KR20050099540A - Ｎｅｌｌ 펩티드 발현 시스템 및 ｎｅｌｌ 펩티드의 골형성 활성 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 골 성장 인자(bone growth factor)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 NELL1을 포함하는 합성물(compositions), NELL1을 포함하는 제조물, 그리고 골 형성을 유도하기 위해 NELL1을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NELL1 및 NELL2 펩티드의 발현과 정제를 위한 방법을 제공한다.

Description

ＮＥＬＬ 펩티드 발현 시스템 및 ＮＥＬＬ 펩티드의 골 형성 활성{NELL peptide expression systems and bone formation activity of NELL peptide}

미합중국 후원의 연구 및 개발하에 이루어진 발명에 대한 권리에 관한 진술

본 과업은 NIH/NIDR 승인 번호(grant number) DE9400호 및 CRC/NIH 승인 번호 RR00865호에 의해 후원되었다. 미합중국의 정부는 본 발명의 일정 권리를 소유할 수 있다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 골 성장 인자(bone growth factor)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 NELL1을 포함하는 합성물(compositions), NELL1을 포함하는 제조물, 그리고 골 형성을 유도하기 위해 NELL1을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NELL1 및 NELL2 펩티드의 발현과 정제를 위한 방법을 제공한다.

성장 인자들은 생체내 또는 생체밖의 세포들의 특정 개체군들(defined populations)의 성장 및 분화(differentiation)에 영향을 주는, 펩티드와 같은 물질이다.

골 형성은 장골[연골성(endochondral) 골 형성]과 편평골[막내(intramembraneous) 골 형성]의 발생(development)동안에 일어난다. 또한, 골격의 본래의 모습(integrity)을 보존하기 위하여 성인에게 계속적으로 일어나는 골 개조(bone remodeling) 동안에 골 형성이 일어난다. 마지막으로, 예를 들어, 골절에서 또는 외과적 상태에서 골 손상이 일어나는 때와 같이 골 수리동안에 골 형성이 일어난다. 단계별 골 형성 메카니즘이 장골과 편평골의 태생 전개(embryological development)에 포함되는 것으로 생각되기는 하나, 수리는 막내 골 형성을 포함하는 것으로 생각된다.

어느 쪽의 메카니즘에 의한 골 형성이든지, 성장 인자에 의해 조절되는 조골세포(osteoblasts)의 활성을 포함한다. 조골세포는 골수 기질 세포(marrow stromal cells)[중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells; MSC)라고도 알려져 있음]의 풀(pool)로부터 얻어진다(derived). 이 세포들은 여러 가지 조직에 존재하고 골수 기질(bone marrow stroma)에 널리 퍼져있다. MSC는 널리 퍼져 있으며 조골세포, 연골세포(chondrocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 근세포(myocytes), 및 지방세포(adipocytes)를 포함하는 다양한 세포 형태로 분화될 수 있다. 성장 인자는, 각기 골 형성에 강한 영향을(impact) 주는, 골원 세포(osteogenic cell) 증식, 분화, 및 조골세포 무기질화(osteoblast mineralization)에 강한 영향을 주는 것으로 생각된다.

자생 골(autogenous bone)은 예를 들어, 두개골 조기유합(craniosynostosis) 및 할접(cleft grafting)으로 환자의 골을 수리하기 위해 사용되어 왔다. 두개골 조기유합(craniosynostosis; CS), 즉 두개골 봉합의 조기 종결(premature closure)은 3,000명의 유아들 중 한 명에게 영향을 미치므로, 가장 일반적인 인간의 선천적 두개안면 변형들(human congenital craniofacial deformities) 중의 하나이다. 조기 봉합 종결은 외과적 교정이 필요할 수 있는 두개골 동질이상(cranial dimorphism)을 가져온다. 인간 두개골 조기유합(CS)에서의 조기 봉합 종결은 두가지의 아마도 독특한 프로세서들(processes), 즉, 두개관 과성장(calvarial overgrowth) 및 골고정(bony fusion)에 의해 발생될 수 있다. 최근에는, FGF2와 FGFR1가 CBFA1-전달 경로(CBFA1-mediated pathways)(8)를 통한 조기 두개 봉합 고정(premature cranial suture fusion)과 관련되어 있다. CBFA1의 미스센스 돌연변이(missense mutation)는, 지연된 봉합 종결로 나타나는 쇄골두개생성장애(cleidocranial dysplasia)로 연결된다.

자생골 조직이식 과정(Autologous bone grafting procedures)은 장골릉(iliac crest) 또는 해골(orcalvaria)과 같은 자생골을 활용하여 실행되어 왔다. 이 도너 사이트(donor site)는, 장골릉 도너 사이트에 대한 고통, 보행장애(gait disturbance), 대퇴 감각이상(thigh paresthesia)과, 두개 이식편(calvarial grafts)에 대한 감염, 신경결손(neurologic deficits), 및 혈종(hematomas)을 포함하는 관련 질병이 없지 않다. 또한, 도너 사이트는 제한된 볼륨(volume)을 가질 수 있으며, 수술 시간과 입원 기간이 늘어나게 할 수 있다.

무생물재료 이식재(alloplastic grafting materials)도 또한 사용되어 왔고, 성장 인자들이 동물 모델에 대해 시험되어 왔다. 예를 들어, bFGF는 골 재생 및 수리에 사용할 수 있는 가능성을 보여주었다. 다른 과(family)의 골생성 성장 인자(osteogenic growth factors)가 골 형성 단백질(bone morphogenic protein; BMP)로서 기술되어 왔다. 특히, BMP-2 재조합 단백질은 자생 미립자 골 및 골수와 같거나 또는 이보다 우수하게 하악 연속성 결손(mandibular continuity defects) 및 구개열 결손(cleft palate defects)을 재생시키는 것으로 입증되었다. BMPs 및 다른골 형성 성장 인자들이 임상용으로 사용하기 위해 연구되어 왔다. 그러나, BMP의 최소 유효 투약량을 사용하는 비용이 임상 용도의 하나의 제약 요소가 되어 왔다.

척추 고정술(spinal fusion)은 척추의 하나 이상의 추골(vertebrae)를 서로 결합시켜 서로더 이상 움직이지 않도록 하는 외과 수술이다. 필요한 조치들(indications)은 골절된 척추골(ertebra)의 치료, 변형의 교정(correction of deformity), 움직임(motion)으로 인한 고통의 제거, 불안정성(instability)의 치료 및 경부 디스크 탈출증(cervical disc herniations)을 포함한다. 수술은 추골 사이에 하나의 고형체(solid union)를 얻기 위해 추골사이에 하나의 골 이식편(bone graft)을 배치하는 것을 포함할 수 있다. 이 과정은 또한 골 이식편을 안정화시키고 치료하는 것을 돕기 위해 플레이트(plates), 나사(screws), 케이지(cages), 그리고 최근에는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein)(2 및 7)을 배치하는 것을 포함하는 보충 치료도 포함할 수 있다. 자생 골 이식은 임상적으로 선호되는 방법이기는 하나 아직 약 30-50%의 실패율을 가진다. 자생 골 이식은 독립된 수술이고, 또한 상당한 이환율을 수반한다.

그러므로, 골 성장(bone development), 장애(disorders), 또는 골 손상(bone trauma)에 골의 생성을 유도하기 위해 안전하고 효과적이며 입수가능한 합성물(compositions)과 방법들이 요구된다.

도 1은, 인간 NELL1 cDNA를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 1)이다.

도 2는, 인간 NELL1을 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 2)이다.

도 3은, 쥐 NELL1 cDNA를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 3)이다.

도 4는, 쥐 NELL1을 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 4)이다.

도 5는, 마우스 NELL1 cDNA를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 5)이다.

도 6은, 마우스 NELL1을 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 6)이다.

도 7은, 인간 NELL2 cDNA를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 7)이다.

도 8은, 인간 NELL2를 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 8)이다.

도 9는, 쥐 NELL2 cDNA를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 9)이다.

도 10은, 쥐 NELL2를 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 10)이다.

도 11는, 마우스 NELL2 cDNA를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 11)이다.

도 12은, 마우스 NELL2를 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 12)이다.

도 13은, 닭 NELL2를 엔코딩하는 핵산 서열(서열번호 13)이다.

도 14는, 닭 NELL2를 엔코딩하는 아미노산 서열(서열번호 14)이다.

도 15는, 기능성 NELL 펩티드를 제조하는 하나의 방법의 흐름도이다.

도16은, 시그널 펩티드-NELL1-FLAG 핵산 구성을 나타낸다. 밑줄친 아미노산 서열은 멜리틴 시그널 펩티드(melittin signal peptide)로부터 유래된다. 알라닌과 프롤린 사이의 결합부는 하이 파이브 세포(High Five cells)에 의한 분비를 위한 추정 절단 사이트(putative cleavage site)이다. RTVLGFG---- 로부터의 잔기들은 쥐/인간 NELL1 단백질의 성숙된 단백질(mature protein)로부터 유래된다.

도 17은, NELL1-FLAG 의 세포밖 발현(extracellular expression)의 산물을 나타낸다. 도 17A는 무-세럼 배지(serum-free medium) [생산력(Productivity): ca. 3 mg/L 배지]의 하이파이브 세포로부터 생성되어 정제된 NELL1 펩티드를 포함하는 UnoQ-용리물(eluate)의 CBB-염색된(stained) SDS-PAGE 겔(CBB-stained SDS-PAGE gel)이고; 도 17B는 안티-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅(Western blotting)이다. 도 17C는 무-세럼 배지 [생산력: < 0.1 mg/L 배지]의 COS7 로부터 생성되어 정제된 NELL1 펩티드를 포함하는 UnoQ-용리물(eluate)의 CBB-염색된 SDS-PAGE 겔이고; 도 17D는 안티-FLAG 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅이다.

도 18은, 무-세럼 배지의 곤충 세포에 의한 NELL2-FLAG 펩티드의 세포밖 발현을 설명하는 웨스턴 블로트(Western blot)이다.

도 19는, 두가지 형태의 무-세럼 배지(Express Five SFM 및 ESF921)의 하이파이브 세포에 의한 NELL1 및 NELL2-FLAG 펩티드의 세포밖 발현을 설명하는 웨스턴 블로트이다.

도 20은, NELL1 펩티드(1ng, 10ng, 100ng/ml) 및 BMP4(100ng/ml)에 노출된 흰쥐 태아 두개 세포(fetal rat calvarial cells)에서의 알카라인 포스파타제 유도(alkaline phosphatase induction)를 나타낸 막대그래프이다.

도 21A ∼ D는 NELL1으로 처리된 NELL1 (A & B 5ng/ml 및 C & D 50ng/ml)로 처리된 조골세포의 현미경 사진들이다.

도 22A 및 22B는 아스코르브산이 없는 극소결절(micronodules)을 형성하는 NELL1 MC3T3 극소결절의 현미경 사진들이고; 도 22B는 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase)에 대해 염색된 것이다.

도 23A ~ 23C는 A) 안티-NELL, B) β-Gal 및 C) NELL 아데노바이랄 구성체(adenoviral constructs)에서의 무기질화를 나타낸 현미경 사진들이고; 도 23D 및 23E는 시간 경과에 따른 각 세포 그룹의 오스테오칼신(osteocalcin) 및 오스테오폰틴(osteoponin) 레벨(levels)을 나타낸 막대그래프이다.

도 24는, 두개관 과성장(calvarial overgrowth)을 보여주는 무기질화를 나타내기 위해 염색된 NELL1 과발현 유전자도입 쥐(NELL1 over expressing transgenic mouse)의 현미경 사진이다.

도 25A 및 25B는 각각 A) NELL1 과발현 유전자도입 쥐 그리고 B) 정상적 동복자(normal littermate)의 무기질화에 대해 염색된 두개관(calvaria)의 현미경 사진들이다.

도 26은, A) Cbfa1 또는 B) 대조구(control)로 처리된 흰쥐 태아 두개 세포(fetal rat calvarial cells)의 NELL1 유전자 발현을 나타낸 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction) 블로트이다.

도 27A ∼ 도27C는 각각 A) 야생형(wild-type), B) Cbfa1^+/-, 그리고 C) Cbfa1^+/- + NELL1^overexp 쥐들의 두개골의 두개골(상단), 쇄골(중앙) 및 마이크로-CT의 골격 염색(skeletal staining) 사진들이다.

도 28A 및 28B는, 각각 A) BMP2 처리되고 B) NELL1 처리된 두개골 결손의 처리구(우측) 및 대조구(좌측)의 마이크로CT(microCT) 사진들이다.

도 29는, NELL1(우측) 및 BMP(좌측) 처리된 두개골 결손(calvarial defects)의 마이크로CT 사진이다.

도 30A 및 30B는, 마이크로 CT 처리된 NELL1 (우측)와 대조구(우측) 두개골 결손의 사진들이다.

도 31A 및 31B는, A) NELL1^overexp 그리고 B) 야생형 쥐들의 TUNEL 염색 연골(stained cartilage)의 현미경 사진이다.

도 32는, 선택된 위치에 골을 생성하기 위해 환자를 치료하는 하나의 방법의 흐름도이다.

도 33A는 임플란트의 하나의 실시예를 설명한 개략도이고; 도 33B는 선택된 위치에 골을 형성하기 위해 환자를 치료하는 하나의 실시예를 설명한 개략도이다.

본 발명은 NELL1 및 NELL2 펩티드의 발현 및 정제를 위한 방법을 제공할 수 있다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 방법은 NELL 펩티드와, NELL 펩티드 발현 핵산 구성체 (nucleic acid constructs expressing NELL peptides)와 그리고 다량의 NELL 펩티드를 만드는데 유용할 수 있는 NELL 펩티드 발현 세포를 포함한다. 하나의 실시예에서, NELL 펩티드 발현 핵산 구성체는, 숙주 세포에 NELL 펩티드의 단백질 트래픽킹(protein trafficking) 및 생산후 변형(post production modification)을 촉진할 수 있는 시그널 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 시그널 펩티드는 숙주 세포로부터 펩티드의 분비를 촉진할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 적어도 임상 또는 연구 목적을 위해 정제될 수 있는 다량의 기능성 NELL 펩티드를 제공하는 장점이 있다.

본 발명은 NELL 펩티드를 포함하는 합성물과 기질을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 합성물은 NELL1을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 적용 위치(application site)와 관련하여, 펩티드의 용도, 안정도, 활성, 확산 및/또는 농도에 영향을 줄 수 있는 추가작용제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 기질은 임플란트 부근의 골 수리를 촉진할 수 있는 NELL1 펩티드 및/또는 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 여러 임상 용도에서 골 생성 분화(osteogenic differentiation), 조골세포 무기질화(osteoblastic mineralization) 및/또는 골 형성의 방법들을 포함할 수 있다.

본 발명은 적어도 NELL 펩티드가 공지된 성장 인자보다 더 큰 효과를 제공할 수 있거나 다른 성장 인자들의 활성을 증진시킬 수 있다는 장점이 있다. 그러므로, 각 성장 인자가 적은 투약량으로 임상 용도를 위해 사용될 수 있다. 이것은 적어도 임상 치료가 더 알맞은 가격으로 제공될 수 있다는 점에서 중요하다. 또한, 본 발명은 NELL1이, BMP 만으로 치료의 임상요금(clinical rate) 및 효과를 향상시킬 수 있는 골 생성 분화(osteogenic differentiation), 골 형성 무기질화(osteoblastic mineralization) 및 골 형성을 강화한다는 점에서 아무튼 유리하다.

정의

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 아미노산 잔기들의 폴리머를 지칭하기 위해 호환성이 있게 사용될 수 있다. 이 용어들은, 자연 발생 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 하나 또는 그보다 많은 아미노산 잔기가 해당 자연 발생 아미노산의 인공의 화학적 동족체(artificial chemical analogue)인 아미노산 폴리머에 적용될 수 있다.

용어 "NELL1 cDNA"는 서열번호 1, 3 및 5 (각각 도 1, 3 & 5에 해당)를 지칭할 수 있으며, 그리고 "NELL2 cDNA"는 서열번호 7, 9, 11 및 13 (각각 도 7, 9, 11 & 13에 해당)을 지칭할 수 있다.

NELL1 펩티드는 NELL1 유전자 또는 cDNA에 의해 발현될 수 있는 단백질이며, 서열번호 2, 4, 및 6 (각각 도 2, 4 & 16에 해당)을 포함한다. NELL1 펩티드는 골 생성 세포 분화(osteogenic cell differentiation), 조골세포 분화(osteoblast differentiation) 또는 골 형성을 유도하는 능력을 보유한 하나의 NELL1 펩티드 단편을 포함할 수 있다. NELL2 펩티드는 NELL2 유전자 또는 cDNA에 의해 발현될 수 있는 단백질이고 서열번호 8, 10, 12 및 14 (각각 도 8, 10, 12 및 14에 해당)를 포함한다. NELL2 펩티드는 완전한 NELL2 펩티드 서열과 유사한 활성을 보유한 NELL2 펩티드 단편(fragment)을 포함할 수 있다.

용어 "항체"는 손상되지 않은 면역글로블린(intact immunoglobulin), 중연쇄 및 경쇄 가변 부위(light and heavy chain variable regions)만을 포함하는 Fv 단편, 2황화물 결합(disulfide bond)에 의해 연결된(linked) Fv 단편, 가변 부위(variable regions)와 일부 불변 부위(parts of the constant regions)를 포함하는 Fab 또는 (Fab)'2 단편, 그리고 단일 사슬 항체 등과 같은 여러 형태의 변형 또는 변경된 항체들을 포함할 수 있다. 하나의 항체는, Fab 및 F(ab')^2', 및/또는 에피토프 결정인자(epitopic determinant)를 결합할 수 있는 단일 사슬 항체(예를 들어, scFv)와 같은 그 단편뿐만 아니라 손상되지 않은 분자들을 포함할 수 있다. 항체는 (마우스 또는 쥐와 같은) 동물 또는 인간 유래이거나 키메라(chimeric)이거나 인간화된(humanized) 것일 수 있다. 항체는, 다클론성(polyclonal) 항체 또는 NELL1 또는 NELL2 단백질에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 대한 특이성(specificity)을 갖는 단일클론성(monoclonal) 항체와 같은 단일클론성 항체("mAb's") 일 수 있다.

용어 "포착제(capture agent)"는 항체-항원, 렉틴-탄수화물(-lectin-carbohydrate), 핵산-핵산, 비오틴-아비딘(biotin-avidin) 등과 같은 결합 복합체(binding complex)를 형성하기 위해 다른 분자에 특이하게 결합하는(specifically bind) 분자를 지칭할 수 있다.

용어 "특이하게 결합한다(specifically bind)"는, 분자들[예를 들어, 단백질 및 다른 생물제제(biologics)]내의 이종 개체군(heterogeneous population)의 실재 생체분자(presence biomolecule)를 결정하는(determinative) 결합 반응을 나타내며, 생체분자(biomolecule)(예를 들어, 단백질, 핵산, 항체 등)를 나타낼 수도 있다. 따라서, 지정된 조건[예를 들어, 항체의 경우에 면역분석(immunoassay) 조건 또는 핵산의 경우에 한정적 혼성화(stringent hybridization) 조건] 하에서, 특정 리간드(ligand) 또는 항체는 그 특정 "타깃(target)" 분자에 결합할 수 있고, 샘플에 존재하는 다른 분자들에 상당한 양이 결합하지 않을 수 있다.

용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 서로 공유적으로 연결된 적어도 두 개의 뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 본 발명의 핵산은, 몇몇 경우에 예를 들어, 포스포라미드(phosphoramide), 포스포로티오아테(phosphorothioate), 포스포로디티오아테(phosphorodithioate), 오메틸포포로아미디트 연쇄(omethylphophoroamidite linkages), 및/또는 펩티드 핵산 백본(backbones) 및 연쇄(linkages)를 포함하는 대체 백본(alternate backbones)을 가질 수 있는 핵산 동족체(nucleic acid analogs)가 포함될 수 있기는 하나, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으며, 그리고 포스포디에스테르 결합(phosphodiester bonds)을 포함할 수 있다. 아날로그 핵산은 포지티브 백본 및/또는 비-리보스 백본을 포함할 수도 있다. 핵산은 또한 하나 또는 그보다 많은 카르보사이클릭 당(carbocyclic sugars)을 포함할 수도 있다. 리보스-포스페이트 백본(ribose-phosphate backbone)의 변형은 라벨(labels)과 같은 부가 성분(additional moieties)의 첨가를 촉진하거나, 예를 들어, 생리적 환경에서의 그러한 분자들의 안정도와 반감기(half-life)를 증가시키기 위해 행해질 수 있다.

