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Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit dem Gebiet der Klonierung und Expression von menschlichem Transforming Growth Faktor-Beta2 (TGF-ss2). Gegenstand der Erfindung ist eine für TGF-ss2 kodierende Nukleotidsequenz, der TGF-ss2 selbst sowie Verfahren und Zellen zur Herstellung desselben.
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InhibitorsubstanzTGF-ss ist ausserdem in der Lage, fetale Rattenmuskel-Mesenchym-Zellen zu differenzieren und zur Produktion knorpelspezifischer Makromoleküle zu veranlassen (Seyedin et al., 1986, J. Biol. Chem.
261 : 5693-5695).
Im Gegensatz zu seiner Wirkung auf die Zellproliferation kann der aus menschlichen Thrombozyten Isolierte TGF-ss ebenso wie ein funktionell verwandtes Protein aus BSC-1-Zellen der A. frikanischen Grünen Meerkatze das Wachstum bestimmter Zellen in Kultur inhibieren (Tucker et al., 1984, Science 226 : 705-707). Ausserdem konnte eine Wachstumshemmung mehrerer menschlicher Krebszellinien durch TGF-Beta gezeigt
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Effekt von TGF-ss Ist unter Umständen von mehreren Faktoren, wie dem Zelltyp und dem physiologischen Zustand der Zellen abhängig (Sporn et al., 1986, Science 233 : 532-534). cDNA-Klone, welche für Human- (Derynck et al., 1985, Nature 316 : 701-705), Mäuse- (Derynck et al., 1986, J. Biol.
Chem 261 4377-4379) und Simian- (Sharpies et al., 1987, DNA 6 : 239-244) TGF-ss kodieren, wurden bereits isoliert. DNA-Sequenzanalysen dieser Klone welsen darauf hin, dass TGF-ss In Form eines grossen Prekursor-Polypeptlds synthetisiert wird, wobei dessen carboxy-terminales Ende unter Bildung des
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sämtlichen TGF-ss-Faktoren mitwies auf eine Homologie zu TGF-ss hin, weshalb dieses Protein als TGF-ss2 bezeichnet wurde. Die früher Isolierten Human- (Derynck et al., 1985, Nature 316 : 701-705), Mäuse- (Derynck et al, 1986, J Biol Chem 261 4377-4379) und Simian- (Sharpies et al., 1987, DNA 6. 239-244) TGF-ss-Faktoren wurden als TGF-ss 1 bezeichnet.
Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung soll die Herstellung grosser Mengen von TGF-ss2 durch eukaryontische Wirtszelle, welche mit rekombinanten DNA-Vektoren transftzlert sind, die TGF-ss2 kodierende Sequenzen enthalten, ermöglicht werden. Diese Sequenzen werden durch expressionsregulierende Elemente kontrolliert Man erhält für den Human-TGF-2-Prekursor kodierende cDNA-Klone aus einer cDNA-Genbank, hergestellt aus einer Tamoxifen-behandelten menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie PC-3.
Aus der cDNA-Sequenz eines solchen Klones ergibt sich, dass TGF-ss2 In Form eines Polypeptid-Prekursors mit 442 Aminosäuren synthetisiert wird, aus dem die reife (maturierte) TGF-ss2-Untereinhelt mit 112 Aminosäuren durch proteolytische Spaltung erzeugt wird. Dieser TGF-ss2-Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-442 zeigt eine 41% ige Homologie zum Prekursor von TGF-ss1. Gemäss einer weiteren Ausführungsform erhält man cDNA-Klone, welche für den Simlan-TGF-ss2-Prekursor kodieren, aus einer cDNA-Genbank einer Nierenzellinie BCS-40 aus Afrikanische Grüne Meerkatze.
Die cDNA-Sequenz eines solchen Klones ergibt, dass TGF-ss2 ebenso als Prekursor-Polypeptid mit 414 Aminosäuren synthetisiert wird, woraus die maturierte TGF-ss2-Unterelnhelt mit 112 Aminosäuren durch proteolytische Spaltung abgeleitet wird. Dieser TGF-ss2- Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-414 mit einer Aminosäuresequenz von 414 Aminosäuren stimmt
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mit der Aminosäurensequenz von TGF-ss2-442 überein, wobei allerdings ein einzelner Asparagmrest anstelle der 29 Aminosäuren langen Teilsequenz vom Rest Nummer 116 bis zum Rest Nummer 144 der Human-TGF-ss2-442-Sequenz enthalten ist.
Ausserdem wurden in einer BSC-40 cDNA-Genbank für einen Simian-TGF-ss2-442-Prekursor kodierende Klone sowie in einer Human-PC-3 cDNA-Genbank für einen Human-TGF-2-414-Prekursor kodierende Klone nachgewiesen. Die Human- und Simian-TGF-ss2-442-Prekursoren scheinen auf der Aminosäureebene ebenso wie die Human- und Slmian-TGF-ss2-414-Prekursoren absolut homolog zu sein.
Die maturierten 112 Aminosäure-Monomeren von TGF-ss1 und TGF-ss2 zeigen eine 71% ige Homologie.
Es wurden Expressionsvektoren hergestellt, welche die kodierende Sequenz für den maturierten TGF- ss2-Faktor in Phase mit der Signal- und Prekursorsequenz von TGF-ss1 enthalten und zur Transfektion von Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) verwendet. Die dabei gebildeten Transfektanten produzieren und sezernieren maturierten, biologisch aktiven TGF-ss2.
Die hierin verwendeten Abkürzungen besitzen folgende Bedeutung :
TGF-ss2 : Ein Transforming Growth Faktor-Beta2 aus Menschen oder Affen, welcher im wesentlichen die Aminosäuresequenz etwa vom Ami- nosäurerest Nummer 331 bis etwa zum Aminosäurerest Nummer
442 gemäss Fig. 1 a umfasst.
TGF-ss2-Prekursor Eine Gruppe von Transforming Growth Faktor-Beta2-Molekülen aus Menschen oder Affen, welche eine Aminosäuresequenz ge-
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bis etwa zum Aminosäurerest 442, wobei die Aminosäuresequenz vom Aminosäurerest Nummer 116 bis zum Aminosäurerest 144 deletlert und durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt ist, umfassen. Dieser Ausdruck steht für einen TGF-beta2-Prekursor mit der Bezeichnung TGF-ss2-442 oder TGF-ss2-414, welche vom
Menschen oder vom Affen abgeleitet sind.
TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor : Ein neues Transforming Growth Faktor-Beta-Prekursor-Molekül. welches im wesentlichen eine Aminosäuresequenz etwa vom Aml- nosäurerest Nummer 1 bis etwa zum Aminosäurerest 390 gemäss
Fig. 1 b umfasst.
TGF-ssl-Prekursor Slmian-Transformmg Growth Faktor-Betal-Prekursor und Signal- sequenzen, welche Im wesentlichen etwa die Aminosäurereste
Nummer 1 bis etwa 278 gemäss Fig. 1 b umfassen FIGURENBESCHREIBUNG
Fig. 1 a : Nukleotidsequenz von Human-TGF-ss2-442 cDNA und abgeleitete Aminosäuresequenz. Das
2597 bp Insert von pPC-21 wurde in pEMBL subkloniert (Dante et al., 1983, Nucleic Acids
Res. 11. 1645-1654) und an bel den Strängen unter Verwendung der Dideoxy-Kettenabbruch-
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sowohl die kodierende Sequenz als auch unmittelbar darüber die abgeleitete Sequenz angegeben. Die Sequenz des maturierten TGF-ss2 Ist eingerahmt und das Signalpeptid mit einer Linie oberhalb gekennzeichnet. Potentielle Glycosylierungsstellen sind mit Sternchen gekennzeichnet.
Die mutmassliche Signalsequenz-Schnittstelle ist mit einem Pfeil gekenn- zeichnet. Die Nukleotidsequenz von Simian-TGF-32-414 cDNA ist mit der Human-TGF-ss2-
442 cDNA-Sequenz Identisch, mit der Ausnahme, dass die Nukleotide 346 bis 432 (ge- schwärzt) de ! et) ert und durch die Sequenz AAT ersetzt sind Ausserdem sind an verschiede- nen Stellen der Sequenz stumme Vertauschungen von Nukleotiden gezeigt (angegeben durch einzelne Buchstaben direkt unter dem ausgetauschen Nukleotid). Die für den Slmlan-
TGF-ss2-414-Prekursor abgeleitete Aminosäuresequenz stimmt mit der Aminosäuresequenz des Human- TGF-ss2-442-Prekursors überein, mit der Ausnahme, dass Asparagin die Amino- säurereste 116 bis 144 in der Human-TGF-ss2-442-Strukturersetzt.
