额外的酰基肉碱，例如表2中包括的那些可能计算脂肪酸的β和ω氧化的那些酰基肉碱。
此外，优选地，脂质选自鞘脂类和甘油脂(例如甘油磷脂)，例如，在表4和5中所包含的一种或多种脂质。更优选地，花生四烯酸脂质(分子中含有38个或更多个碳原子的脂肪酸)选自含有4，5和6个不饱和键的多不饱和脂质、单不饱和脂质和饱和脂质。
更优选地，所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:6，磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:5，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:4，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C32:2，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C17:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C26:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0和溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C24:0。
更优选地，代谢物的组合进一步包括腐胺、精胺和二甲基化精氨酸中的一种或多种。
优选地，用于预测对乳腺癌新辅助化疗的治疗反应的方法进一步包括测定下列物质中的一种或多种(优选为两种或多种，更优选为三种或多种)的量或量的比率：磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:6，磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:5，磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:4，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C32:2，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C17:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C26:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，溶血磷脂酰胆碱酰基-烷基C24:0，腐胺，精胺，总的二甲基化精氨酸。
在一个具体的优选实施例中，以上所描述的生物标志物集合可以作为生物标志物集，用于预测患有乳腺癌的受试对象对化学疗法的完全治疗应答(对于pCR高预测值)。因此，在一个可选的实施例中，本发明指向如上描述的代谢组合物作为生物标志物集的用途，该生物标志物集用于预测患有乳腺癌的受试对象对化学疗法的完全治疗应答(对于pCR高预测值)。
乳腺癌肿瘤活性生物化学反应的评估
在另外一个实施例中，本发明指向一种代谢物组合物的用途，所述代谢物组合物包含在哺乳类动物受试对象的血液样本中，该代谢物组合物至少包含：一种选自谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸，以及一种脂质，所述代谢组合物作为生物标志物集，用于评估乳腺癌肿瘤的酶活性。
本发明进一步地指向一种评估哺乳类动物受试对象乳腺癌肿瘤生物化学反应的评估方法，所述方法包括测量受试对象血液样本中至少一种选自谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸以及一种脂质的数量。
在本发明中，惊人地发现乳腺癌肿瘤活性能够通过特定的代谢生物标志物的测量表征，其反映了肿瘤代谢物的酶活性。在本发明上下文中，乳腺癌活动的生物化学反应(反应或反映)因此被定义为前体-产物代谢物比率的测量，所述比率反映了与致癌作用相关的重要新陈代谢反应的酶活性，例如谷氨酰胺分解、糖酵解、谷氨酰胺反应，以及烷化甘油磷酸盐合酶反应(AGPS)。
具体的，与现有技术的肿瘤表征相比，例如测量肿瘤尺寸或体积，惊人地发现通过新陈代谢生物标志物方式表征肿瘤活性更加有利及卓越。具体的，已发现了新陈代谢活动一般与肿瘤尺寸相独立，因此本发明提供了一种更加合适的参数来测定乳腺癌肿瘤活性。例如，治疗类型及药物剂量，例如在化学疗法中的剂量，在现有技术中经常通过简单测量肿瘤的尺寸来确定。然而，肿瘤尺寸并没有反应肿瘤的新陈代谢活动，相同尺寸的肿瘤可能有高侵入性或甚至不活跃。因此，病患需要根据肿瘤实际的新陈代谢活动调整疗法。因此，现有技术应用的疗法经常不足以或者不合适高效治疗病患的癌症。因此，评估乳腺癌肿瘤活性的生物化学或者新陈代谢反应提供了一种合适的工具来调整病患的治疗，从而大幅提升病患的依从性及生活质量。
脂质优选从鞘脂类和甘油糖脂中选择，例如甘油磷脂，例如包含在表4和5中的一个或多个脂质。更优选的，花生四烯酸脂质(脂肪酸包括38个或更多个碳)从包括4、5和6个不饱和键的多元不饱和脂质，单不饱和以及饱和脂质中选择。
更优选的，脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基及脂酰胆碱酰基-酰基。
更优选的，代谢物组合物更进一步包括亮氨酸和鸟氨酸中的一种或多种。
评估乳腺癌肿瘤活性的生物化学反应的方法优选地还包括测量一个或多个，优选两个或更多，更优选三个或更多亮氨酸和鸟氨酸的数量或者数量的比率，全部磷脂酰胆碱酰基-烷基/全部磷脂酰胆碱(酰基-烷基和酰基-酰基)的比率。
乳腺癌肿瘤的次级分类
在另一个实施例中，本实施例指向了如上所述的生物标志物和生物标志物集用于哺乳类动物受试对象的乳腺癌肿瘤的次分类的用途。
乳腺癌肿瘤分类及次分类通常依据细胞受体状态而进行。乳腺癌细胞可能具有或不具有许多不同形态的受体，现有分类中最主要的三个是：雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，以及HER2。带有或者不带有这些受体的细胞被称为ER阳性(ER+)，ER阴性(ER-)，PR阳性(PR+)，PR阴性(PR-)，HER2阳性(HER2+)以及HER2阴性(HER2-)细胞。不具有上述3个受体中的任何一个的细胞被称作基础性或者三阴性细胞。
在本发明中意外地发现血液代谢物特征可特异性用于肿瘤次分类。因此，本文所描述的生物标志物及生物标志物集对于血液样本中的乳腺癌肿瘤的次分类是特别有用的。此外，根据特定地血液代谢物特征，本发明的生物标志物及生物标志物集能够将固有的癌症次分类再细分为低应答肿瘤和高应答肿瘤。
