DE68918248T2 - TGF beta 1/beta2: ein chimärer transformierender Wachstumsfaktor. - Google Patents
TGF beta 1/beta2: ein chimärer transformierender Wachstumsfaktor.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen chimären Transformations-Wachstumsfaktor-beta, der als TGF-β1/β2 bezeichnet wird, Nukleotide Sequenzen und Expressionsvektoren, die für TGF-β1/β2 kodieren und Verfahren zur Herstellung des TGF-β1/β2. Die Erfindung wird beispielhaft durch die Herstellung und Sekretion von TGF-β1/β2 durch CHO-Zellen erläutert, die mit Expressionsvektoren transfiziert worden sind, die für ein chimäres TGF-β1/β2 Prekursorgen kodieren. Das chimäre Genprodukt besitzt die biologische Aktivität des TGF-β.
- Der Transformations-Wachstumsfaktor-beta (TGF-β) stellt ein Mitglied einer kürzlich beschriebenen Polypetidfamilie dar, die die zelluläre Differenzierung und Proliferation reguliert. Zu weiteren Mitgliedern der Familie zählen die "Mullerian Inhibitory Substance" (Cate et al., 1986, Cell 45 : 685-698), die Inhibine (Mason et al., 1985, Nature 318 : 659-663) und ein Protein, das auf Grund eines Transkriptes des dekapentaplegischen Genkomplexes von Drosophila vorhergesagt wurde (Padgett et al., 1987, Nature 325 : 81-84).
- Vier Typen des TGF-β sind identifiziert und als TGF-β1, TGF-β2, TGF- β1.2 und TGF-β3 bezeichnet worden. Der erste beschriebene Typ, TGF-β1, besteht aus zwei identischen, durch Disulfid miteinander verbundenen Untereinheiten, die Molekulargewichte von 13 000 besitzen (Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 7155-7160; Frolik et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 3676-3680; Frolik et al., 1984, J. Biol. Chem. 260 : 10 995-11 000). Man hat ihn aus verschiedenen Gewebequellen gereinigt, zu denen Placenta (Frolik et al., 1983, Nature 325 : 81-84), Blutplättchen (Childs et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 5312- 5316; Assoian et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 7155-7160), Niere (Roberts et al., 1983, Biochemistry 22 : 5692-5698) und entmineralisierter Knochen (Seyedin et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 119-123) zählen. Man hat cDNA-Klone isoliert, die für TGF- β1 von Mensch (Derynck et al., 1985, Nature 316 : 701-705), Maus (Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 261 : 4377-4379) und Affe (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244) kodieren. Die DNA- Sequenzanalyse dieser Klone zeigt, daß TGF-β1 als ein großes Prekursor-Polypeptid synthetisiert wird, dessen Carboxy-Terminus abgespalten wird, wodurch man das reife TGF-β-Monomer erhält. Man hat eine hohe Sequenzhomologie zwischen allen TGF-β1-Precursor-Proteinen, die alle aus den obigen Quellen stammen, festgestellt.
- In Gegenwart von 10% Serum und dem epidermalen Wachstumsfaktor fördert TGF-β1 das verankerungsunabhängige Wachstum von normalen Ratten-Nierenfibroblasten (Robert et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 5339-5343; Roberts et al., 1982, Nature 295 : 417-419; Twardzik et al., 1985, J. Cell. Biochem. 28 : 289-297); in Gegenwart von 10% Serum allein ist er in der Lage, die Koloniebildung von AKR-2B- Fibroblasten zu induzieren (Tucker et al., 1983, Cancer Res. 43 : 1518- 586). Weiterhin ist gezeigt worden, daß TGF-β1 bei fötalen, mesenchymalen Rattenmuskelzellen bewirkt, daß sie differenzieren und Knorpel-spezifische Makromoleküle produzieren (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 216 : 5693-5695).
- Man hat gezeigt, daß TGF-β1, der aus humanen Blutplättchen gereinigt wurde, im Gegensatz zur Wirkung auf die Zellproliferation das Wachstum von bestimmten Zellen in Kultur inhibiert (Tucker et al., 1984, Science 226 : 705-707). Es ist weiterhin gezeigt worden, daß TGF-β1 das Wachstum verschiedener menschlicher Krebszellinien inhibiert (Roberts et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 119-123). Diese inhibitorische/stimulierende Wirkung des TGF-β1 kann von verschiedenen Faktoren abhängen, zu denen der Zelltypus und der physiologische Zustand der Zellen zählen (zur Übersicht siehe Sporn et al., 1986, Science 233 : 532-534).
- TGF-β2 ist, wie TGF-β1 ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 26 000, das aus zwei identischen Untereinheiten von 13 000 Dalton besteht, die durch Disulfid miteinander verbunden sind (Chiefetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415; Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406- 2410), und ist aus entmineralisiertem Rinderknochen (Seydin et al., 1987, J. Biol. Chem. 262 : 1946-1949), Schweineblutplättchen (Cheifetz et al., 1987, 48 : 409-415), einer humanen prostatischen Ardenocarcinom- Zellinie PC-3 (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410) und einer humanen Glioblastom-Zellinie (Wrann et al., 1987, EMBO 6 : 1633- 1636) isoliert worden. Man hat cDNA-Klone isoliert, die für den humanen und den Affen TGF-β2 kodieren (Madisen et al., 1988, DNA 7 : 1- 58; Webb et al., 1988, DNA 7 : 493-497). Das reife TGF-β2-Monomer wird von einem von zwei größeren Prekursor-Polypeptiden abgespalten, deren mRNAs auf Grund von differentiellem Spleißen entstehen (Webb et al., 1988, DNA 7 : 493-497).
- TGF-β1 und TGF-β2 besitzen eine 71%ige Idendität in der Aminosäuresequenz ihrer reifen Regionen, und eine 41%ige Identität in ihren Prekursor-Strukturen. TGF-β3, dessen Aminosäusesequenz kürzlich aus cDNA-Klonen hergeleitet worden ist, scheint eine C-terminale Sequenz von 112 Aminosäuren zu besitzen, die etwa 80% Homologie zu den reifen Monomeren des TGF-β1 und des TGF-β2 aufweist (Dijke et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 4715-4719). TGF-β1.2 stellt eine heterodimere Form dar, die eine β1- und eine β2-Untereinheit umfaßt, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind (Cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415).
- Der Aminoteil der Prekursorregion des TGF-β1 von Mensch, Nager und Affe zeigt einen hohen Homologiegrad (Derynck et al., 1985, Nature 316 : 701-705; Derynck et al., 1986, J. Biol. Chem. 216 : 4377-4379; Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244), was auf eine wichtige biologische Funktion hinweist, die mit diesem Teil des Moleküls verbunden ist. Jüngste Studien, die zeigen, daß dieser Teil des TGF- β1-Prekursors glykosyliert und phosphoryliert ist, unterstützen diese Behauptung, da man annehmen kann, daß eine Zelle nicht den Aufwand betreiben würde, diese sekundären Modifikationen durchzuführen, wenn damit nicht eine bestimmte Funktion verbunden wäre (Brunner et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8 : 2229-2232). Diese Modifikationen können zur Dimerisierung des Prekursors oder um dessen Bewegung aus der Zelle heraus zu lenken wichtig sein. Es gibt Belege, die nahelegen, daß eine Glykosylierung des Prekursors am Transport des reifen TGF-β1 aus der Zelle heraus beteiligt ist (Purchio et al., 1988, Biol. Chem. 263 : 14211-14215).
