JPH0335794A - TGF―β1/β2:新規キメラ変換成長因子―ベータ - Google Patents
TGF―β1/β2:新規キメラ変換成長因子―ベータInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、TCF−β1/β2と称される新規変換成長
因子ベータ、TGF−β1/β2をコードするヌクレオ
チド配列及び発現ベクター、及びTGF−βl/β2の
製造方法に関するものである。キメラTGF−β1/β
2前駆体遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフ
ヱクシジンされたC、IIO細胞によるTGF−βl/
β2の生産及び分泌により本発明は実証される。キメラ
遺伝子産物はTGF−β1生物活性を有する。
因子ベータ、TGF−β1/β2をコードするヌクレオ
チド配列及び発現ベクター、及びTGF−βl/β2の
製造方法に関するものである。キメラTGF−β1/β
2前駆体遺伝子をコードする発現ベクターでトランスフ
ヱクシジンされたC、IIO細胞によるTGF−βl/
β2の生産及び分泌により本発明は実証される。キメラ
遺伝子産物はTGF−β1生物活性を有する。
変換成長因子−ベータ (TGF−β)は、最近記述さ
れている細胞分化及び増殖を制御する一群のポリベプチ
ド類の一員である。この−群の他のものには、Mull
erの阻害物質(Ca teら、1986. Ce11
45 :685−698)、インヒビンg (Maso
n ら、1985゜Nature 318: 659−
663)及びドロソフィラ (叶oso−phira)
の15倍(decapentaplegic)遺伝子複
合体の転写物から推定されるタンパク質(Padget
tら、■987、 Nature 325:8l−8
4)がある。
れている細胞分化及び増殖を制御する一群のポリベプチ
ド類の一員である。この−群の他のものには、Mull
erの阻害物質(Ca teら、1986. Ce11
45 :685−698)、インヒビンg (Maso
n ら、1985゜Nature 318: 659−
663)及びドロソフィラ (叶oso−phira)
の15倍(decapentaplegic)遺伝子複
合体の転写物から推定されるタンパク質(Padget
tら、■987、 Nature 325:8l−8
4)がある。
4タイプのTGF−βが同定され、TGF−β1 、T
GF−β2、TGF−β1,2及びTGF−β3と命名
されている。最初に記載したタイプ、TGF−βlは、
分子量13.000を有しジスルフィド結合した2個の
同一なサブユニットからなる(Assoian ら、1
983. J。
GF−β2、TGF−β1,2及びTGF−β3と命名
されている。最初に記載したタイプ、TGF−βlは、
分子量13.000を有しジスルフィド結合した2個の
同一なサブユニットからなる(Assoian ら、1
983. J。
Biol、 Chem、 258:7155−7160
; Frolikら、1983゜Proc、 Nat
l、 Acad、 Sci、 USA 80 : 36
76−3680 ;Frolikら、1984. J、
Biol、 Chem、 260 : 10995−
11000)。これは、胎盤(Frolikら、198
3. Nature325:8l−84) 、血小板(
Childsら、1982+ Proc。
; Frolikら、1983゜Proc、 Nat
l、 Acad、 Sci、 USA 80 : 36
76−3680 ;Frolikら、1984. J、
Biol、 Chem、 260 : 10995−
11000)。これは、胎盤(Frolikら、198
3. Nature325:8l−84) 、血小板(
Childsら、1982+ Proc。
Natl、Acad、 Sci、 USA 79:53
12−5316 ; As5oianら、1983.
J、 Biol、 Chew、 258:7155−7
160) 、腎1Ii(Roberts ら、1983
. Biochemistry 22 : 5692−
5698)、及び脱石灰化骨(Seyedinら、19
85. Proc。
12−5316 ; As5oianら、1983.
J、 Biol、 Chew、 258:7155−7
160) 、腎1Ii(Roberts ら、1983
. Biochemistry 22 : 5692−
5698)、及び脱石灰化骨(Seyedinら、19
85. Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 USA 82:1
19−123)を含む数種の組織源から精製されている
。ヒト(Derynckら、1985、 Nature
316:701−705) 、マウス(Derync
kら、1986. J、 Biol、 Chem、 2
61:4377−4379) 、及びサル(Sharp
lesら、19B?、 DNA 6 :239−244
)のTGP−βlをコードするcDNAクローンが単離
されている。TGF−βlは大きな前駆体ポリペプチド
゛として台底され、そのカルボキシ末端が切断されて成
熟TGF−β単量体を生成することを、これらのクロー
ンのDNA配列分析は示している。上記起源全てに由来
するTGF−βl前駆体タンパク質の全体にわたって強
い配列相同性が見いだされた。
19−123)を含む数種の組織源から精製されている
。ヒト(Derynckら、1985、 Nature
316:701−705) 、マウス(Derync
kら、1986. J、 Biol、 Chem、 2
61:4377−4379) 、及びサル(Sharp
lesら、19B?、 DNA 6 :239−244
)のTGP−βlをコードするcDNAクローンが単離
されている。TGF−βlは大きな前駆体ポリペプチド
゛として台底され、そのカルボキシ末端が切断されて成
熟TGF−β単量体を生成することを、これらのクロー
ンのDNA配列分析は示している。上記起源全てに由来
するTGF−βl前駆体タンパク質の全体にわたって強
い配列相同性が見いだされた。
l0%血清及び上皮成長因子の存在下において、TGF
−β1は正常ラット腎WtuM維芽細胞の固定源非依存
性成育を促進しくRobertsら、1981. Pr
oc。
−β1は正常ラット腎WtuM維芽細胞の固定源非依存
性成育を促進しくRobertsら、1981. Pr
oc。
Natl、 Acad、 Sci、 IJSA
78;5339−5343 HRobertsら、
1982. Nature 295:417−419
; Twardzik ら、1985、 J、 Ce
11. Biochem、 28:289−297)
、10%血清のみの存在下においては、AKR−2B繊
維芽細胞のコロニー形成を誘導する能力を持つ(Tuc
kerら、1983、 Cancer Res、 43
:151B−1586) 、また、TGF−β1は胎児
性ラット筋間葉細胞の分化および軟骨特異的巨大分子の
生成を引き起こすことも示されている(Seyedin
ら、1986. J、 Biol、 Chefa、 2
61:5693−5695)。
78;5339−5343 HRobertsら、
1982. Nature 295:417−419
; Twardzik ら、1985、 J、 Ce
11. Biochem、 28:289−297)
、10%血清のみの存在下においては、AKR−2B繊
維芽細胞のコロニー形成を誘導する能力を持つ(Tuc
kerら、1983、 Cancer Res、 43
:151B−1586) 、また、TGF−β1は胎児
性ラット筋間葉細胞の分化および軟骨特異的巨大分子の
生成を引き起こすことも示されている(Seyedin
ら、1986. J、 Biol、 Chefa、 2
61:5693−5695)。
その細胞増殖に対する効果とは対照的に、ヒト血小板か
ら精製されたTGF−β1は、培養においである種の細
胞の成育を阻害することが示されている(Tacker
ら、1984.5cience 226:705−70
7)。また、TGF−βlは数種類のヒト腫瘍細胞株の
成育を阻害することも示されている(Robertsら
、1985゜Proc、 Na1l、 Acad、 S
ci、 USA 82:119−123)。このTGF
−βlの阻害/促進作用は、細胞の種類や細胞の生理学
的状態を含む数個の因子に依存するであろう (総説と
しては、5porn ら、1986,5cience2
23 : 532−534を参照〉。
ら精製されたTGF−β1は、培養においである種の細
胞の成育を阻害することが示されている(Tacker
ら、1984.5cience 226:705−70
7)。また、TGF−βlは数種類のヒト腫瘍細胞株の
成育を阻害することも示されている(Robertsら
、1985゜Proc、 Na1l、 Acad、 S
ci、 USA 82:119−123)。このTGF
−βlの阻害/促進作用は、細胞の種類や細胞の生理学
的状態を含む数個の因子に依存するであろう (総説と
しては、5porn ら、1986,5cience2
23 : 532−534を参照〉。
TGF−βlと同様にTGF−β2は、ジスルフィド結
合した2個の同一な13.000ドルトンのサブユニッ
トからなる、分子1fi26.ooOのポリペプチドで
あり(Chiefetzら、1987. Ce1l 4
8:409−415 ; Ikedaら、1987.
Biochemistey 26:2406−2410
)、ウシ脱石灰化骨(Seyedinら、1987.
J、 Biol、 Chem、 262:1946−1
949)、ブタ血小板(Cheifetzら、1987
.Ce1148:409−415)、ヒト前立腺癌細胞
株PC−3(Ikedaら、 1987. Bioch
emistry 26:2406−2410)、および
ヒト神経膠芽細胞腫細胞株(Wrannら、1987.
E旧06 :1633−1636)から単離されてい
る。ヒト及びザルT G、F−β2をコードするcDN
Aクローンが、単離されているCMad 1sonら、
1988. DNA 7:l−8HWebbら、198
8、 DNA 7:493−497)、そのmRN^が
スプライシングにより生ずるであろう2種類のより大き
な前駆体ポリペプチドの一つから、切断される (We
bbら、198B、 DNA ’7:493−497)
。
合した2個の同一な13.000ドルトンのサブユニッ
トからなる、分子1fi26.ooOのポリペプチドで
あり(Chiefetzら、1987. Ce1l 4
8:409−415 ; Ikedaら、1987.
Biochemistey 26:2406−2410
)、ウシ脱石灰化骨(Seyedinら、1987.
J、 Biol、 Chem、 262:1946−1
949)、ブタ血小板(Cheifetzら、1987
.Ce1148:409−415)、ヒト前立腺癌細胞
株PC−3(Ikedaら、 1987. Bioch
emistry 26:2406−2410)、および
ヒト神経膠芽細胞腫細胞株(Wrannら、1987.
