BR112017004773B1 - Biomarcadores para avaliação do câncer de mama - Google Patents

Abstract

BIOMARCADORES PARA AVALIAÇÃO DO CÂNCER DE MAMA. A presente invenção refere-se a um conjunto de biomarcadores metabólicos para uso na avaliação de câncer de mama em um indivíduo mamífero. Em particular, a invenção refere-se a um conjunto de biomarcadores metabólicos para rastreio e/ou diagnóstico de câncer de mama, o conjunto de biomarcadores metabólicos compreendendo pelo menos (a) um aminoácido selecionado de glutamina, glutamato e serina e um lipídio, ou (b) glutamina e glutamato. Além disso, a invenção refere-se a um conjunto de biomarcadores metabólicos para prever a resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante de câncer de mama. Adicionalmente, a invenção refere-se a um conjunto de biomarcadores metabólicos para avaliar a reflexão bioquímica da atividade tumoral do câncer de mama. Ademais, a invenção refere-se a um conjunto de biomarcadores metabólicos para subclassificação entre subtipos de tumor de câncer de mama intrínsecos. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para avaliar o câncer de mama que compreende a obtenção de uma amostra biológica, de preferência sangue, de um indivíduo mamífero e a medição na amostra biológica da quantidade e/ou proporções de metabólitos. Utilizando os biomarcadores específicos e o método de acordo com a (...).

Description

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a novos biomarcadores para avaliação do câncer de mama. Em particular, a presente invenção proporciona novos biomarcadores para utilização na pesquisa e/ou diagnóstico de câncer de mama em pacientes, prognóstico de resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante do câncer de mama, avaliação de reflexos bioquímicos da atividade tumoral do câncer de mama e classificação de tumores do câncer de mama de acordo com seus subtipos intrínsecos. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para avaliar o câncer de mama em um sujeito mamífero e a um kit para a realização desse método. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para avaliar o câncer de mama, o qual compreende a obtenção de uma amostra biológica, de preferência sangue, de um sujeito mamífero, e a medição na amostra biológica da quantidade e/ou proporção de metabolitos. Ao se utilizar os biomarcadores específicos e os métodos de acordo com a presente invenção torna-se possível avaliar de forma mais adequada e confiável o câncer de mama.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Metabolômica

[0002] A metabolômica é uma medição quantitativa abrangente de compostos de baixo peso molecular que cobrem sistematicamente os principais metabólitos, que representam toda a gama de vias de metabolismo intermediário. A capacidade de analisar grandes matrizes de metabólitos extrai informações bioquímicas que refletem verdadeiros pontos finais funcionais de eventos biológicos abertos, enquanto outras tecnologias de genômica funcional, como transcriptômica e proteômica, embora altamente valiosas, apenas indicam a causa potencial para a resposta fenotípica. Portanto, essas tecnologias não podem necessariamente prever efeitos de drogas, resposta toxicológica ou estados de doença ao nível do fenótipo, a menos que uma validação funcional seja adicionada.

[0003] A metabolômica elimina esta lacuna de informação ao descrever, em particular, essa informação funcional, uma vez que as diferenças metabólicas nos fluidos e tecidos biológicos fornecem a ligação mais próxima às várias respostas fenotípicas. Desnecessário dizer que tais alterações no fenótipo bioquímico são de interesse direto para fármacos as indústrias farmacêuticas, biotecnológicas e de saúde, uma vez que a tecnologia apropriada permite prospecção e integração rentáveis dessa informação.

[0004] Em geral, o fenótipo não é necessariamente prognosticado pelo genótipo. A diferença entre genótipo e fenótipo é medida por muitas reações bioquímicas, cada uma com dependências individuais a variadas influências, incluindo drogas, nutrição e fatores ambientais. Nessa cadeia de biomoléculas dos genes ao fenótipo, os metabólitos são as moléculas quantificáveis com a ligação mais próxima ao fenótipo. Muitos estados fenotípicos e genotípicos, tais como, uma resposta tóxica a uma droga ou prevalência de doença, são prognosticados por diferenças nas concentrações de metabólitos funcionalmente relevantes dentro dos fluidos e tecidos biológicos.

Câncer de Mama

[0005] O câncer de mama é um tipo de câncer originário do tecido mamário, mais comumente do revestimento interno de dutos de leite ou dos lóbulos que suprem os dutos com leite. Em todo o mundo, o câncer de mama é responsável por 22,9% de todos os tipos de câncer (excluindo os tipos de câncer de pele do tipo não-melanoma) em mulheres. Em 2012, cerca de 226.870 mulheres nos Estados Unidos foram diagnosticadas com câncer de mama, o que representa 29% de todos os recém-diagnosticados pacientes de câncer feminino, levando a mais de 39.000 mortes nos Estados Unidos em 2011, sendo classificada como a segunda principal causa de morte por câncer em mulheres. O diagnóstico precoce pode aumentar significativamente as taxas de sobrevivência a longo prazo para o câncer de mama e, atualmente, a mamografia é o procedimento de pesquisa mais aceitável e eficaz para a detecção de câncer de mama, tendo sido recomendado pela U.S. Preventive Services Task Force (USPSTF) para mulheres com idade superior a 40 anos. No entanto, devido à alta falsa taxa positiva dessa pesquisa, a USPSTF revisou a sua recomendação para uma menor frequência de pesquisa por mamografia em 2009. Outras técnicas de exame de imagem, como a ultrassonografia e ressonância magnética, também têm sido utilizadas na pesquisa do câncer de mama. Infelizmente, mesmo com a inclusão dessas técnicas de exame de imagem, cerca de 20% dos pacientes com câncer de mama ainda não podem ser detectados.

[0006] Novos métodos de pesquisa e diagnóstico seriam muito úteis, especialmente nos países em desenvolvimento com dimensões continentais, onde os serviços especializados de mamografia não são oferecidos a todas as mulheres com mais de 40 anos de idade. Apenas no Brasil, por exemplo, cerca de 30 milhões de mulheres por ano são indicadas para exames de mamografia, no entanto, menos de 50% terá acesso a este exame. O resultado é que, entre os 52.000 novos casos/ano, mais de 60% correspondem a casos avançados, que irão necessitar de uma quimioterapia pré-cirúrgica para diminuir os grandes volumes de tumores desproporcionados, de modo a possibilitar uma cirurgia.

[0007] Portanto, existe uma necessidade urgente neste segmento da técnica para novos procedimentos de pesquisa, que podem ser facilmente realizados, isto é, sem a necessidade de equipamento ou recursos especializados. Além disso, há uma necessidade urgente para a provisão de métodos mais confiáveis e eficazes para o diagnóstico do câncer de mama com alta precisão, bem como, para métodos de previsão da progressão da doença e resposta à quimioterapia.

[0008] Uma abordagem promissora para a pesquisa no diagnóstico do câncer de mama é a utilização de biomarcadores, tais como, biomarcadores de plasma (ou soro) (como os antígenos e padrões de proteínas). No entanto, esses meios ainda estão longe de uso clínico. Alguns marcadores tumorais, tais como, CA15.3 e CA27.29, são recomendados apenas para monitoramento terapêutico, mas não para a pesquisa.

[0009] Portanto, são urgentemente necessários novos biomarcadores eficazes para a pesquisa e diagnóstico do câncer de mama que possam ser utilizados individualmente ou em combinação com outros métodos existentes.

[0010] Recentemente, descobriu-se que as propriedades metabólicas das células cancerosas são diferentes das células normais, uma vez que são dependentes da glicólise aeróbica, síntese de ácidos graxos e glutaminólise para a proliferação. A síntese de ácidos graxos intensificada, por exemplo, proporciona rapidamente a proliferação de células de tumor de lipídios para biogênese da membrana, conferindo uma vantagem de crescimento e sobrevivência. Da mesma forma, as células cancerosas são extremamente sensíveis à privação de glutamina e não podem proliferar em cultura sem a mesma. A "dependência de glutamina" resulta numa produção aumentada de subprodutos necessários para células que se proliferam rapidamente, tais como, células precursoras de aminoácidos e, como resultado, o metabolismo celular desregulado está também ligado à resistência a fármacos na terapia do câncer. De fato, a Sintase de Ácidos Graxos (FASN), uma enzima fundamental complexa que catalisa a síntese de ácidos graxos, está ligada à resistência adquirida a Taxol/Trastuzumab/Adriamicina no câncer de mama, ou à Gemcitabina intrínseca, e resistência à radiação no câncer pancreático. Finalmente, a glutaminólise está ligada à resistência à cisplatina, através da ativação do alvo mamífero da sinalização de Rapamicina Complexo 1 (mTORC 1) no câncer gástrico.

[0011] O câncer de mama é geralmente tratado com cirurgia, que pode ser seguida por procedimentos de quimioterapia ou radioterapia, ou ambos. A quimioterapia neoadjuvante tem sido usada principalmente para auxiliar no tratamento de cânceres de mama localmente avançados, especialmente aqueles considerados inoperáveis na primeira visita. Nos últimos anos, no entanto, tem sido cada vez mais utilizada para tumores menores e operáveis, a fim de poupar e preservar grandes porções de tecido mamário, do que, em caso contrário, serem removidos na cirurgia principal. Outra peculiaridade dessa abordagem de tratamento é que se proporciona uma oportunidade única para quantificar com precisão, por exames clínicos e/ou radiológicos, as variações do volume tumoral em resposta ao regime de quimioterapia adotado.

[0012] Além disso, o tipo de terapia, a seleção de fármacos e o regime de dosagem, convencionalmente, têm sido estabelecidos por mera determinação do tamanho do tumor. O tamanho do tumor, no entanto, não reflete a sua atividade bioquímica e metabólica e, portanto, não reflete se o tumor pode ser altamente agressivo ou benigno. Assim, as ferramentas convencionalmente utilizadas na técnica têm sido insuficientes para definir adequadamente o tratamento do câncer de mama no paciente.

[0013] A informação valiosa com relação à atividade metabolômica de um tumor de câncer de mama é utilizada na invenção não apenas para indicar regimes alternativos quando se observa uma resposta mínima ou nenhuma resposta à quimioterapia, mas, também, para identificar os doentes que obtêm uma resposta patológica completa (pCR) e, portanto, com mais resultados favoráveis.

[0014] Grandes esforços neste segmento da técnica têm sido dirigidos para o desenvolvimento de ferramentas prognosticadoras, capazes de colaborar na identificação de pacientes que têm maiores chances de alcançar pCR como ypTO/ypNO. Além disso, a ocorrência de progressão da doença é também uma grande preocupação com o uso de quimioterapia neoadjuvante e, embora muitos pesquisadores tenham procurado determinar prognosticadores clínicos e moleculares de um pCR, poucos destes pesquisadores relataram prognosticadores de progressão.

[0015] Wei S. e outros, no artigo “Metabolomics approach for predicting response to neoadjuvant chemotherapy for breast câncer”, publicado em Molecular Oncology (2012), desenvolveram um modelo de previsão combinando derivados metabólitos por NMR e MS, o que corretamente identificou 80% dos pacientes, cujos tumores não mostraram resposta completa à quimioterapia. Mediante uma combinação de quatro metabólitos, três deles detectados por ressonância magnética nuclear (NMR) (treonina, glutamina e isoleucina) e um por espectroscopia de massa (MS) (ácido linolênico), foi possível distinguir grupos de pacientes sem resposta, ou com resposta parcial ou completa. No entanto, o número de pacientes corretamente identificados de 80% não é ainda satisfatório.

