FI97299B - Menetelmä kimeerisen transformoivan beta-kasvutekijän valmistamiseksi - Google Patents

Description

97299

Menetelmä kimeerisen transformoivan beta-kasvutekijän valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää uuden kimeerisen transformoivan TGF-/31//32 :ksi nimetyn kasvutekijän valmistamiseksi TGF-/?l/jS2 : ta koodaavia nukleotidijaksoja ja ilmentymi s vektoreita. Keksinnöstä on esimerkkinä TGF-/3l/|32 :n valmistus ja eristys CHO-soluilla, jotka on transfektoitu ilmentymis-10 vektoreilla, jotka koodaavat kimeerisen TGF-/31//32 :n prekur-sorin geeniä. Kimeerisellä geenituotteella on TGF-/3:n biologinen aktiivisuus.

Transformoiva beta-kasvutekijä (TGF-j8l/02) on äskettäin ku-15 vatun solujen eriytymistä ja lisääntymistä säätelevän poly-peptidiperheen jäsen. Tähän perheeseen kuuluvat lisäksi Mullerian inhibiittoriaine (Cate et ai., 1986, Cell 45:685-698), inhibiinit (Mason et ai., 1985, Nature 318:659-663) ja Drosofilan dekapentaplegigeenikompleksin transkriptio-20 tuotteesta ennustettu proteiini (Padgett et ai., 1987, Nature 325:81-84).

Neljä erityyppistä TGF-j8:aa on identifioitu ja nimetty TGF-|8l:ksi, TGF-/32:ksi, TGF-01.2:ksi ja TGF-|33:ksi. Ensin ku-25 vattu tyyppi, TGF-jSl, koostuu kahdesta identtisestä disul-fidisidoksella yhdistetystä alayksiköstä, joiden moolimassa on 13 000 (Assoian et ai., 1983, J. Biol. Chem. 258:7155-7160; Frolik et ai. 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:-3676-3680; Frolik et ai., 1984, J. Biol. Chem. 260:10995-30 11000). Se on puhdistettu useista kudoslähteistä kuten is tukasta (Frolik et ai., 1983, Nature 325:81-84); verihiutaleista (Childs et ai., 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5312-5316; Assoian et ai., 1983, J. Biol. Chem. 258:-7155-7160) munuaisesta (Roberts et ai., 1983, Biochemistry 35 22:5692-5698), ja demineralisoidusta luusta (Seyedin et ai., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:119-123). Ihmisen (Derynck et ai., 1985, Nature 316:701-705), hiiren (Derynck et ai., 1986, J. Biol. Chem. 261:4377-4379) ja apinan (Sharpies et ai., 1987, DNA6:239-244) TGF-/S:a koodaavia 40 cDNA-klooneja on 2 97299 eristetty. Näiden kloonien DNA-sekvenssianalyysi osoittaa että TGF-βΙ syntetisoituu suurena prekursoripeptidinä, jonka karboksyylipää lohkeaa kypsän TGF-β -monomeerin tuottamiseksi. Kaikista yllämainituista lähteistä eristetyillä TGF-5 βΐ -prekursoriproteiineilla on havaittu olevan vahva sek-venssihomologia.

Kun läsnä on 10 %:a seerumia ja epidermaalista kasvutekijää, TGF-βΙ edistää normaalien rotan munuaisen fibroblastisolujen 10 ankkuroinnista riippumatonta kasvua (Roberts et ai., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:5339-5343; Roberts et ai., 1982, Nature 295:417-419; Twardzik et ai., 1985, J. Cell. Biochem. 28:289-297); mikäli läsnä on vain 10 %:a seerumia se kykenee indusoimaan AKR-2B -fibroblastisolujen pesäke-15 muodostusta (Tucker et ai., 1983, Cancer Res. 43:1518-1586). TGF-βΙίη on osoitettu myös aiheuttavan rotan sikiön lihasten mesenkymaalisolujen eriytymistä ja rustolle spesifisten makromolekyylien tuottoa (Seyedin et ai., 1986, J. Biol.

Chem. 261:5693-5695).

20

Vastoin sen solujen lisääntymistä edistävää vaikutusta ihmisen verihiutaleista puhdistetun TGF-βΙίη on osoitettu inhiboivan tiettyjen soluviljelmien kasvua (Trucker et ai., 1984, Science 226:705-707). TGF^l:n on myös osoitettu 25 inhiboivan useiden ihmisen syöpäsolulinjojen kasvua (Roberts et ai., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:119-123).

• Tämä TGF^l:n inhiboiva/stimuloiva vaikutus voi riippua useista tekijöistä kuten solutyypistä ja solujen fysiologisesta tilasta (katso katsausartikkelia Sporn et ai., 1986, 30 Science 233:532-534).

TGF-p2, kuten TGF^l:kin, on polypeptidi, jonka moolimassa ·· on 26 000 ja joka koostuu kahdesta identtisestä, disulfidi- sidoksella yhdistetystä 13 000 daltonin alayksiköstä (Chei-35 fetz et ai., 1987, Cell 48:409-415; Ikeda et ai., 1987,

Biochemistry 26:2406-2410). Se on eristetty naudan demine-ralisoidusta luusta (Seydin et ai., 1987, J. Biol. Chem. 262:1946-0949), sian verihiutaleista (Cheifetz et ai., 1987, 3 97299 48:409-415), Ihmisen eturauhasen adekarsinoomasolulinjasta PC-3 (Ikeda et ai., 1987, Biochemistry 26:2406-2410) ja ihmisen glioblastoomasolulinjasta (Wrann et ai., 1987, EMBO 6:1633-1636). Ihmisen ja apinan TGF-p2:ta koodaavia cDNA-5 klooneja on eristetty (Madisen et ai., 1988, DNA 7:1-8;

Webb et ai., 1988, DNA 7:493-497). Kypsä TGF-p2 -monomeeri lohkaistaan jommasta kummasta suuremmasta prekursoripolypep-tidistä, joiden mRNA:t voivat saada alkunsa differentiaalisen silmukoitumisen kautta (Webb et ai., 1988, DNA 7:493-10 497).

TGF-pl:llä ja TGF-p2:lla on 71 %:nen aminohappoyhtäläisyys niiden kypsillä alueilla ja 41 %:nen yhtäläisyys prekur-sorirakenteissa. TGF-p3:ssa, jonka aminohappojärjestys on 15 aivan äskettäin päätelty cDNA-klooneista, on ilmeisesti 112 aminohapon C-terminaalinen sekvenssi, joka on 80 %:sti homologinen kypsien TGF-βΙ - ja TGF-p2 -monomeerien kanssa (Dijke et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4715-4719). TGF-pi.2 on muodoltaan heterodimeerinen ja koostuu 20 disulfidisidoksilla yhdistetyistä βΐ- ja p2-alayksiköistä (Cheifetz et ai., 1987, Cell 48:409-415).

Ihmisestä, jyrsijöistä ja apinoista eristetyn TGF-pi:n prekursorialueen amino-osat ovat keskenään hyvin homologisia 25 (Derynck et ai., 1985, Nature 316:701-705; Derynck et ai., 1986, J. Biol; Chem. 216:4377-4379; Sharpies et ai., 1987, DNA 6:239-244), mikä viittaa siihen, että molekyylin tällä osalla voi olla tärkeä biologinen tehtävä. Äskettäiset tutkimukset, jotka osoittavat, että TGF-pi:n prekursorin 30 tämä osa on glykosyloitu ja fosforyloitu, tukee tätä väitettä, koska voidaan olettaa, että solu ei tee näitä sekundäärisiä muutoksia, ellei niillä ole erityistä tehtävää (Brunner et ai., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2229-2232). Nämä muutokset voivat olla tärkeitä prekursorin dimerisaatiolle 35 tai sen ohjaamiseksi ulos solusta. On todisteita siitä, että prekursorin glykosylaatio liittyy kypsän TGF-pi:n kuljetukseen ulos solusta (Purchio et ai., 1988; J. Biol. Chem. 263:14211-14215).