E旧06 :1633−1636)から単離されてい
る。ヒト及びザルT G、F−β2をコードするcDN
Aクローンが、単離されているCMad 1sonら、
1988. DNA 7:l−8HWebbら、198
8、 DNA 7:493−497)、そのmRN^が
スプライシングにより生ずるであろう2種類のより大き
な前駆体ポリペプチドの一つから、切断される (We
bbら、198B、 DNA ’7:493−497)
。
TGF−β1及びTGF−β2は、その成熟領域におい
て71%のアミノ酸配列が同一であり、その前駆体構造
においては、41%が同一であった。最近アミノ酸配列
がcDNAクローンより推定されたTGF−β3は、T
GF−β1及びTGF−β2の成熟単量体に対して約8
0%の相同性を有するC−末端の112個のアミノ酸配
列を含むものと思われる(Dijkeら、1988゜P
roc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA
85:4715−4719)。
て71%のアミノ酸配列が同一であり、その前駆体構造
においては、41%が同一であった。最近アミノ酸配列
がcDNAクローンより推定されたTGF−β3は、T
GF−β1及びTGF−β2の成熟単量体に対して約8
0%の相同性を有するC−末端の112個のアミノ酸配
列を含むものと思われる(Dijkeら、1988゜P
roc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA
85:4715−4719)。
TGF−β1,2は、ジスルフィド結合によって結合し
た一つのβ1及びβ2からなる異種二量体形態である
(Chiefetzら、1987. Ce1l 48:
409−415)。
た一つのβ1及びβ2からなる異種二量体形態である
(Chiefetzら、1987. Ce1l 48:
409−415)。
(1) TGF−1の プロセシングヒト、薩歯類
、及びサル起源からのTGF−β1の前駆体領域のアミ
ノ部分が、高度の相同性を示しくDerynckら、1
985. Nature 316:701−705;D
erynckら、1986.J、Biol、Chem、
261:4377−4379 ; 5harplesら
、1987. ON^6 : 239−244)、重要
な生物学的機能が、該分子のこの部分と関連しているこ
とを示唆する。TGF−β1前駆体のこの部分がグリコ
ジル化され、リン酸化されていることを明確に示した最
近の研究は、この主張を支持するが、これはもし特定の
機能のためでないならば、このような二次的修飾を行う
という労力を細胞が費やすとは考えられないためである
(Brunnerら、198B、 Mol。
、及びサル起源からのTGF−β1の前駆体領域のアミ
ノ部分が、高度の相同性を示しくDerynckら、1
985. Nature 316:701−705;D
erynckら、1986.J、Biol、Chem、
261:4377−4379 ; 5harplesら
、1987. ON^6 : 239−244)、重要
な生物学的機能が、該分子のこの部分と関連しているこ
とを示唆する。TGF−β1前駆体のこの部分がグリコ
ジル化され、リン酸化されていることを明確に示した最
近の研究は、この主張を支持するが、これはもし特定の
機能のためでないならば、このような二次的修飾を行う
という労力を細胞が費やすとは考えられないためである
(Brunnerら、198B、 Mol。
Ce11. Biol、 8:2229−2232)。
このような修飾は前駆体の二量体化のために、またはそ
の移動を細胞の外へ方向付けるために重要であろう。前
駆体のグリコジル化が成熟TGF−β1の細胞外への輸
送に関わっていることを示唆する証拠がある(Purc
hi。
の移動を細胞の外へ方向付けるために重要であろう。前
駆体のグリコジル化が成熟TGF−β1の細胞外への輸
送に関わっていることを示唆する証拠がある(Purc
hi。
ら、1988. J、 Biol、 ChelI+、
263:1421L14215)。
263:1421L14215)。
サルTGF−β1を発現するCHO細胞において、プロ
セシングに関わる中間前駆体複合体か、または発現にお
ける人為的産物のいずれかであると思われるものの存在
が報告されている(GentrVら、198B、 Mo
1. Ce11. Biol、 8:4162−416
8 HGentry ら、1987、 Mo1. Ce
1l、 Biol、 7:3418−3427) 、こ
れらの研究は、トランスフェクションされたcllo1
1I胞により合成されるTCP−βlが、ジスルフィド
結合により相互に結合したプローTGF−β1、或q4
T G Fβ1、及び前駆体のプロ領域からなること
を明らかにした。このようなジスルフィド結合した前駆
体複合体は、単離した潜在型TGF〜β1にも見られた
(Miyazanoら、198EL J、Ce11.
Biochem、 5uppl。
セシングに関わる中間前駆体複合体か、または発現にお
ける人為的産物のいずれかであると思われるものの存在
が報告されている(GentrVら、198B、 Mo
1. Ce11. Biol、 8:4162−416
8 HGentry ら、1987、 Mo1. Ce
1l、 Biol、 7:3418−3427) 、こ
れらの研究は、トランスフェクションされたcllo1
1I胞により合成されるTCP−βlが、ジスルフィド
結合により相互に結合したプローTGF−β1、或q4
T G Fβ1、及び前駆体のプロ領域からなること
を明らかにした。このようなジスルフィド結合した前駆
体複合体は、単離した潜在型TGF〜β1にも見られた
(Miyazanoら、198EL J、Ce11.
Biochem、 5uppl。
12(A):200; Wakefieldら、198
7. J、 Biol、 Chem。
7. J、 Biol、 Chem。
5upp1.11(A):46)。
Gen tryら (Gentryら、1988+ M
o1. Ce11. Biol、。
o1. Ce11. Biol、。
8:4162−4168)は、トランスフェクションC
HO細胞におけるプレープローTGF−β1のプロセシ
ングについて以下のようなスキームを提案した。言及さ
れたアミノ酸位置番号は公刊されたサルTCP−β1配
列に由来する (Sharplesら、1987. O
N^6:239−244)。この提案されたスキームに
よると、その第一段階は、Gly−29/ Leu−3
0ペプチド結合でのシグナルペプチド切断に関わる。こ
の切断事象は前駆体が粗面小胞体膜を通過する間に同時
翻訳的に起こる可能性が最も高い(Blobelおよび
Dobbers te in 。
HO細胞におけるプレープローTGF−β1のプロセシ
ングについて以下のようなスキームを提案した。言及さ
れたアミノ酸位置番号は公刊されたサルTCP−β1配
列に由来する (Sharplesら、1987. O
N^6:239−244)。この提案されたスキームに
よると、その第一段階は、Gly−29/ Leu−3
0ペプチド結合でのシグナルペプチド切断に関わる。こ
の切断事象は前駆体が粗面小胞体膜を通過する間に同時
翻訳的に起こる可能性が最も高い(Blobelおよび
Dobbers te in 。
1975、 J、 Ce11. Biol、 67:8
35−851 : Walterら、1984、 Ce
1l 38:5−8)。シグナルペプチドの切断に続い
て、コアグリコジル化ユニット(Rothmanら、。
35−851 : Walterら、1984、 Ce
1l 38:5−8)。シグナルペプチドの切断に続い
て、コアグリコジル化ユニット(Rothmanら、。
197B、Ce1115:1447−1454)が、A
sn−82、Asn−136、Asn−176に位置す
る三箇所の推定N−グリコジル化部位のそれぞれで、ブ
ロー↑GF−β1に付加される。ついでコアグリコジル
化プローTGF−βlは、ゴルジ体を通過しながら引き
続いてプロセシングを受け、リン酸化糖タンパク質含有
複合体、シアル酸のついたオリゴ糖を生成する。台底及
び通過の際のいくつかの段階で、二塩基性残基でのタン
パク質加水分解的切断及びジスルフィド異性化反応が起
こり、成熟TGF−β1を放出する。
sn−82、Asn−136、Asn−176に位置す
る三箇所の推定N−グリコジル化部位のそれぞれで、ブ
ロー↑GF−β1に付加される。ついでコアグリコジル
化プローTGF−βlは、ゴルジ体を通過しながら引き
続いてプロセシングを受け、リン酸化糖タンパク質含有
複合体、シアル酸のついたオリゴ糖を生成する。台底及
び通過の際のいくつかの段階で、二塩基性残基でのタン
パク質加水分解的切断及びジスルフィド異性化反応が起
こり、成熟TGF−β1を放出する。
最近の別の研究において、TGF−β1前駆体中にマン
ノース−6−リン酸が同定された。リン酸化されたta
g似体、マンノース−6−リン酸は、標的輸送及びリソ
ソーム酵素の細胞間交換に機能的役割を演じていると思
われる(von Figura、 1986+Ann、
Rev、 Bioches+。55 :167−19
3)。リソソーム酵素のマンノース−6−リン酸残基を
認識する特異的レセプターが同定されており、輸送系の
必須構成要素である。マンノース−6−リン酸を含む分
泌リソソームタンパク質が組織培養培地の順化培地中に
同定されている(GalおよびGottesman、
1986+J、 Biol、Chem、 261: 1
760−1765s Caponyら、1981J、C
e11.Biol、 104:253−262 ; B
aumbach ら、1984゜Proc、 Natl
、 Acad、 Sct、 U、S、A、 81:29
85−2989;SahagianおよびGottes
man+ 1982+ J、Biol、Chem。
ノース−6−リン酸が同定された。リン酸化されたta
g似体、マンノース−6−リン酸は、標的輸送及びリソ
ソーム酵素の細胞間交換に機能的役割を演じていると思
われる(von Figura、 1986+Ann、
Rev、 Bioches+。55 :167−19
3)。リソソーム酵素のマンノース−6−リン酸残基を
認識する特異的レセプターが同定されており、輸送系の
必須構成要素である。マンノース−6−リン酸を含む分
泌リソソームタンパク質が組織培養培地の順化培地中に
同定されている(GalおよびGottesman、
1986+J、 Biol、Chem、 261: 1
760−1765s Caponyら、1981J、C
e11.Biol、 104:253−262 ; B
aumbach ら、1984゜Proc、 Natl
、 Acad、 Sct、 U、S、A、 81:29
85−2989;SahagianおよびGottes
man+ 1982+ J、Biol、Chem。
257:11145−11150)、 TCF−β1前
駆体のマンノース−6−リン酸残基が、成熟TGF−β
1を生成させるタンパク質加水分解的プロセシングのた
めに、プローTGF−β1をリソソームに方向付けるこ
とが考えられる。あるいは、マンノース−6−リン酸残
基は、切断されたTGF−β1前駆体を分解のためにリ
ソソームに標的輸送する機能を持つのかも知れない。
駆体のマンノース−6−リン酸残基が、成熟TGF−β
1を生成させるタンパク質加水分解的プロセシングのた
めに、プローTGF−β1をリソソームに方向付けるこ
とが考えられる。あるいは、マンノース−6−リン酸残
基は、切断されたTGF−β1前駆体を分解のためにリ
ソソームに標的輸送する機能を持つのかも知れない。
〔発明の要約]
本発明は、発現調節因子により制御されるTGF−β1
/β2前駆体コード配列を含む組換えDNAヘクターで
トランスフェクションされた真核宿主細胞による、TG
F−βl/β2と称される新規キメラTGF−βの大量
生産に関するものである。サルTGFβ1 cDNA
(Sharplesら、1987. DNA6:239
