PT92454B - Processo de clonacao e expressao de factor de crescimento transformante beta 1 de simio - Google Patents

Description

C presente invento refere-se a clonaçáo. expressão. e utilização do factor de crescimento transformante 61 de simic (rTGF-βΙ). 0 produto do invento tem uma bioactividade equivalente à do TGF-01 humano maduro autêntico.

2. Antecedentes da InveriçSo factor de crescimento transformante (TGF) da família dos péptidos moduladores do crescimento consiste em duas moléculas estruturalmente e funcionalmente dissemelhantes, o TGF-alfa e o TGF-beta. O TGF-alfa, sintetizado e libertado células de roedores transformados por retrovírus

1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:4001-4005; Twardzik et a 1.. 1982, Science 216: 894-897) e por linhas de ^DeLarco et a 1. , de tumor humano (Todaro et al. 77:5258-5262), compete com o aminoácido' por algumas das linhas de células 1980, Proc. Natl. Acad, Sei. USA factor de crescimento epidérmico (EGF) na ligação ao receptor de EGF (Todaro et al., 1976, Nature 264, 26-29) e estimula a fosforilação específica da tirosina do receptor de EGF (Reynolds et al., 1981, Nature 292:259-262). Um mitogéneo potente para células de origem mesenquimal, a forma madura do TGF-alfa compreende 50 resíduos aminoácidos, partilha de homologia de sequência quer com o EGF de roedor quer com o EGF humano, (Marquardt et aI.. 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4684-4688) e é clivado a partir de um precusor de 159 (Dervnck et al., 1984, Cell 38:287-297; Lee et

1985, Nature 313:489-491).

uma proteína como estando Biol. Chem.

Muito recentemente, tem sido identificada isolada a partir de osso desmineralizado de bovino, relacionada com o TGF-β (Seyedin et al . , 1987, 0

262:1946-1949). A proteína tem também sido isolada a partir de plaquetas de porcino (Cheifetz et a I., 1987, Cell 48:409-415), de uma linha de células do adenocarcinoma prostático humano PC-3 (Ikeda et a I . . 1987, Biochemistry 26:2406-2410), e de uma linha de células do g1ioblastoma humano (Wrann et a 1., 1987, EMBO

6:1633-1636). A sequência de aminoácidos parcial desta proteína indicou que ela era homóloga ao TGF-β e tem sido denominada TGFbad original d

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1985, Nature 316:701-705), Biol. Chem. 261:4377-4379) e DNA 6:239-244) previamente

-3-82. 0 TGF-βΙ humano (Derynck et a 1 de ratinho )Derynck et al., 1986, J de símio (Sharples et a 1., 1987, descritos, tem sido e é aqui a seguir designado por TGF-βΙ.

O TGF-81, um homodímero ligado por dissulfureto (9 resíduos de cisteina por cadeia) contém duas subunidades idênticas (112 resíduos aminoácidc6 por subunidade) e utiliza um receptor diferente quer do TGF-alfa quer do EGF (Frolik et a 1., 1984, J. Biol. Chem. 260:10995-11000: Tucker et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6757-6761). Este modulador potente do comportamento das células é sintetizado por uma variedade de células, normais e transformadas, em cultura (Roberts et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5339-5343) e tem sido purificado a partir de várias fontes incluindo a placenta (Frolik et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:3676-3680), o rim (Roberts et al.. 1983,

Biochemistry 22:5692-5698), a urina (Trwardzik et al . . 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297) e as plaquetas sanguíneas (Childs et al. , 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5312-5316). O TGF-βΙ quer requer,/o TGF-alfa quer o EGF, para promover o crescimento independente da fixação dos fibroblastos de rim de ratazana normais (NRK) ,· contudo o requisito para o TGF-alfa ou o EGF é menos rigoroso para promover o crescimento independente da fixação de AKR-2, uma célula indicadora de murino (Tucker et al., 1983, Câncer Res. 43:1581-1586). Em contraste ao estímulo do crescimento de células, tem-se mostrado que o TGF-βΙ de plaquetas humanas e um polipéptido funcionalmente relacionado com propriedades bioquímicas muito idênticas, isolado a partir de células de macaco verde africano (BSC-1), exibem também efeitos inibidores do crescimento em algumas células em cultura (Tucker et al . , 1984, Science 226:705-707). Quer a bifunciona 1 idade do TGF-βΙ (inibição/estimulação) quer a sua distribuição ubíqua aparente sugerem que ele possa desempenhar um papel chave na regulação do crescimento e do comportamento de células de mamíferos.

A sequência de aminoácidos deduzida dos (ADNc) que codificam o precursor TGF-βΙ de origem humana (Derynck et al.

316:701-705) e do ratinho (Derynck et al., 1986,

1985, Nature Biol. Chem.

261:4377-4379) indica um elevado grau de homologia, não só na

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—4— área da sequência de TGF-βΙ maduro, mas também na região precursora amino terminal.

Embora o gene do TGF-βΙ humano tenha sido identificado e sequenciado, a clonação e expressão de grandes quantidades de TGF-βΐ activo não têm sido até agora descritas. Podem ser reponsáveis pela dificuldade na expressão de TGF-βΙ activo um certo número de factores, um dos quais pode envolver a complexidade da estrutura terciária da molécula. 0 TGF-βΙ maduro tem um certo número de ligações dissulfureto intercadeias e intracadeias, a formação das quais requer um processamento adequado durante a expressão do produto do gene. Além disso, a forma madura do TGF-βΙ derivou de uma molécula precursora maior, glicosilada. Podem ser requeridos modelos correctos de glicosilação do precursor para o processamento, secreção e clivagem correctos da forma madura do TGF-βΙ, Assim, a clonação e expressão de um gene com a sequência de codificação correcta num sistema vector de expressão/célula hospedeira inapropriado, podem resultar na expressão de um produto com a estrutura primária adequada (i.e. , sequência de aminoácidos) mas com estruturas secundárias e terciárias incorrectas (i.e., dobragem e conformação) resultando numa molécula inactiva. Assim, tem sido dificultada a produção de grandes quantidades de TGF-βΙ.

3. Sumário do Invento

O presente invento refere-se à produção de grandes quantidades de TGF-βΙ de slmio por células hospedeiras eucarióticas transfectadas com vectores de ADN recombinante contendo a sequência de codificação do TGF-βΙ de símio controlada por elementos reguladores da expressão. Foi obtido um clone de ADNc que codifica o precursor TGF-βΙ de símio a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de uma linha de células de macaco verde africano, BSC-40. A sequência de aminoácidos deduzida do TGF-βΙ de símio maduro mostra 100¾ de homologia com a do TGF-βΙ humano maduro. Verificou-se uma forte homologia de sequência entre as regiões precursoras das proteínas humanas e de símios apenas com cinco modificações de aminoácidos em 278 resíduos. Verificou-se que a sequência precursora de símio (e murino)codifica menos um resíduo de aminoácidos que a humana.

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-5Foram construídos vectores de expressão que continham a sequência de codificação completa para o TGF-βΙ de simio colocada sob o controlo dos elementos de expressão SV40. Usaram-se estes vectores para trar.sfectar células de ovário de criceto Chinês (células CHO). Os transfectantes CHO resultantes produzem e segregam, quer rTGF-βΙ maduro que tem uma actividade biológica comparável à do TGF-βΙ autêntico, quer a forma precursora de rTGF-βΙ que tem também uma actividade biológica.

4Descrição das Figuras

FIG. 1. Sequência de nucleótidos ADNc de TGF-βΙ de símio e sequência de aminoácidos deduzida. O inserido de 1600 pb de pTGF-61-2 foi subclonado nos vectores de clonação M13mpl8 e M13mpl9 (Yanisch-Perron et al., 1985 Gene 33:103-119) e ambas as cadeias foram sequenciadas utilizando o processo de terminação da cadeia de didesoxilo (Sanger et al., 1977 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467). A sequência de aminoácidos deduzida de TGF-βΙ de símio é apresentada directamente sobre a sequência de ADNc. A sequência de nucleótidos de TGF-βΙ humano está alinhada com, e apresentada directamente abaixo, da sequência de ADNc de símio ; os pontos indicam resíduos de nucleótidos homólogos dentro das sequências. As diferenças de aminoácidos entre as proteínas humanas e de símio estão indicadas na linha superior. A sequência de TGF-βΙ maduro está esquadrada e o péptido de sinal está sobrelinbado.

FIG. 2. Análise de mancha Northern do ARN de uma linha de células humanas (MCF-7) e de símio (BSC-40) utilizando uma sonda de ADNc de TGF-βΙ de símio. O ARN poliadeni1ado foi isolado a partir de células MCF-7 e de células BSC-40 como se descreveu (Purchio et a 1., 1979, J. Virol 29:763-769), fraccionado num gel de agarose-formaldeído a 1% (12), transferido para uma membrana de nylon (Hyhond, Amersham) e hibridado com uma sonda de 3?

ρΤ6Γ-β1-2 marcado com [ p]. Faixa 1, ARN de MCF-7 humano (5yyg); faixa 2, ARN de BSC-40 de símio (5/g). 0 28S e o 18S indicam a posição de migração dos ARNs rihossomais 28S e 18S.

FIG. 3. Construção do plasmídeo de expressão amplificável

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-6pSV2 (TGF-Bl-dhfr). Os pormenores da construção são os que se descrevem na secção 7 infra. O plasmídeo recombinante final continha o ADNc de TGF-βΙ, que codifica a forma precursora completa de TGF-βΙ, e o ADNc de dhfr de ratinho em tandem. A iniciação da transcrição dos (ARNm)s de TGF-βΙ e de dhfr é conduzida pelo promotor inicial SV40. Os sinais de poliadenilação e as outras sequências responsáveis pelo correcto processamento do ARN são fornecidos pelas sequências 3' do SV40. Os sítios de restrição em parêntesis são perdidos durante a construção do plasmídeo de expressão amplificável.

FIG. 4. Detecção das sequências de ácidos nucleicos de TGF-βΙ nas células CHO em várias fases da selecção MTX. Painel A: análise de mancha Northern para a detecção de sequências de ARNm de TGF-βΙ. O ARNm contendo poli (A)+(5 /g) foi fraccionado num gel de agarose-formaldeido a 1% manchado em membranas Hybond N (Amersham) e sondado com o ADN de TGF-βΙ radiomarcado como se descreve em Materiais e Métodos. A faixa contendo o ARNm de CHO não transfectado foi exposta durante 48 horas para revelar os níveis endógenos da mensagem de TGF-βΙ de 2,5 Kb. As faixas contendo ARNm de células TGF-D1-3 foram expostas 5 minutos. Os marcadores ribossomais estão representados à direita. Painel B: análise de mancha Southern do ADN genómico dos transfectantes de células CHO com TGF-B1-3 em várias fases de selecção MTX. 0 ADN de elevado peso molecular dos transfectantes de TGF-01-3 foi digerido com BamHI ou EcoRI e fraccionaram-se 20 Ju g num gel de agarose a 1%. 0 ADN foi transferido para membranas Hybond N (Amersham) e sondado com ADN de TGF-βΙ traduzido com incisão. 0 tempo de exposição foi de 30 horas para as células TGF^l-3-0 e de 10 horas para as células TGF-£l-3-200 e 2000. Os marcadores de tamanho do ADN são indicados à esquerda da figura. As setas indicam os tamanhos do ADN que se prevêm hibridar com a sonda de

TGF-βΙ.

FIG. 5. Ensaio de inibição do crescimento de células epiteliais do pulmão de marta CCL-64 com TGF-βΙ recombinante ou natural. Painel A: Ensaio de inibição do crescimento utilizando

TGF-βΙ natural purificado a patir do baço de bovino; obtém-se

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-7tipicamente uma inibição de 50% utilizando 8-12 picogramas de

TGF-βΙ. Painel B: Os sobrenadantes isentos de recolhidos a partir de monocamadas confluentes do de TGF-01-3em várias fases de amplificação. Os extensivamente dialisados contra ácido acético 0,2 M e ensaiasoro foram transfectante meios foram dos para a . inibição do crescimento como se descreve na secção

7.1.6 infra. Os resultados apresentados estão normalizados para 7 uma colheita de 1x10 células por 5 ml._, células TGF-βΙ não ampl i f i cadas ; _a__Bcélulas TGF-01-3 adaptadas ao metotrexato 2 yttM o__océlulas TGF-61-3 adaptadas ao metotrexato 20 7M.

FIG. 6. Activação ácida de TGF-βΙ recombinante. Efectuou-se uma colheita de 24 horas de sobrenadantes isentos de soro a partir de células TGF-pl-3/2000. Dialisaram-se porções iguais contra ácido acético 0,2M ou NH^HCOg 50mM (pH7,0). Como controlo, o sobrenadante primeiramente dialisado contra NH^HCO^ 50mM, foi dialisado contra ácido acético 0,2M. Mostra-aeuma curva de bioactividade dose-resposta do material diferencialmente proce_s sado.4_4, sobrenadante dialisado contra NH_ZHCO_Q._B_» ácido acético adicionalmente sobrenadante dialisado contra material tratado com ácido acético 0,2 M.

NH₄HC0₃

0,2M._a.

dialisado contra

FIG. 7. Diagrama de linhas ilustrando as características estruturais da proteína rTGF-βΙ e indicando as regiões peptídicas utilizadas para a produção de anti-soros anti-péptidos específicos de certos sítios. Para os aminoácidos usa-se o código de uma letra: A (alanina), C (cisteina), D (ácido aspártico), E (ácido glutâmico), F (fenilalanina), G (glicina), H (histidina), I (isoleucina), K (lisina), L (leucina), M (metionina), N (asparagina), P (prolina), Q (glutamina), R (arginina), S (serina), T (treonina), V (valina), W (triptofano), Y (tirosina). São identificados os domínios funcionalmente importantes do TGF-01: sequência orientadora, sequências precursoras e TGF-βΙ maduro.

FIG. 8. Identificação do TGF-βΙ recombinante nos meios condicionados de células TGF-61-3 por imunomancha. Os sobrenadantes isentos de soro foram recolhidos a partir de culturas confluentes de células e extensivamente dialisados contra ácido acético

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0.2Μ. Após 1iofi1ização, o material foi solubilizado em tampão de 5

SDS-amostra, o equivalente de 2 x 10 células fci fraccionado em geles de SDS-poliacrilamina. e foram detectadas por imunomancha proteínas TGF-βΙ imunorreactivas. Para as imunomanchas utilizou-se anti-TGF-βΙ 359-33^- Para a experiência de bloqueio de péptido. adicionaram-se 50^g/ml de pépt1^0339-331 ^ao anti-corpo antes da imunomancha. Painel A: Imunomancha do material recolhido nos sobrenadantes de TGF-61-3 adaptado ao metotrexato 0, 2, ou 20 juM e fraccionado em geles de SDS-poliacrilamida sob condições de redução. Incluiu-se para comparação o TGF-Dl (100 ng) de baço de bovino natural. Painel B: Os sobrenadantes foram fraccionados sob condições de não redução. Incluiu-se o TGF-βΙ (250 ng) de baço de bovino.

FIG. 9. Imunomancha de TGF-βΙ recombinante segregado produzido pelas células TGF-61-3 sondadas com anti-TGF-βΙ anti-TGF-βΙ.

Os sobrenadantes foram

81-94 recolhidos, '225-236' processados como descrito na FIG.8 e fraccionados em geles de gradiente de SDS-poliacri1amida. (A) Imunomancha dos sobrenadantes fraccionados em geles de SDS-poliacrilamida de redução. Mostra-se no último painel uma imunomancha realizada com uma mistura de anticorpos específicos do precursor e específicos do TGF-βΙ para mostrar as três formas distintas de material recombinante. (B) Imunomancha dos sobrenadantes fraccionados em geles de SDS-poliacrilamida sob condições de não redução. Mostra-se no último painel uma mistura de anticorpos específicos do precursor e específicos do TGF-βΙ.

FIG. 10. Detecção das formas madura e precursora de rTGF-£Jl nas proteínas segregadas totais de células TGF-31-3/0 e TGF-βΙ-3/2000. As células cultivadas até à confluência em placas de cultura de tecidos redondas de 60 mm foram marcadas em 3 ml de

DMEM deficiente em metionina. cisteina e soro de feto de bovino e 35 35 contendo 100 / Ci/ml de S-metionina e S-cisteína. Após 18 horas, recolheu-se o sobrenadante marcado isento de soro, clarificou-se, e fraccionou-se em geles de SDS-poliacrilamida a

7,5-17,5% de redução. A seguir à electroforese, o gel foi 3 processado com En Hance e autarradiografado. Os resultados mostram

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uma exposição de 8 horas utilizando 3^1 do sohrenadante marcado ri è

FIO. 11. Detecção segregadas pelas células precursor TGF-βΙ. Ver isentos de a 0,2 M e proteína:; relacionadas com TGF-βΙ TGF-63-2000. A) Diagrama de linhas de discussão no texto. B) As células

TGF-33-2000 foram cultivadas até à confluência em placas de lOOmm como previamente se descreveu ÍGentry et a 1., 1987. Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). Recolheram-se os sobrenadantes soro (5 ml), dia 1isaram-se contra ácido acético

1iofi1izaram-se e analisaram-se por imunomancha amostras de 0,5 ml como se descreveu (Gentry et a 1., 1987. Mol. Cell. Biol.

7:3418-3427) utilizando um grupo de anticorpos anti-péptido contra os resíduos aminoácidos 369-381 (Anti-TGF3„,_n ) e 81-94 (anti-TGFpgi-g^): faixa 1, amostra não reduzida; faixa 2, amostra reduzida. Os números na esquerda (faixa 1) e na direita (faixa 2) indicam a posição dos padrões de peso molecular em qui1oda1 tons. C) As cé- lulas TGF-B3-2000 foram cultivadas até à confluência em placas de cultura de tecido de 60 mm e pulsadas em meio isento de soro (3 ml), deficiente em metionina e cisteína contendo

100-200/Ci/ml de [^^S]-cistena e [^^S]-metionina, durante 15 min.

As células foram então implantadas durante 4 horas em meio isento de soro contendo metionina e cisteína e analisou-se uma amostra, de lO^il em gel de gradiente de SDS-poliacri1amida de 7,5%-15%, como se descreveu (Laemmli 1970, Nature 227:680-685) sob condições de não redução (faixa 1), Uma segunda placa de células foi marcada durante 24 horas em meio isento de soro contendo 3

200^Cí/ml [ H]-glucosamina e o sohrenadante isento de células foi dialisado durante 48 horas contra ãcido acético 0,2 M. Liofilizaram-se duzentos microlitros deste material e analisou-se num gel de gradiente de SDS-poliacri1amida de 7.5%-15%, sob condições de não redução. 0 gel foi fluoroqrafado e exposto para autorradiografia utilizando filme de raios X Cronex-4 (DuPont). D) 0 mesmo que C) com a excepção de as amostras serem analisadas sob condições de redução. E) As células TGF-&3-2000 foram marcadas 32 com 1 mCi/ml de [ P]-ortofosfato em meio isento de soro e de fosfato. Os sobrenadantes isentos de células foram tratados como anteriormente de descreveu, fraccionados num gel de SDS-poliaBAD ORIGINAL ft

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5624-071-118 ff

-10crilamida a 15% sob condições de redução e o gel foi autorradio32 grafado. F) 0 precursor marcado com [ P] foi purificado por dois ciclos de e1ectroforese em gel de SDS-poliacrilamida e hidrolisado durante uma hora a 95 ⁰ C em HCL 6M (Cooper et a 1., 1983,

Meth. Enzymol. 99:387-402). Os produtos de digestão foram separados por e1ectroforese a pH 1,9 e a pH 3,5, e detectados por autorradiografia. Os padrões internos (P-ser, P-thr, p-tyr) foram detectados com ninidrina.

FIG. 12. Digestão de sobrenadantes isentos de soro a partir de células TGF-33-2000 com várias enzimas g1ico1íticas. A) As células TGF-B3-2000 foram cultivadas até à confluência e incubadas durante 24 horas em meio isento de soro. 0 meio foi dialisado contra ácido acético 0,2 M, liofilizado, e trataram-se as amostras com neuraminidase (0,25 unidades/ml, faixa 3), N-glicanase (20 unidades/ml, faixa 2) ou endoglicosidase H (0,2 unidades/ml, faixa 4). Os digeridos foram fraccionados por electroforese em gel de SDS-poliacri1amida sob condições de redução e analisados por imunomancha como se descreve na legenda para a Figura 11. A faixa contém uma amostra não tratada. B) Os sobrenadantes isentos de 35 soro de células TGF-03-2000 foram marcados com [ S]-metionina e 35 [ S]-cisteína como se descreve na legenda para a Figura 11 e digeridos como anteriormente com endog1icosidaee H (faixa 2), neuraminidase (faixa 3) e N-glicanase (faixa 4). A faixa 1 contém uma amostra não tratada. Os digeridos foram fraccionados por e1ectroforese em gel de SDS-poliacri1amida sob condições de redução e os geles foram autorradiografados. A N-glicanase foi adquirida da Genzyme (Boston, Mass.) e a endoglicosidaGe He a neuraminidase foram adquiridas da Calbiochem (La Jolla, CA): as condições tampão foram as recomendadas pelo fabricante.

FIG. 13. Tradução sem células dos transcritos específicos de TGF-βΙ. A) Subclonou-se um fragmento Pst I-Eco R de 1350 pares de bases contendo a região de codificação completa de TGF-βΙ (3) no pSP64 (Pharmacia) e transcreveram-se 5 de plasmídeo linearizado com SP6 polimerase (Kreig e Melton, 1984, Nucleic Acids Res. 18:7057-7070) adquirida da Betbesda Research Labs (Baltimore, MD) utilizando condições iónicas previamente descritas (Pelham e

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-11Jackson, 1976, Eur. J. Biochem. 67:247-251). A mistura reaccional foi digerida com DNase, extraída duas vezes com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (24:24:1) e precipitada com etanol. O ARN foi dissolvido em 50 μ 1 de ^0 e fraccionaram-se 10 μΐ (faixa 2) num gel de agarose-ureia a 1% como se descreveu (Purchio et a 1. , 1980, J. Virol. 35:629-639). A faixa 1 contem marcadores de ARN ribossomal de reticulócito. O gel foi manchado com brometo de etídio, iluminado com luz UV e fotografado. Β) O ARN anteriormente descrito foi tratado durante 10 minutos, a 22 °C, com metilmercúrio 10 mM, ajustou-se a 2-mercaptoetanol 20 mM e traduziu-se 1 /*g num sistema de tradução isento de células de reticulócito dependente da mensagem (Purchio et al., 1983, d. Virol, 48:320-324) num volume total de 50 /1 utilizando [^“'Sj-metionina e condições iónicas previamente descritas (Sharples et al,, 1987, DNA 6:239-244). As misturas reaccionais foram fraccionadas num gel de SDS-poliacrilamida a 10% (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685); o gel foi fluorografado e exposto a filme de raios X Cronex-4. Faixa 1, sem ARN adicionado; faixa 2, 1 /<g de ARN de TGF-βΙ.

FIG. 14. Cromatografia de penetração em gel numa coluna Bio-Sil TSK-250 (21,5 x 600 mm) de 20 mg de proteína, após precipitação com sulfato de amónio de 500 ml de sobrenadante, isento de soro, de células TGF-63-2000. A coluna foi equilibrada com 0,1% de TGA em água contendo 40% de acetonitrilo (v/v) com 2 ml/min, a 22 ^cC; foram recolhidas fracções de 4 ml. Alíquotas das fracções indicadas foram ensaiadas para avaliar a actividade inibidora do crescimento em células epiteliais de pulmão de marta (-o-). 0 traço a cheio dá a absorvância da proteína a 254 nm. Como marcadores utilizaram-se as proteínas seguintes:

^-quimotripsinogénio (Mr 25 700), ribonuclease pancreática A de bovino (Mr 13 700), e insulina (Mr 5 700).

FIG. 15. Purificação do rTGF-βΙ por HPLC de fase inversa. Modelo de eluição de 0,65 mg de proteína a partir do TGF-βΙ purificado por cromatografia de penetração em gel (Figura 2, grupo B) numa coluna yqBondpak C^q (tamanho de partícula 10

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-123,9 χ 300 mm). A eluição foi realizada com um gradiente linear de 10 minutos de 0,05¾ de TFA em água até 30¾ de acetonitrilo em TFA a 0,045%, e com um gradiente de 10 minutos de 36-60% de acetonitrilo em TFA a 0,045%. A coluna foi operada com um caudal de 0,2 ml/min, a 22 ^cC. Foram ensaiadas aliquotas das fracções indicadas para avaliar a actividade inibidora do crescimento nas células epiteliais de pulmão de marta (-o-). A faixa horizontal indica o rTGF-Bl reunido. 0 material que absorve em UV foi continuamente controlado quer a 214 nm (_); a linha a tracejado (----) indica a concentração de acetonitrilo.

FIG. 16. Análise em gel de SDS-poliacri1amida de proteínas rTGF-Bl purificadas. As formas precursora e madura do TGF-B1 foram fraccionadas por SDS-PAGE sob condições de não redução (A) ou de redução (B) e coradas com azul de Coomassie R-250. O nTGF-βΙ foi isolado a partir do baço de bovino e utilizado para comparação. São indicadas à esquerda e direita da figura as

proteínas	marcadoras em Kilodalton.
FIG.	17.	Padrão de coloração por azul	de	Coomassie de
proteínas	do	meio condicionado	de células	CHO	amp1i f içadas
exprimindo	o	TGF-βΙ. 0 meio	condicionado	foi	diali sado,

fraccionado em geles de SDS-poliacri1amida a 15% sob condições de redução, e corado com azul de Coomassie R-250. Para referência, as letras a, b, e c estão indicadas à esquerda da figura para indicar moléculas rTGF-βΙ. Faixa 1, 0,25 ml de meio condicionado; Faixa 2, mostra proteínas marcadoras com o peso molecular indicado em Kilodalton.

FIG. 18. Cromatografia de penetração em gel numa coluna Bio-Sil TSK-250 (7,5 x 600 mm) de péptidos CNBr de precursor rTGF-βΙ. Padrão de eluição de 800 pmol de percursor rTGF-βΙ clivado com CNBr. A coluna foi equilibrada com TFA a 0,1% em água contendo 40% de acetonitrilo com 0,25 ml/minuto a 22 °C. O material que absorve em UV foi controlado a 214 nm. Os picos designados por M referem-se aos péptidos CNBr sujeitos a degradação de Edman; os números referem-se à posição daquele(s) fragmento ou fragmentos particular(es) ligados por ligações dissulfureto na sequência completa (Sharples et a 1., 1987, DNA

Λ;?

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-136:239-244).

FIG. 19. Curvas de inibição do crescimento de proteínas TGF-βΙ purificadas utilizando células indicadoras de pulmão de marta. A inibição do crescimento foi avaliada como se descreve no texto. A concentração de polipéptidos TGF-βΙ foi determinada por análise dos aminoácidos. -4-, proteína precursora recombinante; -·-, nTGF-βΙ do baço de bovino; -o-, rTGF-pl.

FIG. 20. (A) Estrutura proposta do precursor TGF-βΙ realçando a sua natureza ligada cruzadamente por dissulfureto.

(B) Sumário dos acontecimentos de processamento de pré-pró-TGF-βΙ os em células CHO transfectadas. Rea1çan-se/s1tios de processamento proteolítico. Os asteriscos indicam sítios de glicosi1 ação. A escurecido, o péptido de sinal; a aberto, a região pró; a tracejado, o TGF-βΙ maduro.

FIG. 21. Efeito do TGF-βΙ e do TGF-02 no crescimento de tumores de pulmão humano A549 em ratinhos nude Os ratinhos nude machos (Balb/c-nu+/nu+) com 12 semanas de idade, foram injectados subcutaneamente na região dorsal do pescoço com 1,3 χ 10⁶ células do carcinoma do pulmão humano (A549) num volume de 0,2 ml de so3 lução salina tamponada com fosfato. Os tumores palpáveis (lOmm - 3x3x1 mm) desenvolveram-se em 20 dias, em aproximadamente 80¾ dos animais. Os animais comportando tumores foram transferidos ao acaso para diferentes jaulas. 0 dia 1 de tratamento corresponde ao primeiro dia em que os animais foram tratados após terem desenvolvido tumores mensuráveis. Cada grupo de 5 animais foi injectado como indicado, subcutaneamente, num local adjacente ao tumor (peritumoraImente) num volume de veiculo de 0,10 ml. O(s) grupo(s) de controlo foi(foram) injectado(s) quer com albumina do soro de bovino (2> g) purificada por cromatografia liquida de alta pressão, quer com péptido sintético (200 ng) correspondendo a uma região em laçada do factor de crescimento epidérmico (resíduos 11-21). 0 tamanho do tumor foi medido com um compasso medidor de calibres em três dimensões antes das injecções subsequentes nos dias indicados na abcissa. Os valores para cada ponto representam o volume de tumor médio. O TGF-βΙ e o TGF-02 foram

318

5624-071-118

-14purificados até à homogeneidade a partir de osso de bovino como previamente descrito (Massaque et a 1., 1986, Proc. Nat. Acad. Sei.. 83:8206-8210; Sporn et al,, 1983. Science 219:1329) e estabilizados com um excesso dez vezes maior de albumina de soro de bovino. As quantidades totais de cada factor administradas durante a duração desta experiência particular foram de 1,4 /i g por anima 1.

FIG. 22. Resposta à dose de inibição do TGF-βΙ de tumores do carcinoma humano A549 em ratinhos pude.o protocolo é idêntico ao da descrição da FIG. 21 exceptuando que o tamanho do tumor inicial no dia 1 de tratamento (dia 25 após a inoculação das 3 células tumorais) foi maior (20 mm ). Os grupos de animais de controlo foram injectados com BSA; os grupos de animais tratados receberam 5 injecções de três em três dias de 12,5, 50 ou 200 ng de TGF-βΙ administrado peritumoralmente durante um período de 15 dias. Os valores representam o volume médio de tumor de cada grupo de animais no dia 15.

FIG. 23. Fotografia de ratinhos nudé'com carcinoma do pulmão A549, não tratado e tratado com TGF-βΙ. O topo da fotografia é o animal de controlo com um grande tumor subcutâneo no dia 20 (fotografia actual de ratinhos da experiência descrita na FIG.21); a base da fotografia é representativa do animal do grupo tratado com TGF-βΙ (mesma experiência). 0 inserido (direita superior) mostra tumores excisados de animais de controlo (esquerda) e tratados (direita). (As diferenças de tamanho na fotografia entre os tumores em animais e após excisão reflectem a diferença no alcance da câmara).

FIG. 24. Exame histológico de tumores excisados de animais simulados e tratados com TGF-βΙ. Os tumores recentemente excisados (dia 20 de tratamento, FIG. 21) foram fixados em formalina tamponada embebida em parafina, seccionados e corados com tricromo de Gamori Secção de tumor derivado de animais simulados. Painel A (20x), Painel C (lOOx). Secção de tumor derivado de animais tratados com TGF-βΙ. Painel B (20x), Painel D (lOOx). Painel D inserido; parede de vaso de secção de tumor derivado de animais tratados com TGF-βΙ (lOOx).

3ie

5624-071-118 «·

-15FIG. 25. Modelo de coloração de secções de tumor do pulmão humano fixadas de animais simuladas e tratados com TGF-βΙ. Secções de tumores derivados de animais simulados corados com PAS (Painel A). 100x; com azul de Alcian (Painel C) lOOx; secção de tumor derivada de animais tratados com TGF-βΙ corados com PAS, (Painel B) ÍOOx, azul de Alcian (Painel D) lOOx.

FIG. 26. Electroforese proteínas precursoras TGF-βΙ 17. (A) Diagrama de linhas em gel de SDS-poliacrilamida das libertadas pelas células do clone da proteína TGF-βΙ; ΐ , indica os sítios de glicosilação que estão fosfori1ados; ΐ , indica os sítios de glicosilação não fosfori1ados. Os sobrenadantes, isentos de células, de células do clone 17 foram marcados com e .32, [³^S]-metionina e [³^S]-cisteína (B), [³H]-glucosamina (C), [³H]

-manose (D) [ P]-fosfato (E) em meios isentos de soro; as amostras foram processadas e analisadas num gel de gradiente de SDS-po1iacri1amida de 7,5-15% (B e C), ou num gel de SDS-poliacrilamida a 15% (D e E).

FIG, 27. Digestão com N-glicanase de proteínas precursoras

TGF-βΙ produzidas pelas células do clone. (A) Os sobrenadantes 35 isentos de células marcados com [ S] foram processados, tratados com N-glicanase e analisados num gel de gradiente de SDS-poliacrilamida de 7,5-15%: faixa 1, sem enzima; faixa 2, mais N-glicanase. (Β) O mesmo que em A, exceptuando que o marcador foi o [³²P]-fosfato.

FIG. 28. Sequências de aminoácidos de glicopéptidos precursores do TGF-βΙ. São indicados os péptidos obtidos por clivagem com protease VB de S. aureus (E), e tripsina (T). 1 , indica os sítios de glicosilação que estão fosfori1ados; T , indica sítios de glicosilação não fosforilados. A numeração refere-se à posição do glicopéptido particular na sequência completa do precursor TGF-βΙ.χ, resíduo não identificado.

FIG. 29. Cromatografia de penetração em gel de péptidos CNBr 32 de precursor TGF-βΙ marcado com [ P]. Cromatografia numa coluna Bio-sil TSK250 (7,5 x 600 mm). Modelo de eluição de 650 pmol de precursor TGF-βΙ S-piridiIetilado e de 165 000 cpm de precursor

318

5624-071-118

32_τ

-16[~~Ρ]-TGF-βΙ S-piridiletilado clivado com CNBr. As fracções 32 indicadas foram medidas pela radioactividade do [ Ρ] (-o-). A linha a cheio dá a absorvância da proteína a 214 nm. As proteínas seguintes foram utilizadas como marcadores .· χ-lactoglobul ina (Mr 18 400), citocromo C (Mr 12 300), e insulina (Mr 5 700). Os picos referem-se aos péptidos CNBr; os números daquele fragmento particular na sequência precursor do TGF-βΙ (Sharples et a 1 , , 1987, DNA designados por um M referem-se à posição completa do

6:239-244).

FIG. 30.

Cromatografia líquida de alta pressão de inversa de péptidos de protease V8 de 5. aureus do péptido

M(39-113). Cromatografia numa coluna RP-300 (2,1 x 30 mm) de eluição de 370 pmol de M(39-113) contendo 12 500 32 [ P]-M(39-113) digerido com protease V8 de S. aureus. A fase CNBr . Modelo cpm de eluição dos péptidos foi realizada com um gradiente linear de 2 horas de ácido trifluoacético a 0,1% em água até 60% de acetonitrilo contendo ácido trif1uoacético 0,08%, com um caudal de 100 1/minuto, a 35 °C. 0 material que absorve em UV foi controlado pela 32 absorvância a 215 nm (---). A radioactividade do [ Ρ] (-o-) foi determinada num contador de cintilação de líquido LS 6800 (Beckman). Os picos designados por um E referem-se aos péptidos de protease V8 sujeitos a degradação de Edman.

FIG. 31. Cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa de péptidos de protease V8 de 5. aureus e de péptidos de tripsina do péptido CNBr M(134-253). Cromatografia numa coluna

RP-300 (2,1 x 30 mm). (A) Modelo de eluição de 400 pmol de

M(134-253) contendo 44 000 cpm de [ Ρ]-Μ(134-253) digerido com protease V8 de 5. aureus. (B) Modelo de eluição de péptidos de tripsina derivados do grupo A (FIG. 31A) contendo 3 100 cpm de 32 [ Ρ]-Ε(170-194). As condições de cromatografia são descritas na legenda para a FIG. 30. Os picos designados por um E referem-se aos péptidos de protease V8, e os picos designados com um T referem-se aos péptidos tripsina sujeitos a degradação de

Edma n.

