AT401939B - Nukleotidsequenz, die für den transforming growth faktor-beta2 kodiert, transforming growth faktor-beta2 sowie verfahren und zellen zur herstellung desselben - Google Patents

Nukleotidsequenz, die für den transforming growth faktor-beta2 kodiert, transforming growth faktor-beta2 sowie verfahren und zellen zur herstellung desselben Download PDF

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AT401939B AT0186592A AT186592A AT401939B AT 401939 B AT401939 B AT 401939B AT 0186592 A AT0186592 A AT 0186592A AT 186592 A AT186592 A AT 186592A AT 401939 B AT401939 B AT 401939B
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   Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit dem Gebiet der   Klonierung   und Expression von menschlichem Transforming Growth Faktor-Beta2 (TGF-ss2). Gegenstand der Erfindung ist eine für   TGF-ss2   kodierende Nukleotidsequenz, der   TGF-ss2   selbst sowie Verfahren und Zellen zur Herstellung desselben. 
 EMI1.1 
    InhibitorsubstanzTGF-ss   ist ausserdem in der Lage,   fetale     Rattenmuskel-Mesenchym-Zellen   zu differenzieren und zur Produktion knorpelspezifischer Makromoleküle zu veranlassen (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem. 



  261 : 5693-5695). 



   Im Gegensatz zu seiner Wirkung auf die Zellproliferation kann der aus menschlichen Thrombozyten Isolierte TGF-ss ebenso wie ein funktionell verwandtes Protein aus BSC-1-Zellen der A. frikanischen Grünen Meerkatze das Wachstum bestimmter Zellen in Kultur inhibieren (Tucker et   al.,   1984, Science 226 : 705-707). Ausserdem konnte eine Wachstumshemmung mehrerer menschlicher Krebszellinien durch TGF-Beta gezeigt 
 EMI1.2 
 Effekt von TGF-ss Ist unter Umständen von mehreren Faktoren, wie dem Zelltyp und dem physiologischen Zustand der Zellen abhängig (Sporn et al., 1986, Science 233 : 532-534). cDNA-Klone, welche für Human- (Derynck et   al.,   1985, Nature 316 : 701-705), Mäuse- (Derynck et al., 1986, J. Biol.

   Chem 261 4377-4379) und Simian- (Sharpies et al., 1987, DNA 6 : 239-244) TGF-ss kodieren, wurden bereits isoliert.   DNA-Sequenzanalysen   dieser Klone welsen darauf hin, dass TGF-ss In Form eines grossen   Prekursor-Polypeptlds synthetisiert   wird, wobei dessen carboxy-terminales Ende unter Bildung des 
 EMI1.3 
 sämtlichen TGF-ss-Faktoren mitwies auf eine Homologie zu TGF-ss hin, weshalb dieses Protein als   TGF-ss2   bezeichnet wurde. Die früher Isolierten   Human- (Derynck   et   al.,   1985, Nature   316 : 701-705), Mäuse- (Derynck   et al, 1986, J Biol Chem 261 4377-4379) und Simian- (Sharpies et al., 1987, DNA 6. 239-244) TGF-ss-Faktoren wurden als   TGF-ss 1   bezeichnet. 



   Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung soll die Herstellung grosser Mengen von TGF-ss2 durch eukaryontische Wirtszelle, welche mit rekombinanten DNA-Vektoren   transftzlert   sind, die   TGF-ss2   kodierende Sequenzen enthalten,   ermöglicht   werden. Diese Sequenzen werden durch expressionsregulierende Elemente kontrolliert Man erhält für den   Human-TGF-2-Prekursor   kodierende   cDNA-Klone   aus   einer cDNA-Genbank,   hergestellt aus einer   Tamoxifen-behandelten   menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie PC-3.

   Aus der cDNA-Sequenz eines solchen Klones ergibt sich, dass TGF-ss2 In Form eines   Polypeptid-Prekursors   mit 442 Aminosäuren synthetisiert wird, aus dem die reife (maturierte) TGF-ss2-Untereinhelt mit 112 Aminosäuren durch proteolytische Spaltung erzeugt wird. Dieser TGF-ss2-Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-442   zeigt eine 41% ige Homologie   zum Prekursor von   TGF-ss1.   Gemäss einer weiteren Ausführungsform erhält man cDNA-Klone, welche für den   Simlan-TGF-ss2-Prekursor   kodieren, aus einer   cDNA-Genbank   einer Nierenzellinie BCS-40 aus Afrikanische Grüne Meerkatze.

   Die cDNA-Sequenz eines solchen Klones ergibt, dass TGF-ss2 ebenso als Prekursor-Polypeptid mit 414 Aminosäuren synthetisiert wird, woraus die maturierte   TGF-ss2-Unterelnhelt mit   112 Aminosäuren durch proteolytische Spaltung abgeleitet wird. Dieser   TGF-ss2-   Prekursor mit der Bezeichnung   TGF-ss2-414 mit einer   Aminosäuresequenz von 414 Aminosäuren stimmt 

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 mit der Aminosäurensequenz von   TGF-ss2-442 überein, wobei   allerdings ein einzelner Asparagmrest anstelle der 29 Aminosäuren langen Teilsequenz vom Rest Nummer 116 bis zum Rest Nummer 144 der Human-TGF-ss2-442-Sequenz enthalten ist. 



   Ausserdem wurden in einer BSC-40 cDNA-Genbank für einen   Simian-TGF-ss2-442-Prekursor   kodierende Klone sowie in einer Human-PC-3 cDNA-Genbank für einen   Human-TGF-2-414-Prekursor   kodierende Klone nachgewiesen. Die   Human- und Simian-TGF-ss2-442-Prekursoren   scheinen auf der Aminosäureebene ebenso wie die Human- und Slmian-TGF-ss2-414-Prekursoren absolut homolog zu sein. 



   Die maturierten 112 Aminosäure-Monomeren von   TGF-ss1   und   TGF-ss2   zeigen eine 71% ige Homologie. 



   Es wurden Expressionsvektoren hergestellt, welche die kodierende Sequenz für den maturierten TGF- ss2-Faktor in Phase mit der Signal- und Prekursorsequenz von   TGF-ss1   enthalten und zur Transfektion von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) verwendet. Die dabei gebildeten Transfektanten produzieren und sezernieren maturierten, biologisch aktiven TGF-ss2. 



   Die hierin verwendeten Abkürzungen besitzen folgende Bedeutung :
TGF-ss2 : Ein Transforming Growth Faktor-Beta2 aus Menschen oder Affen, welcher im wesentlichen die   Aminosäuresequenz   etwa vom Ami- nosäurerest Nummer 331 bis etwa zum Aminosäurerest Nummer
442 gemäss Fig.   1 a   umfasst. 



   TGF-ss2-Prekursor Eine Gruppe von Transforming Growth   Faktor-Beta2-Molekülen   aus Menschen oder Affen, welche eine Aminosäuresequenz ge- 
 EMI2.1 
 bis etwa zum Aminosäurerest 442, wobei die Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Nummer 116 bis zum Aminosäurerest 144   deletlert   und durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt ist, umfassen. Dieser Ausdruck steht für einen TGF-beta2-Prekursor mit der   Bezeichnung TGF-ss2-442   oder   TGF-ss2-414,   welche vom
Menschen oder vom Affen abgeleitet sind. 



     TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor : Ein   neues Transforming Growth Faktor-Beta-Prekursor-Molekül. welches im wesentlichen eine   Aminosäuresequenz   etwa vom Aml- nosäurerest Nummer 1 bis etwa zum   Aminosäurerest   390 gemäss
Fig. 1 b umfasst. 



     TGF-ssl-Prekursor Slmian-Transformmg   Growth Faktor-Betal-Prekursor und Signal- sequenzen, welche Im wesentlichen etwa die Aminosäurereste
Nummer 1 bis etwa 278 gemäss Fig. 1 b umfassen FIGURENBESCHREIBUNG 
Fig. 1 a : Nukleotidsequenz von Human-TGF-ss2-442 cDNA und abgeleitete   Aminosäuresequenz.   Das
2597 bp Insert von pPC-21 wurde in pEMBL subkloniert (Dante et al., 1983, Nucleic Acids
Res. 11. 1645-1654) und an bel den Strängen unter Verwendung der Dideoxy-Kettenabbruch- 
 EMI2.2 
 sowohl die kodierende Sequenz als auch unmittelbar darüber die abgeleitete Sequenz angegeben. Die Sequenz des maturierten   TGF-ss2   Ist eingerahmt und das   Signalpeptid   mit einer Linie oberhalb gekennzeichnet. Potentielle Glycosylierungsstellen sind mit Sternchen gekennzeichnet.

