DE69426019T2

DE69426019T2 - Stabile bakterizide proteine, welche die permeabilität erhöhen und pharmazeutische zusammensetzungen, diese enthaltend

Info

Publication number: DE69426019T2
Application number: DE69426019T
Authority: DE
Inventors: Manik Baltaian; David Burke; Lynn Grinna; Arnold Horwitz; Georgia Theofan
Original assignee: Xoma Technology Ltd USA
Current assignee: Xoma Technology Ltd USA
Priority date: 1993-02-02
Filing date: 1994-02-02
Publication date: 2001-05-17
Anticipated expiration: 2014-02-03
Also published as: US6828418B2; EP1310558B1; US20060009383A1; DE69434980T2; KR960700340A; EP1013760A2; DK1310558T3; KR100361997B1; US5674834A; JP2004254697A; WO1994018323A1; DE69426019D1; ATE363535T1; EP1013760A3; US5827816A; NZ262284A; EP0689592B1; NO20023224D0; DE69431995D1; DE69434980D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sieht neue bakterizide/Permeabilität-erhöhende Proteinprodukte und stabile pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die diese enthalten.
Lipopolysaccharid (LPS) ist eine Hauptkomponente der äußeren Membran von Gram- negativen Bakterien und besteht aus Serotyp-spezifischen O-Seitenketten-Polysacchariden, die an eine konservierte Region aus Kern-Oligosaccharid und Lipid A besteht. Raetz, Ann. Rev. Biochem., 59: 129-170 (1990). LPS ist ein wichtiger Mediator in der Pathogenese von Gram-negativem septischem Schock, einer der Haupttodesursachen auf Intensivstationen in den Vereinigten Staaten. Mornson, et al., Ann. Rev. Med. 38: 417-432 (1987).
Man hat LPS-Bindungsproteine in verschiedenen Säugergeweben identifiziert. Mornson, Microb. Pathol., 7: 389-398 (1989); Roeder, et al., Infect., Immun., 57: 1054-1058 (1989). Unter den am intensivsten studierten LPS-Bindungsproteinen ist bakterizides/Permeabilität- erhöhendes Protein (BPI), ein basisches Protein, das in azurophilen Granula von polymorphonuklearen Leukocyten gefunden wird. Menschliches BPI-Protein ist aus polymorphonuklearen Neutrophilen durch Säureextraktion, kombiniert mit entweder Ionenaustauschchromatographie [Eisbach, JJ Biol. Chem., 254: 11000 (1979)] oder E. coli-Affinitäts-Chromatographie [Weiss, et al., Blood, 69: 652 (1987)] isoliert worden und weist eine potente bakterizide Aktivität gegen ein breites Spektrum Gram-negativer Bakterien auf.
Während das BPI-Protein gegen viele Gram-negative Bakterien cytotoxisch ist, weist es keine berichtete cytotoxische Aktivität gegenüber Gram-positiven Bakterien, Pilzen oder Säugerzellen auf. Die Aminosäuresequenz des gesamten menschlichen BPI-Proteins, ebenso wie der das Protein codierenden DNA, ist in Fig. 1 von Gray, et al., J. Biol. Chem., 264: 9505 (1989) vollständig aufgeklärt worden, aufgenommen hierin durch Bezugnahme (SEQ ID NOs.: 1 und 2). Die Publikation von Gray et al. beschreibt die Isolierung von menschlichem BPI- codierender cDNA aus einer cDNA-Genbank, die aus DMSO-induzierten Zellen der menschlichen promyelocytischen Leukämie HL-60-Zellinie (ATTC CCL 240) abgeleitet ist. Mehrfache PCR-Ampliflkationen von DNA aus einer frisch hergestellten cDNA-Genbank, die von derartigen DMSO-induzierten HL-60-Zellen abgeleitet ist, haben die Existenz von menschlichen BPI-codierenden cDNAs enthüllt, wobei das Codon, das Valin an Aminosäureposition 151 spezifiziert, entweder GTC (wie angegeben in SEQ ID NO.: 1) oder GTG ist. Darüber hinaus hat man auch gefunden, daß cDNA-Spezies, die GTG verwenden, um Valin an Position 155 zu spezifizieren, auch entweder Lysin (AAG) für die Aminosäure an Bosition 185 (wie in SEQ ID NOs.: 1 und 2) oder einen Glutaminsäurerest (GAG) an dieser Position spezifizieren.
Ein proteolytisches Fragment entsprechend dem N-terminalen Teil von menschlichem BPI- Holoprotein besitzt die antibakterielle Effizienz des natürlich abgeleiteten 55 kDa menschlichen BPI-Holoproteins. Im Gegensatz zum N-terminalen Teil zeigt die C-terminale Region des isolierten menschlichen BPI-Proteins nur geringe nachweisbare antibakterielle Aktivität. Ooi, et al., J. Exp. Med., 174: 649 (1991). Ein N-terminales BPI-Fragment, das in etwa die ersten 199 Aminosäuren des menschlichen BPI-Holoproteins umfaßt, ist durch rekombinante Mittel als ein 23 kD-Protein hergestellt worden. Gazzano-Santoro et al., Infect. Immun. 60: 4754-4761 (1992). Siehe auch WO 92/03535 (PCTIUS91/05758), die Analoga und Varianten von BPI-Protein beschreibt.
Die projizierte klinische Verwendung von BPI-Produkten zur Behandlung von Gram- negativer Sepsis beim Menschen hat wesentliche Bestrebungen ausgelöst, große Mengen an rekombinanten BPI (rBPI)-Produkten zu produzieren, die für den Einbau in stabile, homogene pharmazeutische Präparate geeignet sind. Zum Beispiel offenbart die ebenfalls eigene, ebenfalls anhängige U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/072,063, offengelegt als WO 93/23540 (Europäische Patentanmeldung Nr. 93913992.9) von Grinna neue Verfahren zur Reinigung rekombinanter BPI-Produkte, die exprimiert sind in und sekretiert werden von genetisch transformierten Säugerwirtszellen in Kultur. Die Wirksamkeit der Reinigungsverfahren ist darin im Zusammenhang mit Produkten von transformierten CHO-Zellen gezeigt, die DNA exprimieren, die die 31 Aminosäure "Leader"-Sequenz von menschlichem BPI codieren und die anfänglichen 199 Amino-terminalen Reste des reifen Proteins (d. h. entsprechend den Aminosäuren -31 bis 199 von SEQ ID NO: 2). Die ebenfalls eigene und anhängige U.S.- Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693, veröffentlicht als WO 93/23434 von Theofan, et al., betrifft neue, rekombinant-produzierte BPI-Proteinanalog-Produkte, die aus der Expression von DNA resultieren, die die BPI-Leadersequenz und entweder 191 oder 199 Amino-terminale Reste von menschlichem BPI, das an DNA fusioniert ist, die eine konstante Region einer schweren Kette von Immunglobulin codiert.
Bemühungen, BPI-Produkte mit einem pharmazeutischen Reinheitsgrad für die Behandlung von Gram-negativer Sepsis beim Menschen zu produzieren, haben nicht zu einheitlich zufriedenstellenden Ergebnissen geführt. Ein Hauptgrund für dies besteht in der Natur der Aminosäuresequenz von menschlichem BPI und der Natur der rekombinanten Wirtszellenumgebung, in der die Produkte produziert werden. Als ein Beispiel können biologisch aktive rBPI- Produkte in guter Ausbeute gereinigt werden, welche die anfänglichen 199 Reste von BPI [rBPI (1-199)] umfassen, die als sekretorische Produkte von transfizierten CHO-Wirtszellen hergestellt werden. Die isolierten BPI-Produkte umfassen jedoch anfangs ebenso dimere Formen von BPI, wie Cystein-Addukt-Spezies. Darüber hinaus können die BPI-Produkte nach Lagerung bei physiologischer Temperatur und pH instabil sein, was zur Bildung von zusätzlichen Dimeren und Adduktspezies führt. Derartige Dimere und Adduktspezies, während sie ihre biologische Aktivität beibehalten, sind nicht bevorzugt für den Einbau in pharmazeutische Präparate, die für die menschliche Verwendung bestimmt sind. Die Dimerbildung und die Bildung von Cystein-Addukten sind das mutmaßliche Ergebnis der Tatsache, daß BPI drei Cysteinaminosäurereste enthält, von denen alle drei innerhalb der biologisch aktiven Amino-terminalen Region von BPI positioniert sind, d. h. an Positionen 132, 135 und 175. Die Bildung einer einzelnen Disulfidbrücke zwischen zwei der drei Cysteine erlaubt die Dimerbildung oder Bildung von Cystein-Addukten, wobei sich das verbleibende freie Cystein im Wirtszellcytoplasma und/oder dem Zellkulturüberstand befand.
Selbst monomere rBPI-Produkte zeigen unterschiedliche Grade von Mikroheterogenitäten hinsichtlich der Anzahl von Carboxy-terminalen Resten, die in derartigen Produkten vorhanden sind. Zum Beispiel ist es schwierig, Expressionsprodukte in der vollständigen Länge in einem Medium nachzuweisen, das Wirtszellen enthält die mit DNA transformiert oder transfiziert sind, die rBPI(1-199) codiert. Stattdessen stellen die aus solchen Zellen erhaltenen Expressionsprodukte eine heterogene Anordnung von Carboxy-terminal verkürzten Spezies des rBPI N-terminalen Fragmentes dar. In der Tat wird das erwartete Produkt in seiner ganzen Länge (1-199) nicht als unter den rBPI-Spezies vorhanden nachgewiesen, die in dem heterogenen Array vorhanden sind. Die Heterogenität der Carboxy-terminalen Aminosäuresequenz von rBPI(1-199)-Produkten scheint aus der Aktivität von Carboxypeptidasen in Cytoplasma der Wirtszelle und/oder dem Kulturüberstand zu resultieren.
Ein weiteres bei der Herstellung von BPI-Produkten mit pharmazeutischem Reinheitsgrad angetroffenes Problem ist die Bildung von makroskopischen Partikeln, die die Homogenität des Produktes ebenso wie seine Aktivität verringern. Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung, die rBPI-Produkte gemäß der Erfindung enthält, umfaßt die Kombination von einem Poloxamer (Polyoxypropylen-polyoxyethylen-Block-Copolymer)-Oberflächenaktiven Mittel und einem Polysorbat (Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester)-Oberflächenaktiven Mittel. Über derartige Kombinationen wird in der ebenfalls eigenen, gleichfalls anhängigen und gleichzeitig eingereichten U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/012,360, veröffentlicht als WO 94/17819 (Europäische Patentanmeldung Nr. 94907963.6) gelehrt, daß sie synergistischen Wirkungen bei der Stabilisierung pharmazeutisch aktiver Polypeptide gegen Partikelbildung aufweisen. Am bevorzugtesten ist eine Zusammensetzung, bei der das rBPI-Produkt in einer Konzentration von 1 mg/ml in Citrat-gepufferter Saline (0,02 M Citrat, 0,15 M NaCl, pH 5,0), die 0,1 Gew.-% Poloxamer 188 (Pluronic F-68, BASF Wyandotte, Parsippany, NT) und 0,002 Gew.-% Polysorbat 80 (Tween 80, ICI Americas Inc., Wilmington, DE) vorhanden ist.
Es besteht weiterhin ein Bedarf in der Technik für verbesserte rBPI-Produkte, die für den Einbau in stabile homogene pharmazeutische Präparate geeignet sind. Derartige Produkte würden idealerweise in großer Ausbeute von transformierten Wirtszellen erhältlich sein, würden die bakteriziden und LPS-bindenden biologischen Eigenschaften von BPI beibehalten und wären hinsichtlich ihrer Kapazität, dimere Spezies und Cystein-Addukte zu bilden beschränkt, und wären durch eine begrenzte Variation ihrer Carboxytermini gekennzeichnet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung sieht neue, biologisch aktive, rekombinant-produzierte BPI ("rBPI")-Protein- und Proteinfragment-Produkte vor, die durch eine Resistenz gegenüber Dimerisierung und Cystein-Addukt-Bildung gekennzeichnet sind, was diese Produkte in höchstem Maße für die pharmazeutische Anwendung geeignet machen. Ebenfalls werden rBPI- Produkte vorgesehen, die durch eine verringerte molekulare Heterogenität am Carboxy- Terminus gekennzeichnet sind. Neue DNA-Sequenzen, die rBPI-Produkte und - analogprodukte codieren, Plasmidvektoren, welche die DNA enthalten, Wirtszellen, die stabil mit den Plasmiden transformiert oder transfiziert sind, rekombinant-präparative Methoden, stabile pharmazeutische Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren werden durch die Erfindung auch vorgesehen.