具体的，本发明提供了一种合适的用以区别不同的肿瘤次分类的工具:
a)ER阳性和/或PR阳性的luminal A/luminal B型肿瘤(luminal A和B,ER+/PR+,ER+/PR-,ER-/PR+)，但同时HER2阴性；
b)luminal B-HER2阳性型肿瘤，ER和或者PR阳性，同时HER2阳性(luminal B HER2+)；
c)HER2阳性型肿瘤，ER阴性及PR阴性，但HER2阳性；
d)三阴型肿瘤(ER-,PR-,HER2-)。
因此，本发明能够明确地鉴定及区别血液中上述提及的不同乳腺癌肿瘤。
本发明更加一步地指向哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢组合物的用途，所述代谢组合物作为生物标志物集，用于对乳腺癌肿瘤亚型进行次分类，所述代谢组合物至少包括：
一种分子中含有至少10个碳原子的酰基肉碱，以及
一种分子中至多含有3个不饱和键的脂质。
术语“不饱和”是指脂质分子中包含一定数量的碳碳双键。
本发明更加一步地提供了一种对哺乳动物受试对象固有的乳腺癌肿瘤亚型进行次分类的方法，所述方法包括测量从受试对象获取的血液样本中至少以下物质的数量：
一种分子中含有至少10个碳原子的酰基肉碱，以及
一种分子中至多含有3个不饱和键的脂质。
更加一步，可选择的代谢物为蛋氨酸亚砜、赖氨酸、组氨酸、lysoPC C24:0、lysoPCC20:3、瓜氨酸和精氨酸中的一种或多种。
优选的，酰基肉毒碱优选从表2中所包含的物质进行选择，其分子包含10个以上的碳原子，优选12个以上，更优选13个以上的碳原子，更进一步优选自戊二酰肉毒碱(C5-DC)及甲基戊二酰肉毒碱(C5-M-DC)及十二烷基二酰基肉毒碱(C12-DC)。
优选的，脂质从鞘脂类和甘油糖脂中选择，例如甘油磷脂，例如表4或5中所示的一种或多种脂质。更优选的，脂质源自花生四烯酸，最优选的，这些脂质在分子中有38个或更多碳原子。
更优选的，脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基及磷脂酰胆碱酰基-酰基，最优选的是从以下物质进行选择：磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:3，磷脂酰胆碱酰基-酰基C36:0，磷脂酰胆碱酰基-酰基C42:0，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:l,磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C40:l。
在更优选实施例中，代谢组合物更进一步包含一种或多种氨基酸，优选一种或多种从表1中选取的氨基酸，最优选选自精氨酸，蛋氨酸，丁烯基肉毒碱，犬尿氨酸及色氨酸。
另外，在相同的肿瘤次类别中，高VS低应答的肿瘤的比较揭示肿瘤的次类型与特定的血液代谢标志物显著相关。
特别地，本发明惊人地发现，基于生物标志物能够区分某些类型的乳腺癌肿瘤，该生物标志物对于某种肿瘤而言是特异的。因此，在此优选实施例评估包括了哺乳动物受试对象、特别是人类的乳腺癌肿瘤的次分类。
在一个具体的优选实施例中，本发明指向了一种辨别哺乳类受试对象Luminal A型乳腺癌肿瘤的方法，所述方法包括测量从受试对象采集的血液样本中至少一种分子中有至少10个碳原子的酰基肉碱，一种至多包括3个不饱和键的PC aa以及至少一种氨基酸的数量。
在另一个优选实施例中，本发明指向了一种辨别哺乳类受试对象Luminal B型HER2阴性肿瘤的方法，所述方法包括测量从受试对象采集的血液样本中至少一种分子中有至少10个碳原子的酰基肉碱，至少一种至多包括3个不饱和键的PC aa，至少一种PC ae，至少一种氨基酸以及至少一种溶原性PC a的数量。
在另一个优选实施例中，本发明指向了一种辨别哺乳类受试对象ER2-阳性肿瘤的方法，所述方法包括测量从受试对象采集的血液样本中至少一种分子中有至少10个碳原子的酰基肉碱，至少一种PC aa，至少一种至多包括3个不饱和键的PC ae，至少一种氨基酸的数量。
在另一个优选实施例中，本发明指向了一种辨别哺乳类受试对象ER2-阳性肿瘤的方法，所述方法包括测量从受试对象采集的血液样本中至少一种分子中有至少10个碳原子的酰基肉碱，至少一种至多包括3个不饱和键的PC aa，至少一种氨基酸以及至少一种溶原性PC a的的数量。
在另一个优选实施例中，本发明指向了一种辨别哺乳类受试对象三阴性肿瘤的方法，所述方法包括测量从受试对象采集的血液样本中至少一种分子中有至少10个碳原子的酰基肉碱，至少一种至多包括3个不饱和键的PC aa，至少一种氨基酸以及至少一种溶原性PC a的的数量。
在另一个优选实施例中，本发明指向了一种辨别哺乳类受试对象HER2过表达肿瘤(HER2阳性和Luminal B HER2阳性)的方法，所述方法包括测量从受试对象采集的血液样本中至少一种分子中有至少10个碳原子的酰基肉碱，至少一种PC ae以及至少一种PC aa。
由于某些特定的肿瘤次类型彼此之间对于化学疗法的应答是不相同的，例如它们可以区分为高应答VS低应答，根据本发明优选实施例的方法能够预测病患是否有可能会对化学疗法(例如新辅助化疗)产生应答，甚至在治疗之前。因此，乳腺癌的治疗可以根据病患的肿瘤类型实现个体化。因此，化学疗法的成功率大幅提升。
试剂盒
此外，本发明还针对一种适用于执行上述方法的试剂盒，所述试剂盒包括一个装置，该装置包括一个或多个井以及一个或多个插件，所述插件浸渍了至少一种内标物。该装置在专利WO 2007/003344以及WO 2007/003343有详尽的描述，这两个专利申请均以引用的方式并入本文。
以下实施例将进一步描述和阐述本发明，但并不意在限制本发明的保护范围。
具体实施方式
基本信息：
病患和方法
总共64份来自于未接受过前期治疗的乳腺癌三期妇女的血浆样本被并行分配到三个对照组。其中，包括93名健康的妇女的第一组在发现阶段使用。第二组在独立验证集中被分析，包括30个乳腺癌妇女血浆样本以及24个对照血浆样本。最后，包括616个志愿者(524个健康者和92个病患(55个大肠癌患者和37个艾滋病患者))的第三组用于检测结果的特异性。