   Die mutmassliche Signalsequenz-Schnittstelle ist mit einem Pfeil gekenn- zeichnet. Die Nukleotidsequenz von   Simian-TGF-32-414 cDNA   ist mit der Human-TGF-ss2-
442 cDNA-Sequenz Identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotide 346 bis 432 (ge- schwärzt)   de ! et) ert   und durch die Sequenz AAT ersetzt sind Ausserdem sind an verschiede- nen Stellen der Sequenz stumme Vertauschungen von Nukleotiden gezeigt (angegeben durch einzelne Buchstaben direkt unter dem ausgetauschen Nukleotid). Die für den Slmlan-
TGF-ss2-414-Prekursor abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt mit der   Aminosäuresequenz   des   Human- TGF-ss2-442-Prekursors überein, mit   der Ausnahme, dass Asparagin die Amino- säurereste 116 bis 144 in der Human-TGF-ss2-442-Strukturersetzt.

   Die Nukleotidsequenz von   Human-TGF-2-414 cDNA   wurde In dem durch   gestnchelte Linien gekennzeichneten Bereich   sequenzlert, wobei vollkommene Homologie zur Human-TGF-ss2-442 cDNA-Sequenz festge- stellt wurde, mit der Ausnahme, dass die Nukleotide 346 bis 432 deletiert und durch die
Sequenz   AAT   ersetzt sind Fig.   1b. Nukleotldsequenz   der Hybnd-TGF-ss1/TGF-ss2-Prekursor-DNA und die abgeleitete   Aminosäu-   

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 resequenz. Es ist sowohl die kodierende Sequenz als auch unmittelbar darüber die abgeleite- te Aminosäuresequenz gezeigt. Die Sequenz des maturierten   TGF-ss2   ist eingerahmt und das
Prekursor-Signalpeptid mit einer Linie oberhalb gekennzeichnet. Glycosylierungsstellen sind mit Sternchen gekennzeichnet.

   Die mutmassliche   Signalsequenz-Schnittstelle   ist mit einem
Pfeil gekennzeichnet. Die kodierende Sequenz entspricht maturiertem Human-TGF-ss2. Die kodierende Sequenz von   Simian-TGF-/32   ist mit der Humansequenz fast Identisch : Lediglich drei stumme Basenaustausche wurden gefunden und sind mit einzelnen Buchstaben direkt unter dem ausgetauschten Nukleotid gekennzeichnet. Einzelheiten zur cDNA-Klonierung von   TGF-ss2   und zur Konstruktion des   TGF-ss1/TGF-ss2-Hybridgens   folgen im Text. 



  Fig.   1 c :   Schematisches Diagramm des   TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor-Gens.   



  Fig.   1d : Restnktionsendonukleasekarten   von pPC-14 (2. 2 kb) und pPC-21 (2. 3 kb). Die umrahmten
Bereiche stehen für die kodierenden Sequenzen des TGF-ss2-Monomers. ATG bezeichnet das Methionin-Startcodon. Der Abstand zwischen ATG und der Kpnl-Schnittstelle In pPC-21 (2. 3 kb) beträgt ca. 420 bp. Der geschwärzte Bereich zeigt die Position des 84-bp-lnserts in pPC-21 (2. 3 kb). 



  Fig.   1e : Partielle DNA-Sequenzanalyse   von pPC-14 (2. 2 kb). Ein synthetisches Oligonukleotid 5'-   AGGAGCGACGAAGAGTACTA-3',   weiches ca. 140 bp oberhalb (upstream) der Kpnl-Schnitt- stelle innerhalb des Inserts in pPC-21 (2. 3 kb) hybridisiert, wurde als Pnmer zur DNA-   Sequenzterung   verwendet. In diesen Bereich Ist die Sequenz von pPC-14 (2. 2 kb) (obere
Zeile) bis zu den Nukleotiden, welche für Asn-116 kodieren, identisch mit pPC-21 (2. 3 kb).
Das 84-bp-lnsert in das Asn-116-codon von pPC-14 (2. 2 kb), das in pPC-21 (2. 3 kb) gefunden wurde, ist ausserdem gezeigt. Die   Kpnl-Schnittstelle   innerhalb des Inserts ist angegeben. 



  Flg.   2 : Homologie   von Human-TGF-ss1- und TGF-ss2-442-Prekursorsequenzen. a)   Primäre     Sequenzhomologie. Identische   Reste sind eingerahmt. Potentielle Glycosylie- rungsstellen   In TGF-ss2   sind mit Sternchen gekennzeichnet, die potentielle Signalsequenz- schnittstelle und die Schnittstelle des maturierten Polypeptids sind gekennzeichnet b) Punktmatrixvergleich mit Hilfe der Gene Pro-Software. Durch jeden Punkt wird ein
Bereich angegeben, worin 5 von 10 Aminosäuren identisch sind.

   Diagonale   L ! men weisen   auf homologe Bereiche hin. 
 EMI3.1 
 wird aus BSC-40 und PC-3 Zellen Isoliert, auf einem Agarose-Formaldehydgel fraktioniert, auf   Hybond-N-Filter   übertragen und mit einem [32P]-markiertem TGF-ss2 spezifischen Marker, pPC-21 (Tell A) oder einem Gemisch von   [32P]-marklertem TGF-ss2-und TGF-ss1- (Sharples   et at., 1987) spezifischen Markern (Teil B) wie in Materials und Methoden beschrieben, 
 EMI3.2 
 ;ylierte RNA (5 Mikrogramm). 



    Flg.   4 Northern Blot-Analyse von polyadenylierter RNA unterschiedlicher Herkunft Polyadenylierte
RNA wurde aus MCF-7 (Human-Mammakarzinom), SK-MEL 28   (Human-Melanom),   KB (Na-   sopharyngealkarzlnom)   und HBL-100 (Human-Mammaepithei) Zellen isoliert und durch Nor- thern   Blot-Hybndislerung   mit einem   TGF-ss2-spezifischen   Marker (pPC-21) gemäss der Be- schreibung In Material und Methoden analysiert. Jede Spur enthält 5 Mikrogramm   poiyaden-   ylierter RNA aus SK-MEL 28 (Spur 1), MCF-7 (Spur 2), HBL-100 (Spur 3) oder KB (Spur 4)
Zellen. 
 EMI3.3 
 
5 : BioaktivitätstestKonfluenz In 100 mm Gewebskulturschalen gezüchtet.

   Die Zellen werden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und 24 h In serumfreiem Medium Inkubiert Die Medien werden gesammelt, gegen   O, 2M   Essigsäure dialysiert und auf Inhibition der DNA-Synthese in   CCL64-Zellen   wie beschrieben (Gentry et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7:341B) getestet. In diesem Test ergeben   3. 3   pg eines gereinigten natürlichen   TGF-ss1-Standards     50%lge Inhibi-   tion ; für die spezifische Aktivität von gereinigtem natürlichen TGF-ss2 wurde etwa der halbe
Wert von TGF-ss1 bestimmt. 



  Fig. 6 Western Blot-Analyse rekombinanter Proteine sezerniert von   1ss9, 12.5, Klon   36   Säuredfaiy-     siert     serumfreie   konditionierte Medien von 1 ss9, 12. 5, Klon 36 Zellen werden durch SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und durch Western-Blotting mit einem Antise- rum gegen das synthetische   NH2-YNTINPEASASPC-COOH   wie beschrieben analysiert (Gen- try et ai., 1987, Mol Cell. Blol. 7. 3418 

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Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Herstellung einer biologisch aktiven, maturierten Form von TGF-ss2 aus der kodierenden Sequenz eines   TGF-ss-Prekursor-Genes   und dessen Produkt.

   Das maturerte biologisch aktive   TGF-ss2   kann durch Klonierung und Expression der kodierenden Nukleotidequenz des   TGF-ss2-Prekursors   in voller Länge oder eines seiner funktionalen Äquivalente in einer Wirtszelle produziert werden, welche den Prekursor richtig prozessiert, so dass maturierter   TGF-ss2   mit einer biologischen Aktivität erzeugt wird, die sich von der Aktivität eines authentischen   natürlichen     TGF-ss2   nicht 
 EMI4.1 
 Hybridsequenzen, wie   z. B.   die   TGF-ss1-Prekursor-Sequenz,   die im richtigen Leserahmen mit der maturierten TGF-ss2-Sequenz verbunden ist, konstruiert und zur Herstellung von biologisch aktivem   TGF-ss2   verwendet werden. 



   Ein Aspekt der Erfindung ist eine für den TGF-ss2 kodierende Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie im wesentlichen die Nukleotidsequenz vom Nukleotidrest Nummer 991 bis zum Nukleotidrest Nummer 1326 gemäss Fig.   1 a   umfasst. 



   Ein Aspekt der Erfindung ist der Transforming Growth Faktor, der im wesentlichen die   Aminosäurese-   quenz vom Aminosäurerest Nummer 331 bis zum   Aminosäurerest   Nummer 442 gemäss   Flg.     1 a   umfasst. 
 EMI4.2 
    eukaryontischesion   regulierenden Nukleotidsequenz enthalten. 



   Zur Verdeutlichung des Herstellungsverfahrens kann dieses in folgende Stufen aufgeteilt werden. 