Die Nukleotidsequenz von Human-TGF-2-414 cDNA wurde In dem durch gestnchelte Linien gekennzeichneten Bereich sequenzlert, wobei vollkommene Homologie zur Human-TGF-ss2-442 cDNA-Sequenz festge- stellt wurde, mit der Ausnahme, dass die Nukleotide 346 bis 432 deletiert und durch die
Sequenz AAT ersetzt sind Fig. 1b. Nukleotldsequenz der Hybnd-TGF-ss1/TGF-ss2-Prekursor-DNA und die abgeleitete Aminosäu-
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resequenz. Es ist sowohl die kodierende Sequenz als auch unmittelbar darüber die abgeleite- te Aminosäuresequenz gezeigt. Die Sequenz des maturierten TGF-ss2 ist eingerahmt und das
Prekursor-Signalpeptid mit einer Linie oberhalb gekennzeichnet. Glycosylierungsstellen sind mit Sternchen gekennzeichnet.
Die mutmassliche Signalsequenz-Schnittstelle ist mit einem
Pfeil gekennzeichnet. Die kodierende Sequenz entspricht maturiertem Human-TGF-ss2. Die kodierende Sequenz von Simian-TGF-/32 ist mit der Humansequenz fast Identisch : Lediglich drei stumme Basenaustausche wurden gefunden und sind mit einzelnen Buchstaben direkt unter dem ausgetauschten Nukleotid gekennzeichnet. Einzelheiten zur cDNA-Klonierung von TGF-ss2 und zur Konstruktion des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybridgens folgen im Text.
Fig. 1 c : Schematisches Diagramm des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor-Gens.
Fig. 1d : Restnktionsendonukleasekarten von pPC-14 (2. 2 kb) und pPC-21 (2. 3 kb). Die umrahmten
Bereiche stehen für die kodierenden Sequenzen des TGF-ss2-Monomers. ATG bezeichnet das Methionin-Startcodon. Der Abstand zwischen ATG und der Kpnl-Schnittstelle In pPC-21 (2. 3 kb) beträgt ca. 420 bp. Der geschwärzte Bereich zeigt die Position des 84-bp-lnserts in pPC-21 (2. 3 kb).
Fig. 1e : Partielle DNA-Sequenzanalyse von pPC-14 (2. 2 kb). Ein synthetisches Oligonukleotid 5'- AGGAGCGACGAAGAGTACTA-3', weiches ca. 140 bp oberhalb (upstream) der Kpnl-Schnitt- stelle innerhalb des Inserts in pPC-21 (2. 3 kb) hybridisiert, wurde als Pnmer zur DNA- Sequenzterung verwendet. In diesen Bereich Ist die Sequenz von pPC-14 (2. 2 kb) (obere
Zeile) bis zu den Nukleotiden, welche für Asn-116 kodieren, identisch mit pPC-21 (2. 3 kb).
Das 84-bp-lnsert in das Asn-116-codon von pPC-14 (2. 2 kb), das in pPC-21 (2. 3 kb) gefunden wurde, ist ausserdem gezeigt. Die Kpnl-Schnittstelle innerhalb des Inserts ist angegeben.
Flg. 2 : Homologie von Human-TGF-ss1- und TGF-ss2-442-Prekursorsequenzen. a) Primäre Sequenzhomologie. Identische Reste sind eingerahmt. Potentielle Glycosylie- rungsstellen In TGF-ss2 sind mit Sternchen gekennzeichnet, die potentielle Signalsequenz- schnittstelle und die Schnittstelle des maturierten Polypeptids sind gekennzeichnet b) Punktmatrixvergleich mit Hilfe der Gene Pro-Software. Durch jeden Punkt wird ein
Bereich angegeben, worin 5 von 10 Aminosäuren identisch sind.
Diagonale L ! men weisen auf homologe Bereiche hin.
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wird aus BSC-40 und PC-3 Zellen Isoliert, auf einem Agarose-Formaldehydgel fraktioniert, auf Hybond-N-Filter übertragen und mit einem [32P]-markiertem TGF-ss2 spezifischen Marker, pPC-21 (Tell A) oder einem Gemisch von [32P]-marklertem TGF-ss2-und TGF-ss1- (Sharples et at., 1987) spezifischen Markern (Teil B) wie in Materials und Methoden beschrieben,
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;ylierte RNA (5 Mikrogramm).
Flg. 4 Northern Blot-Analyse von polyadenylierter RNA unterschiedlicher Herkunft Polyadenylierte
RNA wurde aus MCF-7 (Human-Mammakarzinom), SK-MEL 28 (Human-Melanom), KB (Na- sopharyngealkarzlnom) und HBL-100 (Human-Mammaepithei) Zellen isoliert und durch Nor- thern Blot-Hybndislerung mit einem TGF-ss2-spezifischen Marker (pPC-21) gemäss der Be- schreibung In Material und Methoden analysiert. Jede Spur enthält 5 Mikrogramm poiyaden- ylierter RNA aus SK-MEL 28 (Spur 1), MCF-7 (Spur 2), HBL-100 (Spur 3) oder KB (Spur 4)
Zellen.
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5 : BioaktivitätstestKonfluenz In 100 mm Gewebskulturschalen gezüchtet.
Die Zellen werden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und 24 h In serumfreiem Medium Inkubiert Die Medien werden gesammelt, gegen O, 2M Essigsäure dialysiert und auf Inhibition der DNA-Synthese in CCL64-Zellen wie beschrieben (Gentry et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7:341B) getestet. In diesem Test ergeben 3. 3 pg eines gereinigten natürlichen TGF-ss1-Standards 50%lge Inhibi- tion ; für die spezifische Aktivität von gereinigtem natürlichen TGF-ss2 wurde etwa der halbe
Wert von TGF-ss1 bestimmt.
Fig. 6 Western Blot-Analyse rekombinanter Proteine sezerniert von 1ss9, 12.5, Klon 36 Säuredfaiy- siert serumfreie konditionierte Medien von 1 ss9, 12. 5, Klon 36 Zellen werden durch SDS-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und durch Western-Blotting mit einem Antise- rum gegen das synthetische NH2-YNTINPEASASPC-COOH wie beschrieben analysiert (Gen- try et ai., 1987, Mol Cell. Blol. 7. 3418
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Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Herstellung einer biologisch aktiven, maturierten Form von TGF-ss2 aus der kodierenden Sequenz eines TGF-ss-Prekursor-Genes und dessen Produkt.
Das maturerte biologisch aktive TGF-ss2 kann durch Klonierung und Expression der kodierenden Nukleotidequenz des TGF-ss2-Prekursors in voller Länge oder eines seiner funktionalen Äquivalente in einer Wirtszelle produziert werden, welche den Prekursor richtig prozessiert, so dass maturierter TGF-ss2 mit einer biologischen Aktivität erzeugt wird, die sich von der Aktivität eines authentischen natürlichen TGF-ss2 nicht
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Hybridsequenzen, wie z. B. die TGF-ss1-Prekursor-Sequenz, die im richtigen Leserahmen mit der maturierten TGF-ss2-Sequenz verbunden ist, konstruiert und zur Herstellung von biologisch aktivem TGF-ss2 verwendet werden.
Ein Aspekt der Erfindung ist eine für den TGF-ss2 kodierende Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie im wesentlichen die Nukleotidsequenz vom Nukleotidrest Nummer 991 bis zum Nukleotidrest Nummer 1326 gemäss Fig. 1 a umfasst.
Ein Aspekt der Erfindung ist der Transforming Growth Faktor, der im wesentlichen die Aminosäurese- quenz vom Aminosäurerest Nummer 331 bis zum Aminosäurerest Nummer 442 gemäss Flg. 1 a umfasst.
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eukaryontischesion regulierenden Nukleotidsequenz enthalten.
Zur Verdeutlichung des Herstellungsverfahrens kann dieses in folgende Stufen aufgeteilt werden.