- Es ist über die Existenz von Substanzen berichtet worden, die entweder intermediäre Prekursorkomplexe, die an einer Prozessierung beteiligt sind, oder txpressions-Artefakte in CHO-Zellen, die das Affen TGF-β1- Gen exprimieren, sein können (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8 : 4162-4168, im Druck; Gentry et al., 1987, Mol. Call. Biol. 7 : 3418- 3427). Diese Untersuchungen zeigten, daß der TGF-β1-Prekursor, der von transfizierten CHO-Zellen synthetisiert wird, aus pro-TGF-β1, reifem TGF-β1 und der pro-Region des Prekursors, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind, besteht. Solche Disulfid-verbundenen Prekursor-Komplexe sind weiterhin in isolierten, latenten Formen des TGF-β1 beobachtet worden (Miyazano et al., 1988, J. Cell. Biochem. Suppl. 12(A):200; Wakefield et al., 1987, J. Biol. Suppl. 11(A):46).
- Gentry et al. (Gentry et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8 : 4162-4168) haben das folgende Schema für die Prozessierung von pre-pro-TGF-β1 in transfizierten CHO-Zellen vorgeschlagen. (Die Positionsnummern der Aminosäuren, auf die hier Bezug genommen wird, stammen von der veröffentlichten Sequenz, des Affen- TGF-β1 (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244)). Gemäß diesem vorgeschlagenen Schema beinhaltet der erste Schritt die Abspaltung eines Signalpeptides an der Gly-29/Leu-30 Peptidbindung. Dieser Spaltungsvorgang geschieht höchstwahrscheinlich cotranslational während des Überganges des Prekursors durch die Membran des rauhen endoplasmatischen Retikulums (Blobel and Dobberstein, 1975, J. Cell. Biol. 67 : 835-851; Walter et al., 1984, Cell 38 : 5-8). Nach der Abspaltung des Signalpeptides werden Kernglycosylierungseinheiten (Rothman et al., 1978, Cell 15 : 1447-1454) zu dem pro-TGF-β1 an jeder der drei vorhergesagten N- Glycosylierungsstellen, die bei Asn-82, Asn-136 und Asn-176 lokalisiert sind, zugefügt. Der kernglycosylierte pro-TGF-β1 wird dann nachfolgend während des Überganges durch den Golgi prozessiert, wodurch man einen phosphorylierten, Glycoprotein-haltigen Komplex, sialylierte Oligosaccharide, erhält. Auf einer Stufe während der Synthese oder des Überganges erfolgt eine proteolytische Abspaltung an dem dibasischen Rest und eine Disulfid-Isomerisierung, wodurch der reife TGF-β1 freigesetzt wird.
- In einer weiteren, kürzlich erfolgten Untersuchung wurde Mannose-6- phosphat in dem TGF-β1-Prekursor identifiziert. Mannose-6-phosphat ein phosphoriliertes Zuckeranalog, scheint eine fundamentale Rolle bei dem gelenkten Transport und dem interzellulären Austausch von lysosomalen Enzymen zu spielen (von Figura, 1986, Ann. Rev. Biochem. 55 : 167-193). Spezifische Rezeptoren, die die Mannose-6-posphat Reste von lysosomalen Enzymen erkennen, sind identifiziert worden und bilden wesentliche Bestandteile des Transportsystems. Sekretierte lysosomale Proteine, die Mannose-6-phosphat enthalten, sind im konditionierten Medium von Gewebekulturzellen identifiziert worden (Gal and Gottesman, 1986, biol. Chem. 261 : 1760-1765; Caponyer al., 1981, J. Cell. Biol. 104 : 253-262; Baumbach et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 2985-2989; Sahagian and Gottesman, 1982, J. Biol. Chem. 257 : 11145- %150). Es ist möglich, daß die Mannose-6-phosphat-Reste des TGF-β1- Prekursors, den pro-TbF-β1 zu den Lysosomen lenken, um die proteolytische Prozessierung durchzuführen, wodurch man den reifen THG-β1 erhält. Alternativ können die Mannose-6-phosphat-Reste wirken, indem sie den gespaltenen TGF-β1-Prekursor zu den Lysosomen leiten, um den Abbau durchzuführen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von großen Mengen eines neuen chimären TGF-β, der als TGF-β1/β2 bezeichnet wird, mittels eukaryontischer Wirtszellen, die mit rekominanten DNA-Vektoren transfiziert sind, die die für den TGF-β1/β2-Prekursor kodierende Sequenz enthalten, die durch Regulatorelemente der Expressionen kontrolliert wird. Die Affen-TGF-β1 cDNA (Sharples et al., 1987, DNA 6:239-244) wurde so modifiziert, daß die Nukleotide die für die Aminosäurereste mit den Nummern 9-13, 17, 19, 25 und 26 der Sequenz des reifen TGF-β1 kodierten, in die Nukleotide überführt wurden, die für die entsprechenden Aminosäuren der Struktur des reifen TGF-β2 kodieren. Der Codongebrauch vom Affen wurde beibehalten.
- Expressionsvektoren, die für den chimären TGF-p1/β2-Prekursor unter der regulatorischen Kontrolle von Elementen zur Expressionsregulation des Simian Virus 40 (SV 40) kodierten, wurden konstruiert und zur Transfektion von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen verwendet. Man erhielt CHO-Transfektanten, die einen hohen Grad an reifem TGF-β1/β2 synthetisierten und sekretierten. Die TGF-β1/β2-Expression wurde mit Methotrexat amplifiziert, und ampifizierte Transfektanten sekretierten so viel wie 1 mg/l des reifen TGF-β1/β2. Eine Ansäuerung der konditionierten Medien der CHO-Transfektanten ergab ein Maximum an bioaktivem TGF-β1/β2. Man nimmt an, daß der hohe Grad an reifem TGF- β1/β2, der von den transfizierten CHO-Zellen sekretiert wird, auf einer ungewöhnlichen Effizienz der proteolytischen Prozessierung des chimären Prekursor-Proteins beruht. Eine solche erhöhte prozessierungs-Effizienz kann wiederum von strukturellen Merkmalen herrühren, die von der Kombination der Anmelder aus den Aminosäuresequenzen des TGF-β1 und des TGF-β2 in der aminoterminalen Domäne der reifen TGF-β-Struktur beeinflußt werden.
- Fig. 1. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des TGF- β1/β2-Hybridproteins, kodiert von dem Expressionsplasmid p5β/dhfr.