   (a) Isolierung oder Genenerung der kodierenden Sequenz für einen   TGF-ss2-Prekursor ;   (b) Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher die Expression einer kodierenden Sequenz für TGF-   ss2   steuert ; (c) Transfektion einer geeigneten Wirtszelle, welche das Gen repliziert und exprimiert und das Genpro- dukt zur Produktion der maturierten, biologisch aktiven Form von   TGF-ss2 prozessiert,   und (d) Identifizierung und Reinigung des maturierten biologisch aktiven TGF-ss2. 



   Nach Identifizierung des Transfektanten, welcher eine hohe Expressionsrate für bioaktives matunertes   TGF-ss2   aufweist, wird erfindungsgemäss dieser   Klon   vermehrt und das expnmlerte Genprodukt daraus isoliert. 



   Das Verfahren wird anhand von Beispielen beschrieben. Hierin werden cDNAs der kodierenden TGF-   ss2-Prekursorregion   hergestellt,   kloniert, sequenzlert   und zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet, welcher eine hohe Expressionsrate von TGF-ss2 in CHO-Zellen steuert. In einer speziellen Ausführungsform wird die gesamte Aminosäuresequenz der maturierten Form von Human-TGF-ss2 bestimmt, welche Insgesamt eine Homologie von 71% mit TGF-ss1 aufweist. Unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden wurden Klone einer PC-3 cDNA-Genbank identifiziert, welche für   TGF-ss2   kodieren.

   Die DNASequenzanalyse eines dieser Klone ergab, dass   TGF-ss2   ebenso   wie TGF-ss1 In   Form eines grösseren 
 EMI4.3 
    Homologie zwischen TGF-TGF-ss2   können daraus geschlossen werden
In einer speziellen Ausführungsform wird die Herstellung grosser Mengen von biologisch aktivem TGF-   ss2   durch Expression eines neuartigen   TGF-ss1/TGF-ss2-Hybndgens In CHO-Zellen erreicht.   



   Die verschiedenen Aspekte dieses Verfahrens werden Im folgenden sowie In den Beispielen näher beschrieben. 



  Isolierung und Erzeugung der   TGF-ss2-kodlerten Region   
 EMI4.4 
 benen Verfahrens können die darin dargestellten Nukleotidsequenzen oder Fragmente oder funktionale Äquivalente davon zur Erzeugung des rekombinanten Moleküls verwendet werden, welches die Expression des TGF-ss2-Produktes in einer geeigneten Wirtszelle steuert. Gemäss einer speziellen Ausführungsform   wird ein TGF-ss1/TGF-ss2-Hybndgen- (Fig. 1 b) hergestellt   und zur Transfektion von CHO-Zellen verwendet. Transfektanten mit einer Produktionsrate von 500 ug matunertem biologisch aktivem TGF-ss2 pro ml Kulturmedium wurden Isoliert. 



   Aufgrund der Degeneration der kodierenden Nukleotidsequenz können andere DNA-Sequenzen, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, die den Sequenzen gemäss Fig   1 a   und   1 b In wesentlichen gleichen,   

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 zur   Klonierung   und Expression von   TGF-ss2   verwendet werden. Derartige Veränderungen beinhalten
Deletionen, Additionen oder Substitutionen unterschiedlicher Nukleotidreste, welche zu einer Sequenz führen, die für ein identisches oder funktional äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt kann
Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz aufweisen, welche zu stummen Veränderungen führen und wodurch ein bioaktives Produkt erzeugt wird.

   Derartige Aminosäu- resubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydro-   phobizität,   Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der betreffenen Reste erfolgen. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und   Glutaminsäure ; positiv geladene   Aminosäu- ren umfassen Lysin und Arginin ; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder unpolaren
Kopfgruppen mit vergleichbarer Hydrophilie beinhalten : Leucin, Isoleucin, Valin ; Glycin, Alanin ; Asparagin,
Glutamin ; Serin, Threonin ; Phenylalanin, Tyrosin. 



   Die kodierende Nukleotidsequenz für   TGF-ss2   kann man aus Zellen erhalten, welche eine   TGF-ss2   ähnliche Aktivität aufweisen. Die kodierende Sequenz kann man durch   cDNA-Klonierung   von RNA erhalten, welche aus derartigen Zellen durch genomische   Klonierung   isoliert und gereinigt wurde. Man kann entweder   cDNA-oder genomische Genbanken   von Klonen herstellen, welche mit Hilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren,   z. B.   unter Verwendung von Restriktionsenzymen aus DNA-Fragmenten erzeugt wurden.

   Die Genfragmente, welche für   TGF-ss2   kodieren, können durch Screening solcher Genbanken mit einer Nukleotidsonde nachgewiesen werden, welche zu einem beliebigen Teil der in Fig. 1a dargestellten Sequenz im wesentlichen komplementär ist. Klone mit der Gesamtsequenz, d. h. Klone, welche den gesamten kodierenden Bereich des   TGF-ss2-Prekursors   enthalten, können selektiert und expnmlert werden. 



   Gemäss einer anderen Ausführungsform kann die kodierende Sequenz in Fig. 1 a als ganzes oder teilweise unter Verwendung von bekannten chemischen Methoden synthetisiert werden (s.   z. B.   Caruthers et   al.,   1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7 : 215-223 ; Crea und Horn, 1980, Nuc. Acids. Res. 9 (10) : 2331 ; Matteucci und Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21 : 719 und Chow und   Kempe,   1981, Nuc. Acids Res. 



    9 (12) : 2807-2817).   Andererseits könnte das Protein dadurch hergestellt werden, dass man mit Hilfe von chemischen Methoden die Aminosäuresequenz in Fig.   1   als Ganzes oder teilweise synthetisiert. Beispielsweise können Peptide mit Hilfe der Festphasensynthese auf einem Beckman 990-Gerät hergestellt werden, und   anschliessend   wie beschrieben (L. E. Gentry et   al.,   1983, J. Blol. Chem.   258 : 11219-11228 ; L. E.   Gentry and A.   Lawton,   1986, Virology   152 : 421-431)   abgespalten werden. Zur Reinigung kann man präparative hochauflösende   Flüssigchromatographie   verwenden. Die Peptidzusammensetzung kann durch   Aminosäure-   analyse bestimmt werden. 



   Gemäss einer speziellen Ausführungsform   In den hlenn   beschriebenen   Beispielen erhält   man die TGF- ss2-kodierende Sequenz durch   Kloomerung   der cDNA der kodierenden Sequenz des Human-TGF-ss2Prekursors, abgeleitet von   polyadenyllerter   RNA. Diese wurde aus einer   Tamoxifen-behandelten   menschlichen prostatischen   Adenokarzmomze) ! mie   PC-3 Isoliert, deren   TGF-ss2-Produktion   bereits nachgewiesen war. Der gesame kodierende Bereich eines   cDNA-Klons   wurde sequenziert und mit der veröffentlichten Sequenz für   Human- TGF-ss1 verglichen   (s. Fig. 2). 



   Die   DNA-Sequenzanalyse   von   TGF-ss2-cDNA-Klonen   zeigt, dass   TGF-ss2   ebenso wie TGF-ss1 als grosses   Prekursorprotein   synthetisiert wird, dessen carboxyterminales Ende unter Bildung des maturierten 112 Aminosäuren langen   TGF-ss2-Monomers abgespalten wird   Für   TGF-ss2   wurde ein Molekulargewicht von 24 000 nachgewiesen, wobei das Molekül aus zwei   disulfidverbrückten   13 000 Dalton grossen Untereinheiten besteht   (Ikeda   et al., 1987,   Biochemistry 26:2406-2410;   Cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415).

   Zur Produktion von matunertem   TGF-ss2   ist daher sowohl eine entsprechende proteolytische Spaltung als auch die Bildung   intra- und intermolekularer Disulfidbrücken erforderlich.   Eine aminoterminale hydrophobe Leadersequenz (Reste 3-19)   ist im   Prekursor nachweisbar und kann für das Ausschleusen des Proteins aus der   Zelle verantwortlich sein. Matunerter TGF-ss2   kann während dieses Vorgangs mit dem restlichen Teil des Prekursors noch verbunden sein   TGF-ss2   zeigt gegenüber TGF-ss1 Im maturierten Bereich des Prekursors eine   71% ! ge Homologie,   die 
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 rungsgrad auf und deutet darauf hin, dass dieser Teil des Moleküls eine wichtige biologische Funktion besitzen könnte.

   Im Gegensatz dazu ist lediglich eine   31     ! ge   Homologie zwischen den N-terminalen Prekursorbereichen von   TGF-ss1   und   TGF-ss2   zu beobachten Nach Abspaltung des wahrscheinlichen Signal peptids würde der   TGF-ss2-Prekursor   eine grössere Anzahl von Aminosäuren als der   TGF-ss1-   Prekursor besitzen Die pnmären   Strukturunterschiede Innerhalb   des aminoterminalen Bereichs des TGF- 

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   ss1- und TGF-ss2-Prekursorproteins   können auf funktionalen Unterschieden beruhen. Es werden jedoch auffällig homologe Bereiche innerhalb der Prekursoren in isolierten Blocks gefunden, welche eine Konservierung wichtiger funktionaler Domänen auch innerhalb der N-terminalen Prekursorregion andeuten. 



