CZ307724B6 - Způsob detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu - Google Patents
Způsob detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307724B6 CZ307724B6 CZ2017-501A CZ2017501A CZ307724B6 CZ 307724 B6 CZ307724 B6 CZ 307724B6 CZ 2017501 A CZ2017501 A CZ 2017501A CZ 307724 B6 CZ307724 B6 CZ 307724B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- marker
- breast cancer
- markers
- values
- patient
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje metodu detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu, zejména primárního karcinomu prsu. V této metodě se stanoví logaritmus hodnoty popisující podíl alespoň jednoho markeru ve vzorku apokrinního potu odebraného z těla pacienta, přičemž marker je vybraný ze skupiny markerů nalezených v rámci překládaného řešení, a vyhodnocením logaritmu hodnoty popisující podíl uvedeného alespoň jednoho markeru ve vzorku apokrinního potu vůči logaritmům hodnot tohoto markeru zjištěných pro osoby trpící karcinomem prsu a pro osoby netrpící karcinomem prsu se provede závěr spočívající v přiřazení pacienta do skupiny osob trpících karcinomem prsu nebo do skupiny osob netrpících karcinomem prsu. Při vyhodnocování se využívají matematickostatistické metody.
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu detekce markérů ze vzorku apokrinního potu odebraného z těla pacienta/pacientky pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu.
Dosavadní stav techniky
Karcinom prsu zůstává vedoucí příčinou smrti žen po celém světě. Je to druhá hlavní příčina smrti na rakovinu u žen v Evropě i v dalších státech s narůstající incidencí, která v současné době odpovídá 105 případů ročně na 100 tisíc obyvatel. Narůstající počet případů je pozorován ve věku nad 45 s nejvíce ohroženou skupinou žen mezi 45. a 73. rokem. Nejvyšší incidence karcinomu prsu je zaznamenávána ve vyspělých zemích, s čímž souvisí větší zájem populace o vlastní zdraví a také zlepšení diagnostiky. Pokud jde o Českou republiku, je maximum výskytu tohoto onemocnění ve věku 57 let. V posledních letech vzrostl počet nově hlášených onemocnění v nižších věkových skupinách. Ve věkové skupině 35 až 39 let téměř o 17 %. V roce 1999 bylo v České republice hlášeno 5013 onemocnění, a z toho 95 nových onemocnění na 100 tisíc žen. V roce 2005 byla nově diagnostikována rakovina prsu u 5533 českých žen, což je 16 % všech nádorových diagnóz u žen vtémže roce. Toto číslo odpovídá 105,4 případů ročně na 100 tisíc žen, avšak je nutné zdůraznit, že v exponovaném věkovém rozmezí 45 až 73 let věku je toto číslo podstatně vyšší. V roce 2014 již dosáhl počet nově diagnostikovaných nádorů prsu u žen počtu 7008, což představuje více než 130 nádorů na 100 000 žen. Ve stejném roce zemřelo na karcinom prsu 1940 žen, což představuje více než 36 úmrtí na 100 000 žen.
Karcinom mléčné žlázy se vyskytuje výjimečně i u mužů (jen 0,8 % případů na 100 tisíc mužů), ale letalita je mimořádně vysoká a odpovídá 62,5 % nemocných mužů, což je dvojnásobek rizika úmrtí v případě srovnání s onemocněním žen (36 %).
Nejvíce se vyskytujícími nádory prsu jsou invazivní duktální karcinomy, včetně komedonového typu, nejčastěji se vyskytujícím histologickým typem je infiltrující duktální karcinom (70 až 80 %), lobulámí invazivní karcinomy tvoří zhruba 10 % všech invazivních typů karcinomu a jsou charakterizovány multicentricitou a často postižením obou prsů.
Dosavadními hlavními metodami při vyhledávání rakoviny prsu je vedle samo vyšetření a vyšetření lékařem mamografie, vyšetření ultrazvukem, vyšetření přítomnosti změn v genech zvyšujících riziko nádoru prsu - zejména progeny BRCA1 a BRCA2. Pokud jde o mamografické vyšetření vedle snímkování s cílem screeningu s minimální dávkou záření je využita diagnostická mamografie při podezření na karcinom prsu s použitím vyšší intenzity rentgenového záření. Při využití mamografického vyšetření je zejména v poslední době vzato v úvahu riziko onkogenního působení ionizujícího záření, a proto se počet vyšetření racionálně omezuje.