在手术之前，利用临床和放射性方法对初始肿瘤进行测量，其平均尺寸为7.09cm(3.5-14cm)。通过病理专家直接在手术产物上评估最终的肿瘤体积，且pCR被定义为在乳房或节点中没有任何侵入性和非侵入性残留物的组织病理学现象(ypTO/ypNO)。那些在乳腺中发生了至少90％的应答且在腋窝中没有残余的肿瘤的患者被命名为“高应答者”(Hresp)，相较而言，剩下的患者被命名为“低应答者”(Lresp)。为了识别与pCR相关的代谢物，在训练集(training set)阶段包括患者在内的起始29个样本被用于预测性标志物发现，接下来的30个样本被分到独立验证集(validation set)中。
为了确定与稳定疾病/发展(SDPR)相关的代谢因子，所有患者被包括在内，具有最大30％的临床应答，包括12个稳定期疾病和7个发展期。在预测性代谢标志物的发现期间，利用起始的21个被纳入的患者组建训练集，剩下的38个患者作为独立验证集。
为了检测预测模型是否不仅与高/低应答率相关，还与肿瘤应答的不同程度相关，根据肿瘤应答的发展程度(0％,30％,30-75％,75-90％,90-99％和100％)或SDPR(0-30％),Lresp(30-90％),Hresp(>90％),pCR(100％)，通过分析特异性的代谢物来确定结果。同时，试图为已确定的代谢物的致癌特性的额外确认提供支持，因此，这些已确定的代谢物在初始肿瘤体积(肿瘤体积从4cm直到12cm)的发展梯度中也进行了检测。
最后，为了评估血液代谢物是否可以预测化疗应答，鉴于乳腺癌不同的亚型，对病患进行分类，首先根据的是Minckwitz等人(2012)进行癌症固有的亚型分类，其次根据肿瘤应答率的高低进行分类(Hresp＞75％)和Lresp(＜75％))。
代谢物的测定
1、非目标性鸟枪实验MS/MS分析是在巴西圣保罗的AB-Sciex实验室的独立服务中进行的。血浆样本被注入到日本岛津公司的Prominence LC系统，该系统结合到AB-Sciex5600Tripe TOF质谱仪中，扫描速率为100光谱/秒，稳定质量准确度为约2ppm。利用含5.0Mm甲酸铵的甲醇/水(90/10)等梯度洗脱从而进行流动注射分析(FLA)。流速和注入量分别为0.025ml/min和50uL。没有进行离子源或去簇电压(50V和-40V)优化。电离参数为：CUR＝20psi,GS1＝20psi,GS2＝15psi,Temp＝250℃,IS＝5000V(-4000V)。在测量和相关扫描阶段，所采用的参数如下：MS扫描范围为m/z 100-1200，累积时间0.25s，产物离子扫描范围为m/z 100-1200，累积时间0.03s。
2、目标性定量代谢组学/脂类组学(ESI-MS/MS)轮廓是在独立验证集(具有34个乳腺癌病患妇女和616个对照血浆样本)中进行的，是在两个独立的收取服务费的定量代谢组学平台(澳大利亚因斯布鲁克的Biocrates Life Sciences AG和美国、加拿大的QuestDiagnostics Nichols Institute San Juan Capistrano)进行的。目标性(ESI)MS/MS定量技术在专利US 2007/0004044有详尽的描述。简要来说，目标性的轮廓方案用于定量筛选已知小分子代谢物，通过多反应监测、中性丢失和前体离子扫描的方式。生物样品的代谢物的定量是采用适当的内标物实现的，采用的方法已证实符合21CFR(联邦管理法规)第11部分的规定，在给定的误差范围内，其暗示了可重复性的证据。所有被分析的代谢物的浓度以μm计算。
代谢物组(panel)
总计，检测到183种不同的代谢物：40个酰肉碱，19个蛋白原氨基酸、鸟氨酸和瓜氨酸,19个生物胺，己糖,76个磷脂酰胆碱,l4个溶血磷脂酰胆碱和15个鞘磷脂。
根据甘油部分中的酯(a)键和醚(e)键的存在,甘油磷脂被进一步区分，两个字母(aa＝二酰基，ae＝酰烷基，ee＝二烷基)表示两个甘油结合到脂肪酸残基上,而一个字母(a＝酰基或e＝烷基)则表明单个脂肪酸残基的存在。
脂类侧链组合物缩写为Cx:y,x表示侧链的碳原子数，y表示双键的数目。例如，“PCae C38:l”代表缩醛磷脂/plasmenogen磷脂酰胆碱，其在两条脂肪酸侧链中具有38个碳原子，且在其中之一具有一个双键。
数据分析
训练集用于标志物发现，通过逻辑回归分析识别任何与应答相关的临床变量。代谢物浓度的定量和质量控制评估是软件包(奥地利因斯布鲁克BIOCRATES LifeSciences AG)执行的。
内标物作为代谢物浓度计算的参考。随后导出xls文件,该文件包含样品名称、代谢物名称和血浆中代谢物浓度(单位为μmol/L)。
数据被上传到基于网络的分析软件MetaboAnalyst 2.0(www.metaboanalyst.ca)，并通过MetaboAnalyst的标准化协议(Xia et al 2012)对数据进行规范化，以进行单元/多元变量分析、多维特征选择、聚类和监督分类、功能富集以及代谢途径分析。
数据也被导入ROCCET(ROC Curve Explorer&Tester)(见网页http://www.roccet.ca/ROCCET/)，通过SVM(支撑向量机)、PLS-DA(偏最小二乘法判别分析)和随机森林算法(Random Forests)产生单元或多元的ROC曲线(受试者操作特性曲线)。
曲线是由MCCV(蒙特卡罗交叉检验)产生的，采用了平衡的二次抽样，样本的2/3用来评估特性的重要性。其中，重要的特性被用来构建分类模型，用剩余的1/3样本验证分类模型。上述过程将会被反复多次，以计算每个模型的性能和置信区间。
术语定义
(1)上调和下调:上调意味着代谢物的浓度的增加,例如，由于酶活性变化而导致的生化反应率的上升。反之，则是下调。
(2)t试验：t-试验是统计假设试验，所用的数据是MarkerView软件整合的数据，其可以应用于表中每一个变量，在给定标准差和样本的数量的情况下，其可以确定每个组的均值是否显著不同,例如，发现两个不同组之间是否存在有效的差别。
(3)p值：p值是获得已实际观察到的结果或更极端结果的概率，假定无效假设(没有任何变化和影响的假设)是正确的。p值总是正数,其值越低，发生变化的概率越小。0.05或更小的p值在5％的水平上拒绝无效假设,这意味着仅仅在5％概率内会发生改变。在我们的表格中这是一个水平集。
(4)Log-倍数变化:Log-倍数变化定义为每一种条件下的平均对数转换浓度之间的区别。这是一种描述不同组值高低的方式。例如,Log-倍数变化了0.3，即相较于对照(健康组)有exp(3)＝1.34的上升倍数改变。Log-倍数变化了-0.3，即相比于对照(健康组)，有exp(-3)＝0.74＝(l/1.34)的上升倍数改变或相对于疾病组有1.34的下降倍数改变。
结果
1、筛查和/或诊断乳腺癌
单元和多元试探性ROC分析