   Northern Blot-Analysen ergaben grössenmässig zwei Hauptklassen von   TGF-ss2-spezifischer mRNA   mit 
 EMI6.1 
 
1welcher annähernd 1 kb grösser ist als der entsprechende Bereich in pPC-21 und pPC-14 und der ausserdem eine unterschiedliche Polyadenylierungsstelle aufweist. Daraus kann geschlossen werden, dass eine alternative Polyadenylierung eine Ursache ist. die zur Erzeugung multipler   TGF-ss2-mRNAs   (wie in Northern Blots beobachtet) führt. 



     BSC-40-Zellen enthalten   vergleichbare Mengen von   TGF-ss1-und TGF- 2-spezifischen Transcriptionen ;     Tamoxifen-behandelte   PC-3-Zellen enthalten mehr   TGF-ss1-mRNA   als TGF-ss2-mRNA (Fig. 3b). Letzteres Ergebnis ist nicht zu erwarten, da diese Zellen mehr   TGF-ss2-Protein     als TGF-ss1 produzieren (Ikeda   et al, 1987, Biochemistry   26 : 2406-2410).   Daraus kann auf eine posttranscriptionale Regulation der Synthese dieser Wachstumsmodulatoren geschlossen werden. Versuche zum besseren Verstehen der transcriptionalen und translationalen Kontrollmechanismen, die zur Produktion von   TGF-ss1   und   TGF-ss2   führen, werden durchgeführt.

   Die Herstellung adequater Mengen von TGF-ss2 mit Hilfe der DNA-Rekombination. wie bereits für TGF-ss1 durchgeführt, sollte der Durchführung weiterer Experimente zur Erforschung der verschiedenen Effekte dieses Proteins dienen. 



   Gemäss einer weiteren Ausführungsform wurde die   TGF-ss2-kodierende   Sequenz durch   cDNA-Kionie-   rung der kodierenden Sequenz des   Simian-TGF- ; 82-Prekursors   hergestellt. Letzterer wurde von polyadenylierter RNA abgeleitet. die aus der   BSC-40-Zellinie   afrikanischer grüner Meerkatzen isoliert wurde. Die gesamte kodierende   Region eines cDNA-Klons   wurde sequenziert Daraus ergaben sich identische Aminosäuresequenzen des   Human-und Simian-TGF-ss2-Prekursors   und eine annähernde Identität ihrer Nukleotidsequenzen. 



  Konstruktion eines Expressionsvektors mit der   TGF-ss2   kodierenden Sequenz 
Zur Expression von biologisch aktivem, matunertem TGF-ss2 sollte ein Expressionsvektor/Wirtssystem   gewählt   werden, welches nicht nur hohe Transcnptions- und Translationsraten, sondern auch die richtige Prozessierung des Genproduktes bewirkt. Dies ist insbesondere wichtig bel Verwendung der gesamten kodierenden Sequenz eines   TGF-ss2-Prekursors   im Expressionssystem, da die maturierte Form von   TGF-ss2   wahrscheinlich über zelluläre Prozessierungsvorgänge vom Prekursorprodukt abgeleitet wird. Zusätzlich 
 EMI6.2 
 



   Anscheinend wird der maturierte   TGF-ss2,   ein disulfidverbrücktes Homodimeres mit 112 Aminosäuren pro Untereinheit, durch zelluläre Prozessierung gebildet. Hierbei erfolgt eine proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren Arg-Ala des Prekursors (Reste 330 und 331 m Fig.   1a).   Zusätzlich enthält der TGF-ss2-Prekursor drei potentielle   N-Glycosylierungsstellen, welche   in der maturierten Form nicht zu beobachten sind ; eine nchtige Glycosylierung des Prekursors kann für die zelluläre Synthese und Freisetzung oder Sekrotion des maturierten Moleküls entscheidend sein.

   Der maturierte   TGF-ss2   umfasst ein 
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    Disulfidbrücken beteiligt.Die Fähigkeit   der im Expressionssystem verwendeten Wirtszelle zur korrekten Expresson und Prozesserung des   TGF-ss2-Genproduktes   ist daher für die Produktion eines biologisch aktiven maturierten   TGF-ss2   von Bedeutung. 



   Eine Vielzahl von Tierzeilen/Expressionsvektorsystemen (d. h. Vektoren, welche die zur Steuerung der   Replikation, Transcnption   und Translation der TGF-ss2-kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle 
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 Promoter). 



   Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren In Stärke und   Spezifität.   In   Abhängigkeit   des verwendeten   Wirts/Vektorsystems   können beliebige Transcnptlons- und Translationselemente aus einer 

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 Vielzahl von geeigneten Elementen verwendet werden. Wenn   z. B.   in einem   Säugetierzellsystem   kloniert wird, können z. B. Promotoren aus dem Genom von Säugetierzellen   (z. B. Mäuse-Metallothionein-Promoter)   oder aus Viren, welche in diesen Zellen wachsen   (z. B.   Vaccinavirus   7. 5   K Promoter) verwendet werden. Mit Hilfe von rekombinanten DNA oder synthetischen Methoden hergestellte Promotoren können ebenso zur Transcription der inserierte Sequenzen verwendet werden. 



   Spezifische Initiationssignale sind für eine ausreichende Translation der insertierten proteinkodierenden Sequenzen erforderlich. Diese Signale beinhalten das ATG-Startcodon und die daran angrenzenden Sequenzen. Für den Fall, dass das gesamte TGF-ss2-Gen einschliesslich seines eigenen Startcodons und der daran angrenzenden Sequenzen in geeignete Expressionsvektoren insertiert wird, sind keine weiteren   Translationskontrollsignale   erforderlich. Wenn jedoch nur ein Teil der kodierenden Sequenz insertiert wird, müssen exogene Translationskontrollsignale sowie das ATG-Startcodon eingeführt werden. Ausserdem ist es erforderlich, dass das Startcodon mit dem Leserahmen der   TGF-ss2-kodierenden   Sequenz in Phase insertiert wird, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten.

   Die erwähnten exogenen Translationskontrollsignale und Startcodons können sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein. Die Effektivität der Expression kann mit Hilfe von   Transcriptions-Attenuationssequenzen.   Enhancerelementen usw. verstärkt werden. 



   Jede beliebige bekannte Methode zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann zur Konstruktion des Expressionsvektors der das   TGF-ss-Gen   und geeignete   Transcriptions/Translations-Kon-   trollsignale enthält, verwendet werden. Diese Verfahren umfassen in   vitro-DNA-Rekombinationstechniken,   
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   Bei Verwendung eines Adenovirus als Expressionsvektor kann die   TGF-ss2-kodierende   Sequenz an einen   Adenovirus-Transcriptions/Translations-Kontrollkomplex (z. B.   die Late Promoter und die Tripartite Leader-Sequenz) ligiert werden. Diese chimeren Gene können dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination insertiert werden. Eine Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms   (z. B.   Region E1 oder E3) führt zu einem lebensfähigen rekombinanten Virus, welches zur Expression von   TGF-ss2   im infizierten Wirt befähigt ist. In ähnlicher Weise kann der Vaccina 7. 5 K-Promoter verwendet werden. 



   Ein anderes Expressionssystem zur Expression von   TGF-ss2   Ist ein   Insektensystem.   In einem dieser Systeme wird als Vektor zur Expression fremder Gene das Autographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera   frugiperda-Zellen.   Die   TGF-ss2-kodierende   Sequenz kann in nicht-essentiellen Bereichen   (z. B.   dem Polyhednngen) des Virus   kloniert   und von einem AcNPV-Promotor   (z. B.   dem Polyhedrin-Promotor) kontrolliert werden. Nach erfolgter Insertion der TGF-ss2kodierenden Sequenz ist eine Inaktivierung des Polyhedringens und die Produktion unverschlossener 
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  Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von Spodoptera   fruglperda-Zellen   verwendet, in denen das inserierte Gen expnmiert wird. 



   Zusätzlich kann ein   Wirtszellstamm gewählt   werden, welcher die Expression der inserierten Sequenz moduliert oder das Genprodukt auf gewünschte Weise modifiziert und prozessiert. Die Expression bestimmter Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren   (z. B. Zink-und Cadmiumionen   für Metallothioneinpromotoren) erhöht werben. Somit kann die Expression von durch Genetic Englneenng erzeugtem TGF- 
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 e W ! rtsze ! ! e ieta !Wirtszeiten besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen zur   posttranslatlonalen Prozesslerung   und Modifikation von Proteinen. Geeignete Zellinie oder Wirtssysteme können zur Gewährleistung der richtigen Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins ausgewählt werden. 



  Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, welche das   TGF-ss2   Genprodukt expnmieren 
Die die rekombinante   TGF-ss2-kodierende   Sequenz enthaltenden Wirtszelle, welche das biologisch aktive, maturierte Produkt exprimieren. können mit Hilfe von wenigstens vier allgemeinen Verfahren identifiziert werden : (a)   DNA-DNA-Hybndisierung ;   (b) Anwesenheit oder Abwesenheit   von"Marker"-Genfunktionen ;   (c) Bestimmung der Transcnptionsrate. wie z B durch Messung der Expression des   TGF-ss2-mRNA-  
Transcnptes in den Wirtszelle ; und (d) Detektion des maturierten Genproduktes über einen Immunoassay und schliesslich dessen biologische
Aktivität. 