FIG. 32. Identificação da precursoras TGF-βΙ marcada manose-6-fosfato (A) Proteínas foram hidrolisadas com . 3 2 „ com [ P /· /

5624-071-118

acido durante 2 horas. Os produ) com fosfoaminoácidos nao radio; separados por electroforese a pl Mostra-se um autorradiocrama . A com ma nos e-5rtocona lmente , ca arr : os tato e a pH 3,5. i direita na parte de baixo (cabeça de seta). Estão assinaladas a manose-6fosfato (M6P). a fosfosserina (PS), a fosfotreonina (PT), a

O '‘ t f osf ot i ros i na (PY) e o fosfato inorgânico (Pi). 0 [“^P] foi deteetado comigrando a manose-6-fosfato e o Pi. e nas posições esperadas para os fosfo-oliqossacáridos (cabeças de seta pequenas). (B) Análises similares de produtos de hidrólise de 1 precurhora de (B) E(76-91) e (C) E(134-139). (D) As proteínas soras TGF-βΙ marcadas com ( P] foram hidrolisadas e separadas por electroforese a pH 8,9 seguida por cromatografia.

FIG. 33A. Análise em gel de SDS-po1iacri1amida do péptido de brometo de cianogénio purificado MÍ134-253). 0 M(134-253) foi fraccionado num gel de SDS-poliacrilamida a 15% sob (1) condições de não redução ou, (2) de redução, e corado com azul brilhante de Coomassie R-250. Os marcadores de pesos moleculares estão indicados em qui1oda1 tons.

FIG. 33B. Diagrama de linhas da pré-pró-TGF-β1. O pró-TGF-31, a região pró do precursor, e o TGF-βΙ maduro são indicados pelas faixas a, b, e c, respectivamente. SSo indicados os resíduos CYS (C) na região pró. São mostrados os sítios contendo manose-6-fosfato (I) e os sítios não fosforilados (?) de glicosi1 ação 1igada a N.

FIG. 33C. Mutantes de percursor TGF-βΙ. Os sobrescritos indicam as posições de aminoácidos das substituições SER. Os nucleótidos não coincidentes estão em impressão forte e os codões SER novos estão sublinhados.

FIG. 33D.E. Imunomanchas de proteínas mutantes TGF-βΙ segregadas por células COS transf ectadas. Os sobrenadantes isentos de soro foram acolhidos, dialisados contra ácido acético 0,2 M, fraccionados em geles de SDS-poliacri1amida de 7,5-17,5% e analisados por imunomancha sob condições de redução (D) ou de não redução (E). As manchas foram sondadas com uma mistura de antiBAD ORIGINAL

313

24 — 071 — 11 Η

corpos — β i

181-5½

-18anti-pêptido específicos da ' e maduros (ant i-TGF-31.

região pro

As célui ai

Íanti-TGFCOS foram vector

TGF-31⁵'³-' (faixa 4). TGF-31 ^d22“ q o o a / O o s (faixa 5). TGF-pX (faixa 6), e TGF-pl ^z (faixa 7) tra rie -f t ;o:

vector (~H3K) s') iaixc ou codificando o TGF-βΙ (faixa S225 faixa 1 contem sobrenadantes de células COS não transfectadas pesos moleculares padrões estão indicados em qui1oda1 tons.

A

Os

FIG. 33F.G. Identificação de proteínas precursoras e de proteínas maduras TGF-pl mutantes. Os sobrenadantes de células

COS transfectadas com 7ΓΗ3Μ (faixa 2), pTGF-pl (faixa 3), pTGFS33 q?o>3 coqr

-31 (faixa 4), pTGF-pl°““^J (faixa 5), pTGF-fl (faixa 6) ou

S2Ô3/227 pTGF-31 “ (faixa 7), foram coibidos e processados como se descreve para a FIG. 33D,E. As imunomanchas foram realizadas sob condições de não redução ccm anticorpos específicos para (F) as sequências maduras (anti-TGF-31359-331)> ou (θ) a região pró (anti-TGF-31_Q1_g^). A faixa 1 contem sobrenadante de células COS não transfectadas. Os pesos moleculares padrões estão indicados em qui1oda1 tons.

125

FIG. 34. Ligação do precursor TGF-βΙ marcado com I ao receptor da manose-6-fosfato purificado. 0 receptor da manose-6-fosfato-IGF-II humano purificado (Roth et a 1 . , 1987 Biochem.

Biophys. Res. Commun. 149:600-606) foi adsorvido em cavidades de microtítulo revestidas com anticorpos para este receptor. Adicio175 nou-se o precursor TGF-βΙ marcado com “ I (100 000 cpm por cavidade) na presença das concentrações indicadas de competidores não marcados. Após 3 h a 4 °C. as cavidades foram lavadas, recortadas, e contadas. Os resultados são médias de cavidades duplicadas que diferem em menos de 10¾ e que são representativos de três experiências. Em cavidades não contendo competitor (0¾ de inibição) ligou-se 5.2¾ de ligando marcado. TGF, precursor TGE-01: M1P, manose-l-fosfato. M6P, manose-6-fosfate.

FIG. 35. A insulina estimulou o aumento na ligação de IGF-II e de precursor TGF-31 recombinante aos adipócitos de ratazanas.

Os adipócitos de ratazanas, pré-tratados ou não com insulina, 125 foram incubados quer com precursor I-TGF-βΙ recombinante (4.9 ⁴

125 4 x 10 cpm) quer com I-IGF-II (4,2 x 10 cpm). Para avaliar a

BAD ORIGINAL ft

7b 318

5624-071-118

-19ligação não específica, foram incluídos o IGF-II lOOnM ou a manóP 3 mM como indicado. Os resultados são médias de determinações em triplicado.

FIG. 36. Ligação de IGF-II e de precursor TGF-βΙ recombinante às células CHO e células CHO sobre-exprimindo o receptor de IGF-II/man6P humano (CHO-IGF-IIR). As células foram

125 4 incubadas quer com I-IGF-II (8,0 x 10 cpm) quer com precursor

125 5

I-TGF-βΙ recombinante (1,3 x 10 cpm) e onde indicado, foi incluída quer man6P 5 mM quer o IGF-II 100 nM para avaliar a ligaçào não específica. Os resultados são médias de determinações em triplicado.

FIG. 37. Especificidade de ligação do precursor TGF-βΙ recombinante às células CHO sobre-exprimindo o receptor

IGF-II/man6P humano. As células foram incubadas com precursor

125 4

I-TGF-βΙ recombinante (6,7 x 10 cpm) e com a concentração indicada de ligando não marcado competidor. Os resultados são médias de determinações em triplicado.

FIG. 38. Interna 1ização de precursor TGF-βΙ recombinante. As células CHO sobrexprimindo o receptor IGF-II/man6P foram

125 4 incubadas a 37 C com precursor I-TGF-βΙ recombinante (5 x 10 cpm) na presença ou ausência de man6P 5 mM. Aos tempos indicados, foram determinadas as contagens quer das células associadas totais quer das células associadas resistentes a ácidos (i.e., internaiizadas). Os resultados são médias de determinações em tripliçado.

FIG. 39. Ligação do precursor TGF-βΙ de plaquetas ao receptor IGF-II/man6P isolado. 0 receptor IGF-II/man6P purificado adsorvido às cavidades de micrctitulo foi incubado com precursor 125

TGF-βΙ recombinante marcado com I na presença das concentrações indicadas, quer de TGF-βΙ latente purificado de plaquetas (o ) quer de TGF-βΙ recombinante ( ). Após 3 h. a 4 C, determinou-se a quantidade de radioactividade ligada ao receptor.

FIG. 40. Ligação do receptor IGF-II/man6P ao precursor TGF-βΙ recombinante mas não ao TGF-βΙ das plaquetas: análise de mancha Western. Sujeitaram-se a e1ectroforese o precursor TGF-βΙ

318

5624-071-118 ti *>· „L.

//L

-20recombinante (R) (0,5yUg) e o de plaquetas (P) (2,5yUg) num gel de SDS-poliacri1amida reduzido, transferiram-se para um filtro de nitrocelulose e fizeram-se reagir quer com anticorpos anti-péptidos específicos para uma sequência no precursor (esquerda) quer com o receptor IGF-II/man6P e anticorpos para o receptor (direita). A presença de anticorpos de coelho ligados foi detectada com fosfatase-a1 ca 1ina conjugada com lg anti-coelho e com um corante histoquimico para a fosfatase-a1 ca 1ina. A posição dos marcadores de peso molecular (em qui1oda1 tons) está indicada por setas. As posições do precursor não clivado recombinante (a), fragmento de precursor recombinante (b), e fragmento de precursor de plaquetas (c) estão também indicadas.

FIG. 41. Identificação do TGF-βΙ imunorreactivo de células de CHO tratadas com tunicamicina (TU) e de células CHO não tratadas. As células cultivadas até à confluência em cultura completo foram tratadas com 2,5y^g/ml de TU meio de com uma concentração final de dimetilsulfóxido de 0,1% (v/v) durante 4 h. Adicionou-se então meio isento de soro contendo TU e recolbeu-se células de controlo só receberam (v/v). Para as proteínas segregadas, a passadas 24 h. As dimetilsulfóxido a 0,1% meio foi dialisado contra ácido acético 0,1 M, seco e analisado por imunomancha. As letras a, b e c indicadas no centro da imunomancha indicam as três formas do TGF-βΙ. Esta imunomancha representa proteínas segregadas a partir de 2 x 10 células em 1 ml de meio. Para a forma associada celular de TGF-βΙ, colheram-se 5 5 x 10 células e analisaram-se por imunomancha. Os anticorpos utilizados eram uma mistura de anticorpos específicos anti-péptido precursor e maduro (Secção 7.1.8., infra).

FIG. 42. Evolução no tempo da secrecção de TGF-βΙ pela linha de células CHO transfectadas com TGF-B3-2000 do clone 17. (A) SDS-PAGE de meio condicionado recolhido em vários instantes de células CHO marcadas por pulsação. As células marcadas por impulsos durante 0,5 h com uma combinação de [35—C]-cisteína e (35-S)-metionina. 0 meio foi fraccionado num gel de gradiente de SDS-poliacrilamida de 7,5-20% sob condições de redução. As proteínas marcadoras (kD) estão localizadas à direita da figura.

318

5624-071-118

-21(B) Quantificação do TGF-βΙ segregado a partir de células de CHO em vários instantes. Uma vez que a proporção de TGF-βΙ maduro para a quantidade de precursor TGF-βΙ não variou durante a secrecção, os niveis relativos de factor de crescimento recombinante segregado foram medidos por varrimentos densitométricos do TGF-βΙ de 12 kD observado nas fluorograficas. Cada ponto representa a média de experiências em triplicado e inclui o desvio padrão. A quantidade relativa de TGF-βΙ maduro segregado após 20 h foi considerado como 1,0.

FIG. 43. Efeitos dos inibidores de glicosilação na secrecção de TGF-βΙ em células CHO. (A) Foram incubadas culturas confluentes de células em meio deficiente em soro, metionina e cisteina, durante 1 h antes de uma pulsação de 0,5 h com [35-S]-cisteina e [35—S]-metionina. Foram utilizados inibidores às concentrações seguintes; SW 0,25 mM, CA 0,52 mM, dN 4 mM, dMM a 4 mM e TU 6 y<M. A seguir a uma gravação de 6 h, o meio condicionado foi fraccionado em geles de SDS-poliacri1amida e f1uorografado. Os marcadores são idênticos aos que se descreveram na FIG. 41. (B) Quantificação do factor de crescimento recombinante segregado por células CHO a seguir ao tratamento com os inibidores. A quantidade relativa de factor de crescimento foi determinada por varrimentos densitométricos das fluorograficas. Os resultados são de 3 experiências independentes ilustrando-se os desvios padrões. A quantidade relativa de TGF-βΙ maduro em células CHO de controlo foi considerada com 1,0.

FIG. 44. Digestão de proteínas TGF-βΙ segregadas a partir de células tratadas com inibidor com enzimas de adaptação glicosilacional. 0 meio de cultura condicionado das células CHO transfectadas, marcadas com [35-S]-metionina e [35-S]-cisteina, foi recolhido após uma gravação de 6 h e digerido com endo H, neuraminidase, ou N-glicanase. Os produtos de digestão foram fraccionados em geles de gradiente de poliacri1amida de 7,5%-20%, de redução, e f1uorografados. Os marcadores designados à esquerda e direita das fluorografias são idênticos aos que se descreveram na FIG. 41.

FIG. 45. Fosforilação de precursores TGF-βΙ de células CHO 'Câ’·'

3ie

5624-071-118

-22tratadas com os inibidores de glicosilação. As culturas confluentes de células CHO do clone 17 TGF-33-2000 foram marcadas com [32-P]-ortofosfato e processadas como se descreve na Secção 12.1., aqui et seq. . 0 meio de cultura marcado foi recolhido e removeu-se o excesso de [32-P]-ortofosfato com uma coluna de dessa 1inízagão Sephadex G-25. As proteínas marcadas com 32-P foram fraccionadas por SDS-PAGE redutora e autorradiografadas.

As proteínas marcadoras (kD) estão localizadas à direita da autorradiografia e as letras a e b, que se mostram à esquerda, representam os polipéptidos precursores TGF-βΙ.

FIG. 46. O mutante de delecção deficiente nos três sinais de glicosilação não é segregado a partir das células. (A) Diagrama para a construção de um mutante de delecção de TGF-βΙ deficiente nas sequências de sinal de glicosilação e sua inserção no plasmídeo de expressão transiente CDM8. Utilizou-se Sac II para remover o ADN que codifica as três sequências de glicosilação do

TGF-01. Esta delecção resulta na remoção da estrutura de 160 aminoácidos; a proteína mutante é fundida entre a Arg-50 e a Gly-211 utilizando a nomenclatura de numeração de Sharples et a 1. e será designada por TGF-βΙΔ51-210. (B) Expressão transiente de

TGF-βΙ Δ 51-210 em células Cos-1. As células Cos-1 foram cultivadas até à semi-confluência e transfectadas com CDM8 contendo inserido de ADNc de TGF-βΙ Δ 51-210. As condições de transfecção foram as que se descrevem na Secção 12.1.7., infra. Incubaram-se as células 48 h após a transfecção em meio deficiente em soro e recolheram-se 48 h mais tarde. 0 meio condicionado foi dialisado contra ácido acético 0,1 M, secou-se e analisou-se por imunomancha utilizando anticorpos específicos anti-péptido para o TGF-βΙ precursor e maduro.

FIG. 47. Os ionóforos ou bases fracas, que afectam o pH i ntra lisossomal inibem o processamento proteolítico da molécula TGF-βΙ em células CHO, (A) Análise de SDS-PAGE de meio condicionado recolhido após uma gravação de 6 h. As células foram tratadas às concentrações indicadas. Os marcadores à esquerda e à direita da figura são idênticos aos que se mostram na FIG. 41. (B) Avaliação quantitativa do processamento proteolítico das

318

5624-071-118

-23moléculas TGF-βΙ segregadas. Para estas experiências, trataram-se as células com cloroquina 200 χχΜ, monensina 1 /< M ou cloreto de amónio lOmM. As quantidades relativas de factor de crescimento recombinante foram calculadas por varrimentos densitométricos da fluorografia por adição do TGF-βΙ total segregado e normalização dos níveis do factor de crescimento recombinante. Após normalização, determinou-se a quantidade de TGF-βΙ maduro presente por densitometria e indicou-se o nível de processamento proteolítico. Cada ponto representa três experiências independentes e inclui o desvio padrão. 0 processamento relativo do TGF-βΙ recombinante de células de controlo é tratado como 1,0.

FIG. 48. Tratamento com glicosidade de polipéptidos TGF-βΙ recombinantes segregados a partir de células CHO que tinham sido tratadas com cloroquina, monensina, e cloreto de amónio. O meio condicionado de células do clone 17 TGF^3-2000 marcadas por pulsação e incubadas com cloreto de amónio (lOmM), cloroquina (200 Jj. M) ou monensina (1 M) foi tratado com Endo H, neuraminidase, ou N-glicosidase. Os produtos de digestão foram analisados por SDS-PAGE e fluorografia. Os marcadores foram os que se descreveram na FIG. 41.

FIG. 49. A activação, induzida pelo interferão gama, de LnTGF-βΙ por monócitos é dependente da dose. Os monócitos (2 x 10^ células/ml) foram cultivados em placas de microtítulo de 96 cavidades Costar com 5 p g/ml de rTGF-βΙ latente purificado (LnTGF-βΙ), na ausência (controlo) ou presença de concentrações crescentes de rY INF de 10 a 1000 U/ml. Adicionou-se citoquina às cavidades de cultura simultaneamente com o LnTGF-βΙ e os sobrenadantes foram colhidos 24 h mais tarde e ensaiados para avaliar a actividade. TGF-β utilizando o ensaio de inibição de crescimento que se descreve na Secção 7.1.6., infra.

FIG. 50. Identidade funcional do TGF-βΙ activado por monócitos, mediado por /INF, com TGF-β derivado de plaquetas. Os sobrenadantes de 24 h isentos de soro, colhidos a partir de monócitos cultivados na presença de 100 U/ml de rXINF e de 5yng/ml de actividade de LnTGF-β, foram quantificados em amostras reunidas por experimentação em diluições em série em triplicado

318

5624-071-118 'jf

-24no ensaio de inibição do crescimento que se descreve na Secção 7.1.6.. infra. utilizando um padrão de TGF-β de plaquetas conhecido. As diluições 1 og de TGF-β activado por monócitos (1, 10, 100 ng) foram então testadas num ensaio de crescimento independente da fixação de células de rim de ratazanas normal (NRK) (Twardzik et a 1 , , 1982, Science 216:894-897) na presença ou na ausência de 30 )> g/ml de um anticorpo monoclonal neutra 1 izante, ID 11.16. preparado contra TGF-βΙ de bovino como previamente se descreveu (Dasch et al., 1989, d. Immunol. 142:1536-1541). As colónias maiores do que 20 células foram marcadas em 8 campos aleatórios de baixa energia.

FIG. 51. Análise de SDS-PAGE de TGF-βΙ activado monócitos induzido por /INF. As células derivadas da linha por de em células TGF-B3-2000 original foram incubadas durante a noite

3” ’ (Amersham L-C4, 5-3H

DMEM isento de soro contendo ^H-leucina 45-70 Ci/mM, 0,5 mCi/ml). Os complexo LnTGF-βΙ marcado com descreve na Seccão 13.1.1.

sobrenadantes foram colhidos e o 3

H-leucina foi purificado como se infra. Os monócitos (1 x 10 células/ /ml) foram incubados em DMEM contendo 0,5% de soro humano com 1,6 x 10 de complexo TGF-/3lp marcado com H-leucina, na presença ou na ausência de 100 U/ml de r/-INF durante 12 h, os sobrenadantes foram clarificados e analisados por SDS-PAGE (12,5%) sob condições de não redução. Os marcadores incluíram albumina de soro de bovino, 68 kD; albumina de ovo, 45 kD; anidrase carbónica, 30 kD; citocromo C, 14 kD e TGF-β, 24 kD, e foram visualizados por coloração de prata (Dasch et a I., 1989, J. Immunol. 142: 1536-1541). A proteína marcaoa com H-leucina foi detectada por autorradiografia em filme Kodak X -omat AR com . de ι1 uminação/quadro de intensificação. Faixa A, monócitos mais /-INF, faixa B, monócitos sem /-INF.

5. Descrição do Invento presente invento refere-se ao processo de preparação de uma forma madura, biológicamente activa, de rTGF-βΙ a partir da sequência de codificação de gene precursor TGF-βΙ de símio e do seu produto. 0 TGF-βΙ biologicamente activo, maduro, pode ser

318

5624-071-118 t

-25produzido pela clonação e expressão da sequência de codificação de nucleótidos do comprimento total do TGF-βΙ de simio numa célula hospedeira que processa correctamente o precursor de modo a que produza um TGF-βΙ maduro, que tem uma actividade biológica que é virtualmente indistinguível daquela do TGF-βΙ natural autêntico.

presente invento refere-se também a uma proteína precursora rTGF-βΙ, biologicamente activa, que pode ser produzida utilizando o gene precursor TGF-βΙ de simio. Os precursores rTGF-βΙ, biologicamente activos, podem ser produzidos pela clonação e expressão da sequência de codificação de nucleótidos do comprimento total do TGF-βΙ de simio numa célula hospedeira apropriada capaz de segregar os precursores TGF-βΙ.

processo do invento pode ser dividido nas fases seguintes exclusivamente para os fins de descrição: (a) isolamento ou produção da sequência de codificação para a forma precursora de TGF-βΙ de simio; (b) construção de um vector de expressão que irá dirigir a expressão da sequência de codificação do TGF-βΙ de simio; (c) transfecção de células hospedeiras apropriadas que são capazes de replicação e expressão do gene e processamento do produto de gene para produzir a forma biologicamente activa, madura, do TGF-βΙ e/ou os precursores TGF-βΙ; e (d) identificação e purificação dos precursores TGF-βΙ e do TGF-βΙ, biologicamente activo, maduro.

Uma vez identificado um transfectante que exprime níveis elevados de precursores TGF-βΙ e/ou de TGF-βΙ maduro, bioactivo, a prática do invento envolve a expansão daquele clone e o isolamento do produto de gene expresso.

processo do invento é aqui demonstrado, por meio de exemplos em que se preparou o ADNc da região de codificação do precursor TGF-βΙ de simio e foi cionado, e sequênciado. A região de codificação foi então colocada sob controlo de elementos de controlo de expressão SV40 e utilizada para transfectar células CHO. Os transfectantes CHO produziram um rTGF-βΙ maduro com actividade biológica que era indistinguível do TGF-βΙ natural, bem como de formas precursoras biologicamente activas maiores.

Os vários aspectos do processo do invento são descritos com

316

5624-071-118

-26mais detalhe nas sub-secções abaixo e nos exemplos que se sequem.

5.1. ISOLAMENTO OU PKODUÇfiO DA REGIÃO DE

CODIFICAÇÃO DE TGF-βΙ DE SIMIOS

Na FIG. 1. descreveu-se a sequência de codificação de nucleótidos para o TGF-βΙ de símio. Na prática do processo do invento, esta sequência de nucleótidos, ou o seu equivalente funcional, podem ser utilizados para produzir as moléculas recombinantes que irão dirigir a expressão do produto TGF-βΙ. Devido à degeneração das sequências de codificação de nucleótidos, outras sequências de ADN que codificam substancialmente a mesma sequência de aminoácidos que se ilustra na FIG. 1, podem ser utilizadas na prática do presente invento para a cíonaçâo de TGF-βΙ. Estas alterações da sequência de nucleótidos da FIG. 1 incluem delecções, adições ou substituições de diferentes resíduos de nucleótidos resultando numa sequência que codifica o mesmo ou um produto de gene funcionalmente equivalente. O produto de gene pode conter delecções, adições ou substituições de resíduos aminoácidos dentro da sequência, o que resulta numa mudança silenciosa produzindo-se assim um produto bioactivo. Tais substituições de aminoácidos podem ser feitas na base de similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofi1icidade e/ou da natureza antipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos carregados negativamente incluem o ácido aspártico e o ácido glutâmico; os aminoácidos carregados positivamente incluem a lisina e a arginina; os aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregada ou grupos de cabeça não polar com valores de hidrofi1icidade similares incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina.

A sequência de codificação de nucleótidos para o TGF-βΙ pode ser obtida a partir de fontes de células de símio que produzem níveis elevados de actividade semelhante ao TGF-βΙ. A sequência de codificação pode ser obtida por cíonaçâo de ADNc de ARN isolado e purificado a partir de tais fontes celulares ou por cíonaçâo genómica. Podem preparar-se quer as bibliotecas de ADNc quer as bibliotecas genómicas de clones a partir de fragmentos de

318

5624-071-118

Α-b..ADN produzidos incluindo, mas restrição. Os com a do TGF-βΙ demonstram também

-27utilizando técnicas bem conhecidas na arte, não limitadas, à utilização de enzimas de fragmentos que codificam o TGF-βΙ podem ser identificados por exame destas bibliotecas com uma sonda de nucleótidos que é substancialmente complementar de qualquer porção da sequência que se descreve na FIG. 1. Podem se 1eccionar-se para expressão os clones a todo o comprimento, i.e., aqueles contendo a região de codificação completa para o precursor TGF-βΙ.

Numa concretização alternativa da invenção, a sequência de codificação da FIG. 1 podia ser sintetizada, no todo ou em parte, utilizando os processos químicos bem conhecidos na arte.

Nos exemplos que aqui se descrevem, a sequência de codificação de TGF-βΙ de slmio foi obtida por clonação de ADNc da sequência de codificação de precursor TGF-βΙ derivada de um ARN poliadenilado isolado a partir da linha de células de macaco verde Africano, BSC-40, que se tinha constatado que produzia níveis elevados de um inibidor de crescimento funcionalmente relacionado com o TGF-βΙ. A região de codificação completa foi sequenciada e comparada com as sequências publicadas de TGF-βΙ de humano e de murino (ver FIG. 1). A sequência de aminoácidos deduzida do TGF-βΙ de slmio maduro demonstra 100% de homologia humano maduro.

forte homologia aminoácidos diferentes entre as sequências precursoras de humano e de slmio. Interessantemente, a sequência precursora de slmio (e de murino) codifica um resíduo aminoácido a menos do que a sequência descrita para o TGF-βΙ humano (ver FIG. 1, resíduos aminoácidosnúmeros 158-159).

A notável conservação na sequência de TGF-βΙ entre espécies de simios, roedores, e humanos sugere que foi requerida uma forte pressão evolutiva, por necessidade, para conservar a importante funcionalidade. Isto aplica-se, não só á forma madura de TGF-βΙ, que tem um papel bifuncional importante como regulador de crescimento, mas também à região polipeptídica do precursor, a montante da sequência TGF-βΙ madura, que pode também exibir actividades moduladoras de crescimento coordenadas.

As sequências precursoras de sequência só com cinco

318

5624-071-118

-28A espécie mais importante de ARNm de TGF-βΙ nas células BSC-40 tem 2,5k.b, de acordo com os resultados obtidos para as mensagens específicas de TGF-βΙ de murino e de humano (FIG. 2). As faixas menores observadas a 4kb e a l,45ko podem representar, quer os transcritos aberrantemente processados,quer os que podem codificar uma molécula semelhante a TGF-βΙ (CIF-B) recentemente descrita por Seyedin (1987. J. Biol. Chem. 262: 1946-1949) que contém uma homologia extensa para o TGF-βΙ.

A sequência de polipéptidos deduzida dos clones de símio de humano, e de ratinho contém uma externa adjacente, muito idêntica, de 14 resíduos hidrofóbicos nas posições 8-21 que podem constituir um péptido de sinal amino-termina 1. Adicionalmente, um dipéptido Arg-Arg precede imediatamente o terminal amino de TGF— BI maduro sugerindo sítios de clivagem proteolítica similares. 0 precursor TGF-βΙ de símio contém também três sítios de N-glicosilação potenciais que não se encontram na molécula madura. Assim, não só foi conservada a estrutura primária do polipéptido maduro e de precursor de TGF-βΙ entre as espécies, mas também sítios de modificação pós-tradução distintos.

As células BSC-40 sintetizam e libertam níveis elevados de TGF-βΙ relativamente a outras linhas de células que se testaram. Os meios condicionados por células BSC contêm uma actividade que, na presença de níveis de nanogramas de EGF e TGF-alfa, estimula o crescimento, independente da fixação, de células NRK e exibe características bioquímicas idênticas às do TGF-βΙ purificado a partir de plaquetas humanas (Frolik et a 1., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 3676-3680; Roberts et a 1. , 1983, Biochemistry 22:5692-5698). Adicionalmente, descreveu-se o isolamento de um inibidor de crescimento, a partir de células BSC-1, funcionalmente similar ao TGF-βΙ que compete com o TGF-βΙ derivado de plaquetas na ligação aos receptores de membrana TGF-βΙ (Tucker et a 1 . , 1984, Science 226:705-707). A grande quantidade de ARNm especifico de TGF-βΙ sintetizado pelas células BSC-40, uma linha de células derivada de células BSC-1, sugere que o modulador de crescimento bifuncional identificado por Tucker et a 1. em meios condicionados por BSC-1 é de facto o TGF-βΙ. Isto é também demonstrado por resultados recentes, que confiram as observações de

318

5624-071-118 ν '

y.

Ff

-29Tucker et a 1 . , de que o TGF-βΙ de outras fontes inibe também o crescimento de algumas células de tumor em cultura (Roberts et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:119-123). Contudo, a prova formal de que o inibidor derivado de BSC-1 é de facto o produto do gene que aqui se descreve requererá a análise da sequência de actividade semelhantes ao TGF-βΙ libertada pelas células BSC-1 em cultura.

5.2. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO

CONTENDO A SEQUENCIA DE CODIFICAÇÃO TGF-1

De forma a exprimir uma forma madura, bio 1ogicamente activa, do TGF-1, deverá escolher-se um sistema de vector de expressão/ /hospedeiro que proporcione, não só niveis elevados de transcrição e tradução, mas também o processamento correcto do produto de gene. Isto é especialmente importante quando se utiliza a sequência de codificação completa do precursor TGF-βΙ de slmio nas estruturas de expressão, porque a forma madura de TGF-βΙ parece ser derivada do produto precursor após os acontecimentos de processamento celular. 0 esquema de processamento proposto é apresentado na FIG. 20. Adicionalmente, pode se 1eccionar-se um sistema de expressão/célula hospedeira que proporcione a secreção do produto.

Em particular, parece que o TGF-βΙ maduro, um homodlmero ligado por dissulfureto de 112 aminoácidos por sub-unidade, é formado por processamento celular envolvendo a clivagem proteolítica do precursor de comprimento total nos aminoácidos

Arg-Arg (resíduos números 277 e 278 na FIG. 1). Adicionalmente, o precursor TGF-βΙ de slmio contém três sítios de N-g1icosi1 ação potenciais que não se encontram na forma madura e a análise de 3 sobrenadantes isentos de soro marcados com [ H]-glucosamina de uma linha de células de ovário de criceto Chinês que segregam níveis elevados de TGF-βΙ recombinante, indica que o precursor TGF-βΙ, mas não a forma madura, está glicosilado. Assim a glicosilação adequada do precursor pode ser importante para a síntese celular e libertação ou secreção da molécula madura. 0 precursor TGF-βΙ, mas não a forma madura, está também fosforilado, sugerindo adicionalmente a importância funcional do precursor. Além

31S

5624-071-118

-30disso, a forma madura de TGF-ίΊ compreende um dímero ligado por dissulfureto envolvendo nove resíduos de cisteina por subunidatíe. Alguns destes estão envolvidos em ligações dissul furetc· interccdeias e outros em ligações dissulfureto intracadeias o que afecta a estrutura terciária e a configuração da molécula madura, e. como um resultado. a sua actividade biológica.

capacidade de uma célula hospedeira utilizada no

Assim, s istema ci tomega1ovisistemas de a

de expressão para exprimir e processar correctamente o produto de gene TGF-βΙ de símio é importante para a produção de um TGF-01 maduro, biologicamente activo.

Nos exemplos que aqui descrevem, a forma bioactiva madura de TGF-βΙ foi produzida comi êxito utilizando elementos de controlo da expressão do vírus de símio 40 (SV40) num sistema de células hospedeiras de ovário de criceto Chinês (CHO). Contudo, uma variedade de outros sistemas de animal hospedeiro/vector de expressão (i . e . , vectores que contêm os elementos necessários para dirigir a replicação, transcrição e tradução da sequência de codificação de TGF-βΙ numa célula hospedeira apropriada) podem ser utilizados igualmente bem pelo perito na arte. Estes incluem, mas não estão limitados a, sistemas de vector de expressão de vírus/célula hospedeira de mamífero (por exemplo, rus, vírus vacina, adenovírus, e semelhantes);

vector de expressão de vírus de insecto/células de insecto (por exemplo, bacu1ovírus); ou sistemas de expressão de promotor não virai derivados dos genomas de células de mamífero (por exemplo, o promotor metalotionina de ratinho).

Os elementos de expressão destes vectores variam na sua força e especificidade. Dependendo do sistema de hospedeiro/vector utilizado, pode ser utilizado qualquer um de um número de elementos de transcrição e tradução adequados. Por exemplo, aquando da clonação em sistemas de células de mamífero, podem usar-se promotores isolados a partir do genoma de células de mamífero, (por exemplo, promotor metalotionina de ratinho) ou a partir de vírus que crescem nestas células, (por exemplo, promotor de 7,5K do vírus vacina). Os promotores produzidos por técnicas de ADN recombinante ou sintéticas podem também ser utilizados para proporcionar a transcrição das sequências inseridas.

BAD ORIGINAL tf

I

313

5624-071-118

-31São também requeridos sinais de iniciação específicos para a

incluindo o seu próprio codão de iniciação e sequências adjacentes ,· são inseridos nos vectores de expressão adequados, podem não ser necessários sinais de controlo de tradução adicionais. Contudo, nos casos onde apenas uma porção da sequência de ‘codificação é inserida, devem ser proporcionados os sinais de controlo da tradução exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG. Além disso, o codão de iniciação deve estar em fase com a estrutura de leitura das sequências de codificação de TGF-βΙ para assegurar a tradução de todo o inserido. Estes sinais de controlo da tradução exógenos e codões de iniciação podem ser de uma variedade de origens, quer naturais quer sintéticas. A eficiência de expressão pode ser aumentada pela inclusão de sequências de atenuação da transcrição, de elementos de aumento, etc .

Qualquer um dos processos previamente descritos para a inserção de fragmentos de ADN num vector, pode ser utilizado para construir vectores de expressão contendo o gene TGF-βΙ e sinais de controlo da transcrição/tradução adequados. Estes processos podem incluir técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinações in vivo (recombinação genética).

Nos casos onde é utilizado um adenovírus como um vector de expressão, a sequência de codificação de TGF-βΙ pode ser ligada a um complexo de controlo da transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência lider tripartida. Este gene quimérico pode então ser inserido no genoma de adenovírus por recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, a região EI ou E3) resultará num vírus recombinante que é viável e que é capaz de exprimir o TGF-01 em hospedeiros infectados. Similarmente, pode ser utilizado o promotor de 7,5K de vacina.

Um sistema de insecto é um sistema de expressão alternativo que pode ser utilizado para exprimir o TGF-βΙ. Num tal sistema,

318

5624-071-118

-32utiliza-se o vírus da poli-hedrose nuclear da Autographa ca 1i forni ca (AcNPV) como vector para exprimir genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência de codificação de TGF-βΙ pode ser cionada em regiões não essenciais (por exemplo o gene po1i-hedrina) do vírus e colocada sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor poli-hedrina). A inserção bem sucedida da sequência de codificação de TGF-βΙ resultará na inactivação do gene poli-hedrina e na produção de vírus recombinante não-obstruído (i.e., vírus revestimento proteináceo codificado Estes vírus recombinantes são então células Spodoptera frugiperda nas quais se exprime o gene inserido .

deficiente no poli-hedrina). para infectar pelo gene utilizados

Adicionalmente, pode escolher-se uma estirpe de células hospedeiras que modula a expressão das sequências inseridas, ou que modifica e processa o produto de gene da maneira especifica desejada. A expressão de certos promotores pode ser elevada na presença de certos indutores, (por exemplo iões zinco e de cádmio para os promotores de metalotioneína). Deste modo, pode controlar-se a expressão do TGF-βΙ geneticamente construído. Isto é importante se o produto de proteína do gene estranho clonado é letal para as células hospedeiras. Além disso, as modificações (por exemplo glicosilação) e o processamento (por exemplo, a clivagem) de produtos de proteína são importantes para a função da proteína. As células hospedeiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o processamento e modificação pós-tradução de proteínas. As linhas de células ou os sistemas hospedeiros adequados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento correctos da proteína estranha expressa.