Součástí biochemického vyšetření je stanovení základních, většinou nespecifických, markérů pro karcinom prsu pomocí diagnostiky in vitro se zaměřením na onkomarkery typu karcinoembryonálního antigenu (CEA) a antigenů CA 15-3, CA 27-29 a specifický polypeptidový antigen. Tyto markéry však trpí sníženou senzitivitou i specificitou a často nesplňují požadavek časné diagnózy, která má zásadní důležitost pro další prognózu. Vyšší stádia rozvoje rakoviny prsu mají zhoršenou reakci na léčbu, zvyšují riziko relapsu onemocnění a celkově zhoršují prognózu a letalitu onemocnění.
Novým přístupem je použití metabolického profilu (hodnocení metabolomu), který zlepšuje detekci onemocnění formou diagnostického panelu malých molekul pomocí necílené, případně
- 1 CZ 307724 B6 cílené metabolomiky - analýza malých molekul v plazmě a v moči. Novou alternativou nabízející široké uplatnění studia metabolomu (Calderón-Santiago, M., Priego-Capote, F., Turek, N., et al. Human sweat metabolomics for lung cancer screening. Anal Bioanal Chem, 2015, 407, 53815392) v alternativní biologické matrici je pot. Výhodou je získání tohoto biologického materiálu neinvazivní cestou a dále biologická matrice je méně komplikovaná ve srovnání se sérem/plazmou nebo močí (Alvarez-Sánchez, B., Priego-Capote, F., de Castro, L. Metabolomics analysis I. Selection of biological samples and practical aspects preceding sample preparation. Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29(2), 111-119; Álvarez-Sánchez, B., Priego-Capote, F., de Castro, L. Metabolomics analysis II. Preparation of biological samples prior to detection. Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29(2), 120-127; Mena-Bravo, A., de Castro, L. Sweat: A sample with limited present applications and promising future in metabolomics. Journal of Pharmacetuical and Biomedical Analysis, 2014, 90, 139-147).
Pot se tvoří vpotních žlázách apokrinního a exokrinního charakteru, které jsou lokalizovány v epidermis. Jednou z primárních funkcí potu je udržení termoregulace a řízení tělesné teploty pomocí odpařování. Mimoto je pot důležitou složkou mechanizmů ochrany kůže, vylučování metabolitů na široké ploše tělesného povrchu umožňuje exkreci chemosignálních molekul jako je např. androstadienon a skupiny látek charakteru feromonů. Touto cestou je vylučována i část rozpadových produktů z metabolických procesů, jako je kyselina močová. Velký povrch kůže obsazený exokrinními a apokrinními potními žlázami umožňuje vylučovat široké spektrum malých hydrofilních i větších lipofilních metabolitů. Z menších molekul se do této skupiny látek zařazují aminokyseliny, nízkomolekulámí aminy, karboxylové kyseliny, ale i proteiny, antimikrobiální peptidy, xenobiotika a drogy. Do potu je signifikantně vylučován i etanol a výbušniny typu nitrátů, pokud s nimi jedinec před vyšetřením potu přišel do kontaktu. Přestože biologická matrice látek obsažených v potu je z hlediska analytického zvládnutí lépe využitelná pro diagnostiku než plazma a moč, které jsou z hlediska složitosti biologické matrice velmi komplikované, je diagnostické použití potu nízké. Tradičně omezené využití vzorků potu pro klinickou diagnostiku je vysvětlováno nedostatkem studií týkajících se složení potu, obtížností zachování reproducibility stanovení látek v potu vzhledem k velké variabilitě množství odebraného vzorku, malé propracovanosti způsobů odběru vzorku potu a konečně velké variabilitě koncentrace látek v potu při vyšetření v průběhu dne i ve vztahu k longitudinálnímu vyšetření v průběhu dní.
Analýza metabolomu má však, pokud jde o pot jako biologický materiál využívaný pro diagnostické účely, některé nevýhody. Je nutné vzít v úvahu obsah hydrofilních a lipofilních látek, takže vzorek musí být z tohoto hlediska zpracován. Další významnou nevýhodou potu je obtížnost kvantitativního odběru vzorku a konečně velká variabilita obsahu metabolitů v potu vzhledem k velkým rozdílům koncentrace metabolitů ve zředěném a v koncentrovaném potu a variabilitě množství materiálu odebraného u vyšetření.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje způsob detekce markérů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu, zejména primárního karcinomu prsu, při němž se stanoví logaritmus hodnoty popisující podíl alespoň jednoho markéru ve vzorku apokrinního potu odebraného z těla pacienta, přičemž tento markér je vybrán ze skupiny zahrnující následující chemická individua nebo jejich směsi:
-2CZ 307724 B6
| Označení markéru | Chemická identita |
| Ml | karnitin |
| M2 | isovalerylkarnitin / methylbutyrylkarnitin |
| M3 | decenoylkarnitin |
| M4 | dodecenoylkarnitin |
| M5 | hydroxypalmitoylkarnitin |
| M6 | glutamin |
| M7 | prolin |
| M8 | betain |
| M9 | 5-oxoprolin |
| M10 | kreatin / 5-aminolevulinová kyselina |
| Mil | kreatinin |
| M12 | 2-methylbutyrylglycin / isovalerylglycin |
| M13 | fenylserin |
| M14 | kyselina mléčná |
| M15 | glutakonová kyselina / ketoleucin / mevalonolakton / 3-methyl-2-oxopentanová kyselina |
| M16 | galaktitol/mannitol |
| M17 | adenosin |
| M18 | deoxyguanosin |
| M19 | 4-hydroxybenzaldehyd |
| M20 | hydroxyoktanoylkarnitin / pimeloylkarnitin |
V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že hodnoty popisující podíly uvedených markérů ve vzorku potu nebo závislosti mezi hodnotami dvojic těchto markérů se odlišují u skupin osob trpících karcinomem prsu a osob netrpících karcinomem prsu.