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   In einem ersten Versuch kann die Anwesenheit der inserierten TGF-ss2-kodierenden Sequenz im Expressionsvektor durch DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, wobei als Sonden Nukleotidequenzen verwendet werden. Diese weisen Homologien zur kodierenden Sequenz von TGF-ss2 (im wesentlichen gemäss Fig.   1 a)   oder zu Teilen oder Derivaten davon auf. 



   In einem zweiten Versuch kann das rekombinante   Expressionsvektor/Wirtssystem   durch Abwesenheit oder Anwesenheit   bestimmter"Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität. Antibiotikaresistenz,   Methotrexatresistenz, Transformationsphenotyp,   Occlusionskörperbildung   im Baculovirus, usw. ) identifiziert und selektioniert werden. Wenn   z. B.   die   TGF-ss2-kodierende   Sequenz in eine Marker-Gensequenz eines Vektors insertiert wird, können diejenigen Rekombinanten durch die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden, welche die TGF-ss2-kodierende Sequenz enthalten.

   Andererseits kann eine MarkerGensequenz zusammen mit der TGF-ss2-Sequenz unter Kontrolle desselben oder eines weiteren Promotors zur Kontrolle der   TGF-ss2-kodierenden   Sequenz gestellt werden. Die Expression des Markers nach Induktion oder Selektion weist auf die Expression der   TGF-ss2-kodierenden   Sequenz hin. 



   In einem dritten Versuch kann die Transcriptionsaktivität für die   TGF-ss2-kodierende   Region mit Hilfe von Hybridisierungsversuchen bestimmt werden. Beispielsweise kann polyadenylierte RNA isoliert und durch Northern Blotting analysiert werden. Hierzu wird eine zur gesamten oder teilweisen TGF-ss2kodierenden Sequenz homologe Sonde verwendet. Ausserdem können alle Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und durch Hybridisierung mit den oben genannten Sonden verwendet werden. 



   In einem vierten Versuch kann die Expression des matunerten Proteinproduktes immunologisch   z. B   durch Western Blots, Immunoassays, wie der   Radioimmuno-Präzipftation,   enzymgebundene   Immunoassays   
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 Genprodukt nicht sezerniert, können Zell-Lysate auf die gesuchte Aktivität hin getestet werden. In beiden Fällen können biologische Tests, wie der hierin beschriebene Wachstumsinhibitionstest oder die Simulierung des verankerungsunabhängigen Wachstums in   Targetzellen (Twardzlk   und   Herwin.   1985, J. Cell. 
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 Tests verwendet werden. 



   Nach einmaliger Identifizierung eines Klons, welcher grosse Mengen von biologisch aktiven matunertem   TGF-ss2   produziert, kann dieser Klon vermehrt und   TGF-ss2   unter Verwendung bekannter Techniken gereinigt werden. Solche Verfahren sind die   Immunoaffinitätsreinigung,   chromatographische Methoden einschliesslich der hochauflösenden Flüssigchromatographie und andere. 



    BE ! SP ! EL 1 Ktonierung   des TGF-ss2-Prekursors aus PC-3-Zellen 
Die folgenden Beispiele beschreiben   die cDNA-Klonierung   der   TGF-ss2-Prekursor   kodierenden Sequenzen aus der menschlichen prostatischen   Adenokarzinomzellinie PC-3,   aus der   TGF-ss2   bereits früher Isoliert wurde. 



  1. MATERIAL UND METHODEN 
Die folgenden Verfahren wurden zur Klonierung von cDNAs verwendet, welche für den   Human-TGF-jS2-   Prekursor kodieren. 



    1. 1.   Züchtung der Zellen und Extraktion der RNA 
Die menschliche prostatische Adenokarzinomzellinie PC-3 wurde in einem   Tamoxifen-haltigen   Medium wie bereits beschneben   (Ikeda   et al., 1987, Biochemistry 26. 2406-2410) gezüchtet MCF-7-Zellen wurden In Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium mit einem Gehalt von 10% fetalen Kälberserum und 6 Einhei-   ten, Iml Insulin   gezüchtet. Alle anderen Zellinie wurden In dem gleichen insulinfreien Medium gezüchtet Polyadenylierte RNA wurde durch   Oligo [dT]-Cellulosechromatographie isoliert   (Purchio und Fareed, 1979, J. 



    Viral.   29 : 763-769). 



  1 2 Konstruktion der cDNA-Genbank und Screening 
Doppelsträngige cDNA wurde, ausgehend von polyadenylierter RNA synthetisiert, welche aus PC-3- 
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 mit mehr als 1000   Basenpaaren   wurden in Lambda gt10 wie beschrieben kloniert (Webb et   al.,   1987, DNA 6 : 71-79). Die Genbank wurde zuerst mit einer   [32P]-markierten   24fach degenerierten Sonde zweifach gescreent.

   Die verwendete Sonde ist komplementär zu der für die Aminosäuresequenz WKWIHEP kodierenden DNA (Sonde   1),   welche in TGF-ss1 und TGF-ss2 konserviert ist : 
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 die Translation gewöhnlich am ersten Methionin in einem offenen Leserahmen beginnt und da zu TGF-ss1 homologe Bereiche (wie hierin diskutiert) oberhalb (in 5'-Richtung) des zweiten Methionins zu beobachten sind, wurde das erste Methionin versuchsweise als Startsignal für die Translation festgesetzt. Daraus ergibt 
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 wird.

   Der pPC-21-Klon enthält 467 bp oberhalb (in 5'-Richtung) des mutmasslichen Methionin-Startsignals und eine   3'-untranslatierte   Region von etwa 800 bp einschliesslich einer   Poly (A) -Folge.   Fünfzehn Basen oberhalb davon (upstream ; in 5'-Richtung) befindet sich eine Polyadenyherungs-Signalsequenz (Proudfoot and Brownlee, 1976, Nature 263 : 211-214). 



   Die Nukleotidsequenz-Homologie innerhalb der kodierenden Regionen von TGF-ss1 und   TGF-ss2   pPC-
21 cDNA Klonen beträgt 53%. Die für das maturierte Protein kodierenden Bereiche weisen eine 57%ige
Homologie auf, während die Upstream-Prekursor-Region eine   48%lge Homologie zeigt.   Nach optimaler
Anordnung der beiden Sequenzen waren mehrere Nukleotidinsertionen in der   TGF-ss2-Prekursor-Region,   eine davon mit 75 Nukleotiden : zu beobachten. Inwiefern diese Insertionen durch Anwesenheit zusätzlicher
Exons in   TGF-ss2   verursacht werden, ist nicht bekannt.

   Eine signifikante Homologie zwischen den DNA-
Sequenzen in den nicht-kodierenden Bereichen der beiden Klone war nicht zu zu beobachten.   TGF-ss1   weist ausgedehnte G-C-reiche nichtkodierende Bereiche auf, während   TGF-ss2   ausgedehnte A-T-reiche nicht-kodierende Bereiche zeigt. Beide cDNA-Klone enthalten wiederkehrende Strukturmuster im 3'-nichtkodierenden Bereich mit Wiederholungen in   TGF-ss1,   bestehend aus   (Punn) CCCC (Sharples   et al., 1987, DNA 6 : 239-244) und in   TGF-ss2,   bestehend aus ATG oder A   (Pyrimidin) (Purin).   



   Restriktionsanalysen vieler Klone führten zu dem Ergebnis, dass einem Klon (pPC-14) eine KpnlSchnittstelle im aminoterminalen Teil der für   TGF-ss2   kodierenden Sequenz fehlt.   Restriktionsanalysen   für pPC-14 und pPC-21 sind in Fig. 1d angegeben. pPC-14 wurde mit Hilfe eines zu den Nukleotiden 277 bis 296 In Fig.   1 a   komplementären Primer-Oligonukleotids (20 Nukleotide) in einem Bereich von etwa 100 Nukleotiden im betreffenden aminoterminalen Ende sequenziert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Klon pPC-
14 eine Deletion von 87 Nukleotiden (Nukleotidpositionen 346 bis 432 in   Fig. la ;   s. auch Fig.   1 e) enthält,   welche für die fehlende Kpnl-Schnittstelle verantwortlich ist und durch die Sequenz   AAT,   dem Codon für Asparagin, ersetzt ist.

   Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Klon pPC-14 für einen kürzeren TGF-ss2Prekursor mit 414 Aminosäuren kodiert, welcher sich von der durch pPC-21 kodierten Sequenz lediglich durch eine Deletion der Aminosäurereste 116 bis 144 unterscheidet, die durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt sind. 