(a) Isolierung oder Genenerung der kodierenden Sequenz für einen TGF-ss2-Prekursor ; (b) Konstruktion eines Expressionsvektors, welcher die Expression einer kodierenden Sequenz für TGF- ss2 steuert ; (c) Transfektion einer geeigneten Wirtszelle, welche das Gen repliziert und exprimiert und das Genpro- dukt zur Produktion der maturierten, biologisch aktiven Form von TGF-ss2 prozessiert, und (d) Identifizierung und Reinigung des maturierten biologisch aktiven TGF-ss2.
Nach Identifizierung des Transfektanten, welcher eine hohe Expressionsrate für bioaktives matunertes TGF-ss2 aufweist, wird erfindungsgemäss dieser Klon vermehrt und das expnmlerte Genprodukt daraus isoliert.
Das Verfahren wird anhand von Beispielen beschrieben. Hierin werden cDNAs der kodierenden TGF- ss2-Prekursorregion hergestellt, kloniert, sequenzlert und zur Konstruktion eines Expressionsvektors verwendet, welcher eine hohe Expressionsrate von TGF-ss2 in CHO-Zellen steuert. In einer speziellen Ausführungsform wird die gesamte Aminosäuresequenz der maturierten Form von Human-TGF-ss2 bestimmt, welche Insgesamt eine Homologie von 71% mit TGF-ss1 aufweist. Unter Verwendung synthetischer Oligonukleotidsonden wurden Klone einer PC-3 cDNA-Genbank identifiziert, welche für TGF-ss2 kodieren.
Die DNASequenzanalyse eines dieser Klone ergab, dass TGF-ss2 ebenso wie TGF-ss1 In Form eines grösseren
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Homologie zwischen TGF-TGF-ss2 können daraus geschlossen werden
In einer speziellen Ausführungsform wird die Herstellung grosser Mengen von biologisch aktivem TGF- ss2 durch Expression eines neuartigen TGF-ss1/TGF-ss2-Hybndgens In CHO-Zellen erreicht.
Die verschiedenen Aspekte dieses Verfahrens werden Im folgenden sowie In den Beispielen näher beschrieben.
Isolierung und Erzeugung der TGF-ss2-kodlerten Region
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benen Verfahrens können die darin dargestellten Nukleotidsequenzen oder Fragmente oder funktionale Äquivalente davon zur Erzeugung des rekombinanten Moleküls verwendet werden, welches die Expression des TGF-ss2-Produktes in einer geeigneten Wirtszelle steuert. Gemäss einer speziellen Ausführungsform wird ein TGF-ss1/TGF-ss2-Hybndgen- (Fig. 1 b) hergestellt und zur Transfektion von CHO-Zellen verwendet. Transfektanten mit einer Produktionsrate von 500 ug matunertem biologisch aktivem TGF-ss2 pro ml Kulturmedium wurden Isoliert.
Aufgrund der Degeneration der kodierenden Nukleotidsequenz können andere DNA-Sequenzen, welche für Aminosäuresequenzen kodieren, die den Sequenzen gemäss Fig 1 a und 1 b In wesentlichen gleichen,
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zur Klonierung und Expression von TGF-ss2 verwendet werden. Derartige Veränderungen beinhalten
Deletionen, Additionen oder Substitutionen unterschiedlicher Nukleotidreste, welche zu einer Sequenz führen, die für ein identisches oder funktional äquivalentes Genprodukt kodiert. Das Genprodukt kann
Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Sequenz aufweisen, welche zu stummen Veränderungen führen und wodurch ein bioaktives Produkt erzeugt wird.
Derartige Aminosäu- resubstitutionen können auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydro- phobizität, Hydrophilie und/oder der amphipathischen Natur der betreffenen Reste erfolgen. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure ; positiv geladene Aminosäu- ren umfassen Lysin und Arginin ; Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen oder unpolaren
Kopfgruppen mit vergleichbarer Hydrophilie beinhalten : Leucin, Isoleucin, Valin ; Glycin, Alanin ; Asparagin,
Glutamin ; Serin, Threonin ; Phenylalanin, Tyrosin.
Die kodierende Nukleotidsequenz für TGF-ss2 kann man aus Zellen erhalten, welche eine TGF-ss2 ähnliche Aktivität aufweisen. Die kodierende Sequenz kann man durch cDNA-Klonierung von RNA erhalten, welche aus derartigen Zellen durch genomische Klonierung isoliert und gereinigt wurde. Man kann entweder cDNA-oder genomische Genbanken von Klonen herstellen, welche mit Hilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, z. B. unter Verwendung von Restriktionsenzymen aus DNA-Fragmenten erzeugt wurden.
Die Genfragmente, welche für TGF-ss2 kodieren, können durch Screening solcher Genbanken mit einer Nukleotidsonde nachgewiesen werden, welche zu einem beliebigen Teil der in Fig. 1a dargestellten Sequenz im wesentlichen komplementär ist. Klone mit der Gesamtsequenz, d. h. Klone, welche den gesamten kodierenden Bereich des TGF-ss2-Prekursors enthalten, können selektiert und expnmlert werden.
Gemäss einer anderen Ausführungsform kann die kodierende Sequenz in Fig. 1 a als ganzes oder teilweise unter Verwendung von bekannten chemischen Methoden synthetisiert werden (s. z. B. Caruthers et al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 7 : 215-223 ; Crea und Horn, 1980, Nuc. Acids. Res. 9 (10) : 2331 ; Matteucci und Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters 21 : 719 und Chow und Kempe, 1981, Nuc. Acids Res.
9 (12) : 2807-2817). Andererseits könnte das Protein dadurch hergestellt werden, dass man mit Hilfe von chemischen Methoden die Aminosäuresequenz in Fig. 1 als Ganzes oder teilweise synthetisiert. Beispielsweise können Peptide mit Hilfe der Festphasensynthese auf einem Beckman 990-Gerät hergestellt werden, und anschliessend wie beschrieben (L. E. Gentry et al., 1983, J. Blol. Chem. 258 : 11219-11228 ; L. E. Gentry and A. Lawton, 1986, Virology 152 : 421-431) abgespalten werden. Zur Reinigung kann man präparative hochauflösende Flüssigchromatographie verwenden. Die Peptidzusammensetzung kann durch Aminosäure- analyse bestimmt werden.
Gemäss einer speziellen Ausführungsform In den hlenn beschriebenen Beispielen erhält man die TGF- ss2-kodierende Sequenz durch Kloomerung der cDNA der kodierenden Sequenz des Human-TGF-ss2Prekursors, abgeleitet von polyadenyllerter RNA. Diese wurde aus einer Tamoxifen-behandelten menschlichen prostatischen Adenokarzmomze) ! mie PC-3 Isoliert, deren TGF-ss2-Produktion bereits nachgewiesen war. Der gesame kodierende Bereich eines cDNA-Klons wurde sequenziert und mit der veröffentlichten Sequenz für Human- TGF-ss1 verglichen (s. Fig. 2).
Die DNA-Sequenzanalyse von TGF-ss2-cDNA-Klonen zeigt, dass TGF-ss2 ebenso wie TGF-ss1 als grosses Prekursorprotein synthetisiert wird, dessen carboxyterminales Ende unter Bildung des maturierten 112 Aminosäuren langen TGF-ss2-Monomers abgespalten wird Für TGF-ss2 wurde ein Molekulargewicht von 24 000 nachgewiesen, wobei das Molekül aus zwei disulfidverbrückten 13 000 Dalton grossen Untereinheiten besteht (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26:2406-2410; Cheifetz et al., 1987, Cell 48 : 409-415).
Zur Produktion von matunertem TGF-ss2 ist daher sowohl eine entsprechende proteolytische Spaltung als auch die Bildung intra- und intermolekularer Disulfidbrücken erforderlich. Eine aminoterminale hydrophobe Leadersequenz (Reste 3-19) ist im Prekursor nachweisbar und kann für das Ausschleusen des Proteins aus der Zelle verantwortlich sein. Matunerter TGF-ss2 kann während dieses Vorgangs mit dem restlichen Teil des Prekursors noch verbunden sein TGF-ss2 zeigt gegenüber TGF-ss1 Im maturierten Bereich des Prekursors eine 71% ! ge Homologie, die
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rungsgrad auf und deutet darauf hin, dass dieser Teil des Moleküls eine wichtige biologische Funktion besitzen könnte.