[0016] Qiu Y. e outros, no artigo “Mass Spectrometry-Based Quantitative Metabolomics Revealed a Distinct Lipid Profile in Breast Cancer Patients”, publicado no Int. J. Mol. Sci. (2013), desenvolveram uma equação de diagnóstico baseada em três metabólitos (lysoPC a C16:0, PC ae C42:5 e PC aa C34:2) que diferenciou com sucesso os pacientes com câncer de mama de controles saudáveis, com uma sensibilidade de 98,1% e especificidade de 96,0%. No entanto, os autores não foram capazes de gerar resultados preditivos para resposta à quimioterapia, assim como, de qualquer resultado capaz de classificar tumores de câncer de mama, de acordo com seus subtipos intrínsecos. Consequentemente, ainda há espaço, não apenas para melhorias de sensibilidade e especificidade, como, também, para uma expansão significativa na aplicabilidade do modelo.

[0017] Portanto, há uma necessidade urgente neste segmento da técnica para o desenvolvimento de novas técnicas de pesquisa e diagnóstico com elevada precisão e confiabilidade, adequadas para identificar câncer de mama em pacientes, identificando o subtipo de tumor e o seu estado de atividade, prevendo a progressão do câncer de mama, o resultado da doença, bem como, a resposta terapêutica do paciente à quimioterapia.

PROBLEMA TÉCNICO DA INVENÇÃO

[0018] Com base nestas alterações metabólicas específicas do câncer, os inventores têm procurado identificar novas assinaturas de metabólitos sanguíneos, isto é, novos biomarcadores que podem ajudar na pesquisa da população de câncer de mama, bem como, no diagnóstico de câncer de mama em um sujeito. Além disso, tem-se procurado identificar as assinaturas de metabólitos sanguíneos para prever a progressão da doença, assim como, prever uma resposta terapêutica do doente à quimioterapia.

[0019] Tendo em vista os problemas acima mencionados existentes no segmento da técnica, o objeto que fundamenta presente invenção é o fornecimento de novos biomarcadores para avaliar o câncer de mama, cujos marcadores permitem a pesquisa e diagnóstico do câncer de mama já em uma fase inicial da progressão da doença, e com alta precisão e confiabilidade. De forma ótima, o marcador deve ser facilmente detectável em uma amostra biológica, tal como no sangue, e o seu nível deve estar consistentemente correlacionado com o estágio do câncer de mama. Além disso, constitui um objetivo da presente invenção proporcionar um método para avaliar o câncer de mama em uma amostra biológica, que permita um desempenho rápido, conveniente e de elevado rendimento.

[0020] Além disso, os novos biomarcadores devem ser adequados para prever a progressão do câncer de mama, o resultado da doença, bem como a resposta terapêutica do doente à quimioterapia.

[0021] A fim de solucionar os objetivos que fundamentam a presente invenção, os inventores basearam as suas investigações na metabolômica, uma vez que poderiam dar uma ideia das alterações bioquímicas que ocorrem no decurso do desenvolvimento do câncer de mama e oferecem diversos novos e potencialmente melhores biomarcadores. Os inventores descobriram que uma imagem mais abrangente de todas as vias e mecanismos metabolômicos envolvidos no câncer de mama é proporcionada quando se utiliza um painel de metabólitos que são alterados com o câncer de mama em evolução, em vez de utilizar as técnicas de pesquisa realizadas no segmento da técnica, tais como, mamografia ou outras técnicas de exame de imagens.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0022] Portanto, a presente invenção conforme definida nas reivindicações anexas, proporciona novos biomarcadores (isto é, um novo conjunto de biomarcadores), adequados para avaliar câncer de mama, particularmente, numa fase inicial da doença. Além disso, a presente invenção também proporciona um método para avaliar o câncer de mama em um sujeito mamífero com base nos biomarcadores e conjuntos de biomarcadores aqui descritos, assim como, um kit adaptado para realização de tal método.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] Na presente descrição é feita referência às Figuras 1-15, que demonstram exemplos de acordo com a invenção, do aumento ou diminuição de um biomarcador metabólico no câncer de mama em progressão. - Figura 1A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1). - Figura 1B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1). - Figura 2A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1). - Figura 2B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1). - Figura 3A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1). - Figura 3B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1). - Figura 4A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1). - Figura 4B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1). - Figura 5A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Glutamato (Glu) e Acilalquila Fosfatidilcolina C28:1 (PC aa C28:1). - Figura 5B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Glutamato (Glu) e Acilalquila Fosfatidilcolina C28:1 (PC aa C28:1). - Figura 6A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Glutamato (Glu) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1). - Figura 6B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Glutamato (Glu) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1). - Figura 7A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando dois metabólitos de Glutamato (Glu) e Glutamina (Gln). - Figura 7B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando dois metabólitos de Glutamato (Glu) e Glutamina (Gln). - Figuras 8A e 8B: Conjunto de validação final com câncer de mama, comparado com controles. - Figura 9A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Glutamina (Gln) e Dodecanodioilcarnitina (C12-DC), comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com 35-78% de Resposta. - Figura 9B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Glutamina (Gln) e Dodecanodioilcarnitina (C12-DC), comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com Doença Estável/Doença em Progressão. - Figura 10A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C30:0, Glutamina (Gln) e C12-DC, comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com 35-78% de Resposta. - Figura 10B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C30:0, Glutamina (Gln) e C12-DC, comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com Doença Estável/Doença em Progressão. - Figura 11A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Serina (Ser) e C12-DC, comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com Baixa Resposta. - Figura 11B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Serina (Ser) e C12-DC, comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com Doença Estável/Doença em Progressão (SDPR). - Figura 12A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C32:2, Serina (Ser) e C12-DC, comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com 80-92% de Resposta. - Figura 12B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C32:2, Serina (Ser) e C12-DC, comparando pacientes com Resposta Patológica Completa e pacientes com Doença Estável/Doença em Progressão. - Figura 13: Identificação de subtipos específicos de câncer de mama utilizando os metabólitos descritos na Tabela 11. Análise da curva ROC mostrando a identificação de doentes com Tumores Luminais A/B e doentes com Negativos Triplos e Positivos a HER2. - Figura 14: Identificação de subtipos específicos de câncer de mama utilizando os metabólitos descritos na Tabela 12. Análise da curva ROC mostrando a identificação de doentes com Tumores HER2 (LumB-HER2 + HER2) e doentes com Negativos Triplos e Luminais A/B. - Figura 15: Identificação de subtipos específicos de câncer de mama utilizando os metabólitos descritos na Tabela 13. Análise da curva ROC mostrando a identificação de doentes com Negativos Triplos e Positivos a HER2/Luminais A/B.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES PREFERIDAS DA INVENÇÃO

[0024] Ao utilizar os biomarcadores biológicos específicos (conjuntos de) e os métodos de acordo com a presente invenção, tornou-se possível avaliar o câncer de mama com precisão e confiabilidade melhoradas.

[0025] O termo "avaliação" no contexto da presente invenção significa a pesquisa de sujeitos que potencialmente sofrem de câncer de mama, diagnóstico de câncer de mama em sujeitos e monitoramento da progressão da doença, em particular, a detecção e marcação da doença nos diferentes estágios e/ou subclassificação do(s) tumor(es). Além disso, a "avaliação" abrange a previsão de um doente que sofre de câncer de mama ser suscetível de responder à quimioterapia, particularmente, à quimioterapia neoadjuvante. Além disso, a "avaliação" refere-se à determinação e caracterização da reflexão bioquímica da atividade tumoral do câncer de mama. Além disso, a "avaliação" no contexto da presente invenção significa a possibilidade de identificar positivamente um subtipo de tumor de câncer de mama em um doente, e de discriminar determinados tumores de câncer de mama, de acordo com os seus subtipos intrínsecos.

[0026] Foi surpreendentemente obtido na presente invenção proporcionar biomarcadores ou conjuntos de biomarcadores, através da medição da quantidade e/ou proporções de determinados metabólitos em amostras, tais como, amostras de sangue, de sujeitos que tornam possível detectar e diagnosticar câncer de mama em um dispositivo navegador melhorado, e em um estágio precoce da doença, e permitir uma previsão mais precisa e confiável de saber se um paciente que sofre de câncer de mama responderá provavelmente a uma quimioterapia, tal como, a uma quimioterapia neoadjuvante. Em particular, os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores da presente invenção tornam possível prever se um paciente é suscetível de obter uma resposta patológica completa (pCR) à quimioterapia ou a uma doença estável e/ou em progressão (SDPR). Além disso, verificou-se de forma surpreendente, que de acordo com a presente invenção, os subtipos de tumores de câncer de mama podem ser distinguidos com base no seu perfil de metabólito específico.

[0027] No contexto da presente invenção, a resposta patológica completa (pCR) é definida como não invasiva ou residual não invasiva na mama ou nódulos (ypTO ypNO), o que significa desaparecimento completo do tumor, após o término da quimioterapia, sem qualquer sinal residual de câncer deixado na mama e nódulos linfáticos. O pCR é um ponto final substituto adequado, particularmente para pacientes que possuem doença do tipo de câncer luminal B/HER2-negativa, HER2-positiva ou tripla negativa. Desse modo, a presente invenção torna possível identificar pacientes que têm maiores chances de alcançar pCR como ypTO ypNO.

[0028] No contexto da presente invenção, uma doença estável e/ou em progressão (SDPR) é definida de acordo com o National Cancer Institute dos Estados Unidos no National Institute of Health. Assim, os termos "Doença Estável" e "em Progressão" denotam, respectivamente, um câncer que não diminui nem aumenta em extensão ou gravidade, ou indica um câncer que se torna pior ou se espalha no corpo. Ambas as situações não são desejadas especialmente depois de enfrentar meses de regimes de quimioterapia altamente tóxicos; portanto, ambas as possibilidades foram combinadas em apenas um grupo (SDPR) para prever esses resultados desfavoráveis.

[0029] De fato, os biomarcadores de acordo com a invenção são facilmente detectáveis em amostras biológicas, em particular, no sangue, e o seu nível está consistentemente correlacionado com o grau do câncer de mama.

[0030] Em geral, um biomarcador é uma ferramenta valiosa devido à possibilidade de distinguir dois ou mais estados biológicos entre si, funcionando como um indicador de um processo biológico normal, um processo patogênico, ou como uma reação a uma intervenção farmacêutica. Um metabólito é um composto de baixo peso molecular (<1kDa), menor do que a maioria das proteínas, DNA e outras macromoléculas. Pequenas alterações na atividade das proteínas resultam em grandes mudanças nas reações bioquímicas e nos seus metabólitos (= biomarcador metabólico, observando o metabolismo do corpo), cujas concentrações, fluxos e mecanismos de transporte são sensíveis às doenças e à intervenção medicamentosa. Isso permite obter um perfil individual de substâncias fisiológicas e fisiopatológicas, refletindo fatores genéticos e ambientais, como nutrição, atividade física, intestino microbiano e medicação. Assim, um biomarcador metabólico fornece uma informação mais abrangente do que, por exemplo, uma proteína ou um hormônio, que são biomarcadores, mas não biomarcadores metabólicos.

[0031] Em vista disso, o termo "biomarcador metabólico" ou biomarcador curto, conforme aqui utilizado, é definido como sendo um composto adequado como indicador da presença e do estado do câncer de mama, assim como, do subtipo de tumor, sendo um metabólito ou composto metabólico que ocorre durante processos metabólicos no corpo de mamíferos. Os termos "biomarcador" e "biomarcador metabólico" são em geral utilizados como sinônimos no contexto da presente invenção e, tipicamente, referem-se à quantidade de um metabólito ou à proporção de dois ou mais metabólitos. Por conseguinte, o termo biomarcador metabólico ou biomarcador é idealizado de também compreender proporções entre dois ou mais metabólitos.