   Obwohl die gesamte kodierende Region von pPC-14 nicht bestimmt wurde, hegt wahrscheinlich eine vollständige Übereinstimmung mit der kodierenden Sequenz aus pPC-21 vor, da sich mit Ausnahme der Kpnl-Schnittstelle die Restriktionsmuster beider Klone decken (Fig. 1d). Ausserdem wurde ein   Simian-Kion   kodierend für einen 414 Aminosäure grossen   TGF-ss-Prekursor   mit der gleichen 29 Aminosäure grossen Deletion und Substitution nachgewiesen (s. Beispiel im Abschnitt 7, unten). Dieser   Simian-Klon   weist eine kodierende Sequenz auf, weiche zu der des   Human-pPC-21-Klons   Im 5'- und 3'-Bereich der Deletion nahezu identisch ist. 



   Fig 2A zeigt die abgeleitete Proteinsequenz für   Human- TGF-ss1   (Derynck et al, 1985, Nature 316 : 701- 705) im Vergleich zu der Sequenz von   Human-TGF-jS2-442.   Es wurde eine   71% ige Homologie   von TGF-ss2 mit Human-TGF-ss1 im maturierten Bereich des Moleküls bestimmt (Marquardt et al., 1987, J. Biol. Chem., im Druck). Der   aminoterminale   Teil des Prekursors oberhalb (upstream) des maturierten Moleküls zeigt eine   3l% ige Homotogie zwischen TGF-j81   und TGF-ss2-442. Der Dot-Matnx-Homologievergleich in Fig. 2B ergibt eine signifikante Homologie in mehrerer spezifischen Bereichen der Proteine. Ein Vergleich der Nterminalen Aminosäuresequenzen im mutmasslichen Signalpeptidbereich ergibt keinerlei signifitante Homolo-   gie.   



     In TGF-ss2   wird eine Signalsequenz-Schnittstelle nach Aminosäure 20 (Serin) und in TGF-ss1 nach Aminosäure 29 (Glycin) (Von Heijne, 1983, Eur. J. Biochem. 133 : 17-21) vorgeschlagen. Dieser Schnittstelle folgt direkt der erste homologe Block (zwischen   TGF-ss1   und   TGF-ss2),   der sich 34 Aminosäuren in 3'Richtung (downstream) erstreckt Nach Abspaltung der Signalsequenzen würden die   TGF-ss1- und TGF-ss2-   Prekursoren in den ersten vier aminoterminalen Aminosäuren übereinstimmen (einschliesslich Cystein an Position 4). Vierzehn Aminosäuren downstream von diesen mutmasslichen N-Terminus sind 19 der folgenden 21 Aminosäuren in   TGF-ss1   und   TGF-ss2   konserviert.

   Dieser Homologiebereich ist grösser als irgendein anderer Homologiebereich in der C-terminalen Region, die das maturierte TGF-ss-Protein enthält Wie aus den Fig. 2A und 2B zu entnehmen ist, zeigen sich noch mehrere Bereiche mit auffallender Homologie im Upstream-Bereich des maturierten Proteins. Diese Domänen sind jeweils durch eine Vielzahl nichthomologer Aminosäuren voneinander getrennt. 



   Der TGF-ss2-Prekursor weist drei potentielle   N-Glycosylierungsstellen   an den Resten 72,168 und 269 (s Fig.   1 a)   auf. Lediglich die erste Stelle ist in TGF-ss1 konserviert und hegt innerhalb eines grösseren 

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 Blocks konservierter Reste, woraus man entnehmen kann, dass diese Glycosylierungsstelle wichtige strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaften besitzt. 



   Nach Abspaltung der Signalsequenz würde der   TGF-ss2-Prekursor   31 bzw. 59 Aminosäuren mehr als   TGF-ss1   aufweisen. Ein zusätzlicher Cysteinrest in TGF-ss2 befindet sich unmittelbar upstream einer grossen nicht-homologen Aminosäuresequenz vor der Sequenz des maturierten Proteins. Ebenso wie in TGF-ss1 findet man in   TGF-ss2   die Schnittstelle für das maturierte Protein unmittelbar nach einem Bereich von 4-5 basischen Aminosäuren (s. Fig. 2A). Der maturierte Bereich enthält 9 Cysteine.

   Eine Konservierung von 7 der 9 Cysteine ist ein wesentliches Merkmal der verschiedenen Mitglieder der   TGF-ss-Famllle.   Eine Bestimmung der   hydropathischen   Indizes für   TGF-ss1   und TGF-ss2 ergab sowohl für den Prekursor als auch für die maturierte Form ähnliche Muster, wobei beide Proteine generell hydrophiler Natur sind (keine Daten angegeben). 



   Fig. 3A zeigt eine Northern Blot-Analyse unter Verwendung von pPC-21 als Sonde zur Detektion von polyadenylierter RNA aus BSC-40 (einer   Afrikanische-Grüne-Meerkatze-Zellinie)   und tamoxifen-behandelten PC-3-Zellen. PC-3-Zellen enthalten drei Hauptgruppen von TGF-ss2-spezifischen mRNAs mit einer Grösse 
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 Transcripte und geringere Mengen der   5. 1   kb RNA (Fig. 3A, Spur 1). Es Ist zu erwähnen, dass die pPC-21Sonde unter diesen Hybridisierungsbedingungen den In diesen Zellen vorliegenden TGF-ss1-spezifischen 2. 5 kb-mRNA-Typ nicht detektiert. Diese Ergebnisse und frühere Beobachtungen (Sharples et   al.,     1987.   
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 markiert waren.

   Spur 1 in   Flg.   3B zeigt, dass   BSC-40-Zellen   sowohl das TGF-ss1-spezifische 2.5 kb-mRNAFragment als auch die   TGF-ss2-mRNA-Typen   mit 4. 1 und 6. 5 kb enthalten ; Spur 2 in   Flg.   3B zeigt. dass tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen ausserdem die   TGF-ss1-spezlfische   2. 5 kb-mRNA enthalten. Fig. 3B zeigt ausserdem, dass tamoxifen-behandelte   PC-3-Zellen   mehr   TGF-ss1-als     TGF-ss2-spezifische   mRNA enthalten. 



   Der Nachweis von   TGF-ss2-spezifischen     cDNA-Klonen   ermöglichte ein Screening   verschiedener Zelll-   nien auf TGF-ss2-mRNA. Der Northern Blot In Fig. 4 zeigt, dass TGF-ss2-spezifische Transcripte in HBL 100 (einer normalen Epithelzeillinie aus menschlicher Milch, von Dr.

   Greg Schultz). in MCF-7 (einer menschlichen Mammakarzinomzellinie) in SK-MEL 28 (einer Melanomzellinie) nachgewiesen werden können und   KB-Zellen   (eine Nasopharyngeal-Karzinomzellinie) gennge Mengen von   TGF-ss2-mRNA   enthalten BEISPIEL 2 clonierung der cDNA des TGF-ss2-Prekursors aus BSC-40-Zellen 
Die folgenden Beispiele beschreiben die   cDNA-Klonierung   der   TGF-, 82-kodlerenden   Sequenzen aus der   MSC-40-Zelllinie   der Niere Afrikanischer Grüner Meerkatzen, welche   TGF-ss2-spezifische   mRNAs enthalten (Abschnitt   6,   oben).

   Die Ergebnisse welsen daraus hin, dass Simian-TGF-ss2 ähnlich wie Human-TGF-ss2 in Form eines von mindestens zwei längeren Prekursormolekülen synthetisiert wird, woraus das maturierte TGF-ss2-Molekül durch proteolytische Spaltung abgeleitet wird. 



  1 MATERIAL UND METHODEN 
Die folgenden Verfahren wurden zur Konierung der für den   Slmlan- TGF-, 82-Prekursor   kodierenden cDNAs verwendet. 



  1. 1. Züchtung der Zellen und RNA-Extraktion 
BSC-40-Zellen wurden In   Dulbecco's   modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet.   Polyadenyherte   RNA wurde mit Hilfe von Oligo[dT]-Cellulosechromatographie wie beschrieben (Purchio und   Fareed,   1979, J.   Virol.   29 : 763-769) isoliert. 



  1. 2. Konstruktion der cDNA-Genbank und Screening   Doppelstrangige CDNA   wurde mit polyadenylierter RNA aus BSC-40-Zellen wie beschrieben hergestellt (Maniatis et al., 1982, Molecular   Cidning :   A Laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, Cold Spnng Harbor, NY, 371-372) und nach Behandlung mit EcoRI-Methylase mit Oligonukleotidlinkern ligiert, weiche 
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 daut und durch Chromatographie über Sephacryl S-1000 fraktioniert. cDNA-Fraktionen grösser als 750 Basenpaare wurden vereinigt und mit   Lambda-gtIO hg ert. weicher   zuvor   mit EcoRI geschnitten   wurde 

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 (Davis et al., 1980, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics ;

   Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), verpackt (Grosveld et al., 1981, Gene 13 : 227-237) und mit E. coli C600   rK-mK+hfl   plattiert. Die Genbank wurde durch Plaque-Hybridisierung (Bentonet et al., 1977, Science 196 : 180-182) mit [32P]-markierten pPC-21- und pPC-14-Sonden gescreent. Der mit pPC-21 hybridisierende Klon pBSC-40-16 und der mit pPC-14 hybridisierende Klon pBSC-40-1 wurde isoliert und   in pEMBL subkloniert.   Die   TGF-ss2-kodierende   Sequenz aus pBSC-40-1 wurde durch Sequenzierung beider Stränge mit Hilfe der 
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 pBSC-40-16 wurde teilweise sequenziert. 