- Fig. 2. Bioaktivität von konditionierten Medien von pβ41,2.5- Zellen. Die Bioaktivität wurde mit dem Wachstums-Inhibitionsassay von CCL-64-Nerz-Lungen-Epithelzellen gemessen. (A) Serum-freie Medien, die durch sβ41,2.5-Zellen 24 Stunden konditioniert worden waren, wurden gegen 0,2 M Essigsäure dialysiert und wie im Kapitel 6.1.3., infra, untersucht. (B) Standard-Wachstums-Inhibitionskurve für TGF-β1.
- Fig. 3. Immunoblot-Analyse von Proteinen, die von den 5β41,2.5- Zellen sekretiert wurden. Man ließ 5β41,2.5-Zellen bis zur Konfluenz wachsen; die Medien wurden gegen 0,2 M Essigsäure dialysiert und durch Immunoblotting unter nicht-reduzierenden (Spur l) oder reduzierenden (Spur 2) Bedingungen mit anti-TGF-β1&sub3;&sub6;&sub9;&submin;&sub3;&sub8;&sub1; wie im Kapitel 6.1.5., infra beschrieben, untersucht.
- Die vorliegende Erfindung betrifft TGF-β1/β2, Nucleotidsequenzen, die für TGF-β1/β2 und für den TGF-β1/β2-Prekursor kodieren und die Herstellung von TGF-β1/β2 durch rekombinante DNA-Verfahren. TGF-β1/β2, ein neuer chimärer Transformations-Wachstumsfaktor-beta, ist in dem Standardessay, der zur Messung der TGF-β1-Bioaktivität verwendet wird, biologisch aktiv, und ist mit TGF-β1-spezifischen Antikörpern immunreaktiv. Ein Chimär, das strukturell eine Kombination der TGF-β1- und der TGF-β2-Aminosäuresequenzen umfaßt, nämlich das erfindungsgemäße TGF-β1/β2, besitzt wahrscheinlich eine Reihe neuer biologischer Aktivitäten, von denen einige ähnlich oder nahezu identisch mit denjenigen sind, die deren Ausgangsmoleküle zeigen, während andere für TGF-β1/β2 einzigartig sind. Hinsichtlich der Bioaktivitäten, die ähnlich oder nahezu identisch mit denen des TGF-β1 oder des TGF-β2 sind, kann dieser neue Faktor wirksamere Mittel zur Induktion von entsprechenden biologischen Reaktionen liefern, und seine Verwendung kann daher eine wünschenswerte Alternative zu TGF-β1 oder TGF-β2 bei verschiedenen medizinischen Anwendungen, die man sich für die TGF-βs vorstellt, darstellen. Zu solchen Anwendungen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Induktion oder Beschleunigung der Zellproliferation und -differenzierung und die Inhibition der Zellteilung. Somit kann TGF-β1/β2 zum Beispiel Verwendung bei der Behandlung von Krebs und der Förderung der Wundheilung finden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann ausschließlich zu Beschreibungszwecken, in die folgenden Stufen unterteilt werden: (a) die Herstellung der kodierenden Sequenz für den TGF-β1/β2- Prekursor; (b) die Konstruktion eines Expressionsvektors, der die Expression der kodierenden Sequenz des TGF-β1/β2 steuert; (c) die Transfektion von geeigneten Wirtszellen, die in der Lage sind, sich zu replizieren, das Gen zu exprimieren und das Genprodukt zu prozessieren, um die reife Form des TGF-β1/β2 und /oder der TGF-β1/β2- Prekursoren herzustellen; und (d) die Identifizierung und Reinigung der TGF-β1/β2-Prekursoren und des reifen, biologisch aktiven TGF- β1/β2.
- Sobald ein Transfektant identifiziert worden ist, der einen hohen Grad an TGF-β1/β2-Prekursoren und/oder des reifen TGF-β1/β2 exprimiert, gehört zu der erfindungsgemäßen Verfahrenspraxis die Expansion dieses Klones und die Isolierung des exprimierten Genproduktes.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird hier beispielhaft dargestellt, wobei eine Affen-TGF-β1-Prekursor-cDNA (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244) so modifiziert wird, daß die Nukleotide, die für die Aminosäurereste mit den Nummern 9-13, 17, 19, 25 und 26 der reifen Affen- TGF-β1-Sequenz kodieren, zu den Nukleotiden abgeändert werden, die für die entsprechenden Aminosäuren der reifen TGF-β2-Struktur kodieren, während der Codongebrauch vom Affen beibehalten wird. Die resultierende kodierende Sequenz des chimären TGF-β1/β2-Prekursors wird sodann verwendet, um Expressionsvektoren herzustellen, die in der Lage sind, die Synthese des reifen TGF-β1/β2-Produktes zu steuern.
- Die verschiedenen Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens werden detaillierter in den folgenden Kapiteln und in den folgenden Beispielen beschrieben.
- Die Nukleotidsequenz, die für den chimären TGF-β1/β2 codiert, ist in Fig. 1 dargestellt. In der erfindungsgemäßen Verfahrenspraxis kann diese Nukleotidsequenz oder ein funktionelles Equivalent verwendet werden, um die rekombinanten Moleküle zu erzeugen, die die Expression des TGF-β1/β2-Produktes steuern. Auf Grund der Degeneration der kodierenden Nukleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, als die in Fig. 1 dargestellte, erfindungsgemäß verwendet werden. Zu solchen Veränderungen der Nukleotidsequenz der Fig. 1 zählen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von verschiedenen Nukleotidresten, was zu einer Sequenz führt, die für das gleiche oder ein funktionell equivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt kann Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb einer Sequenz beinhalten, was zu einem stillen Austausch führt, wodurch ein bioaktives Produkt produziert wird. Solche Aminosäurensubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in der Polarität, der Ladung, der Löslichkeit, der Hydrophobizität, der Hydrophilizität und/oder der amphipatischen Beschaffenheit der beteiligten Reste durchgeführt werden. Beispielsweise zählen zu negativ geladenen Aminosäuren Asparginsäure und Glutaminsäure; zu positiv geladenen Aminosäuren zählen Lysin und Arginin; zu Aminosäuren mit ungeladenen, dipolaren Kopfgruppen oder unpolaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophilizitätswerte aufweisen, zählen Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin, Aspargin, Glutamin; Serin, Threonin; Phenylalanin, Tyrosin.
- Die Nukleotidsequenz des Affen-TGF-β1 ist aus Zellen vom Affen erhältlich (Sharples et al., 1989, DNA 6 : 239-244). Die Nukleotidsequenz des chimären TGF-β1/β2 in Fig. 1 kann durch bekannte Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Verwendung von DNA-Restriktionsenzymen, synthetischen Oligonuklotiden und DNA-Ligasen zählen. Alternativ kann die kodierende Sequenz der Fig. 1 als Ganzes oder teilweise unter Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik synthetisiert werden.
- In einer besonderen, erfindungsgemäßen Ausführungsform erhielt man die kodierende Sequenz des Affen-TGF-β1 aus einem cDNA-Klone mit voller Länge, der von der afrikanischen Grünaffen-Zellinie BSC-40 erhalten wurde (Sharples et al., 1987, supra). Die in Fig. 1 dargestellte kodierende Sequenz des chimären TGF-β1/β2 wurde dann von der Affen- TGF-β1-cDNA abgeleitet, indem man die kodierende Sequenz der Aminosäurereste mit den Nummern 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 und 26 des reifen TGF-β1-Moleküls entfernte und durch die kodierende Sequenz für die Aminosäurereste mit den Nummern 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 und 26 des reifen TGF-β2-Moleküls (Madison et al., 1988, DNA 7 : 1-8) unter Verwendung von gentechnischen Herstellungsverfahren ersetzte.