Zároveň bylo zjištěno, že je nutné používat v předkládaném postupu logaritmy hodnot popisujících podíly uvedených markérů ve vzorku potu. Nutnost logaritmické transformace změřených podílů složek je vázána na poznatek, že změřené hodnoty mají přibližně logaritmickonormální rozdělení, které je přepočtem na jejich logaritmy převedeno na žádoucí rozdělení blízké rozdělení normálnímu.
Vyhodnocením logaritmu hodnoty popisující podíl uvedeného alespoň jednoho markéru ve vzorku apokrinního potu vůči logaritmům hodnot tohoto markéru zjištěných pro osoby trpící karcinomem prsu a pro osoby netrpící karcinomem prsu se provede závěr spočívající v přiřazení pacienta do skupiny osob trpících karcinomem prsu nebo do skupiny osob netrpících karcinomem prsu. Vyhodnocení obvykle zahrnuje použití matematickostatistických metod.
V tomto textu se termínem „pot“ rozumí apokrinní pot, není-li uvedeno jinak.
-3 CZ 307724 B6
Standardizace hodnot markérů:
Všechny změřené hodnoty markérů (termínem „hodnoty markérů“ se rozumí hodnoty popisující podíly markérů ve vzorku potu) je nutné nejprve standardizovat tak, aby nebyly závislé na kvantitě odebraného potu. Standardizace hodnot se provede tak, že se po stanovení hodnoty popisující podíl x markéru ve vzorku apokrinního potu odebraného z těla pacienta, přičemž markér je vybraný ze skupiny markérů uvedených výše, logaritmus této hodnoty x dělí průměrem logaritmů hodnot popisujících podíly tří standardizačních markérů ve vzorku tohoto apokrinního potu:
| Označení standardizačního markéru | Chemická identita |
| SMI | palmitoleylkarnitin |
| SM2 | hydroxyoktanoylkarnitin / pimeloylkarnitin |
| SM3 | histidin |
Výsledkem standardizace je standardizovaná hodnota X uvedeného markéru; v popsaném výhodném provedení se standardizovaná hodnota X vypočte:
_____________10gaU)_____________ (logflU SMI ) + loga(* SM2 ) + loga(* SM3 ))/3
Na konkrétní volbě základu logaritmu a hodnota X nezávisí.
Klasifikace (vyhodnocení a přiřazení) vzorků pomocí standardizovaných hodnot markérů:
V jednom výhodném provedení vynálezu se pro standardizované hodnoty X alespoň jednoho markéru M výpočtem stanoví hodnoty parametrů (průměru X a směrodatné odchylky sx) hustoty pravděpodobnosti normálního rozdělení, odpovídající standardizovaným hodnotám markéru M ve vzorcích potu souboru osob trpících karcinomem prsu (hustota pravděpodobnosti fc s parametry xc,sc) a ve vzorcích potu souboru „kontrol“, tj. osob bez karcinomu prsu (hustota pravděpodobnostifKs parametry xK, sK).
Následně se stanoví váha markéru M hodnocené osoby jako logaritmus poměru pravděpodobnosti příslušnosti osoby ke skupině osob trpících karcinomem prsu k pravděpodobnosti příslušnosti osoby ke skupině osob netrpících karcinomem prsu.
Tyto výpočty lze vyjádřit vztahy:
/c(X) = /(X|xcAc) fK(X) = f(X\xK,sK) (2)
W = log [fK(xy (3) kde/c je hustota pravděpodobnosti normálního rozdělení standardizovaných hodnot markéru M u osob trpících karcinomem prsu, ft je hustota pravděpodobnosti normálního rozdělení standardizovaných hodnot markéru M u osob netrpících karcinomem prsu, X je standardizovaná hodnota markéru M hodnocené osoby, VFjc váha markéru hodnocené osoby.