  2. ERGEBNISSE 
Man erhielt zwei Klone aus der BSC-40   cDNA-Genbank.   die jeweils mit Sonden hybridisierten. welche für die kodierenden Sequenzen für den Human-TGF-ss2-442- und TGf-ss2-414-Prekursor konstruert wurden   Klon   pBSC-40-16, welcher mit der TGF-ss2-442-Sonde hybridisierte, wurde über einen Bereich von 150 Nukleotide (Nukleotide 300 bis 450 in Fig.   1 a) sequenzlert,   von dem man vermutete, dass er die kodierende Sequenz des 29 Aminosäuren grossen Segmentes aus den Positionen 346 bis 432 in Fig. 1a enthält.

   Die Ergebnisse zeigten, dass pBSC-40-16 in diesem Bereich für eine Aminosäureasequenz kodiert, die der korrespondierenden Sequenz im   Human-TGF-ss2-442     cDNA-Klon,   pPC-21, identisch Ist und zeigt. dass pBSC-40-16 für einen 442 Aminosäure grossen   TGF-ss2-Prekursor   kodiert. 



     Klon   pBSC-40-1, welcher mit der   TGF- ss2-414-Sonde hybridisiert,   wurde Im gesamten kodierenden Bereich sequenziert Die Ergebnisse zeigten, dass dieser   Klon   für einen 414 Aminosäure grossen   TGF-ss2-   
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 ; 82-442-Prekursor identischDie Nukleotide 346 bis 432 in Fig. 1a sind deletiert und durch das Asparagin-Codon AAT ersetzt. Mit Ausnahme von 13 stummen Basenaustauschen sind die belden Strukturen im restlichen Bereich der kodierenden Sequenz absolut homolog. 



  BEISPIEL 3 : Expression von   TGF-ss2   
Die folgenden Beispiele beschreiben die Expression von maturiertem, biologisch aktivem TGF-ss2 in Chinesischer Hamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen), welche mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert wurden, das unter der regulatorischen Kontrolle der SV40-Promotorsequenz die kodierende Sequenz für matunerten Human-TGF-ss2 enthält, die downstream und Im richtigen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz für den   Slmlan-TGF-ss1-Prekursor ligiert   ist. Die Konstruktion steuert Synthese und Sekretion von matunertem, biologisch aktivem   TGF-ss2   bel einer Ausbeute von etwa   0, 5 mg/I.   



  1. MATERIAL UND METHODEN 1. 1. Zellkultur 
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 und 100 ug/ml Streptomycin enthalten. Die CHO-Transfektanten wurden in   Dulbecco's   modifiziertem EagleMedium mit den oben beschriebenen Zugaben vermehrt. CHO-Zellen und deren Denvate wurden routinemässig durch Trypsinisierung be; einem   Teilungsverhältnis   von 1 : 5 überführt. 



   Methotrexat (Sigma, MO) wurde mit einer Stammkonzentration von 10   mg/mi   In Wasser hergestellt Verdünnte NaOH (0, 2 M) wurde zur Solubilisierung des Wirkstoffs hinzugegeben (pH-Endwert von 6). Die Stammlösung wurde   f ! ! tersteriiis) ert   und   bel -200 C   aufbewahrt. Die Stammlösungen von Methotrexat Im Medium (100 uM) wurden bei 40   C nicht   länger als 1 Monat aufbewahrt. 



  1 2 DNA-Manipulationen und Plasmidkonstruktionen   Restnktionsenzyme,   T4 DNA-Ligase, Phosphatase aus Kälberdarm, das Klenow-Fragment der DNAPolymerase I und andere DNA-Reagentien wurden von Bethesda Research Laboratories, MD. bezogen Standard-DNA-Manipulationen wurden nach   T. Maniatis,   et al., 1982, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold   Spnng   Harbor Laboratory, New York, durchgeführt. 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 



   Das Plasmid pSV2- (ss1-TGF-dhfr), welches die   Simian-TGF-l-cDNA   und das Maus-dhfr-Gen in Tandemposition und ebenso die SV40-Zwischensequenz enthält. wurde wie beschrieben hergestellt (Gentry et al., 1987, Mol.   Cell. Biol. 7 : 3418).   



   Das Plasmid pSV2/ss1-ss2/dhfr wurde gemäss Absatz 8. 2. hergestellt. 



    1. 3. DNA- Transfektionen    
Etwa 24 h nach Aufbringen von 106 dhfr-negativen CHO-Zellen auf 100 mm-Platten, wurden die Kulturen mit 20 ug   Ndel-linearisiertem-pSV2- (ss1-TGF-dhfr)-Plasmid   in Form eines Calciumphosphatpräzipi- 
 EMI13.1 
 der linearisierten DNA zu 1 ml einer sterilen   CaCb-Lösung   (250 mM) hinzugefügt. 1 mi einer 2X HEPESLösung (280 mM   NaCI,   50 mM   HEPES,   1, 5 mM Natriumphosphat, pH 7, 1) wurde   anschliessend   tropfenweise hinzugefügt und das Gemisch 30 min in Eis aufbewahrt. Das Präzipitat wurde   anschliessend   tropfenweise in 10 ml eines die Zellen enthaltenden F12-Mediums dispergiert. Nach 4-stündiger Inkubation bei   37.

   C   wurde das Medium entfernt und durch 10 ml F12-Medium mit 25% Glycerin 90 s lang bel Raumtemperatur 
 EMI13.2 
 Medium (20   ml)   inkubiert. Die Selektion der dhfr-exprimierenden Transfektanten erfolgte durch Substitution des Mediums mit einem   DMEM-Suppiement   mit 10% dialysierte FBS (Gibco, N. Y.) und 150   u. g/ml   LProlin. Kolonien wurden nach   10- bis   14-tägiger Kultivierung der Zellen   Im Selektionsmedium   erhalten. Zehn Kolonien wurden mit Hilfe einer Pasteurpipette aufgesaugt und vermehrt. 



  1. 4 Selektion von Methotrexat-resistenten Zellen 
Dthydrofolat-Reduktase (dhfr)-amplifzierte Zellen wurden aus den Pnmär-Transfektanten wie beschne- 
 EMI13.3 
 wurden 105 Zellen auf 100 mm-Platten überimpft und auf erhöhte Methotrexat-Konzentrationen eingestellt Die Platte, die bei der höchsten Methotrexat-Konzentration sichtbare Kolonien ergab, wurde trypsinislert und auf diese Methotrexat-Konzentration für zwei weitere   1 : 5-Zellübertragungen eingestellt. 105 Zellen   wurden   anschliessend bel   5facher Methotrexat-Konzentration auf 100 mm-Platten aufgebracht. Platten, die sichtbare Kolonien enthielten, wurden erneut trypsmisiert und auf das Methotrexathaltige Medium eingestellt. Zellen wurden In verschiedenen Stadien der Amplifikation in einem Medium mit 40% FBS, 10% Dimethylsulfoxid und 50% DMEM eingefroren.

   Methotrexat war in den   Gefrlermedlen   nicht enthalten. 



    1. 5. WachstumsInhibitionstest    
Mink-Lungenepithelzellen, Mv 1 Lu   (Hinterlegungsnummer CCL-64,   American Type Culture Collection) mit hoher Sensitivität für   TGF-ss1   wurden im Wachstumsinhibitionstest verwendet. Zur Bestimmung der DNA-Synthese wurde die   Thymidin-analoge   Verbindung   5'-['251]-Jod-2'-deoxyundin ( 5! dU)   verwendet. Eine   Aktivitätseinheit   wurde als diejenige Menge definiert, die zur   50%igen In@ubition des 125 ldU-Einbaus im   Vergleich zu unbehandelten   CCL-64-Zellen erforderlich   ist. 



   Zum Nachweis der Sekretion von aktivem   TGF-ss2   aus   transfizlerten Zellen   wurde   serumfreier   Überstand konfluenter Zellkulturen innerhalb von 24 h abgetrennt und ausgiebig gegen 0, 2 M Essigsäure dialysiert. Essigsäure wurde durch Lyophilisierung abgetrennt und die Proben m sterilem vollständigem Kulturmedium zur Verwendung Im Test gelöst. 



  2 Konstruktion des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor-Gens zur   TGF-ss2-Expression   
Em Hybnd   TGF-Beta-Prekursor-Gen,   bestehend aus der   Simlan-TGF-ss1-kodierenden   Prekursorsequenz und der   5'-untranslatierten   Sequenz und der Im richtigen Leserahmen daran gebundenen kodierenden Sequenz für maturierten   Human-TGF-j82   und der   3'-untranslatierten   Sequenz wurde gemäss der Darstellung in Flg. 1c konstruiert. pPC-21 wurde zuerst mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, das 2.