Entsprechend einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden rBPI-Protein-Produkte vorgesehen, die ein N-terminales Fragment von BPI umfassen, worin ein Cystein an Aminosäureposition 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, bevorzugterweise eine nicht-polare Aminosäure, wie Serin oder Alanin. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Cysteinrest an Position 132 eines Polypeptids, das die ersten 199 N-terminalen Reste von BPI umfaßt, durch einen Alaninrest in einem rekombinanten Produkt ersetzt, das als "rBPI(1-199)ala¹³²" bezeichnet wird. Auch ist hierin ein Polypeptid offenbart, bei dem das Cystein an Position 135 eines BPI-Fragmentes, das die ersten 199 N-terminalen BPI-Reste umfaßt, durch ein Serin ersetzt ist, was zu einem rekombianten Produkt führt, das als "rBPI(1 -199)ser¹³&sup5;" bezeichnet wird. Besonders bevorzugt ist ein rekombinantes Protein, das als "rBPI(1-193)ala¹³²" bezeichnet wird, das durch verringerte Heterogenität, was die Identität seiner Carboxy-terminalen Reste anbelangt gekennzeichnet ist. Ebenfalls wird ein Polypeptid gelehrt, welches die ersten 193 Amino-terminalen Reste von BPI umfaßt und welches ein Stopp-Codon unmittelbar nach dem Codon für Leucin an Position 193 aufweist.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der Erfindung werden DNA-Sequenzen vorgesehen, die i für das oben beschriebene rBPI-Protein und Proteinfragment-Produkte codieren. Derartige DNA-Sequenzen können auch für die 31 Reste lange BPI-Leadersequenz und das BPI- Polyadenylierungssignal codieren. Ebenfalls vorgesehen sind autonom replizierende DNA- Plasmidvektoren, die DNA umfassen, welche die oben erwähnten Produkte codieren, so wie Wirtszellen, die mit dieser DNA in einer Art und Weise stabil transformiert und transfiziert sind, die ausreichend ist, um ihre Expression zu erlauben. Transformierte oder transfizierte Wirtszellen entsprechend der Erfindung sind von augenscheinlicher Nützlichkeit bei Verfahren für die Produktion von rBPI-Protein-Produkten der Erfindung in großem Maßstab.
Die Erfindung betrachtet auch rBPI-Protein-Produkte in der Form von Fusionsproteinen, die, am Amino-Terminus, rBPI-Protein-Produkte der Erfindung und, am Carboxy-Terminus, eine konstante Region einer schweren Immunglobulinkette oder einer allelischen Variante davon umfassen. BPI/Immunglobulin-Fusionsproteine mit natürlicher Sequenz werden gelehrt in der ebenfalls anhängigen und ebenfalls eigenen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693, veröffentlicht als WO 93/23434, von Theofan, et al., deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die Erfindung betrachtet weiterhin Verfahren zur Herstellung der zuvor erwähnten Fusionsproteine.
Ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung sind DNA-Sequenzen, die biologisch aktive rBPI-Proteinfragment-Produkte mit von etwa 176 bis etwa 198 der N-terminalen Aminosäuren von BPI codieren. Diese DNAs erlauben die Produktion von BPI-Produkten in eukaryontischen Wirtszellen, so wie CHO-Zellen, wobei die Produkte eine geringere Heterogenität hinsichtlich der vorhandenen Carboxy-terminalen Reste zeigen. Derzeit offenbart sind DNAs, die 193 N-terminale Reste von BPI codieren (z. B. DNAs, welche die 31 Aminosäure- Leadersequenz von BPI, die anfänglichen 193 N-terminalen Aminosäuren und einen oder mehrere Stopp-Codons codieren). Von der Erfindung vorgesehen werden solche DNAs, die zusätzlich für Proteine codieren, worin das Cystein an Position 132 ersetzt ist (z. B. rBPI(1- 193ala¹³²).
Schließlich sieht die vorliegende Erfindung auch stabile, homogene pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die die rBPI-Protein-Produkte der Erfindung in pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Adjuvanzien und Trägern umfassen. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen sind gegenüber der Bildung von rBPI-Produktpartikeln resistent. Derartige Zusammensetzungen sind nützlich bei der Behandlung von Gramnegativen bakteriellen Infektionen und die Sequelae davon, einschließlich Endotoxin-vermitteltem Schock und einem oder mehreren damit verbundenen Zuständen, wie verbreitete intravaskuläre Coagulation, Anämie, Thrombocytopenie, Leukopenie, adultes respiratorisches Stress-Syndrom, Nierenversagen, Hypotension, Fieber und metabolische Acidose.
Viele zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden nach Studium der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung für die Fachleute offensichtlich werden, die besonders bevorzugte Ausführungsformen davon beschreibt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 stellt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse von rBPI(1-199)-Produkten dar.
Fig. 2 stellt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse von rBPI(1-193) und rBPI(1- 199)ala¹³²-Produkten dar.
Fig. 3 stellt die Ergebnisse der Kationenaustausch-HPLC-Analyse von rBPI(1-199)- Produkten dar.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Kationenaustausch-HPLC-Analyse von rBPI(1-199)ala¹³²- Produkten dar.
Fig. 5 stellt die Ergebnisse von Umkehrphasen-HPLC-Lauf von rBPI(1-199)-Produkten dar.
Fig. 6 stellt die Ergebnisse von Umkehrphasen-HPLC-Lauf von rBPI(1-199)ala¹³²- Produkten dar.
Fig. 7 stellt die Ergebnisse von Turbiditätsstudien von pharmazeutischen Zusammensetzungen dar, die rBPI-Produkte mit oder ohne Poloxamer/Polysorbat-Oberflächen-aktiven Mittel- Bestandteilen bei pH 7,0 und 57ºC enthalten.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Die folgende detaillierte Beschreibung betrifft die Herstellung und die Eigenschaften verschiedener rBPI-Produktpräparate, die eine Aminosäuresubstitution an einem Cysteinreste und/oder hoch einheitlicher Carboxy-Termini umfassen. Genauer gesagt, betrifft Beispiel 1 ein exemplarisches Mittel, durch das Basensubstitutionen in die Nukleotidsequenz eingeführt werden, die ein beispielhaftes N-terminales Fragment von dem BPI-Protein codieren und den Einbau einer derartig mutierten Sequenz in Plasmid-Vektoren. Beispiel 2 betrifft die Einführung von Vektoren aus Beispiel 1 in geeignete Wirtszellen und beschreibt weiter die Expression von rekombinanten BPI-Protein-Polypeptid-Produkten der Erfindung. Beispiel 3 betrifft die Konstruktion von DNAs, die Cysteinaustausch-Produkte der Erfindung codieren und die Verwendung davon in in vitro Transkriptions-/Translations-Verfahren. Beispiel 4 betrifft Eigenschaften von rBPI-Produkt-Polypeptiden der Erfindung.

BEISPIEL 1

Konstruktion von Vektoren, die BPI-Cystein-Austausch-Analoga enthalten
A. Konstruktion von Plasmiden pING4519 und pING4520
Der Expressionsvektor, pING4503, wurde als eine Quelle von DNA, die ein rekombinantes Expressionsprodukt codierte, und als rBPI(1-199) bezeichnet wird, verwendet, d. h. daß es ein Polypeptid codiert mit der 31-Reste-Signalsequenz und den ersten 199 Aminosäuren des N-Terminus des reifen menschlichen BPI, wie in SEQ ID NOs: 1 und 2 angegeben mit der Ausnahme, daß Valin an Position 151 durch GTG anstelle von GTC spezifiziert wird und Rest 185 Glutaminsäure ist (spezifiziert durch GAG) anstelle von Lysin (spezifiziert durch AAG).
Plasmid pING4503 ist beschrieben worden in der ebenfalls anhängigen und ebenfalls eigenen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693, veröffentlicht als WO 93/23434, von Theofan, et al., die hierin durch Bezugnahme bezüglich des Hintergrundes der Erfindung aufgenommen wird. Kurz gesagt, basiert die Konstruktion von pING4503 auf Plasmid pING2237 N, welches das Enhancerelement der schweren Immunglobulinkette der Maus enthält, das LTR-Enhancer-Promotor-Element der Abelson-murinen Leukämie-Virus (A-MuLv)- DNA, die SV40 195/16S-Splice-Verbindung am 5'-Ende des zu exprimierenden Gens, und die menschliche genomische gamma-1-Polyadenylierungsstelle am 3'-Ende des zu exprimierenden Gens. Plasmid pING2237N weist auch einen Dehydrofolat-Reduktase (DHFR) selektierbaren Marker von der Maus auf. Die rBPI(1-199) codierende DNA, einschließlich 30 bp der natürlichen 5' untranslatierten Region und die Basen, welche die 31 Aminosäuresignalsequenz codieren, ebenso wie 199 N-terminale Aminosäuren von BPI, wird zwischen die einzige SalI- und SstII-Restriktionsschnittstelle in pING4503 inseriert.
Zwei Vektoren, pING4519 und pING4520, wurden auf der Basis von pING4503 zur Expression von rBPI(1-199)-Cysteinaustauschanalogen konstruiert, in denen eine der drei natürlicherweise auftretenden Cysteinreste von BPI durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist.
Eine PvuII-Stelle (CAGCTG), die nur einmal in der DNA vorkommt, die rBPI(1-199) codiert und die zwischen Cystein 132 und Cystein 135 angeordnet ist, wurde in diesen Konstrukten verwendet. Da mehrere zusätzliche PvuII-Stellen in pING4503 existieren, war es zuerst erforderlich, das SalI-SstII-Fragment aus pING4503, welches das Insert enthielt, das rBPI(1-199) codierte, durch Verdau mit SalI und SstII zu isolieren. Das gereinigte SalL-SstII- rBPI(1-199)-Insert wurde dann mit PvuII verdaut, was zu einem etwa 529 bp SalI-PvuII- Fragment und einem etwa 209 bp PvuII-SstII-Fragment führte, von denen jedes getrennt gereinigt wurde.
Plasmid pING4519 ist identisch mit pING4503 mit der Ausnahme, daß pING4519 ein DNA- Insert enthält, das ein rBPI(1-199) codiert, bei dem ein Codon für Alanin das Codon ersetzt, das das native Cystein an Position 132 spezifiziert. Wie oben festgehalten, wird das rekombinante Produkt, das aus der Wirtszellexpression und dem sekretorischen Prozessieren eines solchen Inserts resultiert, als "rBPI(1-199)ala¹³²" bezeichnet. Um pING4519 zu erzeugen, wurden BPI-DNA-Sequenzen aus pING4503 PCR-amplifiziert unter Verwendung des Primers BPI-6: AAGCTTGTCGACCAGGCCTTGAGGT (SEQ ID NO: 3), der eine SalI- Restriktionsstelle am S'-Ende der 30 bp BPI-nicht-translatierten Region einfügte, und BPI-14: CTGGAGGCGGTGATGGTG (SEQ ID NO: 4), der eine Hälfte der PvuII-Stelle und der Basensubstitutionen einfügte, die erforderlich sind, um für Alanin an Position 132 zu codieren. Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung des GeneAmp PCR-Kits (Perkin Eimer Cetus, Norwalk, CT) entsprechend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit SalI verdaut, was zu einem blunt, etwa 529 bp SalI- Fragment führte, was dann in einer Drei-Stück-Ligation verwendet wurde, zusammen mit dem oben beschriebenen, etwa 209 bp PvuII-SstII-Fragment und dem großen Fragment, das aus dem SalI- und SstII-Verdau von pING4503 resultierte, um so pING4519 zu erzeugen.