- Um biologisch aktiven, reifen TGF-β1/β2 zu exprimieren, muß ein Expressionsvektor/Wirtssystem verwendet werden, das nicht nur einen hohen Tranzskriptions- und Translationsgrad liefert, sondern auch die korrekte Prozessierung des Genproduktes sicherstellt. Dies ist besonders wichtig, wenn die vollständige kodierende Sequenz des chimären TGF-β1/β2-Prekursors in den Expressionskonstrukten verwendet wird, da man annimmt,daß der reife, chimäre TGF-β1/β2, ähnlich wie TGF-β1 und TGF-β2, aus einem Prekursor-Molekül oder -Komplex von Molekülen durch zelluläre Prozessierungsvorgänge freigesetzt wird. Weiterhin kann ein Expressions-/Wirtszell-System, das für die Sekretion des Produktes sorgt, wünschenswert sein.
- Insbesondere zeigt sich, daß reifes TGF-β1/β2 ein Disulfid-verbundenes Homodimer mit 112 Aminosäuren pro Untereinheit ist, daß durch zelluläre Prozessierungsvorgänge gebildet wird, von denen man annimmt, daß sie mit jenen vergleichbar sind, die reifes TGF-β1 und TGF-β2 bilden. Der TGF-β1/β2-Prekursor besitzt drei potentielle N-Glycosylierungsstellen in der pro-Domäne (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244). Untersuchungen mit TGF-β1 haben gezeigt, daß eine N-Glycosylierung und eine Phosphorylierung in der pro-Domäne des TGF- β1 auftritt, was eine wichtige funktionelle Rolle des Prekursors bei der zellulären Synthese und der Freisetzung oder Sekretion des reifen Moleküls anzeigt (Brunner et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8 : 2229-2232). Die Gegenwart von Mannose-6-phosphat im TGF-β1-Prekursor unterstützt weiterhin die Hypothese, daß der Prekursor eine unabhängige funktionelle Aktivität besitzt (Purchio et al., 1988, J. Biol. Chem. 263 : 14211-14215). Da der chimäre TGF-β1/β2-Prekursor die Pro-Domäne des Affen-TGF-β1 enthält, nehmen die Anmelder es als wahrscheinlich an, daß der TGF-β1/β2-Prekursor funktionell aktiv und wichtig für die korrekte Prozessierung des reifen TGF-β1/β2-Moleküls ist.
- Somit ist die Fähigkeit der in dem Expressions-System verwendeten Wirtszelle, den chimären TGF-β1/β2 korrekt zu exprimieren und zu prozessieren, wichtig für die Produktion eines reifen, bioaktiven Produktes.
- In einer hier beschriebenen, besonderen Ausführungsform wird der reife, bioaktive TGF-β1/β2 unter Verwendung von Expressions- Kontrollelementen des Simian Virus 40 (SV 40) in einem Chinese Hamster Ovary (CHO) Wirtszellsystem erfolgreich produziert. Eine Reihe anderer animaler Wirts-/Expressionsvektor-Systems (d. h., Vektoren, die die zur Steuerung der Replikation, Transkription und Translation der TGF- β1/β2-kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle notwendigen Elemente enthalten), können jedoch durch den Fachmann gleich gut verwendet werden. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Virus- Expressionsvektor-/Säuger-Wirtszell-Systeme (z. B. Cytomegalievirus, Vaccinia-Virus, Adenovirus und ähnliche); Insektenvirus- Expressionsvektor-/Insektenzell-Systeme (z. B. Baculovirus); oder Expressionssysteme mit nicht-viralen Promotoren, die aus dem Genom von Säugerzellen stammen (z. B. der Maus-Metallothionin-Promotor).
- Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirts-/Vektor-System kann irgendeines aus einer Vielzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden. Wenn man z. B. in Säuger Zellsystemen kloniert, können Promotoren, die aus dem Genom von Säugerzellen (z. B. der Maus-Metallothionin-Promotor) oder von Viren, die in diesen Zellen wachsen (z. B. der Vaccinia-Virus 7,5K-Promotor), verwendet werden. Weiterhin können Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken hergestellt worden sind, verwendet werden, um die Transkription der insertierten Sequenzen zu erreichen.
- Weiterhin sind spezifische Initiationssignale zur ausreichenden Translation der insertierten proteinkodierenden Sequenzen erforderlich. Zu diesen Signalen zählen das ATG-Initiations-Codon und benachbarte Sequenzen. Z.B. müssen in Fällen, in denen nur ein Teil der kodierenden Sequenz des TGF-β1/β2 insertiert ist, exogene Translationskontrollsignale, zu denen das ATG-Initiations-Codon zählt, bereitgestellt werden. Weiterhin muß sich das Initiations-Codon in Phase mit dem Leseraster der kodierenden Sequenz des TGF-β1/β2 befinden, um die Translation des vollständigen Inserts sicherzustellen. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiations-Codons können eine Vielzahl von sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprüngen haben. Die Effizienz der Expression kann durch den Einschluß von Transkriptions-Attenuationssequenzen, Enhancer-Elementen und ähnlichem erhöht werden.
- Irgendeine der vorher für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Methoden kann zur Konstruktion von Expressionsvektoren verwendet werden, die die kodierende Sequenz für den TGF-β1/β2 und geeignete Transkriptions-/Translations- Kontrollsignale enthalten. Zu diesen Verfahren zählen in vitro rekombinante DNA-Techniken, synthetische Techniken und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombination).
- Wenn ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die TGF-β1/β2-codierende Sequenz mit einem Adenovirus-Transkriptions-/ Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z. B. dem Late-Promotor und der Tripartite-Leader-Sequenz. Dieses chimäre Gen kann dann durch n vitro oder in vivo Rekombination in das Adenovirusgenom insertiert werden. Eine Insertion in eine nicht-essentielle Region des Virusgenoms (z. B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, das lebensfähig und in der Lage ist, den chimären TGF-β1/β2 in infizierten Wirten zu exprimieren. Entsprechend kann der Vaccinia 7,5 K-Promotor verwendet werden.
- Ein alternatives Expressionssystem, das verwendet werden kann, um TGF- β1/β2 zu exprimieren, ist ein Insektensystem. In einem solchen System wird das Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um Fremdgene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die TGF-β1/β2-codierende Sequenz kann in nicht-essentielle Regionen des Virus (z. B. das Polyhedrin-Gen) kloniert werden und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (z. B. des Polyhedrin-Promotors) gestellt werden. Eine erfolgreiche Insertion der TGF-β1/β2-codierenden Sequenz wird zu einer Inaktivierung des Polyhedrin-Gens und zur Produktion eines nicht-umschlossenen rekombinanten Virus( d. h., ein Virus, dem die Proteinhülle fehlt, das von dem Polyhedrin-Gen kodiert wird) führen. Diese rekombinanten Viren werden dann verwendet, um Spodoptera frugiperda-Zellen zu infizieren, in denen die insertierten Gene exprimiert werden.