Im Gegensatz dazu ist lediglich eine 31 ! ge Homologie zwischen den N-terminalen Prekursorbereichen von TGF-ss1 und TGF-ss2 zu beobachten Nach Abspaltung des wahrscheinlichen Signal peptids würde der TGF-ss2-Prekursor eine grössere Anzahl von Aminosäuren als der TGF-ss1- Prekursor besitzen Die pnmären Strukturunterschiede Innerhalb des aminoterminalen Bereichs des TGF-
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ss1- und TGF-ss2-Prekursorproteins können auf funktionalen Unterschieden beruhen. Es werden jedoch auffällig homologe Bereiche innerhalb der Prekursoren in isolierten Blocks gefunden, welche eine Konservierung wichtiger funktionaler Domänen auch innerhalb der N-terminalen Prekursorregion andeuten.
Northern Blot-Analysen ergaben grössenmässig zwei Hauptklassen von TGF-ss2-spezifischer mRNA mit
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1welcher annähernd 1 kb grösser ist als der entsprechende Bereich in pPC-21 und pPC-14 und der ausserdem eine unterschiedliche Polyadenylierungsstelle aufweist. Daraus kann geschlossen werden, dass eine alternative Polyadenylierung eine Ursache ist. die zur Erzeugung multipler TGF-ss2-mRNAs (wie in Northern Blots beobachtet) führt.
BSC-40-Zellen enthalten vergleichbare Mengen von TGF-ss1-und TGF- 2-spezifischen Transcriptionen ; Tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen enthalten mehr TGF-ss1-mRNA als TGF-ss2-mRNA (Fig. 3b). Letzteres Ergebnis ist nicht zu erwarten, da diese Zellen mehr TGF-ss2-Protein als TGF-ss1 produzieren (Ikeda et al, 1987, Biochemistry 26 : 2406-2410). Daraus kann auf eine posttranscriptionale Regulation der Synthese dieser Wachstumsmodulatoren geschlossen werden. Versuche zum besseren Verstehen der transcriptionalen und translationalen Kontrollmechanismen, die zur Produktion von TGF-ss1 und TGF-ss2 führen, werden durchgeführt.
Die Herstellung adequater Mengen von TGF-ss2 mit Hilfe der DNA-Rekombination. wie bereits für TGF-ss1 durchgeführt, sollte der Durchführung weiterer Experimente zur Erforschung der verschiedenen Effekte dieses Proteins dienen.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform wurde die TGF-ss2-kodierende Sequenz durch cDNA-Kionie- rung der kodierenden Sequenz des Simian-TGF- ; 82-Prekursors hergestellt. Letzterer wurde von polyadenylierter RNA abgeleitet. die aus der BSC-40-Zellinie afrikanischer grüner Meerkatzen isoliert wurde. Die gesamte kodierende Region eines cDNA-Klons wurde sequenziert Daraus ergaben sich identische Aminosäuresequenzen des Human-und Simian-TGF-ss2-Prekursors und eine annähernde Identität ihrer Nukleotidsequenzen.
Konstruktion eines Expressionsvektors mit der TGF-ss2 kodierenden Sequenz
Zur Expression von biologisch aktivem, matunertem TGF-ss2 sollte ein Expressionsvektor/Wirtssystem gewählt werden, welches nicht nur hohe Transcnptions- und Translationsraten, sondern auch die richtige Prozessierung des Genproduktes bewirkt. Dies ist insbesondere wichtig bel Verwendung der gesamten kodierenden Sequenz eines TGF-ss2-Prekursors im Expressionssystem, da die maturierte Form von TGF-ss2 wahrscheinlich über zelluläre Prozessierungsvorgänge vom Prekursorprodukt abgeleitet wird. Zusätzlich
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Anscheinend wird der maturierte TGF-ss2, ein disulfidverbrücktes Homodimeres mit 112 Aminosäuren pro Untereinheit, durch zelluläre Prozessierung gebildet. Hierbei erfolgt eine proteolytische Spaltung zwischen den Aminosäuren Arg-Ala des Prekursors (Reste 330 und 331 m Fig. 1a). Zusätzlich enthält der TGF-ss2-Prekursor drei potentielle N-Glycosylierungsstellen, welche in der maturierten Form nicht zu beobachten sind ; eine nchtige Glycosylierung des Prekursors kann für die zelluläre Synthese und Freisetzung oder Sekrotion des maturierten Moleküls entscheidend sein.
Der maturierte TGF-ss2 umfasst ein
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Disulfidbrücken beteiligt.Die Fähigkeit der im Expressionssystem verwendeten Wirtszelle zur korrekten Expresson und Prozesserung des TGF-ss2-Genproduktes ist daher für die Produktion eines biologisch aktiven maturierten TGF-ss2 von Bedeutung.
Eine Vielzahl von Tierzeilen/Expressionsvektorsystemen (d. h. Vektoren, welche die zur Steuerung der Replikation, Transcnption und Translation der TGF-ss2-kodierenden Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle
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Promoter).
Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren In Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit des verwendeten Wirts/Vektorsystems können beliebige Transcnptlons- und Translationselemente aus einer
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Vielzahl von geeigneten Elementen verwendet werden. Wenn z. B. in einem Säugetierzellsystem kloniert wird, können z. B. Promotoren aus dem Genom von Säugetierzellen (z. B. Mäuse-Metallothionein-Promoter) oder aus Viren, welche in diesen Zellen wachsen (z. B. Vaccinavirus 7. 5 K Promoter) verwendet werden. Mit Hilfe von rekombinanten DNA oder synthetischen Methoden hergestellte Promotoren können ebenso zur Transcription der inserierte Sequenzen verwendet werden.
Spezifische Initiationssignale sind für eine ausreichende Translation der insertierten proteinkodierenden Sequenzen erforderlich. Diese Signale beinhalten das ATG-Startcodon und die daran angrenzenden Sequenzen. Für den Fall, dass das gesamte TGF-ss2-Gen einschliesslich seines eigenen Startcodons und der daran angrenzenden Sequenzen in geeignete Expressionsvektoren insertiert wird, sind keine weiteren Translationskontrollsignale erforderlich. Wenn jedoch nur ein Teil der kodierenden Sequenz insertiert wird, müssen exogene Translationskontrollsignale sowie das ATG-Startcodon eingeführt werden. Ausserdem ist es erforderlich, dass das Startcodon mit dem Leserahmen der TGF-ss2-kodierenden Sequenz in Phase insertiert wird, um die Translation des gesamten Inserts zu gewährleisten.
Die erwähnten exogenen Translationskontrollsignale und Startcodons können sowohl natürlichen als auch synthetischen Ursprungs sein. Die Effektivität der Expression kann mit Hilfe von Transcriptions-Attenuationssequenzen. Enhancerelementen usw. verstärkt werden.
Jede beliebige bekannte Methode zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann zur Konstruktion des Expressionsvektors der das TGF-ss-Gen und geeignete Transcriptions/Translations-Kon- trollsignale enthält, verwendet werden. Diese Verfahren umfassen in vitro-DNA-Rekombinationstechniken,
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Bei Verwendung eines Adenovirus als Expressionsvektor kann die TGF-ss2-kodierende Sequenz an einen Adenovirus-Transcriptions/Translations-Kontrollkomplex (z. B. die Late Promoter und die Tripartite Leader-Sequenz) ligiert werden. Diese chimeren Gene können dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination insertiert werden. Eine Insertion in eine nicht-essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) führt zu einem lebensfähigen rekombinanten Virus, welches zur Expression von TGF-ss2 im infizierten Wirt befähigt ist. In ähnlicher Weise kann der Vaccina 7. 5 K-Promoter verwendet werden.
Ein anderes Expressionssystem zur Expression von TGF-ss2 Ist ein Insektensystem. In einem dieser Systeme wird als Vektor zur Expression fremder Gene das Autographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) verwendet. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die TGF-ss2-kodierende Sequenz kann in nicht-essentiellen Bereichen (z. B. dem Polyhednngen) des Virus kloniert und von einem AcNPV-Promotor (z. B. dem Polyhedrin-Promotor) kontrolliert werden. Nach erfolgter Insertion der TGF-ss2kodierenden Sequenz ist eine Inaktivierung des Polyhedringens und die Produktion unverschlossener
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Diese rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von Spodoptera fruglperda-Zellen verwendet, in denen das inserierte Gen expnmiert wird.
Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, welcher die Expression der inserierten Sequenz moduliert oder das Genprodukt auf gewünschte Weise modifiziert und prozessiert. Die Expression bestimmter Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren (z. B. Zink-und Cadmiumionen für Metallothioneinpromotoren) erhöht werben. Somit kann die Expression von durch Genetic Englneenng erzeugtem TGF-
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e W ! rtsze ! ! e ieta !Wirtszeiten besitzen charakteristische und spezifische Mechanismen zur posttranslatlonalen Prozesslerung und Modifikation von Proteinen. Geeignete Zellinie oder Wirtssysteme können zur Gewährleistung der richtigen Modifikation und Prozessierung des exprimierten Fremdproteins ausgewählt werden.
Identifizierung von Transfektanten oder Transformanten, welche das TGF-ss2 Genprodukt expnmieren
Die die rekombinante TGF-ss2-kodierende Sequenz enthaltenden Wirtszelle, welche das biologisch aktive, maturierte Produkt exprimieren. können mit Hilfe von wenigstens vier allgemeinen Verfahren identifiziert werden : (a) DNA-DNA-Hybndisierung ; (b) Anwesenheit oder Abwesenheit von"Marker"-Genfunktionen ; (c) Bestimmung der Transcnptionsrate. wie z B durch Messung der Expression des TGF-ss2-mRNA-
Transcnptes in den Wirtszelle ; und (d) Detektion des maturierten Genproduktes über einen Immunoassay und schliesslich dessen biologische
Aktivität.
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In einem ersten Versuch kann die Anwesenheit der inserierten TGF-ss2-kodierenden Sequenz im Expressionsvektor durch DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen werden, wobei als Sonden Nukleotidequenzen verwendet werden. Diese weisen Homologien zur kodierenden Sequenz von TGF-ss2 (im wesentlichen gemäss Fig. 1 a) oder zu Teilen oder Derivaten davon auf.
In einem zweiten Versuch kann das rekombinante Expressionsvektor/Wirtssystem durch Abwesenheit oder Anwesenheit bestimmter"Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität. Antibiotikaresistenz, Methotrexatresistenz, Transformationsphenotyp, Occlusionskörperbildung im Baculovirus, usw. ) identifiziert und selektioniert werden. Wenn z. B. die TGF-ss2-kodierende Sequenz in eine Marker-Gensequenz eines Vektors insertiert wird, können diejenigen Rekombinanten durch die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden, welche die TGF-ss2-kodierende Sequenz enthalten.
Andererseits kann eine MarkerGensequenz zusammen mit der TGF-ss2-Sequenz unter Kontrolle desselben oder eines weiteren Promotors zur Kontrolle der TGF-ss2-kodierenden Sequenz gestellt werden. Die Expression des Markers nach Induktion oder Selektion weist auf die Expression der TGF-ss2-kodierenden Sequenz hin.
In einem dritten Versuch kann die Transcriptionsaktivität für die TGF-ss2-kodierende Region mit Hilfe von Hybridisierungsversuchen bestimmt werden. Beispielsweise kann polyadenylierte RNA isoliert und durch Northern Blotting analysiert werden. Hierzu wird eine zur gesamten oder teilweisen TGF-ss2kodierenden Sequenz homologe Sonde verwendet. Ausserdem können alle Nukleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und durch Hybridisierung mit den oben genannten Sonden verwendet werden.
In einem vierten Versuch kann die Expression des matunerten Proteinproduktes immunologisch z. B durch Western Blots, Immunoassays, wie der Radioimmuno-Präzipftation, enzymgebundene Immunoassays
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Genprodukt nicht sezerniert, können Zell-Lysate auf die gesuchte Aktivität hin getestet werden. In beiden Fällen können biologische Tests, wie der hierin beschriebene Wachstumsinhibitionstest oder die Simulierung des verankerungsunabhängigen Wachstums in Targetzellen (Twardzlk und Herwin. 1985, J. Cell.
EMI8.2
Tests verwendet werden.
Nach einmaliger Identifizierung eines Klons, welcher grosse Mengen von biologisch aktiven matunertem TGF-ss2 produziert, kann dieser Klon vermehrt und TGF-ss2 unter Verwendung bekannter Techniken gereinigt werden. Solche Verfahren sind die Immunoaffinitätsreinigung, chromatographische Methoden einschliesslich der hochauflösenden Flüssigchromatographie und andere.
BE ! SP ! EL 1 Ktonierung des TGF-ss2-Prekursors aus PC-3-Zellen
Die folgenden Beispiele beschreiben die cDNA-Klonierung der TGF-ss2-Prekursor kodierenden Sequenzen aus der menschlichen prostatischen Adenokarzinomzellinie PC-3, aus der TGF-ss2 bereits früher Isoliert wurde.
1. MATERIAL UND METHODEN
Die folgenden Verfahren wurden zur Klonierung von cDNAs verwendet, welche für den Human-TGF-jS2- Prekursor kodieren.
1. 1. Züchtung der Zellen und Extraktion der RNA
Die menschliche prostatische Adenokarzinomzellinie PC-3 wurde in einem Tamoxifen-haltigen Medium wie bereits beschneben (Ikeda et al., 1987, Biochemistry 26. 2406-2410) gezüchtet MCF-7-Zellen wurden In Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium mit einem Gehalt von 10% fetalen Kälberserum und 6 Einhei- ten, Iml Insulin gezüchtet. Alle anderen Zellinie wurden In dem gleichen insulinfreien Medium gezüchtet Polyadenylierte RNA wurde durch Oligo [dT]-Cellulosechromatographie isoliert (Purchio und Fareed, 1979, J.
Viral. 29 : 763-769).
1 2 Konstruktion der cDNA-Genbank und Screening
Doppelsträngige cDNA wurde, ausgehend von polyadenylierter RNA synthetisiert, welche aus PC-3-
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mit mehr als 1000 Basenpaaren wurden in Lambda gt10 wie beschrieben kloniert (Webb et al., 1987, DNA 6 : 71-79). Die Genbank wurde zuerst mit einer [32P]-markierten 24fach degenerierten Sonde zweifach gescreent.
Die verwendete Sonde ist komplementär zu der für die Aminosäuresequenz WKWIHEP kodierenden DNA (Sonde 1), welche in TGF-ss1 und TGF-ss2 konserviert ist :
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die Translation gewöhnlich am ersten Methionin in einem offenen Leserahmen beginnt und da zu TGF-ss1 homologe Bereiche (wie hierin diskutiert) oberhalb (in 5'-Richtung) des zweiten Methionins zu beobachten sind, wurde das erste Methionin versuchsweise als Startsignal für die Translation festgesetzt. Daraus ergibt
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wird.
Der pPC-21-Klon enthält 467 bp oberhalb (in 5'-Richtung) des mutmasslichen Methionin-Startsignals und eine 3'-untranslatierte Region von etwa 800 bp einschliesslich einer Poly (A) -Folge. Fünfzehn Basen oberhalb davon (upstream ; in 5'-Richtung) befindet sich eine Polyadenyherungs-Signalsequenz (Proudfoot and Brownlee, 1976, Nature 263 : 211-214).
Die Nukleotidsequenz-Homologie innerhalb der kodierenden Regionen von TGF-ss1 und TGF-ss2 pPC-
21 cDNA Klonen beträgt 53%. Die für das maturierte Protein kodierenden Bereiche weisen eine 57%ige
Homologie auf, während die Upstream-Prekursor-Region eine 48%lge Homologie zeigt. Nach optimaler
Anordnung der beiden Sequenzen waren mehrere Nukleotidinsertionen in der TGF-ss2-Prekursor-Region, eine davon mit 75 Nukleotiden : zu beobachten. Inwiefern diese Insertionen durch Anwesenheit zusätzlicher
Exons in TGF-ss2 verursacht werden, ist nicht bekannt.
Eine signifikante Homologie zwischen den DNA-
Sequenzen in den nicht-kodierenden Bereichen der beiden Klone war nicht zu zu beobachten. TGF-ss1 weist ausgedehnte G-C-reiche nichtkodierende Bereiche auf, während TGF-ss2 ausgedehnte A-T-reiche nicht-kodierende Bereiche zeigt. Beide cDNA-Klone enthalten wiederkehrende Strukturmuster im 3'-nichtkodierenden Bereich mit Wiederholungen in TGF-ss1, bestehend aus (Punn) CCCC (Sharples et al., 1987, DNA 6 : 239-244) und in TGF-ss2, bestehend aus ATG oder A (Pyrimidin) (Purin).