5.3. IDENTIFICAÇÃO DE TRANSFECTANTES OU

TRANSFORMANTES QUE EXPRIMEM

PRODUTO DE GENE TGF-βΙ

As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação de TGF-βΙ de símio e que exprimem o produto maduro, biologicamente activo, podem ser identificadas pelo menos por quatro aproximações gerais: (a) hibridação ADN-ADN; (b) presença ou

318

5624-071-118

-33ausência de funções de gene marcador; (c) avaliação do nível de transcrição como medida pela expressão dos transcritos de ARNm de TGF-βΙ na célula hospedeira; e (d) detecção do produto de gene maduro tal como é medida por imunoensaio e, finalmente, pela sua actividade biológica.

Na primeira aproximação, pode detectar-se a presença da sequência de codificação do TGF-βΙ de símio inserida no vector de expressão por hihridização de ADN-ADN utilizando sondas compreendendo as sequências de nucleótidos que são homólogas á sequência de codificação de TGF-βΙ de símio substancialmente como se mostra na FIG. 1, ou suas porções ou derivados.

Na segunda aproximação, o sistema de vector de expressão recombinante/hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou na ausência de certas funções de gene marcador (por exemplo, actividade da timidina-quinase, resistência aos antibióticos, resistência ao metotrexato, transformação fenotípica, formação de corpo de obstrução em baculovírus, etc.). Por exemplo, se a sequência de codificação de TGF-βΙ estã inserida na sequência de gene marcador do vector, podem ser identificados recombinantes contendo a sequência de codificação de TGF-βΙ pela ausência da função de gene marcador. Alternativamente, pode ser colocado um gene marcador em tandem com a sequência de TGF-βΙ, sob o controlo do mesmo, ou de um promotor diferente do utilizado para controlar a expressão da sequência de codificação do TGF-βΙ. A expressão do marcador em resposta á indução ou selecção indica a expressão da sequência de codificação do TGF-βΙ.

Na terceira aproximação, a actividade de transcrição para a região de codificação de TGF-βΙ pode ser avaliada por ensaios de hibridização. Por exemplo, pode isolar-se o ARN poliadeni1ado e pode analisai—se por manchas Northern utilizando uma sonda homóloga para a sequência de codificação de TGF-βΙ ou suas porções particulares. Alternativamente, os ácidos nucleícos totais da célula hospedeira podem ser extraídos e ensaiados para avaliar a hibridização com estas sondas.

Na quarta aproximação, a expressão do produto de proteína madura pode ser avaliada imunologicamente, por exemplo por •w·’

7

5624-071-1 IS

-τ* manchas Western, por finais d o aetecçco ct produto de gene ibr~pl biologicamente activo a célula hospedeira segrega o produto de gene, os meios

y....

-34iaunoensaios tais como rádioimunoprecipi nsaios ligados a enzima e semelhantes. Os test acesso do sistema de expressão envc-lvem contado, on ·> rs?r>*nt «s· ft.rtivri Quar:G~ isentos de células, obtidos a partir da células hospedeira transfectante cultivada, podem ser ensaiados em relação ã actividade do TGF-βΙ. Quando o produto de gene não é segregado, os lisados de células podem ser ensaiados relativamente a essa actividade. Em qualquer um dos casos podem utilizar-se ensaios biológicos ensaio de inibição de crescimento aaui descrito ou a célula:

tais como o estimulação alvo, que do crescimento independente da fixação em também aqui se descrevem ou semelhantes.

Uma vez identificado um clone cue produz níveis elevados de TGF-βΙ maduro, bio 1ogicamente activo, o clone pode ser expandido e o TGF-βΙ pode ser purificado utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Estes métodos incluem purificação por imunoafinidade, métodos cromatográficos incluindo a cromatografia líquida de alta pressão, e semelhantes.

Apesar do facto de a sequência de aminoácidos do precursor TGF-βΙ de símio diferir um pouco do precursor humano previsto, a sequência de aminoácidos da forma madura, biologicamente activa, do TGF-βΙ de símio, produzida de acordo com o invento, é idêntica à da forma madura humana. Adicionalmente, o TGF-βΙ de símio do invento tem uma actividade biológica que é indistinguível da do TGF-βΙ natural. Isto indica que os sistemas de expressão/cé1u1 a invento são capazes de processar o produto de modo a produzir uma molécula com actividade hospedeira do expre:

;ao de biológica idêntica àquela do TGF-βΙ natural autêntico. Como um invento, pode ser resu11 ado, pode ser ut i1i zado o TGF-βΙ de símio, produzido de acordo com o utilizado para todas as aplicações em que o TGF-βΙ.

5.4. CARACTERIZAÇÃO INICIAL DO PRODUTO DF GENE TGF-S1

A porção amino da região precursor de TGF-βΙ humanas, de roedores e de símios mostra um grau de fontes elevado de homologia (Derynck et a 1.. 1985, Nature 316:701-705; Derynck bad original $

318

5624-071-118

.. · et a 1., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379: Sharples et a 1 . . 1987. DNA 6:239-244) . suger í ndo que uma função biolOoica importante pode estar associada com esta parte da molécula. C’s dados apresentados na Secção 8, infra. demonstrando que esta porção do precursor TGF-βί está glicosilada e fosforiiada. apoiam esta ideia uma vez que se pode supor que uma célula não suportaria a realização destas modificações secundarias a não ser para uma função específica. Estas modificações podem ser importantes para a dimerização do percursor ou para a direcção do seu movimento para fora da célula: talvez esta fosfoglicoproteina esteja livre para realizar outras funções intra- ou extra-celulares. Há provas que sugerem que a glicosilação do precursor estã envolvida nc· transporte de TGF-βΙ maduro para fora da célula.

5.5. O PRECURSOR TGF-βΙ; PROCESSAMENTO CELULAR,

NATUREZA ESTRUTURAL E FUNÇÃO POSSIVEL

A clonação de ADNc de TGF-βΙ que se descreve na secção 6, infra, sugere que a molécula é submetida a uma variedade de eventos de processamento de pós-tradução antes da saída secretora (Derynck et a 1. , 1985. Nature 316:701-705; Derynck et a 1. , 1986,

J. Biol. Chem. 261:4377-4379; Sharples et_aT . , 1987, DNA

6:239-244). A purificação da proteína e as técnicas de sequenciação do terminal amino foram utilizadas para caracterizar as proteínas TGF-βΙ recombinantes produzidas e libertadas por células CHO-TGF-B1-3-2000 (Secção 8, infra).

A análise da sequência amino-termina 1 do precursor isolado e dos polipéptidos TGF-βΙ maduros, descrita na secções 8.3 e 8.4, infra, proporciona informação sobre estes eventos de processamento proteo1ítico. Os polipéptidos precursores, isolados a partir de geles de poliacrilamida reduzidos, produzem uma sequência de proteínas principal que. de. acordo com a prevista a partir do ADNc de símio (Sharples et a 1 . , 1987, DNA 6:239-244). começa na Leu-30 do precursor TGF-βΙ. Não foi observada heterogeneidade na sequência amino-termina 1 indicando uma especificidade no processa mento proteo1ítico. Este resultado implica a ligação peptídica Gly-29/Leu-30 como o sitio de clivagem de peptidase de sinal e é consistente com o previsto pelo processo bad original

318

5624-071-118 • /

-36de previsão de péptido de sinal de von Heijne (von Heijne, 1986, Nucleic Acids. Res. 14:4683-4690). Adicionalmente á clivagem do péptido de sinal, a purificação e examinação do TGF-βΙ maduro (Secções 8.2 e 8.4, infra) revelaram que o rTGF-βΙ é processado proteoliticamente no sitio de protease dibásica previsto (Sharples et a 1. , 1987, DNA 6:239-244) resultando num polipéptido maduro. Além disso, a análise de sequência de proteínas do fragmento CNBr carboxi-termina1 do TGF-βΙ maduro, sugere uma molécula intacta. Assim, as células CHO possuem as proteases adequadas necessárias para processar correctamente o pré-pró-TGF-{31.

A actividade biológica mais importante segregada por células CHO transfectadas é o factor de crescimento dimérico maduro. Os resultados apresentados na Secção 8.2., infra, indicam que mais do que 95% da actividade presente em meio condicionado de CHO é co-purificado com o rTGF-βΙ maduro, enquanto que menos do que 5% é co-purificado com o precursor rTGF-βΙ maior. Adicionalmente, o TGF-βΙ recombinante comportou-se de modo idêntico ao nTGF-βΙ e possuía uma actividade biológica específica idêntica (Secção 8.5, infra). 0 precursor rTGF-βΙ, em contraste, foi 50 vezes menos activo do que o factor de crescimento maduro. Uma comparação dos perfis de inibição de pulmão de marta mostra uma curva de dose-resposta lígeiramente alterada, sugerindo uma afinidade receptora diferente para o precursor quando comparada com a do TGF-βΙ maduro.

Embora os resultados apresentados na Secção 8.5, infra, e os que acima se discutem sugiram que o precursor rTGF-βΙ é biologicamente activo, uma análise estrutural detalhada tem revelado algumas anormalidades intrigantes, complicando as interpretações definitivas. A análise da sequência de proteínas e de SDS-PAGE, revelaram que o precursor isolado consiste em pró-TGF-βΙ, TGF-βΙ maduro, e na região pró do precursor interligada por ligações dissulfureto. A clivagem química desta mistura ligada por dissulfureto com CNBr, e a separação dos péptidos CNBr, mostra claramente que a CYS-33 do precursor forma uma ligação dissulfureto com um resíduo de cisteína do TGF-βΙ maduro (FIG. 20A). A existência da cadeia monomérica de TGF-βΙ, interligada com seΟ 70 313

5624-071-118 //

s definidas	que
biológica	de-
xo ligado··	por
a cei cc da	3 Ll o

quéncias precursoras, limita cuaisquer cenclusõi possam ser feitas relativamente à act-vidadi precursor intacto. A formação deste complf dissulfureto em células CHO levantou uma cuestã;

importância em tecidos e células que segregam naturalmente o TGF-βΙ. A secreção de nivel muito elevado de polipéptidos rTGF-Bl por células CHO. pode conduzir a uma ligação cruzada não natural devido ao artefacto de ligado por dissulfureto imoortante no nrocessamento

Cell Chem.

Baseado nos infra, é proposto

TGF-βΙ impropriamente dobrado. resultando num expressão. Alternativamente, c complexo precursor pode representar um intermediário de TGF-βΙ. Contudo, os estudos que mostram que a ligação de dissulfureto formada por CYS-33 do precursor não é necessária para a produção de TGF-βΙ bioactivo, maduro, sugerem que tais complexos podem não ser intermediários necessários (Secção 5.7 e 10, infra). Têm sido observados complexos precursores, ligados por dissulfureto, em formas isoladas latentes de TGF-βΙ (Miyazono et a 1. , 1988, J Biochem. Suppl . 12A.-200; Wakefield et a 1 . . 1987, J. Biol.

Suppl. 11Ά.-46).

resultados apresentados na Secção 8.2-8.5, o processamento de pré-pró-TGF-β1 em células

CHO transfectadas (FIG. 20B). Embora o esquema de processamento proposto não esteja completo, ele realça vários dos passos que têm sido, pelo menos, parcialmente definidos. Embora a ordem dos vários passos de processamento não tenha sido completamente caracterizada, eles são descritos como ocorrendo em série para facilitar a compreensão. O primeiro passo envolve a clivagem do péptido de sinal na ligação peptídica G1y-29/Leu-30. Esta clivagem ocorre, muito provavelmente, com a tradução durante a passagem do precursor através da membrana do retículo endoplasmático rugoso (Brobel e Dobbersteiη, 1975, J. Cel. Biol. 67:835-851;

Walter et a 1. . 1984. Cell. 38:5-8). Após a clivagem do péptido de sinal, adicionam-se unidades de glicosilação da região central (Rothman et al.. 1978, Cell. 15:1447-1454) ao pró-TGF-βΙ, a cada um dos sítios de N-g1icosi1 ação previstos, localizados em Asn-82, Asn-136. e Asnl76 (Secções 8.1 e 9). O pró-TGF-βΙ glicosilado da região central é então sequencialmente processado durante a passa

BAD ORIGINAL fí

318

5624-071-118 tu >

rf

-38gem através do complexo de golgi para render uma glicoproteína fosforilada, contendo oligossacãridos sialados, complexos. Em algum estagio durante a síntese ou passagem, ocorre a clivagem proteolítica no residuo dibásico e a isomerização do dissulfureto, libertando-se TGF-βΙ maduro.

Os resultados aqui apresentados na Secção 12., et seg. indicam que o processamento de carbo-hidrato adequado é necessário para a secreção do polipêptido TGF-βΙ a partir da linha de células TGF-B3-2000 do clone 17. Os inibidores de glicosilação que afectam os estágios iniciais de processamento de carbo-hidrato alteram drasticamente a eficiência do processo de secreção. Estudos adicionais com um mutante de delecção de TGF-βΙ, que é deficiente nos três sftios de glicosilação revelaram também defeitos na secreção, e são, muito provavelmente, deficientes na expedição intracelular e, provavelmente, acumulam-se no retículo endoplasmático. Reciprocamente, os inibidores que afectam os últimos estágios de processamento, por inibição da presença de manosidases, dentro do complexo de golgi conduzem a aumentos na secreção de TGF-βΙ. Embora os sinais envolvidos na expedição intracelular não sejam bem compreendidos, estes resultados sugerem que o processamento de carbo-hidrato é necessário para a saida secretora adequada do TGF-βΙ e que os estágios iniciais de remodelação são mais cruciais para a sua expedição intracelular. 0 próprio carbo-hidrato pode um papel directo na secreção, pelo que os receptores para as cadeias laterais de oligossacáridos podem auxiliar a dirigir a proteína através do processo secretor. Alternativamente, o carbo-hidrato pode funcionar, num papel mais indirecto, por determinação de uma confirmação específica e requerida para o transporte do TGF-βΙ.

Há dois tipos de percursos que conduzem à secreção de proteínas, os regulados e os não regulados (constitutivos). Os percursos regulados são encontrados, predominantemente, em tipos de células secretoras e requerem um estímulo externo de forma a libertar material dentro das vesículas secretoras. As células CHO transfectadas que aqui se descrevem são mais características do desempenhar especif i cos

31 S

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-39tipo não regulado. Os resultados dos baixos níveis de TGF-31 processado proteo1iticamente dentro cas células CHO não indicam acumulação ce factor de crescimento maduro, o que e compatível corn um tipo de libertação não ser segregado e libertado por um de crescimento de polipéptidos é um componente principal das plaquetas e é libertado a partir das plaquetas por tratamento com trombina.

O pró-péptido TGF-βΙ é clivado num sitio do terminal carboxilo de quatro resíduos básicos libertando TGF-βΙ maduro, regulado. O iGE-βΙ pode também percurso regulado. Este factor começando 12.. et no requerentes mostrando os (

Alfa-279. Os estudos aqui apresentados na Secção ;eq utili zando reagentes que afectam

PH de processamento não requerer-se existência são de uma os intravesicular demonstram que a clivagem ocorre dentro dos compartimentos vesiculares ácidos sensivelmente da mesma maneira que o processamento da insulina e de precursores de neuropéptido. As propriedades destas proteases geralmente bem entendidas. Pode resíduos básicos emparelhados no sítio de clivagem para proteólise eficiente. É interessante observar que em todos membros da família TGF-β recentemente identificados, o resíduo amino-termina 1 do polipéptido TGF-β maduro é precedido por vários resíduos de aminoácidos básicos. Os inibidores do processamento de glicosilação que podiam alterar a estrutura ou nenhum esta região terciária do efeito no processamento adequadamente processamento de que precedem os pode ser péptido TGF-βΙ tinham pouco proteo1ítico, sugerindo que exposta no precursor independentemente do carbo-hidrato. Os resíduos básicos múltiplos grupos amino-terminais dos membros da família TGF-β maduros podem realçar esta região para a proteólise específica.

5.6. INTERACÇfiO DO PRECURSOR TGF-β1 COM O RECEPTOR DE FACTOR DE

CRESCIMENTO SEMELHANTE A INSULINA II/MANO5E-6-FOSFATO

Os resultados descritos na infra . mostram presença de manose-6-fosfato no precursor TGF-βΙ e levantam a uma função descrevem na precursor possui adicionais que se Secção 11, et seq,, demonstram que o precursor TGF-βΙ se liga ao receptor da superfície celular do factor de crescimento semelhan!

BAD ORIGINAL possibilidade de que o independentemente. Os estudos ,z?

m·' 70 31S và/

5624-071-118

-40te a insulina II/manose-ó-fosfato. Este estudos 'apresentam também provas de cue o precursor TGF-iil ligado estã interna1izado.

A manose-6-fosfato, um análogo de açúcar fosfonlado, parece cjésémcennar um panei funoamenoa 1 nc transporte procurado e na nermuta intercelular de enzimas

Ann. Rev

Biochem

167-193).

lisossomais (von Figura. 1986, Os receptores específicos gue reconhecem os resíduos de manose-6-fosfato de enzimas lisossomais têm sido identificados e são componentes essenciais do sistema de transporte. As proteínas lisossomais segregadas contendo manose-6-fosfato têm sido identificadas no meio condicionado de células de cultura de tecidos (Gal e Gottesman. 1986, J. Biol. Chem. 261:1760-1765; Capony et al,. 1981. 3. Cell. Biol. 104:253-262; Baumbach et a 1. , 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:2985-2989; Sahagian e Gottesman. 1982. J. Biol. Chem. 257:11145-11150). Contudo, todas estas proteínas, exibem actividades de hidrolase ácida. Os resíduos de manose-6-fosfato do precursor TGF-βΙ podem dirigir o pró-TGF-βΙ para os lisossomas para processamento proteolítico para se deter o TGF-βΙ maduro. Alternativamente, os resíduos de manose-6-fosfato podem funcionar para dirigir o precursor TGF-βΙ clivado para os lisossomas para ser degradado.

Tem sido recentemente referido que o receptor de manose-6-fosfato independente de catiões é idêntico ao receptor do factor de crescimento semelhante a insulina II (IGF-II) (Morgan et a 1. ,

1987, Nature 329:301-307; Roth et a 1. , 1987. Biochem, Biophys.

Res. Comm. 149:600-606; MacDonald, 1988, Science 239:1134-1137).

Este receptor parece ser bifuncional, contendo sítios de ligação separados para o IGF-II e para manose-6-fosfato. Embora nao seja muito clara a importância biológica de um receptor único que liga o IGF-II e as proteínas contendo manose-6-fosfato, este receptor bifuncional pode desempenhar papéis importantes para a transdução de sinal e/ou para a selecção desejada de proteínas ligadas ao re ceptor. Mostrou-se que a proliferina, uma glicoproteína relaciona da com a prolactina, que se pensa ser um regulador do crescimento autocrino (Lee e Nathens, 1967, Endocrino 1ogy 120:208-213), conr

BAO ORIGINAL $

316

5624-071-118

-41tem manose-6-fosfato e cue se Iiga forternente aos receptores de IGF-1l/manose-ó-fosfato (Lee e Kathens, 1988. J. Biol. Chem. 263:3521-3527). ê possível gue o precursor TGF-βΙ interactue especíricamente com este receptor de superfície de ' célula bifuncional ou com outro de manose-6-fosfato.

Os requerentes têm determinado que o precursor TGF-βΙ recombinante é capaz de se ligar ao receptor de IGF-II/man6P na membrana plasmãtica de células, com base nos resultados de estudos in vitro. tais como os cue aqui se descrevem na Secção 11. et seq., demonstrando que: (1) a ligação do precursor rTGF-βΙ a adipócitos de ratazanas é aumentada pela trans1ocação, induzida por insulina, do receptor de IGF-I I/rnan6P para a membrana plasmãtica: (2) a ligação do precursor rTGF-βΙ às células CHO sobre-exprimindo o receptor de IGF-II/man6P é maior de que a ligação às células CHO originais; e (3) a ligação do precursor rTGF-βΙ guer aos adipócitos de ratazanas quer às células CHO é especificamente inibida pela manose-6-fosfato.

A manose-6-fosfato inibiu, até metade do máximo, a ligação do rTGF-βΙ às células CHO sobre-exprimindo o receptor de I -e GF-II/man6P (células CHO transfectadas) a uma concentração de 10yi M, um valor máximo do previamente encontrado (8y,M), para inibir até metade do máximo a ligação ao receptor isolado (Secção 9.2., supra.). Adicionalmente, a manose-l-fosfato foi muito menos eficaz na inibição da ligação do que a manõP, resultados estes que são compativéis com as especificidades conhecidas do receptor de IGF-II/man6P para estes dois açúcares (Von Figura e Hasilik, 1986, Ann. P.ev. Biochem. 55:167-193).

Os requerentes crêem que o precursor rTGF-βΙ é rapidamente interna1izado após ligação ao receptor de IGF-II/man6P nas

células	CHO	transfectadas ,	com base nos resultados que	se
descrevem	na	Secção 11.2.1	., infra. Após liqacão a 37 ’C	ao
receptor	de	IGF-II/man6P	em células CHO transfectadas.	o
precursor	rTGF	— 31 torna-se r	apidamente resistente à remoção	por

uma lavagem ácida destas células. Por exemplo, após apenas 10 minutos a 37°C, mais do que 75¾ de radioligando especificamente ligado foi resistente à lavagem ácida, sugerindo que a grande maioria de precursor rTGF-βΙ ligado se tinha, tornado internaiizabad original d #

η 9 ι c

5624-071-118 i4l ) . Após incub racrsê aumentos adicionais marcado e uma vez aue c au:

-42- ·'’ do durante este período de tempo (Haigler. 1980, J. Biol. Chem.

es mais prolongadas a 27'C. observai absorção celular de material radioíío adicional nao foi bloqueado pela manose-6-fosfato, ele é provavelmente devido à absorção de produtos de decomposição de precursor TGF-βΙ degradado.

Foram conduzidos estudos adicionais para determinar se o complexo TGF-β latente isolado a partir de plaquetas podia ou não ligar-se também ao receptor de IGF-II/man6P. Os resultados destas experiências, apresentados na Secção 11.2.2., infra. indicam que o complexo TGF-βΙ derivado de plaquetas competiu fortemente o

As as e

1989, Nature, na endoglicosidase ou tas. latente. Além com man6P e ácido com o precursor rTGF-βΙ na ligação ao receptor, sugerindo que complexo TGF-β latente continha também manose-6-fosfato. tentativas para detectar a ligação do receptor de IGF-II/man6P ao fragmento precursor TGF-βΙ derivado de plaquetas a seguir à electroforese e transferência para filtros de nitrocelulose, foram mal sucedidas e podem ser devidas à presença de menos resíduos de man6P no precursor TGF-βΙ de plaquetas do que no precursor rTGF-βΙ. Uma tal explicação é compatível com diferenças observadas entre os precursores TGF-βΙ de plaquetas os precursores TGF-βΙ recombinantes nas suas capacidades para competir com precursor rTGF-βΙ para a ligação aos receptores de man6P isolados: o precursor derivado de plaquetas é cerca de um terço tão potente como o rTGF-βΙ, neste aspecto. Alternativamente, é possível algum fosfato que seja removido por fosfatases durante o longo procedimento de purificação utilizado para obter o precursor TGF-Bi derivado de plaquetas.

Estudos recentes do precursor TGF-βΙ de plaquetas indicam que a sua estrutura de carbo-hidrato pode ser importante na manutenção deste complexo no estado inactivo (Miyazono e Heldin, imprensa); verificou-se que a digestão por sialidase activa o complexo TGF-βΙ de plaquedisso. verificou-se a incubação do complexo siãlico. mas não com outros açúcares, activa também o TGF-βΙ latente, apoiando um papel para o carbo-hidrato

Γ bad original

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5624-071-118 fi. · *·

-43na manutenção do precursor TGF-βΙ de plaquetas no seu estado latente. Os resultados que aqui se descrevem na Secção 11.2., et seg. sugerem que a man6P no precursor TGF-βΙ pode dirigir esta molécula para as células pela sua interacção com o receptor de IGF-II/man6P. Esta interacção pode conduzir, quer à activação, quer à degradação do precursor TGF-βΙ pela sua interna1ização e distribuição num compartimento endocítico.

5.7. ACTIVIDADE BIOLOGICA DO TGF-βΙ

O produto de TGF-βΙ maduro da invenção é um inibidor potente do crescimento de células de tumor in vitro e in vivo. As experiências medindo o efeito anti-pro1iferativo do TGF-βΙ em células epiteliais de pulmão de marta demonstraram que o TGF-βΙ recombinante da invenção (rTGF-βΙ) e o TGF-βΙ natural (nTGF-βΙ) têm actividades específicas idênticas (Secção 6.5, infra). Adicionalmente, as curvas de dose-resposta do rTGF-βΙ e do nTGF-βΙ são virtualmente indistinguíveis.

Os resultados na Secção 8.6, infra, demonstram que, quer o TGF-βΙ natural, quer o rTGF-βΙ do invento inibem o crescimento de tumor in vivo. A estase do tumor observada em tumores de pulmão humano tratados com TGF-β é também acompanhada pela indução de um fenótipo semelhante mais diferenciado. As células secretoras de muco, uma população menor nos tumores pobremente diferenciados, tratados com controlo, dominam os tumores tratados com TGF-β. Compatível com o papel secretor da célula globlet nos tecidos normais (Robbins e Angell, 1971, Basic patholoqy, W. B. Sander G., Philadelphia, PA) e deste modo, com o estado mais diferenciado, é a expressão aumenta de produtos semelhantes a mucina e de produtos de ácido hialurónico que se encontram em tumores tratados com TGF-β. Outros indícios histológicos inumeráveis sugerem também que a indução mediada por TGF-β do fenótipo diferenciado, incluindo a colocação pronunciada de organização epitelial colunar à volta da parede dos vasos e a deposição aumentada de matriz extrace1u1 ar, i,e. , colagénio.

poderoso efeito inibidor do rTGF-βΙ no crescimento e na diferenciação de adenocarcinomas de pulmão humano em ratinhos nudeat ími cos constitui uma evidência adicional de que o rTGF-βΙ

318

5624-071-118

-44do invento pode ser útil no desenvolvimento de novos, talvez menos citotóxicos, regimes de terapia de cancro.

5.8. PROCESSO MELHORADO PARA A PRODUÇÃO DE TGF-β1 MADURO

Numa concretização especifica do invento, o precursor TGF-βΙ foi modificado por eliminação do aminoácido cisteina da posição 33 (CYS-33) da FIG. 1 e sua substituição com serina. A modificação foi introduzida ao nível do ADN utilizando a mutagénese dirigida ao sítio. As células COS transfectadas com plasmídeos que codificam o gene precursor modificado segregam, finalmente, entre três a cinco vezes mais TGF-βΙ maduro do que as células CHO que exprimem o gene precursor não modificado. Crê-se que esta modificação evita a formação de certos complexos precursor, ligados por dissulfureto, nas células COS transfectadas e, deste modo, permite a secreção de mais TGF-βΙ maduro. A análise preliminar indica que o TGF-βΙ maduro, produzido por este processo, é correctamente processado e biologicamente idêntico ao TGF-βΙ natural.

As modificações do precursor TGF-βΙ nas duas outras cisteínas, CYS-223 e CYS-225, resultou na secreção de TGF-βΙ maduro mas não resultou na secreção de níveis mais elevados. Os detalhes da construção e expressão dos genes TGF-βΙ modificados são apresentados na Secção 10, infra.

Embora as três cisteínas localizadas na região pró do precursor TGF-βΙ possam não ser essenciais para a produção de rTGF-βΙ maduro, elas podem ser importantes na regulação do TGF-βΙ. Neste aspecto, a dimerização do precursor parece desnecessária para a clivagem proteolítica de TGF-βΙ maduro, mas pode ser requerida para a latência.

As células transfectadas com um plasmídeo codificando o pré- pró-TGF-31

S223/225

10.2.4., infra). 0 TGF-βΙ recentemente latente foi purificado a partir de plaquetas humanas na forma de um complexo de elevado peso molecular em que a porção pró dimérica do precursor TGF-βΙ está ligada por dissulfureto a uma proteína desconhecida e não covalentemente associada ao TGF-βΙ maduro (Miyazono et a 1., 1988, libertaram TGF-βΙ numa forma activa (Secção

J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield et al., 1988, J. Biol.

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Chem. 263:7646-7654) de complexos com as formas precursoras e madura: /que também prováve1'isto

TGF-βΙ. Uma TGF-βΙ numa & F

-45No sistema de expressão de células CHO, não bá provas de que uma outra proteína esteja envolvida na formação do TGF-βΙ. é seja verdade no sistema de células COS, uma vez que as formas precursoras e maduras do rTGF-βΙ produzidas pelas células COS parecem similares, se não idênticas, às produzidas pelas células CHO quando examinadas por imunomancba.

Os resultados dos requerentes indicam que o rTGF-βΙ maduro está não cova 1entemente associado com a região pró precursora e quando a região pró não pode formar um dímero, não é conferida latência. Embora isto seja muito provavelmente devido à ruptura da associação não covalente, os requerentes não podem excluir a possibilidade de que o TGF-βΙ maduro esteja não cova 1entemente associado com a região pró de Τ0Ε-β1^223/225 monomérica, (formando um complexo que não é latente em virtude das sequências maduras necessárias para a actividades estarem suficientemente expostas).

Os estudos recentes (Miyazono et a 1., 1988, J.Biol. Chem.

263:6407-6415) indicam que as estruturas de carbo-hidrato na região pró estão envolvidas na ligação não covalente do TGF-βΙ para formar um complexo latente. Talvez, a dimerização da região pró proporcione a estrutura e a estabilidade adequadas para estas interacções. Pouco se conhece à acerca da regulação in vivo do vez que a maioria dos tipos de células libertam forma latente (Lawrence et al., 1984, J. Cell.

Pbysiol. 121:184-188; Pircber et a 1., 1986, Biochem. Biophys. Res. Commun. 136:30-37; Wakefield et al., 1987, J. Cell. Biol.

105:965-975), activação do complexo latente parece ser um regulador crítico. Uma compreensão mais clara da natureza latência deverá auxiliar a determinação dos mecanismos fisiológicos de activação.

nível elevado de expressão e secreção do TGF-βΙ recombinante pode conduzir a uma ligação cruzada não tornando a ligação dissulfureto, entre a CYS-33 e os de cisteína localizados no polipéptido maduro, um artefacto do sistema de expressão. Alternativamente, a CYS-33 pode desempenhar passo desta natura1, resíduos

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-46um papel regulador através de interacções com outras proteínas. Isto parece ser espeeialmente plausível em relação ao complexo, ligado por dissulfureto, isolado a partir de plaquetas.

Assim, as três cisteínas localizadas na porção pró do precursor podem influênciar a maturação e a activação do TGF-βΙ de duas formas. A CYS-223 e a CYS-225 podem permitir ao precursor formar um dímero e podem, subsequentemente, interactuar com o TGF-β1 maduro duma maneira não cova lente para formar um complexo latente, enquanto que a CYS-33 pode actuar por ligação dissulfureto ao TGF-βΙ maduro e/ou a outras proteínas, modulando assim a acção do TGF-βΙ.

6. EXEMPLO: CLONAÇAO DE ADNc DE PRECURSOR TGF-β1

Os exemplos que se seguem descrevem a clonação de ADNc da sequência de codificação de precursor TGF-βΙ a partir duma linha de células de macaco verde Africano (BSC-40, uma sublinha de células BSC-1) que se mostrou anteriormente produzir níveis elevados de um inibidor de crescimento funcionalmente relacionado com o TGF-βΙ. Verificou-se uma homología de sequência excessivamente forte, entre o precursor de símio e o produto de gene previsto, quer para o TGF-βΙ humano quer para o TGF-βΙ de ratinho.

6.1 MATERIAIS E MÉTODOS

Os procedimentos seguintes foram utilizados para cionar o ADNc que codifica o precursor TGF-βΙ.

6.1.1 CRESCIMENTO DE CÉLULAS E EXTRACÇAO DE ARN

Cultivaram-se as células BSC-40 em meio de Eagles modificado por Dulbecco contendo 10% de soro de feto de vitelo. Cultivaram-se as células MCF-7 no mesmo meio contendo 6 unidades/ml de insulina. A partir dessas células isolou-se o ARN poliadenilado por cromatografia de oligo- [dT]-celulose como se descreveu (Purchio et al., 1979, J. Virol. 29:763-769).

6.1.2 CONSTRUÇÃO E ANALISE DE BANCOS DE ADNc

Sintetizou-se ADNc de cadeia dupla a partir de ARN poliadenilado de BSC-40 como se descreveu (Maniatis et a 1 . , 1982,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372) e, após tratamento

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-47com EcoRI-met i1 ase, ligou-se a ligantes oligonucleotídicos contendo um sítio de reconhecimento de enzima de restrição EcoRI (ligantes EcoRI). Digeriu-se o ADNc com EcoRI e fraccionou-se por cromatoorafia em Sephacrvl S-1000. Reuniram-se as fracções de /ao

ADNc maiores que 750 pares de base (pb) e 1igaram-se/1ambda gtlO (Davis et a 1., 1980, A Manual Baterial Genetic; Cold Spring Harbor, NY), empacotaram-se

1981, Gene 13:227-237) e imp1 ataram-se em que tinham sido cortado com EcoRI for Genetic Engineering: Advanced Harbor Laboratory, Cold Spring al . , (Grosveld et

E.coli rK mK^Thf1. 0 banco foi analisado por hibridização de placa (Benton et a 1.. 1977, Science 196:180-182) com uma sonda oligonucleotídica marcada com [³²P] [5'-CACGCAGCAGTTCTTCTCCGTGGAGCTGAAGCAATA-3'] complementar dos codões de 6 a 17 da molécula de TGF-βΙ madura (Derynck et a 1.,1985. Nature 316:701-705). Os vários clones de ADNc foram isolados após análise terciária e subclonados em pBR322. Um clone (pTGF-Dl-2) contendo um inserido de 1600 pb foi subclonado nos vectores de clonação M13mpl8 e M13mpl9 (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33:103-119) e ambas as cadeias foram sequenciadas utilizando o processo de terminação de cadeia de didesoxilo (Sanger et a 1. , 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-5467).

6.1.3 ANÁLISE DE MANCHA NORTHERN

Isolou-se ARN poliadenilado a partir de células MCF-7 e de células BSC-40 como se escrevem (Purchio et a 1. , 1979, 0. Virol. 29:763-769), fraccionou-se num gele de agarose-formaldeido a 1¾ (Lehrach et a 1. . 1977, Biochemistry 16:4743-4751), transferiu-se para uma membrana de nilão

Amersham) e hibridou-se com T]. A hibridação foi realizada a 42^ώ0 em formamida a 50¾ contendo NaCl 0,9M, fosfato de sódio 50 mM, SDS a 0,1%, solução 4xDenharts (Maniatis et a 1., 1982,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 371-372), 0,4 mg/ml de ARNt de levedura e 0,25 mg/ml de ADN de timo de vitelo desnaturado. Os filtros foram lavados a 65^cC em 0,25xSSC (Maniatis et aI., 1982), SDS a 0,1%, secos e expostos a filme de raíos-X Cronex-4 (DuPont) com a ajuda de luz e de écrans intensificadores (DuPont).