Plasmid pING4520 ist identisch mit pING4519 mit der Ausnahme, daß pING4520 ein DNA- Insert enthält, das ein rBPI(1-199)-Analog codiert, in dem ein Serin-Codon an die Stelle des Codons tritt, das das native Cystein an Position 135 spezifiziert. Wie oben festgehalten, wird das rekombinante Produkt, das aus der Wirtszellexpression eines derartigen Inserts resultiert, als "rBPI(1-199)ser¹³&sup5;" bezeichnet. Um pING4520 zu erzeugen, wurden BPI-DNA- Sequenzen aus pING4513 PCR-amplifiziert, einem Plasmid, das im wesentlichen pING4503 ähnlich ist mit der Ausnahme, daß der Selektionsmarker gpt anstelle von DHFR ist und das cDNA-Insert die Signalsequenz und BPI in seiner ganzen Länge (456 Reste) anstelle von nur dem rBPI(1-199)-Teil codiert.
Die Amplifikation durch PCR wurde unter Verwendung von Primer BPI-15: CTCCAGCAGCCACATCAAC (SEQ a NO: 5) erreicht, worin das 5'-Ende die Hälfte einer mutierten PvuII-Stelle einbringt (worin "CTG" zu "CTC" geändert ist) und die Basensubstitutionen, die notwendig sind, um für Serin an Position 135 zu codieren; und Primer BPI-7: GAACTTGGTTGTCAGTCG (SEQ ID NO: 6), der rBPI-codierende Sequenzen darstellt, die stromabwärts der Region angeordnet sind, die für BPI-Rest 199 codiert. PCR-Fragment wurde mit BstBI verdaut, das stromabwärts der Cystein 135-Mutagenesestelle schneidet, und das resultierende glatte etwa 100 bp blunt BstBI-Fragment wurde gelgereinigt. Dann wurde eine Drei-Stück-Ligation mit dem oben beschriebenen 529 bp SalI-PvuII-BPI- Restriktionsfragment, dem glatten 100 bp blunt BstBI-Fragment und einem großen Fragment, das aus BstBI-SalI-Verdau von pING4503 resultiert durchgeführt, um so pING4520 zu erzeugen.
B. Konstruktion von Plasmid pING4530
Ein weiterer Vektor, pING4530, wurde konstruiert, der den Alanin-anstelle-von-Cystein- Austausch, wie in pING4519 enthielt, der aber den gpt-selektierbaren Marker (der für Mycophenolsäureresistenz codiert) anstelle von DHFR-Marker enthielt, der von pING4503 zu pING4519 mit übernommen wurde. Um pING4530 zu konstruieren, wurde ein 1629-bp-SalI- DraIII-Restriktionsfragmentn aus pING4519 isoliert. Dieses Fragment umfaßte die gesamte rBPI(1-199)ala¹³²-codierende Region, ebenso wie eine zusätzliche etwa 895 bp Vektor- Sequenz am 3'-Ende der codierenden Region. Dieses Fragment wurde an das große (etwa 7.230 bp) DraIII-SalI-Vektorfragment ligiert, das aus pING4513 isoliert wurde, um so pING4530 zu erzeugen.
C. Konstruktion von Plasmid 1311404533
Plasmid pING4533 wurde für die Expression von rBPI(1-199)ala¹³² konstruiert, worin das Codon, das die fünfte Aminosäure der BPI-Signalsequenz codiert, Methionin (ATG) an Position -27 in Kontext der Konsensus-Kozak-Translationsinitiationssequenz GCCACCRCCATGG (SEQ ID NO: 7) [Kozak, Nucl. Acid. Res., 15: 8125 (1987)] plaziert wurde und in der die DNA-Sequenz, die für die ersten vier Aminosäuren des BPI-Signals codierte, entfernt wurde. Dies wurde durch PCR-Amplifikation von BPI-Sequenzen von einem Plasmid erreicht, das die menschliche BPI-cDNA in ihrer ganzen Länge enthielt [in pGEM- 7zf(+)] unter Verwendung des PCR-Primers BPI-23: ACTGTCGACGCCACCATGGCCAGGGGC (SEQ ID NO: 8), der eine SalI- Restriktionsstelle und die Nukleotide GCCACC vor dem ATG (Methionin) an Position -27 des BPI-Signals einbrachte und den Primer BPI-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID NO: 9), der dem 3'-Ende der rBPI(1- 199) codierenden Sequenz entsprach.
Die etwa 700 bp PCR-amplifizierte DNA wurde mit SalI und EcoRI verdaut und das resultierende 270 bp-Fragment, einschließlich etwa des ersten Drittels der BPI(1-199)-codierenden Sequenz, gereinigt. Dieses SalI-EcoRI-Fragment wurde an 2 andere Fragmente ligiert: (1) ein 420 bp EcoRI-SstII-Fragment aus pING4519, das für den Rest von BPI(1-199) codierte, worin Alanin Cystein an Position 132 ersetzte; und (2) ein etwa 8000 bp SstII-SalI- Vektorfragment aus pING4502 (ein Vektor, der im wesentlichen ähnlich ist zu pING4503 mit der Ausnahme, daß er nicht die 30 bp 5'-nicht-translatierte Sequenz aufweist und einen gpt- Marker anstelle von DHFR aufweist), um so pING4533 zu erzeugen, das einen gpt-Marker enthält.
D. Konstruktion der Plasmide pING4221, pING4222 und pING4223
Vektoren ähnlich pING4533 wurden mit einen Insert konstruiert, das die optimierte Kozak- Translations-Initiationsstelle enthielt, entsprechend dem Methionylrest -27 der Signalsequenz und eine Alanin-anstelle-von-Cystein-Ersetzung an Position 132. Die das BPI-Fragment codierende Sequenz endete jedoch an Rest 193 in diesen Konstrukten. Wie oben festgehalten, wird das rekombinante Produkt, das aus Wirtszell-Expression dieser DNA resultiert, als "rBPI(1-193)ala¹³²" bezeichnet. Vektoren, die diese Inserts enthalten, wurde hergestellt, indem zuerst pING4533 mit SalI verdaut wurden, das am 5'-Ende des BPI-DNA-Inserts schneidet und AlwNI, welches einen drei bp 3'-Überhang an Rest 192 hinterläßt. Das resultierende etwa 700 bp-Fragment wurde dann gereinigt. Dieses Fragment wurde in das große Fragment re-ligiert, das aus dem pING4533-Verdau mit SstII-SalI resultierte, zusammen mit zwei annealierten komplementären Oligonukleotiden, BPI-30: CTGTAGCTCGAGCCGC (SEQ ID NO: 10) und BPI-31: GGCTCGAGCTACAGAGT (SEQ ID NO: 11). Dies ersetzt die Region zwischen den AlwNI- und SstII-Stellen mit dem Codon für Rest 193 (Leucin), einem Stopp-Codon und einer XhoI-Restriktionsstelle 5' zu der SstII-Stelle und führte zur Regeneration von sowohl der AlwNI- als auch der SstII-Stellen und Plazierung des Stopp- Codons, TAG, unmittelbar hinter dem Codon (CTG) für Aminosäure 193 (Leucin). Das resultierende Plasmid wurde als pING4223 bezeichnet und wies den gpt-Marker auf Ähnliche Konstruktionen wurden genauso gemacht wie für pING4223 beschrieben, mit der Ausnahme, daß verschiedene SstII-SalI-Vektorfragmente verwendet wurden, um Vektoren zu erzeugen mit verschiedenen Selektionsmarkern. Zum Beispiel ist pING4221 identisch mit pING4223 mit der Ausnahme, daß es den his-Marker (der Resistenz gegenüber Histidinol verleiht) anstelle von gpt, und pING4222 ist identisch mit pING4223 mit Der Ausnahme, daß es den DHFR-Marker anstelle von gpt enthält.
E. Konstruktion der Plasmide pING4537, pING4143, pING4146, pING4150 und pING4154
Eine Serie von Vektoren wurde konstruiert, die ein Insert enthielten, das rBPI(1-193)ala¹³² enthielt, die optimierte Kozak-Translationsinitiationsstelle und verschiedene Selektionsmarker, die im wesentlichen identisch sind zu den im Zusammenhang mit pING4221, pING4222 und pING4223 beschriebenen, mit der Ausnahme, daß die menschliche genomische gamma-1 schwere Ketten-Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminations-Region am 3'-Ende der SstII-Stelle ersetzt wurde durch eine menschliche Polyadenylierungssequenz der leichten Kette, gefolgt von genomischen Transkriptionsterminations-Sequenzen der leichten Kette (kappa) der Maus. In collateralen Genexpressionsstudien schien das Polyadenylierungssignal der leichten Kette und die Transkriptionsterminationsregion verantwortlich zu sein für 2,5-5- fache Steigerungen der BPI-Expressionszahlen in Sp2/0- und CHO-K1-Zellen.
Die vorerwähnten Vektoren wurden konstruiert, indem zuerst pING4537 konstruiert wurde, ein Vektor ähnlich pING4533, der das rBPI(1-199)ala¹³²-Insert enthält. pING4537 enthält jedoch die Polyadenylierungssequenzen von menschlicher leichter Kette anstelle von Sequenzen menschlicher schwerer Kette. Die Maus-Kappa-3'-Sequenzen wurden von pING3170 erhalten, einem Expressionsvektor, der eine cDNA von menschlicher leichter Kette codiert und eine 3'-Transkriptionsterminations-Sequenz der genomischen leichten Kette der Maus enthält. Dies wurde durch Verdau mit SstI vorgenommen, welches 35 bp stromaufwärts des Stopp-Codons der leichten Kette der Maus schneidet, Behandlung mit T4-DNA-Polymerase, um die Enden aufzufüllen zu machen, dann Schneiden mit BamHI und Reinigen eines etwa 1350 bp-Fragmentes, welches die Maus-Kappa-3'-Sequenzen enthielt. Das resultierende Fragment besteht aus etwa 250 bp des 3'-Teils der cDNA der konstanten Region von menschlicher leichter Kette und dem Polyadenylierungssignal, gefolgt von einem BamHI- Linker, wie beschrieben in dem als Δ8 in Lui et al.,. J. Immunol. 139: 3521, (1987) bezeichneten Konstrukt. Der Rest des etwa 1350 bp-Fragmentes besteht aus einem Kappa-3'- genomischen BglII-BamHI-Fragment der Maus [Fragment "D" von Xu et al., J. Biol. Chem. 261: 3838, (1986)], welches Transkriptionsterminations-Sequenzen bereitstellt. Dieses Fragment wurde in einer Drei-Stück-Ligation mit zwei Fragmenten von pING4533 verwendet: einen 3044 bp-Fragment, welches das gesamte BPI-Insert und einen Teil des Vektors enthielt, der durch Verdau von SstII, T4 Polymerase-Behandlung und NotI-Verdau (das das gesamte BPI-Insert und einen Teil des Vektors enthielt) und einem ungefähr 4574 bp-BamHI-NotI- Fragment. Der resultierende Vektor, pING4537, ist identisch mit pING4533 mit der Ausnahme der oben angegebenen Unterschiede in der genomischen 3'-nicht-translatierten Region.