首先,进行发现集(30个病患和93个对照)、验证剂1(34个病患和24个对照)和验证集2(34个病患和616个对照)的主成分分析(PCA)和ROC曲线分析，其显示筛查和诊断具有相当大的可靠性,结果如下表6所示:
表6:鉴定出的代谢物与乳腺癌之间的相关性分析(64名乳腺癌患者VS 616名对照)
来自64个病患的PCA和PLS-DA分析被首先包括在内，与616个对照样本想比较。癌症患者与对照组之间血液代谢物的显著差别的存在(在2000次置换后，p＝0.0245)确定了在两个集中的PCA分析。置换检验统计数据显示，在2000次置换循环后p值＜5e-4(8A)。该结果极其显著地证实了PLS-DA分析(8B)。
用于单元/多元分析的已鉴定出的代谢物如表1和表2所描述，t试验、描绘高显著性p值和所有代谢物FDR(假发现率)的相关性研究如表7与表8所示。
表7：
*总的花生四烯酸PUFA PC ae/总的花生四烯酸MUFA PC ae
表8：
*总的花生四烯酸PUFA PC ae/总的花生四烯酸MUFA PC ae
训练集和验证集中获得的多元ROC曲线评估(以获取结果的性能，用于筛选目标)如表6所示。已鉴定出的代谢产物能够准确区分癌症患者和对照，灵敏度＝100％，特异性＝98.31％，阳性预测值(PPV)＝79.09％，阴性预测值(NPV)＝100％，精确地将癌症患者与对照分开来。
更重要的是，即使在1000次置换后，特征(signatures)仍然高度显著，确认了ROC曲线分析。
相关性分析没有显示肿瘤应答率与临床病理变量之间的任何显著性结果，如下表9所示。
表9：
参数 相关性 P值
雌激素状态 -0.092498 0.48594
孕激素状态 -0.0086648 0.94807
年龄 0.064451 0.62769
HER-2状态 0.01862 0.88868
核级 0.090079 0.49747
肿瘤初始体积 0.0016361 0.99019
进一步，训练集阶段所获得的ROC曲线显示了准确区分癌症患者和对照的最小代谢物集，其至少包括(a)一种选自谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸的氨基酸和一种脂质；或(b)谷氨酰胺和谷氨酸。自ROC曲线分析所获得的结果如图1-7所示。
图1A：验证集阶段获得的ROC曲线分析，采用了两种代谢物(谷氨酰胺(Gln)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:l(PC ae C42:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。截点(cutoff)＝-9.397，敏感度＝1.0(1-1)，特异性＝1(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.0，t试验＝8.0019E-22，p值＜0.001(1000次置换)。
图1B：验证集阶段获得的ROC曲线分析，采用了两种代谢物(谷氨酰胺(Gln)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:l(PC ae C42:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。截点＝-9.397，敏感度＝1.0(1-1)，特异性＝0.974(0.935-1)，阳性似然率＝38.5，阴性似然率＝0.0，t试验＝1.2632E-58，p值＜0.001(1000次置换)。
图2A：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酰胺(Gln)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:l(PC ae C38:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。截点＝-6.645，敏感度＝1.0(1-1)，特异性＝0.9844(0.953-1)，阳性似然率＝64.0，阴性似然率＝0.0，t试验＝9.9636E-31，p值＜0.001(1000次置换)。
图2B：验证集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酰胺(Gln)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:l(PC ae C38:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。截点＝-6.645，敏感度＝0.9844(0.953-1)，特异性＝0.9481(0.896-0.967)，阳性似然率＝18.95，阴性似然率＝0.01648，t试验＝3.6347E-42，p值＜0.001(1000次置换)。
图3A：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(丝氨酸(Ser)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:l(PC ae C38:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。截点＝6.231，敏感度1.0(1-1)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.0，t试验＝1.9204E-13，p值＜0.001(1000次置换)。
图3B：验证集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(丝氨酸(Ser)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:l(PC ae C38:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。截点＝5.575，敏感度＝0.9219(0.851-0.969)，特异性＝0.93(0.885-0.98)，阳性似然率＝13.17，阴性似然率＝0.08401，t试验＝1.6951E-43，p值＜0.001(1000次置换)。
图4A：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(丝氨酸(Ser)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:l(PC ae C42:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。截点＝7.468，敏感度＝0.9655(0.941-1)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.03448，t试验＝3.7077E-10，p值＜0.001(1000次置换)。