[0032] O termo "quantidade", tipicamente, refere- se à concentração de um metabólito em uma amostra, tal como uma amostra de sangue, sendo normalmente expresso em mol/L, mas também pode ser medido em outras unidades tipicamente utilizadas na técnica, tais como, g/L , mg/L ou outras mais. O termo "soma" significa tipicamente a soma da quantidade de todos os metabólitos, conforme especificado na respectiva modalidade. O termo "proporção" significa tipicamente a proporção de quantidades de metabólitos, conforme especificado na respectiva modalidade. O biomarcador metabólico (ou conjunto) medido de acordo com a presente invenção pode compreender as classes de metabólitos (isto é, analitos) de aminoácidos e aminas biogênicas, acilcarnitinas, hexoses, esfingolipídios e glicerofosfolipídios, conforme listado nas Tabelas 1 a 5 apresentadas abaixo. As definições dessas classes são conhecidas dos especialistas versados na técnica, no entanto, os elementos preferidos dessas classes estão resumidos nas Tabelas 1 a 5, abaixo. Além disso, as aminas biogênicas da Tabela 1 são entendidas como um grupo de compostos biologicamente ativos de ocorrência natural, derivados da descarboxilação enzimática dos aminoácidos naturais. Uma substância biogênica é uma substância fornecida por processos de vida, e as aminas biogênicas contêm um grupo amina.

[0033] De preferência, o biomarcador metabólico (conjunto) medido de acordo com a presente invenção compreende a combinação de biomarcadores, conforme especificado nas reivindicações em anexo.

[0034] Surpreendentemente, foi verificado que a medição de um conjunto de biomarcadores compreendendo estas classes de metabólitos, isto é, medindo a quantidade e/ou as proporções de certos metabólitos indicativos, permite a pesquisa e/ou o diagnóstico do câncer de mama de uma maneira melhorada em um estágio inicial da doença, permitindo a previsão de resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante do câncer de mama, e também a avaliação da reflexão bioquímica da atividade tumoral do câncer de mama, e permitindo ainda a subclassificação entre subtipos intrínsecos de tumores de câncer de mama.

[0035] Se um metabólito ou uma classe de metabólitos, conforme especificado para a respectiva combinação de biomarcadores, for omitida, ou se o seu número for diminuído, a avaliação do câncer de mama torna- se menos sensível e menos confiável. Isto aplica-se particularmente aos estágios iniciais da doença, não sendo de nenhum modo detectáveis de forma confiável, conforme métodos conhecidos que utilizam biomarcadores conhecidos.

[0036] De fato, a medição dos metabólitos contidos nos respectivos conjuntos de biomarcadores permite, ao mesmo tempo, uma avaliação mais exata e mais fiável do câncer de mama, tipicamente, com uma sensibilidade preferivelmente superior a 80%, mais preferivelmente, superior a 90%, ainda mais preferivelmente, superior a 98% e mais preferencialmente, de 100%. Tal fato não foi descrito nem tornado óbvio com o conhecimento do estado da técnica.

[0037] Além disso, os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores da presente invenção, conforme aqui descritos, permitem uma avaliação mais confiável e precisa do câncer de mama, com uma especificidade superior a 80%, mais preferivelmente, superior a 85%, ainda mais preferivelmente, superior a 90%, e mais preferencialmente, de 100%.

[0038] Além disso, o conjunto de biomarcadores da presente invenção, conforme aqui descrito, permite uma avaliação mais confiável do câncer de mama, com um valor prognosticado positivo (PPV) superior a 40%, mais preferivelmente, superior a 50%, ainda mais preferivelmente, superior a 60%, e mais preferencialmente, superior a 80%.

[0039] Além disso, o conjunto de biomarcadores da presente invenção, conforme aqui descrito, permite uma avaliação mais confiável do câncer de mama, com um valor prognosticado negativo (NPV) superior a 80%, mais preferivelmente, superior a 90%, ainda mais preferivelmente, superior a 98%, e mais preferencialmente, de 100%.

[0040] Em uma modalidade preferida, o conjunto de biomarcadores da presente invenção, conforme aqui descrito, permite uma avaliação mais confiável do câncer de mama, com uma sensibilidade de 100% e um NPV de 100%.

[0041] O significado dos termos "sensibilidade", "especificidade", "valor prognosticado positivo" e "valor prognosticado negativo" é tipicamente conhecido no segmento da técnica, sendo definido no contexto da presente invenção conforme a "Teoria do Valor Prognosticado", estabelecida Pela Universidade de Iowa, USA.

[0042] Nesta teoria, o valor de diagnóstico de um procedimento é definido pela sua sensibilidade, especificidade, valor prognosticado e eficiência. As fórmulas são resumidas abaixo.

[0043] A sensibilidade de um teste é a percentagem de todos os pacientes com doença presente que tenham um teste positivo. TP = Teste Positivo; FN = Falso Negativo; (TP/(TP+FN)) x 100 = % de Sensibilidade

[0044] A especificidade de um teste é a percentagem de todos os pacientes sem doença que tenham um teste negativo. TN = Teste Negativo; FP = Falso Positivo; (TN/(FP+TN)) x 100 = % de Especificidade

[0045] O valor prognosticado de um teste é uma medida (%) das vezes em que o valor (positivo ou negativo) é o valor verdadeiro, isto é, a percentagem de todos os testes positivos que são positivos verdadeiros é o Valor Prognosticado Positivo. (TP/(TP+FP)) x 100 = % do Valor Prognosticado de um Resultado Positivo, (TN/(FN+TN)) x 100 = % do Valor Prognosticado de um Resultado Negativo.

[0046] O desempenho dos biomarcadores pode ainda ser avaliado pela determinação das Proporções de Probabilidade Positiva e Negativa (LR) aqui utilizadas durante a Análise Estatística de Variação Única.

[0047] Em uma modalidade mais preferida, o conjunto de biomarcadores da presente invenção, conforme aqui descrito, permite uma avaliação mais confiável do câncer de mama, com uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 85% ou mais e um NPV de 100%.

[0048] Em uma modalidade mais preferida, o conjunto biomarcador da presente invenção, conforme aqui descrito, permite uma avaliação mais confiável do câncer de mama, com uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 90% ou mais, um PPV de 80% ou mais, e um NPV de 100%.

[0049] Na modalidade mais preferida, o conjunto biomarcador da presente invenção, conforme aqui descrito, permite uma avaliação mais confiável do câncer de mama, com uma sensibilidade de 100%, uma especificidade de 100%, um PPV de 100% e um NPV de 100%.

[0050] Conforme mencionado acima, a doença a ser avaliada é o câncer de mama. De preferência, é o câncer de mama nos estágios I, II, III ou IV, mais preferencialmente, o câncer de mama no estágio III, tal como, o estágio III a, b ou c. A definição dos estágios médicos de câncer de mama é fornecida pelo American Joint Committee on Cancer (AJCC) do National Institute of Cancer dos Estados Unidos, nos National Institutes of Health (cf. Breast, no artigo de Edge S.B., Byrd D.R., Compton C.C., e outros, Editores: AJCC Cancer Staging Manual, 7a. ed., Nova York, NY: Springer, 2010, páginas 347-76). O sistema de ocorrência de estágios fornece uma estratégia para agrupar pacientes em relação ao prognóstico. As decisões terapêuticas são formuladas parcialmente, de acordo com as categorias da ocorrência de estágio, mas, principalmente, de acordo com o tamanho do tumor, o estado do nó de linfa, o receptor de estrogênio e os níveis de receptor de progesterona no tecido tumoral, o estado do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2/neu), o estado da menopausa e a saúde geral do paciente.

[0051] A amostra biológica é obtida de um mamífero, de preferência, de um camundongo, um rato, uma cobaia, um cão, um miniporco, ou de um ser humano, mais preferivelmente, um ser humano, de mais preferência, de uma mulher. A amostra biológica preferencialmente é sangue, no entanto, qualquer outra amostra biológica conhecida de um especialista versado na técnica que permite que as medições de acordo com a presente invenção também são adequadas. A amostra de sangue é tipicamente de sangue completo, soro ou plasma, em que o plasma sanguíneo é o preferido. Amostras secas coletadas em filtro de papel também são aceitas. Assim, os métodos de acordo com a invenção são tipicamente métodos in vitro.

[0052] Para a medição das concentrações de metabólitos na amostra biológica é utilizado um método analítico quantitativo, tal como, cromatografia, espectroscopia e espectrometria de massa, conquanto que a espectrometria de massa é particularmente preferida. A cromatografia pode compreender os tipos de cromatografia de GC, LC, HPLC e UHPLC; a espectroscopia pode compreender UV/Vis, IR e NMR; e os analisadores de massa/espectrometria podem compreender ESI-QqQ, ESI-QqTOF, MALDI-QqQ, MALDI- QqTOF e MALDI-TOF-TOF. Mais preferivelmente, os analisadores de massa/espectrometria compreendem Analisadores de Massa Quadripolares, Analisadores de Massa de Armadilha de Íons, Analisador de Massa TOF (Time of Flight), Analisador de Massa Orbitrap, Analisador de Massa de Setor Magnético, Analisador de Massa de Setor Eletrostático, Ressonância Ciclotrônica de Íons (ICR) e combinações de analisadores de massa, incluindo analisador tipo quadrupolo único (Q) e quadrupolo triplo (QqQ), QqTOF, TOF-TOF, Q-Orbitrap. É preferida a utilização de espectrometria de massa em Tandem de FLA e HPLC.

[0053] As abreviações são apresentadas a seguir. GC = Cromatografia gasosa, CE = Eletroforese capilar, LC = Cromatografia líquida, HPLC = Cromatografia Líquida de Alta Pressão, UHPLC = Cromatografia Líquida de Ultra Alta Pressão, UV-Vis = Ultravioleta Visível, IR = Infravermelho, NIR = Próximo de Infravermelho, NMR = Ressonância Magnética Nuclear, ESI = Ionização por Pulverização de Elétrons, MALDI = Dessorção/ionização por Laser Auxiliada por Matriz, TOF = Tempo de Vôo, APCI = Ionização Química sob Pressão Atmosférica, QqQ = Configuração do tipo triplo quadrupolo, também conhecida como Qlq2Q3 (onde os quadrupolos Q1 e Q3 são filtros de massa e q2 é um quadrupolo sem resolução de massa).

[0054] Para a medição das quantidades de metabólitos, a metabolômica alvo é utilizada para quantificar os metabólitos na amostra biológica, incluindo as classes de analito de aminoácidos, aminas biogênicas, acilcarnitinas, hexoses, esfingolipídios e glicerofosfolipídios. A quantificação é feita na presença de padrões internos marcados isotopicamente, sendo determinada pelos métodos conforme descritos acima. Uma lista de analitos incluindo as suas abreviações (códigos BC), que são adequados como metabólitos a serem medidos conforme a invenção está indicada nas Tabelas seguintes. Tabela 1: Aminoácidos e Aminas Biogênicas (μM). Tabela 2: Acilcarnitina (μM). Tabela 3: Hexoses (mM) Tabela 4: Esfingolipídios (mM) Tabela 5: Glicerofosfolipídios (mM)

[0055] Adicionais modalidades preferidas da presente invenção serão descritas a seguir. No entanto, a sua combinação com as características descritas acima não pretende ser excluída.