(Hybond, 32 uma sonda pTGF-pi-2 marcada com ^r

318

5624-071-118 •F

-486.2 RESULTADOS

Analisou-se a biblioteca de ADNc construído em lambda gtlO utilizando ARN poliadenilado de células ESC-40, como anteriormente se descreveu com um desóxio 1igonuc1eótido com 36-meros complementar dos codSos de 6 a 17 da molécula TGF-βΙ madura (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705). Devido à estreita semelhança entre o TGF-βΙ de bovino (Roberts et al.. 1983, Biochemistry 22:5692-5698) e o TGF-βΙ humano (Derynck et a 1. . 1985, Nature 316:701-705) se 1eccionou-se uma sonda derivada de sequências humanas para analisar os clones de ADNc de TGF-βΙ de símio.

Foram identificados um total de 13 clones positivos após três etapas de purificação em placa. Um clone de 1600 pb, o pTGF-Bl-2, que pareceu, por análise de enzima de restrição, conter a região de codificação completa do precursor de TGF-βΙ foi escolhido por sequenciação. Na FIG. 1 mostra-se a sequência de ADN, conjuntamente com a sequência de aminoácidos deduzida. Verificou-se a existência de uma estrutura de leitura aberta única que codificava um polipéptido de 390 aminoácidos. 0 polipéptído TGF-βΙ maduro consiste nos 112 resíduos carboxi-terminais. Este arranjo é o mesmo que se descreveu para o TGF-βΙ humano (Derynck et a I., 1985, Nature 316:701-705) e para o TGF-βΙ de ratinho (Derynck et al . . 1986, J. Biol . Chem. 261 .-4377-4379) . 0 clone de ADNc de símio é 98% homólogo em relação ao clone de ADNc humano ao longo de toda a região de codificação, só com 27 bases mal emparelhadas (FIG. 1) e uma lacuna de três bases.

Dentro da região 5' de não codificação, as sequências de ADN do TGF-βΙ humano e de símio são 91% homólogas, com 3 lacunas, enquanto que as regiões 3' de não codificação são 94% homólogas sem lacunas. Mesmo a montante do codão de iniciação 5' situa-se uma estrutura de suporte potêncial que esta também presente no clone de ADNc humano mas não no clone de ratinho. Uma inserção aparente dentro desta região, no clone de ratinho, podia inibir a formação desta estrutura. Tais como os clones humanos e de ratinho, o clone de ADNc de símio não tinha todo o comprimento uma vez que não se identificou uma sequência 3' po1iadeni1ada. A natureza rica em G-C do terminal 3' do ARNm do precursor TGF-βΙ,

318

5624-071-118

-49pode ter resultado numa estrutura secundária que evitou a sintese de ADN nesta região. A região 3' de não codificação exibe uma repetição notável da sequência da purina. CCCC, a seguir ao codão de terminação. Esta sequência ocorre nove vezes na sequência humana, com uma repetição adicional contendo uma base de diferença. Ambos os clones de simio e de murino contêm 8 repetições, com 2 adicionais contendo uma única base de diferença.

A análise de Mancha Northern utilizando a sonda de TGF-01-2 mostrou hidridação com espécies importantes de ARN poliadeni1ado de 2,5Kb, de células BSC-40 e da linha de células de carcinoma mamário humano MCF-7 (FIG.2). Este é o mesmo tamanho do transcrito principal encontrado em linhas de células humanas (Derynck et al., 1985, Nature 316:701-705) e em linhas de células de ratinhos (Derynck et a 1 . , 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379). Podem também ser observadas bandas menores de 4Kb e de 1,45 Kb na faixa 2 da FIG.2.

Mostra-se também na FIG. 1 a homologia de aminoácidos entre as proteínas precursores de TGF-βΙ de humano e de símio. Só se verificam cinco mudanças de amidoácidos, sendo todos eles encontrados dentro da região precursora amino-termina1: existe uma homologia completa entre as proteínas TGF-βΙ maduras de símio e de humano ao nível dos aminoácidos. Por contraste, só se verificou uma homologia de 84% (ao nível dos aminoácidos) entre as moléculas TGF-βΙ precursoras de símio e de ratinhos; as diferenças incluem o seguinte: encontrou-se uma mudança de um aminoácido , uma serina (ratinho) para uma alanina (simio) na região de codificação TGF-βΙ madura. 0 gene humano codifica um aminoácido extra (arginina, posição 158) no precursor que não está presente nem no clone de símio nem no de murino. Presumivelmente esta mudança é devida a uma inserção dentro do gene humano que foi sequenciado (Derynck et a 1 . , 1985, Nature 316:701-705). A estreita identidade entre a região precursora das proteínas TGF-βΙ de macaco, ratinho e humano sugere que esta parte da molécula pode também ter uma função biológica importante.

terminal carboxilo do precursor contém a forma madura de 112 aminoácidos de TGF-βΙ de símio e é identificado pela sua homologia com o produto de gene humano correspondente. Esta região

313

5624-071-118 ,/ &

-50em cisteina (9 resíduos) representa a forme ao precursor rica

do TGF-31 e não	contêm quaisquer sítios c	le gl i cosi 1	ação
enquanto que	se podem identificar tr	és sítios	de
a ç· a o potenciais	(Asn nas posições 62.	136 e	177)

noutras regiões do precursor. É conhecido que o homodímero TGF-βΙ, quer de origem humana quer de roedores, requer ligações dissulfureto intactas para manter a actividade (Messague, 1984 J. Biol. Chem. 259:9756-9761). 0 terminal amino do TGF-βΙ humano maduro tal como se estabeleceu por análise da sequência primária (Derynck et a 1. . 1985, Nature 316:701-705) é precedido por um dipéptido Arg-Arg. Este sítio de clivagem similar está também presente, uma posição idêntica, no homólogo de símio. A clivagem, quer durante, quer após, o processo de tradução, concomitante com uma ou ambas as formações de ligação dissulfureto, intracadeia e intercadeia, resultaria na génese do homodímero activo (dimerização). A este respeito, o precursor TGF-βΙ contêm uma região rica em leucina de 14 aminoácidos hidrofóbicos (posições 8-21, FIG. 1) que pode funcionar como um péptido de sinal e desempenhar um papel na cascata de secreção/processamento.

7. EXEMPLO: EXPRESSÃO DO TGF-βΙ

Os exemplos que se seguem descrevem a expressão do TGF-βΙ activo em células de ovário de criceto Chinês (CHO) transfectadas com um plasmideo recombinante contendo a sequência de codificação controlo de elementos de expressão do vírus de As experiências que aqui demonstram que um certo do TGF-βΙ sob o símio 40 (SV40) número de transfectantes CHO produziram e segregaram níveis elevados de TGF-βΙ. 0 TGF-βΙ libertado pelas células transfectados demonstrou uma actividade biológica comparável a do TGF-βΙ natural autêntico, tal como foi determinada por ensaios de inibição do crescimento utilizando células alvo que são sensíveis ao TGF—β1.

7.1. MATÉRIAS E MÉTODOS

7.1.1. CULTURA DE CÉLULAS

As células de ovário de criceto Chinês (CHO) deficientes em di-hidrofolato-reductase (dhfr) (Urlaub e Chasin, 1980 Proc.Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 77:4216) foram propagadas em meio de Ham F-12 Γ

BAD ORIGINAL

318

5624-071-118

sá?

-51(Gibco Laboratories, NY) suplementado com 10% de soro de feto de bovino (FBS) e 150 ug/ml de L-prolina. Incluiram-se a penicilina e a estreptomicina com 100 U/ml e 100/g/ml, respectivamente. Os transfectantes CHO foram cultivados em meio de Eagie modificado por Dulbecco contendo os mesmos suplementos acima indicados. As células CHOe os seus derivados foram rotineiramente submetidos a tripsinização com uma relação de separação de 1:5.

Preparou-se o metotrexato (Sigma, MO) com uma concentração de armazenamento de 10 mg/ml em ãgua. Adicionou-se NaOH diluido (0,2 M) de forma a solubilizar a droga (pH final de 6). O produto armazenado foi esterilizado por filtração e armazenado a -20 °C. As soluções de armazenamento de metotrexato em meios (100 JUM) foram mantidas a 4 °C durante não mais do que 1 mês.

7.1.2. MANIPULAÇÕES DE ADN E CONSTRUÇÕES DE PLASMÍDEO

As enzimas de restrição, a ADN ligase T4, a fosfatase intestinal de vitelo, o fragmento Klenow de ADN polimerase I e os outros reagentes de ADN foram adquiridos no Bethesda Research Laboratories, MD. As manipulações de ADN padrão foram realizadas como se descreve em Maniatis, T. , et a 1.. 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

O plasmídeo pSV2 (β1-TGF-dhfr), que contem o ADNc de TGF-βΙ de símio e o gene dbfr de ratinho, em tandem, bem como as sequências SV40 intervenientes, foi construído como se descreve na FIG. 3. Inicialmente preparou-se o plasmídeo pSV2-Bl-TGF. O fragmento PstI-EcoRI de 1378 pb de ADNc do TGF-βΙ, contendo a região de codificação completa para a proteína TGF-βΙ, foi inserido na região poli-ligante de pSP65 de modo a colocar um sitio de restrição do Hindl11, 5' em relação à sequência de reconhecimento PstI. 0 plasmídeo resultante foi então digerido com EcoRI. reparado para se obterem terminais rombos com o fragmento Klenow de ADN-po1imerase I. e isolou-se o fragmento Hi ndlIΙ-EcoRI (rombo) contendo a sequência de codificação do TGF-βΙ. 0 plasmídeo pSV2-Bl-TGF foi então construído por inserção do fragmento HindlIΙ-EcoRI (rombo) no p5V2-neo no lugar do gene de resistência à neomicina (neo), por ligação no fragmento HindIII-Hpal do vector.

318 5624-071-118 ajW··

-52A construção de pSV2-(βΙ-TGF-dhfr) necessitou nesta altura, de dois passos. 0 primeiro passo requereu o isolamento do fragmento Ndei-EcoRI (rombo) de pSV2-31-TGF. Isto foi conseguido pela digestão do plasmídeo pSV2-31-TGF com EcoRI, preenchimento dos terminais com o fragmento Klenow de ADN-polimerase I, corte do vector rombo com Ndel e Pvul, e isolamento do fragmento Ndel-EcoRI (rombo) de 2,6 Kb. A digestão com Pvul foi necessária de modo a que um fragmento de plasmfdeo contaminante fosse copurificado após electroforese em gel de agarose. 0 passo final na construção foi a inserção de um segmento Ndel-EcoRI (rombo), contendo o ADNc de TGF-βΙ e as sequências SV40, num fragmento Ndel-PvulI de pSV2-dhfr. 0 plasmfdeo pSV2-(βΙ-TGF-dhfr) resultante contem um único sítio Ndel que pode ser utilizado para linearizar o ADN.

7.1.3. TRÃNSFECÇÕES DE ADN

Aproximadamente 24 horas após a sementeira de 10^ células CHO, deficientes em dhfr, em placas de 100 mm, as culturas foram transfectadas com 20 T⁷ g de plasmídeo pSV2-(βΙ-TGF-dhfr) linearizado com Ndel, na forma de um precipitado de fosfato de cálcio (Wigler, M. , et a 1., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:1373-1376). Resumidamente, adicionaram-se 20 9 de ADN linearizado a 1 ml de solução estéril de CaCl250 mM. Adicionou-se então, gota-a-gota uma porção de 1 ml de solução 2X ΗΕΡΕΞ (NaCl 280 mM, ΗΕΡΕΞ 50 mM, fosfato de sódio 1,5 mM, pH 7,1), e deixou-se a mistura em repouso em gelo durante 30 minutos. 0 precipitado foi então disperso, gota-a-gota, sobre as células contendo 10 ml de meio F12. Após incubação a 37^cC durante 24 horas, removeu-se o meio e substituiu-se com 10 ml de meio F12 contendo glicerol a 25% durante 90 segundos à temperatura ambiente. As células foram lavadas uma vez com 20 ml de meio F12 e incubadas em meio F12 não selectivo (20 ml) durante 48 horas adicionais. A selecção dos transfectantes exprimindo dhfr foi realizada por substituição do meio por DMEM suplementado com FBS dialisado a 10% (Gibco, N.Y.) e 150 ^g/ml de L-prolina. Após cultura das células durante 10-14 dias no meio de selecção observaram-se colónias. Aspiraram-se dez colónias com uma pipeta

313

5624-071-118

-53pasteur e expandiram-se .

7.1.4 . SELECÇÃO DE CÉLULAS RESISTENTES AO METOTREXATO

As células amplificadas exprimindo di-hidrofolato-reductase (dhfr)foram derivadas dos transfectantes primários essencialmente como descritos (Gasser, C.S. e Schimke. R.T.,1986, J. Biol. Chem. 261:6938-6946). Após expansão, foram semeadas 10 células em placas de 100 mm e adaptadas a concentrações crescentes de metotrexato. As concentrações iniciais de metotrexato foram de 50, 100, e 200 nM. A placa contendo colónias visíveis à concentração de metotrexato mais elevada foi tripsinizada e adaptada àquela concentração de metotrexato durante pelo menos duas passagens de células 1:5 adicionais. As células (10 ) foram então semeadas em discos de 100 mm com 2,5 e 10 vezes a concentração de metotrexato. A placa contendo colónias visíveis foi de novo tripsinizada e adaptada em meio contendo metotrexato. As células foram reconge1adas, em várias etapas de amplificação, em meios contendo 40% de FBS 10% de dimetil-sulfóxido 50% de DMEM. 0 metotrexato não foi incluído nos meios de conge1amento. 7.1.5. QUANTIFICAÇAO DOS NÍVEIS DE MENSAGEIRO DE BETA-TGF

Os níveis de ARNm de TGF-βΙ foram avaliados utilizando uma solução de hibridação (Uhler, M.D., et a 1., 1986, Proc. Natl.

Acad. Sei. U.S.A. 83:1300-1304). Clonou-se o fragmento SmaI-SmaI de 600pb do ADNc de TGF-βΙ em pSP65 e utilizou-se para preparar 32

ARN complementar, marcado com [ Ρ], pela ARN-polimerase SP6, como especificado pelo fabricante (Promega Biotech, Madison WI) . O ADN M13 de cadeia única contendo o ADNc de TGF-βΙ completo, do mesmo sentido do ARNm, foi utilizado como padrão. 0 ácido nucleico total foi isolado, a partir de células transfectadas, por digestão com proteinase K e extracção com fenol/clorofórmio (McKnight, G.S., et_aT., 1980, J. Biol.

Chem. 255:144-147). O de ácido nucleico total foi determinado a corante (Labarca, C., e Paigen, K., número de moléculas de ARNm teor de ADN de amostras pelo ensaio de ligação 1980, Anal. Biochem. 102:344-352 por células foi estimado por comparação com os padrões de TGF-βΙ do M13 admitindo um valor de 7 picogramas de ADN por célula.

7C 316

5624-071-118

-547.1.6. ENSAIO DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO ί Lu íNúmero cie . on) , cue sco

As células epiteliais cie pulmão cie marta, Mv registo CCL-64. American Type Culture Ccliect extremamente sensíveis ao TGF-βί, foram utilizadas para o ensaio de inibiçSo de crescimento. O ensaio foi realizado utilizando a 125

-desoxiuridina ( IDU). análoga da timidina. síntese de ADN. Foi definida uma unidade de inibir a

125

5’-[ Ii-iodo-2 sendo a quantidade requerida para 125

IDU em 50¾ em comparação com a de células para avaliar a actividade como incorporação de

CCL-64 não tratadas. Utilizando o TGF-βΙ isolado como um padrão, uma unidade de actividade correspondeu geralmente a 80-100 pg/ml de TGF-β1.

Para ensaiar células transfectadas relativamente à secreção de TGF-βΙ activo recolheram-se os sobrenadantes livres de soro a partir de uma colheita de 24 horas em culturas confluentes de células, e dia 1isaram-se extensivamente contra ácido acético 0,2 M. 0 ácido acético foi removido por liofilização e a redissolveu-se a amostra em meio de cultura completo, estéril, para os ensa i os.

7.1.7. ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO INDEPENDENTE DA FIXAÇÃO

Os sobrenadantes foram testados em relação à sua capacidade para estimular o crescimento de fibroblastos de rim de ratazana normal (NRK; clone 49) como colónias em agar mole. O ensaio em agar mole foi realizado como se descreveu (Twardzik e Sherwin, 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297; Delarco e Todaro, 1978 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75:4001-4005) utilizando sobrenadantes dialisados com; ãcido.

7.1.8. SINTESE DE PèPTIDOS E PRODUÇÃO Dl

ANTICORPOS

Os péptidos foram sintetisados por técnicas de fase sólida num dispositivo Beckman 990, e clivados previamente se descreveu (Gentry, L. Eiol.Chem. 258:11219-11225: Gentry, L. Virology 152:421-431). A purificação a partir da resina et al .

como τ

1983 .

A.. 1986.

cromatodos

,.E. e Lawton, 'oi rea1izada por grafia líquida de alta eficiência preparativa. A composição péptidos foi confirmada por análise de aminoácidos.

Os péptidos sintéticos foram conjugados com a gama-g1obu1ina de bovino através do residuo cisteina. As repeções de acoplamento

BAD ORIGINAL Ó

318

5624-071-118

-55foram essencialmente como se descreveu (Gentry e Lawton, 1986, supra). Os rendimentos das conjugações de péptido atingem valores entre 8 e 26 moléculas de péptido, ligadas cova 1entemente por molécula de gama-globulina.

Inocularam-se coelhos brancos da Nova Zelândia, em três a seis sítios, por inoculações subcutâneas e intradérmicas combinadas, com os conjugados de péptido (100^ g de equivalentes de péptido) emulsionados em adjuvante completo de Freunds. Foram administradas inoculações de reforço com intervalos de 2-3 semanas. Tomaram-se sangrias 7-14 dias após os reforços.

7.1.9. IMUNOMANCHA

As proteínas foram fraccionadas em geles de gradientes de SDS-poliacri1amida de 7,5%-17,5% e transferidas para nitrocelulose não modificada (0,45 jJm; Schleicher e Schuell) durante 14-18 horas, a 200 mA, a 4°C (Burnette, W.N., 1981, Anal. Biochem. 112:195-203). A capacidade de ligação em excesso da nitrocelulose foi bloqueada por incubação com BLOTTO a 2,5% (Johnson, D.A., et al., 1984, Gene Anal. Techn. 1:3-8) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,2% de NP-40. O anti-soro de coelho, diluído 1:75 em BLOTTO a 2,5% foi incubado com as folhas de nitrocelulose bloqueadas, durante 2 horas â temperatura ambiente. Após lavagem do anticorpo em excesso por cinco lavagens de 5 minutos em BLOTTO a 2,5% as folhas de nitrocelulose foram incubadas com proteína . A conjugada com fosfatase alcalina, diluída 1.-500 em BLOTTO a 2,5%. Após uma hora de incubação, lavaram-se as folhas de nitrocelulose 5 vezes com PBS (lavagens de 5 minutos) contendo 0,2% de NP-40 e desenvolveram-se (Leary et a 1., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:4045-4049).

7.1.10. ANÁLISE DE MANCHA NORTHERN

O ARN po1iadeni1ado citoplásmico foi preparado a partir de células em cultura de tecidos como se descreveu (Purchio e Fareed, 1979, J. Virol. 29:763) e fraccionado num gel de agarose-formaldeído a 1% (Lehrach et a 1. , 1977, Biochemistry 16:4743). Transferiu-se o ARN para uma membrana de nylon Hybond (Amersham) e hibridou-se com uma sonda de pTGF-61-2 radiomarcada. A hibridização foi realizada em NaCl 0,9 M, fosfato de sódio 50mM / 9 318 •118 ^7 j,4 mg r i c e ; o *-_t tr- - ;

r/acem;

•ç ARNt 50% de a d os

EDTA 5 mM. 0.1%. de SDS. 4x Der de levedura. 0.25 mg/ml de ADN de t:

formamida. durante 30 horas a 43 ‘C. Os filoros foram 1 quatro vezes e;n 0.25 x SSC a 65 ^eC (30 minuto expostos para autorradiografia.

7.1.11. ANALISE DE MANCHA SOUTHERN

ADN de elevado peso molecular foi isolado a partir de núcleos sedimentados obtidos apôs extracçâo de ARN (Purchio e Fareed. supra). Dispersou-se o sedimento nuclear em tampão TE e depois ajustou-se a pH 7,4/EDTA 10 mM. incubou-se a 37 ^cC r⁴1. s de seguinao-se dia 1ise digeriu-se o ADN com

1%, de dodecilsulfato de sódio/Tris-HCL 10 mM. Adicionou-se prcteínase K até 100 /g/ml e durante 16-18 horas. Apôs o ADN ter sido extraído com feno 1/clorofórmio e precipitado com etanol. removeu-se o ARN residual por digestão com ARNase A isenta de ADNase, durante 2 horas em tampão TE, extensa contra TE.

Para a análise de mancha Southern.

enzima de restrição apropriada e manchou-se em membranas de nylon Hybond (Soutbern, E.M., 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517). Hibridaram-se os filtros de membrana de nylon Hybond, a 65 °C durante 20 boras, em tampão de hibridação contendo 5 x 10^ cpm/ml de fragmento EcoRI-EcoRI. traduzido com incisão, desnaturado, de ADNc de TGF-βΙ obtido a partir de pTGF-31-2 e lavaram-se como é descrito pelo fabricante (Amersham).

7.2. EXPRESSÃO DO TGF-βΙ EM CÉLULAS CHO

De erma a exprimi:

níveis elevados de TGF-fl bioactivo recornoinanl descritos <

ut i1i zaram-se (Mui ligar,. P.. C .

Oí e

et

Berg

1:449-459; Subramani,

1:854-864) para preparar um (pSV2-p1-TGF-dhfr) que coloca os (ADNc)s de di-hidrofo1ato-reductase de ratinho, em tandem plasmídeo (FIG. 3). 0 grande porção do ADNc vectores pSV2, origina

P.. 1981. Mol. Cell. Biol.

Cell. Biol. expressão

TGF-βΙ de simio de al

1981, Mol. plasmídeo de dentro do plasmídeo de expressão compreende uma de TGF-βΙ que codifica a molécula precursora TGF-βΙ completa. A ligação física destes dois genes dentro do mesmo plasmídeo permite a coamplificação das sequências de TGF-βΙ durante a amplificação do dhfr. Os sinais requeridos

BAD ORIGINAL f . ' * poliadeni1 ação. e fornecidos celas

318

5624-071-118

-57para a iniciação da transcrição, terminação.

cada ADNc são idênticos e são de ALK cio vírus de símio 40 ÍSV40) .

CHO iniciais foram seleccionadas, crescentes de metctrexato (MTX)

0' pSV2-B 1-TGF-dhf r foi transf ecoado em ce deficientes em dhfr na forma de um precipitado de fosfato ae cálcio. Foram isolados dez transfectantes CHO exprimindo o fenótipo dhfr por propagação em meio selectivo. Todos os dez transfectantes exibiram ARNm de TGF-βΙ tal como se determinou por ensaio de hihridização em solução. Para aumentar o nível de expressão de TGF-βΙ, as células derivadas dos dez transfectantes passo-a-passo, em concentrações As várias fases de amplificação, testaram-se as células para avaliar o nível de ARNm de TGF-βΙ por hihridização em solução. Quatro dos dez transfectantes iniciais mostraram níveis aumentados de ARNm de TGF-βΙ. No presente invento descreve-se um destes clones (TGF-B1-3), que através de amplificação em MTX, exibiu níveis muito elevados de ARNm de TGFBl.

Na tabela I mostra-se o número de cópias de ARNm de TGF-βΙ por célula TGF-B1-3 em várias fases de amplificação. As células CHO nas várias fases de amplificação serão designadas por TGFB1-3-0, TGFB1-3-200, TGFB1-3-2000 e correspondem às células

CHO seleccionadas em MTX 0,2 y M e 20 M, respectivamente.

TABELA I

Expressão de ARNm de TGF-31 em transfectantes CHO

Células Número de Cópias de ARNm de TGF-βΙ por célula

Cu 11 ivadas _Concentração de MTX (Λ*Μ)

	(0)	(2)	(20)
TGF-B1-3	350	34000	76000
CHO# 7	700	—	—
CHO não transfectadas	20

O número de cópias ARNm por célula foi determinado por hiF

BAD ORIGINAL

318

5624-071-118 // bridização em solução. Os cálculos foram baseados na aproximação de que o teor de ADN de uma célula é de 7 pi cogramas.

Como controlos, incluiram-se células CHO não transfectadas e um transfectante CHO (CHO #7) que inicialmente mostrou exprimir TGF-βΙ recombinante com niveis baixos. 0 CHO #7 foi obtido por cotransfecção com pSV2-31-TGF (FIG. 3) e pSV2-neo, seguida por selecção em Gentecidin (Gihco, NY) . O transfectante TGF-31-3 inicial exibiu níveis de ARNm de TGF-βΙ similares aos do CHO #7 e, aproximadamente, 20 vezes maiores do que os de células CHO não transfectadas. Contudo, após selecção com MTX, o número de cópias de ARNm de TGF-βΙ, observado em células TGF-31-3, aumentou dramaticamente aproximando-se muito das 80 000 cópias por célula em MTX 20 yjM. Isto representou uma amplificação superior a 200 vezes em relação ao transfectante TGF-31-3 inicial e uma amplificação cerca de 4000 vezes em relação ás células CHO não transfectadas.

Mostra-se na FIG. 4A uma mancha northern de ARNm poli (A)+, seleccionado a partir de células TGF-31-3, nas várias fases de amplificação.

Incluiu-se também o ARNm de células CHO não transfectadas para revelar os niveis baixos de ARNm de TGF-βΙ endogéneo de 2,5 Kb presente nestas células (asterisco, FIG. 4A). Esta expressão de nível baixo de ARNm de TGF-βΙ tem também sido observada em várias outras linhas de células. Os transfectantes TGF-31-3 revelaram grandes quantidades de ARN hibridável migrando na dimensão prevista de 2 Kb.

O mecanismo mais provável para o aumento dramático de ARNm de TGF-βΙ, nas células TGF-31-3, após selecção com MTX, é um resultado da amplificação. De forma a examinar a amplificação do gene, isolou-se o ADN a partir das células TGF-31-3, em várias fases de selecção com MTX. digeriu-se com enzimas de restrição, transferiu-se para membranas de nylon Hybond, e hibridou-se com ADN de TGF-βΙ marcado com [ P]. Ambas as enzimas de restrição EcoRI e BamHI cortam duas vezes dentro do plasmideo introduzido, gerando cópias lineares de ADN de plasmideo deficientes nas sequências de flanqueamento. Uma vez que um dos sítios BamHI resi70 315

5624-071-118

-59dia dentro do ADNc de TGF-βΙ de símio, a digestão com esta enzima deveria libertar dois fragmentos que se hibridam na sonda traduzida com corte. Na FIG. 4B mostram-se os resultados de mancha Southern nas células seleccionadas com MTX, observou-se uma forte hibridação com a sonda de TGF-βΙ. O tratamento destes fragmentos correspondeu precisamente ao tamanho previsto dos fragmentos contendo TGF-βΙ de pSV2-TGF-01-dhfr (um fragmento de 4,7 Kb obtido por digestão com EcoRI e fragmentos de 4,4 e 0,51 Kb obtidos por digestão com BamHI). Observaram-se também produtos de digestão em níveis mais baixos, no transfectante não seleccionado inicial (TGF-01-3/0). Os varrimentos densitométricos comparando as células TGF-31-3 diferentes revelaram, pelo menos, uma amplificação de 15 a 35 vezes maior das sequências TGF-βΙ em células TGF-pl-3/200 e TGF-Bl-3/2000, respectivamente.

7.3. DETECÇÃO DE TGF-βΙ RECOMBINANTE BIOACTIVO SEGREGADO

Para determinar se a proteína TGF-βΙ foi ou não preparada e segregada nas células TGF^l-3 transfectadas, recolbeu-se meio condicionado a partir destas células e testou-se para avaliar o material bioactivo. Um bioensaio sensível e específico baseado na capacidade do TGF-βΙ para inibir o crescimento de células epiteliais de pulmão de marta (CCL-64) foi o ensaio inicial utilizado. Mostra-se na FIG. 5A uma curva de dose-resposta padrão típica, utilizando TGF-βΙ humano autêntico altamente purificado.

Neste ensaio observa-se tipicamente uma inibição de 50¾ do para crescimento de células de pulmão de marta? 8-12 picogramas (80-120 pg/ml) de TGF-βΙ. 0 meio condicionado recolhido a partir de células ΤΟΡ-β1-3 em todas as fases de amplificação exibiu a capacidade de inibir o crescimento de células CCL-64. Mostram-se na FIG. 5B as curvas de dose-resposta destes sobrenadantes. Estas mostram declives similares às curvas de inibição observadas para o TGF-βΙ natural autêntico.

A tabela II mostra os níveis de material bioactivo presente em sobrenadantes de cultura de células TGF^l-3, calculado a partir das curvas que se mostram na FIG. 5B.

318

/·/

5624-071-118

-60Concentração de TGF-βΙ Biologicamente Activo colhido a partir de Transfectantes CHO¹

Concentração de TGF-βΙ em meios condicionados de transCélulas _fectantes CHO baseada na Bioact i vidade

Cultivadas Concentração de MTX (uM)

	(0)	(2)	(20)
TGF^l-3 5,8	ng/ml	1000 ng/ml	5600 ng/ml
CHO #7 25	ng/ml	—	—
CHO não-
-Transfectadas 1	ng/ml	—	—

A concentração de material bioactivo em sobrenadantes livres de células é expressa em ng/ml, tal como é determinado a partir dos dados apresentados na Figura 2B. Os cálculos foram baseados em 10 picogramas de TGF-β nativo para extrair uma inibição de 50% de células CCL-64.

As quantidades absolutas de TGF-β produzidas pela linha de células TGF-B1-3/200 variou de entre 1,5 mg/1 a 6.5 mg/1. Isto pode ser devido a vários factores incluindo condições de cultura de tecidos, de quer das células indicadoras (CCL-64), quer das células TGF^l-3/2000.

Observaram-se baixos níveis de TGF-βΙ bioactivo segregado em sobrenadantes de células TGF-81-3 não amplificadas. Estes níveis foram similares aos níveis observados nos transfectantes CHO 47. As células ΤΟΓ-β1-3 se 1eccíonadas com KTX exprimiram níveis muito mais elevados de TGF-βΙ bioactivo recombinante. Para uma selecção ccm MTX 20^M, as células TGF-Bl-3 (TGF-β1-3/2000) segregam quase 6 yug/ml de TGF-βΙ activo nos sobrenadantes de cultura isentos de soro.

Na tabela III mostram-se os níveis de material bioactivo segregado em sobrenadantes de cultura do transfectante TGF-βΙ-Β

315

24-071-118

-61ίο com MTX.

X.· '

A bioactividade foi células de pulmão de dos por célula por

P' '>, ct (Cl γ- a rn nas várias fases de selec a v a i i a d a utilizand marta e os valores resultantes foram normaliza 24 horas, por contraste com o transfectante TG

-se níveis baixos de TGF-pl bioactivo segregado nos sobrenadantes dos transfectantes TGF-31 não amplificados. O maior produtor de material TGF-pl recombinante foram as células TGF-31-3/2000 quantidade de material recombinante bioactivo, segregada por destas células em 5 ml de meio de cultura de tecido durante período de 24 horas, aproximou-se muito dos 30 / g de TGF-βΙ quantidade de bioactividade detectada nos sobrenadantes condicionados para cada um dos transfectantes correlacionou-se com o nível relativo de ARNm de TGF-31 observado nestas linhas de células.

A um

A

TABELA III

Quantidade de TGF-pl Bioactivo segregado pelos Transfectantes CHO em várias Fases de Selecção com MTX. fg de TGF-βΙ bioactivo segregado/cé1u1a/24h^a

Número do 0 nM 2M 20gjM transfectante_MTX_MTX_MTX

TGF-pl-3 2,9 500 2800^b a A quantidade de TGF-βΙ bioactivo segregado por uma placa de cultura de tecido redonda de 100 mm confluente, em 5 ml de DMEM isento de soro, foi determinada utilizando o ensaio de inibição de células do pulmão de marta como se descreve em Materiais e Processos, o número de células foi determinado por contagem num hemocitómetro .

b Uma placa de cultura de tecido redonda, de 100 mm. confluen7 te (c.a. lx 10 células) destas células segregara perto de 30 yj g de TGF-βΙ bioactivo em 5 ml de sobrenadante isento de soro.

Utilizou-se também um segundo bioensaio para caracterizar adicionalmente o TGF-pl recombinante segregad^o. Este ensaio é bad original / J mo 1 écu 1 as resczmento de células NRK em )624-071-118 _c o_ baseado na capacidade do TGF-βΙ, em cooperação com a semelhantes a EGF. para estimular <

agar mole. Na tabela IV mostrsm-í os resultados deste bioensaio.

A actividade do iGF-βΙ recombinante é indestinguíve1 daquela TGFbl de plaquetas naturais humanas utilizado como controlo.

TABELA IV

Ensaio de Colónia em Agar Mole comparando o TGF-βΙ recombinante e o TGF-βΙ natural^

Número de Colónias formadas em Agar Mole

TGF-βΙ recombinante

TGF-βΙ	a partir de meios	TGF-βΙ de plaque-
(nq/ml)	Condicionados	tas Humanas
10,0	260	251
5.0	263	247
1,0	225	211
0,5	193	182
0,1	50	85
1 As	células de rim de ratazana normais	foram implantadas em

agar nobre de Difco a 0,3% com 1 ng/ml de factor de crescimento epidérmico (EGF). Foram contados por cavidade, oito campos de baixa potência. Não se formaram colónias quando estavam ausentes o TGF-βΙ ou o EGF. A quantidade de TGF-ΒΙ recombinante adicionada foi estimada com base nos valores derivados do ensaio de inibição de células epiteliais de pulmão de marta. A actividade formando colónias foi avaliada utilizando sobrenadantes recolhidos a partir de células TGF-61-3 se 1eccionadas com MTX 20/>M.

7.4. A ACTIVAÇÃO ACIDA OPTIMIZA A BIQACTIVIDADE DO TGF-βΙ RECOMBINANTE SEGREGADO

Tem-se verificado que muitos tipos de células segregam TGF-βΙ natural numa forma latente requerendo a acidificação para se ter a bioactividade óptima. Os bioensaios apresentados em

BAD ORIGINAL

Sei?

9 31 S

5624-071-118 p s

X<

iguras e tabelas anteriores foram realizados utilizando matéria dialisado contra ácido. De forma transfectadas segregam uma forma ae de TGF-31. os sobrenadantes erminar se as células CHO biologicamente inactiva. latenisentcs de soro recolhidos a partir de células TGF-β1-3/2000 foram dialisados contra ácido acético 0,2M ou NH^HCO^ 50mM (pH 7) e ensaiados para avaliar a actividade inibidora das células mostram-se os resultadosácida foram potentes na pulmão de marta CCL-64.

de pulmão de marta. Na FIG. 6 Os sobrenadastes que receberam diálise ua capacidade para inibir as células de Em contraste, as amostras dialisadas contra NH^HCO^ possuíam níveis muito menores (menores do que 1%) de actividade inibidora. Os sobrenadastes que foram primeiro dialisados contra NH^HCO^ e depois tratados por uma segunda diálise contra ácido acético 0.2M, readquiriram a sua potente actividade inibidora. A curva de dose-resposta deste material foi sobreposta com a curva gerada por amostras que só receberam o passo de diálise ácida.