Restriktionsanalysen vieler Klone führten zu dem Ergebnis, dass einem Klon (pPC-14) eine KpnlSchnittstelle im aminoterminalen Teil der für TGF-ss2 kodierenden Sequenz fehlt. Restriktionsanalysen für pPC-14 und pPC-21 sind in Fig. 1d angegeben. pPC-14 wurde mit Hilfe eines zu den Nukleotiden 277 bis 296 In Fig. 1 a komplementären Primer-Oligonukleotids (20 Nukleotide) in einem Bereich von etwa 100 Nukleotiden im betreffenden aminoterminalen Ende sequenziert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Klon pPC-
14 eine Deletion von 87 Nukleotiden (Nukleotidpositionen 346 bis 432 in Fig. la ; s. auch Fig. 1 e) enthält, welche für die fehlende Kpnl-Schnittstelle verantwortlich ist und durch die Sequenz AAT, dem Codon für Asparagin, ersetzt ist.
Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Klon pPC-14 für einen kürzeren TGF-ss2Prekursor mit 414 Aminosäuren kodiert, welcher sich von der durch pPC-21 kodierten Sequenz lediglich durch eine Deletion der Aminosäurereste 116 bis 144 unterscheidet, die durch einen einzelnen Asparaginrest ersetzt sind.
Obwohl die gesamte kodierende Region von pPC-14 nicht bestimmt wurde, hegt wahrscheinlich eine vollständige Übereinstimmung mit der kodierenden Sequenz aus pPC-21 vor, da sich mit Ausnahme der Kpnl-Schnittstelle die Restriktionsmuster beider Klone decken (Fig. 1d). Ausserdem wurde ein Simian-Kion kodierend für einen 414 Aminosäure grossen TGF-ss-Prekursor mit der gleichen 29 Aminosäure grossen Deletion und Substitution nachgewiesen (s. Beispiel im Abschnitt 7, unten). Dieser Simian-Klon weist eine kodierende Sequenz auf, weiche zu der des Human-pPC-21-Klons Im 5'- und 3'-Bereich der Deletion nahezu identisch ist.
Fig 2A zeigt die abgeleitete Proteinsequenz für Human- TGF-ss1 (Derynck et al, 1985, Nature 316 : 701- 705) im Vergleich zu der Sequenz von Human-TGF-jS2-442. Es wurde eine 71% ige Homologie von TGF-ss2 mit Human-TGF-ss1 im maturierten Bereich des Moleküls bestimmt (Marquardt et al., 1987, J. Biol. Chem., im Druck). Der aminoterminale Teil des Prekursors oberhalb (upstream) des maturierten Moleküls zeigt eine 3l% ige Homotogie zwischen TGF-j81 und TGF-ss2-442. Der Dot-Matnx-Homologievergleich in Fig. 2B ergibt eine signifikante Homologie in mehrerer spezifischen Bereichen der Proteine. Ein Vergleich der Nterminalen Aminosäuresequenzen im mutmasslichen Signalpeptidbereich ergibt keinerlei signifitante Homolo- gie.
In TGF-ss2 wird eine Signalsequenz-Schnittstelle nach Aminosäure 20 (Serin) und in TGF-ss1 nach Aminosäure 29 (Glycin) (Von Heijne, 1983, Eur. J. Biochem. 133 : 17-21) vorgeschlagen. Dieser Schnittstelle folgt direkt der erste homologe Block (zwischen TGF-ss1 und TGF-ss2), der sich 34 Aminosäuren in 3'Richtung (downstream) erstreckt Nach Abspaltung der Signalsequenzen würden die TGF-ss1- und TGF-ss2- Prekursoren in den ersten vier aminoterminalen Aminosäuren übereinstimmen (einschliesslich Cystein an Position 4). Vierzehn Aminosäuren downstream von diesen mutmasslichen N-Terminus sind 19 der folgenden 21 Aminosäuren in TGF-ss1 und TGF-ss2 konserviert.
Dieser Homologiebereich ist grösser als irgendein anderer Homologiebereich in der C-terminalen Region, die das maturierte TGF-ss-Protein enthält Wie aus den Fig. 2A und 2B zu entnehmen ist, zeigen sich noch mehrere Bereiche mit auffallender Homologie im Upstream-Bereich des maturierten Proteins. Diese Domänen sind jeweils durch eine Vielzahl nichthomologer Aminosäuren voneinander getrennt.
Der TGF-ss2-Prekursor weist drei potentielle N-Glycosylierungsstellen an den Resten 72,168 und 269 (s Fig. 1 a) auf. Lediglich die erste Stelle ist in TGF-ss1 konserviert und hegt innerhalb eines grösseren
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Blocks konservierter Reste, woraus man entnehmen kann, dass diese Glycosylierungsstelle wichtige strukturelle und/oder funktionelle Eigenschaften besitzt.
Nach Abspaltung der Signalsequenz würde der TGF-ss2-Prekursor 31 bzw. 59 Aminosäuren mehr als TGF-ss1 aufweisen. Ein zusätzlicher Cysteinrest in TGF-ss2 befindet sich unmittelbar upstream einer grossen nicht-homologen Aminosäuresequenz vor der Sequenz des maturierten Proteins. Ebenso wie in TGF-ss1 findet man in TGF-ss2 die Schnittstelle für das maturierte Protein unmittelbar nach einem Bereich von 4-5 basischen Aminosäuren (s. Fig. 2A). Der maturierte Bereich enthält 9 Cysteine.
Eine Konservierung von 7 der 9 Cysteine ist ein wesentliches Merkmal der verschiedenen Mitglieder der TGF-ss-Famllle. Eine Bestimmung der hydropathischen Indizes für TGF-ss1 und TGF-ss2 ergab sowohl für den Prekursor als auch für die maturierte Form ähnliche Muster, wobei beide Proteine generell hydrophiler Natur sind (keine Daten angegeben).
Fig. 3A zeigt eine Northern Blot-Analyse unter Verwendung von pPC-21 als Sonde zur Detektion von polyadenylierter RNA aus BSC-40 (einer Afrikanische-Grüne-Meerkatze-Zellinie) und tamoxifen-behandelten PC-3-Zellen. PC-3-Zellen enthalten drei Hauptgruppen von TGF-ss2-spezifischen mRNAs mit einer Grösse
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Transcripte und geringere Mengen der 5. 1 kb RNA (Fig. 3A, Spur 1). Es Ist zu erwähnen, dass die pPC-21Sonde unter diesen Hybridisierungsbedingungen den In diesen Zellen vorliegenden TGF-ss1-spezifischen 2. 5 kb-mRNA-Typ nicht detektiert. Diese Ergebnisse und frühere Beobachtungen (Sharples et al., 1987.
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markiert waren.
Spur 1 in Flg. 3B zeigt, dass BSC-40-Zellen sowohl das TGF-ss1-spezifische 2.5 kb-mRNAFragment als auch die TGF-ss2-mRNA-Typen mit 4. 1 und 6. 5 kb enthalten ; Spur 2 in Flg. 3B zeigt. dass tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen ausserdem die TGF-ss1-spezlfische 2. 5 kb-mRNA enthalten. Fig. 3B zeigt ausserdem, dass tamoxifen-behandelte PC-3-Zellen mehr TGF-ss1-als TGF-ss2-spezifische mRNA enthalten.
Der Nachweis von TGF-ss2-spezifischen cDNA-Klonen ermöglichte ein Screening verschiedener Zelll- nien auf TGF-ss2-mRNA. Der Northern Blot In Fig. 4 zeigt, dass TGF-ss2-spezifische Transcripte in HBL 100 (einer normalen Epithelzeillinie aus menschlicher Milch, von Dr.
Greg Schultz). in MCF-7 (einer menschlichen Mammakarzinomzellinie) in SK-MEL 28 (einer Melanomzellinie) nachgewiesen werden können und KB-Zellen (eine Nasopharyngeal-Karzinomzellinie) gennge Mengen von TGF-ss2-mRNA enthalten BEISPIEL 2 clonierung der cDNA des TGF-ss2-Prekursors aus BSC-40-Zellen
Die folgenden Beispiele beschreiben die cDNA-Klonierung der TGF-, 82-kodlerenden Sequenzen aus der MSC-40-Zelllinie der Niere Afrikanischer Grüner Meerkatzen, welche TGF-ss2-spezifische mRNAs enthalten (Abschnitt 6, oben).