Pesquisa e/ou Diagnóstico do Câncer de Mama

[0056] Em uma primeira modalidade, os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores da presente invenção são utilizados para pesquisa de sujeitos, tais como pacientes humanos, que potencialmente sofrem de câncer de mama, e para o diagnóstico de câncer de mama nestes sujeitos. Surpreendentemente, foi verificado, de acordo a presente invenção, que os marcadores biológicos e os conjuntos de biomarcadores, conforme aqui descritos, são particularmente úteis para uma pesquisa rápida, fácil e de alto rendimento de um grande número de sujeitos, como, por exemplo, pacientes humanos, e para o diagnóstico de câncer de mama a partir de amostras de sangue destes sujeitos com maior precisão dos resultados. Assim, na presente modalidade, a avaliação compreende a pesquisa e/ou o diagnóstico de câncer de mama em um sujeito mamífero, de preferência, em um ser humano.

[0057] Assim, a invenção é direcionada para a utilização de uma combinação de metabólitos compreendendo, pelo menos: (a) um aminoácido selecionado a partir de glutamina, glutamato e serina e um lipídio; ou (b) glutamina e glutamato, como um conjunto de biomarcadores para pesquisa e/ou diagnóstico do câncer de mama.

[0058] A invenção é ainda dirigida a um método para pesquisa e/ou diagnóstico de câncer de mama em um sujeito mamífero, ou uma população de sujeitos mamíferos, o método compreendendo a medição numa amostra de sangue obtida a partir do sujeito, da quantidade de pelo menos: (a) um aminoácido selecionado a partir de glutamina, glutamato e serina, e um lipídio; ou (b) glutamina e glutamato.

[0059] Embora a precisão e a confiabilidade da pesquisa e/ou do diagnóstico, conforme determinado pelos parâmetros de um ou mais dentre especificidade, sensibilidade, PPV e NPV, utilizando a combinação de biomarcadores acima especificada, já seja bastante melhorada em comparação com os procedimentos do estado da técnica, como, por exemplo, a mamografia, a precisão e confiabilidade podem ser mais ainda melhoradas, mediante uso de um ou mais, preferivelmente, dois ou mais, mais preferivelmente, três ou mais metabólitos adicionais.

[0060] Assim, em uma modalidade preferida, o conjunto de biomarcadores compreende ainda um ou mais aminoácidos adicionais, tais como aqueles incluídos na Tabela 1. Os aminoácidos adicionais são preferencialmente selecionados de aminoácidos glucogênicos/cetogênicos, tais como, glicina, cisteína, alanina, arginina, prolina, aspartato, asparagina, metionina, isoleucina, leucina, lisina, treonina fenilalanina, tirosina e triptofano, mais preferencialmente, asparagina e aspartato.

[0061] Além disso, o lipídio é de preferência selecionado a partir de esfingolipídios e glicerolipídios, tais como os glicerofosfolipídios, por exemplo, um ou mais dos lipídios incluídos nas Tabelas 4 e 5. Ainda preferivelmente, o lipídio é derivado de ácido araquidônico, de preferência, lipídios derivados de ácido araquidônico contendo 38 ou mais átomos de carbono, mais ainda preferivelmente, selecionado a partir de acilalquila fosfatidilcolina araquidônico poli-insaturado, acilalquila fosfatidilcolina araquidônico monoinsaturado e acilalquila fosfatidilcolina araquidônico saturado.

[0062] Em outra modalidade ainda preferida, a combinação de metabólitos compreende um ou mais dos compostos de esfingomielina e glutaconilcarnitina.

[0063] Além disso, o método para pesquisa e/ou diagnóstico de câncer de mama compreende, de um modo preferido, adicionalmente a medição da quantidade, ou proporção de quantidades, de um ou mais, preferivelmente, dois ou mais, mais preferivelmente, três ou mais dos seguintes: - soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas poli- insaturadas; - soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas monoinsaturadas; - soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas saturadas; - proporção da soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas poli-insaturadas/soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas monoinsaturadas; - proporção da soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas monoinsaturadas/soma de acilalquila fosfatidilcolinas araquidônicas saturadas; - acilalquila fosfatidilcolina C38:1; - acil-acil fosfatidilcolina C28:1; - esfingomielina C24:1 e/ou esfingomielina C18:0; e - glutaconilcarnitina.

[0064] Opcionalmente, o método compreende a etapa adicional de identificar, com base nas quantidades de metabólitos e proporções de metabólitos medidos, os sujeitos que sofrem de câncer de mama e ainda, preferivelmente, tratar o câncer de mama nestes sujeitos, por exemplo, por meio de quimioterapia.

[0065] Como o método da presente modalidade pode ser realizado mediante utilização de amostras de sangue, o método aumenta consideravelmente a aceitação do sujeito em comparação com os procedimentos de pesquisa citados pelo estado da técnica, como, por exemplo, a mamografia. Em particular, o método acentuadamente aumenta a confiabilidade e a sensibilidade dos resultados de pesquisa, em particular, reduz o número de resultados falsos positivos e falsos negativos, além de ser menos demorado e, portanto, pode ser realizado com um número elevado de pacientes.

[0066] Além disso, o método acentuadamente aumenta a aceitação do sujeito em comparação com procedimentos de pesquisa citados pelo estado da técnica, como, por exemplo, a mamografia. Em particular, o método aumenta consideravelmente a confiabilidade e sensibilidade dos resultados de pesquisa, em particular, reduz o número de resultados falsos positivos e falsos negativos, além de ser menos demorado.

Previsão da Resposta Terapêutica à Quimioterapia Neoadjuvante

[0067] Em outra modalidade, os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores da presente invenção são utilizados para prever se um paciente que sofre de câncer de mama é suscetível de responder à quimioterapia neoadjuvante. A terapia neoadjuvante é uma modalidade de tratamento proporcionada como uma primeira etapa para reduzir um tumor antes do tratamento principal, que geralmente é a cirurgia. Exemplos de terapia neoadjuvante incluem radioterapia com quimioterapia (tal como, ciclofosfamida, taxol, doxorrubicina) e terapia hormonal (Tamoxifeno, Inibidores de Aromatase).

[0068] Assim, a invenção é ainda dirigida à utilização de uma combinação de metabólitos, compreendendo os conjuntos de biomarcadores descritos a seguir, para predizer se um sujeito mamífero que sofre de câncer de mama é suscetível de responder à quimioterapia neoadjuvante.

[0069] Em particular, a presente invenção é dirigida à utilização de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um sujeito mamífero, a combinação de metabólitos compreendendo, pelo menos: - um aminoácido selecionado a partir de serina e glutamina; - arginina metilada; - uma acilcarnitina; e - um lipídio, como um conjunto de biomarcadores para o prognóstico da resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante do câncer de mama.

[0070] A invenção é ainda dirigida a um método para prever a resposta terapêutica a uma quimioterapia neoadjuvante de câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida do sujeito, da quantidade de pelo menos: - um aminoácido selecionado a partir de serina e glutamina; - arginina metilada; - uma acilcarnitina; e - um lipídio

[0071] Embora a precisão e a confiabilidade da previsão, conforme determinado pelos parâmetros de um ou mais dentre especificidade, sensibilidade, PPV e NPV, utilizando a combinação de biomarcadores acima especificada, já seja bastante melhorada em comparação com os procedimentos do estado da técnica, a precisão e confiabilidade podem ser mais ainda melhoradas, mediante uso de um ou mais, preferivelmente, dois ou mais, mais preferivelmente, três ou mais metabólitos adicionais.

[0072] Preferivelmente, a arginina metilada é arginina dimetilada (DMA).

[0073] Em uma modalidade preferida, o conjunto de biomarcadores compreende ainda um ou mais aminoácidos adicionais, tais como aqueles incluídos na Tabela 1. Os aminoácidos adicionais são preferencialmente selecionados de aminoácidos glucogênicos/cetogênicos, tais como, glicina, cisteína, alanina, arginina, prolina, aspartato, asparagina, metionina, isoleucina, leucina, lisina, treonina fenilalanina, tirosina e triptofano, mais preferivelmente, alanina, aspartato, asparagina, glutamato e glicina.

[0074] Numa modalidade preferida, a acilcarnitina é selecionada entre aquelas incluídas na Tabela 2, mais preferivelmente, é selecionada a partir de uma ou mais dentre glutarilcarnitina (C5-DC), metilglutarilcarnitina (C5-M-DC) e dodecanodioilcarnitina (C12-DC). Ainda mais preferivelmente, a combinação de metabólitos compreende ainda uma ou mais acilcarnitina adicionais, tais como, aquelas que tornam possível calcular a oxidação beta e ômega dos ácidos graxos incluídos na Tabela 2.

[0075] Além disso, o lipídio é de preferência selecionado a partir de esfingolipídios e glicerolipídios, tais como, glicerofosfolipídios, por exemplo, um ou mais dos lipídios incluídos nas Tabelas 4 e 5. Mais preferencialmente, os lipídios araquidônicos (ácidos graxos contendo 38 átomos de carbono ou mais na molécula) são selecionados a partir de lipídios poli-insaturados contendo 4, 5 e 6 insaturações, lipídios monoinsaturados e lipídios saturados.

[0076] Preferivelmente, o lipídio é selecionado a partir de acilalquila fosfatidilcolina C44:6, acilalquila fosfatidilcolina C44:5, acilalquila fosfatidilcolina C38:4, acilalquila fosfatidilcolina C30:0, acilalquila fosfatidilcolina C32:2, acilalquila fosfatidilcolina C30:0, acilalquila fosfatidilcolina C42:0, lisofosfatidilcolina a C17:0, lisofosfatidilcolina a C26:0, lisofosfatidilcolina a C30:0 e lisofosfatidilcolina a C24:0.

[0077] Mais preferencialmente, a combinação de metabólitos compreende ainda um ou mais dentre putrescina, espermina e arginina dimetilada.

[0078] O método para se prever a resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante de câncer de mama compreende, de um modo preferido, além da medição da quantidade ou proporção de quantidades, de um ou mais, de preferência dois ou mais, mais preferencialmente três ou mais de: acilalquila fosfatidilcolina C44:6 acilalquila fosfatidilcolina C44:5, acilalquila fosfatidilcolina C38:4, acilalquila fosfatidilcolina C30:0, acilalquila fosfatidilcolina C32:2, acilalquila fosfatidilcolina C30:0, acilalquila fosfatidilcolina C42:0, lisofosfatidilcolina a C17:0, lisofosfatidilcolina a C26:0, lisofosfatidilcolina a C30:0, lisofosfatidilcolina a C24:0, putrescina, espermina, e total de arginina dimetilada.

[0079] Numa modalidade particularmente preferida, as combinações de biomarcadores acima descritas podem ser utilizadas como um conjunto de biomarcadores para prever uma resposta terapêutica completa de um sujeito que sofre de câncer de mama à quimioterapia (elevado valor de prognóstico para pCR). Assim, numa modalidade alternativa, a invenção é dirigida à utilização de uma combinação de metabólitos, conforme descrito acima, como um conjunto de biomarcadores para prever a resposta terapêutica completa de um sujeito que sofre de câncer de mama à quimioterapia (elevado valor de prognóstico para pCR). Desse modo, numa modalidade alternativa, a invenção é dirigida à utilização de uma combinação de metabólitos conforme descrito acima, como um conjunto de biomarcadores para prever a resposta terapêutica completa de um sujeito que sofre de câncer de mama à quimioterapia (elevado valor de prognóstico para pCR).