4 97299

On raportoitu aineista, jotka voidaan tulkita muokattavana oleviksi prekursorikomplekseiksi tai ilmentymisartefaktoiksi apinan TGF-βΙ -geeniä ilmentävissä CHO-soluissa (Gentry et ai., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:4162-4168 press; Gentry et 5 ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). Nämä tutkimukset paljastivat, että transfektoitujen CHO-solujen syntetisoima TGF-βΙ -prekursori koostuu pro-TGF-βΙ:stä, kypsästä TGF-βl:stä ja prekursorin pro-alueesta, jotka on yhdistetty disulfidisidoksilla toisiinsa. Vastaavia disulfidisidoksil-10 la yhdistettyjä prekursorikomplekseja on havaittu myös TGF-βΙ :n eristetyissä latenttimuodoissa (Miyazano et ai., 1988, J. Cell. Biochem. Suppl. 12(A):200; Wakefield et ai., 1987, J. Biol. Chem. Suppl. 11(A):46).

15 Gentry et ai. (Gentry et ai., 1988, Mol. Cell Biol., 8:4162-4168) ovat esittäneet seuraavan kaavion esi-pro-TGF^l:n muokkaukselle transfektoiduissa CHO-soluissa. (Aminohappojen järjestysnumerot, joihin viitataan, vastaavat julkaistua apinan TGF^l:n sekvenssiä (Sharpies et ai., 20 1987, DNA 6:239-244). Ehdotetun kaavion mukaan ensimmäisessä vaiheessa signaalipeptidi lohkaistaan Gly-29/Leu-30 -pep-tidisidoksen kohdalta. Tämä lohkaisu on mitä todennäköisimmin samanaikainen translaation kanssa ja tapahtuu prekursorin kulkiessa karkean endoplasmisen retikulumin läpi 25 (Blobel and Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol. 67:835-851; Walter et ai., 1984, Cell 38:5-8). Signaalipeptidin loh-kaisun jälkeen ytimen glykosylaatioyksiköt (Rothman et ai., 1978, Cell 15:1447-1454) liitetään pro-TGF-βΙ:een kolmeen ennustettuun N-glykosylaatiokohtaan, jotka sijaitsevat Asn-30 82:ssa, Asn-136:ssa ja Asn-176:ssa. Seuraavaksi ydingly- kosyloitua pro-TGF-βΙ:a muokataan vaiheittain Golgin laitteen läpikulun aikana, jolloin saadaan fosforyloitu glyko-proteiini, joka sisältää monimutkaisia sialoituja oligosakkarideja. Synteesin tai läpikulun jossain vaiheessa tapahtuu 35 proteolyyttinen lohkaisu kaksiemäksisen jäännöksen kohdalta ja disulfidi-isomeraatio, minkä seurauksena vapautuu kypsää TGF^l:tä.

5 97299

Toisessa äskettäisessä tutkimuksessa identifioitiin mannoosi- 6-fosfaattia prekursori-TGF-βΙ:ssä. Mannoosi-6-fosfaatti, fosforoitu sokerianalogi näyttää olevan perustavanlaatuisen tärkeä lysosomaalisten entsyymien kohdistetussa kuljetuksessa 5 ja solujen välisessä vaihdossa (von Figura, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55:167-193). On identifioitu erityisiä reseptoreita, jotka tunnistavat lysosomaalisten entsyymien mannoosi-6-fosfaatti jäännökset ja jotka ovat kuljetusjärjestelmän olennaisia osia. Käsitellystä kudossoluviljelmäalustasta on identi-10 fioitu mannoosi-6-fosfaattia sisältäviä eriytettyjä lysoso- maalisia proteiineja (Gal and Gottesman, 1986, J. Biol. Chem. 261:1760-1765; Capony et ai., 1981, J. Cell. Biol. 104:253-262; Baumbach et ai., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:-2985-2989; Sahagian and Gottesman, 1982, J. Biol. Chem. 257:-15 11145-11150) . On mahdollista, että prekursori-TGF-01:n man noosi- 6-fosfaatti jäännökset voivat ohjata TGF-/3l:n lysosomei-hin proteolyyttistä muokkausta varten, jolloin saadaan kypsää TGF-/3l:tä. Vaihtoehtoisesti mannoosi-6-fosfaatti jäännökset voivat ohjata lohkaistun TGF-/3l:n prekursorin lysosomeihin 20 hajottamista varten.

Tämä keksintö koskee uuden kimeerisen TGF-01//32:ksi nimetyn TGF-)8:n suurimittaista valmistusta eukarioottisilla isän-täsoluilla, jotka on transfektoitu TGF-01/|S2:n prekursoria 25 koodaavan sekvenssin ja sen ilmentymistä sääteleviä osia sisältävillä yhdistelmä-DNA-vektoreilla. Apinan TGF-01:n cDNA:-ta (Sharpies et ai., 1987, DNA 6:239-244) muunnettiin siten, että nukleotidit, jotka koodaavat kypsän TGF-j8l-sekvenssin aminohappojäännöksiä 9-13, 17, 19, 25 ja 26 vaihdettiin kyp-30 sän TGF-/32:n rakenteessa vastaavia aminohappoja koodaaviksi nukleotideiksi. Apinan kodonikäytäntö säilytettiin.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

35

Konstruoitiin kimeerisen TGF-1/P2:n prekursoria koodaavia ilmentymisvektoreita, jotka olivat simianvirus 40:n ilmentymistä säätelevien osien säätelyn alaisia ja niitä käytettiin 1 kiinalaisen hamsterin munasolujen (CHO) transfektoin- 40 6 97299 tiin. Saatiin CHO-transfektantteja, jotka syntetoivat ja erittävät suuria määriä kypsää TGF-pi/p2:ta. Vahvistettiin TGF-pi/p2:n ilmentymistä metotreksaatilla ja vahvistetut transfektantit erittivät kypsää TGF-pl/^2:ta jopa 1 mg/L.

5 CHO-transfektanttien käsitellyn alustan happokäsittelyn seurauksena saatiin maksimaalinen määrä bioaktiivista TGF-pi/p2:ta. Otaksutaan, että transfektoitujen CHO-solujen erittämä suuri kypsän Τ0Γ-β1/β2:η määrä johtuu kimeerisen prekursoriproteiinin epätavallisen tehokkaasta proteolyyt-10 tisestä muokkauksesta. Kohonnut muokkaustehokkuus voi puolestaan johtua rakenteellisista ominaisuuksista, joihin vaikuttaa hakijoiden tekemä TGF^lrn ja TGF^2:n aminohappo-sekvenssi, joiden tekemä TGF-βΙίη ja TGF^2:n aminohappo-sekvenssien yhdistelmä kypsän TGF^rn aminoterminaalisessa 15 alueessa.

Kuvio 1. Ilmentymisplasmidi p5p/dhfr:n koodaama nukleotidi-järjestys ja hybridiproteiini Τ6Γ-β1/β2:η päätelty aminohappojärjestys.

20

Kuvio 2. 5β41,2.5-solujen käsiteltyjen alustojen bioaktii-visuus. Bioaktiivisuus mitattiin minkin keuhkon epiteelisolujen CCL-64 kasvun inhibitioon perustuvalla määritysmenetelmällä. (A) seerumivapailla 5β41,2.5-soluilla 24 25 tunnin ajan käsiteltyjä alustoja dialysoitiin 0.2 M etik- kahappoa vastaan ja määritys tehtiin kuten kohdassa 6.1.3., infrakuvataan. (B) TGF^lrn aiheuttaman kasvuinhibition standardikäyrä.