용어 "특정 혼성화(specific hybridization)"는, 하나의 탐색자(probe)가 그 타깃 서브시퀀스(target subsequence)에 우선적으로 하이브리드할 수 있고, 다른 서열에 대해 더 작은 범위까지 하이브리드할 수 있는 조건을 포함하는 엄격한 조건하에서 하나의 핵산 분자가 특정 뉴클레오티드 서열과 우선적으로 결합, 이중화(duplexing), 또는 하이브리드(hybridizing)하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명은 NELL1을 사용하여 골 형성을 유도하기 위한 작용제(agents) 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 NELL1 및 NELL2 단백질의 발현 및 정제 방법에 관한 것이다.

NELL1은 팅(Ting)과 와타나베(Watanabe)에 의해 동시에 동정되었다(identified). NELL1은 810 aa 펩티드이고, 주로 골에 분포되어 있다. 성인의 경우, NELL2는 안악면골(craniofacial bone)에 높은 레벨로, 그리고 장골(long bone)에 낮은 레벨로 발현된다. 조골세포 분화(osteoblast differentiation), 골 형성 및 재생에서의 그 역할이 연구되어 왔다. NELL2은 1996년에 와타나베에 의해 동정되었고, 816 펩티드이며, 신경 세포와 뇌에 분포되어 있다.

인간 NELL1 유전자는 프로모터 부위(promoter region)의 적어도 3 Cbfa1 반응 요소들(response elements)을 포함한다. Cbfa1은 특히 NELL1 프로모터의 이 반응 요소들과 결합한다. NELL1 발현은, 성장기(development) 및 성인기(adulthood)에 적어도 전구골모세포(preosteoblasts), 조골세포(osteoblasts) 및 비대연골세포(hypertrophic chondrocytes)에서 내생적으로 발현된 이 전사 인자(transcription factors)의 제어하에 일어날 수도 있다. 쇄골 두개 이골증(cleidocranial dysostosis)은, 적어도 부분적으로 Cbfa 분열(disruption)에 기인한 것으로 생각되는 발육상의 두개골 결손(developmental cranial defect)이다.

NELL1 및 NELL2 펩티드의 기능을 연구하기 위하여 펩티드를 만들고 정제하는 시도들이 있었다. 불운하게도, NELL1 및 NELL2 펩티드는 많은 발현 시스템에서 발현될 수 없었다. 특히, 대장균 다이렉트 및 S. 세레비지에 발현 시스템(E. coli direct and S. cerevisiae expression systems)에서 발현이 전혀 검출되지 않았고, 융합 대장균 및 CHO-dhfr 발현 시스템(E. coli fused and CHO-dhfr expression systems)에서는, 매우 낮은 레벨의 발현이 발생하였다. 바쿨로바이러스 시스템(baculovirus system)에서는, 펩티드가 발현되었다.

NELL1 및 NELL2 펩티드가 곤충 세포에서 높은 레벨로 발현될 수 있었다는 것과 곤충 시스템에서 발현된 NELL1 및 NELL2 펩티드가 단백질의 기능 형태(functional forms)라는 것이 본 발명의 놀라운 발견이다.

COS7 세포가 NELL1 및 NELL2 단백질을 리터 배지(litter medium)당 약 10 마이크로그램(micrograms)과 같이 낮은 레벨로 만들기 위해 사용될 수 있으나, 발현을 위해 세럼-함유 배지가 필요하다. 불운하게도, 이 배지는 단백질 제조를 위해 적절하지 않다. 시그널 펩티드에 있어서, NELL1 및 NELL2 내생(endogenous) 시그널 펩티드는 COS7 세포에 펩티드가 낮은 레벨로 발현되게 한다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 곤충 세포 라인(insect cell line)을 사용하여 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 기능성(functional) NELL 펩티드를 발현하는 방법을 포함한다. 하나의 실시예에서, 곤충 세포는 하이 파이브 세포, Sf9 및 다른 Sf 세포일 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 방법은 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 준비하는 것을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 NELL 펩티드의 적어도 하나의 기능부(functional portion)를 엔코딩하는 cDNA 또는 게놈 DNA(genomic DNA)일 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 인간 NELL1 (서열번호 1), 쥐 NELL1 (서열번호 3), 쥐 NELL1 (서열번호 5), 또는 인간 NELL2 (서열번호 7), 쥐 NELL2 (SEQID NO : 9), 쥐 NELL2 (서열번호11), 닭 NELL2 (서열번호 13)를 포함하나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 핵산 서열은 또한 위에 열거한 서열의 일부와 적어도 약 75% 서열 유사성을 가지는 서열과 같이, 본질적 서열 유사성(substantial sequence similarity)을 갖는 서열들을 포함할 수 있다.

또한, 핵산은 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 하나의 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 발현하기 위한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 plZT/V5-His [인비트로젠(Invitrogen)]일 수 있으며, 선택적 표지(selective markers)는 또한 블라스트시딘(blastcidin) 및 네오마이신(neomycin)을 포함할 수 있다.

또한, 핵산 서열은, 유전자 발현의 레벨을 감시하기 위해 리포터 생성물(reporter products)을 엔코딩하거나 또는 펩티드 발현의 레벨을 감시하기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 눈에 보이게 될 수 있는 펩티드 테그(tags)를 엔코딩하는 부가 핵산을 포함할 수도 있다. 부가 서열은 핵산의 발현 또는 발현된 펩티드 생성물의 기능성을 손상시키지 않도록 선택될 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 방법은 하나의 분비성 시그널 펩티드(secretory signal peptide)를 엔코딩하는 하나의 핵산 서열과 함께(in frame with a nucleic acid sequence) NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 준비하는 것을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 분비성 시그널 펩티드는 하나의 분비된 벌 단백질(secreted bee protein) 유래 분비성 시그널 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은, 멜리틴 시그널 서열(melittin signal sequence), 드로스필라(drosphila) 면역글로블린-결합 단백질 시그널 서열, 말 인터페론-감마[equine interferon-gamma (elFN-gamma)] 시그널 펩티드, 뱀 포스폴리파제 A2 억제(snake phospholipase A2 inhibitor) 시그널 펩티드, 인간 및/또는 닭 리소자임(lysozyme) 시그널 펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 포유동물 발현 시스템에 있어서, 프로트립신 선도 서열(protrypsin leading sequence)이 또한 사용될 수 있다.

하나의 실시예에 있어서, 본 발명의 방법은, 하나의 곤충 세포 라인을 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체(nucleic acid construct)로 감염시키는(transfecting) 것과; 그리고 NELL 펩티드의 발현 및/또는 분비를 허용하는 조건하에서 곤충 세포 라인을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 곤충 세포 라인은 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체로 일시적으로 또는 안정되게 감염될 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 분비된 NELL 펩티드를 모으는 것과 그리고/또는 사용을 위해 NELL 펩티드를 정제하는 것을 포함할 수도 있다. 펩티드 생성물은 여러 기능 또는 발현 분석에서 활성이 시험될 수 있다. 예를 들어, 어떤 분석에서, NELL 펩티드가 정해진 파라미터(parameter)에서 제어 물질(control substance)에 대해 상당한 효과를 가지면, NELL 펩티드는 측정된 파라미터에 영향을 주도록 기능한다고 할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은, 하나의 곤충 세포의 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 NELL 펩티드의 적어도 하나의 기능부를 엔코딩하는 하나의 cDNA 또는 게놈(genomic) DNA일 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 인간 NELL1 (서열번호 1), 쥐 NELL1 (서열번호 3), 쥐 NELL1 (SEQID NO : 5), 또는 인간 NELL2 (서열번호 7), 쥐 NELL2 (서열번호 9), 쥐 NELL2 (SEQID NO :11), 닭 NELL2 (서열번호 13)를 포함하나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 핵산 서열은 또한 위에 열거한 서열의 일부와 적어도 약 75% 서열 유사성을 가지는 서열과 같이, 본질적 서열 유사성을 갖는 서열들을 포함할 수 있다.

핵산 구성체(nucleic acid construct)는 하나의 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열을 발현시키기 위한 하나의 발현 벡터를 포함할 수 있다. 또한, 핵산 서열은, 유전자 발현의 레벨을 감시하기 위해 리포터 생성물을 엔코딩하거나 펩티드 발현의 레벨을 감시하기 위해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 시각화될 수 있는 펩티드 테그를 엔코딩하는 부가 핵산을 포함할 수 있다.

핵산 구성체은, 또한 벡터로 변형된 숙주 세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 하나의 단백질을 엔코딩하는 유전자와 같이 선택가능 표지(selectable marker)로도 불리는 하나의 선택 유전자(selection gene)를 가지는, 발현 및 클로닝 벡터(cloning vectors)를 포함하여 구성될 수 있다. 이 유전자의 존재는 벡터를 삭제하는(delete) 숙주 세포가 변형된 숙주에 대해 성장 또는 재생에 있어 유리하지 않을 것이라는 것을 보증한다. 전형적인 선택 유전자들은, (a) 예를 들어, 암피실린(ampicillin), 네오마이신(neomycin), 메토트렉사트(methotrexate) 또는 테트라사이클린(tetracycline) 등의 항생제 또는 다른 독소(toxins)에 대한 내성을 부여하고, (b) 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiencies)을 보완하는, 단백질들을 엔코딩한다.

핵산 구성체는 또한 숙주 유기체에 의해 인식되고, NELL 엔코딩 핵산에 작동가능하게 연결된(linked) 하나의 프로모터(promoter)를 포함할 수 있다. 프로모터들은, 유도가능하고 구성적인 프로모터(inducible and constitutive promoters)를 포함하여, 그 제어하에 핵산의 전사 및 해독을 제어하는, 구조 유전자(structural gene)[일반적으로 약 100 내지 1000 bp]의 시작 코돈(start codon)으로부터 상향으로 위치된 해독되지 않은 서열들이다. 유도가능 프로모터는, 예를 들어, 영양물(nutrient) 또는 온도변화가 있거나 없는, 배양 조건의 어떤 변화에 답하는 그 제어하에 DNA로부터 상승 레벨의 전사를 일으키는 프로모터이다. 이 때, 여러 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 많은 수의 프로모터들이 잘 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능 관계(functional relationship)에 놓일 때 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 프리시퀀스(presequence) 또는 분비성리더(secretory leader)를 위한 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리프로테인(preprotein)으로 발현되면, 하나의 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 하나의 프로모터(promoter) 또는 증폭제(enhancer)는, 서열의 전사에 영향을 주면 코딩 서열(coding sequence)에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 사이트(ribosome binding site)는 해독을 촉진하도록 위치되면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 기능성 NELL 펩티드를 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 이 세포는 하나의 곤충 세포일 수 있다. 하나의 실시예에서, 곤충 세포는 하나의 하이 파이브 세포일 수 있다.

하나의 실시예에서, 이 세포는 하나의 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체로 감염될(transfected) 수 있다. 예를 들어, 세포 라인은 NELL 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체와 일시적으로 또는 안정적으로 감염될 수 있다. 하나의 실시예에서, NELLn 발현 핵산[예를 들어, cDNA(들)]은 세포(예를 들어, 곤충 세포)를 감염시키기에 충분한 유전자 발현 벡터 또는 바이러스 입자(viral particles)로 클론화될 수 있다.

핵산 서열은 또한 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 핵산 서열과 함께 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 서열을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 기능성 NELL 펩티드를 발현하는 세포를 포함할 수 있으며, 기능성 단백질을 분비할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 NELL1 또는 NELL2 펩티드와 같은 NELL 펩티드를 포함하는 하나의 폴리펩티드(아미노산 서열)를 포함할 수 있으며, 분비성 시그널 펩티드를 포함할 수 있다.

예를 들어, NELL 펩티드의 아미노산 서열은, 인간 NELL1 (서열번호 2), 쥐 NELL1 (서열번호 4), 쥐 NELL1 (서열번호 6), 또는 인간 NELL2 (서열번호 8), 쥐 NELL2 (서열번호 10), 쥐 NELL2 (서열번호 12), 닭 NELL2 (서열번호 14)를 포함하나 이에 한정되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다. 아미노산 서열은 또한 위에 열거된 서열의 일부와 적어도 약 75% 서열 유사성을 가지는 서열과 같이, 본질적 서열 유사성을 갖는 서열들을 포함할 수 있거나, 또는 NELL1 펩티드와 같은 유사 활동 결합 도메인(similar active binding domains)을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 아래에 설명될 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 표준 펩티드 정제 프로토콜(standard peptide purification protocols)에 따라, 배양 배지로 분비된 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드를 정제하는 방법을 포함한다.

하나의 실시예에서, 하나의 선택된 세포가 하나의 NELL 펩티드를 발현 및/또는 분비하기 위해 선택된 핵산 서열을 발현하는지의 여부가 시험될 수 있다. 하나의 실시예에서, NELL 펩티드의 존재, 양 및/또는 활성이 시험될 수 있다.

하나의 실시예에서, NELL 펩티드가 당업자들에게 잘 알려진 여러 방법에 의해 검출되고 계량될 수 있다. 이 기술은, 전기영동(electrophoresis), 모세관 전기영동장치(capillary electrophoresis), 고성능액체크로마토그라피(high performance liquid chromatography; HPLC), 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC), 하이퍼확산 크로마트그래피(hyperdiffusion chromatography) 등과 같은 분석 생화학적 방법(analytic biochemical methods) 또는 유체(fluid) 또는 겔 침강소 반응(gel precipitin reactions), 면역 확산법(immunodiffusion) [단일(single) 또는 이중(double)], 면역전기이동법(immunoelectrophoresis), 방사면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 효소 결합 면역 흡착법(enzyme-linked immunosorbent assays; ELISAs), 면역형광 분석법(immunofluorescent assays), 웨스턴 블로팅(western blotting) 등과 같은 여러 면역학적 방법(immunological methods)을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 웨스턴 블로트(Western blot) [면역탁본(immunoblot)] 분석법이 선택된 샘플의 NELL 펩티드(들)의 존재를 검출하고 계량하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술은 분자량에 기초한 겔 전기영동법에 의해 샘플 단백질을 분리하는 것과, 분리된 단백질들을 [니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose filter), 나일론 필터, 또는 파생된 나일론 필터(derivatized nylon filter)와 같은] 하나의 적절한 고형 지지체(solid support)로 옮기는 것과, 그리고 하나의 타깃 펩티드에 특이하게 결합하는 항체들로 그 샘플을 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 분석법은 당업자들에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 [음으로 또는 양으로 또는 타깃 폴리펩티드의 양으로] 평가될(score) 수 있다. 특정 평가 방법은 분석 포맷(assay format)과 라벨의 선택에 달려있을 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블로트 분석법은 효소 라벨(enzymatic label)에 의해 만들어진 염색 생성물을 시각화함에 의해 평가될 수 있다. 정확한 분자량으로 뚜렷히 볼수 있는 염색 밴드 또는 점은 하나의 양의(positive) 결과로 평가될 수 있는 반면, 뚜렷히 볼수 있는 점 또는 밴드의 부재는 음(negative)으로서 평가될 수 있다. 밴드 또는 점의 세기(intensity)는 타깃 폴리펩티드 농도의 양적 측정값을 제공할 수 있다.

그러한 발현 시스템에서 발생된 NELL1 단백질은, 골 형성 단백질(bone morphogenic proteins)의 사용과 유사한 방식(예를 들어, BMP-24를 통한 BMP-1)으로 사용될 수 있다. 그러므로, NELL1 폴리펩티드(들)는, 자연 치유(natural healing)가 제한되거나 존재하지 않는 환경하에서 골절의 수리를 신속하게 하거나 또는 골 수리 또는 교체를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 그외에, NELL1 폴리펩티드는 골 이식재에 합체될 수 있다. 이 이식재들은 골절 치료에 또는 인공보철물(prostheses)의 대체(replacement)/치료(healing) 또는 골 이식(bone transplants) 및 척추고정(spinal fusion)을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 골 형성의 정도 및/또는 속도를 증진시키기 위한 작용제 및 방법을 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 골 형성을 증진시키기 위한 작용제의 전신(systemic) 및/또는 국부적 적용(local application)을 포함할 수 있다. 골 형성의 정도 및/또는 속도를 증진시키기 위한 방법 또는 작용제의 능력의 임상 인덱스(clinical indices)는 DEXA 스캐닝에 의해 평가된 것과 같은 골 형성의 바람직한 위치의 골 밀도의 개선에 의해 입증된다. 골절 치료에서 촉진된 골 형성은 선택된 시간 간격으로 골절 부위의 표준 X-레이에 의해 일상적으로 평가된다. 정량 CT 스캐닝(quantitative CT scanning)과 같이 상기 인덱스를 결정하기 위한 더 진보된 기술이 사용될 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은, 골원 세포의 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것과; 제2 작용제를 선택적으로 쓰는 것과; 그리고 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 세포 표지(cellular marker)의 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)를 증가시키는 방법을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 하나의 골원 세포에 하나의 NELL1 펩티드를 가함에 의해 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증진시키는 것을 포함할 수 있으며, NELL1 펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6, 또는 골 형성 무기질화를 증진시키는 데 효과적인 NELL 펩티드의 일부를 포함하여 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 방법은 발현 조절 분자(expression regulating molecule), Cbfa1의 세포 레벨을 높이는 것과 같이, 하나의 내생적 NELL1 유전자의 발현을 유도함에 의해 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은, 골원 세포를 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체로 감염시킴에 의해 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있으며, NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체는 서열번호1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하여 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

골원 세포는, 조골세포(osteoblasts), 중간엽 세포(mesenchymal cells), 섬유아세포(fibroblasts), 태아 배아 세포(fetal embryonic cells), 줄기 세포(stem cells), 골수 세포(bone marrow cells), 경막 세포(dural cells), 연골세포(chondrocytes), 연골모세포(chondroblasts) 및 지방 줄기 세포(adipose stem cells)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

골원 세포는 또한 골 조직내에 위치되거나, 골 조직과 접촉하거나 또는 골 조직으로 이동하는(migrate) 세포들을 포함할 수 있으며, 이 세포들은 직접적으로 또는 간접적으로 골 조직의 생성을 자극한다. 그와 같이, 골원 세포는 성숙한 조골세포들, 즉, 골 조직을 "직접" 형성하는 세포들, 그 자체로 궁극적으로 분화되는 세포일 수 있다.

제2 작용제는 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 제2 작용제는 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)를 유도함에 있어 NELL1과 함께 보완적(complimentary) 또는 상승적인(synergistic) 효과를 가지도록 선택될 수 있다.

골형성 분화(osteoblastic differentiation)의 세포 표지(cellular markers)는, 증진된 레벨의 알카라인 포스페타제 활동(alkaline phosphatase activity), 오스테오칼신(osteocalcin) 및 오스테오폰틴 mRNA 발현(osteoponin mRNA expression), BMP7 발현, 데코린(decorin) 발현 및 라미닌(laminin) B1 발현을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러나, 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 결과로서의 그 활동 또는 발현이 변화하는 세포 표지(cellular marker)가 그러한 표지로서 사용될 수 있다.

하나의 실시예에서, 골 형성 무기질화(osteoblastic mineralization)를 증진시키는 방법은 하나의 골 형성 세포(osteoblastic cell)의 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것과, 제2 작용제를 선택적으로 쓰는 것과; 그리고 무기질화(mineralization)의 세포 표지의 발현을 유도하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 하나의 NELL1 펩티드를 골 형성이 필요한 부위에 가함에 의해 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있으며, 이 NELL1 펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6, 또는 막내 골 형성을 증가시키는데 효과적인 NELL 펩티드의 일부를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

골 형성성 무기질화의 세포 표지는 증진된 레벨의 칼슘 혼합물(calcium incorporation)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그러나, 그 활동 및 발현이 골 형성성 무기질화의 결과로서 변화하는 여하한 세포 표지는 그러한 표지로서 사용될 수 있다.