Die Ergebnisse welsen daraus hin, dass Simian-TGF-ss2 ähnlich wie Human-TGF-ss2 in Form eines von mindestens zwei längeren Prekursormolekülen synthetisiert wird, woraus das maturierte TGF-ss2-Molekül durch proteolytische Spaltung abgeleitet wird.
1 MATERIAL UND METHODEN
Die folgenden Verfahren wurden zur Konierung der für den Slmlan- TGF-, 82-Prekursor kodierenden cDNAs verwendet.
1. 1. Züchtung der Zellen und RNA-Extraktion
BSC-40-Zellen wurden In Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. Polyadenyherte RNA wurde mit Hilfe von Oligo[dT]-Cellulosechromatographie wie beschrieben (Purchio und Fareed, 1979, J. Virol. 29 : 763-769) isoliert.
1. 2. Konstruktion der cDNA-Genbank und Screening Doppelstrangige CDNA wurde mit polyadenylierter RNA aus BSC-40-Zellen wie beschrieben hergestellt (Maniatis et al., 1982, Molecular Cidning : A Laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, Cold Spnng Harbor, NY, 371-372) und nach Behandlung mit EcoRI-Methylase mit Oligonukleotidlinkern ligiert, weiche
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daut und durch Chromatographie über Sephacryl S-1000 fraktioniert. cDNA-Fraktionen grösser als 750 Basenpaare wurden vereinigt und mit Lambda-gtIO hg ert. weicher zuvor mit EcoRI geschnitten wurde
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(Davis et al., 1980, A Manual for Genetic Engineering : Advanced Bacterial Genetics ;
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), verpackt (Grosveld et al., 1981, Gene 13 : 227-237) und mit E. coli C600 rK-mK+hfl plattiert. Die Genbank wurde durch Plaque-Hybridisierung (Bentonet et al., 1977, Science 196 : 180-182) mit [32P]-markierten pPC-21- und pPC-14-Sonden gescreent. Der mit pPC-21 hybridisierende Klon pBSC-40-16 und der mit pPC-14 hybridisierende Klon pBSC-40-1 wurde isoliert und in pEMBL subkloniert. Die TGF-ss2-kodierende Sequenz aus pBSC-40-1 wurde durch Sequenzierung beider Stränge mit Hilfe der
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pBSC-40-16 wurde teilweise sequenziert.
2. ERGEBNISSE
Man erhielt zwei Klone aus der BSC-40 cDNA-Genbank. die jeweils mit Sonden hybridisierten. welche für die kodierenden Sequenzen für den Human-TGF-ss2-442- und TGf-ss2-414-Prekursor konstruert wurden Klon pBSC-40-16, welcher mit der TGF-ss2-442-Sonde hybridisierte, wurde über einen Bereich von 150 Nukleotide (Nukleotide 300 bis 450 in Fig. 1 a) sequenzlert, von dem man vermutete, dass er die kodierende Sequenz des 29 Aminosäuren grossen Segmentes aus den Positionen 346 bis 432 in Fig. 1a enthält.
Die Ergebnisse zeigten, dass pBSC-40-16 in diesem Bereich für eine Aminosäureasequenz kodiert, die der korrespondierenden Sequenz im Human-TGF-ss2-442 cDNA-Klon, pPC-21, identisch Ist und zeigt. dass pBSC-40-16 für einen 442 Aminosäure grossen TGF-ss2-Prekursor kodiert.
Klon pBSC-40-1, welcher mit der TGF- ss2-414-Sonde hybridisiert, wurde Im gesamten kodierenden Bereich sequenziert Die Ergebnisse zeigten, dass dieser Klon für einen 414 Aminosäure grossen TGF-ss2-
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; 82-442-Prekursor identischDie Nukleotide 346 bis 432 in Fig. 1a sind deletiert und durch das Asparagin-Codon AAT ersetzt. Mit Ausnahme von 13 stummen Basenaustauschen sind die belden Strukturen im restlichen Bereich der kodierenden Sequenz absolut homolog.
BEISPIEL 3 : Expression von TGF-ss2
Die folgenden Beispiele beschreiben die Expression von maturiertem, biologisch aktivem TGF-ss2 in Chinesischer Hamster-Ovarialzellen (CHO-Zellen), welche mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert wurden, das unter der regulatorischen Kontrolle der SV40-Promotorsequenz die kodierende Sequenz für matunerten Human-TGF-ss2 enthält, die downstream und Im richtigen Leserahmen mit der kodierenden Sequenz für den Slmlan-TGF-ss1-Prekursor ligiert ist. Die Konstruktion steuert Synthese und Sekretion von matunertem, biologisch aktivem TGF-ss2 bel einer Ausbeute von etwa 0, 5 mg/I.
1. MATERIAL UND METHODEN 1. 1. Zellkultur
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und 100 ug/ml Streptomycin enthalten. Die CHO-Transfektanten wurden in Dulbecco's modifiziertem EagleMedium mit den oben beschriebenen Zugaben vermehrt. CHO-Zellen und deren Denvate wurden routinemässig durch Trypsinisierung be; einem Teilungsverhältnis von 1 : 5 überführt.
Methotrexat (Sigma, MO) wurde mit einer Stammkonzentration von 10 mg/mi In Wasser hergestellt Verdünnte NaOH (0, 2 M) wurde zur Solubilisierung des Wirkstoffs hinzugegeben (pH-Endwert von 6). Die Stammlösung wurde f ! ! tersteriiis) ert und bel -200 C aufbewahrt. Die Stammlösungen von Methotrexat Im Medium (100 uM) wurden bei 40 C nicht länger als 1 Monat aufbewahrt.
1 2 DNA-Manipulationen und Plasmidkonstruktionen Restnktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, Phosphatase aus Kälberdarm, das Klenow-Fragment der DNAPolymerase I und andere DNA-Reagentien wurden von Bethesda Research Laboratories, MD. bezogen Standard-DNA-Manipulationen wurden nach T. Maniatis, et al., 1982, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spnng Harbor Laboratory, New York, durchgeführt.
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Das Plasmid pSV2- (ss1-TGF-dhfr), welches die Simian-TGF-l-cDNA und das Maus-dhfr-Gen in Tandemposition und ebenso die SV40-Zwischensequenz enthält. wurde wie beschrieben hergestellt (Gentry et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 3418).
Das Plasmid pSV2/ss1-ss2/dhfr wurde gemäss Absatz 8. 2. hergestellt.
1. 3. DNA- Transfektionen
Etwa 24 h nach Aufbringen von 106 dhfr-negativen CHO-Zellen auf 100 mm-Platten, wurden die Kulturen mit 20 ug Ndel-linearisiertem-pSV2- (ss1-TGF-dhfr)-Plasmid in Form eines Calciumphosphatpräzipi-
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der linearisierten DNA zu 1 ml einer sterilen CaCb-Lösung (250 mM) hinzugefügt. 1 mi einer 2X HEPESLösung (280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1, 5 mM Natriumphosphat, pH 7, 1) wurde anschliessend tropfenweise hinzugefügt und das Gemisch 30 min in Eis aufbewahrt. Das Präzipitat wurde anschliessend tropfenweise in 10 ml eines die Zellen enthaltenden F12-Mediums dispergiert. Nach 4-stündiger Inkubation bei 37.
C wurde das Medium entfernt und durch 10 ml F12-Medium mit 25% Glycerin 90 s lang bel Raumtemperatur
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Medium (20 ml) inkubiert. Die Selektion der dhfr-exprimierenden Transfektanten erfolgte durch Substitution des Mediums mit einem DMEM-Suppiement mit 10% dialysierte FBS (Gibco, N. Y.) und 150 u. g/ml LProlin. Kolonien wurden nach 10- bis 14-tägiger Kultivierung der Zellen Im Selektionsmedium erhalten. Zehn Kolonien wurden mit Hilfe einer Pasteurpipette aufgesaugt und vermehrt.