图4B：验证集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(丝氨酸(Ser)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:l(PC ae C42:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。截点＝7.162，敏感度＝0.8906(0.812-0.969)，特异性＝0.98(0.95-1)，阳性似然率＝44.53，阴性似然率＝0.1116，t试验＝1.6951E-43，p值＜0.001(1000次置换)。
图5A：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酸(Glu)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C28:l(PC ae C28:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。截点＝-6.119，敏感度＝0.9483(0.888-1)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.05172，t试验＝4.1972E-20，p值＜0.001(1000次置换)。
图5B：验证集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酸(Glu)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C28:l(PC ae C28:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。截点＝-6.335，敏感度＝0.9219(0.859-0.977)，特异性＝0.83(0.75-0.9)，阳性似然率＝5.423，阴性似然率＝0.09413，t试验＝2.1657E-26，p值＜0.001(1000次置换)。
图6A：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酸(Glu)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:l(PC ae C42:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。敏感度＝100％，特异性＝100％，阳性预测值＝100％，阴性预测值＝100％，p值＜0.001(1000次置换)。
图6B：验证集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酸(Glu)与磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:l(PC ae C42:l))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。敏感度＝100％，特异性＝99％，阳性预测值＝98.46％，阴性预测值＝100％，p值＜0.001(1000次置换)。
图7A：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酸(Glu)与谷氨酰胺(Gln))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝11。截点＝-1.101，敏感度＝1.0(1-1)，特异性＝1.1(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.0，t试验＝9.9058E-17，p值＜0.001(1000次置换)。
图7B：训练集阶段所获得的ROC曲线，采用了两种代谢物(谷氨酸(Glu)与谷氨酰胺(Gln))，乳腺癌n＝64，而对照组n＝77。截点＝-1.101，敏感度＝0.9219(0.851-0.969)，特异性＝0.93(0.86-0.97)，阳性似然率＝13.17，阴性似然率＝0.08401，t试验＝4.6268E-26，p值＜0.001(1000次置换)。
通过上面的数据可以看出,与现有的方法相比，本发明可以以更高的精度和可靠性筛查和诊断乳腺癌患者。这一点通过以下对比(表10)尤其可以显示。
表10:本发明与现有技术研究的比较
*Qui Y.et al.,Int.J.Mol.Sci.2013,14,8047-8061
2、对化疗高(Hresp)或低应答(SDPR)的预测
总共有10个病人(6个来自训练集，4个来自验证集)实现了至少90％的应答,其中7个达到完全病理性应答(pCR)，被定义为ypTO/ypNO。观察到pCR和SDPR占病人的总百分比分别为11.8％(7/59)和32％(19/59)。
在训练集阶段所获得的ROC曲线显示了用于准确预测化疗应答的代谢物的最小的集，所述代谢物的最小的集至少包括一种选自谷氨酸或丝氨酸的氨基酸、甲基精氨酸、一种酰肉碱和一种脂质。从ROC曲线分析获得的结果如图9-12所示。
图9A：在训练集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C42:0，谷氨酰胺以及十二碳二酰基肉毒碱C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和应答率为35-78％的病患(n＝21)。截点＝-11.56，敏感度＝1.0(1-1)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.0，t试验＝8.553E-6，p值＜0.001(1000次置换)。
图9B:在验证集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C42:0，谷氨酰胺以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和具有稳定疾病/发展的病患(SDPR,n＝22)。截点＝-11.56，敏感度＝0.9091(0.773-1)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.09091，t试验＝2.5381E-4，p值＜0.001(1000次置换)。