하나의 실시예에서, 막내 골 형성(intramembraneous bone formation)을 증진시키는 방법은, 골 형성이 바람직한 위치에 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증진시키는 것과, 골 형성이 바람직한 대략 동일한 위치에 제2 작용제를 선택적으로 쓰는 것과; 그리고 막내 골 형성을 유도하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 골 형성이 필요한 부위에 NELL1 펩티드를 가함에 의해 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있으며, 이 NELL1 펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6, 또는 막내 골 형성에 효과적인 NELL 펩티드의 일부를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

제2 작용제는, TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골원 세포, 골, 골 기질(bone matrix), 건 기질(tendon matrix), 인대 기질(ligament matrix)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 제2 작용제는 막내 골 형성(intramembraneous bone formation)을 유도함에 있어 NELL1으로 보완적(complementary) 또는 상승적인(synergistic) 효과를 가지도록 선택될 수 있다.

막내 골의 형성은, 골 형성이 필요한 곳의 골 밀도의 조직학(histology)적 현미경 검사(microscopic inspection), DEXA 스캐닝, X-레이 또는 CT 스캐닝에 의해 평가될(evaluated) 수 있다.

하나의 실시예에서, 연골성 골 형성(endochondral bone formation)을 증진시키는 방법은, 골 형성이 필요한 부위에 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증대시키는 것과; 골 형성이 필요한 부위에 제2 작용제를 선택적으로 쓰는 것과 그리고 골 형성이 필요한 부위에 적어도 연골모세포의 비대(hypertrophy of chondroblast)를 유도하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 골 형성이 필요한 부위에 NELL1 펩티드를 가함에 의해 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 것을 포함할 수 있으며, NELL1 펩티드는, 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6, 또는 연골성 골 형성을 증진시키는데 효과적인 NELL 펩티드의 일부를 포함하여 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

제2 작용제는 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골원 세포, 골, 골 기질, 건 기질, 인대 기질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 제2 작용제는 연골성 골 형성(endochondral bone formation)을 유도함에 있어 NELL1으로 보완적(complementary) 또는 상승적인(synergistic) 효과를 가지도록 선택될 수 있다.

연골성 골의 형성은, TUNEL 염색에 의해 밝혀진 비대성(hypertrophic) 및 고사성 연골모세포(apoptotic chondroblasts)의 증가에 의해 나타난 바와 같이 연골모세포 비대(chondroblast hypertrophy)에 의해 평가될 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 NELL1을 캐리어(carriers) 또는 기질(substrates), 및 최종 기질(resulting substrates)에 결합시키는(incorporate) 방법을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 골 형성을 유도하는 합성물(composition)은, NELL1 펩티드와, NELL1 펩티드의 발현을 변경시키는 작용제 또는 NELL1 펩티드의 활동을 변경시키는 작용제를 포함하는 군으로부터 선택되고, 골 형성을 유도하기에 효과적인 양의 제1 작용제; 그리고 하나의 캐리어를 선택적으로 포함할 수 있다.

이 합성물은, 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6, 또는 골 형성을 유도하는데 효과적인 단편을 포함하여 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 NELL1 펩티드를 포함할 수 있다.

이 합성물은, TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골, 골 기질, 건 기질 또는 인대 기질, 골원 세포 및/또는 골 형성 세포(osteoblastic cells)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 제2 작용제를 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 위의 캐리어는, 효소 또는 가수분해 메카니즘(enzymatic or hydrolytic mechanisms)에 의해 분해가능한 것과 같이 생물분해성이 있을(biodegradable) 수 있다. 캐리어의 예들은, 폴리 (L-락티드) (PLLA), 폴리 (D, L-락티드) (PDLLA), 폴리글리콜리드 (PGA), 폴리 (락티드-코-글리콜리드) (PLGA), 폴리 (-카프롤락톤)[poly (-caprolactone)], 폴리 (트리메틸렌 카르보네이트 [poly (trimethylene carbonate)], 폴리 (p-다이옥사논) [poly (p-dioxanone)], 폴리 (-카프롤락톤-코-글리코리드 [poly (-caprolactone-co-glycolide)], 폴리 (글리콜리드-코-트리메틸렌 카르보네이트) 폴리 (D, L-락티드-코-트리메틸렌 카르보네이트 [poly (glycolide-co-trimethylene carbonate) poly (D, L- lactide-co-trimethylene carbonate)], 폴리아릴레이트(polyarylates), 폴리히드록실부티레이트 [polyhydroxybutyrate (PHB)], 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리 (안하이드라이드-코-이미드 [poly (anhydride-co-imide)], 프로필렌-코-푸마레이트[propylene-co-fumarates], 폴리락톤[polylactones], 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 다음극성 폴리머(polyanionic polymers), 다무수물(polyanhydrides), 폴리에스테르-아미드(polyester-amides), 폴리 (아미노산) [poly (amino-acids)], 호모폴리펩티드, 폴리 (포스파젠) [poly (phosphazenes)], 폴리 (글락사논) [poly (glaxanone)], 다당류(polysaccharides), 및 폴리 (오르소에스테르) [poly (orthoesters)], 폴리글락틴(polyglactin), 폴리글락틱산(polyglactic acid), 폴리알도닉산(polyaldonic acid), 폴리아크릴릭산(polyacrylic acids), 폴리알카노에이트(polyalkanoates)와 같은 폴리-(α-하이드록시 산)[poly-(α-hydroxy acids)]과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 합성 흡수가능 폴리머(synthetic absorbable polymers)와; 코폴리머(copolymers) 및 그 혼합물 그리고 그 유도체 및 변형(modifications)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 미국 특허 4,563,489호와 PCT 국제출원 WO/03024316호를 참고하라. 캐리어의 다른 예들은, 알킬셀룰로오스, 히드록시알킬셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 그리고 그 양이온성 염(cationic salts)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 셀룰로오스 폴리머(cellulosic polymers)를 포함한다. 캐리어의 다른 예들은, 탄산칼슘(calcium carbonates), 인산칼슘(calcium phosphates), 인회석(apatites), 대생물활성 글라스 재료(bioactive glass materials), 및 산호-유래 인회석(coral-derived apatites)와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 합성 및 천연 바이오세라믹을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 미국 특허출원 2002187104호; PCT 국제출원 WO/9731661호; 및 PCT 국제출원 WO/0071083호를 참고하라.

하나의 실시예에서, 천연 세럼 농도의 약 1.5 내지 7-배(fold) 범위의 칼슘 및 인산 농도를 가지며, 약 2.8∼7.8 범위의 pH와, 약 15∼65℃의 온도를 갖는 용액으로 다양한 수단에 의해 조절된, 모조 체액(simulated body fluids)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 침지법(immersion techniques) 또는 솔-겔 법(sol-gel techniques)으로부터 유래된 바이오글라스(bioglass) 및/또는 인회석(apatites)을 포함하는 합성물에 의해 추가로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 미국 특허 6,426,114호 및 6,013,591호; 그리고 PCT 국제출원 WO/9117965호를 참고하라.

캐리어의 다른 예들은 콜라겐[예를 들면, 콜라스태트(Collastat), 헬리스태트 콜라겐 스폰지(Helistat collagen sponges)], 히알루로난(hyaluronan), 섬유소(fibrin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginate), 및 젤라틴(gelatin)을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 PCT 국제출원 WO/9505846호와 WO/02085422호를 참고하라.

하나의 실시예에서, 캐리어는, 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 헤파린 설페이트(heparin sulfate), 푸칸(fucan), 알긴산(alginate)과 같은 헤파린-유사 폴리머(heparin-like polymers) 또는 그 유도체를 포함하되 이에 한정되지 않는 헤파린-결합제(heparin-binding agents)와; 그리고 헤파린 친화도(heparin affinity)를 증진시키기 위한 아미노산 변형(amino acid modifications)을 갖는 펩티드 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 "Journal of Biological Chemistry" [2003, 278(44), p. 43229-43235]를 참고하라.

하나의 실시예에서, 기질은 액체, 고체 또는 겔의 형태일 수 있다.

하나의 실시예에서, 기질은 유동성 겔(flowable gel)의 형태인 하나의 캐리어를 포함할 수 있다. 이 겔은 골 형성이 필요한 사이트에 주사기와 같은 것에 의해 주입가능하도록 선택될 수 있다. 이 겔은 1차 결합(primary bonds)에 의해 형성되고, pH, 이온기(ionic groups), 및/또는 용매 농도에 의해 제어되는 화학적 겔일 수 있다. 이 겔은 또한 2차(secondary) 결합에 의해 형성될 수 있고 온도 및 점도에 의해 제어될 수 있는 물리적 겔일 수 있다. 겔의 예들은 플루로닉스(pluronics), 젤라틴, 히알루로난(hyaluronan), 콜라겐, 폴리락티드-폴리에틸렌 글리콜 용액 및 공액(conjugates), 키토산(chitosan), 시토산 & b-글리세로포스페이트 (BST-겔) [citosan & b-glycerophosphate (BST-gel)], 알지네이트(alginates), 아가로우스(agarose), 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 산화물(polyethylene oxide), N-메틸-2-피롤리돈의 폴리락타드/글리콜리드 [polylactides/glycolides in N-methyl- 2-pyrrolidone]를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 Anatomical Record [2001, 263 (4), 342-349]를 참고하라.

하나의 실시예에서, 캐리어는 적어도 약 250nm의 파장을 갖는 전자기 복사(electromagnetic radiation)와 같은 것에 의해 광중합성될 수 있다(photopolymerizable). 광중합성가능 폴리머(photopolymerizable polymers)의 예들은 폴리에틸렌 (PEG) 아크릴레이트 유도체, PEG 메타크릴레이트(methacrylate) 유도체, 프로필렌 푸마레이트-코-에틸렌 글리콜 [propylene fumarate-co-ethylene glycol], 폴리비닐 알코올 유도체 [polyvinyl alcohol derivatives], PEG-코-폴리 (-히드록시 애시드) 디아크릴레이트 마크로머 [PEG-co-poly (-hydroxy acid) diacrylate macromers]; 그리고 하이알우로닉산(hyaluronic acid) 유도체 및 덱스트란 메타크릴레이트(dextran methacrylate)와 같은 변형 다당류(modified polysaccharides)를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 미국 특허 5,410,016호를 참고하라.

하나의 실시예에서, 기질은 온도 민감성인 하나의 캐리어를 포함할 수 있다. 그 예들은, N-이소프로필아크릴아미드 (NiPAM), 또는 낮은 임계 용해 온도(lower critical solution temperature; LCST)와 에틸 메타아크릴레이트(ethyl methacrylate) 및 N-acryloxysuccinimide의 결합에 의해 강화된 펩티드[예를 들어 NELL1] 결합(binding)을 갖는 변형된 NiPAM; 또는 부틸메타크릴레이트(butylmethacrylate), 헥실메타크릴레이트(hexylmethacrylate) 및 도데실메타크릴레이트(dodecylmethacrylate)와 같은 알킬 메타크릴레이트(alkyl methacrylates)로 만들어진 캐리어를 포함한다. 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 PCT 국제출원 WO/2001070288호와; 미국 특허 5,124,151호를 참고하라.

하나의 실시예에 있어서, 캐리어는, 세포 유착 분자(cell adhesion molecules), 유착 펩티드(adhesion peprides), 및 수용체를 매개로 한 메카니즘(receptor mediated mechanisms)을 통해 세포-기질 부착(cell-matrix attachment)을 촉진할 수 있는 유착 펩티드 동족체, 및/또는 폴리카티오닉 폴리아미노산-펩티드(polycationic polyamino-acid-peptides) [예를 들어 폴리-리진(poly-lysine)], 폴리아니오닉 폴리아미노산-펩티드(polyanionic polyamino-acid-peptides), Mefp-클래스 유착 분자(Mefp-class adhesive molecules) 및 다른 DOPA-풍부 펩티드 [예를 들어 폴리-리진-DOPA (poly-lysine-DOPA)], 다당류(polysaccharides), 및 단백질글리칸(proteoglycans)을 포함하되 이에 한정되지 않는 비-수용체 매개 메카니즘 결합(non-receptor mediated mechanisms binding)을 통해 유착(adhesion)을 촉진할 수 있는 분자 성분(molecular moieties)으로 장식 및/또는 고정되는 하나의 서페이스(surface)를 가질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 PCT 국제출원 WO/2004005421호; WO/2003008376호; WO/9734016호를 참고하라.

하나의 실시예에서, 캐리어는, 콜라겐; 젤라틴; 히알루론산(hyaluronic acid); 알지네이트(alginate); 폴리(에틸렌 글리콜); 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스를 포함하는 알킬셀룰로오스 [히드록시알킬셀룰로오스 포함], 혈액, 섬유소, 폴리옥시에틸렌 산화물(polyoxyethylene oxide), 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트(calcium sulfate hemihydrate), 인회석, 카르복시비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer), 및 폴리 (비닐 알코올)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 격리제(sequestering agents)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 미국 특허 6,620,406,호를 참고하라.

하나의 실시예에서, 캐리어는, 폴리옥시에스테르(polyoxyester) [예를 들어 폴리소르베이트(polysorbate) 80, 폴리소르베이트 20 또는 플루로닉(Pluronic) F-68)]와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 캐리어 물질(carrier materials)내에서 NELL2의 안정 및/또는 분산을 증진하기 위해 계면활성제(surfactants)를 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 캐리어는, 글리신, 글루타민산 염산염(glutamic acid hydrochloride), 염화나트륨, 구아니딘(guanidine), 헤파린(heparin), 글루타민산 염산염(glutamic acid hydrochloride), 아세트산, 숙신산(succinic acid), 폴리소르베이트(polysorbate), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 수크로오스(sucrose), 및 아미노산과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 합체된 미국 특허 5,385, 887호를 참고하라. 하나의 실시예에서, 캐리어는 위에 열거된 것과 같은 물질들의 결합(combination)을 포함할 수 있다.

예시로서, 캐리어는 PLGA/콜라겐 캐리어 멤브레인(PLGA/collagen carrier membrane)일 수 있다. 이 멤브레인은 NELL1 펩티드를 포함하는 용액에 침액될 수 있다.

하나의 실시예에서, 인간 신체에 사용하기 위한 하나의 임플란트는, 임플란트에 가까운 골 형성을 유도하기에 충분한 양의 NELL1을 포함하는 하나의 기질을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 인간 신체에 사용하기 위한 하나의 임플란트는, 임플란트에 가까운 골 형성을 유도하기에 충분한 양의 NELL1을 포함하는 하나의 서페이스(surface)를 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 인간 신체에 사용하기 위한 하나의 임플란트는, 골 형성을 유도하기에 충분한 양의 골원 세포와 NELL1을 포함하는 하나의 서페이스를 가지는 하나의 기질을 포함할 수 있다. 하나의 실시예에서, 임플란트는, 자생조직 세포(autologous cells), 골원 세포 또는 골 형성 세포(osteoblastic cells), 세포 발현 NELL1 또는 다른 골원 분자(osteogenic molecule)를 포함하되 이에 한정되지 않는 세포들로 파종될(seeded) 수 있다.

임플란트는 메쉬(mesh), 핀(pin), 나사(screw), 플레이트(plate), 또는 보철 관절(prosthetic joint) 형상으로 형성된 하나의 기질을 포함할 수 있다. 예시로서, 하나의 기질은 치과용 임플란트 또는 정형 임플란트(orthopedic implant)의 형태일 수 있다. 그리고 NELL1은 임플란트에 가까운 골의 통합(integration)을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 임플란트는 콜라겐을 포함하는 하나의 기질과 같은, 재흡수가능한(resorbable) 하나의 기질을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 합성물은 하나의 시간 방출 정제(time release tablet)내에 포함될 수 있다.

NELL1 펩티드는 약리적 합성물을 형성하기에 적합한 하나의 캐리어(acceptable carrier)와 결합될 수 있다. 적합한 캐리어는, 예를 들어, 합성물을 안정화시키고 작용제의 흡수를 증진 또는 감소시키도록 작용하는 생리학적으로 적합한 화합물을 포함할 수 있다. 생리학적으로 적합한 화합물은, 예를 들어, 글루코오스, 수트로오스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온(glutathione)과 같은 산화방지제(antioxidants), 킬레이트제(chelating agents), 저분자량 단백질, 유사분열 방지제(anti-mitotic agents)의 클리어런스(clearance) 또는 가수분해(hydrolysis)를 감소시키는 합성물, 또는 추가작용제(excipients) 또는 다른 안정제(stabilizers) 및/또는 완충액(buffers)을 포함할 수 있다.

다른 생리학적으로 적합한 화합물은, 습윤제(wetting agents), 유화제(emulsifying agents), 분산제(dispersing agents) 또는 미생물의 성장 또는 활동을 방해하는데 특히 유용한 방부제(preservatives)를 포함한다. 다양한 방부제들이 잘 알려져 있으며, 예를 들어 페놀 및 아스코르브산을 포함한다. 당업자는 생리학적으로 적합한 화합물을 포함하는 하나의 캐리어의 선택이 예를 들어 투여 경로(route of administration)에 좌우됨을 알 것이다.

합성물은 투여의 방법에 따른 다양한 단위 투약 형태(unit dosage forms)로 투여될 수 있다. 예를 들어, 적절한 단위 투약 형태는 분말, 정제, 환약, 캡슐을 포함할 수 있다.

본 발명의 합성물은 수용성 펩티드를 위한 수성 캐리어(aqueous carrier)와 같은 약리적으로 적합한 캐리어에 용해된 NELL1 펩티드의 용액을 포함하여 구성될 수 있다. 여러 가지 캐리어들이 사용될 수 있는데, 예를 들면 완충 식염수(buffered saline) 등이다. 이 용액은 중성이며, 일반적으로 불순물(undesirable matter)을 포함하지 않는다. 이 합성물은 종래의 잘 알려진 살균법(sterilization techniques)에 의해 살균될 수 있다. 이 합성물은, pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제(toxicity adjusting agents) 등과 같은 생리학적 조건에 근접하기 위해 필요한 약리적으로 적합한 보조 물질(auxiliary substances)을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 유산나트륨(sodium lactate) 등이다.

이 조성(formulations)의 NELL1 펩티드의 농도는 매우 광범위하며, 선택된 특정 투여 방법과 환자의 요구(needs)에 따라 유체 볼륨, 점도, 체중(body weight) 등에 일차적으로 기초하여 선택될 것이다.

투여 방법(dosage regimen)은, 다양한 환자 변수(예를 들어 체중, 나이, 성별)와 임상 증상(clinical presentation) [예를 들어 상처의 정도, 상처 위치 등] 뿐만 아니라 지정된(addressed) 임상 징후(clinical indication)에 의해 결정될 것이다.

그러나, 본 발명에 유용한 NELL1 펩티드 또는 작용제의 치료상 유효한 복용량(therapeutical effective dose)은, 상술한 바와 같이 골 형성 분화(osteoblastic differentiation), 무기질화(mineralization) 골 형성을 증진시키기 위한 작용제의 능력에 의해 측정된, 세포에서의 바람직한 효과, 또는 환자의 실제적인 임상 효과(positive clinical effect)를 가지는 그러한 것이다. 각 펩티드 또는 작용제의 치료상 유효한 복용량은 부정적인 부작용을 최소화하면서 바람직한 임상 효과를 달성하도록 조절될 수 있다. 펩티드 또는 작용제의 복용량은 투여 경로, 질병의 심각성(severity), 환자의 나이 및 체중, 환자가 복용하는 다른 약물, 특정 환자에게 적합한 개인별 복용법(individual regimen) 및 복용 수준(dose level)을 결정할 때 주치의에 의해 통상 고려되는 다른 요인들에 의해 개개의 환자에 따라 선택될 수 있다.

제형(dosage form).