1. 4 Selektion von Methotrexat-resistenten Zellen
Dthydrofolat-Reduktase (dhfr)-amplifzierte Zellen wurden aus den Pnmär-Transfektanten wie beschne-
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wurden 105 Zellen auf 100 mm-Platten überimpft und auf erhöhte Methotrexat-Konzentrationen eingestellt Die Platte, die bei der höchsten Methotrexat-Konzentration sichtbare Kolonien ergab, wurde trypsinislert und auf diese Methotrexat-Konzentration für zwei weitere 1 : 5-Zellübertragungen eingestellt. 105 Zellen wurden anschliessend bel 5facher Methotrexat-Konzentration auf 100 mm-Platten aufgebracht. Platten, die sichtbare Kolonien enthielten, wurden erneut trypsmisiert und auf das Methotrexathaltige Medium eingestellt. Zellen wurden In verschiedenen Stadien der Amplifikation in einem Medium mit 40% FBS, 10% Dimethylsulfoxid und 50% DMEM eingefroren.
Methotrexat war in den Gefrlermedlen nicht enthalten.
1. 5. WachstumsInhibitionstest
Mink-Lungenepithelzellen, Mv 1 Lu (Hinterlegungsnummer CCL-64, American Type Culture Collection) mit hoher Sensitivität für TGF-ss1 wurden im Wachstumsinhibitionstest verwendet. Zur Bestimmung der DNA-Synthese wurde die Thymidin-analoge Verbindung 5'-['251]-Jod-2'-deoxyundin ( 5! dU) verwendet. Eine Aktivitätseinheit wurde als diejenige Menge definiert, die zur 50%igen In@ubition des 125 ldU-Einbaus im Vergleich zu unbehandelten CCL-64-Zellen erforderlich ist.
Zum Nachweis der Sekretion von aktivem TGF-ss2 aus transfizlerten Zellen wurde serumfreier Überstand konfluenter Zellkulturen innerhalb von 24 h abgetrennt und ausgiebig gegen 0, 2 M Essigsäure dialysiert. Essigsäure wurde durch Lyophilisierung abgetrennt und die Proben m sterilem vollständigem Kulturmedium zur Verwendung Im Test gelöst.
2 Konstruktion des TGF-ss1/TGF-ss2-Hybrid-Prekursor-Gens zur TGF-ss2-Expression
Em Hybnd TGF-Beta-Prekursor-Gen, bestehend aus der Simlan-TGF-ss1-kodierenden Prekursorsequenz und der 5'-untranslatierten Sequenz und der Im richtigen Leserahmen daran gebundenen kodierenden Sequenz für maturierten Human-TGF-j82 und der 3'-untranslatierten Sequenz wurde gemäss der Darstellung in Flg. 1c konstruiert. pPC-21 wurde zuerst mit EcoRI verdaut, mit dem Klenow-Fragment behandelt, das 2.
3 kb-Fragment mit
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und pPC-21/Hincll- mit den Inserts ! n jeweils entgegengesetzter Onentlerung wurden zur Erzeugung überlappender Exolll-Fragmente durch jeweiligen Verdau mit Sstl und BamHI, gefolgt von Exolll-Verdau, Klenow-Behandlung, erneuter Ligierung der DNA und Transformation von E. coli verwendet. Zwei Klone, Exo 5. 9 und Exo 25C wurden mit unterschiedlich langen 5'-bzw 3'-Sequenzen gefunden und in pEMBL zur Erzeugung von pEMBL 5. 9 und pEMBL 25C subkloniert
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pBMBL 5. 9 wurde mit Hindlll verdaut, zur Erzeugung stumpfer Enden mit dem Klenow-Enzym behandelt, mit Kpnl verdaut und daraus das 0. 6 kb-Fragment (Fragment 1) isoliert.
Exo 25C wurde mit EcoRI und Kpnl verdaut und daraus das 1. 1 kb-Fragment (Fragment 2) isoliert. pGS62 wurde mit BamHI verdaut, mit dem Klenow-Enzym aufgefüllt, mit EcoRI verdaut und mit den Fragmenten 1 und 2 ligiert (pGS62 wurde aus pGS20 (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49 : 857) durch Deletion einer einzelnen EcoRISchnittstelle erzeugt). Das Gemisch wurde zur Transformation von E. coli verwendet, woraus pGS62/CIFB isoliert wurde. pGS62/CIFB wurde mit Pstl und EcoRI verdaut, daraus das 1600 bp-Fragment isoliert und nochmals mit Xholl verdaut. Das daraus resultierende 400 bp grosse Fragment Xholl-EcoRI wurde isoliert (Fragment 3).
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das 300 bp grosse Fragment Isoliert (Fragment 4).
Zwei komplementäre DNA-Stränge mit den unten angegebenen Sequenzen wurden synthetisiert, phosphoryliert, anneliert und mit den oben beschriebenen Fragmenten 3 und 4 ligiert.
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Das Plasmid pss1/ss2 wurde mit EcoR ! verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 aufgefüllt, mit Hindlil geschnitten und daraus das 1600 bp-Fragment isoliert ; pSV2, 1l/32 wurde durch Insertion dieses Fragmentes in pSV2, neo, welches zur Entfernung des neo-Gens zuvor mit Hindlll und Hpal verdaut wurde. pSV2.ss1/ss2 wurde min Pvul und EcoR ! verdaut. m ! t dem Klenow-Enzym aufgefüllt, mit Ndel verdaut und daraus das 2. 6 kb (circa) Ndel-EcoRI-Fragment Isoliert und mit psV2, dhfr ligiert, welches zuvor mit Ndel und Pvull verdaut wurde E.
coli wurde mit dem Ligierungsgemisch transformiert und daraus pSV2/ss1- ss2/dhfr Isoliert.
3 Expression von TGF-ss2 In CHO-Zellen pSV2/ss1-ss2/dhfr wurde zur Transfektion von dhfr-negativen CHO-Zellen verwendet und dhfr-ampliflzler- te Zellen wurden aus den pnmären Transfektanten, wie in Material und Methoden beschrieben, hergestellt
Positive Klone wurden mit Hilfe des Bioassays (Inhibition der Mink-Lungenepithelzellen (CCL-64)) wie beschneben nachgewiesen (Gentry et al., 1987. Mol. Cell. Biol. 7:3418). Rekombinante Proteine wurden mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung eines Antipeptid-Antiserums gegen die Sequenz NH2-
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te annähernd 500 ng/ml des Faktors (Flg. 5).
Eine Analyse des von diesem Klon sezernierten Proteins mit Hilfe von Western Blotting unter Verwendung des Antipeptid-Antiserums ISt In Fig. 6 gezeigt. Daraus ist zu entnehmen, dass sowohl das matunerte 24kd TGF-ss2-Dimer als auch die grössere (annähernd 90kd) Prekursorform nachgewiesen werden konnte.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Die folgenden Mikroorganismen wurden bel der Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) hinterlegt und mit folgenden Hinterlegungsnummern bezeichnet :
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<tb>
<tb> tvtikroorganismen <SEP> Plasmid <SEP> Hinterlegungs-Nummer <SEP>
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pPC-21 <SEP> B-18256
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pPC-14 <SEP> B-18333
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pBSC-40-1 <SEP> B-18335
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> HB101 <SEP> pBSC-40-16 <SEP> B-18334
<tb> Chinese <SEP> Hamster <SEP> Ovary <SEP> pSV/ss1-ss2/dhfr
<tb>
Patentansprüche 1.
Nukleotidsequenz, die für den Transforming Growth Faktor-ss2 kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie Im wesentlichen die Nukleotidsequenz vom Nukleotidrest Nummer 991 bis zum Nukleotidrest
Nummer 1326 gemäss Fig. 1 a umfasst.
2. Transforming Growth Faktor-ss2, dadurch gekennzeichnet, dass er Im wesentlichen die Aminosäurese- quenz vom Aminosäurerest Nummer 331 bis zum Aminosäurerest Nummer 442 gemäss Fig. 1 a umfasst.
3. Verfahren zur Herstellung des Transforming Growth Faktor-ss2, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst : (a) Kultivierung einer eukaryontischen Zelle, welche eine für den Transforming Growth Faktor-ss2 kodierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle einer zweiten Nukleotidsequenz enthält, welche die
Genexpression reguliert, sodass ein Peptid oder Protein durch die eukaryontische Zelle produziert wird, welches Transforming Growth-Faktor-ss2-Aktrvität aufweist: und (b) Isolierung des Transforming Growth Faktor-ss2 aus der Kultur.
EMI15.2