−244)は修飾され、成熟TGF−β1配列の9−1
3.17.19.25及び26番のアミノ酸残基をコー
ドするヌクレオチドが、成熟TGF−β2構造の対応ア
ミノ酸をコードするヌクレオチドに変化していた。サル
のコドンの規則性は維持された。
/β2前駆体コード配列を含む組換えDNAヘクターで
トランスフェクションされた真核宿主細胞による、TG
F−βl/β2と称される新規キメラTGF−βの大量
生産に関するものである。サルTGFβ1 cDNA
(Sharplesら、1987. DNA6:239
−244)は修飾され、成熟TGF−β1配列の9−1
3.17.19.25及び26番のアミノ酸残基をコー
ドするヌクレオチドが、成熟TGF−β2構造の対応ア
ミノ酸をコードするヌクレオチドに変化していた。サル
のコドンの規則性は維持された。
サルウィルス(SV40)発現調節因子の調節制御下で
キメラTGF−β1/β2前駆体をコードする発現ベク
ターを構築し、チャイニーズハムスター卵巣(CIIO
) III胞にトランスフェクションするために使用し
た。高レベルのTGF−β1/β2を合成、分泌するC
HOトランスフェクシントを得た。TGF−βl/β2
発現はメトトレキセートによって増幅され、増殖したト
ランスフェクシントは1mg/Lもの成熟TGF−βl
/β2を分泌した。Cll0トランスフェクタントの順
化培地の酸性化により、最高レベルの生物活性TGP−
β1/β2が生じた。トランスフェクションCHO細胞
により分泌された高レベルのrGF−βl/β2は、キ
メラ前駆体タンパク質のタンパク質加水分解的プロセシ
ングにおける並外れた効率に起因する。このような増加
したプロセシング効率はまた、成熟TGF−β構造のア
ミノ末端ドメインにおけるTGF−β1及びTGF−β
2アミノ酸配列の出願人らの組合せによって影響される
構造上の特質に起因している。
キメラTGF−β1/β2前駆体をコードする発現ベク
ターを構築し、チャイニーズハムスター卵巣(CIIO
) III胞にトランスフェクションするために使用し
た。高レベルのTGF−β1/β2を合成、分泌するC
HOトランスフェクシントを得た。TGF−βl/β2
発現はメトトレキセートによって増幅され、増殖したト
ランスフェクシントは1mg/Lもの成熟TGF−βl
/β2を分泌した。Cll0トランスフェクタントの順
化培地の酸性化により、最高レベルの生物活性TGP−
β1/β2が生じた。トランスフェクションCHO細胞
により分泌された高レベルのrGF−βl/β2は、キ
メラ前駆体タンパク質のタンパク質加水分解的プロセシ
ングにおける並外れた効率に起因する。このような増加
したプロセシング効率はまた、成熟TGF−β構造のア
ミノ末端ドメインにおけるTGF−β1及びTGF−β
2アミノ酸配列の出願人らの組合せによって影響される
構造上の特質に起因している。
本発明は、TGF−β1/β2、TGF−βl/β2及
びTGF−β1/β2前駆体をコードするヌクレオチド
配列、およびm換えDNA法によるTGF−β1/β2
の生産に関するものである。↑GF−β1/β2、新規
キメラ変換成長因子−βは、TGP−β1生物活性測定
に用いた標準アッセイにおいて生物学的に活性であり、
TGF−βl−特異的抗体との免疫反応性を示す。構造
的にはTGF−βl及びTGF−β2アミノ酸配列の組
合せからなるキメラである本発明のTGF−β1/β2
は、新規生物活性を担うことが期待され、その生物活性
の一部はその親分子の示す活性と類似するかまたはほと
んど同一であろうが、他はTGF−β1/β2に独特で
あるかもしれないトTGF−β1またはTGF−β2の
生物活性と類似の、あるいはほとんど同一の生物活性に
関しては、この新因子は、相応する生物学的応答を誘導
するもっと効果的な手段を提供するかもしれず、その使
用は、従って、TGF−β類について考えられる様々な
臨床応用においてTGF−β1及びTGF−β2に変わ
りうる望ましい方法となり得よう。このような応用には
、細胞増殖及び分化の誘導または促進、および細胞分裂
の阻害が含まれるがこれに限定されるものではない。こ
のように、TGF−βl/β2は例えば癌治療や癒傷促
進に使途を見いだすであろう。
びTGF−β1/β2前駆体をコードするヌクレオチド
配列、およびm換えDNA法によるTGF−β1/β2
の生産に関するものである。↑GF−β1/β2、新規
キメラ変換成長因子−βは、TGP−β1生物活性測定
に用いた標準アッセイにおいて生物学的に活性であり、
TGF−βl−特異的抗体との免疫反応性を示す。構造
的にはTGF−βl及びTGF−β2アミノ酸配列の組
合せからなるキメラである本発明のTGF−β1/β2
は、新規生物活性を担うことが期待され、その生物活性
の一部はその親分子の示す活性と類似するかまたはほと
んど同一であろうが、他はTGF−β1/β2に独特で
あるかもしれないトTGF−β1またはTGF−β2の
生物活性と類似の、あるいはほとんど同一の生物活性に
関しては、この新因子は、相応する生物学的応答を誘導
するもっと効果的な手段を提供するかもしれず、その使
用は、従って、TGF−β類について考えられる様々な
臨床応用においてTGF−β1及びTGF−β2に変わ
りうる望ましい方法となり得よう。このような応用には
、細胞増殖及び分化の誘導または促進、および細胞分裂
の阻害が含まれるがこれに限定されるものではない。こ
のように、TGF−βl/β2は例えば癌治療や癒傷促
進に使途を見いだすであろう。
本発明の方法は単に説明のために以下のような段階に分
けられる; (a) TGP−βl/β2前駆体のコー
ド配列の生成i (b) TにI?−β1/β2コート
配列の発現を指示する発現ベクターの構築; (C)
該遺伝子を複製、発現し、該遺伝子産物をプロセシング
する能力を有し、TGF−βl/β2の成541)型、
及び/またはTGF−βl/β2前駆体を生成する適当
な宿主細胞へのトランスフェクション;および(d)
TGF〜β1/β2前駆体及び成熟、生物活性’l’
GF−β1/β2の同定及び精製。
けられる; (a) TGP−βl/β2前駆体のコー
ド配列の生成i (b) TにI?−β1/β2コート
配列の発現を指示する発現ベクターの構築; (C)
該遺伝子を複製、発現し、該遺伝子産物をプロセシング
する能力を有し、TGF−βl/β2の成541)型、
及び/またはTGF−βl/β2前駆体を生成する適当
な宿主細胞へのトランスフェクション;および(d)
TGF〜β1/β2前駆体及び成熟、生物活性’l’
GF−β1/β2の同定及び精製。
ひとたびトランスフェクシントが高しヘルのTGF−β
1/β2前駆体及び/または成熟TGF−βl/β2を
発現することが認識されれば、発明の方法の実施は、該
クローンの増殖及び発現された遺伝子産物の単離を必要
とする。
1/β2前駆体及び/または成熟TGF−βl/β2を
発現することが認識されれば、発明の方法の実施は、該
クローンの増殖及び発現された遺伝子産物の単離を必要
とする。
ここに本発明の方法を下記の例を用いて明らかに示す。
すなわちその例において、サルTGF−βl前駆体cD
NA (Sharplesら、19B?、 DNA G
:239−244)を修飾し、成熟サルTGF−β1の
9−13.17.19.25及び26番のアミノ酸残基
をコードするヌクレオチドを成熟TGF−β2構造にお
ける対応するアよノ酸をコードするヌクレオチドに変化
させたが、サルコドンの規則性は維持されている。次い
で、その結果得られたキメラTGF−β1/β2前駆体
コード配列を、成熟TGF−β1/β2産物の台底を指
示する能力を持つ発現ベクターの構築に使用する。
NA (Sharplesら、19B?、 DNA G
:239−244)を修飾し、成熟サルTGF−β1の
9−13.17.19.25及び26番のアミノ酸残基
をコードするヌクレオチドを成熟TGF−β2構造にお
ける対応するアよノ酸をコードするヌクレオチドに変化
させたが、サルコドンの規則性は維持されている。次い
で、その結果得られたキメラTGF−β1/β2前駆体
コード配列を、成熟TGF−β1/β2産物の台底を指
示する能力を持つ発現ベクターの構築に使用する。
様々な角度からみた本発明の方法は、以下の小項目及び
それに続〈実施例においてより詳細に記述される。
それに続〈実施例においてより詳細に記述される。
(1)キメーTGF−12コー′ のキメラTGF−
β1/β2のヌクレオチドコード配列を第1図に記述し
ている。発明の方法の実施において、このヌクレオチド
配列またはそれと機能的に等価なものを、TCP−βl
/β2産物の発現を指示するであろう組換え分子を生成
させるために使用できる。ヌクレオチドコード配列の縮
退のため、第1図に記述した以外のDNA配列も、本発
明の実°施に際して使用できる。第1図のヌクレオチド
配列のこのような変更には、様々なヌクレオチド残基の
欠失、付加、または置換があり、これにより同一のまた
は機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる
。遺伝子は配列内アミノ酸残基の欠失、付加または置換
を含んでいてもよく、生物活性な産物を生成する表に現
れない変化を生じる。このようなアミノ酸置換は、関連
する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性及び/
または両親媒性の類似に基づいて行われうる。たとえば
負荷電アミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸があ
る;正荷電75ノ酸にはリジン及びアルギニンがある;
類似した親水性を有し、非荷電極性の側鎖あるいは非極
性側鎖を有するアミノ酸には以下のものがある;ロイシ
ン、イソロイシン、バリンニゲリシン、アラニン;アス
パラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;フェニル
アラニン、チロシン。
β1/β2のヌクレオチドコード配列を第1図に記述し
ている。発明の方法の実施において、このヌクレオチド
配列またはそれと機能的に等価なものを、TCP−βl
/β2産物の発現を指示するであろう組換え分子を生成
させるために使用できる。ヌクレオチドコード配列の縮
退のため、第1図に記述した以外のDNA配列も、本発
明の実°施に際して使用できる。第1図のヌクレオチド
配列のこのような変更には、様々なヌクレオチド残基の
欠失、付加、または置換があり、これにより同一のまた
は機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列を生じる
。遺伝子は配列内アミノ酸残基の欠失、付加または置換
を含んでいてもよく、生物活性な産物を生成する表に現
れない変化を生じる。このようなアミノ酸置換は、関連
する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性及び/
または両親媒性の類似に基づいて行われうる。たとえば
負荷電アミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸があ
る;正荷電75ノ酸にはリジン及びアルギニンがある;
類似した親水性を有し、非荷電極性の側鎖あるいは非極
性側鎖を有するアミノ酸には以下のものがある;ロイシ
ン、イソロイシン、バリンニゲリシン、アラニン;アス
パラギン、グルタミン;セリン、スレオニン;フェニル
アラニン、チロシン。
サルTGF−βlのヌクレオチド配列はサル細胞源から
得ることができる(Sharplesら、1987.
DNA6:239−244)。第1図におけるキメラT
GF−β1/β2のヌクレオチド配列は、DNA制限酵
素、合成オリゴヌクレオチド、及びDNAリガーゼの使
用を含むがこれに限定されない当分野に公知の方法によ
り調製することができる。あるいは、第1図のコード配
列を、当分野に周知の化学的方法を用いて、全合成また
は部分合成することができる。
得ることができる(Sharplesら、1987.