Zusätzliche Vektoren, die die 3'-nicht-translatierten Sequenzen von Kappa enthielten, wurden unter Verwendung von pING4537 als die Quelle des Kappa-3'-Fragmentes konstruiert. Die Kappa-3'-nicht-translatierten Sequenzen wurden isoliert durch Verdau von pING4537 mit XhoI (eine eindeutige Stelle, die unmittelbar nach dem BPI-Stopp-Codon auftritt) und BamHl. Das resultierende etwa 1360 bp XhoI-BamHI-Fragment wurde in einer Serie von 3-Stück- Ligationen verwendet, um so die folgenden vier Vektoren zu generieren, die alle Inserts enthalten, die rBPI(1-193)ala¹³² codieren und die die optimierte Kozak- Translationsinitiationsstelle an Rest -27 des Signals enthalten: (1) pING4143 (gpt-Marker), erhalten durch Ligation eines pING4223 4574 bp BamHI-NotI-Fragmentes (gpt-Marker), einen pING4223 NotI XhoI-BPI-Insert-enthaltendes Fragment mit etwa 3019 bp und dem pING4537 XhoI-BamHI-Fragment; (2) pING4146 (DHFR-Marker), erhalten durch Ligation eines pING4222 BamHI-NotI-Fragmentes mit etwa 4159 bp (DHFR-Marker), eines pING 4223 NotI XhoI-BPI-Insert-enthaltendes Fragment mit etwa 3019 bp und das pING4537 XhoI-BamHI-Fragment; (3) pING4150 (his-Marker), erhalten durch Ligation eines pING4221 his-enthaltenden BamHI-NotI-Fragmentes mit etwa 4772 Basenpaaren, eines pING4222 NotI- XhoI-bp-Insert-enthaltendes Fragment und dem pING4537 XhoI-BamHI-Fragment; und (4) pING4154 (neo-Marker), erhalten durch Ligation eines pING3174-neo-enthaltenden BamHI- BsaI-Fragmentes mit etwa 4042 Basenpaaren, eines pING4221 BsaI-XhoI-BPI-Insertenthaltendem Fragment mit etwa 3883 Basenpaaren und dem pING4537 XhoI-BamHI- Fragment. Plasmid pING3174 enthält ein Insert, das DNA für die schwere Antikörperkette codiert und einen neo-Marker enthält. Das neo-Gen und seine flankierenden Sequenzen wurden aus dem von Southern et al., J. Mol. App.. Genet., 1: 327 (1982) berichteten pSv2 neo- Plasmid erhalten.
F. Konstruktion der Plasmide pING4144 und pING4151
Es wurden zwei Plasmide, pING4144 und pING4151, konstruiert, die jeweils identisch mit pING4143 bzw. pING4150 waren mit der Ausnahme, daß die Expression von rBPI- codierenden Sequenzen unter der Kontrolle von unmittelbarem frühen Enhancer/Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (hCMV) anstelle des Abelson Murin Leukämie-Virus (A- MuLv)-LTR-Promotor standen. Deshalb enthielten sowohl pING4144 als auch pING4151 die Mutation des Cysteins an Position 132 zu Alanin, die optimierte Kozak- Translationsinitations-Sequenz und die menschliche poly-A Leichte-Ketten-/genomische Maus-Kappa-Transkriptionsterminationsregion. Die Region zwischen den Nukleotiden 879 und 1708 der ursprünglichen Vektoren (pING4143 und pING4150) wurde durch eine Region des hCMV-Enhancers/Promotors ersetzt, entsprechend den Nukleotiden -598 bis +174, wie in Fig. 3 von Boshart et al., Cell 41: 521 (1985) gezeigt, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Um die hCMV-Promotorregion in BPI-Expressionsvektoren einzuführen, wurde zuerst das Plasmid pING4538 konstruiert, in dem das etwa 1117 bp umfassende Eco- RI-SalIIA-MuLv-Promotor-enthaltende Fragment von pING4222 mit einem etwa 1054 bp langen EcoRI-SalIhCMV-Promotor-enthaltenden Fragment aus Plasmid pING2250, welches den hCMV-Promotor enthält, der die Expression eines leichten Antikörper-Ketten-Inserts steuert. Um pING4144 zu konstruieren, wurden drei Fragment miteinander ligiert: (1) das rBPI(1-193)-enthaltende NotI XhoI-Fragment mit etwa 2955 bp aus pING4538; (2) das XhoI-BamHI-Fragment mit etwa 1360 bp aus pING4537; und (3) das BamHI-NotI-Fragment mit etwa 4770 bp, das das his-Gen aus pING4221 enthält.
G. Konstruktion der Plasmide pING4145, pING4148 und pING4152
Die Plasmide pING4145, pING 4148 und pING4152 wurden konstruiert und waren jeweils identisch mit pING4143, pING4146 bzw. pING4150, mit der Ausnahme, daß sie das Wildtyp (natürliche Sequenz)-Cystein an Position 132 anstelle einer Alanin-Substitution aufwiesen. Somit enthielten alle drei das rBPI(1-193)-Insert, die optimierte Kozak- Translationsinitiations-Sequenz und die menschliche poly-A Leichte-Ketten-/genomische Maus-Kappa-Transkriptionsterminationsregion. Diese drei Plasmide wurden wie folgt konstruiert. Um pING4145 zu konstruieren, wurden die Fragmente miteinander ligiert: (1) das NotI XhoI-BPI(1-193)-enthaltende Fragment mit etwa 3000 bp aus pING4140 (pING4140 ist identisch mit pING4221 mit der Ausnahme, daß es das Wildtyp-Cystein an Position 132 enthält); (2) das XhoI-BamHI-Fragment aus pING4537 mit etwa 1360 bp; und (3) das BamHI- NotI-Fragment mit etwa 4570 bp, das das gpt-Gen aus pING4223 enthält. Um pING4148 zu konstruieren, wurden drei Fragmente miteinander ligiert: (1) das NotI-XhoI-Fragment aus pING4140; (2) das XhoI-BamHI-Fragment aus pING4537; und (3) das BamHI-NotI-Fragment mit etwa 4150 bp, das das DHFR-Gen aus pING4222 enthielt. Um pING4152 zu konstruieren, wurden drei Fragmente miteinander ligiert: (1) das NotI XhoI-Fragment mit etwa 3000 bp aus pING4142 (p11404142 ist identisch mit pING4223 mit der Ausnahme, daß es das Wildtyp-Cystein an 132 enthält); (2) das XhoI-BamHI-Fragment aus pING4537; und (3) das Bam- HI-NotI-Fragment mit etwa 4770 bp, das das his-Gen aus pING4221 enthält.
Tabelle I, unten, faßt den Inhalt der Plasmide zusammen, deren Herstellung in den Abschnitten A bis 6 oben beschrieben ist. TABELLE 1 Tabelle 1 Fortsetzung Tabelle 1 Fortsetzung Tabelle 1 Fortsetzung
* Ein geändertes DHFR-Gen, wie beschrieben in der gleichfalls anhängigen und gleichfalls eigenen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/064,693, veröffentlicht als WO 93/23434

BEISPIEL 2

Transfektion von Zellen für die Expression der rBPI-Cystein-Austausch-Analoga Säugerzellen sind bevorzugte Wirtszellen für die Produktion von rBPI-Protein-Analoga gemäß der Erfindung, da derartige Zellen eine geeignete Sekretion, Faltung und posttranslationale Modifikation der exprimierten Proteine erlauben. Derzeit bevorzugte Säugerwirtszellen für die Produktion von Analogen der Erfindung beinhalten Zellen von Fibroblasten und lymphoiden Ursprungs, wie: CHO-K1-Zellen (ATCC CCL61); CHO-DG44 Zellen, eine Dihydrofolat-Reduktase-defiziente [DHFR&supmin;]-Mutante von CHO Toronto, die von Dr. Lawrence Chasin, Columbia University, erhalten wurde; CHO-DXB-11, eine DHFR&supmin;-Mutante von CHO-K1, erhalten von Dr. Lawrence Chasin; Vero-Zellen (ATCC CRL81); Babyhamster-Nieren (BHK)-Zellen (ATCC CCL10); Sp2/O-Ag14-Hybridoma-Zellen (ATCC CRL1581); und NSO-Myelom (ECACC Nr. 85110503).
Die Transfektion von Säugerzellen kann durch eine Vielzahl von Verfahren vorgenommen werden. Ein verbreiteter Ansatz umfaßt Calciumphosphat-Präzipitation von Expressionsvektor-DNA, die nachfolgend von Wirtszellen aufgenommen werden wird. Ein weiterer allgemeiner Ansatz, Elektroporation, verursacht, daß die Zellen, DNA durch Membranporen aufnehmen, die durch die Erzeugung eines starken elektrischen Feldes erzeugt werden [(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 16,30- 16,31 (1989)]. Die Selektion nach transfizierte Zellen wird durch Einbau eines Gens in den Expressionsvektor erleichtert, dessen Produkt den transfizierten Zellen zu überleben erlaubt und unter selektiven Bedingungen zu wachsen. Eine Anzahl derartiger Gene ist identifiziert worden. Diese umfassen, unter anderem: (1) neo, ein prokaryontisches Gen, das Resistenz gegen das Aminoglycosid-Antibiotikum G418 verleiht; (2) E. coli- Guaninphosphoribosyltransferase (gpt), welche Resistenz gegen Mycophenolsäure (MPA) in Gegenwart von Xanthin codiert, [Mulligan et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981)]; (3) Dihydrofolatreduktase (DHFR), das Wachstum von DHFR&supmin;-Zellen in Abwesenheit von Nukleosiden und Genamplifikation in der Gegenwart zunehmender Konzentration von Methotrexat erlaubt; (4) das hisD-Gen von Salmonella typhimurium, das Wachstum in Gegenwart von Histidinol erlaubt [Hartman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 8047-8051, (1988)]; (5) das trpB-Gen von E coli [Hartman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85 : 8047-8051, (1988)], das Wachstum in Gegenwart von Indol (ohne Tryptophan) erlaubt; und (6) das Glutamin-Synthetasegen, das Wachstum in Medien erlaubt, denen Glutamin fehlt. Die Verfügbarkeit dieser selektiven Marker, entweder alleine oder in verschiedenen Kombinationen, erreicht eine Flexibilität in der Erzeugung von Säugerzellinien vor, die rekombinante Produkte in hohem Maßstab exprimieren.
A. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4533
Plasmid pING4533 enthält Gensequenzen, die rBPI(1-199)ala¹³² codieren, die an den A- MuLv-Prornotor fusioniert sind, die optimierte Kozak-Translationsinitationssequenz, die 3'- nicht-translatierte Region der menschlichen schweren Gamma-1-Kette, und den gpt-Marker für Selektion von MPA-resistenten Zellen.
Die CHO-K1-Zellinie wird in Ham's F12-Medium plus 10% fötales Rinderserum (FBS) gehalten, das mit Glutamin/Penicillin/Streptomycin (Irvine Scientific, Irvine, CA) supplementiert ist. Die Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 ug pING4533-DNA transfiziert, die zuerst mit NotI verdaut wurde, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert wurde. Nach der Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 24 Stunden in nicht- selektivem Ham's F12-Medium zu erholen. Die Zellen wurden dann trypsiniert, bei einer Konzentration von 5 · 10&sup4; Zellen/ml in Ham's F12-Medium, das mit MPA (25 ug/ml) und Xanthin (250 ug/ml) supplementiert war resuspendiert und dann in 10&sup4; Zellen/Loch in 96- Loch-Platten ausplattiert. Untransfizierte CHO-K1-Zellen sind infolge der Inhibierung der Pyrimidinsynthese durch MPA nicht in der Lage, in diesem Medium zu wachsen.
Nach zwei Wochen wurden Kolonien, bestehend aus transfizierten Zellen in den 96-Loch- Platten beobachtet. Die Überstände von Näpfen, die einzelne Kolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch anti-BPI-ELISA unter Verwendung von rBPI(1-199) als ein Standard hin analysiert. In diesem Test waren Immulon-II-Platten mit 96 Löchern (Dynatech, Chantilly, VA) mit Affinitäts-gereinigtem Kaninchen-Anti-rBPI(1-199)- Antiserum vorbeschichtet. Überstand-Proben wurden hinzugefügt und der Nachweis wurde unter Verwendung von Affinitäts-gereinigtem, biotinylierten Kaninchen-Anti-rBPI(1-199)- Antiserum und Peroxidase-markiertem Avidin durchgeführt.