30 Kuvio 3. 5β41,2.5-solujen erittämien proteiinien immuno-blot-analyysi. 5β41,2.5-solut kasvatettiin konfluenssiin; alustoja dialysoitiin 0.2 M etikkahappoa vastaan ja määritys • tehtiin immunoblotting-menetelmällä ei-pelkistävissä (kaista 1) tai pelkistävissä (kaista 2) olosuhteissa anti-TGF^l35g_ 35 3gi:llä kuten kohdassa 6.1.5., infrakuvataan.

Tämä keksintö koskee Τ6Ρ-β1/β2:ta, TGF^l/^2:ta ja TGF-β1/β2:η prekursoria koodaavaa nukleotidisekvenssiä ja TGF- : iHit Kiiti m i-M : .

7 97299 β1/β2:η valmistusta yhdistelmä-DNA-menetelmillä. ΤΘΓ-β1/β2, uusi kimeerinen transformoiva beta-kasvutekijä, on biologisesti aktiivinen standardikokeissa, joita käytetään mitattaessa ΤΘΡ-β1/β2:η bioaktiivisuutta ja se on immunoreaktii-5 vinen TGF^l:lle spesifisten vasta-aineiden kanssa. TGF-β1:η ja ΤβΡ-β2:η aminohapposekvenssien yhdistelmästä koostuvalla kimeerisellä rakentella, keksinnön mukaisella TGF-β1/β2:1ΐ3 on todennäköisesti uusia biologisia aktiivisuuksia, joista jotkut voivat olla samanlaisia tai lähes ident-10 tisiä kuin sen äitimolekyyleiliä, kun taas jotkut saattavat olla Τ0Ρ-β1/β2:η ainutlaatuisia aktiivisuuksia. Mitä tulee niihin bioaktiivisuuksiin, jotka ovat samanlaisia tai lähes identtisiä kuin TGF-βΐΓη ja TGF^2:n bioaktiivisuudet, tämä uusi tekijä voi tarjota tehokkaamman keinon kyseisten bio-15 logisten vasteiden indusointiin ja sen käyttö voi siksi olla toivottava vaihtoehto ΤβΡ-β1:η ja TGF^2:n käytölle erilaisissa TGF^:lle ajatelluissa lääketieteellisissä sovelluksissa. Tällaisiin sovelluksiin kuuluvat solujen lisääntymisen ja eriytymisen indusointi ja kiihdytys ja 20 solun jakautumisen inhibitio, mutta sovellukset eivät rajoitu näihin. Siten ΤβΡ-β1/β2:ΐβ voidaan käyttää esimerkiksi syövän hoitoon ja edistämään haavojen paranemista.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan pelkästään kuvausta 25 varten jakaa seuraaviin vaiheisiin: (a) koodijärjestyksen luominen ΤβΡ-β1/β2:η prekursorille; (b) TGF^l/^2:ta koo-* daavan sekvenssin ilmentymistä ohjaavan ilmentymisvektorin konstruointi; (c) sopivien replikoitumaan, geenin ilmentämiseen ja kypsää τσΡ-β1/β2:ΐ3 ja/tai ΤβΡ-β1/β2:η prekur-30 soreita geenituotetta muokkaamalla tuottamaan pystyvien isäntäsolujen transfektio ja (d) Τ6Γ-β1/β2:η prekursorien ja kypsän, biologisesti aktiivisen ΤβΓ-β1/β2:η identifi-“ kaatio ja puhdistus. 1

Kun transfektantti, joka ilmentää suuria määriä ΤβΓ-β1/β2:η prekursoreita ja/tai kypsää τσΡ-β1/β2:ta, on identifoitu, keksinnön mukaiseen menetelmään kuuluu tämän kloonin kas-.. vattaminen ja ilmennetyn geenituotteen eristys.

97299 8

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan tässä esimerkein, joissa apinan TGF-pi:n prekursorin cDNArta (Sharpies et ai., 1987; DNA 6:239-244) muunnetaan siten, että apinan kypsän TGF-βΙ-sekvenssin aminohappojäännöksiä 9-13, 17, 19, 5 25 ja 26 koodaavat nukletodit vaihdetaan nukleotideiksi, jotka koodaavat vastaavia aminohappoja kypsän TGF-p2:n rakentessa, samalla kun apinan kodonikäytäntö säilyy. Saatua kimeerisen TGF-pl/p2:n prekursorin koodijärjestystä käytetään sen jälkeen kypsän TGF-pi/p2-tuotteen synteesiä 10 ohjaamaan kykenevien ilmentymisvektoreiden konstruointiin.

Keksinnön mukaisen menetelmän eri puolia on kuvattu yksityiskohtaisemmin seuraavissa alakohdissa ja niitä seuraa-vissa esimerkeissä.

15

Kuviossa 1 on esitetty kimeeristä TGF-pi/p2:ta koodaava nukleotidijärjestys. Keksinnön mukaisen menetelmän toteutuksessa tätä nukleotidijärjestystä tai sen toiminnallista vastinetta voidaan käyttää luomaan yhdistelmämolekyylejä, 20 jotka suuntaavat TGF-pi/p2-tuotteen ilmentymistä. Johtuen nukleotidikoodien päällekkäisyydestä keksinnön mukaisen menetelmän toteutuksessa voidaan käyttää muita DNA-sekvens-sejä kuten kuviossa 1 on esitetty. Tällaisiin kuvion 1 mukaisen nukleotidijärjestyksen muutoksin kuuluvat eri nuk-25 leotidijäännösten poistot, lisäykset tai korvaukset, jotka johtavat samaa tai toiminnallisesti vastaavaa geenituotetta koodaavaan jaksoon. Geenituotteessa voi olla aminohappo-jäännösten häivämiä, lisäyksiä tai korvauksia, jotka johtavat hiljaiseen muutokseen ja siten bioaktiiviseen tuot-30 teeseen. Tällaisia aminohappojen korvauksia voidaan tehdä perustuen kyseisten jäännösten polaarisuuden, varauksen, liukoisuuden, hydrofobisuuden, hydrofiilisyyden ja/tai amfipaattisen luonteen yhtäläisyyteen. Esimerkiksi negatii-" visesti varautuneisiin aminohappoihin kuuluvat asparagiini- 35 happo ja glutamiinihappo; positiivisesti varautuneisiin lysiini ja arginiini; aminohappoihin, joissa on varautumat-tomia polaarisia pääteryhmiä tai ei-polaarisia pääteryymiä, joilla on yhtäläiset hydrofiilisyysarvot, kuuluvat seuraavat 9 97299 hapot: leusiini, isoleusiini, väliini; glysiini, alaniini; asparagiini, glutamiini, seriini, treoniini; fenylaniini, tyrosiini.

5 Apinan TGF-pl:n nukleotidisekvenssi voidaan saada apina- solulähteistä (Sharpies et ai., 1989, DNA 6:239-244). Kuvion 1 mukaisen kimeerisen TGF-pi/p2:n nukleotidijärjestys voidaan valmistaa alalla tunnetuilla menetelmillä, joihin kuuluvat, nähin kuitenkaan rajoittumatta, DNA-restriktioent-10 syymien, synteettisten oligonukleotidien, ja DNA-ligaasien käyttö. Vaihtoehtoisesti kuvion 1 mukainen koodijakso voidaan syntetoida kokonaan tai osittain käyttäen alalla hyvin tunnettuja kemiallisia menetelmiä.

15 Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa apinan TGF-pi:n koodisekvenssi saatiin täysipituisesta cDNA-kloonista, joka oli saatu afrikkalaisen vihreän apinan solulinjasta BSC-40 (Sharpies et ai., 1987, supra). Kuviossa 1 esitetty kimeerisen TGF-pi/p2:n koodijärjestys johdettiin sitten 20 apinan TGF-pi:n cDNArsta poistamalla kypsän TGF-βΙ-molekyylin aminohappojäännösten 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 ja 26 koodisekvenssit ja korvaamalla ne kypsän TGF-p2-mo-lekyylin aminohappojäännösten 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 ja 26 koodisekvensseillä (Madisen et ai., 1988, DNA 7:1-25 8) geeninrakennusmenetelmiä käyttäen.