Avaliação das Reflexões Bioquímicas da Atividade Tumoral do Câncer de Mama

[0080] Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida à utilização de uma combinação de metabólitos contidos numa amostra de sangue de um sujeito mamífero, a combinação de metabólitos compreendendo, pelo menos: - um aminoácido selecionado de glutamato, glutamina, alanina, glicina, serina e aspartato, e - um lipídio, como um conjunto de biomarcadores para avaliar as reflexões bioquímicas da atividade tumoral do câncer de mama.

[0081] A invenção é ainda dirigida a um método para avaliar as reflexões bioquímicas da atividade tumoral de câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida do sujeito da quantidade de pelo menos: - um aminoácido selecionado de glutamato, glutamina, alanina, glicina, serina e aspartato, e - um lipídio.

[0082] Foi surpreendentemente descoberto quando da aplicação da presente invenção que a atividade tumoral do câncer de mama pode ser caracterizada pela medição de certos biomarcadores metabólicos, que refletem a atividade enzimática do metabolismo do tumor. No contexto da presente invenção, as reflexões bioquímicas (refletidas ou espelhadas) da atividade do câncer de mama são assim definidas como as medições das proporções de metabólitos de precursor para produto, que refletem a atividade enzimática de reações importantes do metabolismo correlacionadas com a carcinogênese, tais como, glutaminólise, glicólise, atividade de glutaminase e atividade de sintase de fosfato de alquilglicerona (AGPS).

[0083] Em particular, foi surpreendentemente descoberto que a caracterização da atividade tumoral por meio de biomarcadores metabólicos é vantajosa e superior, se comparada com a caracterização tumoral realizada no segmento da técnica, tal como, por medição do tamanho ou volume de um tumor. Em particular, verificou-se que a atividade metabólica é geralmente independente do tamanho do tumor e, desse modo, proporciona um parâmetro mais adequado para determinar a atividade do câncer de mama. Assim, o tipo de terapia e a dosagem do fármaco, por exemplo, a dosagem durante a quimioterapia, têm sido frequentemente determinados no segmento da técnica pela simples medição do tamanho de um tumor. No entanto, o tamanho de um tumor não reflete a atividade metabolômica do tumor, pois tumores do mesmo tamanho podem ser altamente agressivos ou mesmo inativos. Consequentemente, os pacientes necessitam ajustar a terapia e o tratamento com base na atividade metabólica real do tumor. Desse modo, a terapia aplicada na técnica era muitas vezes não suficiente ou não adequada para tratar de forma efetiva o câncer de mama no paciente. Assim a avaliação da reflexão bioquímica ou metabólica da atividade tumoral do câncer de mama proporciona uma ferramenta adequada para adaptar e ajustar a terapia do paciente, desse modo, aumentando consideravelmente a aceitação do paciente e a qualidade de vida.

[0084] O lipídio é preferivelmente selecionado a partir de esfingolipídios e glicerolipídios, tais como, glicerofosfolipídios, por exemplo, um ou mais dos lipídios incluídos nas Tabelas 4 e 5. Ainda mais preferivelmente, os lipídios araquidônicos (ácidos graxos contendo 38 carbonos ou mais), são selecionados a partir de lipídios poliinsaturados contendo 4, 5 e 6 insaturações, lipídios monoinsaturados e lipídios saturados.

[0085] Mais preferivelmente, o lipídio é selecionado a partir de acilalquila fosfatidilcolina e acil-acila fosfatidilcolina.

[0086] Ainda mais preferivelmente, a combinação de metabólitos compreende ainda um ou mais compostos de leucina e ornitina.

[0087] O método para avaliar a reflexão bioquímica da atividade tumoral do câncer de mama compreende ainda, de um modo preferido, a medição da quantidade ou proporção de quantidades de uma ou mais, de preferência duas ou mais, mais preferivelmente, três ou mais proporções de leucina, ornitina, com relação ao total de acilalquila fosfatidilcolina/total de acilalquila e acil-acila fosfatidilcolina.

Subclassificação dos Tumores de Câncer de Mama

[0088] Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida à utilização de biomarcadores e conjuntos de biomarcadores, conforme aqui descrito, para subclassificação de um tumor de câncer de mama em um sujeito mamífero.

[0089] A classificação e subclassificação do câncer de mama é tipicamente realizada com base no estado do receptor celular. As células de câncer de mama podem ou não ter muitos tipos diferentes de receptores, em que os três mais importantes na presente classificação são: receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) e HER2. As células com ou sem estes receptores são chamadas ER positivas (ER+), ER negativas (ER-), PR positivas (PR+), PR negativas (PR-), HER2 positivas (HER2+) e HER2 negativas (HER2-). As células que não apresentam nenhum destes receptores são chamadas basais ou triplas negativas.

[0090] Surpreendentemente, foi verificado quando da aplicação da presente invenção, que as assinaturas de metabólitos de sangue são específicas para subtipos de tumores. Portanto, os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores conforme aqui descritos são particularmente úteis para a subclassificação de tumores de câncer de mama em amostras de sangue. Além disso, é possível com os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores da presente invenção subdividir subtipos intrínsecos de câncer em tumores de resposta baixa e tumores de resposta elevada, com base nas características específicas de metabólitos do sangue.

[0091] Em particular, a invenção proporciona uma ferramenta adequada para discriminação entre os subtipos de tumor de: a) tumores do tipo luminal A/luminal B, sendo ER positivo e/ou PR positivo (luminal A e B, ER+/PR+, ER+/PR-, ER- /PR+), porém, HER2-negativo; b) tumores do tipo luminal B-HER2-positivos, ER e/ou PR positivos, mas, também, tumores HER2 positivos (luminal B HER2+); c) tumores do tipo HER2-positivo, sendo ER negativo e PR negativo, porém, HER2-positivo d) tumores de tipo triplo negativo (ER-, PR-, HER2-).

[0092] Portanto, é possível com a presente invenção identificar e discriminar positivamente entre os tipos acima mencionados de tumores de câncer de mama no sangue.

[0093] Assim, a invenção é ainda dirigida à utilização de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um sujeito mamífero, a combinação de metabólitos compreendendo, pelo menos: - uma acilcarnitina compreendendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula; e - um lipídio contendo um máximo de 3 insaturações na molécula; como um conjunto de biomarcadores para subclassificação de subtipos intrínsecos de tumores de câncer de mama.

[0094] O termo "insaturações" significa o número de ligações duplas carbono-carbono contidas na molécula lipídica.

[0095] A invenção proporciona ainda um método para subclassificação entre subtipos intrínsecos de tumor de câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida do sujeito, da quantidade de pelo menos: - uma acilcarnitina compreendendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula; e - um lipídio contendo um máximo de 3 insaturações na molécula

[0096] Outros metabólitos opcionais são selecionados a partir de um ou mais de sulfóxido de metionina, lisina, histidina, lisoPC a C24:0, lisoPC a C20:3, citrulina e arginina.

[0097] A acilcarnitina é preferivelmente selecionada dentre aquelas incluídas na Tabela 2, que contêm mais do que 10 átomos de carbono, de preferência, mais de 12, mais preferencialmente, mais de 13 átomos de carbono na molécula, e ainda mais preferencialmente, é selecionada a partir de um ou mais dentre os compostos de glutaril carnitina (C5-DC) e metilglutaril carnitina (C5-M- DC) e dodecanodioilcarnitina (C12-DC).

[0098] O lipídio é preferivelmente selecionado a partir de esfingolipídios e glicerolipídios, tais como, glicerofosfolipídios, por exemplo, um ou mais dos lipídios incluídos nas Tabelas 4 e 5. De preferência, o lipídio é derivado do ácido araquidônico, mais preferivelmente, os lipídios com 38 ou mais átomos de carbono na molécula.

[0099] Mais preferivelmente, o lipídio é selecionado a partir de acilalquila fosfatidilcolina e acil-acila fosfatidilcolina, mais preferivelmente, é selecionado a partir de acil-acila fosfatidilcolina C38:3, acil-acila fosfatidilcolina C36:0, acil-acila fosfatidilcolina C42:0, acil-acila fosfatidilcolina C38:0, acil-acila fosfatidilcolina C38:1, acil-acila fosfatidilcolina C38:2 e acil-acila fosfatidilcolina C40:1.

[0100] Em outra modalidade preferida, a combinação de metabólitos compreende ainda um ou mais aminoácidos, de preferência, um ou mais aminoácidos selecionados entre aqueles incluídos na Tabela 1, mais preferencialmente, selecionados de um ou mais dos compostos de arginina, metionina, butenil carnitina, quininina e triptofano.

[0101] Além disso, comparações de tumores com resposta alta versus baixa, dentro do mesmo subtipo de tumor, mostram que a presença de um subtipo de tumor está significativamente associada a uma específica assinatura de metabólito no sangue.

[0102] Em particular, verificou-se surpreendentemente quando da aplicação da presente invenção, que é possível discriminar entre certos tipos de tumores de câncer de mama com base em biomarcadores específicos para esse tumor. Assim, na presente modalidade preferida, a avaliação compreende a subclassificação de tumores de câncer de mama em um sujeito mamífero, de preferência, em um ser humano.

[0103] Em uma modalidade particularmente preferida, a presente invenção é dirigida a um método para identificar um tumor do tipo Luminal A em um sujeito mamífero, cujo método compreende medir na amostra de sangue obtida do sujeito a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, um PC aa contendo um máximo de 3 insaturações, e pelo menos um aminoácido.

[0104] Em outra modalidade preferida, a presente invenção é dirigida a um método para identificar um tumor do tipo Luminal B-HER2 negativo em um sujeito mamífero, cujo método compreende medir na amostra de sangue obtida do sujeito a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, pelo menos um PC aa contendo um máximo de 3 insaturações, pelo menos PC ae, pelo menos um aminoácido e pelo menos um liso PC a.

[0105] Em outra modalidade preferida, a presente invenção é dirigida a um método para identificar um tumor do tipo Luminal B-HER2 positivo em um sujeito mamífero, cujo método compreende medir na amostra de sangue obtida do sujeito a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, pelo menos um PC aa, pelo menos um PC ae contendo um máximo de 3 insaturações, e pelo menos um aminoácido.

[0106] Em outra modalidade preferida, a presente invenção é dirigida a um método para identificar um tumor do tipo ER2 positivo em um sujeito mamífero, cujo método compreende medir na amostra de sangue obtida do sujeito a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, pelo menos um PC aa contendo um máximo de 3 insaturações, pelo menos um aminoácido e pelo menos um liso PC a.

[0107] Em outra modalidade preferida, a presente invenção é dirigida a um método para identificar um tumor do tipo triplo negativo em um sujeito mamífero, cujo método compreende medir na amostra de sangue obtida do sujeito a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, pelo menos um PC aa contendo um máximo de 3 insaturações, pelo menos um aminoácido e pelo menos um liso PC a.

[0108] Em outra modalidade preferida, a presente invenção é dirigida a um método para identificar um tumor que sobre-expressa o tipo HER2 (HER2-positivo e Luminal B HER2 positivo) em um sujeito mamífero, cujo método compreende medir na amostra de sangue obtida do sujeito a quantidade de pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, pelo menos um PC ae e pelo menos um PC aa.

[0109] Como certos subtipos de tumores diferem entre si em relação à resposta à quimioterapia, que, por exemplo, pode ser diferenciada entre resposta alta versus resposta baixa, o método da presente invenção de acordo com esta modalidade preferida permite prever se um paciente é suscetível de responder à quimioterapia, tal como, uma quimioterapia neoadjuvante, mesmo antes da terapia. Assim, a terapia do câncer de mama pode ser individualizada com base no tipo de tumor do paciente. Consequentemente, o sucesso da quimioterapia pode ser acentuadamente aumentado. Kit

[0110] Além disso, a invenção é também dirigida a um kit adaptado para realizar os métodos conforme descrito acima, em que o kit compreende um dispositivo, cujo dispositivo contém um ou mais poços e uma ou mais inserções impregnadas com pelo menos um padrão interno. Um dispositivo desse tipo é descrito pormenorizadamente nos documentos de patente WO 2007/003344 e WO 2007/003343, cujas aplicações são aqui incorporadas por referência.