제형에 포함된 작용제의 치료상 유효한 복용량은 선택된 작용제의 종류 및 투여 경로를 고려하여 선택될 수 있다. 제형은, 제약업자들에게 알려져 있는 바와 같이, 환자에게 투약의 편리성을 위해 보조제(adjutants)와 약리적으로 적합한 캐리어를 포함하며, 다른 불활성 성분과 결합된 작용제를 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은, 골 형성을 증진시키기 위해 선택된 간격으로 유효한 제형의 치료상 유효 복용량으로 NELL1 펩티드를 투여하는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 이 방법은 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골, 골 기질, 건 기질 또는 인대 기질, 골원 세포 또는 골 형성 세포를 포함하되 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 제2 작용제를 골 형성이 필요한 부위에 투여하는 것을 더 포함하여 구성될 수 있다.

하나의 실시예에서, 골 형성을 유도하기 위하여 환자를 치료하는 방법은, 포유동물 골원 세포(mammalian osteogenic cells)를 채취하는 것(harvesting)과, 골원 세포와 접촉하는 NELL1 펩티드의 발현 농도를 증대시키는 것과 그리고 골 형성이 필요한 부위에 골원 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 쇄골두개이골증(cleidocranial disostosis), 또는 구개열(cleft palate)을 갖는 태아, 유아 또는 성인에게서 일어나는 것과 같은 두 개 외상(cranial trauma) 또는 두 개 결손(cranial defects)에 대한 수리를 위한 골 형성이 요구될 수 있다. 하나의 실시예에서, 비-치유 골 결손(non-healing bone defect) [골의 결손이 재생/치료되지 못한 임계 크기 결손(critical size defect)으로도 알려져 있음] 부위에 골 형성이 필요할 수 있다. 임계 크기 결손 모델은, 모든 골 부상 치료가 막(membranous) [막내(intramembraneous)으로도 불림] 골 형성에 의한 것으로 여겨지기 때문에, 장골 골절(long bone fracture)을 포함하는 모든 골 치료에 영향을 미치는 작용제에 대한 제한 시험(stringent test)으로 연구된다. 예를 들어, 장골 골절과 두개골 결손(calvarial defect)은 둘다 막 골 형성에 의해 치료된다. 하나의 실시예에서, 골 형성은 치조 골 이식편(alveolar bone grafts) 또는 치조제 증대술(alveolar ridge augmentation), 또는 치주골 결손(periodontal bone defect)에서 바람직할 수 있다. 하나의 실시예에서, 골 형성은 관절(joint) 또는 치과 임플란트(dental implants), 또는 미용 성형 임플란트(cosmetic surgery onplants)와 같은 임플란트의 통합(integration)을 증진시키기 위해 바람직할 수 있다.

하나의 실시예에서, 골 형성은 골 이식을 위해 자가(autologous), 자생(autogenous) 또는 무생물 재료(alloplastic materials)에 더하여 또는 이에 대한 대안으로 사용될 수 있다.

실시예

다음의 실시예들은 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 것이며, 특허청구범위의 발명을 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1. NELL 펩티드의 발현

하나의 cDNA 단편을 발현 벡터 PiZT/V5-His (3.4kb) (EcoRV 사이트, Invitrogen)에 결찰시키고(ligated) 성숙한 쥐 NELL1 및 하나의 FLAG 태그(tag) 서열의 하나의 멜리틴(melittin) 시그널 펩티드, BamHl- EcoRl cDNA 단편에 포함시켰다. 도 16은 이 실시예에서 사용된 cDNA 구성체의 핵산 서열 및 상응하는 예상 펩티드 서열을 나타낸 것이다.

하이 파이브 세포들 (BTI-TN-5B1-4)을 무-세럼 배지에 적응시켜, NELL1 펩티드 발현 벡터로 감염시켰다(transfected). 세포들을 NELL1 FLAG 구성체를 발현하는 세포 개체군들(cell populations)만을 선택하기 위해 제오신(zeocin)으로 처리하였다. 생존한 세포 개체군들은 안정된 형질전환체(transformants)인 것으로 확인되었다. 세포밖 배지(extracellular media)가 선택되어 NELL1 펩티드의 존재에 대해 시험되었다. NELL1 펩티드가 정제되어 아래에 설명될 기능 분석(functional assays)에 사용되었다.

도 17A는 정제된 NELL1 펩티드를 포함하는 UnoQ-용리물의 CBB-염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸 도면이다. 배지는 본 명세서에 설명된 UnoQ 컬럼 (Bio-Rad)에 부착되었다. 도 4B는, 하나의 단백질 래더(ladder)와 관련된 NELL1-FLAG 발현을 설명하는, 안티-FLAG 항체를 사용한 웨스턴 블로트의 도면이다. 펩티드: 140 kDa [세포내 전조(intracellular precursor)], 130 kDa [성숙형(mature form); 90 kDa 펩티드], 400 kDa [분비형(secreted form), 호모트리머(homotrimer)]. 상기 실시예에서, 발현 시스템의 생산력은 약 3 mg NELL1 펩티드/L 배지 였다.

펩티드를 전혀 발현하거나 분비하지 않는 [예를 들어, 이스트를 포함하는 박테리아 발현(bacterial expression)], 또는 그 펩티드 생성물이 극히 적은 [예를 들어, 융합 대장균 펩티드 시스템(E. coli fused peptide system), CHO-dhfr 세포, > 10 mcg/L)] 다른 발현 시스템에 비해, 설명된 시스템에 의한 생성물(포유동물 및 곤충 세포)은 많은 양의 기능성 단백질을 생산하는데 놀랄만큼 그리고 실질적으로 더 효과적이었다.

재조합(recombinant) 쥐 NELL1 단백질의 발현 및 정제.

곤충 세포에 의한 C-말단 FLAG-태그 NELL1 펩티드(C-terminally FLAG-tagged NELL1 peptide)의 제조를 위해, 하나의 plZT-NELL1-FLC 플라스미드(plasmid)가, pTB701-NELL1-FLC 플라스미드[쿠로다(Kuroda), BBRC]로부터 얻어진 FLAG 에피토프 서열(epitope sequence)에 융합된(fused) 쥐 NELL1 cDNA를 곤충 발현 벡터 plZTN5-His (Invitrogen)에 삽입함에 의해 구성되었다. 또한, NELL1 오리지널 분비성 시그널 서열(original secretory signal sequence)이 PCR 방법을 사용하여 꿀벌 멜라틴(mellitin) 시그널 서열로 대체되었다. 하이 파이브 세포들이 인비트로젠에서 구입되었고, 하이 파이브 무세럼 배지(High Five Serum-Free Medium)(Invitrogen)에서 배양되었다. 하이 파이브 세포들은 FuGene6 (Roche)를 사용하여 plZT-NELL1-FLC 플라스미드로 감염되었다. 감염 48시간 경과 후, 세포들을 400mg/ml의 제오신(Zeocin)(Invitrogen)으로 선택하였다. 안정된 발현 세포 라인이 정착될 때까지 3일 내지 4일마다 선택 배지(selective medium)를 교환하였다. 면역침전법(immunoprecipitation) 및 웨스턴 블로트 분석법을 사용하여 NELL1 분비가 확인되었다. 하이 파이브 세포들이 배양 배지에서 NELL1 펩티드 (140-kDa)를 발현하는 것으로 나타났다.

UNO Q-1 컬럼 (Bio-Rad)을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)로 재조합 쥐 NELL1-FLC 펩티드를 안티-제오신 하이 파이브 세포(Zeocin-resistant High Five cells)의 배양 배지로부터 정제하였다. NELL1 펩티드를 500 mM 염화나트륨에서 녹여 분리하였다(eluted).

COS7 세포에 의한 C-말단 FLAG-태그 NELL1 펩티드(C-terminally FLAG-tagged NELL1 peptide)의 제조(production)를 위해, 하나의 pcDNA3.1-NELL1-FLC 플라스미드가, pTB701-NELL1-FLC 플라스미드로부터 얻어진 FLAG 에피토프 서열에 연결된(linked) 쥐 NELL1 DNA를 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1 (Invitrogen)에 삽입함에 의해 구성되었다. COS7 세포들을 10% FBS가 보충된 DMEM에서 배양하였다. 내생 NELL 시그널 펩티드 플라스미드 및 전기충격에 의한 유전자 이식법(electroporation method)을 사용하여 COS7 세포들을 pcDNA3.1-NELL1-FLC 로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 배양 배지를 NELL1 펩티드에 대한 면역침전법(immunoprecipitation) 및 웨스턴 블로트 분석으로 처리하였다.

도 17C는 NELL1-FLAG을 포함하는 UnoQ-용리물의 CBB-염색된 SDS-PAGE 겔의 도면이다. 이 발현 연구들은 COS 세포가, 시그널 서열을 포함하는 것과 같이 분비성효율(secretion efficiency)을 증대시키기 위해 NELL의 N 말단을 변형시키지 않고, 기능성 NELL 펩티드를 발현하지 않는다는 것을 보여준다. 도 17D는 NELL1- FLAG 발현을 나타내는, 안티-FLAG 항체를 이용한 웨스턴 블로트의 도면이다.

재조합 쥐 NELL2 단백질의 발현 및 정제.

곤충 세포에 의한 C-말단 FLAG-태그 NELL2 펩티드(C-terminally FLAG-tagged NELL2 펩티드)의 제조를 위해, 하나의 plZT-NELL1-FLC 플라스미드가, pTB701-NELL2-FLC 플라스미드로부터 얻어진 하나의 FLAG 에피토프 서열에 융합된 쥐 NELL2 cDNA를 곤충 발현 벡터 plZTN5-His (Invitrogen)에 삽입함에 의해 구성되었다. 하이 파이브 세포들을 FuGene6 (Roche)를 사용하여 plZT-NELL1-FLC 플라스미드로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 세포들이 400 mg/ml의 제오신 (Invitrogen)으로 선택되었다. 안정된 발현 세포 라인이 정착될 때까지 3일 내지 4일마다 선택 배지(selective medium)를 교환하였다. 면역침전법 및 웨스턴 블로트 분석법을 사용하여 NELL2 발현이 배양 배지에서 확인되었다. 하이 파이브 세포들이 배양 배지에서 NELL2 펩티드 (140-kDa)를 발현하는 것으로 나타났다.

UNO Q-1 컬럼 (Bio-Rad)을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피로 재조합 쥐 NELL2-FLC 펩티드를 안티-제오신 하이 파이브 세포(Zeocin-resistant High Five cells)의 배양 배지로부터 정제하였다. NELL2 펩티드를 500 mM 염화나트륨에서 녹여 분리하였다(eluted).

실시예 2. 배양 배지로부터의 NELL2 단백질의 정제

plZT-FLC-NELL2를 수반한(carrying) 하이 파이브 세포들을 3일동안 무세럼 배양 배지(1L)에서 배양하였다. 배양 배지를 5분동안 3000 x g로 원심분리하고 상청액을 수집하였다. PMSF를 1 mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 포화 황산암모늄 용액 [80% 포화 (v/v)]을 첨가하고 용액을 1 시간동안 4 도(degrees)로 유지하였다. 용액을 30분동안 15000 x g로 원심분리하고, 침전물을 수집하였다. 침전물을 4 도에서 50 ml 의 20 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 1 mm EDTA에 용해시켜, 4 도에서 20 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 1 mM EDTA 로 평형이 유지된 양이온-교환 크로마토그래피 UnoQ 컬럼(6 ml, Bio-Rad)에 가하였다[FPLC(Amersham-Pharmacia)에 의한 1ml/분(min) 속도]. 컬럼을 동일한 완충액으로 완전히 세척하였다.

그 다음에 결합 단백질(binding protein)을 동일한 완충액의 0 M 내지 1.5 M 염화나트륨으로 서서히(by the gradation) 녹여서 분리하였다. NELL2-FLAG 단편들이 항(anti)-Flag M2 (Sigma) Ab를 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다. 양성 단편들(positive fractions)을 하나의 관에 수집하였다. 최종 생성물을 1 L PBS에 대하여 이음새없는 셀룰로오스 관(Wako, cutoff MW 12000)에서 4도로 밤새 투석하였다. 생성물을 -70도에서 저장하였다.

NELL2-FLAG 펩티드의 순도를 SDS- PAGE/CBB 염색(staining)으로 시험하였다. 도 18은 정제된 NELL2 펩티드를 함유하는 UnoQ-용리물의 CBB-염색된 SDS-PAGE 겔의 도면이다. 컬럼 A는 약 130 kDa에서 하나의 펩티드 밴드(band)가 세포 배지로부터 분리된 것을 나타낸다. "IP"는 면역침전법을 위해 사용된 안티-FLAG 항체를 지칭하고; "WB"는 웨스턴 블로팅 검출을 위해 사용된 안티-FLAG 항체를 지칭한다.

도 19는 화이브(Five) SFM으로부터 NELL1 및 NELL2의 발현을 나타낸 블로트(blot)이다. "ESF921"은 무-세럼 배지의 상업명을 지칭하고; "Five SFM"은 배지의 상품명을 지칭한다. 두 NELL 단백질들의 발현을 위한 구성체들은 상술한 것들과 유사하다.

실시예 3.

알카라인 포스파타제 활성(alkaline phosphatase activity)의 증대는 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 하나의 초기 세포 표지(early cellular marker)이다. 하나의 연구에서, 태아 쥐 두개 세포(fetal rat calvarial cells)를 본 명세서에 설명된 방법을 사용하여 만들어진 NELL1 (1 ng/ml, 10ng/ml, 100ng/ml), 또는 BMP4 (100ng/ml)의 존재하에 성장시켰다. 알카라인 포스파타제가 종래의 방법에 의해 각 샘플에서 분석되었다.

도 20은, 쥐 두개 세포 배양에서의 처리의 하나의 기능으로서 알카라인 포스파타제 유도(induction)를 나타낸 막대그래프이다("OD" = 광학 밀도). 그러므로, 알카라인 포스파타제 유도에 의해 측정된 바와 같이, NELL1로 처리하는 것은, 조골세포 분화(osteoblast differentiation)를 유도하는데 있어 BMP4 보다 더 효과적이었다.

도 21은, NELL1으로 처리된 쥐 두개 세포 배양의 현미경 사진이다. NELL1로의 처리는, 아스코르브산 없이 알카라인 포스파타제 활성 및 세포 극소결절 형성(cell micronodule formation)을 유도하였는데, 이는 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 징후(indication)이며 골 형성의 전조이다.

실시예 4.

알카라인 포스파타제 분석은 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 초기 세포 표지이다. 하나의 연구에서, 쥐 두개 조골세포(calvarial osteoblasts)를 하나의 24 웰 플레이트(well plate)에서 성장시켰다. 웰들은 NELL1, BMP2, NELL1/BMP2 및 대조구(control)(펩티드 없음)를 포함하는 군으로 나뉘어졌다. 처리는 100ng/ml의 적용 펩티드(application peptide)를 포함하였다. 각 샘플에서 알카라인 포스파타제를 종래의 방법으로 분석하였다.

시간	NELL1	BMP2	NELL1/BMP	대조구
24시간	134%	159%	210%	100%
3일	154%	145%	189%	100%

그러므로, 대조구 또는 단일 펩티드만으로 처리된 세포에 대한 알카라인 포스파타제 활성에 의해 측정된 바와 같이, NELL1 및 BMP는 조골세포 분화(osteoblast differentiation)에 대해서 부가 효과를 가진다.

실시예 5.

골형성 분화(osteoblastic differentiation)에 대한 NELL1 발현의 효과를 연구하기 위해서, 골관련 유전자 발현(bone related gene expression)이, 하나의 NELL1 발현 구성체로 감염된 MC3T3 세포의 마이크로어레이(microarray)에서 감염 3, 6, 9일 후에 β-gal 발현 구성체(β-gal expressing constructs)로 감염된 세포에 대하여 평가되었다.

대조구 세포에 대한 발현 레벨

	감염 후 3일째	감염 후 6일째	감염 후 9일째
상향 조절(Up regulated)	미검출	오스테오칼신 2.5BMP7 2.1	데코린 2.2오스테오칼신 2.6라미닌 B1 2.0BMP7 3.2오스테로폰틴 3.5Col 15alpha1 2.6

NELL1 감염 세포의 몇몇 골관련 유전자들(bone related genes)은, α-gal 제어 감염 세포(α-gal control transfected cells)보다 적어도 두배 더 높은 레벨에서 발현되었다. 그러므로, 늦은 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 세포 표지[오스테오칼신(osteocalcin) 및 오스테오폰틴(osteoponin)]가 높게 조절되기 때문에, NELL1 발현 및 생산은 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)를 증진시켰다.

실시예 6.

극소결절(micronodule) 형성, 또는 복수의 조골세포의 집합(aggregation of a plurality of osteoblasts)은 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)의 징후(indication)이며 골 형성에 대한 전조이다. 이 프로세서는 아스코르브산에 의해 제어되는 것으로 생각된다.

극소결절 형성에서 NELL1의 효과를 연구하기 위해, MC3TC 세포들을 NELL1 코딩 구성체(NELL1 encoding construct)로 세균감염시키고 아스코르브산 없이 성장시켰다.

도 22A 및 22B는, 극소결절을 형성하는 NELL1을 발현하고 알카라인 포스파타제(B)를 위해 염색된 MC3TC 세포의 현미경 사진이다. NELL1 발현은 극소결절 형성 뿐만 아니라 알카라인 포스페이트 유도를 유도하였다. 그러므로, NELL1은 골 형성의 하나의 전조인 세포 극소결절 형성에 있어 활성이며, NELL1만으로 조골세포 분화(osteoblast differentiation)를 유도하기에 충분하다.

실시예 7.

무기질화 또는 칼슘의 세포내 축적(intracellular accumulation)은 골 형성 분화의 징후이며, 골 형성의 전조이다. NELL1 무기질화의 효과를 연구하기 위해 원시 두개 세포(primary calvarial cells)를, 구성체를 엔코딩하는 아데노바이러스(adenoviral) NELL1 또는 β-gal, 또는 하나의 안티센스(antisense) NELL1 바이러스를 엔코딩하는 하나의 제어 구성체로 감염시켰다. 세포들은 배양 3, 6, 9 및 12일 후에 세포내 칼슘 축적물의 존재를 검출하기 위해 폰 카사 염색(Von Kassa staining)에 의해 연달아 시험되었다. 이 결과는 NELL1이 골 무기질화를 촉진시킬 수 있다는 것을 입증하였다.

도 23A 내지 23C는 A) 안티센스 NELL1 바이러스, B) β-gal 또는 C) NELL1 으로 처리된 두개 세포의 현미경 사진들이다. 대조구 세포들(control cells)은 적당한 양으로 무기질화되었고, NELL1 발현 세포들은 무기질화의 레벨이 상승되었으며, 안티센스 NELL1 세포들에서의 무기질화는 억제되었다. 이 "녹-아웃(knock-out)" 연구는 NELL1 이 조골세포 분화(osteoblast differentiation)에 필수적임을 나타낸다.

도 23D 및 23E는, 배양 3, 6, 9 및 12일 후에 오스테오칼신(osteocalcin) 및 오스테오폰틴(osteoponin) mRNA 발현을 대조구 GAPFH에 대한 비율로 나타낸 막대그래프이다. NELL1 발현 세포는 12일 후에 매우 상승된 레벨의 오스테오칼신 및 오스테오폰틴 mRNA를 발현하였다. 그러므로, NELL1은 골 형성에 대한 하나의 전조인 골형성 분화(osteoblastic differentiation)의 늦은 세포 표지(late cellular markers)의 발현을 유도하는데 활성이 있다.

실시예 8.

골 형성에서의 발현에 대한 NELL1의 효과를 시험하기 위해 유전자도입 동물 모델(transgenic animal models)이 사용되어 왔다. CMV 프로모터(promoter)를 NELL1 cDNA에 연결하고, 수정란(fertilized eggs)에 극소 주사하였다(microinject). NELL1이 효능있는(potent) CMV 프로모터의 영향하에 팬-과발현되었다(pan-over-expressed).