Biologisesti aktiivisen, kypsän TGF-pi/p2:n ilmentämiseksi täytyy valita ilmentymisvektori/isäntäjärjestelmä, jonka avulla on mahdollista saada ei ainoastaan suuria määriä 30 transkriptio- ja translaatiotuotteita, vaan myös geenituotteen virheetön muokkaus. Tämä on erityisen tärkeää jos käytetään kimeerisen TGF-pi/p2:n prekursorin kokonaista koodijärjestystä ilmentymiskonstruktioita rakennettaessa, koska kypsän kimeerisen TGF-pi/p2:n otaksutaan TGF-pi:n 35 ja TGF-p2:n tavoin vapautuvan prekursorimolekyylistä tai -molekyylikompleksista solun muokkaustoimintojen välityksellä. Lisäksi ilmentymis/isäntäsolujärjestelmä, jonka avulla tuote saadaan erittymään voi olla toivottava.

10 97299

Erityisesti näyttää siltä, että kypsä TGF-pi/p2 on disul-fidisidoksin yhdistetty, 112 aminohappoa alayksikköä kohti sisältävä homodimeeri, joka on muodostunut solun muokkaus-toimintojen välityksellä, joiden oletetaan olevan saman-5 laisia kuin kypsän TGF-βΙίη ja TGF-p2:n muodostavat toiminnot. TGF-pi/p2:n prekursorilla on kolme mahdollista N-gly-kosylaatiokohtaa sen pro-alueella (Sharpies et ai., 1987, DNA 6:239-244). TGF-pi/p2:llä tehdyt tutkimukset ovat osoittaneet, että transfektoiduissa CHO-soluissa tapahtuu TGF-10 β1:η pro-alueen N-glykosylaatiota ja fosforylaatiota viitaten prekursorin tärkeään toiminnalliseen merkitykseen kypsän molekyylin solusynteesissä ja vapauttamisessa tai erittämisessä (Brunner et ai., 1988, Mol. Cell. Biol. 8:2229-2232). Mannoosi-6-fosfaatin läsnäolo Τ0Ρ-β1/β2:η 15 prekursorissa tukee myös oletusta, jonka mukaan prekursorilla on riippumatonta toiminnallista aktiivisuutta (Purchio et ai., 1988, J. Biol. Chem. 263:14211-14215). Koska ki-meerisen Τ0Γ-β1/β2:η prekursori sisältää apinan TGF-81/82:n pro-alueen, hakijoiden mielestä on todennäköistä, että TGF-20 β1/β2:η prekursori on toiminnallisesti aktiivinen ja tärkeä kypsän Τ6Γ-β1/β2:η molekyylin virheetöntä muokkausta ajatellen. Ilmentymisjärjestelmässä käytetyn isäntäsolun kyky ilmentää ja muokata virheettömästi kimeeristä Τ0Γ-β1/β2:ΐ3 on siten tärkeä ominaisuus kypsän, bioaktiivisen tuotteen 25 valmistuksen kannalta.

Tässä kuvatussa keksinnön erityisessä suoritusmuodossa kypsää, bioaktiivista TGF^l/^2:ta tuotetaan menestyksellisesti käyttäen simianvirus 40:n (SV40) ilmentymistä sää-30 televiä osia kiinalaisen hamsterin munasolujen (CH0) isän-täsolujärjestelmässä. Taitava alan asiantuntija voi kuitenkin käyttää yhtä hyvin erilaisia muita eläinisäntä/ilmen-‘ tymisvektorijärjestelmiä (toisin sanoen vektoreita, joissa on tarpeelliset osat Τ6Ρ-β1/β2:η koodijärjestyksen replikaa-35 tion, kopioinnin ja luennan ohjaamiseksi sopivassa isäntä-solussa). Näihin kuuluvat, tässä mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, virusilmentymisvektori/nisäkäsisäntäsolu-. järjestelmät (esimerkiksi sytomegalovirus, vacciniavirus.

11 97299 adenovirus ja vastaavat); hyönteisvirusilmentymisvektori/ -hyönteissolujärjestelmät (esimerkiksi baculovirus); tai ei-viraalit promoottori-ilmentymisjärjestelmät, jotka on johdettu nisäkässolujen genomeista (esimerkiksi hiiren 5 metallotioneiinipromoottori).

Näiden vektorien ilmentymiselementit vaihtelevat voimakkuuksiltaan ja erityisominaisuuksiltaan. Riippuen käytetystä isäntä/vektorijärjestelmästä mitä tahansa useista sopivista 10 transkriptio- ja translaatioelementeistä voidaan käyttää.

Esimerkiksi nisäkässolujärjestelmissä kloonattaessa voidaan käyttää promoottoreita, jotka on eristetty nisäkässolujen genomista (esimerkiksi hiiren metallotioneiinipromoottori) tai näissä soluissa kasvavista viruksista (esimerkiksi 15 vacciniaviruksen 7.5K-promoottori). On mahdollista käyttää myös yhdistelmä-DNA-tekniikoilla tai synteettisillä menetelmillä tuotettuja promoottoreita lisättyjen sekvenssien transkription aikaansaamiseksi.

20 Spesifiset aloitussignaalit ovat myös tarpeellisia lisättyjen proteiinia koodaavien sekvenssien riittävää luentaa ajatellen. Näihin signaaleihin kuuluvat aloituskodoni ATG ja sen viereiset sekvenssit. Esimerkiksi tapauksissa, joissa ainoastaan osa TGF-pi/p2:n koodijärjestystä on insertoitu, 25 mukana täytyy olla ulkoisia luennan säätelysignaaleja aloituskodoni ATG mukaan lukien. Lisäksi aloituskodoni pitää olla samassa vaiheessa TGF-pi/p2:n koodijaksojen lukukehyksen kanssa koko insertin luennan varmistamiseksi. Nämä ulkoiset luennan säätelysignaalit ja aloituskodonit voivat 30 olla peräisin erilaisista, sekä luonnollisista että synteettisistä lähteistä. Ilmentymisen tehokkuutta voidaan kasvattaa liittämällä mukaan kopiointia vaimentavia sekvenssejä, “ voimistusosia tai vastaavia. 1

Mitä tahansa edellä kuvattua menetelmää, joilla lisätään DNA-fragmentteja vektoriin, voidaan käyttää rakennettaessa TGF-pi/p2:n koodisekvenssin ja sopivat kopiointia/luentaa säätelevät signaalit sisältäviä ilmentymisvektoreita. Näihin 12 97299 menetelmiin voi kuulua in vitro -yhdistelmä-DNA-tekniikoita, synteettisiä tekniikoita ja in vivo -yhdistelyjä (geneettinen yhdistely).

5 Tapauksissa, joissa adenovirusta käytetään ilmentymisvektorina, TGF-pi/p2:n koodisekvenssi voidaan ligatoida ade-noviruksen kopiointia/luentaa säätelevään kompleksiin, esimerkiksi myöhäiseen promoottoriin ja kolmiosaiseen joh-tosekvenssiin. Tämä kimeerinen geeni voidaan sitten lisätä 10 adenoviruksen genomiin in vitro - tai in vivo -yhdistelyllä. Insertio virusgenomin epäolennaiselle alueelle (esimerkiksi alueelle El tai E3) johtaa siihen, että yhdistelmävirus on elinkykyinen ja kykenee ilmentämään kimeerisen TGF-pi/p2:n infektoiduissa isännissä. Vastaavasti voidaan käyttää vac-15 cinia-7.5K-promoottoria.