[0111] Os exemplos seguintes descrevem e esclarecem adicionalmente a presente invenção, sem pretender de nenhum modo limitar o escopo da mesma.

EXEMPLOS Informação Geral: Pacientes e Métodos

[0112] Um total de 64 amostras de plasma de mulheres com câncer de mama no estágio III, sem tratamento prévio, foram incluídas em paralelo com três conjuntos de controles. O primeiro, com 93 mulheres saudáveis, foi utilizado durante a fase de descoberta. O segundo foi analisado em um conjunto de validação independente, com 30 amostras de plasma de mulheres com câncer de mama, assim como, 24 controles. Finalmente, o terceiro conjunto, com 616 voluntários, sendo 524 participantes saudáveis juntamente com 92 amostras (sendo 55 de câncer de cólon e 37 de pacientes com HIV), para verificar a especificidade dos resultados.

[0113] As dimensões iniciais do tumor apresentaram uma média de 7,09 cm (3,5 cm a 14 cm) e foram calculadas utilizando medições clínicas e radiológicas antes da cirurgia. O volume final do tumor foi avaliado, diretamente no produto cirúrgico, por um patologista dedicado e o pCR foi definido como nenhuma evidência histopatológica de qualquer resíduo residual invasivo e/ou não invasivo residual em mama ou nódulos (ypTO/ypNO). Os pacientes, com pelo menos 90% de resposta na mama, sem tumor residual na axila, foram denominados "Pacientes de Resposta Alta - High Responders" (Hresp) e comparados com os restantes pacientes denominados "Pacientes de Resposta Baixa - Low Responders" (Lresp). Para identificar os metabólitos associados com pCR, os primeiros 29 pacientes incluídos foram utilizados para a detecção de marcadores de prognóstico durante o treinamento, e os 30 seguintes foram acessíveis como um conjunto de validação independente.

[0114] Para identificar os metabólitos associados à doença estável/doença em progressão (SDPR), todos os pacientes foram incluídos com uma resposta clínica máxima de 30%, sendo 12 de doença estável e 7 de doença em progressão. O conjunto de treinamento foi montado usando os primeiros 21 pacientes admitidos durante a descoberta de marcadores metabólicos de prognóstico, e os 38 pacientes restantes foram disponibilizados como um conjunto de validação independente.

[0115] Para testar se os modelos de previsão estavam correlacionados não somente a altas e baixas taxas de resposta, mas, com diferentes graus de resposta tumoral, os resultados foram validados analisando metabólitos específicos, de acordo com graus progressivos de resposta tumoral (0%, 30%, 30-75%, 75-90%, 90-99% e 100%) ou SDPR (0-30%), Lresp (30-90%), Hresp (>90%), pCR (100%). Paralelamente, tentou-se dispor de uma confirmação adicional sobre a natureza oncogênica dos metabólitos identificados, assim, também foram testados em um gradiente progressivo de volumes de tumores iniciais, a partir de grupos com tamanho de tumor de 4 cm até 12 cm.

[0116] Finalmente, a fim de avaliar se os metabólitos do sangue podem apresentar previsibilidade da resposta quimioterápica, tendo em vista os subtipos individuais de câncer de mama, os pacientes foram divididos, primeiro, em seus subtipos intrínsecos ao câncer, de acordo com Minckwitz et al., (2012), e segundo, de acordo com taxas de resposta tumoral em tumores altamente responsivos (Hresp, mais de 75%) e de baixa resposta (Lresp, menos de 75%).

Medições de Metabólito 1. Análise exploratória MS/MS do tipo Shotgun não Direcionada.

[0117] Esta análise foi realizada em um serviço independente no Laboratório AB-Sciex localizado em São Paulo, SP, Brasil. As amostras de plasma foram injetadas em um sistema Shimadzu Prominence LC acoplado a um aparelho espectrômetro de massa AB-Sciex 5600 Triple TOF, com uma velocidade de varredura de aquisição de 100 espectros/segundo e uma precisão de massa estável de ~ 2 ppm. A Análise de Injeção de Fluxo (FLA) foi realizada utilizando a eluição isocrática com metanol/água (90/10), com 5,0 mM de formiato de amônio. A vazão e os volumes de injeção foram de 0,025 mL/min e 50 uL, respectivamente. Não foi realizada qualquer otimização da fonte de íons, nem do potencial de desagregação (50V e -40V). Foram aplicados os seguintes parâmetros de ionização: CUR = 20 psi, GS1 = 20 psi, GS2 = 15 psi, Temp. = 250°C, IS = 5000V (- 4000V). MS teve variação de m/z de 100 a 1200 com tempo de acumulação de 0,25 s e a varredura de íons do produto de m/z de 100 a 1200 e tempo de acumulação de 0,03 s foram os parâmetros adotados durante o levantamento e varreduras dependentes, respectivamente.

2. Perfilamento quantitativo Metabolômico/Lipidômico Alvo (ESI-MS/MS).

[0118] Este procedimento foi realizado em um conjunto de validação independente com 34 amostras de plasma de mulheres com câncer de mama, assim como, com 616 controles, em duas bases independentes de taxa por serviço, usando plataforma metabolômica quantitativa na Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Áustria, e Quest Diagnostics Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA, EUA. A técnica quantitativa MS/MS direcionada (ESI) é descrita em detalhes no documento de patente US 2007/0004044. Resumidamente, um esquema de perfil direcionado é utilizado para pesquisar quantitativamente os metabólitos de moléculas pequenas conhecidos, utilizando monitoramento de reação múltipla, perda neutra e análises de varredura de íons precursores. A quantificação dos metabólitos da amostra biológica é obtida mediante referência a padrões internos apropriados, e o método foi provado estar em conformidade com o código 21 CFR (Código de Regulamentações Federais) Parte 11, o que implica prova de reprodutibilidade dentro de um determinado intervalo de erro. As concentrações de todos os metabólitos analisados foram relatadas em uM.

Painel Metabólito

[0119] No total, foram detectados 183 metabólitos diferentes, sendo 40 acilcarnitinas, 19 aminoácidos proteinogênicos, ornitina e citrulina, 19 aminas biogênicas, soma de Hexoses, 76 fosfatidilcolinas, 14 lisofosfatidilcolinas e 15 esfingomielinas.

[0120] Os glicerofosfolipídios são ainda diferenciados relativamente à presença de ligações éster (a) e éter (e) na porção glicerol, em que duas letras (aa = diacila, ae = acilalquila, ee = dialquila) indicam que duas posições de glicerol estão ligadas a um resíduo de ácido graxo, enquanto uma única letra (a = acila ou e = alquila) indica a presença de um único resíduo de ácido graxo.

[0121] A composição da cadeia lateral do lipídio é abreviada como Cx:y, em que x indica o número de carbonos na cadeia lateral e y o número de ligações duplas. Por exemplo, "PC ae C38:1" indica um composto de plasmalogênio/plasmenogênio fosfatidilcolina com 38 carbonos nas duas cadeias laterais do ácido graxo e uma única ligação dupla em um deles.

Análise de Dados

[0122] Foram utilizados casos de experiências para identificação de marcadores e para identificar qualquer variável clínica que pudesse estar associada à resposta por análise de regressão logística. A quantificação das concentrações de metabólitos e a avaliação do controle de qualidade foram realizadas com o pacote de software MetlDQ® (BIOCRATES Life Sciences AG, Innsbruck, Áustria). Os padrões internos servem como referência para os cálculos da concentração dos metabólitos. Um arquivo xls foi então exportado, o qual continha nomes de amostras, nomes de metabólitos e concentração de metabólitos com a unidade de μmol/L de plasma.

[0123] Os dados foram então transferidos para o pipeline analítico MetaboAnalyst 2.0 (www.metaboanalyst.ca) e normalizados, usando protocolos de normalização do MetaboAnalyst (Xia et al, 2012) para análise uni- e multivariada, seleção de características dimensionais altas, agrupamento e classificação supervisionada, enriquecimento funcional, assim como, análise da via metabólica.

[0124] Os dados também foram importados para o ROCCET (ROC Curve Explorer & Tester) disponível em http://www.roccet.ca/ROCCET/, para a geração de curvas uni- e multivariadas (Receiver Operating Characteristic (ROC)), obtidas através da SVM (Support Vector Machine) por meio de Análise Discriminante de Mínimos Quadrados Parciais (PLS- DA) e Florestas de Decisão Aleatória (Random Forests).

[0125] As curvas foram geradas pela validação cruzada de Monte-Carlo (MCCV) utilizando-se uma subamostragem balanceada, onde dois terços (2/3) das amostras foram utilizados para avaliar a importância da característica. Características significativas foram então utilizadas para construir modelos de classificação, que foram validados em 1/3 das amostras que foram deixadas de fora. O mesmo procedimento foi repetido várias vezes para calcular o desempenho e o intervalo de confiança de cada modelo. Definição de Termos: (1) Up-Regulation e Down-Regulation (Suprarregulação e Infrarregulação): Uma suprarregulação significa um aumento na concentração de um metabólito, por exemplo, um aumento na velocidade de ocorrência desta reação bioquímica devido, por exemplo, a uma alteração na atividade enzimática. Para uma infrarregulação é o contrário. (2) Teste-t: O teste-t é um teste de hipóteses estatísticas e o teste utilizado é aquele integrado no software MarkerView, sendo aplicado a todas as variáveis na tabela, determinando se a média para cada grupo é significativamente diferente, dado o desvio padrão e o número de amostras, por exemplo, para descobrir se existe uma diferença real entre as médias de dois grupos diferentes. (3) Valor-p: O valor-p é a probabilidade de se obter um resultado pelo menos tão extremo quanto aquele que foi realmente observado, supondo que a hipótese nula (a hipótese de nenhuma mudança ou efeito) seja verdadeira. O valor-p é sempre positivo e quanto menor o valor, menor a probabilidade de que haja uma ocorrência de mudança. Um valor de p de 0,05 ou menos rejeita a hipótese nula ao nível de 5%, o que significa que em apenas 5% do tempo a mudança é uma ocorrência casual. Este é o nível definido em nossas tabelas. (4) Variação de log-fold: A variação de log-fold é definida como a diferença entre as concentrações de transformação logarítmicas médias em cada condição. Esta é uma maneira de descrever quanto mais alto ou mais baixo o valor está em um grupo, em comparação com outro. Por exemplo, uma mudança de variação log-fold de 0,3 é "equivalente" a um aumento de variação de exp(0,3) = 1,34 vezes, em comparação com o controle (grupo mais saudável). Além disso, uma variação log-fold de -0,3 é "equivalente" a um aumento de variação de exp(-0,3) = 0,74 = (1/1,34) vezes, em comparação com a variação de controle ou diminuição de variação de 1,34 vezes para a doença.