도 24는, 폰 카사 염색(Von Kassa staining)을 나타낸, 하나의 NELL1 유전자도입(transgenic) 쥐 조직의 현미경 사진이다. 도 24에 도시된 바와 같이, NELL1 유전자도입 쥐는 두개관 과성장을 가졌는데, 이는 막 골 형성을 포함하는 골 성장을 유도하는 NELL1의 능력을 확인시키는 것이다.

도 25A 및 25B는 NELL1 유전자도입 쥐 (A) 및 정상적 동복자(normal littermate) (B)의 두개관(calvaria)의 폰 카사 염색을 나타낸 현미경 사진이다. 도 25A에 나타낸 바와 같이, NELL1 유전자도입 쥐는 정상적 동복자에 비해 증진된 무기질화를 나타내었는데, 이는 막 골 형성에서 NELL1의 역할을 확인시켜주는 것이다.

실시예 9.

발육상 결함 유도 Cbfa1 결핍(Cbfa1 deficiency induced developmental defects)에 대한 NELL1 발현의 효과를 시험하기 위해 유전자도입 동물 모델이 사용되어 왔다.

Cbfa1이 NELL1 조절에서 어떤 역할을 하는지의 여부를 결정하기 위해, 태아 쥐 두개관 세포들을 쥐 Cbfa1을 포함하는 플라스미드 벡터로 감염시켰다.

도 26은, 24시간 및 48시간에 Cbfa1 감염 세포들에서의 NELL1의 발현을 대조구 세포들과 비교하여 나타낸 블로트이다. Cbfa1 감염은 [어느 한쪽의 양(positive) 대조구 오스테오칼신을 따라서] 24시간내에 NELL1 발현을 상승시켰다. 이것은 NELL1이 Cbfa1 - 키이 "조골세포 전사 인자" [Cbfa1 - a key "osteoblast transcription factor"]의 다운스트림(downstream)임을 나타낸다.

도 27A ∼ 도 27C는 골격 염색(skeletal staining) (상단, 중앙) 및 마이크로-CT (하단)의 사진들이다. 도 27A는 야생형 쥐의 정상적인 골격 패턴을 나타낸다. 무기질화의 전형적인 보더(boarders)가 눈에 띄며(파선), 전방 및 후방의 퐁트넬(fontenelles)(별표)과 우측 두정 봉합(coronal suture)의 외형(화살표)을 볼 수 있다. 또한, 정상적인 쇄골이 나타나 있다(A-중앙). 마이크로-CT는 전형적인 두개안면골 형태(craniofacial bone morphology)를 나타낸다. 도 27B는 하나의 Cbfa1^+/- 동물의 골격 결손을 나타낸다. 특히, 불완전한 골 무기질화 및 골 형성이, 중심선 두개관 결손 옆의 (파선 사이에) 불충분하게 염색된 조직에 존재하고, 음영(luency) 또한 두정 봉합의 부위(화살표)에 나타나있다. 상당한 정도의 쇄골 형성부전(clavicle hypoplasia)이 나타나 있다(B-중앙), 도 27C는, 골격 염색(skeletal staining) 및 마이크로-CT에서 Cbfa1^+/- 반수체 불완전 동물(haploid deficient animal)에 비해 아주 증가된 두개골 형성을 입증하는 aCbfa1^+/- + NELL1^overexp 의 골격 결손을 나타낸다. 또한, Cbfa1^+/- 반수체 불완전 동물(중앙)에 비해 매우 낮은 정도의 두개관 형성부전(clavicle hypoplasia)이 나타나 있다. 골의 복구가 두정 봉합(화살표)에서 중첩됨을 알 수 있다. 그러므로, NELL1 과발현(over expression)은, 막 골 형성 및 연골성 뼈 형성(endochondral)에서의 NELL1의 역할을 확인시켜주는 유전자도입 쥐의 Cbfa1 결핍을 구제하였다. 또한, NELL1은 태생적 결손이 있는 골에 골을 재생시킬 수 있다.

실시예 10.

임계 크기 결손(critical size defect)은 막내 골 수리를 유도하는 작용제 능력의 연구를 위한 하나의 중요한 모델이다. 골 수리에 대한 NELL1의 효과를 연구하기 위해, 좌측 및 우측 두개관 결손(3mm)을 야생형 성체 CD-1 수컷 쥐에 만들었다. 우측 결손이 200ng의 NELL1 또는 BMP2 중 어느 하나에 침지된 PLGA/콜라겐 캐리어 막으로 이식된 반면, 좌측 결손(대조구)은 PLGA/콜라겐 캐리어 막으로만 이식되었다. 두개관을 뽑아서 마이크로 CT 분석으로 시험하였다.

도 28A는, 두개관 결손(calvarial defect)의 대조구(좌측) 및 BMP2 처리(우측)의 사진이고; 도 28B는 두개관 결손의 대조구 (좌측) 및 NELL1 (우측) 처리의 사진이며; 도 29는 두개관 결손의 NELL1 (좌측) 및 BMP2 (우측) 처리의 사진이다. 아주 많은 양의 골 형성이 NELL1 및 BMP2 군 모두에서 관찰되었다. 그러므로, NELL1 발현은 골 형성에 아주 큰 영향을 주었으며, 임계 크기 결손 모델에 골 재생을 유도함으로써, 막 골 형성에서 NELL의 역할을 확인시켜주었다.

실시예 11.

급속구개확장술(Rapid Palatal Expansion; RPE)은 막내 골 수리를 유도하는 작용제 능력의 연구를 위한 다른 모델이다. 골 수리에 대한 NELL1의 효과를 연구하기 위해, 4-주된 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 쥐들을 1) 대조구 확장, 및 2) NELL1 처리 확장을 위한 군들로 분리하였다. 쥐들을 희생시켜 그 구개를 적출하고 장기 배양기(organ culture)에 생체로 보관하였다. 그 구개를 확장시키고, NELL1을 9일동안 처리 군에 첨가하였다.

도 30A 및 30B는 대조구 (B) 및 NELL1 (A)로 처리된 확장 구개의 사진들이다. 많은 양의 골 형성이 NELL1 및 BMP2 군 모두에서 관찰되었다. 그러므로, NELL1 처리는 RPE 모델의 골 형성에 아주 큰 영향을 줌으로써 막 골 형성에서의 NELL1의 역할을 확인시켜주었다.

실시예 12.

연골성 골 형성(endochondral bone formation)은 장골 발생에서 중요한 과정(key process)이다. 이것은 연골모세포 증식(chondroblast proliferation), 비대(hypertrophy), 세포사(apoptosis), 혈관 침범(invasion of blood vessel), 조골세포 대체(replacement by osteoblasts)를 포함하는 여러 단계를 가진다. 이 단계들의 어느 하나의 촉진이 연골성 골 성장을 유도할 것이다.

도 31A 및 31B는 NELL1 과발현(over-expressing) 유전자도입 쥐 (A) 그리고 야생형 쥐 (B)의 고사성 세포(apoptotic cells)에 TUNEL 염색한 연골(cartilage)의 현미경 사진들이다.

도 31A에 나타난 바와 같이, 쥐의 NELL1 과발현에서, 연골은 비대 연골모세포(hypertrophic chondroblasts) 및 세포사(apoptosis) [고사성 핵(apoptotic nuclei)의 감소를 확인하기 위해 TUNEL ASSAY를 사용하여 갈색 염색으로 표시됨]를 나타낸다. 도 31B는, TUNEL 염색된 정상적인 쥐(야생형)의 연골인데, 매우 적은 수의 고사성 세포가 존재하고, 세포들이 비대하지 않다. 그러므로, NELL1은 연골 비대 및 세포사(apoptosis)를 유도할 수 있으며, 이에 따라 장골 형성 및 재생을 유도한다.

실시예 13. NELL 기질 제조

생체밖.

폴리락티드-코-글리코리드(polylactide-co-glycolide) [85:15 PLGA; 고유점도(intrinsic viscosity) ∼0.6dL/g, 버밍검 폴리머(Birmingham Polymers), AL]를 클로로포름에 용해시켜 5% 용액을 만들어 유리 배양 접시에 붓고 24 시간동안 서서히 증발시켰다. 용매 추출후 필름들을 다음의 8개의 군에 따라 코팅하였다; (a) 코팅없이 폴리머만 ; (b) 일반적인 인회석 [1.5 x SBF 다음에 1 x SBF] ; (c) 가속 생체모방 인회석(accelerated biomimetic apatite) [Mg-free 및 무-카르보네이트 5x SBF 다음에 5 x SBF] ; (d) 피브로넥틴(fibronectin) [0.01 mg/ml] ; (e) 폴리-L-리진(lysine) [0.01 mg/ml] ; (f) 콜라겐 ; (g) Mefp-1 [0.01 mg/ml] ; 및 (h) 콜라겐과 히알루로난(hyaluronan)의 혼합물. 각 군을 NELL1 포함(100ng) 및 NELL1-미포함 군으로 세분하고, 미분화 배지(아스코르브산 및 베타 글리세롤 포스파타제 없이)에서 원시 조골세포(primary osteoblasts)로 7일동안 생체밖에서 배양하였다. 각 재료에 있어, NELL1 군이 NELL1 대조물(counterparts) 보다 더 높게 알카라인 포스파타제 활성을 자극하였다. 재료들 중에서, 가속 인회석(accelerated apatites)(c 군)이 가장 높은 알카라인 포스파타제 활성을 유도하였고, 폴리머 대조구(a 군)가 가장 낮은 활성을 유도하였다.

생체내.

폴리락티드-코-글리코리드(polylactide-co-glycolide) [85:15 PLGA; 고유점도(intrinsic viscosity) ∼0.6dL/g, 버밍검 폴리머(Birmingham Polymers), AL]를 클로로포름에 용해시키고, 석출(particulate leaching) 및 용매 추출 후에 ∼90% 다공성 PLGA 골격(scaffolds)을 만들기 위해 포로겐(porogens)과 혼합하였다. 다공성 골격을 아르곤-플라즈마-에칭하고(argon-plasma-etched), 살균하고, 200 ng NELL1 펩티드를 함유하는 수성 소 타입 I 콜라겐 혼합물(aqueous bovine type I collagen mixture)로 코팅한 다음에 건조시켜 성충 야생형 수컷쥐의 두개관 결손부에 이식하였다. 양의 대조구(positive control) [PLGA/콜라겐/BMP]와 음의 대조구(negative controls) [PLGA/콜라겐만 함유 ; 성장 인자 미포함)를 또한 유사한 결손부에 이식하였다. 4주째에 실시한 마이크로 CT 분석은, 음의 대조구 골격[PLGA/콜라겐만 함유]에 의해 아주 적은 또는 전혀 없는 골 형성이 유도된 반면, NELL1-함유 및 BMP-함유 골격들은 4주 무렵 결손부위에 걸쳐 신속하고 완벽한 무기질화가 유도되었음을 나타낸다. 종래의 조직학은 무기질화가 성숙 골의 모범적인 특성을 제공함을 입증한 바 있다.

본 명세서에 기술된 예들과 실시예들은 단지 설명의 목적만을 위한 것이며, 이에 비추어 여러 가지 변형 및 변경이 당업자들에 의해 제안될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 본원의 정신과 그 범위, 그리고 첨부된 특허청구범위 내에 포함되어져야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 출판물, 특허, 및 특허출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 합체된다. 본 발명은 또한 기술된 실시예들의 여하한 결합 또는 공지된 방법 및 합성물들의 결합을 포함하여 구성될 수 있음을 알 것이다.