Vaihtoehtoinen ilmentymisjärjestelmä, jota voidaan käyttää TGF-pi/p2:n ilmentämiseen on hyönteisjärjestelmä. Eräässä tällaisessa järjestelmässä Autographa californican nukleaari-20 nen polyhedroosivirus (AcNPV) käytetään vektorina ilmentämään vieraita geenejä. Virus kasvaa Spodoptera frugiperda -soluissa. TGF-pi/p2:n koodijärjestys voidaan kloonata viruksen epäolennaisille alueille (esimerkiksi polyhedriinigee-niin) ja asettaa AcNPV:n promoottorin (esimerkiksi poly-25 hedriinipromoottorin) säätelyn alaiseksi. TGF-pi/p2:ta koodaavan sekvenssin onnistuneen insertion seurauksena polyhedriinigeeni inaktivoituu ja muodostuu kuoretonta yhdiselmävirusta (toisin sanoen virusta, jolta puuttuu polyhedriinigeenin koodaama proteiinikuori). Näitä yhdis-30 telmäviruksia käytetään sitten infektoimaan Spodoptera frugiperda -soluja, joissa lisätty geeni ilmentyy.

Lisäksi voidaan valita isäntäsolulaji, joka moduloi lisättyjen sekvenssien ilmentymistä, tai muuntelee ja muokkaa 35 geenituotetta halutulla erityisellä tavalla. Ilmentymistä joistakin promoottoreista lähtien voidaan parantaa tiettyjen indusoijien läsnäololla (esimerkiksi sinkki- ja kad-miumioneilla metallotioneiinipromoottoreiden ollessa ky- • · 97 299 13 seessä). Sen vuoksi geenitekniikalla valmistetun TGF-pi/p2:n ilmentymistä voidaan säädellä. Tämä on tärkeää silloin, kun kloonatun vieraan geenin proteiinituote on isäntäsolulle letaali. Lisäksi luennan jälkeiset muutokset kuten glyko-5 sylaatio ja muokkaustapahtumat kuten proteiinituotteen proteolyyttinen lohkaisu voivat olla tärkeitä proteiinin toiminnallisuudelle. Eri isäntäsoluilla on luonteenomaisia ja spesifisiä proteiinien translaation jälkeisiä muokkaus-ja muuntomekanismeja. Sopiva solulinja tai isäntäjärjes-10 telmä voidaan valita ilmennetyn vieraan proteiinin virheettömän muuntamisen ja muokkauksen varmistamiseksi.

Keksinnön erityisessä suoritusmuodossa rakennetaan ilmen-tymisvektori, jossa TGF-pi/p2:n koodisekvenssi ja hiiren 15 dihydrofolaattireduktaasigeeni (dhfr) ovat peräkkäin ja SV40:n säätelysekvenssien alaisina, ja jota käytetään trans-fektoimaan CHO-soluja, joista dhfr puuttuu. Dhfr-fenotyyppiä ilmentäviä CHO-transfektantteja eristetään kasvattamalla niitä selektiivisessä alustassa. TGF-pi/p2:n ilmentymistason 20 kohottamiseksi transfektantteja voidaan asettaa alttiiksi kasvaville metotreksaattikonsentraatioille, jotta voitaisiin eristää klooneja, jotka kopioivat TGF-pi/p2:n mRNArta entistä enemmän. TGF-pi/p2:n mRNA-taso voidaan määrittää amplifikaation eri vaiheissa liuoshybridisaation avulla 25 (Uhler et ai., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:1300-1304).

Isäntäsolut, jotka sisältävät TGF-pi/p2:n koodijärjestyksen ja jotka ilmentävät biologisesti aktiivista, kypsää tuotet-30 ta, voidaan identifioida ainakin neljällä yleisellä tavalla: (a) DNA-DNA hybridisaatiolla; (b) "marker"-geenin toiminnallisuudella tai toimimattomuudella; (c) määrittämällä ko-piointitaso mitattuna TGF-pi/p2:n mRNA-kopioiden ilmentymisenä isäntäsoluissa ja (d) kypsän geenituotteen detektointi 35 käyttäen mittaukseen immunomääritysmenetelmää ja viime kädessä sen biologisiin aktiivisuuksiin perustuen.

14 97299

Ensimmäisessä lähestymistavassa ilmentymisvektoriin lisätyn TGF-pi/p2:n koodisekvenssin läsnäolo voidaan havaita DNA-DNA -hybridisaation avulla käyttämällä koettimia, joiden sisältämät nukleotidijärjestykset ovat olennaisesti homo-5 logisia TGF-pi/p2:n kuviossa 1 esitetyn koodijärjestyksen kanssa tai niiden osia tai johdannaisia.

Toisen lähestymistavan mukaan yhdistelmäilmentymisvektori/ -isäntä -järjestelmä voidaan identifioida ja valikoida tiet-10 tyjen "marker"-geenien toiminnallisuuden tai toimimattomuuden (esimerkiksi tymidiinikinaasiaktiivisuuden, antibioottiresistenssin, metotreksaattiresistenssin, transfor-maatiofenotyypin, baculoviruksen okkluusiorakenteen muodostumisen jne.) perusteella. Jos TGF-pi/p2:n koodijakso on 15 insertoitu esimerkiksi vektorin marker-geenisekvenssiin, TGF-pi/p2:n koodijakson sisältävät rekombinantit voidaan havaita marker-geenin toimimattomuuden perusteella. Vaihtoehtoisesti marker-geeni voidaan sijoittaa peräkkäin TGF-pl/p2 -sekvenssin kanssa saman tai eri promoottorin säätelyn 20 alaiseksi. Marker-geenin ilmentyminen induktion tai valinnan vasteena viittaa TGF-pi/p2:n koodisekvenssin ilmentymiseen.

Kolmannessa lähestymistavassa TGF-pi/p2:ta koodaavan alueen 25 kopioitumisaktiivisuus voidaan määrittää hybridisaatioko-keilla. Polyadenyloitu RNA voidaan erimerkiksi eristää ja analysoida Northern-blot -menetelmän avulla käyttäen koetin-ta, joka on homologinen TGF-pi/p2:n koodijärjestyksen tai sen erityisten osien kanssa. Vaihtoehtoisesti isäntäsolun 30 kaikki nukleiinihapot voidaan ekstrahoida ja määrittää niiden hybridisaatio tällaisten koettimien kanssa.

Neljännessä lähestymistavassa kypsän proteiinituotteen ilmentyminen voidaan määrittää immunologisesti esimerkiksi 35 Western-blot -menetelmällä, immunomääritysmenetelmillä immunoblotting -menetelmällä, radioimmunosaostuksella, entsyymien käyttöön perustuvilla immunomenetelmillä ja vastaavilla menetelmillä. Ilmentymisjärjestelmän onnistunei- 15 97299 suuden lopullinen testi on kuitenkin biologisesti aktiivisen TGF-pi/p2 -geenituotteen havaitseminen. Mikäli isäntäsolu erittää geenituotetta, voidaan transfektoitujen isäntäsolu jen viljelmästä saadusta soluvapaasta alustasta määrit-5 tää TGF-pi/p2 -aktiivisuus. Jos geenituote ei erity, solu-lysaatien aktiivisuus voidaan määrittää. Kummassakin tapauksessa voidaan käyttää biologisia määritysmenetelmiä kuten tässä kuvattua kasvun inhibitiokoetta tai vastaavia.

10 Kun suuria määriä kypsää TGF^l/p2:ta tuottava klooni on identifioitu, sitä voidaan kasvattaa ja TGF-pi/p2 voidaan puhdistaa alalla hyvin tunnettuja tekniikoita käyttäen. Tällaisiin menetelmiin kuuluvat immunoaffiniteettipuhdis-tus, kromatograafiset menetelmät kuten suuren erotuskyvyn 15 nestekromatografia ja vastaavat menetelmät.