- Außerdem kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der insertierten Sequenzen moduliert, oder der das Genprodukt auf die gewünschte Weise modifiziert und prozessiert. Die Expression mit bestimmten Promotoren kann in Gegenwart von bestimmten Induktoren (z. B. Zink- und Cadmium-Ionen für Metallothionin-Promotoren) erhöht werden. Somit kann die Expression des gentechnisch hergestellten TGF- β1/β2 kontrolliert werden. Dies ist wichtig, wenn das Proteinprodukt des klonierten Fremdgens für die Wirtszellen letal ist. Weiterhin können posttranslationale Modifikationen, wie eine Glycosylierung, und Prozessierungsvorgänge, wie eine proteolytische Spaltung der Proteinprodukte, für die Funktionalität des Proteins wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen für die posttranslationale Prozessierung und Modifizierung von Proteinen. Man kann geeignete Zellinien oder Wirtssysteme wählen, um eine korrekte Modifizierung und Prozessierung der exprimierten Fremdproteine sicherzustellen.
- In einer bestimmten, erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Expressionsvektor, der die TGF-β1/β2-codierende Sequenz in Tandem- Anordnung mit dem Maus-Dihydrofolat-Reduktase-Gen (dhfr) unter der Kontrolle von SV40-Regulatorsequenzen enthält, konstruiert und zur Transfektion von dhfr-defizienten CHO-Zellen verwendet. CHO- Transfektanten, die den dhfr-Phenotyp expremieren, werden durch Vermehrung in selektiven Medien isoliert. Um den Expressionsgrad des TGF-β1/β2 zu erhöhen, können die Transfektanten steigenden Konzentration an Methotrexat ausgesetzt werden, um Klone zu isolieren, die amplifizierte Mengen an TGF-β1/β2 mRNA transkribieren. Die TGF- β1/β2-mRNA-Mengen können auf verschiedenen Stufen der Amplifizierung durch Hybridisierung in Lösung untersucht werden (Uhler et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 : 1300-1304).
- Die Wirtszellen, die die TGF-β1/β2-kodierende Sequenz enthalten, und die das biologisch aktive, reife Produkt exprimieren, können durch wenigstens vier allgemeine Versuche identifiziert werden: (a) DNA-DNA- Hybridisierung; (b) Vorhandensein oder Abwesenheit von "Marker"- Genfunktionen; (c) Schätzung des Transkriptionsgrades, der durch die Expression von TGF-β1/β2-mRNA-Transkripten in der Wirtszelle gemessen wird; und (d) die Detektion des reifen Genproduktes, das durch einen Immunoassay und schließlich durch seine biologischen Aktivitäten bestimmt wird.
- Im ersten Versuch kann das Vorkommen der TGF-β1/β2-kodierenden Sequenz, die in den Expressionsvektor insertiert ist, durch eine DNA- DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden detektiert werden, die Nukleotidsequenzen umfassen, die homolog mit der im wesentlichen in Fig. 1 dargestellten TGF-β1/β2-kodierenden Sequenz oder Teilen oder Derivaten davon sind.
- Bei dem zweiten Versuch kann das rekombinante Expressionsvektor/Wirtssystem auf Grund des Vorhandenseins oder der Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidin-Kinase- Aktivität,Resistenz gegenüber Antibiotika, Resistenz gegenüber Methotrexat, Transformationsphenotyp, Okklusionskörper-Bildung in Baculoviren usw.) identifiziert und selektiert werden. Wenn z. B. eine TGF-β1/β2-kodierende Sequenz innerhalb einer Marker-Gensequenz des Vektors insertiert wird, können Rekombinanten, die die TGF-β1/β2- kodierende Sequenz enteilten, durch die Abwesenheit der Marker-Gen- Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Marker-Gen in Tandem-Anordnung mit der TGF-β1/β2-Sequenz unter die Kontrolle desselben oder eines anderen Promotors, der zur Kontrolle der Expression der TGF-β1/β2-kodierenden Sequenz verwendet wird, gestellt werden. Eine Expression des Markers als Antwort auf eine Induktion oder Selektion zeigt die Expression der TGF-β1/β2-kodierenden Sequenz an.
- Bei dem dritten Versuch kann die Transkriptionsaktivität der TGF- β1/β-kodierenden Region durch Hybridisierungsversuche eingeschätzt werden. Z.B. kann eine polyadenylierte RNA durch einen Northern-Blot unter Verwendung einer Sonde die homolog zu der TGF-β1/β2-kodierenden Sequenz oder bestimmten Teilen davon ist, analysiert werden. Alternativ können die gesamten Nucleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und auf eine Hybridisierung mit solchen Sonden untersucht werden.
- Bei dem vierten Versuch kann die Expression des reifen Proteinproduktes immunologisch abgeschätzt werden, z. B. durch Western- Blots, Immunoassays, wie Immunoblotting, Radioimmunopräzipitation, Enzym-gekoppelte Immunoassays und ähnliches. Die abschließende Untersuchung auf einen Erfolg des Expressionssystems umfaßt jedoch die Detektion des biologisch aktiven TGF-β/β2-Genproduktes. Wenn die Wirtszelle das Genprodukt sekretiert, können die zellfreien Medien, die von der kultivierten, transfektierten Wirtszelle erhalten werden, auf eine TGF-β1/β2-Aktivität untersucht werden. Wenn das Genprodukt nicht sekretiert wird, können Zell-Lysate auf eine solche Aktivität hin untersucht werden. In jedem Fall können biologische Assays, wie der hier beschriebene Wachstums-Inhibitionsassay oder ähnliches, verwendet werden.
- Sobald man einen Klon, der einen hohen Grad an reifem TGF-β1/β2 produziert, identifiziert hat, kann der Klon expandiert und der TGF- β1/β2 unter Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik gereinigt werden. Zu solchen Verfahren zählen eine Immunoaffinitätsreinigung, Chromatographische Verfahren einschließlich der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und ähnliches.
- Ein rekombinantes Plasmid, das für den TGF-β1-Prekursor kodiert, wobei die Aminosäuren 9, 10, 11, 12, 13, 17, 19, 25 und 26 der Sequenz des reifen TGF-β1 durch die entsprechenden Aminosäuren der reifen TGF-β2- Sequenz ersetzt worden sind, wurde konstruiert. Insbesondere wurde die Aminosäure 9 des reifen TGF-β1 (Serin) durch Arginin ersetzt, die Aminosäure Nummer 10 (Serine) wurde durch Asparagin ersetzt, die Aminosäure Nummer 11 (Threonin) wurde durch Valin ersetzt, die Aminosäure Nummer 12 (Glutaminsäure) wurde durch Glutamin ersetzt, die Aminosäure Nummer 13 (Lysin) wurde durch Asparaginsäure ersetzt, die Aminosäure Nummer 17 (Valin) wurde durch Leucin ersetzt, die Aminosäure Nummer 19 (Glutamin) wurde durch Prolin ersetzt, die Aminosäure Nummer 25 (Arginin) wurde durch Lysin ersetzt, und die Aminosäure Nummer 26 (Lysin) wurde durch Arginin ersetzt. Das Konstrukt wurde verwendet, um CHO-Zellen zu transfizieren.