Takto definovaná váha má kladnou hodnotu pro osoby patřící s větší pravděpodobností do skupiny osob trpících karcinomem prsu, a zápornou hodnotu pro osoby patřící s větší pravděpodobností do skupiny osob netrpících karcinomem prsu.
-4CZ 307724 B6
Při použití většího počtu (n) markérů se výsledné hodnocení (klasifikační skóre S) dané osoby definuje jako součet vah pro všechny vybrané markéry:
= (4) í=l
Je výhodné absolutní hodnoty vah omezit. Normální rozdělení je sice dobře použitelnou aproximací reálného rozdělení hodnot markérů, ale hodnoty příliš odlehlé od průměru vedou k neadekvátně velkým absolutním hodnotám vah, takže jediná odlehlá hodnota může v součtu vah rozhodnout o klasifikaci i v rozporu s opačným znaménkem všech ostatních vah. Na základě praktických testů bylo jako optimum zvoleno omezení hodnot hustoty na /(X|x,5x) > 0,05, ale toto optimum se může lišit v závislosti na markérech a jejich parametrech. Hodnoty této podmínce nevyhovující jsou nahrazeny hodnotou omezení, v případě zvoleného optima hodnotou 0,05.
Jiné výhodné provedení klasifikace je založeno na tom, že principy klasifikace použité v předchozím výhodném provedení se efektivně doplní využitím statistických závislostí mezi dvojicemi markérů. Závislost, vyjádřenou regresní přímkou pro dvojici markérů Μχ (se standardizovanými hodnotami X) a My (se standardizovanými hodnotami Y), lze výhodně využít v případě, že se regresní přímka Y = aX + b výrazně liší pro osoby trpící karcinomem prsu od regresní přímky pro osoby tímto karcinomem netrpící.
Mezi typické vlastnosti biologických objektů patří to, že se u měřených veličin často vyskytují velké odchylky od typických hodnot. Pro výstižný popis obecněji platných vlastností a vztahů je vhodné vliv odlehlých hodnot co nejvíce potlačit i při výpočtu optimálních parametrů regresních funkcí. Zde se velmi osvědčila metoda, kterou lze nazvat „cenzumí“. Tato cenzumí metoda vypočítá regresní přímku a pak vyloučí nej odlehlejší bod. Tento proces se stále opakuje, dokud nějaký odlehlý bod existuje. Jako kritérium odlehlosti se zde osvědčila odchylka bodu od regresní přímky větší než dvojnásobek aktuální reziduální odchylky srez.
Pro alespoň jednu takovou dvojici standardizovaných hodnot markérů Μχ, Μγ se výše popsanou cenzumí metodou stanoví parametry obou regresních přímek.
Pro osoby trpící karcinomem prsu Yc—acX+bc srezC (5)
Pro osoby netrpící karcinomem prsu YK—aKX+bK srezK (6) kde srezjsou reziduální odchylky.
Výpočetní vztahy (2), (3) se tím formálně změní takto:
fc(Y) = f(Y\acX+bc^'rezc) fK (y) = f(Y\ aKX + bK, srezK) (7)
W = log fcíY)} [/κ(γυ (8)
Celkový průměr standardizovaných hodnot markéru Μγ je zde nahrazen očekávaným průměrem odpovídajícím hodnotě aX+b; celkové směrodatné odchylky jsou nahrazeny (oproti směrodatné odchylce obvykle menšími) reziduálními odchylkami srez.
Při použití více (n) dvojic markérů se výsledné hodnocení (klasifikační skóre S) dané osoby opět definuje jako součet S takto určených vah W; pro všechny použité dvojice markérů:
= (9) í=l
V tomto výhodném provedení je obzvlášť výhodné, když se stanoví logaritmy hodnot všech markérů vybraných ze skupiny zahrnující dvojice markérů:
| X | Y |
| Ml | M19 |
| M17 | M3 |
| M20 | M15 |
| M6 | M9 |
| M19 | M8 |
| M14 | M8 |
| M7 | Ml |
a provede se jejich vyhodnocení, jak je zde popsáno.
Vzorek apokrinního potu je zpravidla v podobě vzorku drženého kapilárními silami v odběrovém zařízení, např. ve fritě. Takový vzorek lze získat přejížděním odběrovým zařízením, např. fritou, s mírným přítlakem po podpažních jamkách nebo jiných oblastech s produkcí apokrinního potu.
S výhodou se vzorek potu nejprve extrahuje methanolem nebo směsí methanolu a vody (např. 80% methanol) za spolupůsobení ultrazvuku. Extrakt může být použit přímo k provedení diagnostické metody nebo lyofilizován a pro analýzu znovu rozpuštěn v methanolu nebo směsi methanolu a vody (např. 80% methanol).