Esimerkki

Konstruoitiin TGF-pi:n prekursoria koodaava yhdistelmäplas-midi, jossa kypsän TGF-βΙ -sekvenssin aminohapot 9, 10, 20 11, 12, 13, 17, 19, 25 ja 26 oli korvattu kypsän TGF-p2 -sekvenssin vastaavilla aminohapoilla. Erityisesti kypsän TGF-βΙίη aminohappo 9 (seriini) korvattiin arginiinilla, aminohappo numero 10 (seriini) korvattiin asparagiinilla, aminohappo numero 11 (treoniini) korvattiin valiinilla, 25 aminohappo numero 12 (glutamiinihappo) korvattiin gluta-miinilla, aminohappo numero 13 (lysiini) korvattiin aspa-ragiinihapolla, aminohappo numero 17 (väliini) korvattiin leusiinilla, aminohappo numero 19 (glutamiini) korvattiin proliinilla, aminohappo numero 25 (argiini) korvattiin 30 lysiinillä ja aminohappo numero 26 (lysiini) korvattiin arginiinilla. Konstruktiota käytettiin CHO-solujen trans-fektointiin. Transfektantit, jotka tuottivat ja erittivät kypsää bioaktiivista kimeeristä Τ6Ρ-β1/β2:ta, eristettiin. 1

Noin 24 tunnin kuluttua sen jälkeen, kun 10^ dhfr-vajauksel-lista CHO-solua oli siirrostettu 100 mm maljoille, viljelmät transfektoitiin 1 pg:lla Ndel-linearisoitua ρδβ/άϊιίΓ-ρΙββ-midia ja 19 pg:lla kantajana käytettyä kalsiumfosfaattisaos- 16 97299 tumamuodossa olevaa vasikan kilpirauhasen DNA:ta (Wigler, M., et ai., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1373-1376). 20 pg plasmidia ja kantaja-DNA:ta lisättiin nopeasti 1 ml:aan 250 mM:sta steriiliä CaCl2:ta. DNA-liuos (1 ml) 5 lisättiin tipoittain 1 ml:n annokseen kuplivaa 2X HEPES- liuosta (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1.5 mM natriumfosfaatti, pH 7) ja seoksen annettiin olla jäähauteessa 30 minuuttia. Sitten sakka dispersoitiin tipoittain solujen päälle 10 ml:aan F12-alustaa (Gibco). Neljän tunnin inkuboinnin (37°C) 10 jälkeen alusta poistettiin ja korvattiin 10 ml:11a 25 % glyserolia sisältävää F12-alustaa 90 sekunnin ajaksi huoneenlämmössä. Soluja huuhdeltiin kerran 20 ml:11a F12-alus-taa ja inkuboitiin epäselektiivisellä alustalla (20 ml) vielä 48 tunnin ajan. Dhfr:a ilmentävien transfektanttien 15 valinta tehtiin korvaamalla alusta DMEM:llä, jota oli täydennetty 10 %:lla dialysoitua FBS:ä (Gibco) ja 150 pg:lla/ml L-proliinia. Pesäkkeitä havaittiin sen jälkeen, kun soluja oli kasvatettu 10-14 päivää selektioalustalla.

20 Dihydrofolaattireduktaasin (dhfr) tuoton suhteen vahvistetut solut johdettiin primääritransfektanteista oleellisesti aiemmin kuvattuun tapaan (Gasser, C. S. and Schimke, R; T;, 1986, J. Biol. Chem. 261:6938-6946). Kasvatuksen jälkeen 105 solua siirrostettiin 100 mm:n maljoihin ja adaptoitiin 25 kasvaviin metotreksaattikonsentraatioihin (100 nM; 500 nM; 2 500 nM; 10 000 nM; 20 000 nM). Metotreksaatin alkukon-sentraatio oli 100 nM. Maljaa, jolla oli näkyviä pesäkkeitä, käsiteltiin trypsiinillä ja adaptoitiin kyseiseen metotreksaatin konsentraatioon vielä ainakin kahden 1:5 solu-30 kierron ajan. Sitten solut (10^) siirrostettiin 100 mm:n maljoille, joissa metotreksaatin konsentraatio oli seuraa-vaksi suurempi. Maljaa, jolla oli näkyviä pesäkkeitä, kä-* siteltiin jälleen trypsiinillä ja adaptoitiin metotreksaat- tia sisältävässä alustassa. Solut jäädytettiin amplifikaa-35 tion eri vaiheissa alustassa, joka sisälsi 40 % FBS:ää, 10 % dimetylsulfoksidia ja 50 % DMEM:ää. Jäädytysalustassa ei ollut metotreksaattia.

17 97299

Minkin keuhkon epiteelisoluja, Mv 1 Lu (saantinumero CCL-64, amerikkalainen tyyppiviljelmäkokoelma), jotka ovat erittäin herkkiä TGF-8:lle, käytettiin kasvuinhibitioko-keessa. Koe tehtiin käyttäen 5')-jodo-2'-deoksiuridii-5 nia (^-^^IdU) DNA-synteesin määrittämiseksi. Yksikköaktii-visuudeksi määriteltiin se määrä, joka tarvittiin inhiboimaan 50 %:sesti *2i>IdU:n liittymistä käsittelemättömiin CCL-64 -soluihin verrattuna.

10 Tutkittaessa transfektoituneiden solujen aktiivin TGF- β1/β2:η eritystä, kerättiin seerumivapaita supernatantteja yhdestä 24 tunnin keräyksestä täyteen kasvaneilta soluviljelmiltä ja dialysoitiin pitkään 0.2 M etikkahappoa vastaan. Näytteet laimennettiin steriiliin täydelliseen viljelyalus-15 taan määritystä varten.

Peptidit syntetisoitiin kiinteäfaasitekniikoilla Beckman 990 -laitteella ja lohkaistiin hartsista aiemmin kuvattuun tapaan (Gentry, L; E., et ai., 1983, J. Biol. Chem.

20 258:11219-11228; Gentry, L; E;, and Lawton, A;, 1986, Viro logy 152:421-431). Puhdistus vietiin päätökseen käyttäen preparatiivista korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa. Peptidien koostumus vahvistettiin aminohappoanalyysillä.

25 Synteettiset peptidit konjugoitiin naudan gammaglobuliiniin kysteiinijäännöksen kautta. Kytkentäreaktiot tehtiin oleellisesti edellä kuvattuun tapaan (Gentry and Lawton, 1986, supra). Peptidikonjugaatioiden hyötysuhde vaihteli 8:sta 26:een kovalenttisesti sitoutunutta peptidimolekyyliä gam-30 maglobuliinimolekyyliä kohden.

Uuden Seelannin valkoisiin kaniineihin tehtiin kolmesta kuuteen kohtaan yhdistettyjä ihonalaisia ja -sisäisiä siirroksia Freundin täydelliseen adjuvanttiin emulsoiduilla 35 peptidikonjugaateilla (100 pg peptidiekvivalenttia). Tehos-tesiirroksia tehtiin 2-3 viikon välein. Verinäytteitä otettiin 7-14:n päivän kuluttua tehostesiirroksesta.

18 97299 TGF-βΙ -molekyylin peptidisekvenssejä vastaan suunnattuja antipeptidivasta-aineita tuotettiin kaniineissa käyttäen synteettisiä peptideitä immunogeeneinä (Gentry et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). Yksi vasta-aine (anti-TGF-5 0^369-381^ suunnattiin TGF-β -kasvutekijän kypsän muodon epitooppeja vastaan. Kaksi muuta vasta-ainetta (anti-TGF-βΙβΐ-94 ja anti-TGF^l225-236^ ovat prekursorispesifisiä ja ne on suunnattu peptidisekvenssejä vastaan, joita on ainoastaan TGF^l:n prekursorimolekyylissä.