Etwa 800 Kolonien wurden auf diese Weise gescreent. 31 Kolonien mit der höchsten Produktion wurden in Platten mit 24 Löchern für die Bewertung der Produktivität überführt. Die Zellen wurden in einer Platte mit 24 Löchern in Ham's F12-Medium, das mit 10% FBS supplementiert war, bis zur Konfluenz angezogen. Wenn die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde das Ham's F12-Medium entfernt und 1 ml HB-CHO-Serum-freies Medium (Irvine Scientific) plus 40 ul sterile S-Sepharose-beads (Pharmacia, Piscataway, NJ) hinzugegeben, wie in der ebenfalls eigenen, gleichzeitig anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/072,063, veröffentlicht als WO 93/23540 (Europäische Patentanmeldung Nr. 93913992.9) von Grinna. Die Zellen wurden dann für 7 Tage inkubiert, wonach die S- Sepharose-beads entfernt wurde und mit 0,1 M NaCl in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) gewaschen wurden. Das Produkt wurde von den beads durch Hinzufügen von 1,0 M NaCl Tris- Puffer eluiert und durch ELISA, wie oben beschrieben, quantifiziert. Die am meisten produzierende Transformante, bezeichnet als A153, sekretierte etwa 3 ug/ml in diesem Test und wurde zum Wachstum in Excell 301 Serumfreiem Medium (JRH Scientific, Lenexa, KS) adaptiert. Die adaptierten Zellen wurden in 1,5 l Fermentern in Excell 301-Medium in Gegenwart von S-Sepharose-beads angezogen. Die Produktivität wurde nach 120-140 Stunden durch C4-HPLC-Analyse von Produkt bewertet, das von den S-Sepharose-beads eluiert war (Aliquots von SO ml). Die Produktivität war 15-25 ug/l in diesem Stadium der Fermentation.
B. Transfektion von CHO-DG44-Zellen mit pING4222
Plasmid pING4222 enthält DNA, die das rBPI(1-193)Ala¹³²-Analog codiert, das an den A- MuLv-Promotor; die optimierte Kozak-Initationssequenz, die 3'-nicht-translatierte Region der menschlichen schweren Gamma-1-Kette und das Maus-DHFR-Gen für die Selektion von transfizierten Zellen in einem Nukleosid-freien Medium fusioniert ist.
Die Zellinie, CHO DG44, wurde in Ham's F12-Medium plus 10% FBS mit Glutmain/Penicillin/Streptomycin gehalten. Die Zellen wurden mit linearisierter pING4222 DNA (40 ug verdaut mit PvuI, extrahiert mit Phenol-Chloroform, mit Ethanol präzipitiert) unter Verwendung des Calciumphosphatverfahrens von Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977) transfiziert. Nach der Behandlung mit Calciumphosphat wurden die Zellen in Platten mit 96 Löchern mit etwa 10&sup4; Zellen/Loch plattiert und Transfektanten wurden durch Wachstum in selektivem Medium erhalten, das aus αMEM-Medium bestand, dem Nukleoside fehlten (Irvine Scientific), und mit dialysiertem FBS (100 ml Serum dialysiert gegen 4L kaltes 0,15 M NaCl unter Verwendung eines Molekulargewichtsausschlusses von 6000-8000, 16 Stunden, 4ºC) supplementiert war. Nicht transfizierte CHO-DG44-Zellen sind infolge der DHFR-Mutation und des Fehlens von Nukleosiden in dem Medium, das mit dialysiertem Serum supplementiert ist nicht in der Lage, in diesem Medium zu wachsen.
Nach 2 Wochen enthielt jeder Napf etwa 2-3 Kolonien. Die Überstände aus Näpfen einer Platte mit 96 Löchern wurden auf die Anwesenheit von rBPI(1-193)ala¹³² durch ELISA, wie in Abschnitt A analysiert. Die 24 am höchsten produzierenden Klone wurden in Platten mit 24 Löchern in selektivem αMEM-Medium, das mit 0,05 uM Methotrexat supplementiert war, um Genamplifikation der rBPI-Analog-codierenden DNA zu induzieren expandiert. Bei beobachteten Wachstum wurden die Zellen in eine neue Platte mit 24 Löchern überführt und die Produktivität von S-Sepharose-Eluaten, wie in Teil A beschrieben für die pING4533/CHO- K1-Transfektanten bewertet. Die fünf am stärksten produzierenden Klone wurden kombiniert und durch beschränkende Verdünnung in Platten mit 96 Löchern subkloniert. Die Oberstände von Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf Titer von rBPI(1-193)ala¹³² durch ELISA getestet. Zwanzig am meisten produzierende durch ELISA getestete Subklone wurden als nächstes in Platten mit 24 Löchern expandiert und wurden Gegenstand einer weiteren Amplifikation in Gegenwart von 0,4 uM Methotrexat unterzogen und das Ausmaß der Produktexpression für die amplifizierten Zellen wurde durch ELISA bestimmt. Die stärksten Produzenten, Klone 4, 75 und 80 sekretierten 25-37 ug/ml bei Tag 7 in einer Platte mit 24 Löchern, die S-Sepharose enthielten.
C. Transfektion von Sp2/O-Zellen mit pING4223 und pING4221
Eine Strategie, die mit dem Ziel angewandt wurde eine optimale Expression von erwünschten rBPI-Produkten zu erreichen, umfaßte die Transfektion von Zellen mit einem ersten Expressionsplasmid mit einem ersten Marker, Screenen auf die stärksten Produzenten und dann Transfizieren derselben Zellen mit einem zweiten Expressionsplamid mit einem verschiedenen Marker. Diese Strategie ist unter Verwendung von Sp2/O-Zellen unten beschrieben.
Das Plasmid pING4223 enthält DNA, die rBPI(1-193)ala¹³²BPI enthält, das an den A- MuLv-Promotor, die optimierte Kozak-Translationsinitiationsssequenz, die 3'-nicht- translatierten Sequenzen von menschlicher schwerer Gamma-1-Kette und den gpt-Marker zur Selektion auf MPA-resistente Zellen fusioniert ist.
Die Sp2/O-Zellinie wurde in DMEM-Medium gehalten, das mit 10% FBS mit Glutamin/Penicillin/Streptomycin supplementiert war. Die Sp2/O-Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 ug pING4223 DNA transfiziert, die mit NotI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert wurde: Nach Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 48 Stunden in nicht-selektivem DMEM-Medium zu erholen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und bei einer Konzentration von 5 · 10&sup4; Zellen/ml in DMEM-Medium resuspendiert, das mit MPA (6 ug/ml) und Xanthin (250 ug/ml) supplementiert war und in UV- Zellen/Loch in Platten mit 96 Löchern ausplattiert. Nicht transfizierte Sp2/O-Zellen waren infolge der Inhibierung der Pyrimidin-Synthese durch die MPA nicht in der Lage, in diesem Medium zu wachsen. Nach 1,5-2 Wochen wurden in den Platten mit 96 Löchern Kolonien beobachtet, die aus transfizierten Zellen bestanden. Die Überstände von Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von Produkt-reaktivem Protein mittels ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Löchern überführt und die Produktivität wurde bewertet in extinteten Kulturen aus 24 Löchern für Zellen, die in Gegenwart oder Abwesenheit von 10&supmin;&sup7; M Dexamethason gewachsen waren, das eine Erhöhung der Expression durch den A-MuLv-Promotor als ein Ergebnis der Wechselwirkung mit dem Glucocorticoid-Rezeptor verursacht. Der stärkste Produzent, Klon 2X3, sekretierte etwa 3 ug/ml und 7 ug/ml in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason.
Der Klon 2 · 3 wurde als nächstes durch Elektroporation mit pING4221 transfiziert, welcher das his-Gen zur Selektion von Transfektanten enthält. Nach Erholung für 48 Stunden in DMEM plus 10% FBS-Medium wurden die Platten in mit 96-Loch-Platten mit etwa 10&sup4; Zellen/Loch in DMEM/FBS, das mit 6 ug/ml MPA, 250 ug/ml Xanthin und 8 mM Histidinol supplementiert war, ausplattiert. Nicht transfizierte Zellen waren nicht in der Lage, in der Gegenwart von Histidinol und MPA zu wachsen. Nach 1,5-2 Wochen wurden transfizierte Zellen in den 96-Loch- Platten beobachtet. Die Überstände von Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von rBPI-reaktivem Protein mittels ELISA analysiert.
Die stärksten Produzenten wurden in einen Platte mit 24 Löchern überführt. Die Produktivität wurde als Extinktionen von 24-Loch-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10&supmin;&sup7; M Dexamethason bewertet. Der stärkste Produzent, Klon 2X3-130, sekretierte etwa 15 ug/ml und 30 ug/ml in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason. Das Isolat wurde als nächstes durch beschränkende Verdünnung in Platten mit 96 Löchern subkloniert. Die Löcher, die Einzelkolonien enthielten, wurden mittels ELISA gescreent und die stärksten Produzenten expandiert und in 24-Loch-Kulturen erneut in Gegenwart und Abwesenheit von 10&supmin;&sup7; M Dexamethason getestet. Der am stärksten produzierende Subklon, Nr. 25, sekretierte etwa 16 ug/ml bzw. 33 ug/ml in der Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason.
D. Transfektion von Sp2/0-Zellen mit pING4143 und pING4150
Das Plasmid pING4143 enthält DNA, die für rBPI(1-193)ala¹³² codiert, das an den A-MuLv- Promotor, optimierte Kozak-Translationsinitationssequenz und 3'-nicht-translatierte Sequenzen der leichten Kappa-Kette von Maus zusammen mit dem gpt-Gen für die Selektion von MPA-resistenten Zellen fusioniert ist. Die Sp2/0-Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 ug pING4143-DNA, die zuerst mit NotI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert transfiziert war. Nach Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 48 Stunden in nicht-selektivem DMEM-Medium zu erholen. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und in einer Konzentration von 5 · 10&sup4; Zellen/ml in DMEM-Medium, das mit MPA (6 ug/ml) und Xanthin (250 ug/ml) supplementiert war resuspendiert und mit etwa 104 Zellen/Loch in Platten mit 96 Löchern ausplattiert.
Nach etwa 2 Wochen wurden Kolonien aus transfizierten Zellen in den Platten mit 96 Löchern beobachtet. Die Überstände aus Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Löchern überführt. Die Produktivität wurde bewertet als extinkte 24-Loch-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 107 M Dexamethason. Der stärkste Produzent, Klon 134, sekretierte etwa 12 ug/ml und etwa 28 ugiml in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von Dexamethason.
Der Klon 134 wurde durch Elektroporation mit dem Vektor, pING4150, transfiziert, der DNA enthielt, die für rBPI(1-193)ala¹³² codierte, das an den A-MuLv-Promotor und die 3'-nicht- translatierte Region der leichten Kette der Maus mit dem his-Gen für Selektion von Transfektanten fusioniert war. Vor der Elektroporation wurde der Vektor zuerst verdaut und mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Nach Erholung für 48 Stunden in DMEM plus 10% FBS-Medium wurden die Zellen in Platten mit 96 Löchern mit etwa 104 Zellen/Loch in DMEM/FBS, supplementiert mit 6 ug/ml MPA plus 250 ug/ml Xanthin und 8 mM Histidinol plattiert. Nicht transfizierte Zellen sind nicht in der Lage, in Gegenwart von MPA und Histidinol zu wachsen. Nach etwa 2 Wochen wurden Kolonien bestehend aus transfizierten Zellen in den 96-Loch-Platten beobachtet. Die Überstände aus Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine mit 24-Loch-Platte transferiert. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Loch-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10&supmin;&sup7; M Dexamethason bewertet. Der stärkste Produzent, Klon 134-11, wurde in C1770 umbenannt. Klon C1770 sekretierte 36 ug/ml ohne Dexamethason und mehr als 42 ug/ml in Gegenwart von Dexamethason. Dieser Klon (c1770) wurde in der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 als Zugangsnummer HB 11247 hinterlegt.
E. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4143
Die CHO-K1-Zellinie wurde mit pING4143 DNA in der Art und Weise transfiziert, wie sie in Abschnitt A Rk die Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4533 beschrieben wurde. Nach etwa 2 Wochen wurden Überstände von etwa 800 Löchern, die Einzelkolonien enthielten, auf die Anwesenheit von BPI-rekativem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in Platten mit 24 Löchern transferiert. Die stärksten Produzenten, die etwa 9-13 ug/ml sekretierten, können als nächstes an Serum-freies Medium in Vorbereitung auf Wachstum in Fermentern adaptiert werden. Diese können auch mit einem Vektor erneut transfiziert werden, so wie pING4150 oder pING4154, mit his bzw. neo als selektivem Marker, um eine Zellinie bereitzustellen, die sogar noch höhere Titer an rBPI-Produkt produziert.
F. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4144
Das Plasmid pING4144 ist ähnlich zu pING4143 mit der Ausnahme, daß es den menschlichen Cytomegalovirus-Promotor (hCMV) anstelle des A-MuLv-Promotors enthält. Die CHO-K1- Zellinie wurde mit pING4144-DNA in der Art und Weise transfiziert, wie in Abschnitt A beschrieben. Nach etwa 2 Wochen wurden Überstände von etwa 200 Löchern, die Einzelkolonien enthielten, auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in Platten mit 24 Löchern überführt und die rBPI-Expression in 24-Loch-Platten bestimmt, die Natriumbutyrat enthielten. Der stärkste Produzent (Klon 174) sekretierte etwa 3-5 ug/ml ohne Butyrat und etwa 15-18 ug/ml in Gegenwart von 5 mM Butyrat in diesem Test. Dieser Klon, umbenannt zu Klon C1771, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20851 als ATCC- Zugangsnummer CRL 11246 hinterlegt. Starken Produzenten können als nächstes in Vorbereitung auf das Wachstum in Fermentern an Serum-freies Medium adaptiert werden. Diese können auch re-transfiziert werden mit einem Vektor, wie pING4151 oder pING4155, die das rBPI-Gen unter der Kontrolle des hCMV-Promotors enthalten, aber mit his bzw. neo als selektiven Markern, um eine Zellinie bereitzustellen, die sogar noch höhere Titer an BPI produziert.
6. Transfektion von NSO-Zellen mit pING4143
NSO-Zellen wurden mit pING4143-DNA durch Elektroporation transfiziert. Nach etwa 3 Wochen beobachtete man Kolonien, die aus transfizierten Zellen bestanden, in den 96-Loch- Platten. Die Überstände aus Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Löchern überführt. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Loch- Kulturen bewertet. Die stärksten Produzenten sekretierten 15-16 ug/ml. Die stärksten Produzenten können mit einem Vektor, wie pING4150, wie oben beschrieben, erneut transfiziert werden, um sogar noch stärkere Produzenten zu ergeben.
H. Transfektion von NSO-Zellen mit o11404232
NSO-Zellen wurden durch Elektroporation mit pING4132 transfiziert, der DNA enthält, die für rBPI(1-193)ala¹³² codiert, die fusioniert ist an die optimale Kozak- Translationsinitationssequenz, die in den Vektor pEE13 cloniert ist [Bebbington, et al., Biotechnology, 10: 169-175 (1992)]: Vektor pEE13 enthält das Glutamin-Synthetasegen für die Selektion von Transfektanten, die in der Lage sind, in Medium zu wachsen, dem Glutamin fehlt. Nach etwa drei Wochen wurden Kolonien, bestehend aus transfizierten Zellen, in 96- Loch-Platten beobachtet. Die Überstände aus Löchern, die Einzelkolonien enthielten, wurden durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in eine Platte mit 24 Löchern transferiert. Die Produktivität wurde als extinkte 24-Loch-Kulturen bewertet. Die stärksten Produzenten, die 7-15 ug in extinkten 24-Loch-Kulturen sekretierten, können als nächstes einer Amplifikation in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Methioninsulfoximin unterzogen werden.
1. Transfektion von Sp2/0-Zellen mit pING4145
Das Plasmid pING4145 enthält DNA, das für rBPI(1-193)ala¹³² codiert, das an den A- MuLv-Promotor, die optimierte Kozak-Translationsinitationssequenz, 3'-nicht-translatierte Sequenzen der leichten Kappa-Kette von Maus, und ein gpt-Gen zur Selektion auf MPA- resistente Zellen fusioniert ist. Die Sp2/0-Zellen wurden durch Elektroporation mit 40 ug pING4145 DNA transfiziert, die zuerst mit NotI verdaut, mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert war. Nach Elektroporation erlaubte man den Zellen, sich für 48 Stunden in nicht-selektivem DMEM-Medium zu erholen, sie wurden zentrifugiert und in einer Konzentration von 5 · 10&sup4; Zellen/ml in DMEM-Medium resuspendiert, das mit MPA (6 ug/ml) und Xanthin (250 ug/ml) supplementiert war. Die Zellen können dann mit etwa 104 Zellen/Loch in Platten mit 96 Löchern plattiert werden. Nach etwa 2 Wochen wurden Kolonien, die aus transfizierten Zellen bestanden, in Platten mit 96 Löchern beobachtet. Die Überstände aus Zellen, die Einzelkolonien enthalten können dann auf die Anwesenheit von BPI- reaktivem Protein durch ELISA analysiert werden. Die stärksten Produzenten werden in eine Platte mit 24 Löchern überführt und die Produktivität wird als extintete 24-Loch-Kulturen hinsichtlich Zellwachstum in Gegenwart und Abwesenheit von 10&supmin;&sup7; M Dexamethason bewertet.
Um die Expression von BPI zu maximieren, kann die am stärksten produzierende Sp2/0- Transfektante durch Elektroporation mit einem Vektor transfiziert werden, der Gensequenzen enthält, die für rBPI(1-193)ala¹³² codieren, die an den A-MuLv-Promotor und die 3'-nicht- translatierte Region der leichten Kette der Maus mit dem,1üs-Gen für die Selektion von Transfektanten fusioniert ist.
J. Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pING4145
Die Zellinie CHO-K1 wurde mit pING4145 DNA in der oben in Abschnitt A beschriebenen Art und Weise transfiziert. Nach etwa 2 Wochen wurden Überstände von etwa 500-800 Löchern, die Einzelkolonien enthielten, auf die Anwesenheit von BPI-reaktivem Protein durch ELISA analysiert. Die stärksten Produzenten wurden in Platten mit 24 Löchern transferiert und die BPI-Expression in Platten mit 24 Löchern, die S-Sepharose enthielten, bestimmt. Die stärksten Produzenten werden als nächstes an Serum-freies Medium in Vorbereitung auf das Wachstum in Fermentern adaptiert. Diese können auch mit einem Vektor, der einen anderen selektiven Marker enthält, re-transfiziert werden, um eine Zellinie bereitzustellen, die sogar noch höhere Titer an rBPI-Produkt produziert.
K. Expression von rBPI-Produkten aus Insektenzellen
Ein weiteres eukaryontisches System, in dem rBPI-Produkte exprimiert werden können, sind Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert worden sind, der DNA enthält, die für ein rBPI-Produkt codiert. Die Systeme zur Erzeugung von rekombinantem Virus und zum Erreichen der Expression von rekombinanten Produkten davon sind kommerziell erhältlich (Invitrogen, San Diego, CA). DNA, die für rBPI(1-199) codiert, einschließlich der Signalsequenz aus 31 Aminosäuren, wurde in eine NheI-Stelle in einen pBlueBac- Transfer-Vektor (Invitrogen) kloniert. Sf9-Insektenzellen (BRL; ATCC CRL 1711) wurden mit diesem Vektor und dem Wildtyp-AcMNPV (Autographa californica multiple nuclear polyhidrosis virus, Invitrogen) co-transfiziert. Rekombinante virale Plaques wurden dann identifiziert, gereinigt und verwendet, um rekombinantes virales Material in einem hohen Titer zu erzeugen, wie in den Protokollen, die von BRL erhältlich sind, beschrieben.
Das rekombinant hergestellte Baculovirus wurde verwendet, um weitere Sf9 Zellen zu infizieren. Um dies zu erreichen, wurden 8 getrennte 60 mm - Schalen von Sf9-Zellen mit dem Baculovirus infiziert. Jeder der 8 Schalen wurde zu verschiedenen Zeiten während des Tages getestet, indem Medium von einer Schale infizierter Zellen gesammelt wurden. Nach der Entnahme wurde das Medium bei 1000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde bei 4ºC gelagert. Die Zellen wurden dann einmal mit 4 ml PBS gewaschen und mit 100 ul/Schale NP40 Lysispuffer (1% NP40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) durch Inkubation auf Eis für 30 Minuten lysiert.
Die Zellen wurden dann in Eppendorf-Röhrchen mit einem Zellschaber gesammelt. Zellysate wurden dann in einer Mikrofuge für 2 Minuten zentrifugiert. Der Lysatüberstand wurde in neues Röhrchen überführt und bei -20ºC gelagert. Medienproben von jedem Zeitpunkt des Tages wurden hinsichtlich BPI-Gehalt durch ELISA analysiert und die Lysate wurden durch Western unter Verwendung eines Anti-BPI-Antikörpers analysiert.
In den Medien war an den Tagen 1-4 nach der Infektion kein rBPI-Produkt mittels ELISA nachweisbar. An den Tagen 5-6 nach der Infektion wurde jedoch ein Peak von 200-500 ng/ml rBPI-Produkt in den Medienproben nachgewiesen. Western-Analysen der Lysate zeige eine BPI-reaktive Bande von etwa 23 kDa am Tag 2 nach der Infektion. Die Bande zeigte eine zunehmende Intensität bis zum Tag 6.
In Tabelle II, unten, sind die detailliert in Abschnitten A - J oben beschriebenen Tranfektionen zusammengefaßt.

TABELLE II

Wirtszelle Transfiziert mit
CHO-DG44 pING4222
CHO-K1 pING4533, pING4143, pING4144, pING4145
NSO pING4143, pING4232
SP2/O pING4223 gefolgt von pING4221, pING4143 gefolgt von pING4150, pING4145

BEISPIEL 3

Konstruktion von Plasmiden für in vitro-Transkription und Translation von rBPI(1-199)ala¹³² und rBPI(1-199)Ser¹³&sup5;
In vitro-Transkriptions-/Translationsstudien wurden unter Verwendung von Plasmid pIC127 als eine Quelle von DNA, die für rBPI(1-199) codierte durchgeführt. Die Konstruktion von pIC127 wurde wie folgt durchgeführt. DNA, die für rBPI(1-199) codierte, einschließlich der 31-Aminosäure-Signalsequenz, wurde aus einem Plasmid, das die vollständige cDNA enthielt, die BPI in pGEM-72f(+) codierte mit PCR amplifiziert. Die Amplifikation wurde so durchgeführt, daß eine SalI-Stelle am 5'-Ende eingeführt wurde, und XhoI- und SstII-Stellen wurden am 3'-Ende der rBPI-codierenden Sequenz durch Verwendung der Primer BPI-3: GTCGACGCATGCGAGAGAACATGGC (SEQ ID NO: 12) und BPI-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID NO: 9) eingebaut. Das resultierende PCR-amplifizierte Fragment wurde in die SmaI-Stelle der multiple cloning site von Plasmid pT7T3 18u (Pharmacia LKB Technology, Piscataway NJ) blunt-end eincloniert, um so pIC 102 zu erzeugen.