- Transfektanten, die ein reifes, bioaktives, chimäres TGF-β1/β2 produzierten, wurden isoliert.
- Ungefähr 24 Stunden nach Überimpfung von 106 dhfr-defizienten CHO- Zellen auf 100 mm Schalen wurden die Kulturen mit 1 ug eines Nde I- linearisierten p5β/dhfr-Plasmides und 19 ug Kalbsthymus-DNA als Träger in Form eines Calciumphosphatpräzipitates transfiziert (Wigler, M., et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 : 1373-1376). Kurz gesagt wurden 20 ug des Plasmides und der Träger-DNA zu 1 ml 250 mM sterilem CaCl&sub2; gegeben. Die DNA-Lösung (1 ml) wird tropfenweise zu einer 1 ml Portion von 2· HEPES-Lösung (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Natriumphosphat pH 7,1) unter Gasdurchleitung gegeben, und das Gemisch wurde 30 Minuten auf Eis stehengelassen. Das Präzipitat wurde sodann tropfenweise über die Zellen dispergiert, die 10 ml F12 Medium (Gibco) enthielten. Nach vierstündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Medien entfernt und durch 10 ml F12-Medien, die 25% Glycerin enthielten, 90 Sekunden bei Raumtemperatur ersetzt. Die Zellen wurden einmal mit 20 ml F12-Medium gewaschen und für weitere 48 Stunden in dem nicht-selektiven F12-Medium (20 ml) inkubiert. Eine Selektion auf dhfr-expremierende Transfektanten wurde durch Ersatz des Mediums durch DMEM erreicht, das mit 10% dialysiertem FBS (Gibco) und 150 ug/ml L- Prolin ergänzt worden war. Die Kolonien wurden nach der Kultivierung der Zellen 10-14 Tage in dem Selektionsmedium beobachtet.
- Dihydrofolat-Reduktase (dhfr)-amplifizierte Zellen erhielt man, im wesentlichen wie beschrieben, aus den primären Transfektanten (Gasser, C.S. and Schimke, R.T., 1986, J. Biol. Chem. 261 : 6938-6946). Nach der Expansion wurden 10&sup5; Zellen auf 100-mm-Platten überimpft und an steigende Konzentrationen von Methotrexat (100 nM; 500 nM; 2500 nM; 10 000 nM; 20 000 nM) angepaßt. Die Anfangskonzentration des Methotrexats betrug 100 nM. Die Schale, die sichtbare Kolonien enthielt, wurde trypsiniert und an diese Konzentration von Methotrexat über wenigstens zwei weitere 1 : 5 Zellpassagen angepaßt. Die Zellen (10&sup5;) wurden sodann auf 100-mm-Schalen mit der nächsthöheren Konzentration an Methotrexat überimpft. Die Schale, die sichtbare Kolonien enthielt, wurde wiederum trypsiniert und an das Methotrexathaltige-Medium angepaßt. Bei verschiedenen Stufen der Amplifizierung wurden Zellen in Medien, die 40% FBS, 10% Dimethylsulfoxid und 50% DMEM enthielten, weggefroren. Methotrexat war in den Gefriermedien nicht enthalten.
- Nerz-Lungen-Epithelzellen, Mv 1 Lu (Hinterlegungsnummer CCL-64, American Type Culture Collection), die extrem empfindlich gegenüber TGF-β sind, wurden für den Wachstums-Inhibitions-Assay verwendet. Der Assay wurde unter Verwendung des Thymidin-Analogs 5'-(¹²&sup5;I)-Jod- 2'desoxyuridin(¹²&sup5;IdU) durchgeführt, um die DNA-Synthese abzuschätzen. Eine Aktivitäts-Einheit wurde als die Menge definiert, die erforderlich ist, um 50% der Inkorporation von TdU im Vergleich zu unbehandelten CCL-64-Zellen zu inhibieren.
- Um transfizierte Zellen auf eine Sekretion von aktivem TGF-β1/β2 zu untersuchen, wurden serumfreie Überstände aus einer 24stündigen Sammlung von konfluenten Zellkulturen gesammelt und extensiv gegen 0,2 M Essigsäure dialysiert. Die Proben wurden für die Untersuchungen mit sterilem, komplettem Kulturmedium verdünnt.
- Peptide wurden mittels Festphasen-Verfahren auf einem Beckman 990- Gerät synthetisiert und, wie vorher beschrieben, von dem Harz abgespalten (Gentry, L.E., 1983, J. Biol. Chem. 258 : 11219-11228; Gentry, L.E. and Lawton, A., 1986, Virology 152 : 421-431). Die Reinigung erfolgt durch präparative Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie. Die Zusammensetzung der Peptide wurde durch eine Aminosäureanalyse bestätigt.
- Die synthetischen Peptide wurden über den Cysteinrest mit Rinder-γ- Glubolin konjugiert. Die Kopplungsreaktionen wurden im wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Gentry and Lawton, 1986, supra). Die Effizienzen der Peptidkonjugationen reichten von 8 bis zu 26 Peptidmolekülen, die kovalent pro Molekül γ-Globulin verbunden waren.
- New Zealand weiße Kaninchen wurden durch kombinierte subkutane und intradermale Inoculationen mit den Peptid-Konjugaten (100 ug Peptid- Equivalente), die in Freundschem komplettem Adjuvans emulgiert waren, vorbereitet. Booster-Inoculationen wurden in 2-3wöchigen Intervallen verabreicht. Blutentnahmen wurden 7-14 Tage nach dem Boostern durchgeführt.
- Anti-Peptidantikörper, die gegen Peptid-Sequenzen innerhalb des TFG- β1-Moleküls gerichtet waren, wurden in Kaninchen unter Verwendung von synthetischen Peptiden als Immunogene erzeugt (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418-3427). Einer der Antikörper (anti-TGF-β1&sub3;&sub6;&sub9;&submin;&sub3;&sub8;&sub1;) war gegen Epitope gerichtet, die innerhalb der reifen Form des TGF-β-Wachstumsfaktors vorkamen. Die anderen zwei Antikörper (anti- TGF-β1&sub8;&sub1;&submin;&sub9;&sub4; und anti-TGF-β1&sub2;&sub2;&sub5;&submin;&sub2;&sub3;&sub6;) sind Prekursor-spezifisch und gegen Peptid-Sequenzen gerichtet, die nur innerhalb der Prekursor-Moleküle des TGF-β1 vorkommen.