10

Proteiinit fraktioitiin SDS-polyakrylamidigeeleillä 7.5 % - 17.5 % gradientissa ja siirrettiin modifioimattomaan nitroselluloosaan (0.45 pm; Schleicher ja Schuell) 1 tunniksi 24 V jännitteeseen 4°C:ssa (Burnette, W; N;, 1981, 15 Anal. Biochem. 112:195-203). Nitroselluloosan ylimääräinen sidontakapasiteetti estettiin inkuboimalla 2.5 %:sella BL0TT0:lla (Johnson, D. A., et ai., 1984, Gene Anal. Techn. 1:3-8) fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), joka sisälsi 0.2 % NP-40:tä. Suhteessa 1:75 2.5 %:seen 20 BLOTTO:oon laimennettua kaniinin antiseerumia ja käsiteltyjä nitroselluloosa-arkkeja inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lämmössä. Sen jälkeen kun ylimääräinen vasta-aine oli pesty pois viidellä 5 minuutin pesulla 2.5 %:ssa BLOTTO:ssa nitroselluloosa-arkkeja inkuboitiin alkalisen fosfataasikon-25 jugoidun A-proteiinin suhteessa 1:500 2.5 %:seen BLOTTO:oon tehdyssä laimennoksessa. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen nitroselluloosa-arkit pestiin viiteen kertaan (viiden minuutin pesut) PBS:ssä, jossa oli 0.2 % NP-40:ää ja kehitettiin (Leary et ai., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA.

30 80:4045-4049.

; Kimeerisen TGF~81/82 -proteiinin synteesiä ohjelmoiva plas- midi ρδβ/dhfr rakennettiin seuraavasti: pAc373:sta johdettua baculovirusvektoria ρΑσβΤΘΓ-Ι (Miyamoto et ai., 1985, Mol.

35 Cell. Biol. 5:2860-2865; Madisen et ai., 1987, Virology 158:248-250), joka sisältää τσκ-β1:η 1.4 Ke:n Pstl-EcoRi koodisekvenssin (Sharpies et ai., 1987, DNA 6:239-244) . kloonattuna pAc611:n Pstl-EcoRI -kohtaan (Miyamoto et ai., 19 97299 1985, Mol. Cell. Biol. 5:2860-2865; Madisen et ai., 1987, Virology 158:248-250) dlgestoltlln BamHI:11¾ ja EcoRI:llä ja 375 emäsparln fragmentti Τ6Ρ-β1/β2:η koodlsekvensslstä eristettiin (fragmentti 1). pSV2-8TGF: (Gentry et ai., 1987, 5 Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427) digestoitiin Apalrllä ja

EcoRI:llä ja 3.5 Ke:n fragmentti eristettin (fragmentti 2).

Komplementaariset synteettiset oligonukleotidit, joiden sekvenssi on esitetty alla, syntetisoitiin Applied Biosys-10 terns Oligonucleotide Synthesizer -laitteella ja puhdistettiin akryyliamidigeelistä. Fosfaatit lisättiin T4-kinaasin avulla ja ekvimolaariset määrät kinaasilla käsiteltyjä oligonukleotideja hybridisoitiin. Muodostunut kaksoissäi-keinen, synteettinen DNA ligatoitiin sitten alla kuvattuihin 15 fragmentteihin '1' ja '2'. Ligaatioseosta käytettiin E.

colin transformointiin ja 58pSV2(Hpa~ Eco+) eristettiin.

5’ - CAA CAT CTG CAA AGC TCC CGG CAC CGC CGA GCC

CTG GAC ACC AAC TAC TGC TTC AGA AAT GTG CAG

20 GAT AAT TGC TGC CTA CGT CCG CTT TAC ATT GAT

TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TG - 3'

5' GAT CCA TTT CCA CCC TAG ATC CCT CTT GAA ATC

AAT GTA AAG CGG ACG TAG GCA GCA ATT ATC CTG

25 CAC ATT TCT GAA GCA GTA GTT GGT GTC CAG GGC

TCG GCG GTG CCG GGA GCT TTG CAG ATG TTG GGC C - 3' 58pSV2(Hpa~ Eco+):a digestoitiin EcoRI:llä, täytettiin Klenowin entsyymin avulla ja digestoitiin Hindlll:11a ja 30 kimeerisen Τ0Γ-β1/β2:η koodisekvenssin sisältävä 1.4 Ke:n fragmentti (fragmentti 3) eristettiin. 58pSV2 rakennettiin ligatoimalla fragmentti 3 pSV2, neo:on, jota oli sitä ennen digestoitu Hindlll:11a ja Hpal:llä neogeenin eliminoimiseksi.

5βρβν2 digestoitiin EcoRI:llä, täytettiin Klenowin entsyymin avulla, digestoitiin Ndel:11a ja 2,6 Ke:n Ndel-EcoRI:n (tylppä) fragmentti eristettiin ja ligatoitiin 35 20 97299 pSV2/dhfr:ään (Gentry et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3718-3727), jota oli digestoitu Ndel:llä ja PvuII:11a. Ligaatioseosta käytettiin colin transformointiin ja ρδβ/dhfr eristettiin. p58/dhfr:n koodaama nukleotidi- ja 5 siitä johdettu kimeerisen TGF-£l/p2 -molekyylin aminohappojärjestys on esitetty kuviossa 1.

ρδβ/dhfr transfektoitiin CHO-soluihin ja yksittäisiä klooneja amplifioitiin metotreksaatilla kuten kohdassa 6.1., 10 supra on kuvattu. Eräs tällainen amplifioitu klooni, CHO-5β41,2.5 valittiin lähempää karakterisointia varten.

0Η0-5β41,2.5 solut kasvatettiin konfluenssiin 2.5 μΜ meto-treksaatissa. Alusta korvattiin seerumivapaalla alustalla, 15 joka 24:n tunnin kuluttua kerättiin ja dialysoitiin 48 tuntia 0.2 M etikkahappoa vastaan. Dialysoitujen, käsiteltyjen supernatanttien bioaktiivisuus määritettiin inhiboimalla CCL-64 solujen DNA-synteesi kohdassa 6.1.3., supra kuvatulla tavalla. ΟΗΟ-5β41,2.5 -solut erittävät noin 2 20 mg/L bioaktiivista kimeeristä TGF~81/82:ta (kuvio 2).

Näiden solujen erittämiä TGF-βίη sukuisia proteiineja analysoitiin immunoblotting-menetelmällä käyttäen kypsää TGF-β1/β2 vastaan suunnattuja antipeptidivasta-aineita kuten 25 kohdassa 6.1.5., supra on kuvattu. Kuvio 3 osoittaa, että ΟΗΟ-5β41,2.5 -solut erittävät immunoreaktiivisia proteiineja, jotka kulkeutuvat 90:stä 100:aan kilodaltönin ja 24:n kilodaltonin kohdalle analysoitaessa SDS-PAGE:lla ei-pelkis-tävissä olosuhteissa (kuvio 3, kaista 1). 24 kilodaltonin 30 nauha edustaa kypsää τσΡ-β1/β2 -dimeeriä ja 90:sta 100:aan kilodaltonin proteiini edustaa luultavasti kypsää TGF-β1/β2:ΐβ disulfidisidoksin prekursorisekvensseihin liittyneenä (Gentry et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-3427). 1

Pelkistävissä olosuhteissa (kuvio 3, kaista 2) suurin osa proteiineja kulkeutuu 12 kilodaltonin kohdalle, edustaen kypsää τσκ-β1/β2 -monomeeria. On huomattava, että 45 ja 55 kilodaltonin välisellä alueella ei ole immunoreaktiivista 21 97299 ainesta, jota on havaittu tutkittaessa samalla analyysimenetelmällä apinan TGF-pi/p2 -geeniä koodaavalla plasmidil-la transfektoitujen CHO-solujen ilmentämiä yhdistelmäpro-teiineja (Gentry et ai., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:3418-5 3427), mikä viittaa siihen, että kimeeristä TGF-pi/p2:ta muokataan tehokkaammin proteolyyttisesti kuin sen äitimo-lekyyliä TGF-βΙ. Lisäksi 0Η0-5β41,2.5 -solut erittävät noin 2,5 kertaa enemmän bioaktiivista kypsää tuotetta kuin TGF-pl:tä ilmentävät CHO-solut (Gentry et ai., 1987, supra).