Das pIC102-Insert, das rBPI(1-199) und das Signal aus 31 Aminosäuren enthielt, wurde dann durch Verdau des Plasmids mit BamHI und Asp718I ausgeschnitten. Eine BamHI-Stelle flankiert die SalI-Stelle in pIC102 und eine Asp718I-Stelle flankiert die SstII-Stelle in pIC102. Die Enden des ausgeschnittenen Fragments wurden mit T4 DNA-Polymerase angefüllt, und das blunt Fragment wurde dann in Plasmid pGEM1 (ProMega, Madison, WI) cloniert, das zuerst mit PstI und EcoRI verdaut worden war und mit T4 DNA-Polymerase blunt gemacht wurde. Die resultierende Konstruktion wurde als pIC124 bezeichnet und umfaßt das rBPI(1-199)-codierende Insert, das so orientiert ist, daß sein 5'-Ende benachbart zum Sp6- Promotor in pGEMI ist.
Die 31 Aminosäure-Signalsequenz aus in dem pIC124-Insert wurde dann durch Entfernen der Region zwischen zwei HincII-Stellen in pIC124 ausgeschnitten, um pIC127 zu erzeugen. Die ausgeschnittene Region wurde dann durch einen Linker ausgetauscht, der das Startcodon (ATG) wiederherstellte und die Sequenz, welche die ersten Aminosäuren von BPI codierte. Es wurden zwei Fragmente aus dem pIC124-Verdau mit HincII und SstII isoliert: (1) Das HincII - SstII-Fragment, welches die rBPI(1-199) codierende Region mit Ausnahme des Codons für die erste Aminosäure enthielt; und (2) das SstII - HincII-Fragment, das den Rest des Plasmides umfaßte. Der erste Codon in der BPI-codierenden Sequenz und ein Codon für Methionin vor der BPI-Sequenz wurden durch die Verwendung von Linkem, die aus zwei komplementären annelierten Oligonukleotiden gebildet werden inseriert, BPI-28: GACGCCACCATGGTC (SEQ ID NO: 13) und BPI-29: GACCATGGTGGCGTC (SEQ ID NO: 14). Diese zwei Oligonukleotide wurden mit den HincII-SstII- und SstII-HincII- Fragmenten von pIC 124 aneinander ligiert, um pIC 127 zu bilden.
Zwei Plasmide, pML101 und pML102, wurden unter Verwendung von pIC127 für die in vitro-Transkription/Translation von rBPI(1-199)ala¹³² und rBPI(1-199)ser¹³&sup5; konstruiert. Um dies zu bewerkstelligen, wurde pIC 127 mit SstII und EcoRI verdaut und das große SstII- EcoRI-Fragment gereinigt. Um pmL101 zu konstruieren, das ein rBPI(1-199)ala¹³²-Insert enthielt, wurde das EcoRI-SstII-Fragment aus pING4519 an das SstII-EcoRI-Fragment aus PIC127 ligiert. Um pML102 zu konstruieren, das das rBPI(1-199)Ser¹³&sup5;-Insert enthält, wurde das EcoRI-SstII-Fragment aus pI7NG4520 in das SstII-EcoRI-Fragment von pIC 127 ligiert.
rBPI(1-199), rBPI(1-199)ser¹³&sup5; und BPI(1-199)ala¹³² wurden in vitro von Plasmiden pIC127, pML101 und pML102 unter Verwendung des TNT SP6-gekoppelten Retikulocytenlysatsystems von ProMega (Madison, WL) exprimiert. Das System erlaubt die in vitro gekoppelte Transkription und Translation von klonierten Genen unter Verwendung eines eukaryontischen Translationssystems. Jede gekoppelte Transkription/Translation wurde unter Verwendung des Protokolls des Herstellers mit 2 ug Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 25 ul, mit ³&sup5;S-Methionin durchgeführt, um markiertes Protein zu erzeugen. Die markierten Protein-Produkte wurden in 5 ul Aliquots zu einem 20 ul Harnstoffprobenpuffer hinzugegeben und für 3 Minuten bei 95ºC erhitzt. Aliquots (10 ul) einer jeden Probe wurden auf einem 15 % SDS-Polyacrylamidgel entweder mit oder ohne DTT (50 mM) gelaufen. Nach Fixieren und Trocknen des Gels wurden die markierten Proteinbanden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Ergebnisse der Autoradiographie zeigen, daß cDNA, die für rBPI(1-199), rBPI(1-199)ala¹³², und rBPI(1-199)cys¹³&sup5; codiert, Protein-Produkte mit der erwarteten Größe von etwa 23 kDa für ein N-terminales BPI-Fragment exprimierte. Darüber hinaus waren alle drei Expressionsprodukte, rBPI(1-199), rBPI(1-199)ala¹³² und rBPI(1-199)cys¹³&sup5;, in der Lage, hochmolekulare Spezies der für BPI(1-199)-Dimere erwarteten Größe zu erzeugen, ebenso wie größere Spezies, die alle nach Reduktion mit DTT verschwanden. Man glaubt, daß die Expression von dimeren Spezies in rBPI(1-199)cys¹³&sup5;-und rBPI(1- 199)ala¹³²-Produkten das Ergebnis der Verwendung eines zellfreien in vitro Transkriptions- /Translationssystems sein kann. Ein derartiges System erlaubt kein korrektes post- translationales Prozessieren, Falten etc., das normalerweise bei zellulärer Translation erfolgen würde. Somit kann es sein, daß richtige Disulfidbrücken sich nicht immer in dem in vitro- System ausbilden, was in einigen Fällen zur Bildung von Dimeren führt.
Markierte Proteine, die mit dem oben beschriebenen in vitro-Expressionssystem erzeugt wurden, wurden als nächstes hinsichtlich ihrer LPS-Bindungsaktivität getestet. Löcher von Mikrotiterplatten wurden mit LPS von Salmonella minnesota R7 (Rd-Mutante) (5 mg/ml in Methanol-Stammlösung) in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;/20 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) bei pH 9,4 beschichtet (insgesamt 2 ug LPS in einem 50 ul-Loch). Nach Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Löcher mit Wasser gewaschen und bei 37ºC getrocknet. Die Löcher wurden dann mit 215 ul Dulbecco's-PBS/0,1% BSA für 3 Stunden bei 37ºC blockiert. Die Blockierungslösung wurde dann verworfen und die Löcher mit PBS/0,2% Tween-20 gewaschen. Die rBPI-Proben wurden dann hinzugegeben (2 ul des Translationsreagens) zu insgesamt 50 ul PBS/0,2% Tween. Nach Inkubation über Nacht bei 4ºC wurden die Löcher dreimal mit PBS/0,2% Tween gewaschen und die Menge an markiertem Protein, das in einem jeden Loch verblieb, wurde durch Flüssig-Szintillationszählung bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß in etwa gleiches LPS-Bindung für alle drei BPI-Spezies, wie oben angegeben, erfolgte. rBPI(1- 199) zeigte eine Bindung von 48,690 cpm; rBPI(1-199)ala¹³² zeigte eine Bindung von 59,911 cpm; und rBPI(1-199)cys¹³&sup5; zeigte eine Bindung von 52.537 cpm. Ein jeder der vorerwähnten Werte stellt den Mittelwert von Dreifachbestimmungen dar. Die durchschnittliche Bindung der Kontrolle (keine DNA) betrug 5.395 cpm.

BEISPIEL 4

Produktcharakterisierung
A. Physikalische Charakterisierung
Die Charakterisierung von rBPI-Produkten wurde unter Verwendung von Umkehrphasen (C4)-HPLC, Kationenaustausch (MA7C)-HPLC, SDS-PAGE und Elektrospray-Ionisations- Massenspektrometrie (ESI-MS) durchgeführt. Die rBPI-Produkte, die charakterisiert werden sollten, wurden aus Rollerflaschen oder aus einem 10 Liter Fermenter entweder durch ein Ein-Schritt-Reinigungsverfahren oder Mehrschrittverfahren geerntet. Das Ein-Schritt- Verfahren war im wesentlichen jenes, das in der ebenfalls eigenen und anhängigen U.S.- Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/072,063, veröffentlicht als WO 93/23540 (Europäische Patentanmeldung Nr. 93913992.9) von Grinna beschrieben ist, mit dem Hinzufügen eines zweiten Waschschrittes. Kurz gesagt, wurden S-Sepharose-beads zu einem Wachstumsmedium hinzugefügt, das rBPI-Produkte enthielt. Die S-Sepharose wurde dann aus dem Medium entfernt und mit 20 mM Natriumacetat und 100 mM Natriumchlorid bei pH 4,0 gewaschen. Ein zweites Waschen wurde mit 20 mM Natriumacetat und 700 mM Natriumchlorid bei pH 4,0 durchgeführt. Die gereinigten rBPI-Produkte wurden eluiert mit 20 mM Natriumacetat und 1000 mM Natriumchlorid bei pH 4,0.
Das Mehrschritt-Reinigungsverfahren umfaßte die Reinigung von vereinigten Ansätzen von rBPI-Produkten, die zuerst getrennt, wie oben beschrieben, gereinigt worden waren. Nach Reinigung eines jeden der 20 einzelnen rBPI-Produktansätze durch das Ein-Schritt-Verfahren wurden die Ansätze vereinigt und erneut gereinigt durch ein erstes Verdünnen der Salzkonzentration der vereinigten Ansätze auf 200 mM. Die vereinigte Probe wurde dann auf einen S- Sepharose-Säule geladen und bei pH 4,0 mit 20 mM Natriumacetat und 200 mM Natriumchlorid gewaschen, gefolgt von 700 mM Natriumchlorid. Die rBPI-Produkte wurden unter Verwendung von 20 mM Natriumacetat und 1000 mM Natriumchlorid bei pH 4,0 eluiert. Die gereinigten rBPI-Produkte wurden dann analysiert, um ihre physikalischen Charakteristika zu bestimmen.
1. SDS-PAGE-Analyse von rBPI-Produkten
Die SDS-PAGE-Analyse von rBPI-Produkten wurden unter Verwendung von 14% Polyacrylamidgelen und eines tris-Glycin-Puffersystems unter reduzierenden und nicht- reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Die Proteinbanden wurden entweder mit Coomassie-Blau oder Silberfärbung zur Sichtbarmachung gefärbt.
Wie in Fig. 1 gezeigt, erschien das nicht-reduzierte rBPI(1-199) als eine Hauptbande bei etwa 23 kDa und eine kleine Bande bei etwa 40 kDa. Die Hauptbande wurde als rBPI(1-199) durch Vergleich mit gleichzeitig gelaufenen Standards identifiziert, und die kleinere Bande wurde durch Immunfärbung identifiziert als eine dimere Form von rBPI(1-199). Nach Hinzufügen eines 1/20 Volumens von 0,4 M Dithiothreitol (DTT) zu einer getrennten Probe von rBPI(1-199) zeigte SDS-PAGE eine einzelne, gut definierte Bande entsprechend der 23 kDa monomeren Spezies von rBPI(1-199), das unter den nicht-reduzierenden Bedingungen, wie oben beschrieben, identifiziert wurde.
Die SDS-PAGE-Analyse des rBPI(1-199)ala¹³²-Produktes zeigte eine einzelne Bande, die mit der einzelnen 23 kD rBPI(1-199) Bande unter reduzierenden Bedingungen lief. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen lief rBPI(1-199)ala¹³² mit der schneller wandernden der zwei dicht angeordneten Banden, die für rBPI(1-199) (entsprechend der 23 kDa-Bande) beobachtet wurde. Diese Ergebnisse, dargestellt in Fig. 2, zeigen, daß rBPI(1-199)ala¹³² in im wesentlichen monomerer Form nach der Reinigung existiert. Somit zeigen rBPI-Produkte, bei denen ein Cysteinrest durch Alanin ersetzt ist, eine signifikante Resistenz gegenüber Dimerbildung.
2. Kationenaustausch-HPLC-Analyse von rBPI-Produkten
Kationenaustausch-HPLC unter Verwendung einer MA7C-Säule wurde ebenfalls angewendet, um den Dimer-Gehalt von rBPI-Produkten zu messen. Eine Bio-Rad MA7C-Kartusche (4,6 · 30 mm, Bio-Rad Katalog Nr. 125-00556) equilibriert bei 1,0 ml/min mit 40% Puffer B (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,5) wurde verwendet. Das rBPI(1-199)-Produkt wurde durch Verdünnen einer /ml-Probe auf 100 ug/ml analysiert und 200 ul der verdünnten Probe wurden auf die Säule injiziert. Das rBPI wurde mit einem Gradienten aus 40% bis 100% Puffer B über 6 Minuten eluiert. Puffer A umfaßte 20 mM MES bei pH 5,5. Die Absorbanz wurde bei 229 nm überwacht.