DNA6:239−244)。第1図におけるキメラT
GF−β1/β2のヌクレオチド配列は、DNA制限酵
素、合成オリゴヌクレオチド、及びDNAリガーゼの使
用を含むがこれに限定されない当分野に公知の方法によ
り調製することができる。あるいは、第1図のコード配
列を、当分野に周知の化学的方法を用いて、全合成また
は部分合成することができる。
発明の特定の実施態様においては、サルTCP−β1の
コード配列はアフリカミトリザル細胞株、BBC−40
(Sharplesら、1987.上記)から得られた
全長を有するcDN^DNAンから得ることができる。
コード配列はアフリカミトリザル細胞株、BBC−40
(Sharplesら、1987.上記)から得られた
全長を有するcDN^DNAンから得ることができる。
次いで、第1図に記述されたキメラTGF−βI/β2
のコード配列は、遺伝子構築技術を用いて、成74jT
GF−(/ 1 (7) 7 ミ/酸残基番号9.10
. II、12.13.17.19.25及び26のコ
ード配列を除去し、成熟TGF−β2分子(Madis
enら、198B、 DNA 7:1−8)のアミノ酸
残基番号9.105it、12.13.17.19.2
5及び26のコード配列に置き換えることによってサル
TGF−βl配列から誘導される。
のコード配列は、遺伝子構築技術を用いて、成74jT
GF−(/ 1 (7) 7 ミ/酸残基番号9.10
. II、12.13.17.19.25及び26のコ
ード配列を除去し、成熟TGF−β2分子(Madis
enら、198B、 DNA 7:1−8)のアミノ酸
残基番号9.105it、12.13.17.19.2
5及び26のコード配列に置き換えることによってサル
TGF−βl配列から誘導される。
(2)キ −TGF−コー
さIJL二坐盪築
生物学的に活性な7i!熟TGF−β1/β2を発現さ
せるためには、高レベルの転写及び翻訳のみならず、遺
伝子産物の正確なプロセシングを考慮にいれた発現ベク
ター宿主系が選択されるべきである。
せるためには、高レベルの転写及び翻訳のみならず、遺
伝子産物の正確なプロセシングを考慮にいれた発現ベク
ター宿主系が選択されるべきである。
このことは特に発現構築物においてキメラTGFβ1/
β2前駆体のコード配列全体を使用するときに重要であ
るが、これは、TGF〜βlやTGF−β2同様成熟キ
メラTGF−β1/β2が、細胞で生起するプロセシン
グによって前駆体分子または分子複合体から放出される
と信じられているためである。
β2前駆体のコード配列全体を使用するときに重要であ
るが、これは、TGF〜βlやTGF−β2同様成熟キ
メラTGF−β1/β2が、細胞で生起するプロセシン
グによって前駆体分子または分子複合体から放出される
と信じられているためである。
さらに、産物の分泌に備えた発現/宿主細胞系が望まし
い。
い。
とりわけ、成熟TGF−βl/β2は、成熟TGFβl
及びTGF−β2を形成させるプロセシングと類似であ
ると信じられる細胞のプロセシング事象によって形成さ
れるサブユニット当り112個のアミノ酸からなるジス
ルフィド結合したホモ二量体であると思われる。TGF
−β1/β2前駆体は3箇所のN−グリコジル化可能部
位をそのプロ領域に有している (St+arples
ら、1987. DNA 6;239−244)。
及びTGF−β2を形成させるプロセシングと類似であ
ると信じられる細胞のプロセシング事象によって形成さ
れるサブユニット当り112個のアミノ酸からなるジス
ルフィド結合したホモ二量体であると思われる。TGF
−β1/β2前駆体は3箇所のN−グリコジル化可能部
位をそのプロ領域に有している (St+arples
ら、1987. DNA 6;239−244)。
TGF−βlに関する研究は、TGF−β1のプロドメ
インにおけるN−グリコジル化及びリン酸化がトランス
フェクションされたCHO細胞内で起きることを確認し
ており、前駆体の重要な機能的役割を成熟分子の細胞で
の合成、及び放出または分泌に関係付ける(Brunn
erら、1988. Mo[、Ce11.Biol、8
:2229−2232)、また、TGF−β1前駆体に
おけるマンノース−6−リン酸の存在も、前駆体が独立
した機能的活性を有するとの仮説を支持する(Purc
hi。
インにおけるN−グリコジル化及びリン酸化がトランス
フェクションされたCHO細胞内で起きることを確認し
ており、前駆体の重要な機能的役割を成熟分子の細胞で
の合成、及び放出または分泌に関係付ける(Brunn
erら、1988. Mo[、Ce11.Biol、8
:2229−2232)、また、TGF−β1前駆体に
おけるマンノース−6−リン酸の存在も、前駆体が独立
した機能的活性を有するとの仮説を支持する(Purc
hi。
ら、198B、 J、 Biol、 Chew、 23
6:14211−14215)。
6:14211−14215)。
キメラTGF−β1/β2前駆体がサルTGF−βlプ
ロドメインを含むため、出願人らは、TGF−β1/β
2前駆体が機能的に活性であり、成熟TGF−β1/β
2分子の正確なプロセシングにとって重要である可能性
が高いと考えている。したがって、発現系に使用した宿
主細胞の、キメラTGF−βl/β2を正確に発現させ
プロセシングする能力は、成熟、生物活性産物の生産に
重要である。
ロドメインを含むため、出願人らは、TGF−β1/β
2前駆体が機能的に活性であり、成熟TGF−β1/β
2分子の正確なプロセシングにとって重要である可能性
が高いと考えている。したがって、発現系に使用した宿
主細胞の、キメラTGF−βl/β2を正確に発現させ
プロセシングする能力は、成熟、生物活性産物の生産に
重要である。
ここに記載する特別の実施態様において、或塾生物活性
TGF−β1/β2は、チャイニーズハムスター卵1(
C110)宿主細胞系においてサルウィルス40 (S
V40)発現制御要素を用い、成功裡に生産される。し
かしながら、当業者は、様々な他の動物の宿主/発現ベ
クター系(すなわち適当な宿主細胞内でTGF−βl/
β2コ一ド配列の複製、転写及び翻訳を指示するための
必要要素を含有するベクター)を同じように良好に利用
することができる。
TGF−β1/β2は、チャイニーズハムスター卵1(
C110)宿主細胞系においてサルウィルス40 (S
V40)発現制御要素を用い、成功裡に生産される。し
かしながら、当業者は、様々な他の動物の宿主/発現ベ
クター系(すなわち適当な宿主細胞内でTGF−βl/
β2コ一ド配列の複製、転写及び翻訳を指示するための
必要要素を含有するベクター)を同じように良好に利用
することができる。
これらは、ウィルス発現ベクター/1r11i乳頌宿主
細胞(例えば、シトメガロウイルス、ワタシニアウイル
ス、アゾノウ・イルス、その地回種類のもの);昆虫ウ
ィルス発現ベクター/昆虫細胞系(例えば、バクロウィ
ルス);または哺乳類細胞のゲノムから誘導された非ウ
ィルス性プロモーター発現系(例えばマウスメタロチオ
ネインプロモーター)を含むがこれに限定されない。
細胞(例えば、シトメガロウイルス、ワタシニアウイル
ス、アゾノウ・イルス、その地回種類のもの);昆虫ウ
ィルス発現ベクター/昆虫細胞系(例えば、バクロウィ
ルス);または哺乳類細胞のゲノムから誘導された非ウ
ィルス性プロモーター発現系(例えばマウスメタロチオ
ネインプロモーター)を含むがこれに限定されない。
これらのベクターの発現要素はその強度及び特異性にお
いて変化する。使用する宿主/ベクター系に依存して、
多くの適当な転写及び翻訳要素のうちのどれでも一つを
使用することができる。例えば咄乳動吻細胞系内でのク
ローニングの場合には、哺乳類細胞のゲノムから(例え
ばマウスメタロチオネインプロモーター)またはこれら
の細胞内で成育可能なウィルスから(例えばワタシニア
ウイルス7.5にプロモーター)単離されたプロモータ
ーが使用できる。組換えDNAまたは合成技術により製
造されたプロモーターもまた、挿入配列の転写のために
使用することができる。
いて変化する。使用する宿主/ベクター系に依存して、
多くの適当な転写及び翻訳要素のうちのどれでも一つを
使用することができる。例えば咄乳動吻細胞系内でのク
ローニングの場合には、哺乳類細胞のゲノムから(例え
ばマウスメタロチオネインプロモーター)またはこれら
の細胞内で成育可能なウィルスから(例えばワタシニア
ウイルス7.5にプロモーター)単離されたプロモータ
ーが使用できる。組換えDNAまたは合成技術により製
造されたプロモーターもまた、挿入配列の転写のために
使用することができる。
特定の開始シグナルもまた、挿入されたタンパク質コー
ド配列の十分な翻訳のために必要である。
ド配列の十分な翻訳のために必要である。
これらのシグナルは、ATG開始コドン及び隣接配列を
含む。例えばTGF−β1/β2コード配列部分のみが
挿入された場合には、ATG開始コドンを含む外的翻訳
制御シグナルが与えられなければならない。全挿入物の
翻訳を確実に行うためには、開始コドンはTGF−β1
/β2コード配列の読み枠と一致しなければならない。
含む。例えばTGF−β1/β2コード配列部分のみが
挿入された場合には、ATG開始コドンを含む外的翻訳
制御シグナルが与えられなければならない。全挿入物の
翻訳を確実に行うためには、開始コドンはTGF−β1
/β2コード配列の読み枠と一致しなければならない。
これらの外的翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然
及び合成の様々な起源のものであってよい。発現効率は
、転写減衰配列、エンハンサ−等の含有により増強され
うる。
及び合成の様々な起源のものであってよい。発現効率は
、転写減衰配列、エンハンサ−等の含有により増強され
うる。
TGF−β1/β2コード配列及び適切な転写/翻訳制
御シグナルを含む発現ベクターを構築するために、先に
記載したDNA断片をベクター中に挿入するためのあら
ゆる方法が使用できる。これらの方法は、インビトロ組
換えDNA技術、合成技術及びインビボ組換え(遺伝子
!fJiIAえ)を含んでよい。
御シグナルを含む発現ベクターを構築するために、先に
記載したDNA断片をベクター中に挿入するためのあら
ゆる方法が使用できる。これらの方法は、インビトロ組
換えDNA技術、合成技術及びインビボ組換え(遺伝子
!fJiIAえ)を含んでよい。
例えば、発現ベクターとしてアデノウィルスを使用する
場合には、TGF−βI/β2コード配列は、アデノウ
ィルス転写/翻訳制御複合体、例えば後方ブロモ−クー
及び3分節系リーダー配列に連結される。次いで、該キ
メラ遺伝子を、アデノウィルスのゲノム中に、インビト
ロまたはインビボ組換えによって挿入することができる
。該ウィルスゲノムの非必須領域(例えば領域Elまた
はC3)への挿入は、感染宿主内において生存可能で、
キメラTGF−βl/β2の発現能を有する組換えウィ
ルスを生しるであろう。同様にして、ワタシニア7.5
にプロモーターも用いられる。
場合には、TGF−βI/β2コード配列は、アデノウ
ィルス転写/翻訳制御複合体、例えば後方ブロモ−クー
及び3分節系リーダー配列に連結される。次いで、該キ
メラ遺伝子を、アデノウィルスのゲノム中に、インビト
ロまたはインビボ組換えによって挿入することができる
。該ウィルスゲノムの非必須領域(例えば領域Elまた
はC3)への挿入は、感染宿主内において生存可能で、
キメラTGF−βl/β2の発現能を有する組換えウィ
ルスを生しるであろう。同様にして、ワタシニア7.5
にプロモーターも用いられる。
TGF−β1/β2発現のために用いられる別の発現系
は、昆虫系である。このような系の一つにおいて、オー
トグーフッカ1フオルニ力(Auto ra haca
lifornica)核ポリヘドロシスウィルス(へc
NPV)が、外来遺伝子を発現させるベクターとして用
いられる。該ウィルスは、スボドプーーフルジベルS
odo tera fru i erda)細胞内で増
殖する。
は、昆虫系である。このような系の一つにおいて、オー
トグーフッカ1フオルニ力(Auto ra haca
lifornica)核ポリヘドロシスウィルス(へc
NPV)が、外来遺伝子を発現させるベクターとして用
いられる。該ウィルスは、スボドプーーフルジベルS
odo tera fru i erda)細胞内で増
殖する。
TGF−β1/β2コード配列を、該ウィルスの非必須
領域(例えばポリヘトリン遺伝子)中にクローン化し、
AcNPVプロモーター(例えばポリへドリンプロモー
ター)の制御下に置くことができる。