   3 kb-Fragment mit 
 EMI13.4 
 und   pPC-21/Hincll- mit   den Inserts   ! n jeweils   entgegengesetzter   Onentlerung   wurden zur Erzeugung überlappender Exolll-Fragmente durch jeweiligen Verdau mit Sstl und BamHI, gefolgt von Exolll-Verdau, Klenow-Behandlung, erneuter Ligierung der DNA und Transformation von E. coli verwendet. Zwei Klone, Exo 5. 9 und Exo 25C wurden mit unterschiedlich langen 5'-bzw 3'-Sequenzen gefunden und in pEMBL zur Erzeugung von pEMBL 5. 9 und pEMBL 25C subkloniert 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 pBMBL   5. 9   wurde mit   Hindlll   verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem   Klenow-Enzym   behandelt, mit Kpnl verdaut und daraus das 0. 6 kb-Fragment (Fragment 1) isoliert.

   Exo 25C wurde mit EcoRI und Kpnl verdaut und daraus das   1. 1   kb-Fragment (Fragment 2) isoliert. pGS62 wurde mit BamHI verdaut, mit dem   Klenow-Enzym aufgefüllt,   mit EcoRI verdaut und mit den Fragmenten 1 und 2 ligiert (pGS62 wurde aus pGS20 (Mackett et   al.,   1984, J. Virol. 49 : 857) durch Deletion einer einzelnen EcoRISchnittstelle erzeugt). Das Gemisch wurde zur Transformation von E. coli verwendet, woraus   pGS62/CIFB   isoliert wurde. pGS62/CIFB wurde mit Pstl und EcoRI verdaut, daraus das 1600 bp-Fragment isoliert und nochmals mit Xholl verdaut. Das daraus resultierende 400 bp grosse Fragment Xholl-EcoRI wurde isoliert (Fragment 3). 
 EMI14.1 
 das 300 bp grosse Fragment Isoliert (Fragment 4). 



   Zwei komplementäre DNA-Stränge mit den unten angegebenen Sequenzen wurden synthetisiert, phosphoryliert, anneliert und mit den oben beschriebenen Fragmenten 3 und 4 ligiert. 
 EMI14.2 
 



   Das   Plasmid pss1/ss2   wurde mit   EcoR !   verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1   aufgefüllt,     mit Hindlil   geschnitten und daraus das 1600 bp-Fragment   isoliert ; pSV2, 1l/32   wurde durch Insertion dieses Fragmentes in pSV2, neo, welches zur Entfernung des neo-Gens zuvor mit   Hindlll   und   Hpal   verdaut wurde. pSV2.ss1/ss2 wurde min Pvul und   EcoR ! verdaut. m ! t   dem Klenow-Enzym   aufgefüllt,   mit   Ndel   verdaut und daraus das   2. 6   kb   (circa) Ndel-EcoRI-Fragment Isoliert   und mit psV2, dhfr ligiert, welches zuvor mit Ndel und Pvull verdaut wurde   E.

   coli   wurde mit dem Ligierungsgemisch transformiert und daraus pSV2/ss1-   ss2/dhfr Isoliert.    



  3 Expression von   TGF-ss2   In CHO-Zellen   pSV2/ss1-ss2/dhfr   wurde zur Transfektion von dhfr-negativen CHO-Zellen verwendet und   dhfr-ampliflzler-   te Zellen wurden aus den pnmären Transfektanten, wie in Material und Methoden beschrieben, hergestellt
Positive Klone wurden mit Hilfe des Bioassays (Inhibition der Mink-Lungenepithelzellen (CCL-64)) wie beschneben nachgewiesen (Gentry et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7:3418). Rekombinante Proteine wurden mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung eines Antipeptid-Antiserums gegen die Sequenz NH2- 
 EMI14.3 
 te annähernd 500   ng/ml   des Faktors   (Flg.   5). 



   Eine Analyse des von diesem Klon sezernierten Proteins mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung des Antipeptid-Antiserums ISt In Fig. 6 gezeigt. Daraus ist zu entnehmen, dass sowohl das matunerte 24kd TGF-ss2-Dimer als auch die grössere (annähernd 90kd) Prekursorform nachgewiesen werden konnte. 



  HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN 
Die folgenden Mikroorganismen wurden bel der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) hinterlegt und mit folgenden Hinterlegungsnummern bezeichnet : 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
 EMI15.1 
 
<tb> 
<tb> tvtikroorganismen <SEP> Plasmid <SEP> Hinterlegungs-Nummer <SEP> 
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pPC-21 <SEP> B-18256
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pPC-14 <SEP> B-18333
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pBSC-40-1 <SEP> B-18335
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pBSC-40-16 <SEP> B-18334
<tb> Chinese <SEP> Hamster <SEP> Ovary <SEP> pSV/ss1-ss2/dhfr
<tb> 
 Patentansprüche 1.

   Nukleotidsequenz, die für den Transforming Growth   Faktor-ss2   kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie Im wesentlichen die Nukleotidsequenz vom Nukleotidrest Nummer 991 bis zum Nukleotidrest
Nummer 1326 gemäss Fig.   1 a   umfasst. 



  2. Transforming Growth Faktor-ss2, dadurch gekennzeichnet, dass er Im wesentlichen die Aminosäurese- quenz vom Aminosäurerest Nummer 331 bis zum Aminosäurerest Nummer 442 gemäss Fig.   1 a   umfasst. 



  3. Verfahren zur Herstellung des Transforming Growth Faktor-ss2, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst : (a) Kultivierung einer eukaryontischen Zelle, welche eine für den Transforming Growth   Faktor-ss2   kodierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz enthält, welche die
Genexpression reguliert, sodass ein Peptid oder Protein durch die eukaryontische Zelle produziert wird, welches Transforming Growth-Faktor-ss2-Aktrvität aufweist: und (b) Isolierung des Transforming Growth Faktor-ss2 aus der Kultur. 
 EMI15.2 


Claims (1)

  1. ! eot ! dsequenzbis zum Nukleotidrest 1339 gemäss Fig. 1 a umfasst.
    5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transforming Growth Faktor- ss2 kodierende Nukleotidsequenz im wesentlichen eine Nukleotidsequenz vom Nukleotidrest Nummer -70 bis zum Nukleotidrest Nummer 1755 gemäss Fig. 1 b umfasst.
    6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontlsche Zelle eine Chinesische Hamster Ovarialzelle ist 7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleotidsequenz, welche die Genexpression kontrolliert, einen SV40 Promotor umfasst.
    8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleotidsequenz einen Promotor und eine für einen seiektierbaren Marker kodierende Sequenz umfasst, der der eukaryontl- schen Zelle fehlt, sodass die eukaryontische Zelle, welche die für den Transforming Growth Faktor-ss2 kodierende Sequenz enthält, identifiziert werden kann.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der selektierbare Marker Dihydrofolatre- ductase umfasst.
    10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ausserdem die Behandlung der eukaryoot)- schen Zelle mit Methotrexat vorgesehen ist, sodass resistente Kolonien selektiert werden, welche einen erhöhten Gehalt an für Dihydrofolatreductase und Transforming Growth Faktor-ss2 kodierenden Sequen- zen aufweisen 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontische Zelle eine Chines- sche Hamster Ovarialzelle 1St, der die Dihydrofolatreductase fehlt.
    12. Verfahren zur Herstellung des Transforming Growth Faktors-ss2, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst <Desc/Clms Page number 16> (a) Kultivierung des Transfektanten 1ss9, 12.5, Klon 36 (hinterlegt bei der ATCC unter der Nummer CRL 9800) ; und (b) Isolierung des Transforming Growth Faktors-ss2 aus der Kultur.
    13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Transfektant in Gegenwart von Methotrexat kultiviert wird.
    14. Eukaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine für den Transforming Growth Faktor-ss2 kodierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz enthält, welche die Genexpression reguliert, sodass die eukaryontische Zelle aktiven Transforming Growth Faktor-ss2 produ- ziert.
    15. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transforming Growth Faktor-ss2 kodierende Nukleotidsequenz im wesentlichen eine Nukleotidsequenz vom Nukleotid Nummer -70 bis zum Nukleotid Nummer 1755 gemäss Fig. 1b umfasst.
    16. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Chinesische Hamster Ovanalzelle ist.
    17. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleotidsequenz, welche die Genexpression kontrolliert, einen SV40 Promotor umfasst.
    18. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nukleotidsequenz einen Promotor und eine zweite, für einen selektierbaren Marker kodierende Sequenz umfasst, wobei der Marker eukaryontischen Zellen fehlt, sodass die eukaryontlsche Zelle, welche die kodierende Sequenz für den Simian-Tranforming Growth Faktor-ss2 enthält, identifiziert werden kann.
    19. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der selektierbare Marker Dihydrofolatreductase umfasst 20. Eukaryontische Zelle nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Chinesische Hamster Ovanatzette ist. der die Dihydrofolatreductase fehlt 21. Zeilinie, welche 1ss9, 12. 5, Klon 36 umfasst und bel der ATCC unter der Nummer CRL 9800 hinterlegt ist.
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