7.5. IDENTIFICAÇÃO DAS FORMAS MADURA E PRECURSORA

DE TGF-β1 NO MEIO DE CULTURA DE CÉLULAS CHO

DE TGF-β1-3 TRAN5FECTANTES

Os anticorpos anti-péptido dirigidos contra as sequências de péptidos dentro da molécula TGF-βΙ prevista foram produzidos em coelhos utilizando os péptidos sintéticos como imunogénios. Na FIG. 7 mostram-se as sequências de péptidos que foram utilizadas indicando-se também as suas localizações relativas dentro do poli péptido precursor ~^¹369-381' ^{Um do£} contra os epítopo;

TGF-31: TGF-31_ei^_gá. TGF-β1_?25__?36 e TGFanticorpos (anti-TGF-βΙ — — ^369-381^{1 fQ1 diripidc} presentes dentro da forma madura do factor de crescimento TGF-β. Os outros tíois anticorpos (anti-TGF-β 1, e ant i -TGF-β 1 são esoecíficos do precursor e

225-236 dos contra as sequências de péptidos presentes apenas dentro da molécula precursora de TGF-βΙ.

7.5.1. IDENTIFICAÇÃO DE TGF-βΙ MADURO

Os sobrenadantes dos transfectantes TGF-3-3 foram recolhidos '81-94 são diriaie testados por imunomancha com anti-TGF-31_Ogq_₃g^ que identificou o TGF-βΙ maduro autêntico (FIG. 8). A faciImente especif i cidade foi demonstrada por pré-absorção do anticorpo com o imunogénio de péptido sintético antes da imunomancha. si

BAD ORIGINAL

313

5624-071-118

./Γ

-64e testados por imunomancha com anti-TGF-βque facilmente identificou o TGF-βΙ maduro autêntico (FIG. 8). A especificidade foi demonstrada por pré-absorção do anticorpo com o imunogénio de péptido sintético antes da imunomancha.

Sob condições de redução (FIG. 8A), o TGF-βΙ autêntico migra como um polipéptido com uma dimensão de 12-13 kD. Nos sobrenadantes de células TGF-B1-3 seleccionadas com MTX, foi facilmente identificada uma proteína comigrando com TGF-βΙ autêntico (FIG. 8A). Os sobrenadantes recolhidos a partir de células TGF-P1-3 não amplificadas exibiram níveis não detectáveis de TGF-βΙ recombinante utilizando imunomancha. As células TGF-31-3 seleccionadas com MTX 20^ M pareceram produzir os níveis mais elevados de TGF-βΙ maduro, aproximando-se de valores 2 a 4 vezes mais elevados do gue as células seleccionadas com MTX 2/*M. Estes aumentos são compatíveis com os resultados obtidos para a expressão de níveis de ARNm (Tabela I) e bioactividade

IIA e IIB). Sob condições de não redução (FIG. 8B), a

TGF-βΙ recombinante comporta-se como o TGF-βΙ autêntico, migrando como um dímero de 24 kD.

Adicionalmente ao TGF-βΙ maduro, observaram-se também formas maiores de material imunorreactivo. Em geles de redução, estas formas tinham uma dimensão de 44 kD a 56 kD (FIG. 8A). A natureza genérica destas formas imunorreactivas glicosilação extensa. De modo interessante, de redução, estas formas maiores parecem também migrar como um dímero com uma dimensão de 95 kD a 110 kD (FIG. 8B). A identificação destas formas maiores como moléculas precursoras foi confirmada utilizando os anticorpos específicos do precursor como se descreve na subsecção seguinte.

7.5.2. IDENTIFICAÇÃO DO TGF-βΙ PRECURSOR (Tabela proteína pode sugerir uma na ausência de agente

Os sobrenadantes dos transfectantes TGF-31-3 foram recolhidos e testados por imunomancha com os anticorpos específicos dos precursores (FIG. 9). Após redução, os anticorpos dirigidos contra (anti-TGF-31₈₁_₉₄ as duas regiões das e anti-TGF-β 1 sequências precursoras identificaram as formas

225-236 de peso molecular mais elevado de 44 kD a ^56 kD e não reagiram

BAD ORIGINAL $

318 5624-071-118

-65:om ο TGF-βΙ maduro presente nos sobrenadantes (FIG. 9A) . Estes anticorpos específicos do precursor das formas maiores de 44 kD e 56 kD precursores com um peso molecular, de 30 kD Estas moléculas precursoras mais pequenas não reagiram com o anti-TGF-0l2gg_2Q2 ^e só podem representar sequências precursoras.

para alem da identificação detectam também rolipéptidos

Assim, os sobrenadantes condicionados oor células TGF-pl-3 'de se 1eccionadas em MTX, continham, para além/TGF-βΙ maduro. formas precursoras maiores. Estas sequências precursoras, uma vez que são tão altamente conservadas entre espécies, podem exibir outras propriedades biológicas importantes. Para ilustrar todas as três formas de TGF-βΙ dentro dos sobrenadantes de transfectantes após redução, mostra-se uma imunomancha sondada com uma mistura de e de (FIG.

anticorpo especifico do precursor (ant i-TGF-β 1-,->₅_₂36 ’ an1 9A:

anticorpo específico do TGF-βΙ maduro (anti-TGF-β1)

Mostra-se na FIG. 9B os sobrenadantes fraccionados em geles de SDS-poliacrilamida de não redução e sondados com os anticorpos de péptidos específicos do precursor ou com a mistura de anticorpo específico do precursor e anticorpo específico do TGF-βΙ maduro. Uma forma de peso molecular maior com uma dimensão de 95 kD a 110 kD foi facilmente identificada por cada um dos de anticorpos específicos do precursor anticorpos. Uma mistura (anti-TGF-βl_o„ e detectaram a forma dimétrica do TGF-βΙ (24 kD) para além da banda de 95-110 kD .

7.6. O TGF-ΒΙ RECOMBINANTE CONSTITUI A MAIORIA DAS PROTEÍNAS SEGREGADAS A PARTIR DE CÉLULAS

Τ6Ε-β1-3-2000 do TGF-βΙ maduro (anti-TGF-βl-_{cn QO1}) ooy-joi

Cultivaram-se as células TGF-Bl-3/0 e TGF-β1-3/2000 até à confluência, marcaram-se em meio livre de soro com [S]-cisteína 35 e [ S ]-metionina durante 18 horas, e fraccionaram-se as proteínas segregadas radiomarcadas em geles de SDS-poliacrilamida de redução. Na FIG. 10 mostraram-se os resultados. Os sobrenadantes recolhidos a partir de células TGF-Bl-3/0 radiomarcadas não mostraram níveis detectáveis de proteínas TGF-βΙ recombinantes.

r:

318

5624-071-118

Λ-/

-66Eir. contraste, os sobrenadantes das células TGF-B1-3/2000 revelaram quatro proteínas principais segregadas que não se encontram no transf ectante TGF-p-1-3/0 inicial. Três destas proteínas migram de modo idêntico as formas madura e precursora de TGF-βΙ tal como se identificou por imunomancha. A outra proteína que foi fortemente marcada com S]-aminoácidos e libertada pelas células TGF-β1-3/2000 migra para um peso molecular de 22 kD. A análise da sequência amino-terminal desta proteína revelou a sua identidade como di-hídrofolato-reductase.

8. EXEMPLO: CARACTERIZAÇAO DO PRODUTO DE GENE TGF- 1

Os exemplos seguintes apresentam os resultados da purificação e da caracterização extensa dos produtos rTGF-βΙ sintetizados pelas células CHO-TGF-D-3-200Q, Os resultados indicam que o rTGF-βΙ é sintetizado em células CHO como pré-pró-TGF-βΙ qu*e é processado do lado carboxi-termina 1 da Gly-29 e Arg 278, que o precursor rTGF-βΙ está glicosilado e fosforilado mas que a proteína madura não está, que o rTGF-βΙ possui uma actividade específica equivalente à do TGF-βΙ natural, e que o rTGF-βΙ maduro é um inibidor potente do crescimento de células de tumor in vitro e in vivo.

8.1. GLICO5ILAÇAO E FOSFORILAÇfiO DO PRECURSOR rTGF-βΙ

As características estruturais do precursor rTGF-βΙ relevantes para esta secção são ilustradas no diagrama de linhas que se mostra na FIG. 11A. Um líder hidrofóbico, c1ivado a partir da proteína no resíduo aminoácido 29, produz um polipéptido de 361 aminoácidos indicado como a na FIG. 11A. A modificação e clivagem subsequentes resultarão num monómero rTGF-βΙ maduro (marcado por c na FIG. 11A) e numa proteína de 249 aminoácidos consistindo inteiramente de resíduos precursores amino-terminais (b na FIG. 11Ά).

A linha de células utilizada neste exemplo é a ΤΟΓβ3-2000 e mostram-se na FIG. 11B as proteínas relacionadas com o TGF-βΙ segregadas por estas células, ana 1 isadas por imunomancha. Como se descreve na secção 7.5., supra. os sobrenadantes derivados de células TGFB3-2000 contêm uma grande forma de 95 kD -110 kD de rTGF-βΙ bem como o dímero de proteína de 24 kD madura quando ana70 315

5624-071-118

jfS

-67lisados em geles de SDS-poliacrilamida sob condições de não redução: quando analisados sob condições de redução. estes sobrenadantes revelaram conter uma banda de 44 kD - 56 kD , a na faixa 2). uma banda faixa 2) e uma banda de 12 kD kD ; b” na FIG.

’c na FIG. 11B, faixa 2) que é monómero TGF-βΙ maduro. A prova de que as bandas a, b, e c que se mostram na FIG. 11B contêm as regiões do precursor rTGF-βΙ gue se mostram na FIG. 11A é apresentada na secção 7.5., supra. Estas bandas podem ser facilmente visualizadas guando os sobrenadantes.

marcados com

35,

-metionina e

5j-cisteína, de células TGF-33-2000 são analisados directamente por electroforese em gel SDS-poliacrilamida seguida por fluorografia (FIG. 11C, faixa 1 de e

em

FIG. 11D, faixa 1); estas bandas não são detectada sobrenadantes de células CHO não transfectadas.

A natureza difusa das bandas a e b que se mostram na FIG. 11 sugere que elas podem estar glicosi 1adas . Para investigar esta possibilidade, as células TGF33-2000 foram marcadas com 3 [ H]-glucosamina e os sobrenadantes isentos de células analisados por electoforese em gel de SDS-poliacri1amida seguida por fluorografia. A FIG. 11C (faixa 2) mostra que a forma de 95-110 kD foi marcada; não foi detectada marcação no dímero de proteína de 24 kD madura. Quando analisadas sob condições de redução (FIG. 11D, faixa 2), as bandas a e b foram marcadas. Não se verificou marcação na banda c. Assim, o precursor rTGF-βΙ está glicosilado enquanto que o monómero 12 kD maduro não está.

A natureza desta glicosilação foi adicionalmente investigada por tratamento de sobrenadantes de células TGF33-2000 com várias enzimas gliocolíticas seguido por fraccionamento dos produtos de digestão em geles de SDS-poliacrilamida. A FIG análise imunomancha destes digeridos, neuraminidase fez com que as bandas a bandas mais rápidas mas ainda difusas indicando a presença de resíduos de ãcido siálico. A endoglicosidase H. que cliva predominantemente as cadeias de oligossacáridos de manose elevada não teve qualquer efeito detectável (FIG. 12A, faixa 4). A digestão com N-glicanase, que remove o carbo-hidrato ligado a N, fez com ciue as bandas a e b migrasΓ b

12A mostra tratamento ' miarassem (FIG. 12A. faixa uma com como )

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k.D maduro. Os mesmos r sobrenadantes. nisrcâdcs com (FIG. 12B)..

De forma a determinar o tamanho do precursor TGF-βΙ nao modificado, subc1onou-se um fragmento Pst I-Eco RI, de 1350 pares de bases contendo a região de codificação completa de TGF-βΙ (Snarples et a 1 . . 1987, DNA 6:239-244) no pSP64 e transcreveu-se com SP6-polimerase (Kreig et a 1. . 1984, Nucleic Acids Res. 18: 7057-70). A análise destes transcritos em geles de agarose-ureia indicou que foi produzida uma única espécie de ARN (FIG. 13A) que programou a síntese de um polipéptido de 42 kD num sistema de tradução isento de células de reticulócito dependente da mensagem (FIG. 13B). Uma exposição mais prolongada deste gel revelou a presença de um produto de 40 kD menos importante. 0 tamanho (42 kD) do produto de tradução, isento de células, principal está de acordo com o esperado para uma proteína de 390 aminoácidos e corresponde muito provavelmente ao esqueleto polipéptido de TGF-βΙ não modificado, mostra na FIG. 12A (faixa 2) e na FIG. 12B (faixa 4) representaria então a proteína central desg1icosi1ada do rTGF-βΙ menos a sequência orientadora hidrofóbica (a” na FIG. 11A). A banda abaixo desta corresponde à banda desglicosilada b na FIG. 11A.

A incubação de células Τ6Γβ3-2000 na presença de [^“P]-ortofosfatc- e subsequente fraccionamento dos sobrenadantes isentos de células em geles de SDS-poliacrilamida indicaram que o precursor rl r S]-cisteírsa, de células TGF33-2000 principal do banda de 39 kD que se rTGF-β'Ι. , mas não o monómero de (FIG. 11E). A electroforese de .2 k.D maduro, camada fina estava fosforilado de hidro1isadof ae áci d<

mostrou qu<

a m:aior parte do fosfato nao estava igaao a Os dados serina. treonina ou tirosina (manchas X, Y, Z, FIG.11F) obtidos no exemplo da Secção 9. infra, demonstram que o fosfato é incorporado nos grupos carbo-hidrato complexos ligados a asparagina tais como manose-6-fosfato. Discutem-se também as implicações desta constatação. _____ bad original d

316

5624-071-116

-696.2. PURIFICAÇÃO DO TGF-βΙ BIOLOGICAMENTE ACTIVO

US ce cemiãs CnU foram propagadas .ratadas como se supra. Os tubos de ensaio !650 ck“) de Eagles modificado por Dulbecco (DMEM) de feto de bovino (10% V/V), penicilina (100 U/rnl) . estreptomi ci na (100 y g/ml) , L-pro1i na (150 y g/ml ) e metotrexato (20jjM), foram inoculados com uma placa de cultura de tecido redonda de 150 cir/, confluente, de células, TGF-P3-2000 e cultivaram-se a 37‘C. Depois das células se ligarem e atingirem a confluência, lavaram-se duas vezes com 50 ml de meio isento de soro, suplementado como anteriormente, e depois, incubaram-se durante 24 horas em 50 ml de meio isento de soro suplementado adicionalmente com ascorbato e com glutationa reduzida, em concentrações 100 ρ g/ml e 20 ρ g/ml, respectivamente.

Os sobrenadantes isentos de soro foram recolhidos a partir dos tubos de ensaio, centrifugados a 200 x g para remover os detritos celulares, e imediatamente ajustados com fluoreto feniImetilsulfonilo até 10 mg/litro tripsina/1itro de aprotinina (Sigma)

Os sobrenadantes foram concentrados 40 vezes por ultrafi1 tração (membrana YM10, se 1eccionando a fracção de peso molecular 10 000; Amicon) e dialisou-se extensivamente o concentrado resultante contra acético 0,2M. O material dialisado foi liofilizado e armazenado a -20^cC antes da purificação.

meio condicionado foi primeiro fraccionado por cromatografia de penetração em gel. Na FIG. 14 mostra-se um perfil de eluição representativo. Eluiu-se mais do que 95% da actividade biológica, determinada com base em proteínas marcadoras, com um peso molecular de aproximadamente 15 000. Observou-se o mesmo padrão de eluição com nTGF-El utilizando as mesmas condições de coluna. 0 peso molecular aparente, baixo, do TGF-βΙ, tal como foi determinado por cromatografia de penetração em gel, pode ser devido â estrutura fortemente dobrada da molécula de factor de crescimento dimérica ou à adsorção não específica. Observou-se actividade de elevado peso molecular no volume vazio da coluna e determinou-se como sendo menor do aue 5% da actividade

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BAD ORIGINAL &

i ce i u ί 3s iG; descreve na Secção contendo 50 ml de meio suplemento com sor

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Ί c orno de unidades inibidoras de e ácido acético até 0,2M.

316

5624-071-118

-70total aplicada. A SDS-PAGE sob condições de nào redução do grupo A e B revelou que a maior parte da actividade biológica eluíu como uma espécie de polipêptido de 24 kD. enquanto que a actividade em menor quantidade eluíu como um componente de grande peso molecular de 95-110 kD (não se mostram os resultados).

*

Para confirmar que o componente 24 kD representava o rTGF-βΙ adequadamente processado, purificou-se esta espécie até à homogeneidade, utilizando HPLC de fase inversa para caracterização subsequente. O grupo B foi fraccionado num suporte C18 /^Bondapak (FIG. 15). 0 componente biologicamente activo foi eluido num pequeno gradiente de acetonitrilo como um pico homogéneo corn o mesmo tempo de retenção que o nTGF-βΙ. A análise em geles de SDS-poliacrilamida, sob condições de não redução e de redução, demonstrou que este componente activo era homogéneo, comigrando com o nTGF-βΙ isolado a partir de baço de bovino (FIG. 16). 0 rTGF-βΙ foi adicionalmente caracterizado por análise da sequência de proteínas (Tabela V).

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318

5624-071-118

-71· <V TABELA V

Análise da sequência Amino-terminal de Polipéptidos rTGF-^l

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Os polipéptido:

-eluídoe a partir de um o que se mostra a ami no-t ermi ne.

rTGF-BI foi τι-γ_ n ~ Ω Ω1S

5624-071-118

-72e b foram, ele;

a nte:

fco;r.2ssie similar sna i iss da sequén vaduro purificado.

clivado com CNBr e os resultados indicam sequências simultâneas de terminais amino e carboxilo do factor de crescimento.

N.D.: Mão determinado.

Quimicamente clivado

O polipéptido purificado foi brometo de cianogériio antes da sequênciação. Uma vez que o TGF-βΙ maduro só contem uma metionina no resíduo 382, foram obtidas, simultaneamente, duas sequências; uma correspondente à sequência amino-termina1 do factor de crescimento (começando na Ala-279) e outra representando os 8 aminoácidos carboxi-terminais (começando na ILe-383). Os resultados dos requerentes (Tabela V) demonstram que o rTGF-βΙ biologicamente activo é adequadamente processado.

Na Tabela VI mostra-se um sumário dos passos de purificação do rTGF-β 1. O factor de crescimento foi purificado mais do que 30 dois passos de purificação. Nesta experiência o rendimento total foi de 54¾ e obtiveram-se 0,65 mg de meio de cultura condicionado. 0 preparações resultou numa recuperação com vezes em part i cu 1 ar, de rTGF-Bl processamento de superior a 85¾ de poi litro outra:

proteína recombinante, biologicamente activa, um rendimento superior a 1 mg por litro.

TABELA VI

Purificação do rTGF-βΙ maduro do meio condicionado

Fraccão

Prote i na (mg)

Unidades

Actividade Especí fica

Unidades/mq

Rendimento Percentua1

Meio Condicionado⁰ 39,0 14 x 10

TSK (Fracção

B) 1,37 6.3x10 _J »

HPLC-C18 0,65 7,5 x 10

3,6 x 10 x 10

119 x 10,

100 r

BAD ORIGINAL d ί ·.

318 5624-071-118 /-73Uma unidade de actividade é definida ern Procedimento Experime n t a i s.

Proteína determinada assumindo que i unidade de absorvãncía a 280nm= 1 mg/ml de proteína.

Iniciado com um litro de meio condicionado.

Calculado a partir da análise de aminoácidos.

PURIFICAÇÃO E NATUREZA DO PRECURSOR rTGF-βΙ

O precursor rTGF-βΙ foi purificado tirando partido da sua natureza glicosilada. 0 precursor eluido a partir do volume vazio de uma coluna TSK-250 (Grupo A) foi dialisado contra tampão neutro (NH^HCO^ 50mM, pH 7,8), e centrifugado 15 000 x g antes do fraccionamento numa coluna de conconava1ina A-lecitina. Lavou-se extensivamente uma coluna, contendo um ml de conconava1ina A cova 1entemente ligada a Sepharose 4B (Pharmacia), com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e equilibrou-se com NH^HCO^ 50mM, pH 7,0. As amostras a serem absorvidas foram carregadas e recirculadas quatro vezes através da coluna antes da lavagem com dez volumes de PBS. 0 material especificamente ligado foi eluido com solução de metiΙ-χ-D-manopiranosido lOOmM em PBS.

O precursor ligado a eluido com o(-met i lmanosido . gel de SDS-poliacri1amida, do Azul de Coomassie. A protéina conconava1ina A foi especificamente Na FIG. 16 mostra-se um perfil, em precursor purificado corado com eluída migrou a um peso molecular de entre 95-120 RD. Esta forma grande era reactiva com anticorpos dirigidos contra as sequências precursoras e contra o factor de crescimento maduro. Não foi detectado rTGF-βΙ maduro contaminante nesta preparação, mesmo em geles de SDS-poliacri1amida sobrecarregados.

Embora o factor de crescimento dimérico, maduro, esteja ausente da preparação, o precursor purificado, quando analisado por SDS-PAGE de redução, revelou uma espécie de 14 kD que comigrou com o rTGF-βΙ momomérico (FIG. 16). Também evidentes nos geles foram as duas espécies precursoras, o pró-TGF-βΙ (30-390) e a região pró de 30-42 kD do precursor (30-278; ver também FIG.17) As tentativas adicionais para fraccionar este complexo maior em componentes separados foram infrutíferas. A análise da sequência

315

5624-071-118

-74amino-termina 1 do material purificado com conconavalina A revelou duas secuências amino-terminais comecando na outra na Ala-279. Estes resultados sugerem fortemente cue pre;

sor rTGE-fl ce

95-120 kD. purificado a partir do meio condicionado das células CHO, representa uma mistura de pró-TGF-βΐ (30-390), da região pró do precursor (30-278), e da cadeia madura de rTGF-βΙ (279-390) todas interligadas por ligações dissulfureto. Para confirmar esta observação, digeriu-se o precursor com CNBr e purificaram-se os péptidos CNBr para estabelecer a natureza química deste complexo. Dissolveu-se o precursor TGF-βΙ (800 pmol) em 30 μ 1 de ácido fórmico a 70¾ adicionaram-se 16 yM de uma solução contendo 15mg de CNBr lOOml de ácido fórmico a 70¾ (Gross e

em

Cbem. 237:1856-1860). A horas a 30°C, no escuro, e Witkop, 1962, J. Biol. reacção prosseguiu sob azoto durante 4 Cromatografou-se o digerido numa coluna de cromatografia de penetração em gel Bio-Sil TSK-250 equilibrada em ácido trifluoroacético a 0,1¾ (TFA), contendo 40¾ de acetonitrilo como se descreveu (Ikeda et al.. 19B7, Biochemistry 26:2406-2410). A HPLC de fase inversa foi realizada numa coluna /· Bondpak C-18 (3,9 x 300 mm, tamanho de partícula 10/<m; Waters com um gradiente linear composto por TFA a 0,05¾ em água como o tampão de partida e TFA a 0,045¾ em acetonitrilo como tampão limitante. As fracções foram recolhidas em tubos de polipropileno para minimizar as perdas de adsorção não especifica. Na FIG. 18 eluição TSK-250 do precursor rTGF-βΙ vários picos foram aminoácidos. Um fragmento mostra-se um perfil de clivado com CNBr. Os sequênciação de principal contendo uma ponte dissulfureto entre identificados por de péptido CNBr um residuo de cisteína de percursor e o resíduo de cisteína do factor de crescimento maduro é o 14(30-38/279-382/383-390) e na Tabela VII mostra-se a análise da sequência amino-termina1. Este de péptido particular envolve a Cys-33 do precursor residucs de cisteína do factor de crescimento maduro.

CNBr amino-termina 1 14(30-38/262-382/383-390) representa um péptido ligado por dissulfureto envolvendo o pró-TGF-βΙ.

fragmento e um dos O péptido

7570 318

5624-071-118

TABELA VII

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318

5624-071-118

-76a N.D. Nao determinado é⁷ 8.4. SEQUENCIA AMINO TERMINAL DOS POLIPêPTIDQS rTGF-βΙ

A análise automática da sequência foi realizada num sequenciador de aminoácidos modelo 475A (Applied Biosystems). Os derivados feni1tio-hidantoina dos aminoácidos foram separados por HPLC de fase inversa, em série, num analisador modelo 120A PTH (Applied Biosystems) como se descreveu(Marquardt et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:12127-12136).

Sujeitaram-se os meios condicionados isentos de soro, de células CHO-TGF^l-3/2000 exprimindo níveis elevados de rTGF-βΙ de símio, a electoforese em SDS-PAGE sob condições de redução. A coloração com azul de Coomassie revela as três formas moleculares de rTGF-βΙ segregadas por estas células (FIG. 17). A forma maior, uma espécie migrando amplamente alcançando, em tamanho, de 44-56 kD (a na FIG. 17) e possuindo epítopos imunológicos derivados do precursor TGF-βΙ e do TGF-βΙ maduro (Secção 7.5, supra), representa, muito provavelmente, o precursor TGF-βΙ não processado. 0 polipêptido de 30-42 k.D (b na FIG. 17) só contem epítopos derivados de precursor (Secção 7.5, supra), indicando que esta espécie sofreu clivagem proteolítica separando esta e a forma TGF-βΙ madura. A espécie de 14 kD (c na FIG. 17) representa o monómero TGF-βΙ, completamente processado, maduro. As proteínas precursoras recombinantes (a eb na FIG. 17) foram electroeluídas a partir de fatias de acrilamida e caracterizadas por análise da sequência amino-termina 1. NaTabela V supra mostram-se os resultados. A análise da sequência revelou que as duas formas precursoras maiores têm sequências amino-terminais idênticas. A comparação desta sequência com a prevista a partir do ADNc de TGF-βΙ de símio (Sharples, et a 1 . . 1987, DNA 6:239-244) indica que ambas as proteínas maiores sofreram clivagem proteolítica específica na Gly-29/Leu-30 removendo os primeiros 29 aminoácidos da molécula pré-pró-TGF-β1 intacta. A clivagem desta sequência líder de 29 aminoácidos hidrofóbicos é muito provavelmente resultado de uma peptidase de sinal. A ligação peptídica Gly-29/Leu-30 é sitio de clivagem do péptido de sinal, previsto (Von Heijne, 1986, Nucleic Acids Res. 14:4683-4690)

318

5624-071-118 e

-77Como base nestes resultados, o polipéptido TGF-βΙ de 44-56 kD (a na FIG. 17) representa o pró-TGF-βΙ (30-390) enquanto que a espécie de 30-42 k'D (b” na FIG. 17) corresponde a região pró do precursor (30-278) que é deficiente no péptido de sinal e nas sequências TGF-βΙ maduras. A análise da sequência do polipéptido de 14 kD (não se mostram os resultados) revelou um terminal amino intacto, começando na Ala-279 do factor de crescimento maduro, indicando que as células CHO-TGF-01-3/2OOO processam adequadamente o rTGF-βΙ de simio no sítio de clivagem dibásico. Na FIG. 20 apresenta-se um sumário de um esquema de processamento proposto para o TGF-βΙ.

8.5. ACTIVIDADE BIOLÓGICA IN VITRO

As formas purificadas, madura e precursora, do rTGF-βΙ foram testadas para avaliar a actividade biológica em células epiteliais de pulmão de marta como se descreveu na Secção 7.1.6,, supra. Na FIG. 19 apresentam-se os perfis de actividade biológica do rTGF-βΙ maduro e precursor e do TGF-βΙ natural de baço de bovino. Os cálculos da molaridade foram baseados nas composições de aminoácidos previstas (para o rTGF-βΙ precursor, foi utilizada a composição de aminoácidos de pró-TGF-βΙ). Os resultados indicam que o rTGF-βΙ maduro é um inibidor potente da proliferação das células de pulmão de marta (1-2 pM para uma inibição de metade do máximo) e tem uma curva de actividade que se pode sobrepor com a obtida para o TGF-βΙ natural. Noutras palavras, o TGF-βΙ recombinante do invento e o TGF-βΙ natural possuem actividades específicas idênticas. Em contraste, a preparação de precursor foi 50 vezes menos activa do que o factor de crescimento maduro (50-60 pM para uma inibição de metade do máximo) e uma comparação dos perfis de inibição na FIG. 19 revelou uma ligeira diferença nas curvas de dose-resposta, sugerindo diferenças de afinidade receptora entre as formas madura e precursora.

8.6. ACTIVIDADE BIOLÓGICA IN VIVO

Os efeitos do TGF-βΙ i n vivo são amplamente desconhecidos embora tenha sido sugerido o seu papel na inibição do crescimento da glândula mamária (Silberstein e Daniel, 1987, Science 237:291), na cicatrização de feridas (Sporn et a 1 . , 1983, Science

318

5624-071-118 .40

-78219:1329). e no desenvolvimento embrionário (Weeks et a I Cell 51:861). Quer o TGF-β1 quer o TGF-S2 osso (Seyedin et a 1., ad . . 1987, J . Biol . recombinante clonado expresso (Gentry et

1986 . Biol .

1987, naturais derivados de J. Biol. Chem. 261:5693: Seyedin et

262:1946) (Sharples et a 1 al., 1987, Mol.

quer o iGF-βΙ de símio 1987, DNA 6:239-244) e

Cell. Biol.

7:3418) em de células CHO-TGF-31-3-2000, são inibidores potentes da síntese ADN numa variedade de linhas de células de tumor estabelecidas, de origem epitelial humana (Ranchalis et al.. 1987, Biochem.

Biophys. Res. Comm. 148:783). Neste estudo, apresenta-se evidência in vivo de que o TGF-βΙ é também um estático de tumor, para um tumor de pulmão humano desenvolvido em ratinhos ''nude atímicos. Particularmente notável, é a indução pelo TGF-β, de um fenótipo celular semelhante ao diferenciado nas células de tumor inibidas. A linha de células de carcinoma de pulmão humano designada por A549, estabelecida a partir de um caucasiano macho com um adenocarcinoma do pulmão, para inibição por concentrações é um alvo sensível (in vitro) picomolares de TGF-βΙ ou TGF-62 naturais e do TGF-βΙ recombinante do invento. Os ratinhos ”nude foram subcutaneamente inoculados com células A549; desenvolveram-se tumores palpáveis em aproximadamente 80% dos animais em três semanas. A FIG. 21 mostra o efeito do tratamento com TGF-βΙ e TGF-32 no crescimento posterior dos tumores A549 nestes ratinhos. Cada grupo experimental continha cinco animais e os valores nas ordenadas representam as medições de tumor médias, em 3 dimensões (volume). O dia 1 corresponde ao primeiro dia em que os grupos receberam tratamento; os compostos de teste foram subcutaneamente injectados na vizinhança do tumor mas não no próprio tumor. Os animais nos grupos de controlo receberam injecções de albumina de soro de bovino numa solução veículo idêntica à dos grupos animais com tumores tratados com TGF-β. 0 volume de tumor dos grupos de controlo duplicou aproximadamente em cada 7-8 dias. Foram também observados tempos de duplicação similares em experiências separadas com animais com tumores que receberam um péptido sintético biologicamente inactivo. Em contraste, injecções sucessivas, correspondentes aos dias como se indica nas abcissas, dê 2(J(J mg de TGF-jil ê TGF-02 (l,4/4g fiõ total. por regiríiê dê tra-

7570 31S

24-071-118 tamento para cada um) foram estáticas do tumor e retardaram o

Numa expeTC-F-βΙ ns inibição do tumor A549 (FIG. 21). Os valores representam volumes de tumor médios em animais tratados com TGF-β, relativamente aos volumes de tumor de animais tratados com controlo. Foi observada uma inibição de cerca de 25¾ à dose mais baixa testada (12,5 ng por injecção) de TGF-βΙ. As doses mais elevadas, 50 e 200 ng por injecção, foi observada uma inibição correspondentemente maior no crescimento de tumor (37¾ e 60¾. respectivamente). Em algumas experiências, quanto maior o volume de tumor no dia 1, mais baixa é a percentagem de redução no volume, de tumor inibido relativamente aos tumores derivados de grupos de controlo. Os animais que receberam mesmo as doses mais elevadas de TGF-β (1,4 no total após 20 dias) não exibiram grandes manifestações de toxicidadé do TGF-βΙ. Como se mostra na FIG. 23, os animais tratados com TGF-βΙ exibiram caracteristicas normais,· não se observaram anormalidades aparentes após exame grosseiro da maioria dos orgãos durante a biópsia. 0 inserido é representativo do tamanho dos tumores removidos de cada grupo no final da experiência (dia 20) antes da submissão para patologia. Os tumores removidos dos animais de experiência (dia 21, FIG. 21) tinham uma redução superior a 90¾ nos pesos líquidos médios.

TGF-βΙ de símio recombinante, purificado até à homogeneidade a partir de sobrenadantes de cultura isentos de soro, exibiu uma curva de inibição de dose-resposta, in vitro, similar à da molécula natural (osso de bovino) guando testado numa variedade de células de tumor incluindo as células de tumor A549 utilizadas nestes estudos. Na Tabela VIII mostra-se uma comparação do efeito do TGF-βΙ recombinante e natural no crescimento do carcinoma de pulmão humano A549 em ratinhos atímicos. 0 produto recombinante foi mais eficaz na inibição do crescimento de tumor do que o TGF-βΙ derivado de osso, 60¾ de inibição comparada a 46% de inibição.

/:

318

5624-071-118

-80TABELA VIII

Comparação dos Efeitos do TGF-βΙ recombinante e natural no crescimento de tumor

TGF-β1	★ Tamanho do tumor	% de Inibição
Controlo	Tratado
Recombinante	105,4	42.6	60,0
Derivado de osso	83,4	45,4	46,0

* 0 protocolo para estas experiências é o que se descreve na legenda da FIG. 21 com a excepção de que os tumores só foram medidos em duas dimensões médias em animais de cada

Os valores representam áreas de tumor grupo. 0 rTGF-βΙ purificado, e TGF-βΙ natural de osso de bovino (Seyedin et a 1.. 1986, J. Biol. Chem. 261:5693) foram injectados peritumoralmente (200 ng/injecção, l^g no total). As medições representam tamanhos de tumor médios ao dia 17 após tratamento.

Os tumores foram excisados de grupos de animais de controlo e tratados, fixados e submetidos a exame patológico e histológico. Como se mostra na FIG. 24, painel A, sob^energia, as secções de tumor de controlo, corados com tricromo, demonstraram, predominantemente, grandes áreas de necrose dispersas através de um campo relativamente heterogéneo de tipos de células diferentes, principalmente de células epiteliais colunares. Observou-se também um grande número de vasos sanguíneos. Em contraste, as secções similarmente preparadas de espécimes de tumores inibidos com TGF-βΙ, (b) na FIG. 24,demonstraram uma pequena necrose, uma organização mais evidente, e ume distribuição diferente dos tipos de células. Particularmente evidente foi o aumento na ligação de tecido conjuntivo (coloração azul) relativamente às espécimes de tumor de controlo. Adicionalmente, a vascu1 aridade geral pareceu diminuída relativamente aos tumores de controlo. Quando examinadas com uma ampliação mais elevada, as áreas não necrót i cas dos

5624-071-118 •ttumores de

TTO de tipos de células semelhantes às epite pobremente diferenciadas: sendo t densidade dos núcleos corados indicar: proliferação das células de tumor. Em iais e de tipos de células mhem evidente a elevada c uma elevada velocidade de contraste, os espécimes de tumores tratados com TGF-β (d na FIG. 25) apresentam um aspecto significativamente diferente. 0 tipo de células predominantes observado é grande e redondo; os núcleos estão mais dispersos no campo e exibem a característica morfológica crescente de células globiet (um tipo de células de pulmão normais que segregam mucirias). Embora sejam observadas algumas células segregando muco nos espécimes de tumores de controlo, elas representam apenas uma subpopulação menor de células. Foram também mais predominantes nas secções de tumores inibidos com TGF-βΙ (d, inserido. na FIG. 25) os focos disseminados de células epiteliais colunares organizados à volta dos vasos sanguíneos.