이제까지 MELL 펩티드 발현 시스템 및 NELL 펩티드의 골 형성 활성의 특정 실시예들을 설명하였으나, 이들 실시예들에 내재된 개념들은 다른 실시예들에서도 사용될 수 있음을 알아야 한다. 요건데, 본원의 보호범위는 다음의 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Regents of the University of California Ting, Kang Kuroda, Shunichi Wu, Ben <120> Nell Peptide Expression Systems and Bone Formation Activity of Nell Peptide <130> 38586-332 <150> US 60/445,672 <151> 2003-02-07 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2433 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(2433) <400> 1 atg ccg atg gat ttg att tta gtt gtg tgg ttc tgt gtg tgc act gcc 48 Met Pro Met Asp Leu Ile Leu Val Val Trp Phe Cys Val Cys Thr Ala 1 5 10 15 agg aca gtg gtg ggc ttt ggg atg gac cct gac ctt cag atg gat atc 96 Arg Thr Val Val Gly Phe Gly Met Asp Pro Asp Leu Gln Met Asp Ile 20 25 30 gtc acc gag ctt gac ctt gtg aac acc acc ctt gga gtt gct cag gtg 144 Val Thr Glu Leu Asp Leu Val Asn Thr Thr Leu Gly Val Ala Gln Val 35 40 45 tct gga atg cac aat gcc agc aaa gca ttt tta ttt caa gac ata gaa 192 Ser Gly Met His Asn Ala Ser Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Ile Glu 50 55 60 aga gag atc cat gca gct cct cat gtg agt gag aaa tta att cag 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Leu Cys 610 615 620 ccc tct ggg ccc tcc tgc tct ggt gac tgt cct cat gaa ggg ggg ctg 1920 Pro Ser Gly Pro Ser Cys Ser Gly Asp Cys Pro His Glu Gly Gly Leu 625 630 635 640 aag cac aat ggc cag gtg tgg acc ttg aaa gaa gac agg tgt tct gtc 1968 Lys His Asn Gly Gln Val Trp Thr Leu Lys Glu Asp Arg Cys Ser Val 645 650 655 tgc tcc tgc aag gat ggc aag ata ttc tgc cga cgg aca gct tgt gat 2016 Cys Ser Cys Lys Asp Gly Lys Ile Phe Cys Arg Arg Thr Ala Cys Asp 660 665 670 tgc cag aat cca agt gct gac cta ttc tgt tgc cca gaa tgt gac acc 2064 Cys Gln Asn Pro Ser Ala Asp Leu Phe Cys Cys Pro Glu Cys Asp Thr 675 680 685 aga gtc aca agt caa tgt tta gac caa aat ggt cac aag ctg tat cga 2112 Arg Val Thr Ser Gln Cys Leu Asp Gln Asn Gly His Lys Leu Tyr Arg 690 695 700 agt gga gac aat tgg acc cat agc tgt cag cag tgt cgg tgt ctg gaa 2160 Ser Gly Asp Asn Trp Thr His Ser Cys Gln Gln Cys Arg Cys Leu Glu 705 710 715 720 gga gag gta gat tgc tgg cca ctc act tgc ccc aac ttg agc tgt gag 2208 Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Thr Cys Pro Asn Leu Ser Cys Glu 725 730 735 tat aca gct atc tta gaa ggg gaa tgt tgt ccc cgc tgt gtc agt gac 2256 Tyr Thr Ala Ile Leu Glu Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Ser Asp 740 745 750 ccc tgc cta gct gat aac atc acc tat gac atc aga aaa act tgc ctg 2304 Pro Cys Leu Ala Asp Asn Ile Thr Tyr Asp Ile Arg Lys Thr Cys Leu 755 760 765 gac agc tat ggt gtt tca cgg ctt agt ggc tca gtg tgg acg atg gct 2352 Asp Ser Tyr Gly Val Ser Arg Leu Ser Gly Ser Val Trp Thr Met Ala 770 775 780 gga tct ccc tgc aca acc tgt aaa tgc aag aat gga aga gtc tgt tgt 2400 Gly Ser Pro Cys Thr Thr Cys Lys Cys Lys Asn Gly Arg Val Cys Cys 785 790 795 800 tct gtg gat ttt gag tgt ctt caa aat aat tga 2433 Ser Val Asp Phe Glu Cys Leu Gln Asn Asn * 805 810 <210> 2 <211> 810 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Met Asp Leu Ile Leu Val Val Trp Phe Cys Val Cys Thr Ala 1 5 10 15 Arg Thr Val Val Gly Phe Gly Met Asp Pro Asp Leu Gln Met Asp Ile 20 25 30 Val Thr Glu Leu Asp Leu Val Asn Thr Thr Leu Gly Val Ala Gln Val 35 40 45 Ser Gly Met His Asn Ala Ser Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Ile Glu 50 55 60 Arg Glu Ile His Ala Ala Pro His Val Ser Glu Lys Leu Ile Gln Leu 65 70 75 80 Phe Gln Asn Lys Ser Glu Phe Thr Ile Leu Ala Thr Val Gln Gln Lys 85 90 95 Pro Ser Thr Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile Arg Glu Leu Glu His Ser 100 105 110 Tyr Phe Glu Leu Glu Ser Ser Gly Leu Arg Asp Glu Ile Arg Tyr His 115 120 125 Tyr Ile His Asn Gly Lys Pro Arg Thr Glu Ala Leu Pro Tyr Arg Met 130 135 140 Ala Asp Gly Gln Trp His Lys Val Ala Leu Ser Val Ser Ala Ser His 145 150 155 160 Leu Leu Leu His Val Asp Cys Asn Arg Ile Tyr Glu Arg Val Ile Asp 165 170 175 Pro Pro Asp Thr Asn Leu Pro Pro Gly Ile Asn Leu Trp Leu Gly Gln 180 185 190 Arg Asn Gln Lys His Gly Leu Phe Lys Gly Ile Ile Gln Asp Gly Lys 195 200 205 Ile Ile Phe Met Pro Asn Gly Tyr Ile Thr Gln Cys Pro Asn Leu Asn 210 215 220 His Thr Cys Pro Thr Cys Ser Asp Phe Leu Ser Leu Val Gln Gly Ile 225 230 235 240 Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ala Lys Met Thr Ala Lys Leu Asn Tyr 245 250 255 Ala Glu 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Pro Tyr Arg Met 130 135 140 gca gac gga caa tgg cac aag gtc gcg ctg tca gtg agc gcc tct cac 480 Ala Asp Gly Gln Trp His Lys Val Ala Leu Ser Val Ser Ala Ser His 145 150 155 160 ctc ctg ctc cac atc gac tgc aat agg att tac gag cgt gtg ata gac 528 Leu Leu Leu His Ile Asp Cys Asn Arg Ile Tyr Glu Arg Val Ile Asp 165 170 175 cct ccg gag acc aac ctt cct cca gga agc aat ctg tgg ctt ggg caa 576 Pro Pro Glu Thr Asn Leu Pro Pro Gly Ser Asn Leu Trp Leu Gly Gln 180 185 190 cgt aac caa aag cat ggc ttt ttc aaa gga atc atc caa gat ggt aag 624 Arg Asn Gln Lys His Gly Phe Phe Lys Gly Ile Ile Gln Asp Gly Lys 195 200 205 atc atc ttc atg ccg aat ggt ttc atc aca cag tgt ccc aac ctc aat 672 Ile Ile Phe Met Pro Asn Gly Phe Ile Thr Gln Cys Pro Asn Leu Asn 210 215 220 cgc act tgc cca aca tgc agt gac ttc ctg agc ctg gtt caa gga ata 720 Arg Thr Cys Pro Thr Cys Ser Asp Phe Leu Ser Leu Val Gln Gly Ile 225 230 235 240 atg gat ttg caa gag ctt ttg gcc aag atg act gca aaa ctg aat tat 768 Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ala 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Arg Gly Gly Val Leu Val Lys Ile Thr Glu Ala Cys 355 360 365 cct cct ttg aac tgc tca gca aag gat cat att ctt cca gag aat cag 1152 Pro Pro Leu Asn Cys Ser Ala Lys Asp His Ile Leu Pro Glu Asn Gln 370 375 380 tgc tgc agg gtc tgc cca ggt cat aac ttc tgt gca gaa gca cct aag 1200 Cys Cys Arg Val Cys Pro Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Ala Pro Lys 385 390 395 400 tgc gga gaa aac tcg gaa tgc aaa aat tgg aat aca aaa gca acc tgt 1248 Cys Gly Glu Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys 405 410 415 gag tgc aag aat gga tac atc tct gtc cag ggc aac tct gca tac tgt 1296 Glu Cys Lys Asn Gly Tyr Ile Ser Val Gln Gly Asn Ser Ala Tyr Cys 420 425 430 gaa gat att gat gag tgt gca gct aaa atg cac tat tgt cat gcc aac 1344 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ala Lys Met His Tyr Cys His Ala Asn 435 440 445 acc gtg tgt gtc aac ttg ccg ggg ttg tat cgc tgt gac tgc gtc cca 1392 Thr Val Cys Val Asn Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Cys Asp Cys Val Pro 450 455 460 ggg tac atc cgt gtg gat gac ttc tct tgt acg gag cat gat gat tgt 1440 Gly Tyr Ile Arg Val Asp Asp Phe Ser Cys Thr Glu His Asp Asp Cys 465 470 475 480 ggc agc gga caa cac aac tgc gac aaa aat gcc atc tgt acc aac aca 1488 Gly Ser Gly Gln His Asn Cys Asp Lys Asn Ala Ile Cys Thr Asn Thr 485 490 495 gtc cag gga cac agc tgc acc tgc cag ccg ggt tac gtg gga aat ggc 1536 Val Gln Gly His Ser Cys Thr Cys Gln Pro Gly Tyr Val Gly Asn Gly 500 505 510 acc atc tgc aaa gca ttc tgt gaa gag ggt tgc aga tac gga ggt acc 1584 Thr Ile Cys Lys Ala Phe Cys Glu Glu Gly Cys Arg Tyr Gly Gly Thr 515 520 525 tgt gtg gct cct aac aag tgt gtc tgt cct tct gga ttc acg gga agc 1632 Cys Val Ala Pro Asn Lys Cys Val Cys Pro Ser Gly Phe Thr Gly Ser 530 535 540 cac tgt gag aaa gat att gat gaa tgc gca gag gga ttc gtt gaa tgc 1680 His Cys Glu Lys Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Phe Val Glu Cys 545 550 555 560 cac aac tac tcc cgc tgt gtt aac ctg cca ggg tgg tac cac tgt gag 1728 His Asn Tyr Ser Arg Cys Val Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu 565 570 575 tgc aga agc ggt ttc cat gac gat ggg acc tac tca ctg tcc ggg gag 1776 Cys Arg Ser Gly Phe His Asp Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Glu 580 585 590 tcc tgc att gat atc gat gaa tgt gcc tta aga act cac act tgt tgg 1824 Ser Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Leu Arg Thr His Thr Cys Trp 595 600 605 aat gac tct gcc tgc atc aac tta gca gga gga ttt gac tgc ctg tgt 1872 Asn Asp Ser Ala Cys Ile Asn Leu Ala Gly Gly Phe Asp Cys Leu Cys 610 615 620 ccc tct ggg ccc tcc tgc tct ggt gac tgt ccc cac gaa gga ggg ctg 1920 Pro Ser Gly Pro Ser Cys Ser Gly Asp Cys Pro His Glu Gly Gly Leu 625 630 635 640 aag cat aat ggg cag gtg tgg att ctg aga gaa gac agg tgt tca gtc 1968 Lys His Asn Gly Gln Val Trp Ile Leu Arg Glu Asp Arg Cys Ser Val 645 650 655 tgt tcc tgc aag gat ggg aag ata ttc tgc cgg cgg aca gct tgt gat 2016 Cys Ser Cys Lys Asp Gly Lys Ile Phe Cys Arg Arg Thr Ala Cys Asp 660 665 670 tgc cag aat cca aat gtt gac ctt ttt tgc tgc cca gag tgc gat acc 2064 Cys Gln Asn Pro Asn Val Asp Leu Phe Cys Cys Pro Glu Cys Asp Thr 675 680 685 agg gtc acc agc caa 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tcc ggg agc tgg aac aca 336 Ser Arg Pro Pro Gln Gly * Tyr Cys Arg Ser Gly Ser Trp Asn Thr 95 100 105 gct att ttg aac tgg aga gca gtg gcc caa gag aag aga tac gct atc 384 Ala Ile Leu Asn Trp Arg Ala Val Ala Gln Glu Lys Arg Tyr Ala Ile 110 115 120 att aca tcc atg gcg gca agc cca gga ctg agg ccc ttc cct acc gca 432 Ile Thr Ser Met Ala Ala Ser Pro Gly Leu Arg Pro Phe Pro Thr Ala 125 130 135 tgg ccg atg gac agt ggc aca agg tcg cgc tgt ctg tga gcg cct ctc 480 Trp Pro Met Asp Ser Gly Thr Arg Ser Arg Cys Leu * Ala Pro Leu 140 145 150 acc tcc tac tcc atg tcg act gca ata gga ttt atg agc gtg tga tag 528 Thr Ser Tyr Ser Met Ser Thr Ala Ile Gly Phe Met Ser Val * * 155 160 165 atc ctc cgg aga cca acc ttc ctc cag gaa gca atc tat ggc ttg ggc 576 Ile Leu Arg Arg Pro Thr Phe Leu Gln Glu Ala Ile Tyr Gly Leu Gly 170 175 180 aac gta atc aaa agc atg gct ttt tca aag gaa tca tcc aag atg gca 624 Asn Val Ile Lys Ser Met Ala Phe Ser Lys Glu Ser Ser Lys Met Ala 185 190 195 aga tca tct tca tgc cga acg gct tca tca cac agt gcc cca acc taa 672 Arg Ser Ser Ser Cys Arg Thr Ala Ser Ser His Ser Ala Pro Thr * 200 205 210 atc gca ctt gcc caa cat gca gtg att tcc tga gcc tgg ttc aag gaa 720 Ile Ala Leu Ala Gln His Ala Val Ile Ser * Ala Trp Phe Lys Glu 215 220 225 taa tgg att tgc aag agc ttt tgg cca aga tga ctg caa aac tga att 768 * Trp Ile Cys Lys Ser Phe Trp Pro Arg * Leu Gln Asn * Ile 230 235 240 atg cag aga cga gac ttg gtc aac tgg aaa att gcc act gtg aga aga 816 Met Gln Arg Arg Asp Leu Val Asn Trp Lys Ile Ala Thr Val Arg Arg 245 250 255 cct gcc aag tga gtg ggc tgc tct aca ggg acc aag act cct ggg tag 864 Pro Ala Lys * Val Gly Cys Ser Thr Gly Thr Lys Thr Pro Gly * 260 265 270 atg gtg aca act gca gga act gca cat gca aaa gtg gtg ctg tgg agt 912 Met Val Thr Thr Ala Gly Thr Ala His Ala Lys Val Val Leu Trp Ser 275 280 285 gcc gaa gga tgt cct gtc ccc cac tca act gtt ccc cag act cac ttc 960 Ala Glu Gly Cys Pro Val Pro His Ser Thr Val Pro Gln Thr His Phe 290 295 300 ctg tgc ata ttt ctg gcc aat gtt gta aag ttt gca gac caa aat gta 1008 Leu Cys Ile Phe Leu Ala Asn Val Val Lys Phe Ala Asp Gln Asn Val 305 310 315 320 tct atg gag gaa aag ttc ttg ctg agg gcc agc gga ttt taa cca aga 1056 Ser Met Glu Glu Lys Phe Leu Leu Arg Ala Ser Gly Phe * Pro Arg 325 330 335 cct gcc ggg aat gtc gag gtg gag tct tgg taa aaa tca cag aag ctt 1104 Pro Ala Gly Asn Val Glu Val Glu Ser Trp * Lys Ser Gln Lys Leu 340 345 350 gcc ctc ctt tga act gct cag aga agg atc ata ttc ttc cgg aga acc 1152 Ala Leu Leu * Thr Ala Gln Arg Arg Ile Ile Phe Phe Arg Arg Thr 355 360 365 agt gct ggg gtc tgc cga ggt cat aac ttc tgt gca gaa gca cct aag 1200 Ser Ala Gly Val Cys Arg Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Ala Pro Lys 370 375 380 tgt gga gaa aac tcg gaa tgc aaa aat tgg aat aca aaa gcg act tgt 1248 Cys Gly Glu Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys 385 390 395 gag tgc aag aat gga tac atc tct gtc cag ggc aac tct gca tac tgt 1296 Glu Cys Lys Asn Gly Tyr Ile Ser Val Gln Gly Asn Ser Ala Tyr Cys 400 405 410 gaa gat atc gat gag tgt gca gca aag atg cac tac tgt cat gcc aac 1344 Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ala Lys Met His Tyr Cys His Ala Asn 415 420 425 acg gtg tgt gtc aac ttg ccg ggg tta tat cgc tgt gac tgc atc cca 1392 Thr Val Cys Val Asn Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Cys Asp Cys Ile Pro 430 435 440 445 gga tac atc cgt gtg gat gac ttc tct tgt acg gag cat gat gat tgt 1440 Gly Tyr Ile Arg Val Asp Asp Phe Ser Cys Thr Glu His Asp Asp Cys 450 455 460 ggc agc gga caa cac aac tgt gac aaa aat gcc atc tgt acc aac aca 1488 Gly Ser Gly Gln His Asn Cys Asp Lys Asn Ala Ile Cys Thr Asn Thr 465 470 475 gtc cag gga cac agc tgt acc tgc cag cca ggc tac gtg gga aat ggt 1536 Val Gln Gly His Ser Cys Thr Cys Gln Pro Gly Tyr Val Gly Asn Gly 480 485 490 act gtc tgc aaa gca ttc tgt gaa gag ggt tgc aga tac gga ggt acc 1584 Thr Val Cys Lys Ala Phe Cys Glu Glu Gly Cys Arg Tyr Gly Gly Thr 495 500 505 tgt gtg gcc cct aac aaa tgt gtc tgt cct tct gga ttc aca gga agc 1632 Cys Val Ala Pro Asn Lys Cys Val Cys Pro Ser Gly Phe Thr Gly Ser 510 515 520 525 cac tgt gag aaa gat att gat gaa tgt gca gag gga ttc gtt gag tgc 1680 His Cys Glu Lys Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Phe Val Glu Cys 530 535 540 cac aac cac tcc cgc tgc gtt aac ctt cca ggg tgg tac cac tgt gag 1728 His Asn His Ser Arg Cys Val Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu 545 550 555 tgc aga agc ggt ttc cat gac gat ggg acc tat tca ctg tcc ggg gag 1776 Cys Arg Ser Gly Phe His Asp Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Glu 560 565 570 tcc tgc att gat att gat gaa tgt gcc tta aga act cac act tgt tgg 1824 Ser Cys Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Leu Arg Thr His Thr Cys Trp 575 580 585 aat gac tct gcc tgc atc aac tta gca gga gga ttt gac tgc ctg tgt 1872 Asn Asp Ser Ala Cys Ile Asn Leu Ala Gly Gly Phe Asp Cys Leu Cys 590 595 600 605 ccc tct ggg ccc tcc tgc tct ggt gac tgt ccc cac gaa ggg ggg ctg 1920 Pro Ser Gly Pro Ser Cys Ser Gly Asp Cys Pro His Glu Gly Gly Leu 610 615 620 aag cat aat ggg cag gtg tgg att ctg aga gaa gac agg tgt tca gtc 1968 Lys His Asn Gly Gln Val Trp Ile Leu Arg Glu Asp Arg Cys Ser Val 625 630 635 tgt tcc tgt aag gat ggg aag ata ttc tgc cgg cgg aca gct tgt gat 2016 Cys Ser Cys Lys Asp Gly Lys Ile Phe Cys Arg Arg Thr Ala Cys Asp 640 645 650 tgc cag aat cca aat gtt gac ctt ttc tgc tgc cca gag tgt gac acc 2064 Cys Gln Asn Pro Asn Val Asp Leu Phe Cys Cys Pro Glu Cys Asp Thr 655 660 665 agg gtc act agc caa tgt tta gat caa agc gga cag aag ctc tat cga 2112 Arg Val Thr Ser Gln Cys Leu Asp Gln Ser Gly Gln Lys Leu Tyr Arg 670 675 680 685 agt gga gac aac tgg acc cac agc tgc cag cag tgc cga tgt ctg gaa 2160 Ser Gly Asp Asn Trp Thr His Ser Cys Gln Gln Cys Arg Cys Leu Glu 690 695 700 gga gag gca gac tgc tgg cct cta gct tgc cct agt ttg agc tgt gaa 2208 Gly Glu Ala Asp Cys Trp Pro Leu Ala Cys Pro Ser Leu Ser Cys Glu 705 710 715 tac aca gcc atc ttt gaa gga gag tgt tgt ccc cgc tgt gtc agt gac 2256 Tyr Thr Ala Ile Phe Glu Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Ser Asp 720 725 730 ccc tgc ctg gct gat aat att gcc tat gac atc aga aaa act tgc ctg 2304 Pro Cys Leu Ala Asp Asn Ile Ala Tyr Asp Ile 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Ala Val Ala Gln Glu Lys Arg Tyr Ala Ile Ile Thr Ser Met Ala Ala 115 120 125 Ser Pro Gly Leu Arg Pro Phe Pro Thr Ala Trp Pro Met Asp Ser Gly 130 135 140 Thr Arg Ser Arg Cys Leu Ala Pro Leu Thr Ser Tyr Ser Met Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ile Gly Phe Met Ser Val Ile Leu Arg Arg Pro Thr Phe Leu Gln 165 170 175 Glu Ala Ile Tyr Gly Leu Gly Asn Val Ile Lys Ser Met Ala Phe Ser 180 185 190 Lys Glu Ser Ser Lys Met Ala Arg Ser Ser Ser Cys Arg Thr Ala Ser 195 200 205 Ser His Ser Ala Pro Thr Ile Ala Leu Ala Gln His Ala Val Ile Ser 210 215 220 Ala Trp Phe Lys Glu Trp Ile Cys Lys Ser Phe Trp Pro Arg Leu Gln 225 230 235 240 Asn Ile Met Gln Arg Arg Asp Leu Val Asn Trp Lys Ile Ala Thr Val 245 250 255 Arg Arg Pro Ala Lys Val Gly Cys Ser Thr Gly Thr Lys Thr Pro Gly 260 265 270 Met Val Thr Thr Ala Gly Thr Ala His Ala Lys Val Val Leu Trp Ser 275 280 285 Ala Glu Gly Cys Pro Val Pro His Ser Thr Val Pro Gln Thr His Phe 290 295 300 Leu Cys Ile Phe Leu Ala Asn Val Val Lys Phe Ala Asp Gln Asn Val 305 310 315 320 Ser Met Glu Glu Lys Phe Leu Leu Arg Ala Ser Gly Phe Pro Arg Pro 325 330 335 Ala Gly Asn Val Glu Val Glu Ser Trp Lys Ser Gln Lys Leu Ala Leu 340 345 350 Leu Thr Ala Gln Arg Arg Ile Ile Phe Phe Arg Arg Thr Ser Ala Gly 355 360 365 Val Cys Arg Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Ala Pro Lys Cys Gly Glu 370 375 380 Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys Glu Cys Lys 385 390 395 400 Asn Gly Tyr Ile Ser Val Gln Gly Asn Ser Ala Tyr Cys Glu Asp Ile 405 410 415 Asp Glu Cys Ala Ala Lys Met His Tyr Cys His Ala Asn Thr Val Cys 420 425 430 Val Asn Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Cys Asp Cys Ile Pro Gly Tyr Ile 435 440 445 Arg Val Asp Asp Phe Ser Cys Thr Glu His Asp Asp Cys Gly Ser Gly 450 455 460 Gln His Asn Cys Asp Lys Asn Ala Ile Cys Thr Asn Thr Val Gln Gly 465 470 475 480 His Ser Cys Thr Cys Gln Pro Gly Tyr Val Gly Asn Gly Thr Val Cys 485 490 495 Lys Ala Phe Cys Glu Glu Gly Cys Arg Tyr Gly Gly Thr Cys Val Ala 500 505 510 Pro Asn Lys Cys Val Cys Pro Ser Gly Phe Thr Gly Ser His Cys Glu 515 520 525 Lys Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Phe Val Glu Cys His Asn His 530 535 540 Ser Arg Cys Val Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Ser 545 550 555 560 Gly Phe His Asp Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Gly Glu Ser Cys Ile 565 570 575 Asp Ile Asp Glu Cys Ala Leu Arg Thr His Thr Cys Trp Asn Asp Ser 580 585 590 Ala Cys Ile Asn Leu Ala Gly Gly Phe Asp Cys Leu Cys Pro Ser Gly 595 600 605 Pro Ser Cys Ser Gly Asp Cys Pro His Glu Gly Gly Leu Lys His Asn 610 615 620 Gly Gln Val Trp Ile Leu Arg Glu Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys 625 630 635 640 Lys Asp Gly Lys Ile Phe Cys Arg Arg Thr Ala Cys Asp Cys Gln Asn 645 650 655 Pro Asn Val Asp Leu Phe Cys Cys Pro Glu Cys Asp Thr Arg Val Thr 660 665 670 Ser Gln Cys Leu Asp Gln Ser Gly Gln Lys Leu Tyr Arg Ser Gly Asp 675 680 685 Asn Trp Thr His Ser Cys Gln Gln Cys Arg Cys Leu Glu Gly Glu Ala 690 695 700 Asp Cys Trp Pro Leu Ala Cys Pro Ser Leu Ser Cys Glu Tyr Thr Ala 705 710 715 720 Ile Phe Glu Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Ser Asp Pro Cys Leu 725 730 735 Ala Asp Asn Ile Ala Tyr Asp Ile Arg Lys Thr Cys Leu Asp Ser Ser 740 745 750 Gly Ile Ser Arg Leu Ser Gly Ala Val Trp Thr Met Ala Gly Ser Pro 755 760 765 Cys Thr Thr Cys Gln Cys Lys Asn Gly Arg Val Cys Cys Ser Val Asp 770 775 780 Leu Val Cys Leu Glu Asn Asn 785 790 <210> 7 <211> 2451 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(2451) <400> 7 atg gag tct cgg gtc tta ctg aga aca ttc tgt ttg atc ttc ggt ctc 48 Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Leu Ile Phe Gly Leu 1 5 10 15 gga gca gtt tgg ggg ctt ggt gtg gac cct tcc cta cag att gac gtc 96 Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val Asp Pro Ser Leu Gln Ile Asp Val 20 25 30 tta aca gag tta gaa ctt ggg gag tcc acg acc gga gtg cgt cag gtc 144 Leu Thr Glu Leu Glu Leu Gly Glu Ser Thr Thr Gly Val Arg Gln Val 35 40 45 ccg ggg ctg cat aat ggg acg aaa gcc ttt ctc ttt caa gat act ccc 192 Pro Gly Leu His Asn Gly Thr Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Thr Pro 50 55 60 aga agc ata aaa gca tcc act gct aca gct gaa cag ttt ttt cag aag 240 Arg Ser Ile Lys Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Gln Phe Phe Gln Lys 65 70 75 80 ctg aga aat aaa cat gaa ttt act att ttg gtg acc cta aaa cag acc 288 Leu Arg Asn Lys His Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu Lys Gln Thr 85 90 95 cac tta aat tca gga gtt att ctc tca att cac cac ttg gat cac agg 336 His Leu Asn Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile His His Leu Asp His Arg 100 105 110 tac ctg gaa ctg gaa agt agt ggc cat cgg aat gaa gtc aga ctg cat 384 Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Val Arg Leu His 115 120 125 tac cgc tca ggc agt cac cgc cct cac aca gaa gtg ttt cct tac att 432 Tyr Arg Ser Gly Ser His Arg Pro His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile 130 135 140 ttg gct gat gac aag tgg cac aag ctc tcc tta gcc atc agt gct tcc 480 Leu Ala Asp Asp Lys Trp His Lys Leu Ser Leu Ala Ile Ser Ala Ser 145 150 155 160 cat ttg att tta cac att gac tgc aat aaa att tat gaa agg gta gta 528 His Leu Ile Leu His Ile Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val 165 170 175 gaa aag ccc tcc aca gac ttg cct cta ggc aca aca ttt tgg cta gga 576 Glu Lys Pro Ser Thr Asp Leu Pro Leu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly 180 185 190 cag aga aat aat gcg cat gga tat ttt aag ggt ata atg caa gat gtc 624 Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val 195 200 205 caa tta ctt gtc atg ccc cag gga ttt att gct cag tgc cca gat ctt 672 Gln Leu Leu Val Met Pro Gln Gly Phe Ile Ala Gln Cys Pro Asp Leu 210 215 220 aat cgc acc tgt cca act tgc aat gac ttc cat gga ctt gtg cag aaa 720 Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys 225 230 235 240 atc atg gag cta cag gat att tta gcc aaa aca tca gcc aag ctg tct 768 Ile Met Glu Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser 245 250 255 cga gct gaa cag cga atg aat aga ttg gat cag tgc tat tgt gaa agg 816 Arg Ala Glu Gln Arg Met Asn Arg Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg 260 265 270 act tgc acc atg aag gga acc acc tac cga gaa ttt gag tcc tgg ata 864 Thr Cys Thr Met Lys Gly Thr Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Ile 275 280 285 gac ggc tgt aag aac tgc aca tgc ctg aat gga acc atc cag tgt gaa 912 Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Leu Asn Gly Thr Ile Gln Cys Glu 290 295 300 act cta atc tgc cca aat cct gac tgc cca ctt aag tcg gct ctt gcg 960 Thr Leu Ile Cys Pro Asn Pro Asp Cys Pro Leu Lys Ser Ala Leu Ala 305 310 315 320 tat gtg gat ggc aaa tgc tgt aag gaa tgc aaa tcg ata tgc caa ttt 1008 Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Lys Ser Ile Cys Gln Phe 325 330 335 caa gga cga acc tac ttt gaa gga gaa aga aat aca gtc tat tcc tct 1056 Gln Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Glu Arg Asn Thr Val Tyr Ser Ser 340 345 350 tct gga gta tgt gtt ctc tat gag tgc aag gac cag acc atg aaa ctt 1104 Ser Gly Val Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr Met Lys Leu 355 360 365 gtt gag agt tca ggc tgt cca gct ttg gat tgt cca gag tct cat cag 1152 Val Glu Ser Ser Gly Cys Pro Ala Leu Asp Cys Pro Glu Ser His Gln 370 375 380 ata acc ttg tct cac agc tgt tgc aaa gtt tgt aaa ggt tat gac ttt 1200 Ile Thr Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly Tyr Asp Phe 385 390 395 400 tgt tct gaa agg cat aac tgc atg gag aat tcc atc tgc aga aat ctg 1248 Cys Ser Glu Arg His Asn Cys Met Glu Asn Ser Ile Cys Arg Asn Leu 405 410 415 aat gac agg gct gtt tgt agc tgt cga gat ggt ttt agg gct ctt cga 1296 Asn Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg 420 425 430 gag gat aat gcc tac tgt gaa gac atc gat gag tgt gct gaa ggg cgc 1344 Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Arg 435 440 445 cat tac tgt cgt gaa aat aca atg tgt gtc aac acc ccg ggt tct ttt 1392 His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe 450 455 460 atg tgc atc tgc aaa act gga tac atc aga att gat gat tat tca tgt 1440 Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Ser Cys 465 470 475 480 aca gaa cat gat gag tgt atc aca aat cag cac aac tgt gat gaa aat 1488 Thr Glu His Asp Glu Cys Ile Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn 485 490 495 gct tta tgc ttc aac act gtt gga gga cac aac tgt gtt tgc aag ccg 1536 Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Pro 500 505 510 ggc tat aca ggg aat gga acg aca tgc aaa gca ttt tgc aaa gat ggc 1584 Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Thr Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly 515 520 525 tgt agg aat gga gga gcc tgt att gcc gct aat gtg tgt gcc tgc cca 1632 Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ala Asn Val Cys Ala Cys Pro 530 535 540 caa ggc ttc act gga ccc agc tgt gaa acg gac att gat gaa tgc tct 1680 Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser 545 550 555 560 gat ggt ttt gtt caa tgt gac agt cgt gct aat tgc att aac ctg cct 1728 Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro 565 570 575 gga tgg tac cac tgt gag tgc aga gat ggc tac cat gac aat ggg atg 1776 Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met 580 585 590 ttt tca cca agt gga gaa tcg tgt gaa gat att gat gag tgt ggg acc 1824 Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gly Thr 595 600 605 ggg agg cac agc tgt gcc aat gat acc att tgc ttc aat ttg gat ggc 1872 Gly Arg His Ser Cys Ala Asn Asp Thr Ile Cys Phe Asn Leu Asp Gly 610 615 620 gga tat gat tgt cga tgt cct cat gga aag aat tgc aca ggg gac tgc 1920 Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr Gly Asp Cys 625 630 635 640 atc cat gat gga aaa gtt aag cac aat ggt cag att tgg gtg ttg gaa 1968 Ile His Asp Gly Lys Val Lys His Asn Gly Gln Ile Trp Val Leu Glu 645 650 655 aat gac agg tgc tct gtg tgc tca tgt cag aat gga ttc gtt atg tgt 2016 Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys Gln Asn Gly Phe Val Met Cys 660 665 670 cga cgg atg gtc tgt gac tgt gag aat ccc aca gtt gat ctt ttt tgc 2064 Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Val Asp Leu Phe Cys 675 680 685 tgc cct gaa tgt gac cca agg ctt agt agt cag tgc ctc cat caa aat 2112 Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu His Gln Asn 690 695 700 ggg gaa act ttg tat aac agt ggt gac acc tgg gtc cag aat tgt caa 2160 Gly Glu Thr Leu Tyr Asn Ser Gly Asp Thr Trp Val Gln Asn Cys Gln 705 710 715 720 cag tgc cgc tgc ttg caa ggg gaa gtt gat tgt tgg ccc ctg cct tgc 2208 Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Pro Cys 725 730 735 cca gat gtg gag tgt gaa ttc agc att ctc cca gag aat gag tgc tgc 2256 Pro Asp Val Glu Cys Glu Phe Ser Ile Leu Pro Glu Asn Glu Cys Cys 740 745 750 ccg cgc tgt gtc aca gac cct tgc cag gct gac acc atc cgc aat gac 2304 Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile Arg Asn Asp 755 760 765 atc acc aag act tgc ctg gac gaa atg aat gtg gtt cgc ttc acc ggg 2352 Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Met Asn Val Val Arg Phe Thr Gly 770 775 780 tcc tct tgg atc aaa cat ggc act gag tgt act ctc tgc cag tgc aag 2400 Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gln Cys Lys 785 790 795 800 aat ggc cac atc tgt tgc tca gtg gat cca cag tgc ctt cag gaa ctg 2448 Asn Gly His Ile Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu Gln Glu Leu 805 810 815 tga 2451 * <210> 8 <211> 816 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Leu Ile Phe Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val Asp Pro Ser Leu Gln Ile Asp Val 20 25 30 Leu Thr Glu Leu Glu Leu Gly Glu Ser 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cct tat att 432 Tyr Arg Ser Gly Thr His Arg Pro His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile 130 135 140 ttg gct gat gcc aag tgg cac aag ctc tcc tta gcc ttc agt gcc tcc 480 Leu Ala Asp Ala Lys Trp His Lys Leu Ser Leu Ala Phe Ser Ala Ser 145 150 155 160 cac tta att tta cac atc gac tgc aac aag atc tat gaa cga gtg gtg 528 His Leu Ile Leu His Ile Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val 165 170 175 gaa atg cct tct aca gac ttg cct ctg ggc acc aca ttt tgg ttg gga 576 Glu Met Pro Ser Thr Asp Leu Pro Leu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly 180 185 190 cag aga aat aac gca cac ggg tat ttt aag gga ata atg caa gat gtg 624 Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val 195 200 205 caa tta ctt gtc atg ccc cag ggg ttc atc gct cag tgc ccg gat ctt 672 Gln Leu Leu Val Met Pro Gln Gly Phe Ile Ala Gln Cys Pro Asp Leu 210 215 220 aat cga acc tgt cca aca tgc aac gac ttc cat ggg ctt gtg cag aaa 720 Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys 225 230 235 240 atc atg gag ctg cag gac att tta tcg 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ttg tat gaa tgc aag gat cag acc atg aag ctt 1104 Ser Gly Met Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr Met Lys Leu 355 360 365 gtt gag aac gcc ggc tgc ccg gct tta gat tgc ccc gag tct cat cag 1152 Val Glu Asn Ala Gly Cys Pro Ala Leu Asp Cys Pro Glu Ser His Gln 370 375 380 atc gcc ttg tct cac agc tgc tgc aag gtt tgc aaa ggt tat gac ttc 1200 Ile Ala Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly Tyr Asp Phe 385 390 395 400 tgt tct gag aag cat aca tgc atg gag aac tca gtc tgc agg aac ctg 1248 Cys Ser Glu Lys His Thr Cys Met Glu Asn Ser Val Cys Arg Asn Leu 405 410 415 aac gac agg gca gtg tgc agc tgc cgg gat ggt ttc cgg gcc ctc cgg 1296 Asn Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg 420 425 430 gag gac aat gcc tac tgt gaa gac att gac gag tgt gca gag ggg cgc 1344 Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Arg 435 440 445 cat tac tgc cgt gag aac acc atg tgt gtg aac aca ccg ggc tct ttc 1392 His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe 450 455 460 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tgc 1248 Tyr Asp Phe Cys Ser Glu Lys His Thr Cys Met Glu Asn Ser Val Cys 405 410 415 agg aac ctg aac gac agg gtt gtg tgc agc tgc agg gat ggt ttt cgg 1296 Arg Asn Leu Asn Asp Arg Val Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg 420 425 430 gct ctc cga gag gac aac gcc tac tgt gaa gac att gac gag tgt gca 1344 Ala Leu Arg Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala 435 440 445 gaa ggg cgc cat tac tgc cgt gag aac acc atg tgt gtg aat aca cct 1392 Glu Gly Arg His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro 450 455 460 ggt tct ttc atg tgt gtc tgc aaa act ggg tac atc agg atc gac gat 1440 Gly Ser Phe Met Cys Val Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp 465 470 475 480 tac tca tgt aca gaa cat gat gag tgt ctc aca acc cag cac aat tgt 1488 Tyr Ser Cys Thr Glu His Asp Glu Cys Leu Thr Thr Gln His Asn Cys 485 490 495 gat gaa aac gct ttg tgc ttt aac act gtt gga gga cac aac tgt gtc 1536 Asp Glu Asn Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val 500 505 510 tgc aag cct ggc tac acc ggg aat gga acc acg tgc aaa gct ttc tgc 1584 Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Thr Cys Lys Ala Phe Cys 515 520 525 aaa gat ggc tgt aga aac gga gga gcg tgc att gct gcc aat gtg tgt 1632 Lys Asp Gly Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ala Asn Val Cys 530 535 540 gcc tgc cca caa ggc ttc acg gga ccc agc tgt gag aca gac att gac 1680 Ala Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp 545 550 555 560 gag tgc tct gag ggc ttt gtt cag tgt gac agc cgt gcc aac tgc atc 1728 Glu Cys Ser Glu Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile 565 570 575 aac ctg cct ggg tgg tat cac tgt gag tgc aga gac ggc tac cat gac 1776 Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp 580 585 590 aat ggg atg ttt gcg cca ggc gga gaa tcc tgt gaa gat att gac gaa 1824 Asn Gly Met Phe Ala Pro Gly Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu 595 600 605 tgc ggg act ggg agg cac agc tgc acc aac gac acc att tgc ttc aac 1872 Cys Gly Thr Gly Arg His Ser Cys Thr Asn Asp Thr Ile Cys Phe Asn 610 615 620 ttg gac ggg gga tac gat tgc cgg tgt ccc cat ggg aag aac tgc act 1920 Leu Asp Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr 625 630 635 640 ggg gac tgc gtg cac gag ggg aaa gtg aag cac acc ggc cag atc tgg 1968 Gly Asp Cys Val His Glu Gly Lys Val Lys His Thr Gly Gln Ile Trp 645 650 655 gtg ctg gaa aac gac agg tgc tcc gtg tgt tcc tgg cag act ggg ttt 2016 Val Leu Glu Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Trp Gln Thr Gly Phe 660 665 670 gtc atg tgt cga cgg atg gtc tgc gac tgc gaa aac ccc aca gat gac 2064 Val Met Cys Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Asp Asp 675 680 685 ctt tcc tgc tgc cct gag tgt gac cca agg ctg agc agt cag tgc ctg 2112 Leu Ser Cys Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu 690 695 700 cat caa aac ggg gaa acc gtg tac aac agc ggc gac acc tgg gtc cag 2160 His Gln Asn Gly Glu Thr Val Tyr Asn Ser Gly Asp Thr Trp Val Gln 705 710 715 720 gat tgc cgt cag tgc cgc tgc ttg caa gga gaa gtt gac tgt tgg ccc 2208 Asp Cys Arg Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro 725 730 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cac aca gaa gta ttc cca tac atc 432 Tyr Arg Thr Gly Ser His Arg Ser His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile 130 135 140 ctg gca gac gat aag tgg cac agg ctt tcc tta gca atc agt gcc tct 480 Leu Ala Asp Asp Lys Trp His Arg Leu Ser Leu Ala Ile Ser Ala Ser 145 150 155 160 cac ttg att tta cac gtg gac tgc aat aaa atc tat gaa aga gtt gtg 528 His Leu Ile Leu His Val Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val 165 170 175 gag aag ccc ttc atg gac tta cct gtg ggt aca acc ttt tgg cta gga 576 Glu Lys Pro Phe Met Asp Leu Pro Val Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly 180 185 190 cag agg aat aat gca cac ggt tat ttt aag ggc ata atg caa gat gtg 624 Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val 195 200 205 caa tta ctt gtc atg cct caa gga ttt att tct cag tgc cca gat ctt 672 Gln Leu Leu Val Met Pro Gln Gly Phe Ile Ser Gln Cys Pro Asp Leu 210 215 220 aat cgg aca tgc cca act tgt aat gat ttc cat gga ctt gtg cag aaa 720 Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys 225 230 235 240 att atg gaa ctg caa gac att tta gct aaa acg tca gct aag ctg tcg 768 Ile Met Glu Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser 245 250 255 caa gct gag cag agg atg aac aag ttg gat cag tgc tat tgt gaa agg 816 Gln Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg 260 265 270 acc tgc aca atg aaa ggc atg aca tac aga gaa ttt gaa tcc tgg aca 864 Thr Cys Thr Met Lys Gly Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr 275 280 285 gat ggt tgt aag aac tgc act tgc atg aat ggc act gtg cag tgt gaa 912 Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Met Asn Gly Thr Val Gln Cys Glu 290 295 300 gct ttg att tgc tcc ctc tct gac tgt cca cct aat tct gcc ctg tca 960 Ala Leu Ile Cys Ser Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asn Ser Ala Leu Ser 305 310 315 320 tac gtg gat ggc aag tgc tgc aaa gaa tgt caa tcg gtg tgc ata ttt 1008 Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Gln Ser Val Cys Ile Phe 325 330 335 gaa ggc aga acc tac ttt gaa gga caa aga gaa acg gtg tat tca agc 1056 Glu Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Gln Arg Glu Thr Val Tyr Ser Ser 340 345 350 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His Arg Leu Ser Leu Ala Ile Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Leu Ile Leu His Val Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val 165 170 175 Glu Lys Pro Phe Met Asp Leu Pro Val Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly 180 185 190 Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val 195 200 205 Gln Leu Leu Val Met Pro Gln Gly Phe Ile Ser Gln Cys Pro Asp Leu 210 215 220 Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys 225 230 235 240 Ile Met Glu Leu Gln Asp Ile Leu Ala Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser 245 250 255 Gln Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg 260 265 270 Thr Cys Thr Met Lys Gly Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr 275 280 285 Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Met Asn Gly Thr Val Gln Cys Glu 290 295 300 Ala Leu Ile Cys Ser Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asn Ser Ala Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Gln Ser Val Cys Ile Phe 325 330 335 Glu Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Gln Arg Glu Thr Val Tyr Ser Ser 340 345 350 Ser Gly Asp Cys Val Leu Phe Glu Cys Lys Asp His Lys Met Gln Arg 355 360 365 Ile Pro Lys Asp Ser Cys Ala Thr Leu Asn Cys Pro Glu Ser Gln Gln 370 375 380 Ile Pro Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Ile Cys Lys Gly His Asp Phe 385 390 395 400 Cys Thr Glu Gly His Asn Cys Met Glu His Ser Val Cys Arg Asn Leu 405 410 415 Asp Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg 420 425 430 Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Gly Gln 435 440 445 His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe 450 455 460 Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Ser Cys 465 470 475 480 Thr Glu His Asp Glu Cys Val Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn 485 490 495 Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Leu 500 505 510 Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Val Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly 515 520 525 Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ser Asn Val Cys Ala Cys Pro 530 535 540 Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser 545 550 555 560 Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro 565 570 575 Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met 580 585 590 Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Thr 595 600 605 Gly Arg His Ser Cys Ala Asn Asp Thr Val Cys Phe Asn Leu Asp Gly 610 615 620 Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr Gly Asp Cys 625 630 635 640 Ile His Glu Asp Lys Ile Lys His Asn Gly Gln Ile Trp Val Leu Glu 645 650 655 Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys Gln Ser Gly Tyr Val Met Cys 660 665 670 Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Val Asp Leu Phe Cys 675 680 685 Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu His Gln Ser 690 695 700 Gly Glu Leu Ser Tyr Asn Ser Gly Asp Ser Trp Ile Gln Asn Cys Gln 705 710 715 720 Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Pro Cys 725 730 735 Pro Glu Val Asp Cys Glu Phe Ser Val Leu Pro Glu Asn Glu Cys Cys 740 745 750 Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile Arg Asn Asp 755 760 765 Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Thr Asn Val Val Arg Phe Thr Gly 770 775 780 Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gln Cys Lys 785 790 795 800 Asn Gly His Val Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu Gln Glu Leu 805 810 815