图10A:在训练集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C30:0，谷氨酰胺以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和应答率为35-78％的病患(n＝21)。截点＝-10.12，敏感度＝0.7143(0.571-0.905)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.2857，t试验＝8.553E-6，p值＜0.001(1000次置换)。
图10B:验证集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C42:0，谷氨酰胺以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和具有稳定疾病/发展的病患(SDPR,n＝22)。截点＝-10.12，敏感度＝0.773(0.591-0.955)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.2273，t试验＝4.8125E-4，p值＜0.001(1000次置换)。
图11A:训练集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C42:0，丝氨酸以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和低应答的病患(n＝52)。截点＝8.416，敏感度＝0.4902(0.342-0.638)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.5098，t试验＝0.018905，p值＜0.001(100次置换)。
图11B:验证集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C42:0，丝氨酸以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和具有稳定疾病/发展的病患(SDPR,n＝22)。截点＝-8.412，敏感度＝0.875(0.625-1)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.125，t试验＝0.013813，p值＜0.001(100次置换)。
图12A:训练集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C32:2，丝氨酸以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患以及应答率为80-92％的病患(n＝8)。截点＝11.38，敏感度＝0.625(0.375-0.875)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.375，t试验＝0.017765，p值＜0.001(100次置换)。
图12B:验证集阶段所获得的ROC曲线分析，采用了总DMA，PC ae C32:2，丝氨酸以及C12-DC，比较具有完全病理应答(pCR，n＝7)的病患和具有稳定疾病/发展的病患(SDPR,n＝22)。截点＝11.37，敏感度＝0.5909(0.479-0.797)，特异性＝1.0(1-1)，阳性似然率＝无穷大，阴性似然率＝0.4091，t试验＝0.026961，p值＜0.001(100次置换)。
上述数据显示了利用上述特异性生物标志物集合进行预测显著的可靠性与准确性,如特异性、敏感性、PPV和NPV参数所确定。
3、根据固有乳腺癌亚型的代谢物
在训练集阶段所获得的ROC曲线显示了用于乳腺癌亚型的次分类的代谢物的最小的集，所述代谢物的最小的集至少包括一种分子内具有至少10个碳原子的酰肉碱，和一种至多包括3个不饱和键的脂质。自ROC曲线分析所获得的结果如图13-15所示。
图13：利用表11中描绘的代谢物鉴别乳腺癌的特异性亚型。ROC曲线分析显示了Luminal肿瘤A/B患者(n＝30)、三重阴性和HER2-阳性患者(其他肿瘤n＝29)的识别情况。AUC＝0821(95％CI:0.686-0.945)，敏感度＝81.08％,特异性＝82.86％,阳性预测值＝83.33％,阴性预测值＝80.56％,p值＝0.008(1000次置换)。
表11:在多元分析中所使用的鉴别Luminal A/B肿瘤的代谢物列表
代谢物 AUC p值
Lys/C16:1-oh/PC ae C40:1 0.81379 7.4353E-6
C16:1-OH/PC ae C40:1 0.79655 4.2815E-5
C16:1-OH/PC ae C40:1 0.79195 9.1894E-5
lysoPC a C24:O/C9/C10:2 0.78966 5.8548E-5
C16:1-OH/PC ae C42:0 0.78736 5.783E-5
C16:1-OH/PC aa C38:0 0.78621 9.1278E-5
PC ae C30:2/C9/C10:2 0.78621 4.0237E-5
His/C16:1-OH/PC ae C40:1 0.78391 8.8153E-5
图14：利用表12中描绘的代谢物鉴别乳腺癌的特异性亚型。ROC曲线分析显示了HER2肿瘤患者(LumB-HER2+HER2)(n＝19)、三重阴性和Luminals A/B患者(其他肿瘤n＝40)的识别情况。AUC＝0.803(95％CI:0.639-0.926),敏感度＝86.36％,特异性＝76.92％,阳性预测值＝61.29％,阴性预测值＝93.02％,p值＝0.002(1000次置换)。
表12:在多元分析中所使用的鉴别HER2-阳性肿瘤的代谢物列表
代谢物 AUC p值
PC aa C26:0/14:1-OH 0.80921 7.6516E-5
Met-SO/C9/C10:2 0.80132 1.4739E-4
PC ae C30:2/C9/C10:2 0.79342 2.3424E-4
图15：利用表13中描绘的代谢物鉴别乳腺癌的特异性亚型。ROC曲线分析显示了三阴性患者(n＝10)和HER2-阳性/Luminals A/B患者(其他肿瘤n＝49)的识别情况。AUC＝0.875(95％CI:0.762-0.98),敏感度＝83.33％,特异性＝85.96％,阳性预测值＝55.56％,阴性预测值＝96.08％,p值<0.001(1000次置换)。