A natureza secretora de muco do tipo semelhante a globiet de tumores tratados foi confirmada por coloração com base de Schiff e ácido periódico (PAS). As secções de tumores de controlo (a na FIG. 25) revelaram algumas áreas disseminadas de elevada densidade de g1icoproteínas. Foi observada uma intensidade de coloração PAS dramáticamente amplificada através das secções de tumores tratados com TGF-β (b na FIG. 25). É também evidente um fenótipo mais diferenciado e organizado. Ambas as secções de tumor de controlo e as secções de tumor tratado com TGF-β, foram também examinadas para determinar os g1icosaminog1icanos (GAGs), tal como foi medido por coloração com azul de Alcian a pH 2.5. Os espécimes de controlo (c na FIG. 25) exibiram uma coloração muito clara enquanto que os espécimes tratados com TGF-β (d na FIG. 25) mostraram uma coloração significativamente maior, sugerindo um nível elevado de síntese de ácido hialurónicc e ce depos i ção.

9· EXEMPLO: IDENTIFICAÇÃO ΏΑ MANQSE-6-FO5FATO EM DUAS CADEIAS

DE AÇÚCAR, LIGADAS POP ASPARAGINA, DO PRECURSOR rTGF-β1 exemplo seguinte demonstra que todos os três sitios de glicosilação potenciais (Asn-82. -136 e -176) no rTGF-βΙ de simio

BAD ORIGINAL

318

5624-071-118

-82são utilizados para adição de carbo-hidrato e que ocorre a fosforiiação dentro das cadeias laterais de oligossacáridos. Os resultados sugerem um papel funcional independente dc precursor rTGF-β1.

9.1. MATERIAIS E PROCESSOS

9.1.1. MATERIAIS

Foram obt ido:

reagente:

:eauenc i adores na

Αρρ1i ed

Biosystems. Os solventes para HPLC foram da Burdick e Jackson. CNBr foi da Kodak; a 4-vinipiridina foi da Aldrich Chemical Co.; todos os outros produtos químicos tinham grau de reagente. A protease V8 de Staphy1ococcus aureus foi da Miles Laboratories; a tripsina tratada com L-(tosi1amido-2-feni1)eti1c1orometi1cetona foi ohtida na Worthington.

9.1.2. CULTURA DE CÉLULAS

A linha descreve na isolados por de células TGF-B-3-2000 foi propagada como se Secção 7.1.1., supra. Os clones individuais foram diluição limitante em placas de 96 cavidades.

Verificou-se que um clone, o TGF^-3-2000-17 (a seguir referido como clone 17) produzia aproximadamente 2 y» g/ml de TGF-βΙ activo e foi utilizado para anãlise posterior. Estas células foram normalmente passadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo soro de feto de bovino a 10%, 150^ g/ml de L-prolina,

100 U/ml de penicilina, 100^ g/ml de estreptomicina, e metotrexato 20 yjM.

9.1.3. RADIOMARCAÇAO

As células do clone 17 foram cultivadas até à lavadas três vezes com meio isento de fosfato conf1uênc i a, sem soro e incubadas no mesmo meio durante 30 minutos a 37 ^cC. 0 meio foi então substituído com metionina fresca, cisteína e meio isento de 35 35 soro contendo 200y₄Ci/ml de [ S]-metionina e de [ S]-cisteína (NEN, Boston, MA) e as células foram incubadas durante 4 horas a °C. Para a marcação com

H]-açúcares, as células foram cultivadas até à confluência, lavadas com meio isento de soro e marcadas durante 20 horas em meio 100 juCi/ml de ^r3 isento de soro contendo .3

H]-glucosamina ou de [ H]-manose (NEN, Boston,

MA). Os sobrenadantes isentos de soro radiomarcados foram reco70 318

5624-071-118

Ζ'

Ζ

-83lbidos, centrifugados a 4000 x g durante 10 minutos. extensivamente dialisados contra ácido acético 0.2 M e 1iofi1izados.

9.1.4. ELECTROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

Os sedimentos secos foram analisados sob condições de redução em geles de SDS-poliacri1amida a 15% ou em geles de gradiente de SDS-poliacrilamida de 7,5-15% como se descreveu (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685). Os geles foram corados com azul de Coomassie, f1uorografados (para determinar as proteínas 35 3 marcadas com [ S]- e [ H]- (Chamberlain, 1979, Anal. Biocbem. 98:132-136) e expostos a filme de raios X Cronex-4. Alternativamente, as amostras liofilizadas foram digeridas com N-glicanase (Genzyme, Boston, MA) durante 16 boras a 37 ^cC, utilizando as condições recomendadas pelo fabricante, antes da electroforese em gel de poliacrilamida.

9.1.5. HIDRÓLISE ÁCIDA

O precursor rTGF-βΙ marcado com [ *T] , e os glicopéptidos 32 marcados com [ P] foram hidrolisados em HC1 6N durante 2 horas a 95‘C. Os produtos foram separados por electroforese a pH 1,9 e 3,5 e detectados por autorradiografia como se descreveu (Cooper et a 1 . . 1983, Metb. Enzymol. 99:387-402). Alternativamente, a electroforese a pH 8,9 (carbonato de amónio a 1%) foi seguida por cromatografia (ãcido isobutírico 65%, piridina 5%, ãcido acético 3%, butanol 2%, ãgua 25%). Os padrões internos (fosfoserina, fosfotreonina, fosfotirosina) foram detectados por coloração com ninidrina. A manose-6-fosfato foi detectada por pulverização com ácido perclórico a 70%: HCI IM: molibdato de amónio a 4%: acetona (5:10:25:60), secagem, e exposição à luz ultravioleta.

9.1.6. S-PIRIDILETILAÇAO

Para redução, trataram-se 50 Mg de precursor TGF-βΙ e 225000 ' o 7 cpm de precursor rTGF-βΙ marcado com l“’“P] , derivados do sobrenadante isento de soro das células do clone 17, com ditiotreitol (20mM) em 100 yU de tampão Tris-HCl 0,4 M, pH 8.5, contendo HC1-guanidina 6 M, 0,1% de Na^EDTA, durante 2 boras a 50^cC e, subsequentemente, foram S-piridiletilados com 4-vinilpiridina (100 mM) durante 4 boras a 22^cC. A mistura reaccional foi acidificada até pH 2,0 com TFA a 20% e dessa 1inizada numa coluna RP-300 (2,lx30mm

318

5624-071-118 <· — PU —

Applied Biosystem para a eluição. A utilizando um gradiente de iFA/acetonitrilo ncentraoao do a ceto:; i tr 11 o foi aumentada li-

nearm	ente de 0.	1 de	FF A em aç	u a. ate	60% de	acetonitrilo
C C Π t C	ndo 0.08% d	e TFA,	durance 1.	5 noras,	cauda 1	de 100 1/mi
nut o,	a 35cC.
0 17	. CLIVAGEM	QUÍMICA	Ε ENZIMATI	CA

Para a clivagem com CNBr nos resíduos de metionilo, dissolveram-se 650 pmole de precursor TGF-βΙ S-piridi1 eti1ado e 160 000 cpm de precursor TGF-βΙ S-piridi1 eti1ado marcado com [^“P] , em 30 μ 1 de ácido fórmico a 70% e adicionaram-se 4 jli 1 de uma solução contendo 60 mg de CNBr em 100 /Ide ácido fórmico a 70% (Gross e Witkop, 1962, J. Biol. Chem. 237:1856-1860). A reacção prosseguiu sob uma atmosfera de azoto durante 4 horas a 30°C e continuou durante umas 18 horas adicionais a 22°C no escuro.

A clivagem com protease V8 de 5. aureus foi realizada em 40 y*l de tampão de Tris-ácído acético 0.1 M. pH 8,0, contendo ureia 3 M, a 37°C durante 10 horas. A relação enzima/substrato foi de 1 para 10 (p/p). A digestão com tripsina do grupo A e do grupo B (FIG. 31-A) foi realizada em 40 / 1 de tampão de Tris-ácido acético 0,1 M, pH 8,0, contendo 30% de acetonitri1 o, com uma relação de enzima/substrato de 1 para 20, a 37°C durante 15 horas. Os digeridos enzimáticos foram acidificados com TFA a 20% até pH 2.0 e separados por HPLC de fase inversa.

9.1.8. PURIFICAÇÃO DOS PÉPTIDOS

A HPLC foi realizada num sistema de HPLC Waters consistindo em duas bombas M 6000 A, um controlador de sistema, um injector U6K, um detector de comprimento de onda fixo (214 nm) modele 441. ou um sistema de separação modelo 130A (Applied Biosystems), e num registador de gráficos. A cromatografia de penetração em gel numa coluna Bio-Sii TSK-250 (7,5 x 600 mm; Bio-Rad Laboratories) foi realizada em TFA a 10%. contendo 40%'. de acetonitrilo com um caudal de 0,25 mi/minuto. A purificação dos péptidos HPLC de fase inversa foi realizada a 35^cC numa coluna RP-300 (2,1 x 30 mm;

Applied Biosystems). Foram utilizados para eluição os gradientes de acetonitrilo lineares compostos por 0,1% de TFA em água como tampão de partida e acetonitrilo contendo 0,08% de TFA como tamt--BAD ORIGINAL

318

5624-071-118

-85pão limitante. Os péptidos foram recolhidos manualmente. Os péptidos de protease V8 indicados por E. e os péptidos de tripsina indicados por T puderam ser utilizados para análise da sequência sem purificaÇão adicional.

9.1.9. ANALISE DA SEQUENCIA DE AMINOÁCIDOS

A análise automática da sequência foi realizada num sequenciador de aminoácidos modelo 475A (Applied Biosystems) utilizando o programa RUN470-1. Um total de 1,5 mg de BioBrene Plus (Applied Biosystems) foi aplicado e sujeito a dois pré-ciclos de Degradação Edman antes da aplicação da amostra. A conversão dos derivados de tiazolinona em aminoácidos de feni1tio-hidantoína foi realizada com TFA a 25%. Os derivados dos aminoácidos de feniltío-hidantoína foram separados por HPLC de fase inversa, em série, num analisador modelo 120A PTH (Applied Biosystems), como se descreveu (Marquardt et a 1., 1987, J. Biol. Chem. 262:12127-12131).

9.1.10. ESTUDOS DE LIGAÇAO

O precursor TGF-βΙ foi purificado por cromatografia de penetração em gel numa coluna Bio-Sil TSK-250 e por HPLC de fase inversa numa coluna Vydac C4. Iodaram-se aproximadamente 6 ug de 125 precursor purificado com 1 mCi de [ I] como se descreveu (Frolik et al.. 1984, 3. Biol. Chem. 259:10995-11000). Foi utilizado um ensaio de receptor de fase sólida para medir a ligação do

125 precursor { I]-TGF-B1 ao receptor de manosa-6-fosfato /1GF-II (Roth et al.. 1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:600-606).

As cavidades de microtítulo de policloreto de vinilo foram sequencialmente revestidas com 40 1 de proteínas A (20 yi 1 em

NaHCO

20 mH. pH 9,6), anticorpos de coelho para o receptor de

IGF-II (50 g/ml) e 500 ng de receptor de cérebro de feto humano purificado (id.). 0 continha HEPES 50 mH. 0,1% de Tween 20 e tampão utilizado para todas

1avagens pH 7,8, NaCl 50 mM, 0.1% de Triton-x-100, 0,1% de albumina de soro de bovino. As cavidades foram então incubadas com 5% de leite seco não gordo durante 20 minutos a 4 ” C e adicionou-se, a cada cavidade, o precursor TGF-βΙ radiomarcado. Após 3 h a 4‘’C, as cavidades foram lavadas quatro vezes, recortadas e contadas. As contagens não

313

5624-071-118

-85específicamente ligadas foram determinadas na ausência de receptcr e subtraídas antes cio calculo da percentagem de inibicác.

9.2. RESULTADOS

As três formas estruturais de rTGF-31 segregado pelas células do clone 17 são ilustradas pelo diagrama de linhas da FIG. 25A. Também se indicam na FIG. 26A os três sítios de g1icosi1 ação. ligados a asparagina, potenciais, previstos a partir da sequência de ADN do precursor de TGF-pl de slmio:

Asn-82, -136 e -176 (FIG. 1 e Sharples et_al_. , 1987, DNA

6:239-244) .

A FIG. 26B mostra um autorradiograma de proteínas marcadas com [ S] , segregadas pelas células do clone 17, analisadas por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. As proteínas a, b e c podem ser facilmente visualizadas. As proteínas precursoras a e b 3 3 podem ser marcadas com [^JH]-glucosamina, [ H]-manose, e [ P]-fosfato (FIG. 26C, 26D e 26E) indicando que as proteínas precursoras, rTGF-βΙ a e b, mas não o rTGF-pl maduro (proteína

c), estão ambas fosforiladas e glicosi1adas. A digestão das 35 proteínas precursoras marcadas com [ S], com N-glicanase, resultou numa mudança na migração das bandas a e b para bandas de migração mais aguçadas e rápidas, tendo a mais larga das quais um peso molecular de aproximadamente 39000 (FIG. 27A, faixa 2), compatível com o peso molecular calculado de 41200 para a proteína precursor TGF-pl a. A digestão das proteínas, marcadas com [ P], com N-glicanase e o subsequente fraccionamento do digerido por electroforese em gel de SDS-po1íacri1amida indicou que a enzima tinha removido a marcação das proteínas precursoras rTGF-βΙ (FIG. 27B, faixa 2). sugerindo que a marcação com p'P] foi incorporada nos oligossacáridos ligados a asparagina.

As proteínas precursoras rTGF-βΙ, glicosiladas e fosforiladas. a e b, foram sujeitas a clivagem com brometo de cianogénio e subsequente digestão enzimática para posterior caracterização dos sítios de fosfori1 ação. Os g1icopéptidos marcados foram purificados por cromatografia de penetração em gel e por HPLC de fase inversa. A células da sequência dos três fragmentos indicadas na FIG. 28 indicou que a ASN-82. Asn-136, e Asn-176 estão glicosi 1adas. Nos péptidos E(77-91) e E(134-139) encontrou-se mais do que 95¾ co marcado. O péptido T(174-180) //

-87O da marcação com [

S-ρiriò iIeti1ado

A c r om a t oçr a íi a .-,-1 > r z· Ρ η .- — - , 1

J mcorporaca total .

?i clivado com CNLr :e penetração em cel

TSK-25C! resolvera c mostra-se un.

precursor riGE-Sl nos resíduos ce metionina ccc fragmentos CNLr ntn;

Γ~Ρ]-Μ(134-253) , e o [ ^P ] -M ( 39-113 ) . Na FIG. cromatograma representativo.

ΜΟ9-113) foi posteriormente subfragmentado com protease V8 de S. aureus. 0 digerido de enzima foi acidificado e os péptidos separados por HPLC de fase inversa. Na FIG. 30 mostra-se um cromatograma representativo. Determinaram-se as sequências

3?

. , , r.,-,. „ . Arnbos os péptido completas de [^P]-E( 76-91) e [ ''Ρ ] -E ( 76-94 ) contêm um ácido glutêmico carboxi-termina 1.

compatível com de ã

no especificidade da protease. Ambos os péptidos continham um residuo não identificado na posição 82 [Tabela IX). A sequência de ADN prevê um resíduo de asparagina na posição do produto tradução do precursor TGF-βΙ, um sítio potencial para glicosílação ligada a N. 0 rendimento esperado de PTH-Asn ciclo 7 podia ter permitido a identificação de uma asparagina não modificada. 0 rendimento de PTH-Asn na posição 82 foi de aproximadamente 0,5% do esperado com base nos rendimentos dos resíduos adjacentes. 0 baixo rendimento de PTH-Asn-82 pode ser devido à solubilidade diminuída, do derivado de tiazolinona modificado, no solvente de extracção, o cloreto de outros aminoácidos de tiazolinona.

subsequente e1ectroforese bidimensiona1 de []-E(76-91) detectaram manose-6-í³²P]-fosfato, FIG. 31.

M(134-253) foi posteriormente subfragmentado ccm protease aureus. obtende-se dois péptidos maiores marcados com butilo, relativamente

A hidrólise ácida e 32, ao:

V8 de S. ,3 'P] , como se sequências dos péptidos glutamico carboxi-termina especificidade da protease io stra na

FIG. 3IA. Determinou-se que ambas as indicados continham ambas um ácido o que é compatível com a péptido []-Ε(134-139) continha um resíduo não identificado na posição 136 (Tabela IX). 0 rendimento do PTH-Asn previsto foi de aproximadamente 2% do esperado, com base nos rendimentos dos resíduos adjacentes. e assim assumiu-se que era Asn glicosilada. A hidrólise ácida e a

BAD ORIGINAL

318

5624-071-118 •ecm e1ectrofor;

y.f ·

-83bidimensional ce [ P]-E(134-l39) ;e' τ o

IFIG. 32) .

Ei 170-194) ,

O digerido fo face inversa

P}-fosfato A 1111-. 31A), contenda ementado ccm triosina. eparados por EPLC d<

cromatograma representativo. Foi determinada a sequência de 7(174-180) (Tabela IX). 0 péptido T(I74-180) continha um residuo nâo identificado na posição 176. 0 rendimento foi de aproximadamente 1% do esperado, com resíduo adjacente Asn-177 sugerindo a

SôCO, 6 SU>0 os péptidos mostra-se i acidificado e . Na FIG. 31B do PTH-Asn previsto base no rendimento glicosilação do Asn-176. fica do 7(174-180). Este do

É evidente a heterogeneidade cromatoarã32, péptido continha menos de do 'P] total incorporado na proteína precurs<

A hidrólise ácida e subsequente electroforese bidimensiona1 detectaram a manose-632

-[ ^Pj-fosfato (não mostrada).

pico B (FIG. 31A) foi seco e redigerido com protease V8 de Ξ. aureus e, subsequentemente, com tripsina e os péptidos foram separados por HPLC de fase inversa. Obtiveram-se padrões de péptidos similares como se mostra nas FIG. 31A e FIG. 31B, sugerindo uma clivagem incompleta de M(134-253) com protease V8.

fina dof

A análise electroforética de camada ãcidos das proteínas precursoras totais glicopéptidos purificados, mostrou gue incorporado no manose-6-f osf ato ; não foi incorporado [''^P ]-fosfato na Ser. Thr, Tyr (FIG. 32A-C) . A comigração dos péptidos mcorporacos marcados com (‘“Pl e dos padrões de manose-6-f osf ato foi observada após electroforese em tampões a pH 1,9, pH 3,5 e pH 8.9, e em dois diferentes tampões de cromatografia (FIG. 32D e produz i r q 1 i cosli(a e b) ,32 o hidrolisados bem como dos foi

P]-fosfato 32 dados nâo apresentados). A hidrólise acida pode também ⁱ⁺· ~ a partir de proteínas modificadas com fosfatidι1inosito 1 (Lon e Saltiel. 1988, Science mas isto só se verificou no terminai carboxilo das

239:268-295). proteínas e é pois pouco provável que precursor rTGF-β!.

BAD ORIGINAL ;e i;

responsável pela manose-6-fosfato no

318

5624-071-118

-89TABELA IX

Dados da Sequência de Aminoácidos para Gl icopéptidos do Pr ec ur sor r ^T3Ç-S _S -P i r i d i 1 e t i 1 ado

Rendimento em Rendimento em péptido (ciclo) péptido (ciclo)

Posição Residuo (pmol) Posição Residuo (pmol)

E(76-91)

76	Ala	(1)	87,0
77	Vai	(2)	91,3
78	Leu	(3)	111,2
79	Ala	(4)	100,5
80	Leu	(5)	75,7
81	T yr	(6)	71,4
82	Asn	(?)	0,2
83	Ser	(8)	28,5
84	Thr	(9)	42,5
85	Arg	(10)	43,6
86	Asp	(11)	45,8
87	Arg	(12)	47,6
88	Vai	(13)	39,0
89	Ala	(14)	37,9
90	Gly	(15)	23,3
91	Gl u	(16)	10,7

134	Phe	E(134-139) (1) 99,4
135	Phe	(2)	98,3
136	Asn	(3)	2,1
137	Thr	(4)	55,5
138	Ser	(5)	28,1
139	Glu	(6)	52,8

T(174-1SO)

174	T yr	(1)	10,0
175	Ser	(2)	3,8
176	Asn	(3)	0,1
177	Asn	(4)	8,5
178	Ser	(5)	3,3
179	Tr p	(6)	5,1
180	Arg	(7)	1,7

Realizaram-se também experiências concebidas para determinar se o precursor TGF-βΙ é capaz de se ligar ou não ao receptor de 125 manose-6-fosfato. 0 precursor TGF-βΙ marcado com I foi incubado com receptor de manose-6-fosfato purificado. Os resultados apresentados na FIG. 34 demonstram que o precursor pode ligar-se ao receptor purificado uma vez que se liga ao receptor aproximadamente 30 vezes tanto radioligando como em incubações de controlo sem receptor. Esta ligação foi especifica uma vez que ela foi quase completamente inibida (90%), quer por ί70 318

5624-071-118

-90-90precursor TGF-βΙ 100 ηΜ quer por manose-6-fosfato 50^M.

10. EXEMPLO,......EXPRESSÃO DE VARIANTES......TGF-βΙ EMCÉLULAS COS

Foi utilizada a mutagénese dirigida ao sitio, para alterar a estrutura primária do TGF-βΙ nos três resíduos de cisteina, localizados na região pró do precursor TGF-βΙ, por troca das sequências de codificação dos resíduos de cisteina nas posições de aminoácidos 33, 223 e 225 (FIG. 1) pelas sequências de codificação da serina. Foram utilizadas estruturas mutantes para transfectar células COS e analisaram-se as proteínas variantes TGF-βΙ recombinantes produzidas pelos transfectantes. Os resultados indicam que a CYS-33 pode estar envolvida na regulação do processamento do TGF-βΙ maduro.

obtém-se um precursor que resulta níveis mais elevados de TGF-βΙ maduro

Da modificação da CYS-33 finalmente na produção de

10.1 MATERIAIS E PROCESSOS 10.1.1. Ç: AR AC TER I Z AÇÃ.0...p0__PÉ PT I D_0.....CNBr_M(134-253)² precursor tTGF-βΙ sintetizado por células CHO foi purificado por cromatografia de penetração em gel, clivado com CNBr e os péptidos purificados como se descreveu (Secção 8., etseq. aqui). Os péptidos contendo cisteina foram detectados após redução com tributilfosfina e acoplamento com 7-f1uorobenzo-2-oxo-1,3-diazol-4-sulfonato de amónio (Sueyoshi etal., 1985, J.

Biochem. (Tokyo ) 97:1811-1813) e purificados até à homogeneidade por HPLC de fase inversa numa coluna qBondapak C^g (Waters Associates Inc., Milford, Mass.).

Os péptidos foram separados em geles de SDS-poliacrilamida a 15¾ e corados com azul brilhante de Coomassie R-250. Os péptidos ligados por dissulfureto foram analisados com um sequenciador Applied Biosystems 475A. Os aminoácidos derivados de feniltio-hidantoina foram avaliados num analisador Applied Biosystems 120A PTH como se descreveu (Gentry etal., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:4162-4168).

10.1.2. CONSTRUÇÃODE.....VECTORESDE ΕXPRESSÃOÇODIFICANDO 0Ξ

WU ANTES.....TGF-βΙ E.JRANSFECÇOES DE.....ADN pTGF-0-2 (Sharples et a 1 . , 1987, DNA 6 = 239-244) foi digerido com PstI e EcoRI e ligou-se o fragmento de 1400 pb,

Χ·,

318

-91contendo a região de codificação do TGF-βΙ completa, ao plasmideo pSP64 que tinha sido previamente digerido com PstI e EcoRI. construção foi utilizada nara transformar E. coli HB101

A e

de no isolou-se o plasmideo pSP64/TGF-|31 . 0 fragmento PstI-EcoRI

ADNc de TGF-βΙ foi retirado do pSP64/TGF-01 e inserido M13mpl8, colocando um sítio de restrição HindIII 5' em relação ao sítio PstI. Isolou-se o ADN de cadeia simples, contendo a cadeia Mpl8 e a cadeia de nâo codificação do TGF-βI, e utilizou-se como padrão para a mutagénese dirigida ao sítio. A CYS-33, CYS-223, e CYS-225 foram mudadas, individualmente, para codões SER, utilizando um sistema de mitogénese in vitro. dirigida ao oligonucleótido, comercialmente disponível (Amersham).

Para construir os mutantes utilizaram-se os seguintes oligonuc1eótidos :

5' - ACTATCCACC A G C AAGACTAT-3 5 para SER-33; para SER-223; para SER-225;

-TAGCGCCCAC A G C TCCTGTGA - 3 -CACTGCTCCTCTGACAGCAAA-3

-TAGCGCCCACAGCTCCTCTGAC-AGCAAA-3' para SER-223/ /225 .

Em cada caso, a mudança de nucleótidos efectuou a troca de codãos CYS por codões SER. Cinco a dez placas foram analisadas para determinar a mutação desejada por sequenciação de cadeia simples, utilizando o mutante final e caracterizado adicionalmente por sequenciação utilizando o processo de terminação de cadeia de didesoxilo (Sanger et ai., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A. 84:8573-8577).

As formas replicativas contendo os (ADNc)s mutantes foram isoladas, digeridas com EcoRI, reparadas para tornaros terminais rombos, e digeridas com HindiII. Os fragmentos de ADNc resultantes foram ligados em plfH3M (Aruffo e Seed, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:8573-8577; Seed e Aruffo, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:3365-3369) nos sítios HindIII e Xhol (rombos) para construir plasmídeos ρκΗ3Μ/β1 SER-33 (codificando o pré-pró-TGF-β1³³³), ρΐιΗ3Μ/β1 SER-223 (codificando o pré-pró-TGF-01^223^ puH3M/01 SER-225 (codificando o pré-pró-TGF-βΙ^³³^) e

318

5624-071-118 mH ..

(codificando o pré-pró-TGF-βΙ' • tn :

) . As ρΙΐΗ3Μ/β! SEP-223/225 células COS foram transfectadas con estes plasmídeos bem corno con: o plasmídeo ρϊΐΗ3Μ/β1 (codificando o TGF-βΙ de tipo selvagem) como T QP.7 Ρν~<Ί r* KlcgT Ί _ S r· =» H Qr* i (J S . A

Acad. Sei. U . S . A . A transfecção foi ;alizada em placas de 100 mm com 10^v células utilizando 5 ml de material de transfecção durante 2,5 horas a 37^C. As 48 horas após a transfecção, as células foram colocadas em meios isentos de soro e, 72 horas mais tarde, recolheram-se os meios dialisaram-se contra três mudanças de ácido acée analisaram-se por péptidos maduros Secção 7.1.7., se descreveu (Aruffo e Seed. 1987, Proc. Nat.l. Acad. Sei.

84:8573-8577: Seed e Aruffo, 1966, Proc. Natl

64:3365-3369) com as modificações seguintes.

.6 condicionadoí tico 0,2 M específicos de descreveu na imunomancha com anticorpos e de precursores como se mora. A bioactivídade foi determinada pelo ensaio de inibição do crescimento que se descreveu na Secção 7.1.6., supra.

10.2. RESULTADOS

10.2.1. ANALISE DAS PROTEÍNAS CODIFICADAS PELAS SEQUÊNCIAS DE CODIFICAÇÃO DO TGF-βΙ MUTANTE

Na Tabela X seguinte, apresentam-se os valores de bioactividade detectada em meios isentos de soro dialisados condicionados por transfectantes COS. As células transfectadas com o plasmídeo plí Η3Μ/β1 SER-33, codificando um precursor variante TGF-βΙ, segregam entre três e cinco vezes mais proteína biologicamente activa do que as células transf ectadas com o plasmídeo ρΊ'ι Η3Μ/β1, codificando o TGF-βΙ de tipo selvagem. Em contraste, as células transfectadas com os plasmídeos codificando os variantes SER-223 e SER-225 não segregaram níveis de proteína bioactiva mais elevados em comparação com as células transfectadas com a estrutura de tipo selvagem.

318

5624-071-118

TA BE

Bioactivicade de Meios Condicionados por Células COS transfectadas com Vários Plasmídeos codificando o TGF-βΙ

Transf ectante COS_Plasmídeo_Bi oact i vi dade (ng/ml) _A _B

COS-TGF-βΙ	ρπΗ3Μ/β1	39	50
COS-TGF-βl/SER-33	ρτΗ3Μ/β1 SER-33	209	174
COS-TGF-β1/SER-223	ρττΗ3Μ/β1 SER-223	39	37
COS-TGF-βl/SER-225	ρττΗ3Μ/β1 SER-225	26	28

As células COS foram transfectadas com plasmídeos codificando o TGF-βΙ de tipo selvagem (ρΰ Η3Μ/β1); ο TGF-βΙ com CYS-33 substituída por SER (ρΗΗ3Μ/β1 SER-33) ; o TGF-βΙ com CYS-223 substituída por SER (ρϊίΗ3Μ/β1 substituída por SER (ρΤίΗ3Μ/β1 resultados de dois ensaios

SER-223); ou o TGF-βΙ com CYS-225

SER 225). Os valores mostram os independentes de inibição do crescimento (Secção 7.1.6, supra).

A análise de imunomancha foi realizada? o^eurti-TGF-βΙ~ _OO1 3o y—Jo1 + anti-TGF-Blg^g^ como se descreveu na Secção 7.1.8., supra, para detectar proteínas relacionadas com o TGF-βΙ. Os resultados são apresentados na FIG. 33A-G. Sob condições de redução (FIG. 33D), as proteínas mutantes parecem ser idênticas às proteínas do tipo selvagem. Os anticorpos detectaram o monómero maduro de kl) (c na FIG e de 30 a 42 kj imunomancha que se

33B) bem como as formas precursoras de 44 a 56 kO na FIG. 33B). Adicionalmente, a FIG. 33D indica que a quantidade absoluta de proteínas TGF-βΙ segregadas não foi significativamente afectada pelas mutações.

As diferenças entre as proteínas TGF-βΙ mutantes e do tipo selvagem foram evidentes, quando examinadas sob condições de não redução (FIG. 33E). 0 dímero TGF-βΙ maduro (24 kD) estava presente em todos os sobrenadantes de transfectantes. Contudo, (a e b' mostra na os sobrenadantes de transfectantes.

318

5624-071-118

-94as células transfectadas com puK3M./fíl SER-33 obtiveram-se níveis aumentados de dímero de 24 kD quando comparadas com transfectantes oe tipo selvagem ÍFIG. 33E. faixas 3 e 4).

enquanto que os transf ectantes ρυΗ3Μ/β1 SER-33, ρϊϊΗ3Μ/β1 SER-225, e p?)H3M/Bl SER-223/225 produziram nív°is próximos dos do tipo se 1vagem.Este aumento em dímero de 24 kD não parece resultar da síntese/secrecção aumentada de proteínas, ou da clivagem aumentada de TGF-βΙ maduro a partir de pró-TGF-βΙ, uma vez que a imunomancha, sob condições de redução, indicou que os transfectantes ρηΗ3Μ/β1 e ρπΗ3Μ/β1 SER-33 segregaram aproximadamente quantidades iguais ue formas maduras e precursoras (FIG. 33D).

S33

Adicionalmente, as proteínas TGF-βΙ não formaram o complexo precursor de 90 a 110 k.D como formaram as proteínas de tipo selvagem (FIG, 33E). Em vez disso, foram observadas espécies de

130 a 150 kD e de 75 a 85 kD (FIG. 33E, faixa 4). Como se mostra S33 na FIG. 331 e FIG. 33G, as proteínas TGF-βΙ de 130 a 150 kD foram reconhecidas, quer pelos anticorpos específicos da região pró, quer pelos anticorpos específicos maduros, representando S33 muito provavelmente o pró-TGF-βΙ dimérico. 0 polipéptido de 75 a 85 kD só foi detectado pelo anticorpo especifico da região pró (FIG. 33G, faixa 4), representando provavelmente um dímero da S33 região pró do precursor TGFBl

Em contraste, as proteínas mutantes codificadas pelo pu H3M/ βΐ SER-223 e ρηΗ3Μ/β1 SER-225 formaram complexos precursores de a 110 kD (faixas 5 e 6 na FIG. 33E. FIG. 33F e FIG. 33G), embora estivessem também presentes algumas formas precursoras monoméricas. Os anticorpos específicos para a região pró do precursor TGF-βΙ detectaram proteínas de 44 a 56 kD e de 30 a 42 kD (FIG. 33G, faixas 5 e 6), enquanto que os anticorpos específicos para as sequências maduras detectaram apenas as espécies de 44 a 56 kD (FIG. 33F, faixas 5 e 6). Com as células transfectadas com ρηΗ3Μ/β1 SER-223/225 apenas se obtiveram formas precursoras monoméricas (faixa 7 na FIG. 33E. FIG. 33F e FIG.

33G), mas,no entanto, o TGF-βΙ maduro foi ainda proteoliticamente 9223/2^5 clivado a partir de pró-TGF-βΙ ~ e formou o dímero de 24 kD.

318

5624-071-118 <-ç /?'

-yoae

Ά constatação dos requerentes de que a eliminação do resíduo CYS-33 do precursor TGF-βΙ melhora fundamenta 1 mente o rendimento de iGF-β! segregado, talvez evitando que uma população significat íví de monómeros TGF-βΙ nascentes se ia intracelularmente aprisionada dentro dos complexos precursores de elevado peso molecular, pode constituir um processo melhorado para a produção de TGF-βΙ bioactivo recombinante. Além disso, um tal processo pode ter utilidade no aumento da produção de TGF-32 bioactivo recombinante, de TGF-03, de outras formas de TGF-β, de análogos de TGF-β ou de outras proteínas relacionadas.

10.2.2. OS RESÍDUOS PRECURSORES DE TGF-β1 CYS-223 E CYS-225 FORMAM LIGAÇÕES DISSULFURETO INTERCADEIA precursor rTGF-βΙ purificado foi clivado nos resíduos de metionina com CNBr e os péptidos resultantes foram purificados por cromatografia de penetração em gel. Os péptidos contendo CYS foram detectados como se descreveu (Sueyoshi et al.. 1985, J. Biochem. (Tokyo) 97:1811-1813) e purificados até à homogeneidade por HPLC de fase inversa. Os dados da degradação Edman localizaram as posições dos péptidos CNBr na sequência do precursor TGF-βΙ. O péptido M(134-253)₂ continha 2 meios resíduos de cisteina (determinados por análise de aminoácidos), mas era deficiente em grupos sulfidrilo livres (como se determinou com um reagente específico de tiol. fluorescente, sob condições de não redução). As pontes dissulfureto em M(134-253)₂ foram atribuídas por demonstração do carácter dimérico deste péptido. Como se mostra na FIG. 33A, o tamanho do M(134-253)_O foi estimado em 41 kD sob condições de não redução; sob condições de redução, o M(134-253) tinha um peso molecular de 24 kD. A mudança no peso molecular do M(134-253)₂ a seguir à redução. identifica duas ligações dissulfureto. intersubunidades. ligando cadeias idênticas, compatíveis com uma sequência de aminoácidos única para o péptido M(134-253)₂ e com a determinação dos meios resíduos de cisteina por análise de aminoácidos. A heterogeneidade observada do M(134-253)₂ em e1ectrofrorese em gel de SDS-poliacrilamida (FIG. 33A) pode reflectir a glicosilação em Asn-136 e Asn-176.