10 Vaikka näiden havaintojen perustaa ei tällä hetkellä tunneta, kimeerisen Τ0Ρ-β1/β2:η prekursorin sekundäärinen rakenne voi poiketa huomattavasti TGF~81:n sekundäärisestä rakenteesta, mikä johtaa siihen, että kimeerinen TGF~81/82 joutuu alttiiksi intensiteetiltään tai luonteeltaan erilai-15 selle molekylääriselle muokkaukselle. ΤβΡ-β1/β2:η prekur-sori voi esimerkiksi olla soveliaampi substraatti TGF~8:n muokkaustekijöille. Vaihtoehtoisesti ΤΘΓ-β1/β2:η sekundää-rirakenteen ominaisuudet voivat sallia vuorovaikutuksen muiden muokkaustekijöiden kanssa tai sellaisten muokkaus-20 teiden käytön, jotka eivät ole TGF~81:lle yhtä mahdollisia.

Seuraava transfektantti on talletettu Amerikkalaiseen tyyppi viljelmäkokoelmaan, Rockville, MD, ja sille on annettu alla esitetty saantinumero.

25

Transfektantti Plasmidi Saantinumero ΟΗΟ-5β41,2.5 CL 5 ρδβ/dhfr Tätä keksintöä eivät rajoita talletettu solulinja tai seli-30 tyksessä esitetyt suoritusmuodot, jotka on tarkoitettu kuvaamaan vain keksinnön yhtä puolta ja mitkä tahansa toiminnallisesti vastaavat kuuluvat keksinnön piiriin. Niinpä keksinnön useat muunnokset tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäksi ovat ilmeisiä alan asiantuntijalle edellä esitetyn 35 kuvauksen perusteella. Tällaisten muunnosten on tarkoitus kuulua liitteenä olevien patenttivaatimusten piiriin.

22 97299

On myös ymmärrettävä, että kaikki emäsparien ja aminohappo jäännösten numerot ja nukleotidien ja peptidien ilmoitetut koot ovat likimääräisiä ja että niitä on käytetty kuvaus-tarkoituksiin.

Claims (18)

97299

1. Menetelmä kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää 5 a) (i) isäntäsolun viljelyn, joka solu sisältää kuviossa 1 esitetyn kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 nukle-otidijärjestyksen nukleotidista numero 836 nukleotidiin numero 1170 toisen, geenin ilmentymistä siten ohjaavan nukle-otidijakson säätelyn alaisena, että isäntäsolu tuottaa pep-10 tidiä tai proteiinia, jolla on transformoivan kasvutekijän β1/β2 aktiivisuus; ja ii) kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 talteenoton viljelmästä, tai 15 b) (i) isäntäsolun viljelyn, joka solu sisältää kuviossa 1 esitetyn kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 nukle-otidijärjestyksen nukleotidista numero 1 nukleotidiin numero 1170 toisen, geenin ilmentymistä siten ohjaavan nukleotidi-jakson säätelyn alaisena, että isäntäsolu tuottaa peptidiä 20 tai proteiinia, jolla on transformoivan kasvutekijän β1/β2 aktiivisuus; ja ii) kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 talteenoton viljelmästä, tai 25 c) (i) ATCC:hen talletetun, talletusnumeroltaan CRL 9959:n ; transfektantti CH0-5S41,2.5 CL 5:n viljelyn; ii) kimeerisen transformoivan kasvutekijän βΐ/β2 talteenoton viljelmästä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että isäntäsolu on kiinalaisen hamsterin munasarjasolu.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisen geenin ilmentymistä säätelevä nukleotidijak- 35 so käsittää SV40-promoottorin.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen nukleotidijakso sisältää promoottorin ja 97299 isäntäsolusta puuttuvan valikointimarkkerin koodijakson, jolloin kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 koodi-jakson sisältävä isäntäsolu voidaan identifioida.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että valikointimarkkeri on dihydrofolaattireduktaasi.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi isäntäsolujen asettaminen aitio tiiksi metotreksaatille siten, että valikoidaan resistenttejä pesäkkeitä, joissa on dihydrofolaattireduktaasin ja kimeerisen transformoivan kasvutekijän β1/β2 koodijaksoja kohonneita määriä.

7. Patenttivaatimuksen le mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transfektanttia viljellään metotreksaatin läsnäollessa.

8. Eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa 20 kimeeristä transformoivaa kasvutekijää β1/β2, jolla on aminohappojärjestys kuten kuviossa 1 on esitetty aminohappo-jäännöksestä numero 279 aminohappojäännökseen numero 390.

9. Eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa 25 kimeeristä transformoivaa kasvutekijää β1/β2, jolla on ami- • nohappojärjestys kuten kuviossa 1 on esitetty aminojäännöksestä numero 1 aminohappojäännökseen numero 390.

10. Nisäkässolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu

30 DNA-molekyylillä, joka koodaa kimeeristä transformoivaa kas vutekijää β1/β2, joka käsittää aminohappojärjestyksen kuten kuviossa 1 on esitetty aminohaposta numero 279 aminohappoon numero 390. 1 i! Iti t III il li lii

11. Nisäkässolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu DNA-molekyylillä, joka koodaa kimeeristä transformoivaa kasvutekijää βΐ/β2, joka käsittää aminohappojärjestyksen kuten 97299 kuviossa 1 on esitetty aminohaposta numero 1 aminohappoon numero 390.

12. Patenttivaatimuksen 10 mukainen nisäkässolu, tunnettu 5 siitä, että se on transformoitu DNA-molekyyli.Llä, joka koo- ‘ daa kimeeristä transformoivaa kasvutekijää β1/β2, joka kä sittää aminohappojärjestyksen kuten kuviossa l on esitetty aminohaposta numero 279 aminohappoon numero 390, jolloin DNA-molekyylin koodausalue on geenin ilmentymistä siten oh-10 jaavan nukleotidijakson säätelyn alaisena, että solu tuottaa kimeeristä transformoivaa kasvutekijää βΐ/β2.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen nisäkässolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu DNA-molekyylillä joka koodaa 15 kimeeristä transformoivaa kasvutekijää β1/β2 aminohappojär jestyksen kuten kuviossa 1 on esitetty aminohaposta numero 1 aminohappoon numero 390, jolloin DNA-molekyylin koodausalue on geenin ilmentymistä siten ohjaavan nukleotidijakson säätelyn alaisena, että solu tuottaa kimeeristä transformoivaa 20 kasvutekijää β1/β2.

14. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on kiinalaisen hamsterin munasarjasolu.

15. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen solu, tunnettu • siitä, että geenin ilmentymistä ohjaavaan nukleotidijaksoon sisältyy SV40-promoottori.

16. Patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukainen solu, tunnettu 30 siitä, että geenin ilmentymistä ohjaava nukleotidijakso sisältää promoottorin ja valikointimarkkeria koodaavan jakson.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen solu, tunnettu siitä, että valikointimarkkeri on dihydrofolaattireduktaasi. 35

18. Solulinja käsittäen CHO-5fi41,2.5 CL 5:n, joka on talletettuna ATCC:hen ja jonka talletusnumero on CRL 9959. 97299