Hodnoty popisující podíl příslušného markéru v apokrinním potu se získají metodami analýzy kapalných roztoků, například kapalinovou chromatografií. Mohou jimi být například relativní plochy pod odpovídajícími chromatografickými píky, nebo hodnoty molámích, hmotnostních či objemových podílů či koncentrací složek.
Příklady uskutečnění vynálezu
1. Odběr vzorku
Postup odběru potu:
Den před odběrem si pacientka oholí axily (suchým nebo mokrým postupem dle svých zvyklostí) a dále již nebude do odběru potu používat kosmetické přípravky s aplikací do podpaží. Omytí mýdlem nebo tělovým šamponem při sprchování nebo koupeli večer před odběrem není na závadu.
Provedení odběru potu:
• Označit odběrovou nádobku jménem pacientky a stranou podpaží.
• Odběr provádět v rukavicích. Provést odběr axilámího apokrinního potu přejížděním sterilní fritou po povrchu kůže odchlupené části axily, kde ústí apokrinní potní žlázky do vlasových folikulů. Apokrinní pot v jejich vývodech bude exprimován mírným tlakem na fritu a okamžitě odsán kapilaritou do nitra frity. Odběr je proveden z axily, doba odběru přibližně půl minuty.
• Po odběru ihned fritu vložit do odběrové nádobky, nádobku uzavřít, vložit do sáčku obě nádobky, obalit nachlazeným chladicím polštářkem a transportovat do laboratoře.
• V laboratoři uložit do mrazáku na -80 °C.
-6CZ 307724 B6
2. Extrakce a měření
Extrakce hydrofilních metabolitů je založena na rozpuštění potu v methanolu. Tento extrakt je pak následně analyzován cílenou metabolomickou metodou na principu HILIC kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrii. Separace v HILIC módu na aminopropylové stacionární fázi umožňuje analýzu širokého spektra metabolitů (aminokyseliny, organické kyseliny, acylkamitiny, puriny, pyrimidiny, nukleotidy a další). Detekce pomocí hmotnostní spektrometrie využívá měření produktu rozpadu molekulárního iontu v obou polaritách současně. Detekují se tedy specifické hmoty fragmentů při definovaném retenčním čase příslušného metabolitů. Integrace se provádí ve specifickém software dle použitého hmotnostního spektrometru a pro další výpočty jsou používány plochy chromatografických píků.
Odkaz na metodu:
Separation and quantitation of water soluble cellular metabolites by hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry. Bajad SU, Lu W, Kimball EH, Yuan J, Peterson C, Rabinowitz JD. J Chromatogr A. 2006 Aug 25;1125(1):76-88. Epub 2006 Jun 6.
PMID: 16759663
3. Celkové výsledky
Nej lepších výsledků bylo dosaženo s využitím statistických závislostí mezi dvojicemi markérů, a to pro 7 dvojic (Μχ, Μγ) uvedených v Tabulce 1. Parametry a, b, srez regresních přímek Y = aX+b uvedené v tabulce byly získány výpočtem cenzurovaných lineárních regresí pro standardizované hodnoty X, Y těchto markérů. Pro karcinomy byla použita data deseti osob ze všech 70 testovaných nemocných, jejichž nádory byly v nejpokročilejším stadiu. Pro kontroly bylo k tomuto účelu náhodně vybráno 27 z celkového počtu 53 kontrol. Větší počet vybraných, než u karcinomů se ukázal potřebný kvůli velké variabilitě dat u kontrol.
Tabulka 1
| Mx | MY | Cle | bc | SrezC | ClK | bK | SrezK |
| Ml | M19 | 0,211233 | 0,638078 | 0,020908 | 0,717903 | 0,24885 | 0,023597 |
| M17 | M3 | -0,13753 | 0,985096 | 0,016942 | 1,099697 | 0,063081 | 0,028478 |
| M20 | M15 | 1,127815 | -0,32808 | 0,049557 | 0,767611 | 0,027244 | 0,040707 |
| M6 | M9 | 0,767396 | -0,0021 | 0,034329 | 0,654781 | 0,076986 | 0,030981 |
| M19 | M8 | 0,95867 | 0,2156 | 0,076391 | 0,982641 | 0,09054 | 0,025688 |
| M14 | M8 | 0,749167 | 0,309339 | 0,069423 | 1,062469 | -0,04724 | 0,020848 |
| M7 | Ml | 1,436498 | -0,34802 | 0,04133 | -0,07955 | 0,951133 | 0,037894 |
Použitím výpočetních vztahů (1) a (7) až (9) pro hodnocení dat všech 70 osob s nádory a 53 osob kontrolních bylo dosaženo senzitivity 97% (to odpovídá 2 případům nerozpoznaného karcinomu) a specificity 72% (15 kontrol bylo nesprávně vyhodnoceno jako karcinomy).