Resultados 1. Pesquisa e/ou Diagnóstico do Câncer de Mama. Análise Exploratória ROC Uni- e Multivariada

[0126] Em primeiro lugar, foram realizadas Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise da Curva ROC da descoberta (30 pacientes e 93 controles) e conjuntos de validação 1 (34 pacientes e 24 controles) e 2 (34 pacientes e 616 controles), que revelaram uma eminente confiabilidade da pesquisa e diagnóstico, conforme mostrado na Tabela 6 seguinte. Tabela 6: Análise de correlação entre os metabólitos identificados com câncer de mama (64 pacientes com câncer de mama versus 616 controles)

[0127] A análise PCA e PLS-DA das 64 mulheres incluídas inicialmente foi comparada a 616 controles. A existência de metabólitos sanguíneos altamente discriminativos entre pacientes com câncer em comparação com os controles (p = 0,0245 após 2000 testes de permutações) confirmou a análise de PCA durante os dois conjuntos. As Estatísticas de Teste de Permutação estão representando o Valor p < 5e-04 após 2000 rodadas de permutações (8A). Este resultado confirma, como altamente significativo a análise PLS-DA (8B).

[0128] A assinatura de metabólitos identificados utilizada para análise uni- ou multivariada, é descrita nas Tabelas 1 e 2, juntamente com o teste t e estudos de correlação representando valores de p altamente significativos, e Taxas de Descoberta Falsa (FDR) para todos os metabólitos (Tabelas 7 e 8) . Tabela 7 *Soma PUFA PC ae araquidônico/Soma MUFA PC ae araquidônico Tabela 8 *Soma PUFA PC ae araquidônico/Soma MUFA PC ae araquidônico

[0129] A avaliação da curva multivariada ROC obtida durante os conjuntos de experimento e validação para acessar o desempenho dos resultados para fins de pesquisa é mostrada na Tabela 6. Os metabólitos identificados segregam com precisão os pacientes com câncer dos controles, com sensibilidade = 100%, especificidade = 98,31%, valor de prognóstico positivo (PPV) = 79,09% e valor de prognóstico negativo (NPV) = 100%.

[0130] De aspecto importante, mesmo após 1000 rodadas de permutação, as assinaturas permaneceram altamente significativas, o que confirma a análise da curva ROC.

[0131] A análise de correlação não mostrou nenhum resultado significativo entre a taxa de resposta tumoral com as variáveis clínicas e patológicas, conforme demonstrado na Tabela 9 seguinte. Tabela 9

[0132] Além disso, as análises de curva ROC obtidas durante o conjunto de experimentos revelaram um conjunto mínimo de metabólitos para segregar com precisão os pacientes de câncer dos controles, compreendendo pelo menos (a) um aminoácido selecionado de glutamina, glutamato e serina e um lipídio ou (b) glutamina e glutamato. Os resultados obtidos a partir das análises da curva ROC estão ilustrados nas Figuras 1 a 7. Figura 1A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação utilizando dois metabólitos, Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). CutOff = -9,937, Sensibilidade = 1,0 (1-1), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,0, Teste-T = 8,0019E-22, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 1B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação utilizando dois metabólitos, Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). CutOff = -9,937, Sensibilidade = 1,0 (1-1), Especificidade = 0,974 (0,935-1), Razão de Probabilidade Positiva = 38,5, Razão de Probabilidade Negativa = 0,0, Teste-T = 1,2632E-58, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 2A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1) com câncer de mama (n = 11), comparado com Controles (n = 11). CutOff = -6,645, Sensibilidade = 1,0 (1-1), Especificidade = 0,9844 (0,953-1), Razão de Probabilidade Positiva = 64,0, Razão de Probabilidade Negativa = 0,0, Teste-T = 9,9636E-31, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 2B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação utilizando dois metabólitos, Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 77). CutOff = -6,645, Sensibilidade = 0,9844 (0,953-1), Especificidade = 0,9481 (0,896-0,967), Razão de Probabilidade Positiva = 18,95, Razão de Probabilidade Negativa = 0,01648, Teste-T = 3,6347E-42, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 3A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Glutamina (Gln) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). CutOff = 6,231, Sensibilidade = 1,0 (1-1), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,0, Teste-T = 1,9204E-13, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 3B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação utilizando dois metabólitos, Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C38:1 (PC ae C38:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 77). CutOff = 5,575, Sensibilidade = 0,9219 (0,851-0,969), Especificidade = 0,93 (0,885-0,98), Razão de Probabilidade Positiva = 13,17, Razão de Probabilidade Negativa = 0,08401, Teste-T = 1,6951E-43, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 4A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). CutOff = 7,468, Sensibilidade = 0,9655 (0,914-1), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,03448, Teste-T = 3,7077E-10, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 4B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Serina (Ser) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 77). CutOff = 7,162, Sensibilidade = 0,8906 (0,812-0,969), Especificidade = 0,98 (0,95-1), Razão de Probabilidade Positiva = 44,53, Razão de Probabilidade Negativa = 0,1116, Teste-T = 1,6951E-43, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 5A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Glutamato (Glu) e Acil-acil Fosfatidilcolina C28:1 (PC aa C28:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). CutOff = -6,119, Sensibilidade = 0,9483 (0,888-1), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,05172, Teste-T = 4,1972E-20, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 5B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação utilizando dois metabólitos, Glutamato (Glu) e Acil-acil Fosfatidilcolina C28:1 (PC aa C28:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 77). CutOff = -6,335, Sensibilidade = 0,9219 (0,859-0,977), Especificidade = 0,83 (0,75-0,9), Razão de Probabilidade Positiva = 5,423, Razão de Probabilidade Negativa = 0,09413, Teste-T = 2,1657E-26, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 6A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Glutamato (Glu) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). Sensibilidade = 100%, Especificidade = 100%, Valor de Prognóstico Positivo = 100%, Valor de Prognóstico Negativo = 100%, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 6B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação utilizando dois metabólitos, Glutamato (Glu) e Acilalquila Fosfatidilcolina C42:1 (PC ae C42:1) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 77). Sensibilidade = 100%, Especificidade = 99%, Valor de Prognóstico Positivo = 98,46%, Valor de Prognóstico Negativo = 100%, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 7A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Glutamato (Glu) e Glutamina (Gln) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 11). CutOff = -1,101, Sensibilidade = 1,0 (1-1), Especificidade = 1,1 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,0, Teste-T = 9,9058E-17, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 7B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos utilizando dois metabólitos, Glutamato (Glu) e Glutamina (Gln) com câncer de mama (n = 64), comparado com Controles (n = 77). CutOff = -1,101, Sensibilidade = 0,9219 (0,851-0,969), Especificidade = 0,93 (0.86- 0.97), Razão de Probabilidade Positiva = 13,17, Razão de Probabilidade Negativa = 0.08401, Teste-T = 4,6268E-40, Valor de P <0,001 (1000 permutações).

[0133] Conforme pode ser visto dos dados acima, a presente invenção permite a pesquisa e diagnóstico de pacientes com câncer de mama, com uma precisão e confiabilidade aperfeiçoadas, em comparação com métodos conhecidos. Isso pode, em particular, ser ilustrado pela seguinte comparação (Tabela 10). Tabela 10: Comparação da presente invenção com estudos citados pelo estado da técnica. *Qui Y. et al., Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 8047-8061 2. Previsão de Alta Resposta (Hresp) ou Baixa Resposta (Lresp) à Quimioterapia.

[0134] Um total de 10 pacientes obtiveram pelo menos 90% de resposta (6 no estágio de experimentos e 4 no conjunto de validação), entre eles, 7 pacientes atingiram resposta patológica completa (pCR) definida como ypTO/ypNO. A porcentagem total de pCR e SDPR foi observada em 11,8% (7/59) e 32% (19/59) dos pacientes, respectivamente.

[0135] As análises das curvas ROC obtidas durante o conjunto de experimentos revelaram um conjunto mínimo de metabólitos para prever com exatidão a resposta à quimioterapia, compreendendo, pelo menos, um aminoácido selecionado de serina e glutamina, arginina metilada, uma acilcarnitina e um lipídio. Os resultados obtidos a partir das análises das curvas ROC estão ilustrados nas Figuras 9 a 12. Figura 9A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Glutamina (Gln) e Dodecanodioilecarnitina (C12-DC), comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de 35-78% de resposta (n=21). CutOff = -11,56, Sensibilidade = 1,0 (1- 1), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,0, Teste T = 8,553E-6, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 9B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Glutamina (Gln) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de Doença Estável/Doença em Progressão (SDPR, n=22). CutOff = -11,56, Sensibilidade = 0,9091 (0.773- 1), Especificidade = 1,0 (1 1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,09091, Teste T = 2,5381E-4, Valor de P <0,001 (1000 permutações). Figura 10A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C30:0, Glutamina (Gln) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de 35-78% de resposta (n=21). CutOff = -10,12, Sensibilidade = 0,7143 (0,571-0,905), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,2857, Teste T = 8.553E-6, Valor de P < 0,001 (1000 permutações). Figura 10B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C30:0, Glutamina (Gln) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de Doença Estável/Doença em Progressão (SDPR, n=22). CutOff = -10,12, Sensibilidade = 0,773 (0,591-0,955), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,2273, Teste T = 4,8125E-4, Valor de P < 0,001 (1000 permutações). Figura 11A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Serina (Ser) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de Baixa Resposta (n=52). CutOff = 8,416, Sensibilidade = 0,4902 (0,342-0,638), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,5098, Teste T = 0,018905, Valor de P < 0,001 (100 permutações). Figura 11B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C42:0, Serina (Ser) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de Doença Estável/Doença em Progressão (SDPR, n=22). CutOff = -8,412, Sensibilidade = 0,875 (0,625-1), Especificidade = 1,0 (11), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,125, Teste T = 0,013813, Valor de P < 0,001 (100 permutações). Figura 12A: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Experimentos, utilizando DMA Total, PC ae C32:2, Serina (Ser) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de 80-92% de Resposta (n=8). CutOff = 11,38, Sensibilidade = 0,625 (0,375-0,875), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,375, Teste T = 0,017765, Valor de P < 0,001 (100 permutações). Figura 12B: Análise da curva ROC obtida durante o Conjunto de Validação, utilizando DMA Total, PC ae C32:2, Serina (Ser) e C12-DC, comparando os pacientes com Resposta Patológica Completa (pCR, n=7) com pacientes de Doença Estável/Doença em Progressão (SDPR, n=22). CutOff = 11,37, Sensibilidade = 0,5909 (0,479-0,797), Especificidade = 1,0 (1-1), Razão de Probabilidade Positiva = Infinito, Razão de Probabilidade Negativa = 0,4091, Teste T = 0,026961, Valor de P < 0,001 (100 permutações).

[0136] Os dados acima mostram a destacada precisão e a confiabilidade da previsão, determinada pelos parâmetros de especificidade, sensibilidade, PPV e NPV, usando as combinações de biomarcadores acima especificadas. 3. Metabólitos de acordo com Subtipos Intrínsecos de Câncer de Mama.