表13:在多元分析中所使用的鉴别三阴性肿瘤的代谢物列表
*NOS Act＝瓜氨酸/精氨酸(一氧化氮合酶活性)的比率
以上数据显示，基于对肿瘤具有特异性的生物标志物可以区分乳腺癌肿瘤的特定类型，具有很高的准确度和可靠度，如特异性、敏感性、PPV和NPV参数所确定。
工业应用
本发明使得筛选可能遭遇乳腺癌的受试对象(尤其是人类患者)成为可能，以及能够以改进的方式诊断受试对象中的乳腺癌，从而提供更加准确、可靠和有效的筛选和诊断方式。
此外，本发明可以在疾病早期阶段更好地预测遭遇乳腺癌的病患是否对化疗(例如，新辅助化疗)发生应答。事实上，通过本发明，本发明中生物标志物在血液中很容易检测到，并且它们的水平与乳腺癌阶段始终相关。因此，本发明的方法很容易在短时间内高通量地操作，从而提高病人的依从性。
此外，本发明的生物标志物以及生物标志物集可用于区分肿瘤的亚型，从而基于肿瘤亚型进行个性化治疗，从而额外地提高患者的依从性以及增加治疗的成功性。
进一步，本发明可通过生物标志物确定肿瘤活性，相较于现有技术中所采用的肿瘤特征，本发明的生物标志物更有利和优越。评估乳腺癌肿瘤活性的生物化学反应提供了一种合适的工具来调整病患的治疗，从而极大程度地提高病患的依从性以及生活质量。
基于以上，有可能制备一种试剂盒，该试剂盒适于辅助筛选和诊断乳腺癌，适用于辅助病患的肿瘤分类以及确定其生物化学活性，还适用于辅助监测疾病发展以及病患对新辅助化疗的治疗性应答。
实施例：
1.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于筛选和/或诊断乳腺癌，所述代谢物的组合至少包括：
(a)一种选自谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸中的氨基酸以及一种脂质，或
(b)谷氨酰胺和谷氨酸。
2.如实施例1所述的用途，其中所述脂质选自花生四烯酸多不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基，花生四烯酸单不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基和花生四烯酸饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基。
3.如实施例1或2所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括鞘磷脂和戊烯二酰肉毒碱中的一种或多种。
4.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于预测乳腺癌新辅助化疗的治疗应答，所述代谢物的组合至少包括：
一种选自谷氨酰胺和丝氨酸的氨基酸；
甲基化的精氨酸；
一种酰基肉毒碱；和
一种脂质。
5.如实施例4所述的用途，其中所述酰基肉毒碱选自戊二酰肉毒碱和甲基戊二酰肉毒碱中的一种或多种。
6.如实施例4或5所述的用途，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:6，磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:5，磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:4，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C32:2，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:0，溶血磷脂胆碱a C17:0，溶血磷脂胆碱a C26:0，溶血磷脂胆碱a C30:0和溶血磷脂胆碱a C24:0。
7.如实施例4～6任一项所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括腐胺、精胺和二甲基化精氨酸中的一种或多种。
8.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于评估乳腺癌肿瘤的酶活性，所述代谢物的组合至少包括：
一种选自谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸；以及，
一种脂质。
9.如实施例8所述的用途，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基和磷脂酰胆碱酰基-酰基。
10.如实施例8或9所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括亮氨酸和鸟氨酸中的一种或多种。
11.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于对乳腺癌肿瘤亚型进行次级分类，所述代谢物的组合至少包括：
一种分子中含有至少10个碳原子的酰基肉碱，以及
一种分子中至多含有3个不饱和键的脂质。
12.如实施例11所述的用途，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:3，磷脂酰胆碱酰基-酰基C36:0，磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱酰基-酰基C42:0，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:0，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:1，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C40:1。
13.如实施例11或12所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括蛋氨酸亚砜、赖氨酸、组氨酸、lysoPC C24:0、lysoPC C20:3、瓜氨酸和精氨酸中的一种或多种。
14.一种筛选和/或诊断哺乳动物受试对象中乳腺癌的方法，所述方法包括检测从受试对象获取的血液样本中至少以下物质的量：
(a)一种选自谷氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸的氨基酸和一种脂质或
(b)谷氨酸和谷氨酰胺