7Q 318

5624-071-118

S&-9610.2.3. OS PRECURSORES TGF-βΙ VARIANTES PRODUZEM TGF-β1 BIOLOGICAMENTE ACTIVO

A actividade biológica correspondeu bem à quantidade de TGF-βΙ maduro de 24 kD detectado por ímunomancha (FIG. 33E e FIG. 33F). A seguir à activação por ácido, com os sobrenadantes de células transf ectadas por plasmídeos ρ?ΐΗ3Μ/β1 SER-223, pTÍ H3M/B1 SER-225 e plfH3M/Bl SER-223/225 obtiveram-se níveis de actividade inibidora próximos do tipo selvagem (Tabela XI). Em contraste, com os transf ectantes ρΐ»Η3Μ/β1 SER-23, obteve-se aproximadamente 3 a 5 vezes mais actividade do que com os transfectantes ρ«Η3Μ/β1 Estas observações foram consistentes entre as transfecções realizadas separadamente, com células COS transfectadas com ρ.Η3Μ/β1 SER-33, gerando sempre 3 a 5 vezes mais actividade inibidora do que as células transfectadas com o plasmídeo de tipo selvagem ρ^Η3Μ/β1.

TABELA XI

Quantidade de TGF-βΙ Bioactivo Segregado pelos Transfectantes de Células COS^

P1asmídeo	+ ACIDO	- ACIDO
Ρ7ΓΗ3Μ/β1	90,3	4.7
ρ77Ή3Μ/β1 SER-33	304.8	12,5
ρ/ΓΗ3Μ/β1 SER-223	98,4	20,3
ρ7ΓΗ3Μ/β1 SER-225	77.9	11,2
ρ/ΤΗ3Μ/β1 SER-223/225	87,9	65,3

As células COS foram transfectadas com plasmídeos codificando o TGF-βΙ e com variantes: 48 h após a transfecção, os sobrenadantes foram substituídos por meios isentos de soro,· 72 h mais tarde, os meios condicionados foram recolhidos e ensaiados directamente (-ACIDO) ou a seguir à diálise contra ácido acético 0,2 M (+ACIDO) para a inibição do crescimento das células CCL64.

318

5624-071-118 /?

»

-972... .2' / &

10.2.4 . COM 0 VARIANTE TG'-'-p 1 ^{2 3/3225} OBTÉM-SETGE-βΙ BILOGICAMENTEACTIVO SEM.....ACIDIFICAÇAOPREVIA rTGF-βΙ sintetizado pelas células COS é segregado numa forma latente (TABELA XI). Simi larrnente , o TGF-βΙ é libertado pelas plaquetas na forma de um complexo latente de elevado peso molecular (Miyazono et al . , 1988, J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield et al., J. Biol. Chem. 263:7646-7654).

A activação do rTGF-βΙ pode ser realizada por acidificação.

Quer o TGE-βΙ, quer o TGE-βΙ' eram ]>, 90% biologicamente inactivos antes da acidificação, enquanto que o TGE-βΙ S223 e o >223/225

Contudo, o TGF-βΙ

TGF-βΙ S225 eram 80% inactivos pelo menos 70% activo sem tratamento com ácido e, em experiências separadas, os niveis de actividade, antes e após acidificação, eram equivalentes, sugerindo que a região pró do precursor TGF-βΙ é necessária para a latência do rTGF-βΙ. Mostrou-se recentemente que o TGF-βΙ derivado de plaquetas está não-covalentemente associado a um complexo envolvendo a região pró precursora dimérica e uma outra proteína (Miyazono et. al . , 1988, J. Biol. Chem.

263:6407-6415; Wakefield e_t__al., 1988, J. Biol. Chem. 263:7646S 2 2 3/225

-7654). 0 precursor TGF-βΙ^ ^z só existe como um monómero (faixa 7 na FIG. 33E, FIG. 33F e FIG. 33G); assim, as mudanças conformacionais resultantes da substituição, quer de CYS-223 quer de CYS-225, podem não permitir interacções entre o TGF-βΙ maduro e o precursor donde resulta a latência.

. EXEMPLO. INTER ACÇÃO D0 PRECUR 00R TGE-βΙ ..COM 0.. RECEPTOR DE

FACTORDE CRESCIMENTOSEMELHANTEAIN3ULINA/MANOSE-6-FOSFATO

As experiências que a seguir se descrevem demonstram que o precursor TGF-βΙ se liga ao receptor de factor de crescimento semelhante à insulina (IGF)-II/6-manose-6-fosfato (manóP). Estes estudos foram apoiados em parte pelo National Institutes of Health Grant DK34926 e por uma doação da Republic Foundation of Science, SR Srbia, Jugoslávia.

11.1 MATERIAIS.....Γ PR OCE S50S

11.1.1. MATERIAIS foi

IGF-II recombinante foi uma oferta do Dr . Smith (Eli Lilly Co.) e foi iodado (160 Ci/g) como se descreveu (Steele-Perkins et

318

5624-071-118

-98a1., 1988, J. Biol. Chem 263:11486-11492). 0 precursor TGF-βΙ recombinante foi preparado e iodado (190 Ci/g) como-^descreveu na Secção 8.3 e na Secção 9.1.3.. supra, respectivamente. 0 TGF-βΙ latente purificado foi isolado a partir de plaquetas (Miyazono et a 1., 1988, J. Biol. Chem. 263:6407-6415) e dessa 1inizado numa coluna Superose 6. 0 receptor de IGF-II/man6P e os anticorpos policlonais para esta proteína foram os que anteriormente se descreveram (Hari et al.. 1987, EMBO J. 6:3367-3371). As células CHO sobrexprimindo o receptor de IGF-II/man6P humano foram produzidas como previamente se descreveu para o receptor de IGF-I humano (Steele-Perkins et aI., 1988, J. Biol. Chem. 263:11486-11492). Os anticorpos monoclonais para o receptor de IGF-II/man6P (Braukle et a 1 . , 1987, J. Cell. Biol. 104:1735-1742) foram uma oferta do Dr. A. Hasilik (Universitat Munster). Um anticorpo anti-péptido policlonal (para os resíduos 81-94) para/^sequência precursora de TGF-βΙ foi preparado como se descreveu na Secção 7.1.8., supra.

11.1.2. ESTUDOS DE LIGAÇÃO AO RECEPTOR E DE INTERN ALIZAÇAO

As almofadas de gordura: -Dawley machos (180-220 > g) digeridas com

Biol. Chem. pré-incubados epididimais de ratazanas Spragueforam excisadas, trituradas, e colagenase como se descreveu (Rodberg, 1964, J. 239:372-380). Os adipócitos isolados foram com ou sem insulina 1 / M, durante 10 minutos a

37°C em 0,7 ml de tampão de Krebs-Ringer (NaCl 107 mM, KOI 5mM, CaC^ 3mM, MgSO^ lmM, NaHCO^ 7 mM, glucose lOmM, e Hepes 20 mM, pH 7,8) com 3% albumina de soro de bovino. Adicionou-se o ligando marcado indicado e continuaram-se as incubações durante 45 minutos a 37 ®C. As células foram separadas dos meios por centrifugação através de óleo de silício e contou-se a radioactividade na camada celular.

Os estudos de ligação e de i nternalização com células CHO transfectadas e de controlo foram realizados em placas de cultura de 24 cavidades. As células confluentes foram lavadas e incubadas, durante 5 horas a 4^eC, com o ligando marcado em 0,3 ml de tampão de ligação (Hepes 100 mM, pH 7,6, NaCl 120 mM, MgSO^ 1,2 mM, acetato de sódio 15 mM, glucose 5 mM). As células foram então lavadas duas vezes, lisadas com dododeci1-sul fato de sódio

7'fÇ/· 70 313 w

5624-071-118

-99a 0,1% e contadas. Para os estudos de inter nalização, foi adicionado ligando marcado às células em meio de Ham F-12 isento de soro contendo 0.1% de albumina de soro de bovino e Hepes 20 mM pH 7,6. Após os períodos de tempo indicados a 37^cC, as células foram colocadas em gelo e lavadas com solução salina tamponada com Hepes, pré-arrefecida. contendo CaCl^ 0,3 mM. Para determinar a fracção resistente ao ácido (i.e. o ligando internalizado), as células foram incubadas durante 5 minutos a 4°C com CHgCOOH 0,2M, NaCl 0,5 M, pH 3,0 (Haigler et a 1., 1980, 3. Biol. Chem. 255:1239-1240.). As células foram então lavadas, so1ubi1izadas, e contadas como anteriormente.

Foram também realizados estudos de ligação com receptor de IGF-II/man6P isolado (Purchio et al.. 1988, 3. Biol. Chem. 263:14211-14215). Para estes estudos, o receptor purificado foi absorvido nas cavidades de microtítulo revestidas com 100 nM de um anticorpo monoclonal (2C2) especifico para o receptor de IGF-II/man6P humano (Braukle et a 1 . . 1987, 3. Cell. Biol. 104:1735-1742). 0 precursor TGF-βΙ recombinante marcado foi então incubado com o receptor, na presença das concentrações indicadas de ligando de competição, durante 3 horas a 4 °C. As cavidades foram então lavadas, recortadas, e contadas.

11.1.3. ANALISE DE MANCHA WESTERN

O precursor TGF-βΙ recombinante e purificado de plaquetas foi sujeito a electroforese em geles de dodecil-sulfato de sódio-poliacrilamida (12,5%), reduzidos, das para filtros de nitroce 1u1ose

As amostras foram transferi(Schleicher e Schuell) aue foram então incubadas numa solução de bloqueio (3 % ?a^e lbumina de soro de bovino e 0,1% de Triton X-100 em solução salina tamponada com Tris, pH 7,5) durante 30 minutos a 24 ^cC. Os filtros ^cfepois incubados durante a noite a 4 ‘C, quer com 1) um anticorpo anti-péptido de coelho para a sequência precursora de TGF-βΙ

IGF-II/man6P para este (diluído a 1:100) (10); quer com 2) receptor de purificado, seguido por um anticorpo policlonal receptor (Hari et al.. 1987, EMBO 3. 6:3367-3371). Após quatro lavagens, os filtros foram incubados com IgG anti-coelbo conjugada com fosfatase-a1 ca 1ina (1:5000, Promega) durante lha f ' / <íl

318

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FF

Τ’ ··» //ft.-. '·

-100A ligação do tratados com

4QC, lavados, e depois desenvolvidos com o substrato de fosfatase (Promega ).

11.2. RESULTADOS

11.2.1. 0.....PRECURSORTGF-β1.......RECOMBINANTE.......LIGA-SEAOS.....RECEPTORES

DEIG.--II/MAN6PNOSADIPCCITOSE......ÉINTERNAI. IZADO

125

Mediu-se a ligação I-IGF-II e do precursor TGF-βΙ recombinante aos adipócitos primários de ratazanas, com e sem pré-tratamento com insulina. Como previamente referido (Oka et al., 1985, J. BIOL. Chem. 260:9435-9442; Appell et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:10824-10829), a insulina provocou um aumento de 2 a 3 vezes (média=2,4 + 0,3, n=4) na ligação especifica do IGF-II aos adipócitos (FIG. 35A). Como se mostra na Fig. 35B, a insulina provocou um aumento similar na ligação do precursor de TGF-βΙ recombinante aos adipócitos (média=2,7 + 0,3, n=4).

prcursor TGF-βΙ ao controlo e aos adipócitos insulina foi inibida em 65¾ e 81%, respectivamente, pela man6P 3 mM (FIG. 35B). Estes resultados indicam que o precursor TGF-1 recombinante estava ligado ao receptor de IGF-II/man6P nos adipóci tos.

Realizaram-se então estudos de ligação adicionais com uma linha de células CHO que foram transfectadas com um ADNc codificando o receptor de IGF-II/man6P (Morgan et al., 1987,

Nature 329:301-307) e seleccionadas para a sobre-expressão da proteína receptora. Estas células transfectadas ligaram especificamente cerca de 10 vezes mais IGF-II (FIG. 36A), bem como cerca de 15 vezes mais precursor TGF-βΙ recombinante, do que as células CHO originais; a ligação do precursor TGF-βΙ foi substancialmente inibida pela man6P (FIG. 36B). A inibição pela man6P foi dependente da dose e observou-se uma inibição de até metade do máximo para 10 uM (FIG. 37A). 0 manose-1-fosfa to foi pelo menos

1000 vezes menos eficaz na inibição da ligação do precursor TGF-βΐ (FIG. 37A). A ligação do precursor ás células transfectadas foi também inibida pelo precursor TGF-βΙ não marcado mas não pelo TGF-βΙ maduro (FIG. 37B). A IGF-II 100 nM inibiu a ligação do precursor TGF-βΙ em 34%.

precursor TGF-βΙ ligado foi também testado para avaliar a

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-101-

sua capacidade para ser internalizado nas células transfectadas. Após vários períodos de tempo a 3720, o precursor TGF-βΙ da superficie celular foi removido por uma lavagem ácida das células e iriediu-se o precursor TGF-βΙ resistente ao ácido (i.e. internalizado) (Hagler etal., 1980, J. Biol. Chem. 255=1239-1241). Após 15 minutos verificou-se que >75% do precursor TGF-βΙ ligado especificamente estava num compartimento resistente ao ácido (FIG. 38). Observou-se um aumento adicional nas contagens totais e internalizadas após 20 minutos, e este pareceu resultar de uma via de ligação não especifica, uma vez que a man6P não bloqueou o aumento (FIG. 38).

11.2.2. PRESENÇA DE MAN0SE-6-F0SEATOEMTGF-β1LATENTE

Para determinar se o TGF-βΙ latente, isolado a partir de plaquetas, continha também man6P, testou-se o precursor TGF-βΙ de plaquetas, altamente purificado, para avaliar a sua capacidade para inibir a ligação do precursor TGF-βΙ recombinante, marcado, ao receptor de IGF-II/man6P isolado. Verificou-se que o complexo TGF-βΙ latente de plaquetas era um potente inibidor desta ligação, com uma inibição até metade do máximo ocorrendo para, aproximadamente, 0,2 nM (FIG. 39).

Para examinar adicionalmente o complexo TGF-βΙ de plaquetas em relação à presença de man6P, este material foi sujeito a electroforese num gel de SDS-poliacrilamida reduzido, transferido para uma membrana de nitroceiulose, e sequencialmente incubado com o receptor de IGF-II/man6P purificado, anticorpos de coelho para o receptor, Ig anti-coelho conjugada com fosfatase-alcalina e um corante histoquímico para a fosfatase-alcalina. Embora esta técnica pudesse detectar a man6P no precursor TGF-βΙ recombinante não clivado (FIG. 40, banda a) e no fragmento precursor (FIG. 40, banda b), não foi detectada com o TGF-βΙ de plaquetas nenhuma banda do peso molecular apropriado. Em experiências de controlo, um anticorpo especifico para a sequência do precursor TGF-βΙ podia detectar um fragmento de precursor TGF-βΙ de plaquetas (FIG. 40, banda c).

-10212, ANALISE EXEMPLIFICATIVA DO PAPEL FUNCIONAL DOS

318

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CARBQ-HIDRATQS NO PRECURSOR TGF-βΙ

Os estudos seguintes examinam a importância dos epítopos de carbo-hidrato do pré-pró-TGF-β1 no processamento do TGF-βΙ maduro. Os resultados demonstram que a adição de oligossacáridos e a remodelação, desempenham um papel essencial no processo de secreção de TGF-βΙ, mas não desempenham qualquer papel na proteólise específica do pré-pró-TGF-βΙ e, além disso, que o processamento proteolítico do precursor TGF-βΙ ocorre intracelularmente em vesículas ácidas.

12.1. MATERIAIS E MÉTODOS

12.1.1. MATERIAIS

Os inibidores de glicosilação, swainsonina (SW), tunicamicina (TU), castanospermina (CA); 1-desoximanojirimicina (dMM), e l-desoxinojiricina (dN) assim como as enzimas de adaptação de g1icosi1 ação, endog1icosidase H (endo H) e neuraminidase, foram adquiridas em Boehringer-Mannbeim Biocbemicals, Indianapolis, IN. A N-glicanase foi obtida na Genzyme, Boston. MA. O difosfato de cloroquina, a monensina e o dietί1aminoeti1dextrano (DEAE-dextrano; PM 500 000) foram adquiridos na Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. 0 Nuserum foi obtido na Co11aborative Research, Lexington, MA. Todos os outros reagentes de culturas de células foram adquiridos na GIBCO Laboratories, Grand Island, NY. A [35-S]-L-Cisteína e a [35-S]-L-Metionina foram obtidas na NEN Rearch Products, Boston, MA e possuíam actividades especificas >600 e >800 Ci/mM, respectivamente. 0 [32-P]-ortofosfato (sem transportador) foi obtido na ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA. As as enzimas de restrição e/ outras enzimas modificantes de ADN foram obtidos da Betbesda Research Laboratories, Bethesda, MD.

12.1.2. CULTURA DE CÉLULAS

As células CHO-TGF-B3-2000 (clone 17) foram cultivadas e tratadas como se descreveu na Secção 7.1.1., supra. As células COS-1 (ATCC CRL 1650) foram cultivadas em meio de Eagles modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% soro de feto de bovino,100 U/ml de penicilina e 100 /g/ml de estreptomicina, e tratadas por tripsinização.

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-10312.1.3. MARCAÇÃO METABÓLICA E ANALISE DQ TGF-βΙ SEGREGADO

As células TGF-31-2000 foram cultivadas até à confluência, em placas de 35 mm, contendo 2 ml de meio completo. 0 meio foi substituído com meio deficiente em metionina, cisteina e soro, e incubado durante 1 h. As células foram depois marcadas durante 0.5 h com [35-S]-metionina e [35-S]-cisteina, cada uma numa quantidade 100 y/Ci/ml. Após a marcação, as células foram lavadas três vezes em solução salina equilibrada de Hanks e implantadas em DMEM completo isento de soro. Os inibidores de glicosilação, bases fracas ou ionóforos estavam presentes no meio de cultura de tecidos durante todas as incubações anteriores. Os sobrenadantes foram directamente analisados por SDS-PAGE após ebulição em tampão de preparação de amostra de SDS-PAGE. Foram utilizados geles de gradiente de acrilamida, 7,5-20%.

Para a marcação com [32-P]-fos fato, as células foram incubadas em placas de 35 mm contendo 1 ml de fosfato e DMEM isento de soro, durante 1 h. As células foram marcadas com 1 mCi por ml de [32-P]-ortofosfato durante 6 h. O meio isento de células foi recolhido e o excesso de [32-P]-fosfato foi removido por dessalinização numa coluna de 10 ml de Sephadex G-25 equilibrada com bicarbonato de amónio 50 mM. As primeiras três fracções de 0,75 ml contendo radioactividade foram reunidas e 1iofi1izadas, o sedimento liofilizado foi dissolvido em 1001 de tampão de preparação de amostra, e analisaram-se 10 1 por SDS-PAGE e autorradiografia.

12.1.4. QUANTIFICAÇÃO DO TGF-βΙ POR SDS-PAGE

A quantidade de TGF-31 nos sobrenadantes de cultura foi medida, a partir de geles de SDS-poliacri1amida, por densitometria após os geles serem f1uorografados. Na maioria dos casos, a relação de TGF-31 maduro para a quantidade de formas precursoras foi invariante. Assim, utilizou-se a quantidade observada de TGF-31 maduro de 12 kD como uma medida do factor de crescimento total segregado.

Para medir variações na quantidade de processamento, determinou-se o nível total de TGF-31 segregado, após densitometria, por soma de todas as três formas de factor de crescimento recomlesé*'

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-104binante e normalização do nível de secreção entre as várias

fci então calculada para indicar o nível de processamento proteolítico.

12.1.5. DIGESTÃO COM ENZIMAS DE ADAPTAÇÃO DE GLICOSILAÇÃO

Trataram-se os meios de cultura condicionados, marcados com [35-S]-cisteina e [35-S]-metionina, com as enzimas de adaptação de glicosilação. Tratou-se o meio de cultura (23 ^1) com 5 mU de endo H ou 25 mU de neuraminidase, a 37 ° C durante a noite. A digestão com N-glicanase foi realizada a 30°C durante a noite utilizando 1,25 U de enzima. Em todos os casos, o volume foi reaccional total/de 35 7À1 . Os tampões de reacção para a endo H e para a neuraminidase consistiram em Tris-HCL 25 mM, 0,2% de SDS (p/v), a pH 5,7, e acetato de sódio 50 mM, cloreto de cálcio 2 mM e EDTA 0,2 mM, a pH 4,6, respectivamente. As digestões com N-glicanase foram realizadas numa composição de tampão final de EDTA 10 mM, 0,2% de SDS (p/v), 2-mercaptoetano1 0,1 M, e 1% de noidet-P40 (v/v), a pH 7,5. Após a digestão, as amostras foram misturadas com um volume igual de tampão de preparação de amostra 2X-SDS e analisou-se um alíquoto de 16 μ 1 por SDS-PAGE.

12.1.6. PREPARAÇÃO DE UM MUTANTE DE DELECÇÃO SacII DO TGF-βΙ E INSERÇÃO NO VECTOR CDM8

Para a mutagénese de delecção utilizou-se o ADNc de TGF-βΙ, foi subclonado em pUC19. 0 ADN do plasmídeo/digerido com SacII e reiigado, proporcionando a remoção dos 480 nucleótidos da região de codificação do ADNc de TGF-βΙ e proporcionando uma delecção em cadeia. 0 plasmideo resultante foi digerido com EcoRI. reparado para preencher os terminais com o fragmento Klenow de ADN polimerase I e, subsequentemente, digerido com HindIII. Este fragmento foi inserido no plasmideo de expressão CDM8.

ADN do plasmideo de expressão CDM8 (Seed. 1987, Nature 329:840-842) foi digerido com NotI e reparado para preencher os terminais com a enzima Klenow. 0 ADN foi subsequentemente digerido com HindIII e isolado a partir de um gel de agarose utilizando Geneclean. 0 fragmento HindIII-EcoRI (rombo) de ADNc de TGF-βΙ do tipo selvagem e do mutante de delecção SacII, foram então ligados

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-105ao vector CDM8 HindIII-NotI (rombo). Para estudos de expressão utilizou-se o ADN purificado comCsCl .

12.1.7. EXPRESSÃO TRANSIENTE NAS CÉLULAS COS

A expressão transiente nas células COS foi realizada por um protocolo de transfecção com DEAE-dextrano-cloroquina, como se descreveu (Cullen, 1987, Meth. Enzymol. 152:684-704). Resumidamente, incubaram-se as culturas semi-confluentes de células COS-1 cultivadas em placas de 35 mm, em DMEM contendo 10¾ de Nuserum, 1-2 h antes da adição de ADN. A mistura de transfecção foi preparada por adição lenta de ADN, purificado com CsCl, a uma solução estéril de 10 mg/ml de DEAE-dextrano para se ter uma concentração final de 0,2 mg/ml de ADN. A mistura de DEAE-dextrano/ADN (100 /.1) foi então adicionada às células até uma concentração final de 10 y^g/ml de ADN. Adicionou-se depois cloroquina até uma concentração final de 100 ^*g/ml e deixou-se incubar com as células, a 37 °C durante 3 h. O meio contendo ADN/DEAE-dextrano/cloroquina foi então removido e trataram-se as células com 2 ml de 10¾ de dimetil-sulfóxido (v/v) em solução salina tamponada com fosfato. Após 2 minutos à temperatura ambiente, lavaram-se as células duas vezes em solução salina tamponada com fosfato e cu 11ivaram-se em DMEM completo durante 48 h.

Para a análise de imunomancha do TGF-βΙ expresso, adicionou-se então, às células, um meio de cultura isento de soro, recolbeu-se durante 48 h e dialisou-se contra ácido acético a 0,4¾. 0 meio dialisado foi liofilizado, dissolvido em 30^1 de tampão de preparação de amostra, e analisaram-se 5y 1 por análise de imunomancha. As células transfectadas foram também analisadas por imunomancha. A seguir à recolha do meio isento de soro, as células foram colhidas por raspagem e adicionou-se um volume de tampão de preparação de amostra-SDS por volume de células empacotadas. Após ebulição durante 5 minutos, analisaram-se 2 1 de lisado celular por imunomancha.

12.2. RESULTADOS

12.2.1. A TUNICAMICINA INIBE A SECREÇÃO DO TGF-βΙ RECOMBINANTE de células cho transfectadas

Em experiências preliminares concebidas para dirigir o papel

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-106funcional do processamento de glicosilação pare o transporte e secreção de pré-pró-TGF-β!. trataram-se as células CHO. transfectadas. com tunicamicina (TU), um antibiótico de nucleósidos que inibe a adição de oligossacaridos à cadeia de polipéptidos nascente (Tacz e Lampen, 1975, Biochem. Biophys. Res. Cornmun; 64:248-257), e analisou-se o meio condicionado e as células para avaliar o TGF-βΙ expresso. A FIG. 41 mostra os resultados obtidos utilizando imunomancha para detectar proteínas TGF-βΙ no meio de cultura ou nas células. O meio de células de controlo, fraccionado em geles de SDS sob condições de redução, mostrou a existência de três formas de TGF-βΙ recombinante (Ver Secção 7, et seq.). O polipéptido de 44-56 kD representa o pró-TGF-βΙ (“a na FIG. 41), a proteína de 30-42 kD corresponde à região pró do precursor (b na FIG. 41), e a forma de 12 kD representa o TGF-βΙ maduro, adequadamente processado (c na FIG. 41). Contudo, as células CHO, tratadas com tunicamicina, durante um período de 24 h, não pareceram libertar níveis detectãveis de TGF-βΙ imunorreactivo.

A maior forma intracelular de TGF-βΙ nas células de controlo pareceu migrar numa posição correspondente ao factor de crescimento parcialmente glicosilado. Foram também detectãveis níveis muito baixos de polipéptidos TGF-βΙ, processados dentro das células, apenas quando se utilizaram para as imunomanchas quantidades aumentadas de lisado celular. Após tratamento com TU, a maior forma intracelular de polipéptido TGF-βΙ observada correspondeu, em tamanho, ao precursor não glicosilado, O nível deste precursor TGF-βΙ foi compativelmente mais elevado em células tratadas com TU quando comparado com o de células de controlo e, muito possivelmente, indica uma acumulação desta forma dentro das células tratadas. Estes resultados sugerem fortemente que a glicolilação é importante para a saída secretora e, sem ela, pode resultar uma edificação de TGF-βΙ recombinante dentro das células.

12.2.2. PERÍODO DE

TEMPO PARA A SECREÇÃO DE TRANSFECTANTE5 CHO DO

TGF-βΙ

Determinaram-se a velocidade e a extensão da secreção de

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-107 TGF-βΙ recombinante a partir das culturas de células CHO, transfectadas, por marcação por pulsação com [35-SJ-metionina e [35—S]-cisteina, e variáveis. 0 meio de implantação cultura foi durante períodos de tempo recolhido e fraccionado por Na FIG. 42A mostram-se os

TGF-βΙ apareceram

SDS-PAGE seguida por fluorografia resultados.·As três formas recombinantes de gradualmente no meio condicionado e a velocidade de secreção foi então nivelada durante o decorrer da experiência. A relação entre a quantidade de TGF-βΙ maduro e a das formas precursoras não pareceu variar, sugerindo que o processamento proteolítico está completo após a secreção e que ocorre, muito provavelmente, intracelularmente.

A FIG. 42B mostra uma avaliação quantitativa da secreção de TGF-βΙ correspondendo ás três experiências independentes de implantação por pulsação como foi determinado por fluorografia de varrimento. Após um tempo estacionário para a secreção de aproximadamente 1,5 h, os polipéptidos TGF-βΙ foram segregados rapidamente pelas células CHO e após 6 h foi detectável mais^°que 50% da proteína recombinante segregada. 0 tempo estacionário de 1,5 h é um pouco mais longo do que o referido para o tempo estacionário de secreção de outros polipéptidos, uma diferença que pode reflectir variações nas velocidades de processamento para as glicoproteínas ou uma dependência tipo celular (Bauer et al.. 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 128:368-375;

1982, 3. Biol. Chem. 258:3304-3308; Lodish et al.

Biol. 98:1720-1729). Após uma implantação de 20 h, o nível de secreção do material recombinante, ta 1 como foi detectado no meio condicionado por CHO, começou a adicionais escolheu-se um período de tinha sido segregado mais do que 50% do material recombinante (FIG. 42).

12.2.3. OS INIBIDORES DA GLICOSILACAO OU DO PROCESSAMENTO DE

Leford e Davis, , 1984, J. Cell.

estacionar. Para 6 h pois naquele estudos período

GLICOSILAÇÃO AFECTAM 0 NIVEL DE rTGF-β1 SEGREGADO

Para elucidar adicionalmente o papel da glicosilação no processamento e secreção do TGF-βΙ por células CHO, trataram-se as células transfectadas com vários inibidores da glicosilação e

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-108testaram-se os seus efeitos na secreção de factor de crescimento recombinante. Adicionalmente à tunicamicina, foram utilizados quatro inibidores afectando o processamento terminal das cadeias laterais de oliqossacáridos crescentes. A castanospermina (CA) e a desoxinoiirimicina (dN) interferem com a adaptação inicial dos resíduos de' glucose dentro do resíduo endop1asmático após a adição do oligossacárido central (Heltkamp et al.. 1982, Biosci. Rep. 2:899-906; Saunier et a 1 . . J. Biol. Chem. 257:14155-14161; Schwartz e Datema, 1984, Trends Biochem. Sei. 9:32-34). A swainsonina (SW) e a desoximanojirimicina (dMM), por outro lado, inibem as manosidases I e II do complexo de golgi, respectivamente (Elbein et a 1.. 1984, Arch. Biochem. Biophys. 235:579-588; Tulsiani et al . . 1982, J. Biol. Chem. 257:7936-7939).

Na FIG. 43Ά mostra-se uma fluorografia do meio condicionado de células de CHO, exprimindo TGF-βΙ, tratadas com os inibidores. As células CHO foram pré-tratadas com os inibidores durante lhe depois, marcadas por pulsação e implantadas. Os sobrenadantes foram subsequentemente recolhidos após uma implantação de 6 h. Compatível com os resultados que se mostram na FIG. 41, a TU reduziu drasticamente a secreção de TGF-βΙ. A inibição da actividade da glucosidase no retículo endoplasmático por CA e dN, reduziu também, nitidamente, a secreção. Em contraste, as células tratadas com dMM ou SW, os inibidores de actividade da manosidase no complexo de golgi, aumentaram ligeiramente a secreção.

Na FIG. 43B mostra-se um sumário destes resultados de três experiências independentes. Os niveis de secreção na presença de TU, CA, e dN foram entre 5-15% dos níveis observados nas células de controlo. A SW e a dMM resultaram em níveis aumentados de proteínas recombinantes, segregadas com aumentos de quase 30%. As experiências de tempo sugerem uma velocidade similar de secreção quando comparada com a de células de controlo, indicando um aumento ou diminuição generalizados na secreção, mais do que uma mudança na velocidade. Adicionalmente, o processamento proteolitico específico de TGF-βΙ não pareceu ser alterado a seguir ao tratamento com inibidor. Em todos os casos foi evidente, uma relação similar de pró-TGF-βΙ (a na FIG. 43A) para as formas processadas de TGF-βΙ (b e c na FIG. 43A), mesmo na ausência

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-109de carbo-hidrato (TU na FIG. 43A). Estes resultados indicam que a remodelação completa das cadeias laterais de oligossacáridos TGF-βΙ não é necessária para a saída de secreção desde que se. mantenha a adaptação inicial dos resíduos de glucose e desde que a integridade dos oligossacáridos não seja importante para o processamento proteolítico da pré-pró-TGF-βΙ.

12.2.4. ESTRUTURA DAS CADEIAS LATERAIS DE OLIGOSSACARIDOS TGF-βΙ

Investigou-se a natureza dos grupos carbo-hidrato, presentes nos polipéptidos TGF-βΙ segregados pelas células CHO tratadas com inibidor. O meio condicionado de células CHO marcadas por pulsação, com e sem inibidores, foi recolhido e tratado com N-glicanase, endo H, e neuraminidase. Na FIG.· 44 mostram-se os resultados. Com a N-glicanase, que remove todos os açúcares ligados por N, resultam polipéptidos precursores TGF-βΙ a e b, comigrando em geles de SDS de redução, independentemente do tratamento com inibidor. Como esperado, as células tratadas de controlo foram essencialmente insensíveis à endo H, uma glicosidase que remove cadeias de oligossacáridos do tipo alta manose, confirmando a estrutura proposta de carbo-hidrato do complexo. Contudo, o tratamento com endo H dos sobrenadantes de células CHO tratadas com inibidor, indicou a remoção completa das cadeias laterais precursoras TGF-βΙ, no caso da dMM, e só resultando, do tratamento com CA, dN, e SW, sensibilidades parciais a esta glicosidase. O tratamento com neuraminidase revelou que a dMM, CA, e dN não continham resíduos sialados evidentes. Contudo. o tratamento com SW sugere que os polipéptidos precursores TGF-βΙ, libertados sob estas condições, continham um componente de ácido siálico substancial dentro das suas cadeias laterais de o 1igossacáridos.

12.2.5. 6-FOSFORILAÇAQ DE MANOSE DE POLIPÉPTIDOS PRECURSORES

TGF-β1 LIBERTADOS DAS CÉLULAS CHO TRATADAS COM INIBIDOR

O precursor TGF-βΙ é facilmente marcado com [32-P]-ortofosfato e esta incorporação é devida à fosforilação dos resíduos de manose obtendo-se manose-6-fosfato ; a fosforilação ocorre dentro das primeiras cadeias laterais de carbo-hidrato do precursor de factor de crescimento (Secção 9., supra). Uma vez ζ

/ J*.,.

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-110-

que a modificação do caminho de glicosilação por tratamento com inibidor, pode afectar a 6-fosforilação de manose do precursor, as células foram marcadas corn [32-P]-ortofosfato e examinou-se a capacidade dos polipéptidos precursores TGF-βΙ para se tornarem marcados (FIG. 45). A fosforilação proeminente foi evidente nos precursores TGF-βΙ de células tratadas com SW e dMM. Os efeitos da CA e da dN foram muito menos evidentes devido à secreção reduzida de polipéptidos TGF-βΙ. Contudo, exposições mais prolongadas revelaram que a marcação com [32-P] tinha ocorrido dentro das proteínas comigrando com os precursores. Assim, o tratamento com inibidor das células CHO não pareceu afectar a fosforilação dos polipéptidos TGF-βΙ na manose-6-fosfato.

12.2.6. ESTUDOS......DE MUTAGÊNESE DE DELECÇÃO

Para se obterem provas adicionais relativas ao papel da glicosilação na secreção de proteínas TGF-βΙ recombinantes, deleccionou-se uma grande porção do precursor, obtendo-se um mutante com uma estrutura deficiente em todos os três sitios de glicosilação. Na FIG. 46A ilustra-se a aproximação utilizada para fazer a delecção. A digestão do ADN por Saci I e a religação resultaram na remoção de 160 aminoácidos dentro da região pró do TGF-βΙ. A religação ocorreu entre a Arg-50 e a Gly-211 e designa-se por TGF-βΙ Δ 51-210. 0 mutante de delecção foi então colocado no plasmídeo de expressão CDM8 (Seed,, 1987, Nature 329:840-842) a jusante do promotor CMV como se ilustra (FIG. 46A) .