Claims (155)

1. 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로(in frame with a nucleic acid) 적어도 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 하나의 핵산 구성체(construct)를 준비하는 단계와;

   하나의 곤충 세포를 상기 핵산 구성체로 감염시키는 단계와;

   NELL1 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 곤충 세포를 배양하는 단계와;

   세포 라인에서 분비된 NELL1 펩티드를 선택적으로 모으는 단계와;

   NELL1 펩티드를 선택적으로 실질적으로 정제하는 단계와; 그리고

   NELL1 펩티드의 활성을 선택적으로 시험하는 단계를 포함하여 구성되는,

   하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 곤충 세포가 하나의 하이 파이브 세포(high five cell)인, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 곤충 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열(melittin signal sequence)인, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5로 구성되는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
6. 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
7. 제5항에 있어서, 상기 곤충 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
8. 제5항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
9. 제5항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
10. 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는 하나의 핵산 구성체를 포함하는, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인(cell line).
11. 제10항에 있어서, 상기 세포가 하나의 곤충 세포인, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
12. 제11항에 있어서, 상기 세포가 하나의 하이 파이브 세포(high five cell)인, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
13. 제10항에 있어서, 상기 세포가 상기 NELL1 펩티드를 분비하는, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
14. 제10항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
15. 제10항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산이 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5로 포함하는 군으로부터 선택되는, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
16. 제1항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
17. 하나의 NELL1 펩티드와 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 포함하여 구성되는, 폴리펩티드.
18. 제16항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
19. 제17항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 폴리펩티드.
20. 하나의 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는 하나의 핵산 구성체를 준비하는 단계와;

    하나의 포유동물 세포를 상기 핵산 구성체로 감염시키는 단계와;

    상기 NELL1 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 포유동물 세포를 배양하는 단계와;

    세포 라인에서 분비된 NELL1 펩티드를 선택적으로 모으는 단계와;