15.一种预测哺乳动物受试对象中对于乳腺癌新辅助化疗的治疗应答的方法，所述方法包括检测从受试对象获取的血液样本中至少以下物质的量：
一种选自谷氨酰胺和丝氨酸的氨基酸；
甲基化的精氨酸；
一种酰基肉毒碱；和
一种脂质。
16.一种评估哺乳动物受试对象中乳腺癌肿瘤活性的生物化学反应的方法，所述方法包括检测从受试对象获取的血液样本中至少以下物质的量：
一种选自谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸；
甲基化的精氨酸；以及，
一种脂质。
17.一种对哺乳动物受试对象中乳腺癌肿瘤亚型进行次级分类的方法，所述方法包括检测从受试对象获取的血液样本中至少以下物质的量：
一种分子中含有至少10个碳原子的酰基肉碱，以及
一种分子中至多含有3个不饱和键的脂质。
18.如实施例14至17中任一项所述的方法，其中所述检测是基于定量分析方法，优选色谱、光谱法和质谱仪/光谱法。
19.如实施例18所述的用途，其中色谱包括GC,CE,LC,HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis,IR,NIR和NMR；质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合，包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ),QqTOF,TOF-TOF,Q-Orbitrap,APCI-QqQ,APCI-QqTOF,MALDI-QqQ,MALDI-QqT和MALDI-TOF-TOF。

Claims (15)

1.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于筛选和/或诊断乳腺癌，所述代谢物的组合至少包括：
(a)一种选自谷氨酰胺、谷氨酸、丝氨酸中的氨基酸以及一种脂质，或
(b)谷氨酰胺和谷氨酸。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述脂质选自花生四烯酸多不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基，花生四烯酸单不饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基和花生四烯酸饱和磷脂酰胆碱酰基-烷基。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括鞘磷脂和戊烯二酰肉毒碱中的一种或多种。
4.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于预测乳腺癌新辅助化疗的治疗应答，所述代谢物的组合至少包括：
一种选自谷氨酰胺和丝氨酸的氨基酸；
甲基化的精氨酸；
一种酰基肉毒碱；和
一种脂质。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述酰基肉毒碱选自戊二酰肉毒碱和甲基戊二酰肉毒碱中的一种或多种。
6.如权利要求4或5所述的用途，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:6，磷脂酰胆碱酰基-烷基C44:5，磷脂酰胆碱酰基-烷基C38:4，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C32:2，磷脂酰胆碱酰基-烷基C30:0，磷脂酰胆碱酰基-烷基C42:0，溶血磷脂胆碱a C17:0，溶血磷脂胆碱a C26:0，溶血磷脂胆碱a C30:0和溶血磷脂胆碱a C24:0。
7.如权利要求4～6任一项所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括腐胺、精胺和二甲基化精氨酸中的一种或多种。
8.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于评估乳腺癌肿瘤的酶活性，所述代谢物的组合至少包括：
一种选自谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和天冬氨酸的氨基酸；以及，
一种脂质。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-烷基和磷脂酰胆碱酰基-酰基。
10.如权利要求8或9所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括亮氨酸和鸟氨酸中的一种或多种。
11.哺乳动物受试对象的血液样品中所含有的代谢物的组合的用途，所述代谢物的组合作为生物标志物集，用于对乳腺癌肿瘤亚型进行次级分类，所述代谢物的组合至少包括：
一种分子中含有至少10个碳原子的酰基肉碱，以及
一种分子中至多含有3个不饱和键的脂质。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述脂质选自磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:3，磷脂酰胆碱酰基-酰基C36:0，磷脂酰胆碱磷脂酰胆碱酰基-酰基C42:0，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:0，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:1，磷脂酰胆碱酰基-酰基C38:2和磷脂酰胆碱酰基-烷基C40:1。
13.如权利要求11或12所述的用途，其中所述代谢物的组合进一步包括蛋氨酸亚砜、赖氨酸、组氨酸、lysoPC C24:0、lysoPC C20:3、瓜氨酸和精氨酸中的一种或多种。
14.如权利要求1或13任一项所述的用途，其中所述代谢物是基于定量分析方法测定的，优选色谱、光谱法和质谱仪/光谱法。
15.如权利要求14所述的用途，其中色谱包括GC,CE,LC,HPLC和UHPLC；光谱包括UV/Vis,IR,NIR和NMR；质谱仪/光谱法包括ESI、四极质谱仪、离子阱质谱仪、TOF(飞行时间)质谱仪、Orbitrap质谱仪、扇形磁场质谱仪、扇形静电场质谱仪、离子回旋共振(ICR)以及它们的组合，包括单级四极杆(Q)和三级四极杆((QqQ),QqTOF,TOF-TOF,Q-Orbitrap,APCI-QqQ,APCI-QqTOF,MALDI-QqQ,MALDI-QqTOF和MALDI-TOF-TOF。
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