[0137] As análises das curvas ROC obtidas durante o conjunto de experimentos revelaram um conjunto mínimo de metabólitos para subclassificação de subtipos de câncer de mama, compreendendo pelo menos uma acilcarnitina contendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula, e pelo menos um lipídio contendo um máximo de 3 insaturações na molécula. Os resultados obtidos a partir das análises das curvas ROC estão ilustrados nas Figuras 13 a 15. Figura 13: Identificação de subtipos específicos de câncer de mama utilizando os metabólitos descritos na Tabela 11. Análise da curva ROC mostrando a identificação de pacientes com Tumores Luminais A/B (n=30) e pacientes com Triplos Negativos e Positivos para HER2 (Outros Tumores N=29). AUC = 0,821 (CI 95%: 0,686-0,945), Sensibilidade = 81,08%, Especificidade = 82,86%, Valor de Prognóstico Positivo = 83,33%, Valor de Prognóstico Negativo = 80,56%, valor P = 0,008 (1000 permutações). Tabela 11: Lista de metabólitos utilizados na Análise Multivariada para identificar tumores do tipo Luminal A/B. Figura 14: Identificação de subtipos específicos de câncer de mama utilizando os metabólitos descritos na Tabela 12. Análise da curva ROC mostrando a identificação de pacientes com Tumores HER2 (LumB-HER2 + HER2) (n=19) e pacientes com Triplos Negativos e Luminais A/B (n=30) (Outros Tumores N=40). AUC = 0,803 (CI 95%: 0,639-0,926), Sensibilidade = 86,36%, Especificidade = 76,92%, Valor de Prognóstico Positivo = 61,29%, Valor de Prognóstico Negativo = 93,02%, Valor P = 0,002 (1000 permutações). Tabela 12: Lista de metabólitos utilizados na Análise Multivariada para identificar tumores HER2-positivos. Figura 15: Identificação de subtipos específicos de câncer de mama utilizando os metabólitos descritos na Tabela 13. Análise da curva ROC mostrando a identificação de pacientes com Tumores Triplos Negativos (n=10) e HER2 Positivos/Luminais A/B (n=30) (Outros Tumores N=49). AUC = 0,875 (CI 95%: 0,762-0,98), Sensibilidade = 83,33%, Especificidade = 85,96%, Valor de Prognóstico Positivo = 55,56 %%, Valor de Prognóstico Negativo = 96,08%, Valor p <0,001 (1000 permutações). Tabela 13: Lista de metabólitos utilizados na Análise Multivariada para Identificar Tumores Triplos Negativos. * NOS Act = (Nitric Oxide Synthase Activity) - proporção de Citrulina/Arginina

[0138] Os dados acima mostram que é possível discriminar entre certos tipos de tumores de câncer de mama com base em biomarcadores específicos para esses tumores, com alta precisão e confiabilidade, conforme determinado pelos parâmetros de especificidade, sensibilidade, PPV e NPV.

Aplicabilidade Industrial

[0139] A presente invenção torna possível a pesquisa em sujeitos, em particular, pacientes humanos, potencialmente sofrendo de câncer de mama, assim como, diagnosticar o câncer de mama em sujeitos de uma forma aperfeiçoada, proporcionando, assim, procedimentos de pesquisa e diagnóstico mais precisos, confiáveis e eficazes.

[0140] Além disso, a presente invenção permite ainda prever se um paciente que sofre de câncer de mama é suscetível de responder à quimioterapia, tal como, uma quimioterapia neoadjuvante, já numa fase inicial da doença. De fato, os biomarcadores de acordo com a invenção são facilmente detectáveis no sangue, e o seu nível está consistentemente correlacionado ao estágio do câncer de mama. Desse modo, os métodos da invenção podem ser facilmente executados, com alto rendimento e em um curto período de tempo e, assim, permitir uma melhor aceitação do paciente.

[0141] Além disso, é possível com os biomarcadores e conjuntos de biomarcadores da presente invenção discriminar subtipos de tumores, permitindo, assim, um tratamento individual baseado no subtipo do tumor, aumentando adicionalmente a aceitação do paciente e aperfeiçoando o sucesso da terapia.

[0142] Além disso, a invenção permite a determinação da atividade tumoral por meio de biomarcadores metabólicos, o que é vantajoso e superior, se comparado com a caracterização tumoral conforme realizada no segmento da técnica. A avaliação da reflexão bioquímica da atividade tumoral de câncer de mama proporciona uma ferramenta adequada para adaptar e ajustar a terapia do paciente, aumentando, assim, consideravelmente a aceitação do paciente e a qualidade de vida.

[0143] Com base nisso, é possível preparar um kit que seja adequado para ajudar na pesquisa e diagnóstico do câncer de mama, classificando o tumor do paciente e determinando a sua atividade bioquímica, monitorando a progressão da doença e a resposta terapêutica do paciente à quimioterapia neoadjuvante.

Modalidades da Invenção

[0144] Assim, a presente invenção refere-se às seguintes modalidades preferidas: 1. Uso de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um sujeito mamífero, em que a combinação de metabólitos compreende pelo menos: (a) um aminoácido selecionado a partir de glutamina, glutamato e serina, e um lipídio, ou (b) glutamina e glutamato, como um conjunto de biomarcadores para pesquisa e/ou diagnóstico de câncer de mama. 2. Uso, de acordo com a modalidade 1, em que o lipídio é selecionado de acilalquila fosfatidilcolina araquidônico poli-insaturado, acilalquila fosfatidilcolina araquidônico monoinsaturado e acilalquila fosfatidilcolina araquidônico saturado. 3. Uso, de acordo com as modalidades 1 ou 2, em que a combinação de metabólitos compreende ainda uma ou mais dentre esfingomielina e glutaconil carnitina. 4. Uso de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um sujeito mamífero, em que a combinação de metabólitos compreende pelo menos: - um aminoácido selecionado a partir de serina e glutamina; - arginina metilada; - uma acilcarnitina; e - um lipídio, como um conjunto de biomarcadores para o prognóstico da resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante do câncer de mama. 5. Uso, de acordo com a modalidade 4, em que a acilcarnitina é selecionada de uma ou mais de glutaril- carnitina e metilglutaril-carnitina. 6. Uso, de acordo com as modalidades 4 ou 5, em que o lipídio é selecionado a partir de acilalquila fosfatidilcolina C44:6; acilalquila fosfatidilcolina C44:5; acilalquila fosfatidilcolina C38:4; acilalquila fosfatidilcolina C30:0; acilalquila fosfatidilcolina C32:2; acilalquila fosfatidilcolina C42:0; lisofosfatidilcolina a C17:0; lisofosfatidilcolina a C26:0; lisofosfatidilcolina a C30:0; e lisofosfatidilcolina a C24:0. 7. Uso, de acordo com as modalidades 4 a 6, em que a combinação de metabólitos compreende ainda um ou mais dentre os compostos de putrescina, espermina e arginina dimetilada. 8. Uso de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um sujeito mamífero, em que a combinação de metabólitos compreende pelo menos: - um aminoácido selecionado a partir de glutamato, glutamina, alanina, glicina, serina e aspartato; e - um lipídio, como um conjunto de biomarcadores para avaliar as reflexões bioquímicas da atividade tumoral de câncer de mama. 9. Uso, de acordo com a modalidade 8, em que o lipídio é selecionado de acilalquila fosfatidilcolina e acil-acila fosfatidilcolina. 10. Uso, de acordo com as modalidades 8 ou 9, em que a combinação de metabólitos compreende ainda um ou mais dentre os aminoácidos de leucina e ornitina. 11. Uso de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um sujeito mamífero, em que a combinação de metabólitos compreende pelo menos: - uma acilcarnitina compreendendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula; - um lipídio contendo um máximo de 3 insaturações na molécula; como um conjunto de biomarcadores para subclassificação de subtipos de tumores de câncer de mama. 12. Uso, de acordo com a modalidade 11, em que os lipídios são selecionados de acil-acila fosfatidilcolina C38:3; acil-acila fosfatidilcolina C36:0; acil-acila fosfatidilcolina C42:0; acil-acila fosfatidilcolina C38:0; acil-acila fosfatidilcolina C38:1; acil-acila fosfatidilcolina C38:2; e acilalquila fosfatidilcolina C40:1. 13. Uso, de acordo com as modalidades 11 ou 12, em que a combinação de metabólitos compreende ainda um ou mais dentre sulfóxido de metionina; lisina; histidina; lisoPC a C24:0; lisoPC a C20:3; citrulina e arginina. 14. Método para pesquisa e/ou diagnóstico de câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição numa amostra de sangue obtida a partir do sujeito da quantidade de pelo menos: (a) um aminoácido selecionado a partir de glutamina, glutamato e serina, e um lipídio; ou (b) glutamina e glutamato. 15. Método para prognosticar uma resposta terapêutica à quimioterapia neoadjuvante ao câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida do sujeito da quantidade de pelo menos: - um aminoácido selecionado a partir de serina e glutamina, - arginina metilada - uma acilcarnitina, e - um lipídio. 16. Método para avaliar as reflexões bioquímicas da atividade tumoral de câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida do sujeito da quantidade de pelo menos: - um aminoácido selecionado de glutamato, glutamina, alanina, glicina, serina e aspartato, e - um lipídio. 17. Método para subclassificação de subtipos de tumor de câncer de mama em um sujeito mamífero, o método compreendendo a medição em uma amostra de sangue obtida do sujeito da quantidade de pelo menos: - uma acilcarnitina compreendendo pelo menos 10 átomos de carbono na molécula; e - um lipídio contendo um máximo de 3 insaturações na molécula. 18. Método de acordo com qualquer uma das modalidades 14 a 17, em que a medição é baseada em um método analítico quantitativo, de preferência, cromatografia, espectroscopia e analisadores de massa/espectrometria. 19. Método, de acordo com a modalidade 18, em que a cromatografia compreende os tipos de GC, CE, LC, HPLC, e UHPLC; a espectroscopia compreende UV/Vis, IR, NIR e NMR; e os analisadores de massa/espectrometria compreendem ESI, Analisadores de Massa tipo Quadrupolo, Analisadores de Massa de Armadilha de Íons, Analisador de Massa TOF (Time of Flight) , Analisador de Massa Orbitrap, Analisador de Massa de Setor Magnético, Analisador de Massa de Setor Eletrostático, Ressonância Ciclotrônica de Íon (ICR) e combinações dos mesmos, incluindo analisador tipo quadrupolo simples (Q) e quadrupolo triplo (QqQ), QqTOF, TOF-TOF, Q-Orbitrap, APCI-QqQ, APCI-QqTOF, MALDI-QqQ, MALDI-QqTOF e MALDI-TOF-TOF.

Claims (5)

1. Uso de uma combinação de metabólitos contidos em uma amostra de sangue de um indivíduo mamífero caracterizado pelo fato de que a combinação de metabólitos compreende pelo menos: (a) um aminoácido selecionado a partir de glutamina, glutamato e serina, e um esfingolipídio ou glicerolipídio, ou (b) glutamina e glutamato, como um conjunto de biomarcadores para pesquisa e/ou diagnóstico de câncer de mama.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lipídio é selecionado de acilalquila fosfatidilcolina araquidônico poli-insaturado, acilalquila fosfatidilcolina araquidônico monoinsaturado e acilalquila fosfatidilcolina araquidônico saturado.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a combinação de metabólitos compreende ainda uma ou mais dentre esfingomielina e glutaconil carnitina.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os metabolitos são medidos com base em um método analítico quantitativo, de preferência cromatografia, espectroscopia e analisadores de massa/espectrometria.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a cromatografia compreende GC, CE, LC, HPLC e UHPLC; a espectroscopia compreende UV/Vis, IR, NIR e NMR; e os analisadores de massa/espectrometria compreendem ESI, Analisadores de Massa tipo Quadrupolo, Analisadores de Massa de Armadilha de Íons, Analisador de Massa TOF (Time of Flight), Analisador de Massa Orbitrap, Analisador de Massa de Setor Magnético, Analisador de Massa de Setor Eletrostático, Ressonância Ciclotrônica de Íon (ICR) e combinações destes, incluindo analisador tipo quadrupolo simples (Q) e quadrupolo triplo (QqQ), QqTOF, TOF-TOF, Q-Orbitrap, APCI-QqQ, APCI-QqTOF, MALDI-QqQ, MALDI- QqTOF e MALDI-TOF-TOF.