領域(例えばポリヘトリン遺伝子)中にクローン化し、
AcNPVプロモーター(例えばポリへドリンプロモー
ター)の制御下に置くことができる。
TGF−β1/β2コード配列の好結果の挿入は、ポリ
ヘトリン遺伝子の不活化及び非閉塞組換えウィルス (
すなわち、ポリヘトリン遺伝子によりコートされるタン
パク質性外皮を欠失したウィルス)の生成をもたらす。
ヘトリン遺伝子の不活化及び非閉塞組換えウィルス (
すなわち、ポリヘトリン遺伝子によりコートされるタン
パク質性外皮を欠失したウィルス)の生成をもたらす。
次いで、これらの組換えウィルスは、挿入遺伝子を発現
する。;<ffl F7□1芝jし欠乏ヱ土l細胞を感
染させるために使用される。
する。;<ffl F7□1芝jし欠乏ヱ土l細胞を感
染させるために使用される。
さらに、該挿入配列の発現を調節する、または該遺伝子
産物を特定の望ましい様式で修飾及びプロセシングする
宿主細胞株が選択される。ある種のプロモーターによる
発現を、ある種の誘導因子の存在下で上昇させることが
できる(たとえば、メクロチオネインプロモーターに対
する亜鉛及びカドミウムイオン)。従って、遺伝的に操
作されたTGF−βl/β2の発現を制御することがで
きる。
産物を特定の望ましい様式で修飾及びプロセシングする
宿主細胞株が選択される。ある種のプロモーターによる
発現を、ある種の誘導因子の存在下で上昇させることが
できる(たとえば、メクロチオネインプロモーターに対
する亜鉛及びカドミウムイオン)。従って、遺伝的に操
作されたTGF−βl/β2の発現を制御することがで
きる。
このことは、クローン化された外来遺伝子のタンパク質
産物が、宿主細胞にとって致命的である場合に重要であ
る。さらに、グリコジル化のような翻訳後の修飾、及び
タンパク質産物のタンパク質加水分解的切断のようなプ
ロセシング過程は、タンパク質の機能化にとって重要で
ある。様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセ
シング及び修飾のための、特徴的かつ特異的な機構を有
している。発現される外来タンパク質の正しい修飾及び
プロセシングを確実にするために、適切な細胞系または
宿主系を選択することができる。
産物が、宿主細胞にとって致命的である場合に重要であ
る。さらに、グリコジル化のような翻訳後の修飾、及び
タンパク質産物のタンパク質加水分解的切断のようなプ
ロセシング過程は、タンパク質の機能化にとって重要で
ある。様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセ
シング及び修飾のための、特徴的かつ特異的な機構を有
している。発現される外来タンパク質の正しい修飾及び
プロセシングを確実にするために、適切な細胞系または
宿主系を選択することができる。
発明の特定の実施態様においては、5V4031’A]
節配列の制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子(dhfr)と縦列にTGF−β1/β2コード配列
を含む発現ベクターが構築され、dhfr−欠失Cll
0細胞にトランスフェクションするために用いられる。
節配列の制御下にマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝
子(dhfr)と縦列にTGF−β1/β2コード配列
を含む発現ベクターが構築され、dhfr−欠失Cll
0細胞にトランスフェクションするために用いられる。
dhfr表現型を発現するCHO)ランスフエクタント
が、選択培地での増殖により分離された。TGF−β1
/β2の発現レベルを増加させるために、増幅されたレ
ベルのTGF−β1/β2 mRNAを転写するクロー
ンを分離する目的で、トランスフェクシントを濃度を上
昇させたメトトレキセートにさらしてもよい。TGF−
β1/β2 mRNA レベルは、増幅の様々な段階で
、溶液ハイブリッド形成(Uhlerら、1986+
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、υ、S
、A、83:1300−1304)によって検定できる
。
が、選択培地での増殖により分離された。TGF−β1
/β2の発現レベルを増加させるために、増幅されたレ
ベルのTGF−β1/β2 mRNAを転写するクロー
ンを分離する目的で、トランスフェクシントを濃度を上
昇させたメトトレキセートにさらしてもよい。TGF−
β1/β2 mRNA レベルは、増幅の様々な段階で
、溶液ハイブリッド形成(Uhlerら、1986+
Proc、 Natl、 Acad、 Sci、υ、S
、A、83:1300−1304)によって検定できる
。
TGF−βl/β2コ一ド配列を含み、生物学的に活性
な成熟産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一
般的アプローチによって同定される;(a) DNA
−DNA ハイフ゛す・ンド形成;<b)マーカー遺伝
子機能の存在または不在;(C)宿主細胞内のTGF−
β1/β2 mRNA転写物の発現により測定される転
写レベルの評価;および(d)イムノアツセイおよび最
終的にはその生物活性で測定される成熟遺伝子産物の検
出。
な成熟産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一
般的アプローチによって同定される;(a) DNA
−DNA ハイフ゛す・ンド形成;<b)マーカー遺伝
子機能の存在または不在;(C)宿主細胞内のTGF−
β1/β2 mRNA転写物の発現により測定される転
写レベルの評価;および(d)イムノアツセイおよび最
終的にはその生物活性で測定される成熟遺伝子産物の検
出。
第1のアプローチにおいては、発現ベクターに挿入され
たTGF−βI/β2コード配列の存在は、第1図に概
略を示したTGF−βl/β2コ一ド配列に相同なヌク
レオチド配列、あるいはその一部分または誘導体からな
るプローブを用いたDNA −DNAハイブリッド形戒
形成り検出できる。
たTGF−βI/β2コード配列の存在は、第1図に概
略を示したTGF−βl/β2コ一ド配列に相同なヌク
レオチド配列、あるいはその一部分または誘導体からな
るプローブを用いたDNA −DNAハイブリッド形戒
形成り検出できる。
第2のアプローチにおいては、組換え発現ベクター/宿
主系は、ある種の“マーカー”遺伝子機能(例えば、チ
ミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート
耐性、形質転換表現型、バクロウィルスにおける閉塞体
形成など)の存在または不在に基づいて同定され、選択
される。例えハT G F−β1/β2コード配列がベ
クターのマーカー遺伝子中に挿入された場合には、TG
F−β工/β2コード配列を含む組換え体を、マーカー
遺伝子機能の不在により同定することができる。別法と
して、TGF−β■/β2コード配列の発現制御に使用
される同一のまたは異なったプロモーターの制御下に、
マーカー遺伝子を↑GF−βl/β2配列に縦列に位置
させることができる。誘導または選択に対応するマーカ
ーの発現は、TGP−β1/β2コード配列の発現を示
している。
主系は、ある種の“マーカー”遺伝子機能(例えば、チ
ミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセート
耐性、形質転換表現型、バクロウィルスにおける閉塞体
形成など)の存在または不在に基づいて同定され、選択
される。例えハT G F−β1/β2コード配列がベ
クターのマーカー遺伝子中に挿入された場合には、TG
F−β工/β2コード配列を含む組換え体を、マーカー
遺伝子機能の不在により同定することができる。別法と
して、TGF−β■/β2コード配列の発現制御に使用
される同一のまたは異なったプロモーターの制御下に、
マーカー遺伝子を↑GF−βl/β2配列に縦列に位置
させることができる。誘導または選択に対応するマーカ
ーの発現は、TGP−β1/β2コード配列の発現を示
している。
第3のアプローチにおいては、TGF−βI/β2コー
ド領域の転写活性を、ハイブリッド形成により評価する
ことができる。例えば、ポリアデニル化RNAは、TG
F−β1/β2コード配列またはその特定の部分に相同
なプローブを用いたノーザンプロットにより単離及び分
析される。別法として、宿主細胞の全核酸を抽出し、こ
のようなプローブに対するハイブリッド形成により検定
してもよい。
ド領域の転写活性を、ハイブリッド形成により評価する
ことができる。例えば、ポリアデニル化RNAは、TG
F−β1/β2コード配列またはその特定の部分に相同
なプローブを用いたノーザンプロットにより単離及び分
析される。別法として、宿主細胞の全核酸を抽出し、こ
のようなプローブに対するハイブリッド形成により検定
してもよい。
第4のアプローチにおいて、成熟タンパク質産物を、免
疫学的に、例えばウェスタンプロットや、イムノブロッ
ティング、放射免疫沈澱、酵素結合イムノアッセイとい
ったイムノアッセイなどにより評価することができる。
疫学的に、例えばウェスタンプロットや、イムノブロッ
ティング、放射免疫沈澱、酵素結合イムノアッセイとい
ったイムノアッセイなどにより評価することができる。
しかしながら、発現系の成功についての最終的な試験は
、生物学的に活性なTGF−β1/β2遺伝子産物の検
出に関するものである。宿主細胞が遺伝子産物を分泌す
る場合には、培養トランスフェクタント宿主細胞から得
られる無細胞培地が、TGF〜βl/β2活性について
検定される。遺伝子産物が分泌されない場合には、この
ような活性について細胞溶解物を検定することができる
。いずれの場合にも、ここに記載された成長阻害アッセ
イなどの生物学的検定法が使用できる。
、生物学的に活性なTGF−β1/β2遺伝子産物の検
出に関するものである。宿主細胞が遺伝子産物を分泌す
る場合には、培養トランスフェクタント宿主細胞から得
られる無細胞培地が、TGF〜βl/β2活性について
検定される。遺伝子産物が分泌されない場合には、この
ような活性について細胞溶解物を検定することができる
。いずれの場合にも、ここに記載された成長阻害アッセ
イなどの生物学的検定法が使用できる。
ひとたび或PTGF−βl/β2を高水準で生産するク
ローンが同定されれば、該クローンを増殖させて、当分
野で周知の技術を使用して+fj製することができる。
ローンが同定されれば、該クローンを増殖させて、当分
野で周知の技術を使用して+fj製することができる。
このような方法には、イムノアフィニティ精製、高速液
体クロマl−グラフィーを含むクロマトグラフィーの手
法等がある。
体クロマl−グラフィーを含むクロマトグラフィーの手
法等がある。
実施例1
成熟TGF−β1配列のアミノ酸9.10、IL 12
.13.17.19.25及び26を成熟TGF−β2
配列の対応するアミノ酸で置き換えたTGF−β1前駆
体をコードする組換えプラスミドを構築した。詳述する
と、成熟TGF−βtのアミノ酸9 (セリン)はアル
ギニンによって置き換えられた、10番のアミノ酸(セ
リン)はアスパラギンによって置き換えられた、11番
のアミノ酸(スレオニン)はバリンによって置き換えら
れた、12番のアミノ酸(グルタ藁ン酸)はグルタミン
によって置き換えられた、13番のアミノ酸(リジン)
はアスパラギン酸によって置き換えられた、17番のア
ミノ酸(バリン)はロイシンによって置き換えられた、
19番のアミノ酸(グルタミン)はプロリンによって置
き換えられた、25番のアミノ酸(アルギニン)はリジ
ンによって置き換えられた、26番のアミノ酸(リジン
)はアルギニンによって置き換えられた。CHO細胞に
トランスフェクションするために該構築物を用いた。
.13.17.19.25及び26を成熟TGF−β2
配列の対応するアミノ酸で置き換えたTGF−β1前駆
体をコードする組換えプラスミドを構築した。詳述する
と、成熟TGF−βtのアミノ酸9 (セリン)はアル
ギニンによって置き換えられた、10番のアミノ酸(セ
リン)はアスパラギンによって置き換えられた、11番
のアミノ酸(スレオニン)はバリンによって置き換えら
れた、12番のアミノ酸(グルタ藁ン酸)はグルタミン
によって置き換えられた、13番のアミノ酸(リジン)
はアスパラギン酸によって置き換えられた、17番のア
ミノ酸(バリン)はロイシンによって置き換えられた、
19番のアミノ酸(グルタミン)はプロリンによって置
き換えられた、25番のアミノ酸(アルギニン)はリジ