- Die Proteine wurden auf 7.5% - 17,5% SDS-Polyacrylamid Gradientenggelen fraktioniert und 1 Stunde bei 4ºC und bei 24 Volt auf nicht-modifizierte Nitrozellulose (0,45 um; Schleicher und Schuell) transferiert (Burnette, W.N., 1981, Anal. Biochem. 112 : 195-203). Eine überschüssige Bindungskapazität der Nitrozellulose wurde durch Inkubation mit 2,5% BLOTTO (Johnson, D.A., et al., 1984, Gene Anal. Techn. 1 : 3-8) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,2% NP-40 enthielt, abgesättigt. Das Kaninchen-Antiserum, das 1 : 75 in 2,5% BLOTTO verdünnt worden war, wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur mit den abgesättigten Nitrozelluloseblättern inkubiert. Nachdem man überschüssigen Antikörper durch fünf 5minütige Waschschritte in 2,5% BLOTTO abgewaschen hatte, wurden die Nitrozelluloseblätter mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Protein A, das 1 : 500 in 2,5% BLOTTO verdünnt worden war, inkubiert. Nach einer 2stündigen Inkubation wurden die Nitrozelluloseblätter 5mal in PBS (5minütige Waschschritte), das 0,2% NP-40 enthielt, gewaschen und entwickelt (Leary et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 : 4045-4049).
- Das Plasmid, das die Synthese des chimären TGF-β1/β2-Proteins, p5β/dhfr, steuert, wurde wie folgt konstruiert. pAcβTGF-1, ein von pAc373 stammender Baculovirus-Vektor (Miyamoto et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5 : 2860-2865; Madison et al., 1987 Virology 158 : 248-250), der die 1,4 Kb pstI-EcoRI-kodierende Sequenz des TGF-β1 enthielt (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244), die in die PstI-EcoRI-Stelle des pAc661 (Miyamoto et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5 : 2860-2865; Madisen et al., 1987, Virology 158 : 248-250) kloniert worden war, wurde mit BamHI und EcoRI verdaut, und das 375 bp-Fragment der TGF-β1- kodierenden Sequenz wurde isoliert (Fragment 1). pSV2-βTGF (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418-3427) wurde mit ApaI und EcoRI verdaut und das 3,5 Kb-Fragment wurde isoliert (Fragment 2).
- Komplementäre synthetische Oligonukleotide, die die nachfolgend dargestellten Sequenzen besaßen, wurden mit einem Applied Biosystems Oligonucleotide Synthesizer synthetisiert und aus einem Acrylamidgel gereinigt. Es wurden Phosphate zusammen mit T4-Kinase zugefügt, und equimolare Mengen der kinasierten Oligonukleotide wurden zusammengefügt. Die zusammengefügte, doppelsträngige, synthetische DNA wurde sodann mit den oben beschriebenen Fragmenten "1" und "2" ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und 5βpSV2 (Hpa&supmin; Eco&spplus;) wurde isoliert.
- 5βpSV2 (Hpa&supmin; Eco&spplus;) wurde mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, mit HindIII verdaut, und das 1,4 Kb Fragment, das die chimäre TGF-β1/β2-kodierende Sequenz enthielt, wurde isoliert (Fragment 3). 5βpSV2 wurde konstruiert, indem man das Fragment 3 in den pSV2,neo ligierte, der vorher mit HindIII und HpaI verdaut worden war, um das neo-Gen zu eliminieren.
- 5βpSV2 wurde mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, mit NdeI verdaut, und das 2,6 Kb NdeI-EcoRI-Fragment (glatt) wurde isoliert und in das pSV2/dhfr (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3718-3727), das mit NdeI und PvuII verdaut worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli zu transformieren, und p5β/dhfr wurde isoliert. Die Nukleotide und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen des chimären TGF-β1/β2-Moleküls, das vom p5β/dhfr kodiert wurde, sind in der Fig. 1 dargestellt.
- CHO-Zellen wurden mit p5β/dhfr transfiziert, und einzelne Klone wurden mit Methotrexat, wie im Kapitel 6.1., supra, beschrieben, amplifiziert. Ein solcher amplifizierter Klon, CHO-5β41, 2.5, wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
- Man ließ CHO-5β41, 2.5-Zellen bis zur Konfluenz in 2,5 uM Methotrexat wachsen. Das Medium wurde durch serumfreies Medium ersetzt, nach 24 Stunden gesammelt und 48 Stunden gegen 0,2 M Essigsäure dialysiert. Die Bioaktivität der dialysierten, konditionierten Überstände wurde durch Inhibition der DNA-Synthese von CCL-64-Zellen, wie im Kapitel 6.1.3., supra beschrieben, untersucht. CHO-5β41, 2.5-Zellen sekretieren ungefähr 2 mg/L bioaktiven, chimäres TGF-β1/β2 (Fig. 2).
- TGF-β-verwandte Proteine, die von diesen Zellen sekretiert werden, wurden durch Immunoblotten unter Verwendung von Anti-Peptid- Antikörpern, die gegen das reife TGF-β1 gerichtet waren, wie im Kapitel 6.1.5., supra, beschrieben, analysiert. Die Fig. 3 zeigt, daß CHO-5β41, 2.5-Zellen immunreaktive Proteine sekretieren, die bei 90- 100 Kilodalton und bei 24 Kilodalton wandern, wenn sie unter nichtreduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE analysiert werden (Fig. 3, Spalte 1). Die 24 Kilodalton-Bande stellt das reife TGF- β1/β2-Dimer dar, und das 90-100 Kilodalton Protein stellt wahrscheinlich das reife TGF-β1/β2 dar, das mit Disulfid an Prekursor- Sequenzen gebunden war (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418- 3427).
- Unter reduzierenden Bedingungen (Fig. 3, Spalte 2) wandert die Hauptmenge der Proteine bei 12 Kilodalton, was das reife TGF-β1/β2- Monomer darstellt. Zu beachten ist das Fehlen einer immunreaktiven Substanz im Bereich von 45-55 Kilodalton, was bei einer vergleichbaren Analyse von rekombinanten Proteinen, die in CHO-Zellen exprimiert wurden, die mit Plasmiden transfiziert worden waren, die für das Affen-TGF-β1-Gen kodieren (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418-3427), beobachtet worden war, was nahelegt, daß der chimäre TGF-β1/β2 proteolytisch effektiver pozessiert wird als das Ausgangsmolekül TGF-β1. Außerdem sekretieren CHO-5β41, 2.5-Zellen etwa 2,5mal mehr bioaktives, reifes Produkt als CHO-Zellen, die TGF-βl exprimieren (Gentry et al., 1987, supra). Obwohl die Ursache für diese Beobachtungen gegenwärtig unbekannt ist, kann die Sekundärstruktur des chimären TGF-β1/β2-Prekursors wesentlich von der Sekundärstruktur des TGF-β1 abweichen, wobei auf Grund der Sekundärstruktur das chimäre TGF-β1/β2 molekularen Prozessierungsvorgängen mit unterschiedlicher Intensität oder Beschaffenheit unterzogen werden. Zum Beispiel kann der TGF-β1/β2-Prekursor ein bevorzugteres Substrat für die Faktoren, die an der TGF-β-Prozessierung beteiligt sind, darstellen.
- Andererseits können die sekundären Strukturmerkmale des TGF-β1/β2 es diesem erlauben, mit anderen Prozessierungsfaktoren oder -wegen, die dem TGF-β1 nicht zugänglich sind, zu interagieren.