    NELL1 펩티드를 선택적으로 실질적으로 정제하는 단계와; 그리고

    골 형성을 유도하기 위해 NELL1 펩티드의 활성을 선택적으로 시험하는 단계를 포함하여 구성되는,

    하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 곤충 세포가 하나의 COS7 세포인, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 곤충 분비성신호 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
23. 제20항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
24. 제20항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
25. 하나의 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는, 하나의 포유동물 세포에 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
26. 제24항에 있어서, 상기 곤충 분비성 시그널 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 핵산 구성체.
27. 제24항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는, 핵산 구성체.
28. 제24항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 핵산 구성체.
29. 하나의 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는 하나의 핵산 구성체를 포함하는, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
30. 제29항에 있어서, 상기 세포가 하나의 포유동물 세포인, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
31. 제30항에 있어서, 상기 세포가 하나의 COS7 세포인, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
32. 제29항에 있어서, 상기 세포가 상기 NELL1 펩티드를 분비하는, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
33. 제29항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
34. 제29항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는, 기능성 NELL1 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
35. 제20항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
36. 하나의 NELL1 펩티드와 하나의 분비성 시그널 펩티드를 포함하여 구성되는, 폴리펩티드.
37. 제35항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
38. 제35항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 폴리펩티드.
39. 적어도 하나의 NELL2 펩티드, 그리고 NELL2 펩티드를 갖는 구성의(in frame with the NELL2 peptide) 적어도 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는, 적어도 하나의 핵산을 포함하는 하나의 핵산 구성체를 준비하는 단계와;

    하나의 곤충 세포를 상기 핵산 구성체로 감염시키는 단계와;

    NELL2 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 곤충 세포를 배양하는 단계와;

    세포 라인에서 분비된 NELL2 펩티드를 선택적으로 모으는 단계와;

    NELL2 펩티드를 선택적으로 실질적으로 정제하는 단계와; 그리고

    NELL2 펩티드의 활성을 선택적으로 시험하는 단계를 포함하여 구성되는,

    하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 곤충 세포가 하나의 하이 파이브 세포인, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 곤충 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
42. 제39항에 있어서, 상기 NELL2를 엔코딩하는 핵산이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호11 또는 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드가 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
44. 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
45. 제43항에 있어서, 상기 곤충 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
46. 제43항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호11 또는 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
47. 제5항에 있어서, 상기 NELL2가 서열번호 8, 서열번호10, 서열번호 12 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
48. 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는 하나의 핵산 구성체를 포함하는, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
49. 제48항에 있어서, 상기 세포가 하나의 곤충 세포인, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
50. 제49항에 있어서, 상기 세포가 하나의 하이 파이브 세포인, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
51. 제48항에 있어서, 상기 세포가 상기 NELL2 펩티드를 분비하는, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
52. 제48항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
53. 제48항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 핵산이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 또는 서열번호 13를 포함하는 군으로부터 선택되는, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
54. 제39항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드가 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 곤충 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
55. 하나의 NELL2 펩티드와 하나의 곤충 분비성 시그널 펩티드를 포함하여 구성되는, 폴리펩티드.
56. 제55항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드가 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 폴리펩티드.
57. 제55항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 멜리틴 시그널 서열인, 폴리펩티드.
58. 적어도 하나의 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산과 NELL2 펩티드를 갖는 구성의 하나의 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하는, 하나의 핵산 구성체를 준비하는 단계와;

    하나의 곤충 세포를 상기 핵산 구성체로 감염시키는 단계와;

    상기 NELL2 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 상기 곤충 세포를 배양하는 단계와;

    세포 라인에서 분비된 NELL2 펩티드를 선택적으로 모으는 단계와;

    NELL2 펩티드를 선택적으로 실질적으로 정제하는 단계와; 그리고

    신경 세포 생존(neuronal cell survival)을 촉진하기 위해 NELL2 펩티드의 활성을 선택적으로 시험하는 단계를 포함하여 구성되는,

    하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 하나의 COS7 세포인, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
60. 제58항에 있어서, 상기 포유동물 분비성 시그널 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
61. 제58항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 또는 서열번호 13를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
62. 제58항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드가 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
63. 하나의 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는, 하나의 포유동물 세포에 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
64. 제63항에 있어서, 상기 곤충 분비성 시그널 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 하나의 포유동물 세포에 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
65. 제63항에 있어서, 상기 NELL2를 엔코딩하는 핵산이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 또는 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
66. 제63항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드가 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 핵산 구성체.
67. 하나의 분비성 시그널 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산을 갖는 구성으로 적어도 하나의 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함하여 구성되는 하나의 핵산 구성체를 포함하는, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
68. 제67항에 있어서, 상기 세포가 하나의 포유동물 세포인, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
69. 제68항에 있어서, 상기 세포가 하나의 COS7 세포인, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
70. 제67항에 있어서, 상기 세포가 상기 NELL2 펩티드를 분비하는, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
71. 제67항에 있어서, 상기 분비성 시그널 펩티드가 하나의 NELL 펩티드 시그널 서열인, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
72. 제67항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드를 엔코딩하는 핵산이 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호11, 또는 서열번호 13을 포함하는 군으로부터 선택되는, 기능성 NELL2 펩티드를 발현하기 위한 세포 라인.
73. 제58항에 있어서, 상기 NELL2 펩티드가 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 또는 서열번호 14를 포함하는 군으로부터 선택되는, 하나의 포유동물 세포에 하나의 기능성 펩티드를 발현하는 방법.
74. 하나의 골원 세포에 하나의 NELL1 유전자 생성물(gene product)의 농도를 증가시키는 단계와;

    제2 골 생성 작용제(second osteogenic agent)를 선택적으로 쓰는 단계와; 그리고

    골형성 분화(osteoblastic differentiation)의 세포 표지의 발현을 선택적으로 유도하는 단계를 포함하여 구성되는, 골원 세포 분화(osteogenic cell differentiation)를 증진시키는 방법.
75. 제74항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 하나의 조골 세포에 NELL1 펩티드를 가하는 것을 포함하여 구성되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
76. 제74항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
77. 제74항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 내생 NELL1 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
78. 제77항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 Cbfa1의 세포 레벨(cellular levels)을 증가시키는 것을 포함하여 구성되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
79. 제74항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 구성체로 골원 세포를 감염시키는 것을 포함하여 구성되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
80. 제74항에 있어서, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산이 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하여 구성되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
81. 제74항에 있어서, NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
82. 제74항에 있어서, 상기 골원 세포가 조골세포(osteoblasts), 중간엽 세포(mesenchymal cells), 섬유아세포(fibroblasts), 태아 배아 세포(fetal embryonic cells), 줄기 세포(stem cells), 골수 세포(bone marrow cells), 경막 세포(dural cells), 연골세포(chondrocytes), 연골모세포(chondroblasts), 원시 두개 세포(primary calvarial cells), 줄기 세포, 및 지방 줄기 세포(adipose stem cells)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
83. 제74항에 있어서, 상기 제2 골 형성 펩티드가 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
84. 제74항에 있어서, 골 형성 분화의 유도 세포 표지(induced cellular marker)가 알카라인 포스파타제 활성(alkaline phosphatase activity), 오스테오칼신 mRNA 발현(osteocalcin mRNA expression), 오스테오폰틴(osteoponin) mRNA 발현, 데코린(decorin) 발현, 및 라미닌(laminin) B 발현을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골원 세포 분화를 증진시키는 방법.
85. 하나의 조골 세포의 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계와;

    조골 세포에 하나의 작용제를 선택적으로 쓰는 단계와; 그리고

    무기질화의 세포 표지의 발현을 유도하는 단계를 포함하여 구성되는, 골 형성 무기질화(osteoblastic mineralization)를 증진시키는 방법.
86. 제85항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 하나의 조골 세포에 하나의 NELL1 펩티드를 가하는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
87. 제85항에 있어서, NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4,or 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
88. 제85항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 내생 NELL1 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
89. 제88항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 Cbfa1의 세포 레벨(cellular levels)을 증가시키는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
90. 제85항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 구성체로 골원 세포를 감염시키는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
91. 제85항에 있어서, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체가 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하여 구성되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
92. 제85항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
93. 제85항에 있어서, 상기 골원 세포가 조골세포, 중간엽 세포, 섬유아세포, 태아 배아 세포, 줄기 세포, 골수 세포, 경막 세포, 연골세포, 연골모세포, 원시 두개 세포, 줄기 세포, 및 지방 줄기 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
94. 제85항에 있어서, 제2 골 형성 작용제가 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
95. 제85항에 있어서, 무기질화의 유도 세포 표지가 칼슘 혼합(incorporation)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성 무기질화를 증진시키는 방법.
96. 골 형성이 필요한 부위의 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계와;

    골 형성이 필요한 대략 동일한 부위에 제2 작용제를 가하는 단계와; 그리고

    막내 골 형성을 유도하는 단계를 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
97. 제96항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 골 형성이 필요한 부위에 NELL1 펩티드를 가하는 것을 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
98. 제96항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
99. 제96항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 내생 NELL1 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
100. 제96항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 구성체로 세포를 감염시키는 단계와, 그리고 골 형성이 필요한 부위에 근접하게 상기 세포를 가하는 단계를 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
101. 제96항에 있어서, NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체가 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
102. 제96항에 있어서, NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
103. 제96항에 있어서, 상기 작용제가 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골, 기질, 인대 기질(ligament matrix), 건 기질(tendon matrix), 조골 세포, 골 형성 세포(osteoblastic cells)를 포함하는 군으로부터 선택되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
104. 제96항에 있어서, 막내 골의 형성을 유도하는 단계가 CT, 유전자 발현(gene expression), 조직구도(histology), 기계적 시험(mechanical testing)에 의해 평가되는, 막내 골 형성을 증가시키는 방법.
105. 골 형성 및/또는 치료 및/또는 재생이 필요한 부위의 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계와;

     골 형성이 필요한 부위에 하나의 작용제를 선택적으로 쓰는 단계와; 그리고

     골 형성이 필요한 부위에 연골모세포의 비대(hypertrophy of chondroblast)를 적어도 유도하는 단계를 포함하여 구성되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
106. 제105항에 있어서, 골 형성이 골 치료 또는 골 재생을 포함하는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
107. 제105항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 골 형성이 필요한 부위에 NELL1 펩티드를 가하는 것을 포함하여 구성되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
108. 제105항에 있어서, 상기 NELL1 펨티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
109. 제105항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 내생 NELL1 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
110. 제105항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 구성체로 세포를 감염시키는 것과, 그리고 골 형성이 필요한 부위에 근접하게 세포들을 가하는 것을 포함하여 구성되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
111. 제110항에 있어서, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 핵산 구성체가 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하여 구성되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
112. 제110항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
113. 제105항에 있어서, 상기 작용제가 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골, 기질, 인대 기질, 건 기질, 조골 세포, 골 형성 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
114. 제105항에 있어서, 상기 연골모세포 비대를 유도하는 단계가 고사성 연골모세포(apoptotic chondroblasts)의 증가를 초래하는, 연골성 골 형성을 증가시키는 방법.
115. 척추 고정(spinal fusion)이 필요한 추골(vertebra)에 근접하게 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계와;

     척추 고정이 필요한 부위에 추골에 근접하게 하나의 보충 활성제(additional active agent)를 선택적으로 쓰는 단계와; 그리고

     척추 고정이 필요한 부위에 연골모세포 비대(chondroblast hypertrophy) 또는 조골세포 분화(osteoblast differentiation)를 유도하는 단계를 포함하여 구성되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
116. 제115항에 있어서, 골 형성 분화(osteoblastic differentiation)를 증가시키는 단계를 더 포함하는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
117. 제115항에 있어서, 골 형성 분화(osteoblastic mineralization)를 증가시키는 단계를 더 포함하는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
118. 제115항에 있어서, 막 골 형성을 유도하는 단계를 더 포함하는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
119. 제115항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 척추 고정이 필요한 부위에 하나의 NELL1 펩티드를 가하는 것을 포함하여 구성되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
120. 제115항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
121. 제115항에 있어서, NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가 내생 NELL1 유전자의 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
122. 제115항에 있어서, 하나의 NELL1 유전자 생성물의 농도를 증가시키는 단계가, 하나의 NELL1 펩티드를 엔코딩하는 하나의 핵산 구성체로 세포를 감염시키는 것과, 그리고 척추 고정이 필요한 부위에 근접하게 상기 세포들을 가하는 것을 포함하여 구성되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
123. 제122항에 있어서, 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산 구성체가 서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하여 구성되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
124. 제122항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
125. 제115항에 있어서, 상기 작용제가 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골, 기질, 인대 기질, 건 기질, 조골 세포, 골 형성 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 추골에 근접하게 골 형성을 증가시키는 방법.
126. 하나의 NELL1 펩티드, 그리고 NELL1 펩티드의 발현을 변경하는 하나의 작용제 또는 하나의 NELL1 펩티드의 활성을 변경하는 하나의 작용제를 포함하는 군으로부터 선택되고 골 형성을 유도하기에 효과적인 양(effective amount)의 제1 작용제와;

     선택적으로 하나의 캐리어를 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물(composition).
127. 제126항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
128. 제126항에 있어서, 상기 작용제가 TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
129. 제126항에 있어서, 상기 작용제가 골 기질, 건 기질 또는 인대 기질, 조골 세포, 골 형성 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
130. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가 효소 또는 가수분해 메카니즘(enzymatic or hydrolytic mechanisms)에 의해 분해가능한, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
131. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가, 폴리 (L-락티드), 폴리 (D, L-락티드), 폴리글리콜리드, 폴리 (락티드-코-글리콜리드), 폴리 (-카프롤락톤)[poly (-caprolactone)], 폴리 (트리메틸렌 카르보네이트 [poly (trimethylene carbonate)], 폴리 (p-다이옥사논) [poly (p-dioxanone)], 폴리 (-카프롤락톤-코-글리코리드 [poly (-caprolactone-co-glycolide)], 폴리 (글리콜리드-코-트리메틸렌 카르보네이트) 폴리 (D, L-락티드-코-트리메틸렌 카르보네이트 [poly (glycolide-co-trimethylene carbonate) poly (D, L- lactide-co-trimethylene carbonate)], 폴리아릴레이트(polyarylates), 폴리히드록실부티레이트 (polyhydroxybutyrate), 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리 (안하이드라이드-코-이미드, 프로필렌-코-푸마레이트[propylene-co-fumarates], 폴리락톤[polylactones], 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 다음극성 폴리머(polyanionic polymers), 다무수물(polyanhydrides), 폴리에스테르-아미드(polyester-amides), 폴리 (아미노산) [poly (amino-acids)], 호모폴리펩티드, 폴리 (포스파젠) [poly (phosphazenes)], 폴리 (글락사논) [poly (glaxanone)], 다당류(polysaccharides), 및 폴리 (오르소에스테르) [poly (orthoesters)], 폴리글락틴(polyglactin), 폴리글락틱산(polyglactic acid), 폴리알도닉산(polyaldonic acid), 폴리아크릴릭산(polyacrylic acids), 폴리알카노에이트(polyalkanoates)와 같은 폴리-(α-하이드록시 산)[poly-(α-hydroxy acids)]를 포함하는 군으로부터 선택된 합성 폴리머를 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
132. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가 알킬셀룰로오스, 히드록시알킬셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 그리고 그 양이온성 염(cationic salts)을 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 셀룰로오스 폴리머를 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
133. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가, 탄산칼슘(calcium carbonates), 인산칼슘(calcium phosphates), 인회석(apatites), 대생물활성 글라스 재료(bioactive glass materials), 및 산호-유래 인회석(coral-derived apatites)을 포함하는 군으로부터 선택된 합성 또는 천연 바이오세라믹을 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
134. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가 콜라겐, 히알루로난(hyaluronan), 섬유소(fibrin), 키토산(chitosan), 알긴산(alginate), 및 젤라틴(gelatin)을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
135. 제126항에 있어서, 덱스트란 설파이트(dextran sulfate), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 헤파린 설페이트(heparin sulfate), 푸칸(fucan), 알긴산(alginate)을 포함하는 군으로부터 선택되는 헤파린-결합제(heparin-binding agents)를 더 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
136. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가 유동성 겔(flowable gel)의 형태인, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
137. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가 광중합성가능한(photopolymerizable), 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
138. 제126항에 있어서, 상기 캐리어가 온도 민감성인, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
139. 제126항에 있어서, 상기 합성물이, 콜라겐, 젤라틴, 하이알우로닉산(hyaluronic acid), 알긴산(alginate), 폴리(에틸렌 글리콜), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸셀롤로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스를 포함하는 알킬셀룰로오스(히드록시알킬셀룰로오스 포함), 혈액, 섬유소(fibrin), 폴리옥시에킬렌 옥사이드(polyoxyethylene oxide), 칼슘 설페이트 헤미하이드레이드(calcium sulfate hemihydrate), 인회석, 카르복시비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer), 및 폴리 (비닐 알코올)을 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 격리제(sequestering agent)를 더 포함하는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
140. 제126항에 있어서, 상기 합성물이 폴리소르베이트(polysorbate) 80, 폴리소르베이트 20 또는 플루로닉(Pluronic) F-68을 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 계면활성제를 더 포함하는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
141. 제126항에 있어서, 상기 합성물이 글리신, 글루타민산 염산염(glutamic acid hydrochloride), 염화나트륨, 구아니딘(guanidine), 헤파린(heparin), 글루타민산 염산염(glutamic acid hydrochloride), 아세트산, 숙신산(succinic acid), 폴리소르베이트(polysorbate), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 수크로오스(sucrose), 및 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 하나의 완충제를 더 포함하는, 골 형성을 유도하기 위한 합성물.
142. 골 형성을 증진시키기 위해 선택된 간격으로 유효한 제형의 치료상 유효 복용량으로 NELL1 펩티드를 투여하는 단계를 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증진시키기 위하여 환자를 치료하는 방법.
143. 제142항에 있어서, TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골 기질, 건 기질 또는 인대 기질을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 작용제를 골 형성이 필요한 부위에 투여하는 단계를 더 포함하여 구성되는, 막내 골 형성을 증진시키기 위하여 환자를 치료하는 방법.
144. 포유동물 골원 세포를 채취하는 단계와;

     상기 골원 세포와 접촉 상태의 NELL1 펩티드의 농도를 증가시키는 단계와;

     골 형성이 필요한 부위에 골원 세포를 투여하는 단계를 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법.
145. 제144항에 있어서, 상기 골원 세포와 접촉 상태의 NELL1 펩티드의 농도를 증가시키는 단계가, 상기 골원 세포에 NELL1 펩티드를 포함하는 하나의 합성물을 가하는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법.
146. 제144항에 있어서, 상기 골원 세포와 접촉 상태의 NELL1 펩티드의 농도를 증가시키는 단계가, NELL1 펩티드의 내생 발현을 유도하는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법.
147. 제144항에 있어서, 상기 골원 세포와 접촉 상태의 NELL1 펩티드의 농도를 증가시키는 단계가, NELL1 펩티드를 발현하는 하나의 핵산 구성체로 상기 세포를 감염시키는 것을 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법.
148. 제145항, 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 NELL1 펩티드가 상기 NELL1을 엔코딩하는 핵산이 서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6을 포함하는 군으로부터 선택되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법.
149. 제145항, 제146항 또는 제147항에 있어서, TGF-β, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, 콜라겐, 골, 기질, 인대 기질, 건 기질, 조골 세포, 골 형성 세포를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 작용제를 골 형성이 필요한 부위에 투여하는 단계를 더 포함하여 구성되는, 골 형성을 유도하기 위해 환자를 치료하는 방법.
150. 임플란트에 가까운 골 형성을 유도하기에 충분한 양의 NELL1을 포함하는 하나의 기질(substrate)을 포함하여 구성되는, 인체용 임플란트.
151. 적어도 그 일부가 임플란트에 가까운 골 형성을 유도하기에 충분한 양의 NELL1을 포함하는 하나의 서페이스(surface)를 갖는 하나의 기질(substrate)을 포함하여 구성되는, 인체용 임플란트.
152. 적어도 그 일부가 골원 세포(osteogenic cells)를 포함하는 하나의 서페이스(surface)를 가지며, 골 형성을 유도하기에 충분한 양의 NELL1을 포함하는, 하나의 기질(substrate)을 포함하여 구성되는, 인체용 임플란트.
153. 제145항, 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 기질이 메쉬(mesh), 핀(pin), 나사(screw), 플레이트(plate), 또는 보철 관절(prosthetic joint) 형상으로 형성된, 인체용 임플란트.
154. 제145항, 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 기질이 재흡수가능한(resorbable), 인체용 임플란트.
155. 제145항, 제146항 또는 제147항에 있어서, 상기 기질이 콜라겐을 포함하여 구성되는, 인체용 임플란트.