ンによって置き換えられた、26番のアミノ酸(リジン
)はアルギニンによって置き換えられた。CHO細胞に
トランスフェクションするために該構築物を用いた。
成熟、生物活性キメラTGF−β1/β2を生成、分泌
するトランスフェクシントを単離した。
するトランスフェクシントを単離した。
(1)杜牲反逝去扶
(1,1) DNA ’″ンスフエジョン10hdh
fr−欠失CHO細胞を100開培養皿に接種しておよ
そ24時間後に、該培養物に、lugのNde l線状
化p5β/dhfrプラスミドおよびキャリアーとして
19μgの子ウシ胸腺DNAを、リン酸カルシウム沈澱
(Wigler、 M、ら、197!L Proc、
Natl。
fr−欠失CHO細胞を100開培養皿に接種しておよ
そ24時間後に、該培養物に、lugのNde l線状
化p5β/dhfrプラスミドおよびキャリアーとして
19μgの子ウシ胸腺DNAを、リン酸カルシウム沈澱
(Wigler、 M、ら、197!L Proc、
Natl。
^cad、 Sci、 U、S、A、 76:1373
−1376)として、トランスフェクションした。概説
すると、20ugのプラスミド及びキャリアーDNAを
1 rrdlの250mM 滅菌塩化カルシウムに添加
した。3′!;DNA溶液(1mfりを2 XHEPE
S溶液(280mM NaCl、 50mM HEPE
S、 1.5mMリン酸ナトリウム、pH7,1)の1
rttlに小量ずつ添加し、該混合液を30分間氷上
に放置した。次いで沈澱を、10−〇F12培地を含む
細胞上に分散して滴下した。37°C4時間インキュヘ
ーション後、培地を除去し、室温で90秒間、25%グ
リセL1−ルを含むF12培地10 m(lと交換した
。細胞を20m1のF12培地で−回すすぎ、非選択F
12培地(20mR)中で、さらに48時間インキュベ
ートした。 dhfr発現トランスフェクタントの選択
は、培地をIO%透析済みウシ胎児血清(FBS) (
Gibco)及び150μg/mj!Lプロリンを添加
したDMIEMと交換することによって行われた。該選
択培地で10−14日細胞を培養した後、コロニーが観
察された。
−1376)として、トランスフェクションした。概説
すると、20ugのプラスミド及びキャリアーDNAを
1 rrdlの250mM 滅菌塩化カルシウムに添加
した。3′!;DNA溶液(1mfりを2 XHEPE
S溶液(280mM NaCl、 50mM HEPE
S、 1.5mMリン酸ナトリウム、pH7,1)の1
rttlに小量ずつ添加し、該混合液を30分間氷上
に放置した。次いで沈澱を、10−〇F12培地を含む
細胞上に分散して滴下した。37°C4時間インキュヘ
ーション後、培地を除去し、室温で90秒間、25%グ
リセL1−ルを含むF12培地10 m(lと交換した
。細胞を20m1のF12培地で−回すすぎ、非選択F
12培地(20mR)中で、さらに48時間インキュベ
ートした。 dhfr発現トランスフェクタントの選択
は、培地をIO%透析済みウシ胎児血清(FBS) (
Gibco)及び150μg/mj!Lプロリンを添加
したDMIEMと交換することによって行われた。該選
択培地で10−14日細胞を培養した後、コロニーが観
察された。
(1,2)メ レキセー のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ(dhfr)増幅細胞は、基本的には(Ga
sser、 C,S、およびSchimke、 R。
ダクターゼ(dhfr)増幅細胞は、基本的には(Ga
sser、 C,S、およびSchimke、 R。
T、、1986. J、 Biol、 Chem、 2
61:693B−6946)の記載にしたがってはじめ
のトランスフェクシントから誘導された。増殖後10S
細胞が、100mm培養皿に接種され、メトトレキセー
ト濃度の上昇(LOOnM ;500nM ; 2,5
00nM ; to、000nM ; 20.OO
OnM)に適応させた。メトトレキセートの初発温度は
1100nであった。目にみえるコロニーを含む平板を
トリプシン処理し、少なくともさらに2回の1:5細胞
継代の間、上記濃度のメトトレキセートに適応させた。
61:693B−6946)の記載にしたがってはじめ
のトランスフェクシントから誘導された。増殖後10S
細胞が、100mm培養皿に接種され、メトトレキセー
ト濃度の上昇(LOOnM ;500nM ; 2,5
00nM ; to、000nM ; 20.OO
OnM)に適応させた。メトトレキセートの初発温度は
1100nであった。目にみえるコロニーを含む平板を
トリプシン処理し、少なくともさらに2回の1:5細胞
継代の間、上記濃度のメトトレキセートに適応させた。
次いで、細胞(106)をつぎに高い濃度のメトトレキ
セートを含む100nu++ 1@養皿に接種した。
セートを含む100nu++ 1@養皿に接種した。
目にみえるコロニーを有する培養皿を再びトリプシン処
理し、培地を含むメトトレキセート中で適応させた。細
胞は、増幅の様々な段階で、40%FBS、10%ジメ
チルスルフオキシドおよび50%DMEM含有培地中で
凍結保存された。この凍結培地にはメトトレキセート・
は含まれない。
理し、培地を含むメトトレキセート中で適応させた。細
胞は、増幅の様々な段階で、40%FBS、10%ジメ
チルスルフオキシドおよび50%DMEM含有培地中で
凍結保存された。この凍結培地にはメトトレキセート・
は含まれない。
(1,3)底遣韮圓に乞ム1±
ミンク肺上皮細胞、MvlLu(寄託番号CCL−64
゜アメリカンタイプカルチャーコレクション)、はTG
F−βに対してきわめて感受性であるが、これを成育阻
害アッセイに使用した。ア・ンセイは、f)NA合合成
評価するためにチミジンアナログ5“−[15■]ヨー
ド2″デオキシウリジン(”rdu)を使用して行った
。活性の1ユニツトは、1s1dUの取り込みを非処理
CCL−64細胞と比較して50%阻害するのに必要な
星と定義した。
゜アメリカンタイプカルチャーコレクション)、はTG
F−βに対してきわめて感受性であるが、これを成育阻
害アッセイに使用した。ア・ンセイは、f)NA合合成
評価するためにチミジンアナログ5“−[15■]ヨー
ド2″デオキシウリジン(”rdu)を使用して行った
。活性の1ユニツトは、1s1dUの取り込みを非処理
CCL−64細胞と比較して50%阻害するのに必要な
星と定義した。
活性TGF−βl/β2の分泌についてトランスフェク
ションされた細胞を検定するために、気血清上清を細胞
の集密培養の一つの24時間集団から集め、大容量の0
.2M酢酸に対して透析した。試料はアッセイのために
滅菌完全培地に希釈した。
ションされた細胞を検定するために、気血清上清を細胞
の集密培養の一つの24時間集団から集め、大容量の0
.2M酢酸に対して透析した。試料はアッセイのために
滅菌完全培地に希釈した。
(1,4)ペプチド配列 び−“ −・−ペプチドは固
相法によりベックマン990装置で合成され、すでに記
載されたように(Gentry、 L。
相法によりベックマン990装置で合成され、すでに記
載されたように(Gentry、 L。
E、ら、1983. J、 Riot、 Chem、
258:11219−11228 ;Gentry+
L、E、およびLawton+ A、+1986. V
irology152:421−431)、樹脂から溶
離された。精製は調製用高速液体クロマトグラフィーで
行った。ペプチドの構造はアミノ酸分析によって確認さ
れた。
258:11219−11228 ;Gentry+
L、E、およびLawton+ A、+1986. V
irology152:421−431)、樹脂から溶
離された。精製は調製用高速液体クロマトグラフィーで
行った。ペプチドの構造はアミノ酸分析によって確認さ
れた。
合成ペプチドはシスティン残基を介してウシガンマグロ
ブリンに複合された。カップリング反応は、基本的に記
載(Gentry、 [E、およびLawton。
ブリンに複合された。カップリング反応は、基本的に記
載(Gentry、 [E、およびLawton。
A、 、 1986.上記)の通り行われた。ペプチド
の複合効率は、ガンマグロブリン分子当り共有結合した
ペプチドが8から26分子までの範囲であった。
の複合効率は、ガンマグロブリン分子当り共有結合した
ペプチドが8から26分子までの範囲であった。
フロイント完全アジュバント中に乳化させたペプチド複
合体(ペプチド100μg当量)は、ニューシーラント
シロウサギに、皮下接種および皮肉接種を組み合わせて
3箇所から6箇所で注入された。追加接種は2−3週間
間隔で投与した。追加接種の後7−14日で、採血した
。
合体(ペプチド100μg当量)は、ニューシーラント
シロウサギに、皮下接種および皮肉接種を組み合わせて
3箇所から6箇所で注入された。追加接種は2−3週間
間隔で投与した。追加接種の後7−14日で、採血した
。
TGF−β1分子内のペプチド配列に向って指向する抗
ペプチド抗体は、免疫源として合成ペプチドを用いウサ
ギで作成された(Gen tryら、1987. Mo
l。
ペプチド抗体は、免疫源として合成ペプチドを用いウサ
ギで作成された(Gen tryら、1987. Mo
l。
Ce11. Biol、 7:3418−3427)
、該抗体のうちの一つ(抗−TGF−β1 !69−3
81)はTGF−β成長因子の成熟型に存在するエピト
ープに向けられていた。
、該抗体のうちの一つ(抗−TGF−β1 !69−3
81)はTGF−β成長因子の成熟型に存在するエピト
ープに向けられていた。
他の二つの抗体(抗−TGF−βI l1l−94およ
び抗−TGF−β12□S−2ff6)は前駆体特異的
であり、TGF−βlの前駆体分子内にのみ存在するペ
プチド配列に向けられている。
び抗−TGF−β12□S−2ff6)は前駆体特異的
であり、TGF−βlの前駆体分子内にのみ存在するペ
プチド配列に向けられている。
(1,5)イムノプロ・・−ング
タンパク質は、7.5%−17,5%直直線度勾配5D
S−ポリアクリルアミドゲル上で分画し、非修飾ニトロ
セルロース(0,45μm : 5chleicher
および5chuell)に、4°C124V、1時間で
転移させた(BurneLLe、 W、N、、1981
+ Anal、Biochem、 112:195−2
03)。ニトロセルロースの余剰の結合能力は、0.2
%NP−40を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)中で2
.5%BLOTTO(Johnson、 D、 A、ら
、1984. GeneAnal、 Techn、 l
:3−8)とインキュベートすることによってブロック
した。2.5%BLOTTO中l:75希釈のウサギ抗
血清を、ブロックされたニトロセルロースシートと共に
室温で2時間インキュベートした。2.5%BLOTT
O中で5分間洗浄5回によって余分な抗体を洗い流した
後、該二トロセルロースシートは、2.5%BLOTT
O中1 : 500に希釈されたアルカリフォスファタ
ーゼ結合プロティンAと共にインキュベートした。1時
間インキュベートした後、該ニトロセルロースシートは
0.2%NP−40を含むPBS(5分間洗浄)で5回
洗浄し、展開された (Leary ら、1983.
Proc、 Natl、 Acad。
S−ポリアクリルアミドゲル上で分画し、非修飾ニトロ
セルロース(0,45μm : 5chleicher
および5chuell)に、4°C124V、1時間で
転移させた(BurneLLe、 W、N、、1981
+ Anal、Biochem、 112:195−2
03)。ニトロセルロースの余剰の結合能力は、0.2
%NP−40を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)中で2
.5%BLOTTO(Johnson、 D、 A、ら
、1984. GeneAnal、 Techn、 l
:3−8)とインキュベートすることによってブロック
した。2.5%BLOTTO中l:75希釈のウサギ抗
血清を、ブロックされたニトロセルロースシートと共に
室温で2時間インキュベートした。2.5%BLOTT
O中で5分間洗浄5回によって余分な抗体を洗い流した
後、該二トロセルロースシートは、2.5%BLOTT
O中1 : 500に希釈されたアルカリフォスファタ
ーゼ結合プロティンAと共にインキュベートした。1時
間インキュベートした後、該ニトロセルロースシートは
0.2%NP−40を含むPBS(5分間洗浄)で5回
洗浄し、展開された (Leary ら、1983.