4. Ukázky konkrétních vyhodnocení
Ukázka vyhodnocení dat ženy s nepříliš pokročilým karcinomem.
Hodnoty fc, /κ jsou vypočteny využitím vztahů (7) a parametrů regresí z Tabulky 1, hodnoty vah Wpodle vztahu (8). Skóre S je sumou hodnot W.
Tabulka 2
| Mx | MY | X | Y | fc(Y) | /k(Y) | W |
| Ml | M19 | 0,993 | 0,859 | 16,537 | 0,050 | 2,519 |
| M17 | M3 | 0,877 | 0,798 | 0,050 | 0,050 | 0,000 |
| M20 | M15 | 0,814 | 0,598 | 7,940 | 4,067 | 0,291 |
| M6 | M9 | 0,970 | 0,755 | 10,869 | 4,981 | 0,339 |
| M19 | M8 | 0,859 | 1,137 | 2,287 | 0,050 | 1,660 |
| M14 | M8 | 0,941 | 1,137 | 1,205 | 0,050 | 1,382 |
| M7 | Ml | 0,985 | 0,993 | 2,020 | 0,067 | 1,482 |
| skóre .8 | 7,673 |
Kladné skóre odpovídá klasifikaci „karcinom“
Ukázka vyhodnocení dat správně klasifikované ženy z kontrolní skupiny. Výpočty jsou provedeny analogicky jako v předchozí ukázce.
Tabulka 3
| Mx | MY | X | Y | fc(Y) | fK(Y) | W |
| Ml | M19 | 0,867 | 0,877 | 0,567 | 16,484 | -1,463 |
| M17 | M3 | 0,838 | 0,965 | 0,050 | 11,060 | -2,345 |
| M20 | M15 | 0,903 | 0,790 | 1,049 | 2,252 | -0,332 |
| M6 | M9 | 0,975 | 0,693 | 3,471 | 9,851 | -0,453 |
| M19 | M8 | 0,877 | 0,920 | 1,076 | 7,242 | -0,828 |
| M14 | M8 | 0,960 | 0,920 | 1,703 | 0,808 | 0,324 |
| M7 | Ml | 0,829 | 0,867 | 8,151 | 9,403 | -0,062 |
| skóre .8 | -5,159 |
Záporné skóre odpovídá klasifikaci „bez karcinomu“.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (8)
1. Způsob detekce markérů ze vzorku apokrinního potu, odebraného z těla pacienta a drženého kapilárními silami v odběrovém zařízení, pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu, zejména primárního karcinomu prsu, vyznačený tím, že
- ze vzorku apokrinního potu se pomocí kapalinové chromatografie získají hodnoty popisující podíl alespoň jednoho markéru ve vzorku apokrinního potu, přičemž markér je vybraný ze skupiny zahrnující následující chemická individua nebo jejich směsi:
- následně se stanoví logaritmy uvedených hodnot popisujících podíl alespoň jednoho markéru ve vzorku apokrinního potu,
5 - každý logaritmus hodnoty popisující podíl uvedeného alespoň jednoho markéru ve vzorku apokrinního potu se standardizuje tak, že logaritmus hodnoty popisující podíl markéru ve vzorku apokrinního potu se dělí průměrem logaritmů hodnot popisujících podíl tří standardizačních markérů ve vzorku apokrinního potu:
-9CZ 307724 B6
a tím se získá standardizovaná hodnota X markéru,
- a vyhodnocením logaritmu hodnoty popisující podíl uvedeného alespoň jednoho markéru ve vzorku apokrinního potu vůči logaritmům hodnot tohoto markéru zjištěných pro osoby trpící karcinomem prsu a pro osoby netrpící karcinomem prsu se provede závěr spočívající v přiřazení pacienta do skupiny osob trpících karcinomem prsu nebo do skupiny osob netrpících karcinomem prsu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že vyhodnocení a přiřazení pacienta do příslušné skupiny se provede tak, že pro standardizované hodnoty X alespoň jednoho markéru M, kde markér M je vybrán ze skupiny markérů uvedených v nároku 1, se výpočtem stanoví hodnoty průměru x a směrodatné odchylky s hustoty pravděpodobnosti normálního rozdělení, popisující standardizovaný podíl tohoto markéru ve vzorku potu u osob trpících karcinomem prsu a u kontrol, následně se stanoví váha markéru M pro pacienta jako logaritmus poměru pravděpodobnosti příslušnosti ke skupině osob trpících karcinomem prsu k pravděpodobnosti příslušnosti ke skupině osob netrpících karcinomem prsu:
./U-Y) = ./'(X|a7,.s;J fK(X) = f(X\xK,sKY
W = log
7c(X)i kde X je standardizovaná hodnota markéru M pacienta, W je váha markéru M pro pacienta, fc je hustota pravděpodobnosti normálního rozdělení standardizované hodnoty markéru M u osob trpících karcinomem prsu, ft je hustota pravděpodobnosti normálního rozdělení standardizované hodnoty markéru M u osob netrpících karcinomem prsu, přičemž takto definovaná váha markéru má kladnou hodnotu pro osoby patřící s větší pravděpodobností do skupiny osob trpících karcinomem prsu, a zápornou hodnotu pro osoby patřící s větší pravděpodobností do skupiny osob netrpících karcinomem prsu.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se vyhodnotí logaritmy hodnot alespoň jedné dvojice markérů vybraných ze skupiny markérů uvedených v nároku 1, na základě statistických závislostí mezi těmito dvěma markéry, vůči logaritmům hodnot této dvojice markérů zjištěných pro osoby trpící karcinomem prsu a pro osoby netrpící karcinomem prsu, a provede se diagnostický závěr spočívající v přiřazení pacienta do skupiny osob trpících karcinomem prsu nebo do skupiny osob netrpících karcinomem prsu.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se využije alespoň jedna dvojice markérů M.\- a My, kde markéry M.\- a My jsou vybrány ze skupiny markérů uvedených v nároku 1, přičemž se z jejich standardizovaných hodnot X, Y vypočte regresní přímka a vyloučí se nejodlehlejší bod, přičemž tento krok se opakuje, dokud existuje odlehlý bod, přičemž kritériem odlehlosti je s výhodou odchylka bodu od regresní přímky větší než dvojnásobek aktuální reziduální odchylky srez;
přičemž uvedeným postupem se stanoví parametry a, b, srez regresních přímek pro osoby trpící karcinomem prsu Yc - acX +bc srezC a pro osoby netrpící karcinomem prsu YK—aKX+bK srezK;
- 10CZ 307724 B6 a následně se stanoví váha této dvojice markérů pro pacienta pomocí hodnot hustoty pravděpodobnosti fc a Ι'κ normálního rozdělení standardizovaných hodnot markéru My v závislosti na standardizované hodnotě markéru My jako logaritmus poměru pravděpodobnosti příslušnosti ke skupině osob trpících karcinomem prsu k pravděpodobnosti příslušnosti ke skupině osob netrpících karcinomem prsu:
Λ+) = f(Y I acX +bc,S^c) fK(Y) = f(Y I aKX
W = log [fK(Yy kde X je standardizovaná hodnota markéru Μχ pacienta, Y je standardizovaná hodnota markéru My pacienta, W jc váha dvojice markérů pro pacienta, přičemž takto definovaná váha má kladnou hodnotu pro osoby patřící s větší pravděpodobností do skupiny osob trpících karcinomem prsu, a zápornou hodnotu pro osoby patřící s větší pravděpodobností do skupiny osob netrpících karcinomem prsu.
5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačený tím, že se použije alespoň jedna dvojice markérů Μχ, Μγ vybraná z dvojic ____________________
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 2, 4 nebo 5, vyznačený tím, že se použije více markérů nebo více dvojic markérů a pro vyhodnocení a přiřazení se využije hodnota klasifikačního skóre S definovaného jako součet vah pro všechny vybrané markéry nebo vybrané dvojice markérů:
n s = í=l
7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že hodnoty hustot fc, ft nižší, než předdefinovaná nejnižší hodnota jsou nahrazeny touto předdefinovanou nejnižší hodnotou; s výhodou je touto nejnižší hodnotou 0,05.
8. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že vzorek apokrinního potu se nejprve extrahuje methanolem nebo směsí methanolu a vody, s výhodou za spolupůsobení ultrazvuku, a poté použije přímo k provedení diagnostické metody nebo se lyofilizuje a pro analýzu znovu rozpustí v methanolu nebo směsi methanolu a vody.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-501A CZ307724B6 (cs) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | Způsob detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu |
| PCT/CZ2018/050045 WO2019042487A1 (en) | 2017-08-29 | 2018-08-28 | METHOD FOR DIAGNOSING BREAST CANCER FROM AN APOCRINE SWEAT SAMPLE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-501A CZ307724B6 (cs) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | Způsob detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017501A3 CZ2017501A3 (cs) | 2019-03-20 |
| CZ307724B6 true CZ307724B6 (cs) | 2019-03-20 |
Family
ID=63528462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-501A CZ307724B6 (cs) | 2017-08-29 | 2017-08-29 | Způsob detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307724B6 (cs) |
| WO (1) | WO2019042487A1 (cs) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030199743A1 (en) * | 2000-11-29 | 2003-10-23 | Berlin Stuart M. | Screening test and procedure using apocrine sweat |
| US8653006B2 (en) * | 2010-09-03 | 2014-02-18 | Purdue Research Foundation | Metabolite biomarkers for the detection of esophageal cancer using NMR |
| WO2016038157A1 (en) * | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Idcgs Clínica De Diagnósticos Médicos Ltda | Biomarkers for assessing breast cancer |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011046597A2 (en) * | 2009-10-13 | 2011-04-21 | Purdue Research Foundtion | Biomarkers for the detection of breast cancer |
-
2017
- 2017-08-29 CZ CZ2017-501A patent/CZ307724B6/cs unknown
-
2018
- 2018-08-28 WO PCT/CZ2018/050045 patent/WO2019042487A1/en active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030199743A1 (en) * | 2000-11-29 | 2003-10-23 | Berlin Stuart M. | Screening test and procedure using apocrine sweat |
| US8653006B2 (en) * | 2010-09-03 | 2014-02-18 | Purdue Research Foundation | Metabolite biomarkers for the detection of esophageal cancer using NMR |
| WO2016038157A1 (en) * | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Idcgs Clínica De Diagnósticos Médicos Ltda | Biomarkers for assessing breast cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2017501A3 (cs) | 2019-03-20 |
| WO2019042487A1 (en) | 2019-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kim et al. | Urine metabolomics analysis for kidney cancer detection and biomarker discovery | |
| Phillips et al. | Prediction of breast cancer risk with volatile biomarkers in breath | |
| Nwosu et al. | Bioelectrical impedance vector analysis (BIVA) as a method to compare body composition differences according to cancer stage and type | |
| Noothalapati et al. | Biological and medical applications of multivariate curve resolution assisted Raman spectroscopy | |
| BR112020024715A2 (pt) | biomarcadores proteicos para identificar e tratar o envelhecimento da pele e afecções cutâneas | |
| Tanja et al. | High expression of MAGE-A10 cancer-testis antigen in triple-negative breast cancer | |
| JP2020501567A (ja) | 乾燥の徴候を呈している皮膚を診断するための方法 | |
| Binz et al. | Systematic investigations of endogenous cortisol and cortisone in nails by LC-MS/MS and correlation to hair | |
| Khajuria et al. | Toxicological hair analysis: pre-analytical, analytical and interpretive aspects | |
| Iwano et al. | Breast cancer diagnosis based on lipid profiling by probe electrospray ionization mass spectrometry | |
| Kuerer et al. | Identification of distinct protein expression patterns in bilateral matched pair breast ductal fluid specimens from women with unilateral invasive breast carcinoma: High‐throughput biomarker discovery | |
| KR20190065263A (ko) | 대장암의 평가 방법, 평가 장치, 평가 프로그램, 평가 시스템, 및 단말 장치 | |
| Rodrigues-Peres et al. | Aluminum concentrations in central and peripheral areas of malignant breast lesions do not differ from those in normal breast tissues | |
| Waki et al. | Investigation by imaging mass spectrometry of biomarker candidates for aging in the hair cortex | |
| CZ307724B6 (cs) | Způsob detekce markerů ze vzorku apokrinního potu pro statistické vyhodnocení karcinomu prsu | |
| Marek-Bukowiec et al. | mRNA fingerprint of early-stage clear cell renal cell carcinoma identified in urinary exosomes by mRNA sequencing | |
| MOHSENI et al. | Prognostic values of proliferative markers ki-67 and repp86 in breast cancer | |
| EP3377894B1 (en) | Method for drug binding analysis in a tissue sample | |
| Weitzel et al. | Discovery and verification of protein differences between Er positive/Her2/neu negative breast tumor tissue and matched adjacent normal breast tissue | |
| CN114807370A (zh) | 一种新型的用于乳腺癌免疫治疗疗效精准预测的模型及其应用 | |
| Lüthgens et al. | TPA-RIA in clinical cancer diagnostics | |
| Behboodi et al. | Studying the proteomic pattern of cancerous tissue in patients with breast cancer and its' comparing with healthy breast | |
| CN107894454B (zh) | 一种快速无损诊断乳腺疾病的质谱分析模型 | |
| Rodrigues-Peres et al. | Tissue aluminum concentration does not affect the genomic stability of ERBB2, C-MYC, and CCND1 genes in breast cancer | |
| JP2010266386A (ja) | 患者由来の代謝物を使用したがんの検査方法 |