ADN mutante foi transfectado em células C0S-1 utilizando um sistema de expressão transiente e examinou-se o nivel de secreção de TGF-βΙ por imunomancha (FIG. 46B). Exprimiu-se o vector de expressão, contendo o TGF-βΙ de tipo selvagem, em células COS-1 e conseguiu-se a secreção de todas as três formas de polipéptidos de factor de crescimento recombinante (faixa 2 na FIG. 46B). Inclui-se também na imunomancha um controlo revelando estas formas (faixa 3 na FIG. 46B). Em contraste, não se observaram niveis detectáveis de TGF-βΙ nos sobrenadantes de células COS-1 transfectadas com o mutante de delecção. Nas células de controlo observou-se, intracelularmente, uma pequena y

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-111- v,·:· quantidade de precursor TGF-βΙ; estes resultados foram similares aos obtidos de uma experiência anterior (FIG. 41). Para os transfectantes TGF-βΙ Δ 51-210. uma proteína imunorreactiva de cerca de 20 kD. correspondendo em tamanho à prevista para o mutante de delecção, foi expressa, intracelularmente, nestas células COS-1 transfectadas. Os resultados anteriores indicam que o TGF-βΙ Δ 51-210 não foi eficazmente segregado pelas células e que se acumulou intracelularmente. Embora uma porção relativamente grande do precursor TGF-βΙ tivesse sido removida por delecção, a não secreção do TGF-βΙ é compatível com os resultados inibidores e implica um papel de alvo intracelular importante para os epítopos carbo-hidrato do precursor TGF-βΙ.

12.2.7. PROCESSAMENTO PROTEOLITICO INTRACELULAR DENTRO DAS

VESÍCULAS ÁCIDAS processamento proteolítico do precursor TGF-βΙ nos resíduos básicos para se obter o TGF-βΙ, maduro ocorre, muito provavelmente, dentro das células. De forma a examinar a natureza da protease envolvida no processamento do TGF-βΙ, trataram-se as células CHO, transfectadas, com bases fracas ou com um ionóforo monovalente. Ambos os reagentes aumentaram o pH intravesicular do seu meio ácido para um pH próximo da neutralidade, e afectaram, quer o processo de transporte, quer o processamento proteolítico (Devault, et a 1., 1984, 3. Biol. Chem. 259:5146-5151; Mellman, et a 1 . . 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:663-700; Poole, et a I., 1981, 3. Cell. Biol. 90:665-690; Tartakoff e Vassalli, 1977, 3. Exp. Med. 146:1332-1345; Tartakoff e Vassalli, 1978, 3. Cell. Biol. 79:284-299). As células CHO transfectadas foram tratadas com estes reagentes, durante 1 h, antes da marcação por pulsação, e foram implantadas em meio completo, isento de soro, contendo estes reagentes, durante 6 h. 0 meio condicionado foi então analisado por SDS-PAGE; na FIG. 47A mostram-se f1uorográfias correspondentes. As bases fracas, cloreto de amónio e cloroquina, bem como o ionóforo monensima, reduziram muito o grau de processamento proteolítico observado para o precursor TGF-βΙ. 0 nivel global de secreção das moléculas TGF-βΙ, por outro lado, ou não foi afectado, ou só foi levemente afectado por estes reagentes. De modo

318

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takoff e Vassalli Vassalli, 1978, J de 20¾ dos dos controlos, que a clivagem proteolítica

Rev. Med.

Ann. Exp.

-112interessante, mostrou-se que o ionóforo carboxilico de monensina para a secreção de imunoglobulinas por células plasmáticas. (Tar1977, J. Exp. Med. 146:1332-1345: Tartakoff e Cell. Biol. 79:284-299) .

Na FIG. 47B ilustra-se um sumário das três experiências independentes para quantificar estes efeitos. Uma vez que se observou um ligeiro efeito na secreção, norma 1izáram-se os níveis totais de TGF-βΙ recombinante, libertado pelas células CHO, por soma do TGF-βΙ total observado nas experiências de implantação por pulsação utilizando varrimentos densitométricos de fluorográfias em gel de SDS. Após normalização, determinou-se a quantidade de TGF-βΙ maduro segregado, indicando o nível de processamento proteolítico. O cloreto de amónio produziu o efeito mais fraco, para a concentração utilizada nestas experiências, mostrando uma eficiência de clivagem de cerca 70¾ dos valores de controlo. A cloroquina e a monensina, por outro 1ado, reduziram drasticamente o processamento para níveis próximos

Estes resultados indicam fortemente do precursor para se obter o TGF-βΙ maduro ocorre por uma protease com um pH ácido óptimo.

Outras publicações têm indicado que os reagentes anteriores podem afectar a glicosilação (Mellman, et al., 1986 Biochem. 55:663-700; Tartakoff e Vassalli, 1977, J.

146:1332-1345; Tartakoff e Vassalli, J. CellBiol. 79:284-299,Tborens, et al.. 1986, Nature 321:618-620). De facto, a FIG. 47A indica que a monensina e a cloroquina podem modificar a estrutura das cadeias laterais de oligossacáridos uma vez que as proteínas migram de modo diferente em geles de SDS. Para investigar adicionalmente este aspecto, utilizaram-se glicosidases para analisar a estrutura de carbo-hidrato dos precursores TGF-βΙ segregados (FIG. 48). Em todos os casos, os resultados foram similares; as amostras tratadas mostraram a mesma sensibilidade à N-glicanase, endo H e neuraminidase tal como aconteceu com o material tratado com controlo. Após a digestão com neuraminidase, as proteínas precursoras TGF-βΙ migraram de modo idêntico. Assim, as mudanças na migração electroforética induzidas pela monensina e cloroquina no precursor TGF-βΙ, foram, muito provavelmente, devidas a modi70 318

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-113-

ficações no grau de sialação. Este resultado é compatível com outros resultados publicados que têm assinalado modificações na glicosilação terminal a seguir ao tratamento com estes agentes (Tartakoff e Vassalli, 1977, J. Exp. Med. 146:1332-1345; Tartakoff e Vassalli, 1978, J. Cell. Biol. 79:284-299; Thorens, et al.. 1986, Nature 321:618-620).

Adicionalmente, as células tratadas com monensina incorporaram ainda [32-P]-ortofosfato na molécula precursora, indicando que o pH intravesicular não afecta a fosforilação nos resíduos de manose. É pouco provável que a mudança subtil na estrutura de carbo-hidrato, observada após o tratamento com monensina e cloroquina, possa afectar o processamento proteolítico, uma vez que os inibidores de adaptação da glicosidase, que alteram drasticamente a estrutura da cadeia lateral de carbo-hidrato, não resultaram em qualquer efeito notável em proteínas TGF-βΙ processadas proteoliticamente.

13. EXEMPLO: ACTIVAÇÃO INDUZIDA PELO GAMA-INTEREERÃO DD TGE-β LATENTE PELOS MACROFAGOS HUMANOS

13.1. MATERIAIS E MÉTODOS 13.1.1. PURIFICAÇÃO DO TGF-βΙ LATENTE

As culturas de células CHO expressando o rTGF-βΙ latente (LnTGF-βΙ) (1,4 mg/1) foram cultivadas em meio com baixo teor em soro (0,2%) e os sobrenadantes foram colhidos 24 h após a sementeira. Os sobrenadantes foram clarificados por centrifugação de baixa velocidade e a proteína precipitou com sulfato de amónio (80% de saturação, a pH 7,2). Ressuspendeu-se o precipitado em solução salina tamponada com fosfato, arrefecida, (PBS) e dialisou-se extensivamente a 42C durante 2 dias. Carregou-se uma amostra contendo 6,2 mg de proteína numa coluna p-100 equilibrada em PBS, 100-200 MESH (BioRad). 0 LnTGF-βΙ inactivo foi resolvido nesta coluna a partir do TGE-β activo residual e foi localizado por visualização de geles de SDS-PAGE, corados com prata (Blobel e Dobberstein, 1975, J. Cell Biol. 67:835-851; Morrissey, 1981, Analyt. Biochem. 117:307-310) e subsequente activação ácida como se detectou no ensaio de inibição do cr escimento de células epiteliais de pulmão de marta CCL-64 (GIA) (Secção 7.1.6., supra)

318

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-114Resumidamente. as células foram cultivadas cultura de tecidos de 96 cavidades (Falcon concentração de 3 x 10° células por > 1 de DMEM contendo 10% soro de feto de vitelo. Os padrões de TGF-β testados estavam ácido acético 0,2 M e foram liofilizados em tubos de 12 x 75 em placas de 3072) com uma de em mm as amostras de vitelo, e triplicado, 5 estéreis (Falcon 2063). Ressuspenderam-se liofilizadas em DMEM com 10% de soro de feto adicionaram-se 50 / 1 às cavidades de teste, em horas após a implantação (foram testadas amostras não acidificadas sem tratamento prévio). Após incubação a 37°C numa atmosfera de 5% de CO₂-95% de ar, humidificada, durante 72 h, adicionou-se [Ι^όχ] id.(Jdr (Amersham IM 355) em 50 jj 1 de meio (1 >Ci/ml). As células foram incubadas durante 24 h adicionais e foram então lavadas Ix com PBS. fixadas durante 10 minutos em 200 /J de metanol, e secas ao ar durante 15 minutos. As células foram solubilizadas em 200 jul de NaOH 1 M, durante 20 minutos a 65 C, e o material marcado foi recolhido utilizando o Sistema de recolha de sobrenadantes Titertek (Flow Laboratories, 78-210-05).

Exprimiu-se a inibição-estimulação do crescimento como a 125 diminuição ou aumento da percentagem de incorporação de [ I]Id— Udr das células tratadas quando comparada com a incorporação das células não tratadas.

13.1.2. ENSAIO DE ACTIVAÇÃO DE TGF-β1 LATENTE

Os monócitos foram preparados a partir de sangue humano fresco, fraccionados, activados e semeados (2 x 10° células/ml) em meios de Eagles modificados por Dulbecco (DMEM). As culturas foram incubadas a 37°C durante 24 h, na presença ou na ausência de 5 jj g/ml de LnTGF-βΙ purificado e/ou de 100 juU/ml de gama-interferão recombinante (r -f INF) , (AMGEN) . Os sobrenadantes foram colhidos, clarificados por centrifugação de baixa velocidade e congelados em gelo seco, antes das diluições de teste, em série em triplicado, no ensaio inibidor do crescimento (GIA). Os valores para o TGF-β foram determinados utilizando uma curva GIA padrão produzida com TGE-β de plaquetas, purificado. 13.2. RESULTADOS

A tabela XII mostra que o precursor TGF-β purificado a pH

318

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-115neutro exibe uma bioactividade mínima (mesmo para concentrações de 1 y g/rnl) . Contudo. o pré-tratamento transiente com ácido acético, foi capaz de activar aproximadamente 7,5% do precursor numa base em peso, i.e., 250 ng de precursor acidificado renderam 18,7 ng de TGF-β activo. Numa base molar, isto corresponde a uma activação de 40%. A análise de SDS-PAGE demonstra que a molécula activada por ácido tem uma massa idêntica ao TGF-β nativo (24 kD) e os estudos de sequências principais indicaram que o complexo precursor TGF-β não activado residual é um resultado de uma falsa formação de ligação de dissulfureto entre os resíduos de cisteina no precursor e o homodímero TGF-β maduro (Marquardt et al., a publicar). Utilizando esta poliproteína purificada como fonte de precursor TGF-βΙ exógeno maduro, examinou-se a capacidade de várias células cultivadas para activar e libertar TGF-β nos sobrenadantes de cultura. Não se observou activação com diversas linhas de células de linfócitos estabelecidas incluindo HUT-78, CEM e a linha derivada dos monócitos, U937. Do mesmo modo, as células B e T humanas, recentemente cultivadas, mostraram uma activação mínima, quando existente.

Tabela XII

Activação Acida do TGF-βΙ latente

TGF-βΙ latente recombinante Actividade do TGF-β (inibição do crescimento) ng/ml ng/ml

Pré-tratamento

	Nenhum	Acido
10	0	0,6
100	0	9,2
250	<0.5	18,7
1000	6,0	80,14

Os resultados apresentados na TABELA XIII indicam que os mohhhh70 318

nócitos humanos, cultivados na presença de 100 U/ml de r-< INF e de 5 ug de LnTGF-βΙ, são capazes de activar o TGF-βΙ latente. Os monócitos de sangue periférico humano libertam quantidades mínimas de TGF-β activo (<0,l pM/ml de sobrenadantes de cultura).

A incubação dos monócitos com 5 ^g de LnTGF-βΙ, durante 24 b, resultou em.alguma activação de base (aproximadamente 0,1 pM/ml 7 por 1 x 10 células). Contudo. os monócitos cultivados na presença de 100 U/ml de r t-INF e de 5 de LnTGF-βΙ resultaram num aumento surpreendente na quantidade de TGF-β activo detectada nos sobrenadantes. A extensão da activação foi substancial, 2,1-2,5 pM de TGF-01/ml, o que é equivalente a cerca de metade da que foi alcançada só com tratamento ácido (relação de activação citoquina/ácido de 0,42 e 0,50, experiências 1 e 2, respectivamente). As culturas de controlo de monócitos tratados só com r /-INF não resultaram em qualquer activação significativa (0,2-0,4 pM/ml) do TGF-β latente endógeno significativamente libertado por alguns monócitos cultivados (Assoian et a 1., 1987,

Proc. Acad. Sei. U.S.A. 84:6020-6024). A quantidade de activação foi proporcional à quantidade de substrato LnTGF-βΙ adicionado e a saturação foi alcançada com 10 y g/ml de substrato utilizando 7 monócitos e 100 U/ml de r /-INF. A cinética da activação demonstrou o processamento e a libertação máximos de TGF-β, 7-8 horas após a incubação do LnTGF-β com r γ -INF, indicando que o processamento pode requerer a transcrição do gene induzida por /-INF, envolvendo talvez a transcrição de um(uns) gene(s) de enzima(s) de processamento.

318

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-117-

Tabela XIII

Activação Induzida por Gama Interferão do LnTGF-βΙ pelos Monócitos Humanos p Moles de TGF-β Relação de Activação ★

Activado/ml Citoquina/Acido

Monócitos sózinbos Monócitos + }—INF Monócitos + y-INF+ + LnTGF-βΙ

Monócitos + LnTGF-βΙ

Experiência

I II <0,1 0,4

0,2 0,4

2,1 2,5

0,1 <0,1

Experiência

I II

0,42 0.50 * 2b em ácido acético IM a 22 ’C.

Como se mostra na FIG 49, a activação. do LnTGF-βΙ pelos monócitos foi dependente da dose de f-INF utilizada. Observou-se uma resposta mensurável com tão pouco como 10 unidades/ml de r f-INF (10 ng/ml de TGF-β deteetado pelo GIA). As experiências anteriores (TABELA XIII) foram realizadas com uma dose de lOOU/ml de ^-INF (20 ng/ml de TGF-β libertado) com um valor de saturação máximo alcançado com 1000 U/ml de r f -INF. Em experiências separadas, a IL-2 recombinante foi capaz de estimular as células T humanas frescas para processar LnTGF-βΙ, mas a resposta foi fraca em relação è observada com monócitos tratados com r y -INF (0,5 p Mo 1es/TGF-B/2 x 10^ células/unidades de rIL-2).

Realizaram-se várias experiências para determinar se a actividade de inibição do crescimento de TGF-β, dependente de LnTGF-βΙ recuperado de culturas de monócitos tratados com r y-INF foi de facto a actividade do TGF-β. 0 TGF-β foi originalmente isolado porque estimulou as células do rim cie ratazana normais (NRK) a crescer como colónias em ágar mole na presença de quantidades baixas de EGF ou TGF- cx . Como se mostra na FIG, 50, quer o TGF-β natural, purificado com ácido, quer o EGF são requeridos para estimular o crescimento das colónias de células NRK (120 colónias por oito campos de baixa energia, aleatórios).

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-118Os sobrenadantes (sem acidificação prévia) colhidos a partir de monôcitos tratados com r χ-INF e incubados com TGF-βΙ, também induziram eficazmente a formação de colónias de células NRK; 1 e 100 ng de rTGF-βΙ, activado com monôcitos. estimularam o crescimento de 90 e 190 colónias de NRK, respectivamente. Quando se realizaram os ensaios na presença de um anticorpo monoclonal, neutra 1izante para o TGF-βΙ derivado do osso de bovino, foi suprimida a formação de colónias de NRK (90% de inibição para uma concentração de TGF-β de 100 ng/ml). Uma inibição mAB proporcional do crescimento das colónias foi dependente da concentração original de TGF-βΙ adicionado ao ensaio.

As culturas de células CHO, exprimindo LnTGF-βΙ, foram 3 incubadas durante a noite com H-leucina e purificou-se o complexo precursor TGF-βΙ marcado como se descreveu em Materiais e Mé3 todos. 0 LnTGF-βΙ marcado com H-leucina foi incubado com monôcitos tratados com r γ -INF e com monôcitos não tratados, utilizando condições isentas de soro e colheram-se os sobrenadantes e analisaram-se por SDS-PAGE sob condições de não redução. Os resultados são apresentados na FIG. 51. Adicionalmente ao precursor TGF-βΙ de 110 kD, observou-se uma banda migrando com o padrão TGF-β de 24 kD em sobrenadantes colhidos a partir de culturas tratadas com r fINF (faixa A). Esta banda não era tão pronunciada nos sobrenadantes colhidos a partir de culturas de 3 monôcitos, incubadas só com LnTGF-βΙ marcado com H-leucina (faixa B).

Estes resultados indicam que οχINF induz eficazmente os monôcitos humanos para mediarem a libertação de TGF-β activo a partir de um complexo TGF-β recombinante latente. 0 TGF-β libertado nos sobrenadantes, derivado de LnTGF-βΙ, adicionado exogenamente, parece ser funcionalmente idêntico ao TGF-βΙ (neutralização mAB de formação de colónias NRK) e exibe uma massa (SDS-PAGE) idêntica ao TGF-β natural, isolado após purificação, a pH ácido, de plaquetas e do osso.

14. DEPOSITO DE MICROORGANISMOS

Os transformantes seguintes foram depositados na American

Type Culture Collection, Rockville, MD, tendo sido atribuídos os

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-119números de acesso registados:

Tansfectante Plasmídeo

CHO-TGF-B-3/2000 pSV2-(3-TGF

Número de Acesso

CRL 9434

O presente invento não é para ser limitado no seu âmbito, pelas linhas de células depositadas, uma vez que as concretizações. depositadas são entendidas como ilustrações simples de um aspecto do invento e todas as que são funcionalmente equivalentes são abrangidas pelos campo do presente invento. De facto, várias modificações do invento, para além daquelas que aqui se mostram e descrevem tornar-se-ão evidentes para os peritos na arte a partir da descrição precedente e dos desenhos acompanhantes. Tais modificações são abrangidas pelo âmbito das reivindicações apensas.

Deve também entender-se que todos os números dos pares de bases e dos resíduos de aminoácidos e também os tamanhos dados, para os nucleótidos e péptidos, são aproximados e são utilizados para fins de descrição.

Γ r. r e

i....

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-120-

Claims (4)

1. REIVINDICA

   Is - Processo para transformante Si. caracte:

   procuçãe oe factor de crescimento (a) cultivar uma célula eucariútica contendo uma sequência de nucleótidos codificando factor de crescimento transformante SI de símio sob o controlo de uma segunda sequência de nucleótidos que regula a expressão do gene de modo que um péptido ou proteina tendo a actividade do factor de crescimento transformante SI seja produzida pela célula eucariótica; e (b) recuperação do factor de crescimento transformante SI da cultura.
2. 2ã - Processo de acordo com a reivindicação 1. caracterizado por a sequência de nucleótidos que codifica o factor de crescimento transformante SI de símio nucleótidos substancialmente como compreender uma sequência de

   Simio

   Humano

   -26» AGCCGATCTGTCGCACCTCCGACA---AACATC---CCTCTCCTCCTACCA;aTCTCGCCCATCTACGTT -19« CTCC..C...CCA...A..CCCT.TTC....C.ACC.AC..T.............g..............

   ^^lml° AmccGTGGGATAcTCAGACACccccGCTCCAACccTcc:cTccACCACTccGcccTTCicccGTACGA-ccTCAACTTicccTcc»GGCCciccTAC -100

   Humano Simio cttttcccgggcgacccccagcccctgcacgggcggggcctccccaccaaactagccctcticgcgctctcggcagtgcccggggccgccgcctcccc Humano «C.. . . .A • Ce . C... .K 2? Gl, Pro Simio Met Pro Pro Str Gl, Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu frro Leu Leu Trp Leu Leu Vel Leu Thr Pro Ser Arg Humano ATG CCG CCC TCC CCG CTG CGG CTG CTG CCC CTC CTG CTA CCG CTC CTG TGG CTA CTC GTG CTG ACG CCT ACC c.. CCG • C. 35 «5 Ala Simio Pro Ala Ala Gl, Leu Sar Thr C,i Lyt Thr 1 la A*P Met Clu Leu Val l_Tj Arg I,t Arg Ue Clu Thr lia Arg Humano CCS GCC CCA CCA CTA TCC ACC TCC AAC ACT ATC GAC ATC CAC CTC CTC AAC CCC AAC CGC ATC CAG ACC ... C.. ATC CGC Simio CO 70 Gl, Cln 11c Leu Ser lyi Leu Arg Leu Alt Ser Pro Pro Ser Cln Cly Clu Vel Pro Pro Cl/ Pro Leu Pro C1 u Humano CSC CAC ATC CTC TCC AAC CTC CCC CTC CCC ACC CCC CCC ACC CAC CCG GAC CTC CCC CCC GCC CCG CTG CCC GAC Simio Ala Vel Leu Ala Leu T,r Aí n Ser Thr 85 Arg Asp Arg Vel Ala Cl, Clu Ser Ale Clu 95 Pro Clu Pro Clu P ro Glu Humano CCC GTG CTC CCC CTS TAC AAC AGC ACC CCC CAC CGC CTC CCC CCC CAC ACT CCC CAC CCC CAC CCC CAA CCC CAC 110 . .A . .A 120 .....C . .T Simio Ala Aí p T,r T,r Ala Ly» Clu Vai Thr Arg Val Leu Met Val Clu Thr His Asn Clu 11« T/r Asp Lys Phe Ly» Hurr.ano CCC CAC TAC TAC GCC AAC GAC CTC ACC CGC CTC CTA ATG CTC CAA ACC CAC AAC CAA ATC TAT CAC AAC TTC AAC Simio 135 1« 5 Gin Sar Thr His Ser 11* T,r Met Phe Phe Asn Thr Ser Clu Ltu Arg Clu Ala Val Pro Clu Pro Val Leu leu Humano CAC ACC ACA CAC ACC ATA TAT ATC TTC TTC AAC ACA TCA CAC CTC CCA CAA CCA CTA CCT CAA CCT GTG TTG CTC . .T . .c ..C . . .

   150

   725

   375 «50

   Ar, 1(0 170

   Simio Sar Arg Ala Glu ltu Arg lau ltu Arg leu 1,1 leu l,» *al Glv Cln Hlj Vai Glv leu T,r Gin 1,1 T,r

   Humano TCC CGG CCA CAG CTG CGT CTC CTC --- AGC CIC AAG TTA AAA GTC CAG CAC CAT CTC GAC CTG TAC CAG AAA TAC

   ........................AGG..........................C.....................

   527

   BAD ORIGINAL $

   70 318

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   F'·/· '

   165

   Asp

   195

   Simio Ser Atn Atn Ser Trp Arg Tyr leu S«r Atn Arg Leu Leu «1· Pro Sír Atn Sír Pro Glu Trp leu S»r Phe Asp Humano AGC AAC AAT TCC TGG CGA TAC CTC AGC AAC CGG CTG CTG GCG CCC AGC AAC TCG CCC GAG TGG TTG TCT TTT GAT 597 210 ..A G. . . .A 220 . .A Simio Vi 1 Thr Cly Vil V*T Arg Gin Trp Leu 5«r Arg Cl, Gl, Glu 11· Glu Cly Phe Arg Leu Ser Ali Mis Cy» Ser 672 Humano GTC ACC GGA GTT GTG CCG CAG TGG TTC AGC CGC .<T CGA GGC GAA ATT GAG GGC TTT CCC CTT AGC CCC CAC TGC ICC Simio Arg 23S 245 c,» Ai p Ser ly» Ai p Ai A Thr Leu Gl a «•1 Aip 11« Atn Cl, Phe Thr Thr Cl, Arg Arg ciy Aip leu AT* Thr Humano TO T CAC ACC AAA CAT AAC ACA CTC CAA CTC CAC ATC AAC CCC TTC ACT ACC CCC CCC CCA CCT CAC CTC CCC ACA 747 Simio .GG 260 270 . .c II» »1 t Cl, Ket At A *rg Pro Phe Leu l.u Leu *1< Thr Pro Leu Glu Arg AT* Gin Htl leu Gin Sír Ser Humano at r CAT GGC ATG AAC CCG CCT TTC CTG CTT CTC ATC CCC ACC CCG CTG CAG AGG GCC CAA . .G CAT CTG CAA AGC TCC 623 7f*| 79 ή Simio Arg H t Arg Arg Ala Leu As p Thr As n lyr Cyi Ph« Ser Ser Thr G u Lyt As n c_r» Cy» Vi 1 Arg G n Leu Tyr Humano CGG CAC CGC CGA GCC CTG GAC ACC AAC TAC T TCC TTC AGC TCC ACC GAG AAQ AAC TGC TCC GTG CGG CAG CTG TAT . . c 697 11Π vn Símio J e At p Ph í Arg lyt As p Leu Cl, Trp Lys Trp 1 ie Hlt Glu Pro ly» Oy Tyr w t Al* As n Pn« Cy» Leu Cl, Humano ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC CCC TGG AAG TCC ATC CAC GAG CCC AAG CCC TAC CAT CCC AAC TTC TGC CTG f GCG 972 ^ΊΊ5 115 Simio Pro tn Pro lyr 11· Trp Ser Leu Asp Thr ClA Tyr 5»r Lyt «•1 Leu Ali Leu lyr Atn Gin Míl As n Pro Cly Humano CCC TGT Γ CCC TAC ATT TCG ACC CTG CAC ACC CAC TAC ACC AAG CTC CTG GCC CTC TAC AAC CAC CAT AAC CCC GGC 1047

   37fl·

   Simio Alt Ser A)i Ali Pro Cyt Cys V*l Pro Gin Aí* teu Glu Pro Leu Pro He Vel Tyr Tyr Vel Cly Arg Lyt Pro

   Humano GCC TCG GCC GCG CCG TGC TGC GTG CCG CAC CCG CTG CAG CCA CTG CCC ATC GTG TAC TAC GTC GGC CGC AAG CCC

   .........................................G.................................

   -1LL

   Simio Lys V*1 Glu Gl_n Leu Ser Atn Met Jl« Vel Arg Ser Cyt lyt Cyt Ser Humano AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC CTG CGC TCC TGA AAA TGC AGC ... . . . ..................................G......

   TGA GGCCCCGCCCCGCCCCGCCCCACCCCCCCAG

   .....T..................G.........

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   Simio CCCCCGCCCCCCCCCACCCCACCCCCCCTGTCTTCCCCTTGCGCGCTCTATTTAACGACACCCGTGCCCCAAGCCCACCTGGGGCCCCATTAAAGA Humano ..........A....C....C.........C.......A.........................................................

   1300 do nucleótido número 1 ao 1173.
3. 3ê - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de nucleótidos que codifica o factor de crescimento transformante βΐ de simio compreender uma sequência de nucleótidos substancialmente como a apresentado na reivindicação anterior do nucleótido número 1 ao 1173, na qual o codão para o resíduo de aminoácido número 33 é alterado para AGC.

   42 - Processo de acordo com a reivindicação 1. caraeterizado por a célula eucariótica compreender uma célula de ovário de criceto chinês.

   5â - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda sequência de nucleótidos que controla a expressão do gene compreender um promotor SV40.

   6s - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda sequência de nucleótidos compreender um promotor e uma sequência que codifica um marcador se 1eccionáve1 da qual a célula eucariótica é deficiente, de modo que a célula eucariótica

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   -122contendo a sequência de codificação do factor de crescimento transformante 61 de símio possa ser identificáve1.

   7ã - Processo tíe acordo com a reivindicaçSo 6, caracterisado por marcador seleccionável repreender di-hidro

   8S - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender ainda expor a célula eucariótica a metotrexato, de modo que sejam seleccionadas colónias resistentes que contêm níveis amplificados das sequências de codificação para di-hidrofolato-redutase e factor de crescimento transformante 01 de símio.

   9a _ Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a célula eucariótica compreender uma célula de ovário de deficiente criceto chinês/em di-hidrofolato-redutase.

   10& - Processo de produção de factor de crescimento transformante 01, caracterizado por compreender:

   (a) cultivar transfectante CHO-TGP-01-3/2OOO, depositado no

   ATCC e cujo número de acesso atribuído é CRL 9434; e (b) recuperar factor de crescimento transformante 01 da cultura.

   lia - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o transfectante ser cultivado na presença de metotrexato.

   123 - Processo de produção de célula eucariótica, caracterizado por a célula conter uma sequência de nucleótidos codificando factor de crescimento transformante 01 de símio sob o controlo de de nucleótidos que regula a expressão a célula eucariótica produza factor crescimento transformante activo,01.

   13a - Processo de acordo com a reivindicaçSo 12, caracterizado por a sequência de nucleótidos que codifica o factor de crescimento transformante de símio 01 compreender a sequência de nucleótidos essencialmente como se apresentou na reivindicaçSo 2, do nucleótido número 1 ao 1173.

   14a - Processo de acordo com a reivindicação 12 do por o codão para o resíduo de aminoácido alterado para AGC.

   15a - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender uma célula de ovário do criceto chinês.

   uma segunda sequência gene, de modo que do de caracterizanúmero 33 ser

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   -12316ã - Processo de acordo com a reivindicação 12. caracterizasegunda oo por a/sequencia ae nucmeotiaos. que controla a expressão do çene. compreender um promotor de SV40.

   i7ê - Processo de acorde com a reivindicação 12, caracterizado por a segunda sequência de nucleótidos compreender um promotor e uma sequência codificando um marcador se 1eccionáve1, no qual a célula eucariótica é deficiente, de modo que a célula eucariótica, contendo a sequência de codificação para o factor de crescimento transformante de simio (31 possa ser identificada .

   18ê - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o marcador seleccionével compreender di-hidrofolato redutase .

   193 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por compreender uma célula de ovário do criceto chinês deficiente em di-hidrofolato redutase.

   203 - Processo de produção de linha de células, caracterizado por compreender CHO-TGF-y2>l-3/2000 como depositada no ATCC com o número de acesso CRL 9434.

   213 - Processo de preparação de um polipéptido essencialmente puro, caracterizado por o polipéptido compreender a sequência de aminoácidos, essencialmente como apresentada na reivindicação 2.

   223 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender os resíduos de aminoácido números 1 a 390.

   233 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por compreender os resíduos de aminoácido número 30 a 390.

   243 - Processo de acordo comi a reivindicação 21, caracterizado por compreender os resíduos de aminoácido números 30 a 278.

   25ê - processo de acordo com as reivindicações 21, 22. 23 ou 24, caracterizado por o polipéptido ser glicosilado.

   26s - Processo para preparaçao de acordo com as reivindicações 21, 22, 23 ou 24. caracterizado por o polipéptido ser fosforilado.

   27a - Processo de acordo com a reivindicação 26, do por conter pelo menos um manose-6-fosfato.

   28a - processo de acordo com a reivindicação 27, do por o manose-6-fosfato estar ligado a uma cadeia caracterizacaracterizade açúcar

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   -124ligada a asparagina do precursor rTGF-6i.

   295 - Processo de acordo com a reivindicação 28 , caracter' i za- do por 0 sítio de asparagina ser 0 residuo de ar ci noá cido número 82. 30s - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracteriza- do por 0 sítio de asparagina ser 0 resíduo de aminoácido número 136 31* - Processo de acordo com a reivindicação 28. caracteriza- do por 0 sítio de asparagina ser 0 resíduo de aminoácido número

   176 .

   32â - Processo de preparação de um polipêptido essencialmente puro, caracterizado por o polipêptido compreender a sequência de aminoácidos essencialmente como apresentada na reivindicação 2, na qual o resíduo de aminoácido número 33 é serina.

   33a - Processo de preparação de um polipêptido essencialmente puro, caracterizado por o polipêptido compreender a sequência de aminoácidos essencialmente como apresentada na reivindicação 2, na qual o resíduo de aminoácido número 223 é serina.

   34a - Processo de preparação de um polipêptido essencialmente puro, caracterizado por o polipêptido compreender a sequência de aminoácidos essencialmente como apresentada na reivindicação 2. na qual o resíduo de aminoácido número 225 é serina.

   35a - Processo de preparação de um polipêptido essencialmente puro, caracterizado por o polipêptido compreender a sequência de aminoácidos essencialmente como apresentada na reivindicação 2, na qual o resíduo de aminoácido números 223 e 225 são serina.

   36a — Processo de acordo com as reivindicações 32, 33, 34 ou 35 . caracterizado por compreender os resíduos de aminoácido números 1 a 390. 37* - Processo de acordo com as reivindicações 32, 33, 34 ou 35. caracterizado por compreender os resíduos de aminoácido

   números 30 a 390.

   38* - Processo de acordo com as reivindicações 32 . 33. 34 ou 35, car acterizado por compreender os resíduos de aminoácido números 30 a 278. 39* - Processo de acordo com as reivindi cações 32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38, caracterizado por 0 polipêptido ser glicosilado

   40ê - Processo de a:

   57 ou 33. caracti

   7031Θ

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   0 c; . 36 , G O 41ã do por 0 42â do por 0 ligada a 43ã do por 0 44a · do por 0 45â do por 0 46a -

   —¹ 25— :rdo com as

   1 Ζ o O C Γ

   Processo de acordo com a reivindicação 40, caracteriza42â - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o manose-6-fosfato estar ligado a uma cadeia de açúcar codificando precursor de factor de crescimento caracterizado por a sequência de codificação transformante^l, de nucleótidos essencialmente como apresentada na reivindicação 2, desde cerca do nucleótido número 1 ao 1173.
4. 4?a - Processo de produção de uma sequência de nucleótidos codificando precursor caracterizado por a transf ormante/ll, sequência de apresentada na na codificando precursor caracterizado por a nucleótidos transf ormante p > sequénc i a apresentada de na do nucleótido número 1 ao 1173, na de aminoácido 223 é mudado Dara de factor de crescimento sequência compreender a codificação de nucleótidos essencialmente como reivindicação 2, desde cerca do nucleótido número 1 ao 1173 qual o codão para o resíduo de aminoácido número 33 é mudado para AGC.

   43a _ processo de produção de uma sequência de de factor de crescimento sequência compreender a codificação de nucleótidos essencialmente como reivindicação 2, desde cerca qual o codão para o resíduo AGC.

   49ê - Processo de produção de uma sequência de nucleótidos codificando precursor de factor de crescimento caracterizado por a sequência compreender a transf ormante ^,1, sequência de codificação de nucleótidos essencialmente como apresentada na

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   -126reivindicação 2, desde cerca do nucleótido número 1 ao 1173, na qual o codão para o resíduo de aminoácidos 225 é mudado para TCT.

   50â - Processo de produção de uma sequência de nucleótidos codificando precursor de factor de crescimento transformanteyjl, caracterizado por a sequência compreender a sequência de codificação de nucleótidos essencialmente como apresentada na reivindicação 2. desde cerca do nucleótido número 1 ao 1173, na qual os codões para os resíduos de aminoácidos 223 e 225 são mudados para AGC e TCT, respectivamente.