Proc、 Natl、 Acad。
Set、 U、S、A、 80:4045−4049)
。
。
キメラTGF−β1/β2タンパク質の合成をプログラ
ムするプラスミドを以下のように構築した。
ムするプラスミドを以下のように構築した。
pAc373 (MiyamoLoら、1985. M
o1. Ce11. Biol、 5:2860−28
65HMadisenら、1987. Virolog
y 158:248−250)から誘導されたバクロウ
ィルスベクターpAcβTGF−1は、pAc611
(Miyamotoら、1985. Mof。
o1. Ce11. Biol、 5:2860−28
65HMadisenら、1987. Virolog
y 158:248−250)から誘導されたバクロウ
ィルスベクターpAcβTGF−1は、pAc611
(Miyamotoら、1985. Mof。
Ce11. Biol、 5:2860−2865 H
Madisenら、1987゜Virology 15
8:24B−250)のPst I −EcoRI部位
にクローン化されたTGF−β1の1.4Kb力匹■−
影遼RIコード配列(Sharplesら、1987.
DNA6 :239−244)を含むが、このpAc
βTGF−1をBan+HIおよびEcoR■で消化し
、TGF−βlコード配列の375塩基対断片を単離し
た(断片l)。psv 2−βTGP (Gentr
yら、1987. Mo1. Ce11. Biol、
7:3418−3427)を石!およびEcoRIで
消化し、3.5Kb断片を単離した(断片2)。
Madisenら、1987゜Virology 15
8:24B−250)のPst I −EcoRI部位
にクローン化されたTGF−β1の1.4Kb力匹■−
影遼RIコード配列(Sharplesら、1987.
DNA6 :239−244)を含むが、このpAc
βTGF−1をBan+HIおよびEcoR■で消化し
、TGF−βlコード配列の375塩基対断片を単離し
た(断片l)。psv 2−βTGP (Gentr
yら、1987. Mo1. Ce11. Biol、
7:3418−3427)を石!およびEcoRIで
消化し、3.5Kb断片を単離した(断片2)。
下記に示す配列を持つ相補的合成ヌクレオチドを、アプ
ライドバイオシステムズ オリゴヌクレオチドシンセサ
イザーで合或し、アクリルアミドゲルで猜製した。ホス
ファターゼをT4キナーゼと共に添加し、等モル澄のリ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。次いで、ア
ニールされた二木鎖合成DNへは、上記断片Il+およ
び“2′に連結された。該連結反応混合液を、E、co
liを形質転換するために使用し、5βpSV2 (七
+a−Eco”)を単離した。
ライドバイオシステムズ オリゴヌクレオチドシンセサ
イザーで合或し、アクリルアミドゲルで猜製した。ホス
ファターゼをT4キナーゼと共に添加し、等モル澄のリ
ン酸化オリゴヌクレオチドをアニールした。次いで、ア
ニールされた二木鎖合成DNへは、上記断片Il+およ
び“2′に連結された。該連結反応混合液を、E、co
liを形質転換するために使用し、5βpSV2 (七
+a−Eco”)を単離した。
−CAA CAT CTG CAA AGCTC
CCGG CACCGCCGA GCCCTG
GACACCAACTACTGCTTCAGA AA
T GTG CAGGAT AAT TGCTGC
CTA CGT CCG CTr TACATT
GATTTCAAG AGG GAT CTA
GGG TGG AAA TG −3’1 GAT CCA TTT CCA CCCTAG
ATCCCT CTT GAA ATC5βpS
V2(jLL−Eco”)をEcoRl テ消化し、フ
レノウ醇素で充填し、l1indtllで消化して、キ
メラTGF−βl/β2コード配列を含む1.4Kb断
片を単離した(断片3)、5βpSV2は、断片3をp
SV2に連結することにより構築され、このpsv 2
は、ne。
CCGG CACCGCCGA GCCCTG
GACACCAACTACTGCTTCAGA AA
T GTG CAGGAT AAT TGCTGC
CTA CGT CCG CTr TACATT
GATTTCAAG AGG GAT CTA
GGG TGG AAA TG −3’1 GAT CCA TTT CCA CCCTAG
ATCCCT CTT GAA ATC5βpS
V2(jLL−Eco”)をEcoRl テ消化し、フ
レノウ醇素で充填し、l1indtllで消化して、キ
メラTGF−βl/β2コード配列を含む1.4Kb断
片を単離した(断片3)、5βpSV2は、断片3をp
SV2に連結することにより構築され、このpsv 2
は、ne。
遺伝子を除去するためにl1indlllおよび石組1
で車前に消化しておいた。
で車前に消化しておいた。
5βpSV2をEcoRlで消化し、フレノウ醇素で充
填し、ル膿1で消化して、2.6にbの力独I−シ釧R
1(平滑)断片を単離し、さらにカ匡!およびI’vu
llで切断しておいたpSV2 /dl+rr CGe
rnLyら、1987゜Mo1. Ce11.°Bio
1.7:3718−3727)に連結した。該連結反応
混合液を、!!、co目を形質転換するために使用し、
pI5β/dhfrを単離した。p5β/dhfrによ
りコードされるキメラTGF−β1/β2分子のヌクレ
オチド配列及び推定アミノ酸配列を第1図に示す。
填し、ル膿1で消化して、2.6にbの力独I−シ釧R
1(平滑)断片を単離し、さらにカ匡!およびI’vu
llで切断しておいたpSV2 /dl+rr CGe
rnLyら、1987゜Mo1. Ce11.°Bio
1.7:3718−3727)に連結した。該連結反応
混合液を、!!、co目を形質転換するために使用し、
pI5β/dhfrを単離した。p5β/dhfrによ
りコードされるキメラTGF−β1/β2分子のヌクレ
オチド配列及び推定アミノ酸配列を第1図に示す。
(6,2) CHOにお3るTGP−12のp5β/d
hfrは、CHO細胞にトランスフェクションされ、上
記実施例1の(1)に述べたように、単一のクローンが
メトトレキセートによって増幅された。このような増幅
されたクローンの−っ、CHO−5β41.2.5をさ
らなる特徴付けのために選択した。
hfrは、CHO細胞にトランスフェクションされ、上
記実施例1の(1)に述べたように、単一のクローンが
メトトレキセートによって増幅された。このような増幅
されたクローンの−っ、CHO−5β41.2.5をさ
らなる特徴付けのために選択した。
ClO−3β41,2.5細胞は、2.5μHメトトレ
キセート中で集密状態に成育された。培地を無血清培地
と交換し、24時間後に集め、48時間0.2M酢酸に
対して透析した。透析された順化培地上清は、上記実施
例1の(1,3)に記述されたように、CCL−64細
胞のDNA合成阻害によって、生物活性を検定された。
キセート中で集密状態に成育された。培地を無血清培地
と交換し、24時間後に集め、48時間0.2M酢酸に
対して透析した。透析された順化培地上清は、上記実施
例1の(1,3)に記述されたように、CCL−64細
胞のDNA合成阻害によって、生物活性を検定された。
ClO−3β41.2.5細胞は約2■/Lの生物活性
キメラTGF−β1/β2を分泌する(第2図)。
キメラTGF−β1/β2を分泌する(第2図)。
コレらの細胞により分泌されるTGF−β関連タンバク
質を、上記実施例1の(1,5)に記述されたように成
熟TGF−β1に対して向けられた抗−ペプチド抗体を
用いたイムノプロンティングによって分析した。第3図
は、非還元条件下、SOS −PAG[Eで分析すると
、C110−5β41,2.5細胞が、90から100
キロドルトン及び24キロドルトンを泳動する免疫反応
性タンパク質を分泌していることを示す(第3 図、レ
ーンi)。24キロドルトンのバンドは成熟TGF−β
1/β2二量体を表し、90から100キロドルトンの
タンパク質はおそら< +iil駆体配列体配列ルフィ
ド結合した成熟TGF−β1/β2を示す(Gentr
yら、1987. Mo1. Ce11. Biol、
7:341B−3421)。
質を、上記実施例1の(1,5)に記述されたように成
熟TGF−β1に対して向けられた抗−ペプチド抗体を
用いたイムノプロンティングによって分析した。第3図
は、非還元条件下、SOS −PAG[Eで分析すると
、C110−5β41,2.5細胞が、90から100
キロドルトン及び24キロドルトンを泳動する免疫反応
性タンパク質を分泌していることを示す(第3 図、レ
ーンi)。24キロドルトンのバンドは成熟TGF−β
1/β2二量体を表し、90から100キロドルトンの
タンパク質はおそら< +iil駆体配列体配列ルフィ
ド結合した成熟TGF−β1/β2を示す(Gentr
yら、1987. Mo1. Ce11. Biol、
7:341B−3421)。
還元条件下では(第3図、レーン2)、タンパク質の大
部分は12キロドルトンに泳動し、成熟TGF−βl/
β2単量体を表す。サルTGF−βl遺伝子をコードす
るプラスミドをトランスフェクションされたCHO細胞
中で発現される組換え体タンパク質についての同様の分
析において観察された45から55キロドルトンの範囲
の免疫反応性物質が存在しなかったこと(Gentry
ら、1987. Mo1. Ce1l。
部分は12キロドルトンに泳動し、成熟TGF−βl/
β2単量体を表す。サルTGF−βl遺伝子をコードす
るプラスミドをトランスフェクションされたCHO細胞
中で発現される組換え体タンパク質についての同様の分
析において観察された45から55キロドルトンの範囲
の免疫反応性物質が存在しなかったこと(Gentry
ら、1987. Mo1. Ce1l。
Biol、7:341B−3427)は、キメラTGF
−β1/β2がその親分子であるTGF−β1に比べて
より効率的にタンパク質加水分解的なプロセシングを受
けることを示しており、注目すべきである。さらに、C
110−5β41,2.5細胞はTGF−βを発現する
C110細胞に比べて2.5倍の生物活性な成熟タンパ
ク質を分泌する。これらの観察の基礎は現時点では不明
であるが、キメラTGF−β1/β2前駆体の2次構造
がTGF−β1の2次構造と著しく異なっており、この
2次構造によってキメラTGF−βl/β2が異なる強
度あるいは性質の分子的プロセシングを受けるものと思
われる。例えば、TGF−β1/β2前InはTGF−
β1のプロセシングに関与する因子に対してより都合の
よい基質であるかも知れない。
−β1/β2がその親分子であるTGF−β1に比べて
より効率的にタンパク質加水分解的なプロセシングを受
けることを示しており、注目すべきである。さらに、C
110−5β41,2.5細胞はTGF−βを発現する
C110細胞に比べて2.5倍の生物活性な成熟タンパ
ク質を分泌する。これらの観察の基礎は現時点では不明
であるが、キメラTGF−β1/β2前駆体の2次構造
がTGF−β1の2次構造と著しく異なっており、この
2次構造によってキメラTGF−βl/β2が異なる強
度あるいは性質の分子的プロセシングを受けるものと思
われる。例えば、TGF−β1/β2前InはTGF−
β1のプロセシングに関与する因子に対してより都合の
よい基質であるかも知れない。
あるいは、TGF−β1/β2の2次構造の性質は、T
GF−β1/β2がTGF−βlが利用できないような
他のプロセシングの因子あるいは経路と関与できるよう
にしているのかも知れない。
GF−β1/β2がTGF−βlが利用できないような
他のプロセシングの因子あるいは経路と関与できるよう
にしているのかも知れない。
以下のトランスフェクシントがアメリカンタイプカルチ
ャーコレクション(American Type Cu
1−ture Co11ection) Rockvi
lle、 MDに寄託され、示しである寄託番号を与え
られた。
ャーコレクション(American Type Cu
1−ture Co11ection) Rockvi
lle、 MDに寄託され、示しである寄託番号を与え
られた。
スンスフェクー乙上 11表まV −■Cll0−5
β41.2.5 CL 5 p5β/dhfr
CRL−9959零発唄は、寄託された細胞系による範
囲、または発明の一局面の一つの例示として意図されこ
こに明示された実施態様による範囲に限定されることは
なく、機能的に等価な如何なるものも本発明の範囲内に
ある。実際、ここに示し記述した以外に様々な改変が、
前述の記述から、当業者にとって明らかになるであろう
。このような改変は、添付の請求の範囲内にあるものと
意図される。
β41.2.5 CL 5 p5β/dhfr
CRL−9959零発唄は、寄託された細胞系による範
囲、または発明の一局面の一つの例示として意図されこ
こに明示された実施態様による範囲に限定されることは
なく、機能的に等価な如何なるものも本発明の範囲内に
ある。実際、ここに示し記述した以外に様々な改変が、
前述の記述から、当業者にとって明らかになるであろう
。このような改変は、添付の請求の範囲内にあるものと
意図される。
また、ヌクレオチド及びペプチドに付されたあらゆる塩
基対及びアミノ酸残基の番号及びサイズは概数であり説
明の目的のために使用されたと理解される。
基対及びアミノ酸残基の番号及びサイズは概数であり説
明の目的のために使用されたと理解される。
第1図2発現プラスミドp5β/dhfrによりコード
されたTGF−β1/β2ハイブリツドタンパク質のヌ
クレオチド配列及び推定アミノ酸配列。 第2図、5β41.2.5細胞由来順化培地の生物活性
。生物活性は、CCL−64Sンク肺上皮細胞の成育阻
害アッセイにより測定した。(A)5β412.5細胞
により24時間順化された無血清培地を0.2M酢酸に
対して透析し、下記実施例Iの(1,3)の記載にした
がって検定した。(B) TGF−βlの標f威育阻害
曲線。 第3図、5β41.2.5細胞により分泌されたタンパ
ク質のイムノプロット分析。5β41,2.5細胞は集
密状態まで成育させた;培地を0.2M酢酸に対して透
析し、非還元条件(レーン1)または還元条件(レーン
2)のもと、抗TGP−β116?−:l□を用いたイ