- Der folgende Transfektant ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, am 11. Januar 1989 hinterlegt worden und mit der aufgeführten Hinterlegungsnummer bezeichnet worden.
- Transfektant Plasmid Hinterlegungsnummer
- CHO-5β41, 2.5 CL 5 p5β/dhfr CRL 9959
- Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll nicht durch die hinterlegte Ziellinie oder die offenbarten Ausführungsformen beschränkt werden, die nur als einzelne Erläuterungen eines erfindungsgemäßen Aspektes gedacht sind, und alle funktionellen Äquivalente gehören zum erfindungsgemäßen Schutzumfang. Es ist klar, daß verschiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu den hier dargestellten und beschriebenen, auf Grund von der vorangegangenen Beschreibung dem Fachmann ersichtlich sein werden. Solche Modifikationen sollen zum Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche gehören.
- Es ist weiterhin klar, daß alle Basenpaar- und Aminosäurerest-Nummern und -Größen, die für die Nukleotide und Peptide angegeben sind, nur angenähert sind und zu Beschreibungszwecken verwendet werden.
Claims (21)
1. Chimärer Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2, umfassend
die in Fig. 1 dargestellte Aminosäureseguenz vom Aminosäurerest
Nummer 279 bis zum Aminosäurerest Nummer 390.
2. Isoliertes DNA-Molekül, das für den chimären
Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2 codiert, der die in Fig.
1 dargestellte Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Nummer 279
bis zum Aminosäurerest Nummer 390 umfaßt.
3. Isoliertes DNA-Molekül, das für den chimären
Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2 codiert, der die in Fig.
1 dargestellte Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Nummer 1
bis zum Aminosäurerest Nummer 390 umfaßt.
4. Säugerzelle, die mit einem DNA-Molekül transformiert ist,
das für den chimären Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β
codiert, der die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz vom
Aminosäurerest Nummer 279 bis zum Aminosäurerest Nummer 390
25 umfaßt.
5. Säugerzelle, die mit einem DNA-Molekül transformiert ist,
das für den chimären Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2
codiert, der die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz vom
Aminosäurerest Nummer 1 bis zum Aminosäurerest Nummer 390
umfaßt.
6. Säugerzelle, die mit einem DNA-Molekül transformiert ist,
das für den chimären Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2
codiert, der die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz vom
Aminosäurerest Nummer 279 bis zum Aminosäurerest Nummer 390
umfaßt, wobei sich die codierende Region des DNA-Moleküls unter
der Kontrolle einer Nukleotidsequenz befindet, die die
Genexpression reguliert, so daß die Zelle den chimären
irransformations-Wachstumsfaktor-β1/β2 herstellt.
7. Säugerzelle, die mit einem DNA-Molekül transformiert ist,
das für den chimären Transformations-Wachstumsfaktor β1/β2
codiert, der die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz vom
Aminosäurerest Nummer 1 bis zum Aminosäurerest Nummer 390
umfaßt, wobei sich die codierende Region des DNA-Moleküls unter
der Kontrolle einer Nucleotidsequenz befindet, die die
Genexpression reguliert, so daß die Zelle den chimären
Transformations-Wachtstumsfaktor-β1/β2 herstellt.
8. Zelle gemäß den Ansprüchen 6 und 7, nämlich eine Chinese
Hamster Ovary-Zelle.
9. Zelle gemäß den Ansprüchen 6 oder 7, wobei die
Nukleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen SV40-
Promotor umfaßt.
10. Zelle gemäß den Ansprüchen 6 oder 7, wobei die
Nukleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen
Promotor und eine für einen selektierbaren Marker codierende
Sequenz umfaßt.
11. Zelle gemäß Anspruch 10, wobei der selektierbare Marker
Dihydrofolat-Reduktase ist.
12. Zell-Linie, bezeichnet als CHO-5β41,2.5 CL5, hinterlegt
bei der American Type Culture Collection unter der
Hinterlegungs-Nr. CRL 9959.
13. Verfahren zur Herstellung eines chimären
Transformationswachstumsfaktor β1/β2, umfassend:
(a) die Kultivierung einer Säugerwirtszelle, die mit einem
DNA-Molekül transformiert ist, das für den chimären
Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2 codiert, der die in
Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest
Nummer 279 bis zum Aminosäurerest Nummer 390 umfaßt, wobei
sich die codierende Region des DNA-Moleküls unter der
Kontrolle einer Nukleotidsequenz befindet, die die
Genexpression reguliert, so daß ein Peptid oder ein
Protein, das die Aktivität des chimären Transformations-
Wachtstumsfaktors-β1/β2 besitzt, von der Wirtszelle
hergestellt wird; und
(b) die Gewinnung des chimären
Transformationswachstumsfaktors-β1/β2 aus der Kultur.
14. Verfahren zur Herstellung eines chimären
Transformationswachstumsfaktors-β1/β2, umfassend:
(a) die Kultivierung einer Säugerwirtszelle, die mit einem
DNA-Molekül transformiert ist, das für den chimären
Transformations-Wachstumsfaktor β1/β2 codiert, der die in
Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest
Nummer 1 bis zum Aminosäurerest Nummer 390 umfaßt, wobei
sich die codierende Region des DNA-Moleküls unter der
Kontrolle einer Nukleotidsequenz befindet, die die
Genexpression reguliert, so daß ein Peptid oder ein
Protein, das die Aktivität des chimären
Transformationswachtstumsfaktors-β1/β2 besitzt, von der Wirtszelle
hergestellt wird; und
(b) die Gewinnung des chimären
Transformationswachstumsfaktors-β1/β2 aus der Kultur.
15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die Wirtszelle
eine Chinese Hamster Ovary-Zelle ist.
16. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die
Nukleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen SV40-Promotor
umfaßt.
17. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die
Nukleotidsequenz, die die Genexpression reguliert, einen Promotor und
eine für einen selektierbaren, der Wirtszelle fehlenden Marker
codierende Sequenz umfaßt, so daß die Wirtszelle, die die für
den chimären Transformations-Wachstumsfaktor-β1/β2 codierende
Sequenz enthält, identifiziert werden kann.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei der selektierbare
Marker Dihydrofolat-Reduktase ist.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, weiterhin umfassend die
Exposition der Wirtszelle gegenüber Methotrexat, so daß
resistente Kolonien selektiert werden, die amplifizierte Mengen
der für Dihydrofolat-Reduktase codierenden Sequenz und des
chimären Transformations-Wachstumsfaktors-β1/β2 enthalten.
20. Verfahren zur Herstellung eines chimären Transformations-
Wachstumsfaktors-β1/β2, umfassend:
(a) die Kultivierung der transfizierten Zellinie
CHO-5β41,2.5 CL5, die hinterlegt ist bei der American Type
Culture Collection unter der Hinterlegungs Nr. CRL 9959;
(b) die Gewinnung des chimären Transformations-
Wachstumsfaktors-β1/β2 aus der Kultur.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der Transfectant in
Gegenwart von Methotrexat kultiviert wird.
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