ムノブロッティングにより、実施例1の(1,5)の記
載にしたがって、検定した。
されたTGF−β1/β2ハイブリツドタンパク質のヌ
クレオチド配列及び推定アミノ酸配列。 第2図、5β41.2.5細胞由来順化培地の生物活性
。生物活性は、CCL−64Sンク肺上皮細胞の成育阻
害アッセイにより測定した。(A)5β412.5細胞
により24時間順化された無血清培地を0.2M酢酸に
対して透析し、下記実施例Iの(1,3)の記載にした
がって検定した。(B) TGF−βlの標f威育阻害
曲線。 第3図、5β41.2.5細胞により分泌されたタンパ
ク質のイムノプロット分析。5β41,2.5細胞は集
密状態まで成育させた;培地を0.2M酢酸に対して透
析し、非還元条件(レーン1)または還元条件(レーン
2)のもと、抗TGP−β116?−:l□を用いたイ
ムノブロッティングにより、実施例1の(1,5)の記
載にしたがって、検定した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、アミノ酸番号約279からアミノ酸残基番号約39
0までの、実質的に第1図に記述されたアミノ酸配列か
らなるキメラ変換成長因子−β1/β2。 2、ヌクレオチド残基番号約836からヌクレオチド残
基番号約1170までの、実質的に第1図に記述された
ヌクレオチド配列からなるキメラ変換成長因子−β1/
β2をコードするヌクレオチド配列。 3、ヌクレオチド残基番号約1からヌクレオチド残基番
号約1170までの、実質的に第1図に記述されたヌク
レオチドコード配列からなるキメラ変換成長因子−β1
/β2をコードするヌクレオチド配列。 4、ヌクレオチド番号約836からヌクレオチド番号約
1170までの、実質的に第1図に記述された、キメラ
変換成長因子−β1/β2のヌクレオチドコード配列を
含有する細胞。 5、ヌクレオチド番号約1からヌクレオチド番号約11
70までの、実質的に第1図に記述された、キメラ変換
成長因子−β1/β2のヌクレオチドコード配列を含有
する細胞。 6、細胞がキメラ変換成長因子−β1/β2を生産する
ように遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の
制御のもとに、ヌクレオチド番号約836からヌクレオ
チド番号約1170までの、実質的に第1図に記述され
た、キメラ変換成長因子−β1/β2のヌクレオチドコ
ード配列を含有する細胞。 7、細胞がキメラ変換成長因子−β1/β2を生産する
ように遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の
制御のもとに、ヌクレオチド番号約1からヌクレオチド
番号約1170までの、実質的に第10図に記述された
、キメラ変換成長因子−β1/β2のヌクレオチドコー
ド配列を含有する細胞。 8、チャイニーズハムスター卵巣細胞からなる請求項第
6項または第7項記載の細胞。 9、遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列がS
V40プロモーターを有してなる請求項第6項または第
7項記載の細胞。 10、第二のヌクレオチド配列がプロモーターおよび選
択マーカーのコード配列を有してなる請求項第6項また
は第7項記載の細胞。 11、該選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼを有
してなる請求項第10項記載の細胞。 12、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託
され、寄託番号CRL−9959を有するCHO−5β
41、2.5CL5からなる細胞系。 13、(a)宿主細胞がキメラ変換成長因子−β1/β
2活性を有するペプチドまたはタンパク質を生産するよ
うに遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の制
御のもとに、ヌクレオチド番号約836からヌクレオチ
ド番号約1170までの、実質的に第1図に記述された
、キメラ変換成長因子−β1/β2のヌクレオチドコー
ド配列を含有する宿主細胞を培養し、 (b)該培養物からキメラ変換成長因子−β1/β2を
回収すること、 からなるキメラ変換成長因子−β1/β2の製造方法。 14、(a)宿主細胞がキメラ変換成長因子−β1/β
2活性を有するペプチドまたはタンパク質を生産するよ
うに遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチド配列の制
御のもとに、ヌクレオチド番号約1からヌクレオチド番
号約1170までの、実質的に第1図に記述された、キ
メラ変換成長因子−β1/β2のヌクレオチドコード配
列を含有する宿主細胞を培養し、 (b)該培養物からキメラ変換成長因子−β1/β2を
回収すること、 からなるキメラ変換成長因子−β1/β2の製造方法。 15、該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞を
有してなる請求項第13項または第14項記載の方法。 16、遺伝子発現を、調節する第二のヌクレオチド配列
がSV40プロモーターを有してなる請求項第13項ま
たは第14項記載の方法。 17、第二のヌクレオチド配列がプロモーターおよび宿
主細胞に欠失した選択マーカーのコード配列を有してな
り、その結果キメラ変換成長因子−β1/β2コード配
列を含む宿主細胞を同定できる、請求項第13または第
14項記載の方法。 18、該選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼを有
してなる請求項第17項記載の細胞。 19、増幅されたレベルのジヒドロ葉酸レダクターゼお
よびキメラ変換成長因子−β1/β2のコード配列を包
含する耐性コロニーを選択するために、該宿主細胞をメ
トトレキセートにさらすことからなる請求項第18記載
の方法。 20、(a)アメリカンタイプカルチャーコレクション
に寄託され、寄託番号CRL−9959を有するトラン
スフェクタントCHO−5β41、2.5CL5を培養
し、 (b)該培養物からキメラ変換成長因子−β1/β2を
回収すること、 からなるキメラ変換成長因子−β1/β2の製造方法。 21、該トランスフェクタントがメトトレキセート存在
下で培養される請求項第20項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28497288A | 1988-12-15 | 1988-12-15 | |
US284,972 | 1988-12-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0335794A true JPH0335794A (ja) | 1991-02-15 |
Family
ID=23092228
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1325735A Pending JPH0335794A (ja) | 1988-12-15 | 1989-12-15 | TGF―β1/β2:新規キメラ変換成長因子―ベータ |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5244793A (ja) |
EP (1) | EP0374044B1 (ja) |
JP (1) | JPH0335794A (ja) |
KR (1) | KR900009983A (ja) |
CN (1) | CN1045994A (ja) |
AT (1) | ATE111520T1 (ja) |
AU (1) | AU634733B2 (ja) |
CA (1) | CA2005120A1 (ja) |
DE (1) | DE68918248T2 (ja) |
DK (1) | DK633389A (ja) |
ES (1) | ES2063834T3 (ja) |
FI (1) | FI97299C (ja) |
HU (1) | HUT52550A (ja) |
IE (1) | IE66571B1 (ja) |
IL (1) | IL92669A (ja) |
NO (1) | NO300464B1 (ja) |
PT (1) | PT92603B (ja) |
ZA (1) | ZA899517B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5304541A (en) * | 1988-12-15 | 1994-04-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods using novel chimeric transforming growth factor-β1/β2 |
CA2003886A1 (en) * | 1988-12-16 | 1990-06-16 | Anthony F. Purchio | Cloning and expression of simian transforming growth factor-beta 1 |
US5169764A (en) * | 1990-08-08 | 1992-12-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Multitrophic and multifunctional chimeric neurotrophic factors, and nucleic acids and plasmids encoding the chimeras |
US5206023A (en) * | 1991-01-31 | 1993-04-27 | Robert F. Shaw | Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage |
GB9106678D0 (en) * | 1991-03-28 | 1991-05-15 | Ferguson Mark W J | Wound healing |
US5270300A (en) * | 1991-09-06 | 1993-12-14 | Robert Francis Shaw | Methods and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage or bone |
US6515009B1 (en) | 1991-09-27 | 2003-02-04 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
US5811447A (en) | 1993-01-28 | 1998-09-22 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
AU2738392A (en) * | 1991-11-11 | 1993-05-13 | Ciba-Geigy Ag | Novel hybrid transforming growth factors |
IT1259042B (it) * | 1992-01-27 | 1996-03-11 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Preparazione di vettori di espressione per la sintesi del polipeptide chiamato fattore osteogenetico op-1 in cellule eucariotiche di spodoptera frugiperda via infezione con baculovirus ricombinante |
US6395494B1 (en) | 1993-05-13 | 2002-05-28 | Neorx Corporation | Method to determine TGF-β |
US5420243A (en) * | 1993-01-26 | 1995-05-30 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Biologically active TGF-β2 peptides |
US5981568A (en) | 1993-01-28 | 1999-11-09 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
US6663881B2 (en) | 1993-01-28 | 2003-12-16 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
US6491938B2 (en) | 1993-05-13 | 2002-12-10 | Neorx Corporation | Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells |
ATE406909T1 (de) * | 1993-05-13 | 2008-09-15 | Poniard Pharmaceuticals Inc | Prävention und behandlung von pathologien, die mit einer abnormalen proliferationglatter muskelzellen verbunden sind |
US6117911A (en) | 1997-04-11 | 2000-09-12 | Neorx Corporation | Compounds and therapies for the prevention of vascular and non-vascular pathologies |
WO2003077852A2 (en) * | 2002-03-12 | 2003-09-25 | Tissuegene, Inc. | CARTILAGE REGENERATION USING CHONDROCYTE AND TGF-β |
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