Die Analyse von rBPI(1-199) zeigte zwei Peaks. Ein erster Peak eluierte mit einer Retentionszeit von etwa 3 Minuten, wie in Fig. 3 gezeigt. Ein zweiter, kleinerer Peak eluierte bei etwa 6 Minuten. Der erste Peak, in Fig. 3 dargestellt, stellt rBPI(1-199)-Monomer dar, und der zweite Peak in Fig. 3 stellt rBPI(1-199)-Dimer dar, wie durch Vergleich der Retentionszeiten von gereinigten Monomer und Dimer-Standards bestimmt. Der zweite (Dimer-) Peak erschien nicht, wenn die Proben mit DTT reduziert wurden bevor sie auf die Säule injiziert wurden.
Identische Verfahrensweisen wurden verwendet, um das Elutionsmuster von rBPI(1- 199)ala¹³² zu bestimmen. Wie in Fig. 4 gezeigt, eluiert rBPI(1-199)ala¹³² als ein einzelner Peak mit einer Retentionszeit entsprechend derjenigen, die für den rBPI(1-199)-Monomer- Peak beobachtet wurde. Es gab keinen Hinweis auf Dimer in der rBPI(1-199)ala¹³²-Probe.
3. Umkehrphasen (C4)-HPLC und Elektronenspray-Ionisations-Massenspektrometrie- Analyse von rBPI-Produkten
Mikroheterogenität von rBPI-Produkten wurde durch Umkehrphasen-HPLC und Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) aufgezeigt. Für die HPLC-Analyse wurde eine Brownlee BU-300 C4-Säule mit 37% Mobiler Phase B bei einer Flußrate von 0,5 ml/min equilibriert (80% Acetonitril/0,065% TFA). Die Proben (jeweils 1 ml) von rBPI(1- 199) wurden auf 100 ug/ml verdünnt und 50 ul der Probe wurde injiziert. Die Säule wurde mit 37% Mobiler Phase B für 2,5 Minuten gewaschen und dann unter Verwendung eines Gradienten von 37% bis SO % Mobiler Phase B über 20 Minuten eluiert. Die Mobile Phase A war 5% Acetonitril/0,1% TFA, und die Absorbanz wurde bei 220 nm überwacht.
Die Ergebnisse der Umkehrphasen-HPLC-Analyse von rBPI(1-199)-Produkten sind in Fig. 5 gezeigt. rBPI(1-199)-Produkte eluieren als ein zweiter (Haupt-)Peak mit einem teilweise aufgelösten ersten (kleineren) Peak am vorangehendem Anstieg des zweiten Peaks. Nach Reduktion mit DTT eluiert nur ein Peak, entsprechend dem zweiten Peak, von der Säule.
Identische Verfahrensweisen wurden, um rBPI(1-199)ala¹³²-Produkte zu analysieren verwendet. Wie in Fig. 6 gezeigt, eluierte rBPI(1-199)ala¹³² als ein einzelner Peak entsprechend dem zweiten (Haupt-)Peak, auf den sich oben bezogen wird.
Die Eluate entsprechend den oben beschriebenen ersten und zweiten HPLC-Peaks, von drei getrennten Ansätzen von rBPI(1-199) wurden isoliert und analysiert, um ihren Gehalt durch ESI-MS zu bestimmen. Die Analyse des Eluats, das den zweiten (Haupt-)Peak von dem rBPI(1-199)-Lauf ergab, zeigte eine etwas geringere Masse, wie die von einem 199- Aminosäureprotein erwartete. Diese Daten zeigten an, daß der größte Teil der Masse, der in dem zweiten Peakeluat gefunden wurde, zu einem 1-193 rBPI-Protein-Fragment korrespondierte. Es sind jedoch auch andere Spezies mit einem Größenbereich von 1-198 bis 1-194 vorhanden. Die Analyse des Eluats, das den einzelnen Peak ergab und der von HPLC auf rBPI(1-199)ala erhalten wurde, erbrachte Ergebnisse ähnlich denjenigen, die von dem Eluat erhalten wurde, das den obigen zweiten (Haupt-)Peak produzierte. Diese Ergebnisse sind mit Peptidkartierungsdaten konsistent, die verkürzte Carboxytermini in rBPI(1-199)- Produkten zeigten.
Wenn die gleiche Analyse an rBPI(1-193)Produkten durchgeführt wurde, wurde eine signifikant verringerte C-terminale Heterogenität beobachtet. Die von rBPI(1-193)-Produkten erhaltenen ESI-MS-Daten zeigten, daß etwa 85% des Proteins entweder die ersten 191, 193 oder 193 (+ ein N-terminales Alanin) Aminosäuren des N-Terminus von BPI enthalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle III gezeigt. TABELLE III Elektronenspray-Ionisations-Massenspektrometrie-Ergebnisse für rBPI(1-193) und rBPI(1-199)-HPLC-Monomer-Peaks
* Es wurden nur Spezies quantifiziert, die als in Mengen von mehr als 10% vorhanden nachgewiesen wurden. Diese Spezies wurden dann auf 100% normalisiert.
Diese Daten zeigen, daß, während die rBPI(1-199)-codierende DNA kein Protein in seiner gesamten Länge (d. h. Aminosäuren 1-199 des N-Terminus von BPI) produzierte, die rBPI(1 - 193)-codierende DNA signifikante Mengen des rBPI(1-193)-Proteins produzierte. Auf der Grundlage dieser und anderer Daten erscheint es so, daß signifikante Verringerungen der Heterogenität und signifikante Erhöhungen bei der Produktion des gewünschten Proteins (d. h. dasjenige, für welches das DNA-Insert codiert) durch Verwendung verkürzter Formen der rBPI-codierenden DNA erhalten werden können, während optimale bakterizide und LPS- bindende Aktivität aufrechterhalten werden kann. Man erwartet, daß die Verkürzung der zu exprimierenden DNA signifikante Verringerungen der Heterogenität des Expressionsproduktes in dem Umfang produzieren werden, daß die zu exprimierende DNA nicht über das Cystein am Aminosäurerest 175 hinaus verkürzt wird. Von Expressionsprodukten von verkürzten Formen von DNA, die rBPI-Proteine codiert, die in dem Bereich der ersten 176 Aminosäuren des N-Terminus von BPI bis zu den ersten 193 Aminosäuren des N-Terminus von BPI aufweisen wird erwartet, daß sie auch die volle bakterizide und LPS-Bindungsaktivität beibehalten.
Die ESI-MS-Daten zeigten auch die Anwesenheit von Mikroheterogenität am Aminoterminus von rBPI-Produkten. Es wurden Formen von rBPI-Produkt mit einem Alaninrest am Aminoterminus gefunden und durch Sequenzierung tryptischer Peptide bestätigt.
Wie in Fig. 5 gezeigt, ergab die ESI-MS-Studie des Eluats, das den ersten (kleineren) Umkehrphasen-HPLC-Peak produzierte, Proteine mit einer Massenverteilung ähnlich jener, die den zweiten (Haupt-)Peak bildeten, mit der Ausnahme, daß jeder Massenwert um etwa 119- 120 Dalton höher war. Diese Daten lassen vermuten, daß das wie oben beschriebene Eluat, das den ersten (kleineren) HPLC-Peak produzierte, ein Disulfid-verknüpftes Cystein-Addukt enthält, da dies zu einer einheitliche Verschiebung der Massenwerte führen würde.
Um diese Hypothese zu testen, daß der erste (kleinere) Umkehrphasen-HPLC-Peak, der durch rBPI(1-199) produziert wurde, Cystein-Addukte darstellt, wurde rBPI(1-199) Ellman's Reagens (Dithionitrobenzoesäure, DTNB) ausgesetzt, das an freie Sulfhydrylgruppen in etwa molaren Äquivalenten bindet. Eine derartige Behandlung zeigte, daß es weniger als ein Mol freies Sulfhydryl pro Mol rBPI(1-199) gibt. Mit Blick auf die Anwesenheit dreier Cysteinreste in BPI (an den Positionen 132, 135 und 175) unterstützen diese Ergebnisse die Vorstellung, daß es entweder eine intramolekulare Disulfid-Verbindung in den rBPI-Produkten gibt, oder daß zwei der Sulhydrylgruppen sterisch nicht verfügbar sind. rBPI(1-199)ala¹³² zeigte keine Reaktivität mit dem Ellman's Reagens.
4. Lagerstabilität von rBPI(1-199)-Produkten
Proben von rBPI(1-199) (1 mg/ml) in einem Puffer umfassend 20 mM Natriumcitrat, 0,15 M Natriumchloridpuffer, 0,1% Poloxamer und 0,002% Polysorbat 80 bei pH 5,0 wurden analysiert, um ihre Lagerstabilität über eine Dauer von 8 Wochen bei der empfohlenen Lagertemperatur von 2º-8ºC und bei höheren Temperaturen von 22ºC und 37ºC zu bestimmen.
Die Ergebnisse für Lagerung bei 2ºC-8ºC, dargestellt in Tabelle IV, zeigen einen Anstieg in Gegenwart von Dimer (von 1% bis 4%), aber keine signifikante Erhöhung der Cystein- Addukt- oder Partikelbildung in der Probe. Tabelle IV
Lagerung bei den erhöhten Temperaturen von 22ºC und 37ºC zeigt jedoch, daß sich die Anwesenheit von Dimer und Partikeln in der Probe dramatisch erhöhte und die Menge an Cystein-Addukt sich moderat erhöhte. Diese Ergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Zusätzlich wurde kein Dimer nach Lagerung für 2 Wochen nachgewiesen, wenn rBPI(1-193)ala¹³² bei 22ºC bis 37ºC gelagert wurde. Unter ähnlichen Bedingungen zeigt rBPI(1-193) signifikante Erhöhungen. Tabelle V
5. Turbidität von pharmazeutischen Zusammensetzungen von rBPI
Experimente wurden durchgeführt, um die Turbidität verschiedener rBPI-enthaltender pharmazeutischer Zusammensetzungen zu bestimmen. In diesem Zusammenhang bezeichnet Turbidität die Tendenz pharmazeutischer Zusammensetzungen, sich an Entfaltung (d. h. Verlust der tertiären Proteinstruktur) und/oder Partikelbildung (Wechselwirkungen zwischen einzelnen Proteinen, um große (> 10 um) Partikel zu bilden) zu beteiligen. Die getesteten pharmazeutischen Zusammensetzungen enthielten entweder rBPI(1-199), rBPI(1-199)ala¹³² oder rBPI(1-193)ala¹³² in entweder einem Citratpuffer (20 mM Natriumcitrat/150 mM Natriumchlorid, pH 5,0) oder einen Citratpuffer, der 0,1% Poloxamer 188 (ein Poloxamer- Oberflächen-aktives Mittel, das zusammengesetzt ist aus Polyoxpropylen-polyoxyethylenblock-copolymer) und 0,002% Polysorbat 80 (ein Polysorbat-Oberflächen-aktives Mittel, das Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester enthält), umfaßt. Wie oben ausgeführt, stabilisiert die Verwendung einer Kombination aus Poloxamer/Polysorbat-Oberflächen-aktiven Mittelsystemen pharmazeutische Zusammensetzungen, wie gelehrt in der ebenfalls eigenen und ebenfalls anhängigen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/012,360, eingereicht am 02. Februar 1993, veröffentlicht als WO 94/17819 (Europäische Patentanmeldung Nr. 94907963.6 von McGregor et al.
Proben wurden analysiert, um ihre Resistenz gegenüber Turbidität über die Zeit bei zunehmenden Temperaturen und entweder pH 7,0 oder pH 5,0 zu bestimmen. Vor der Analyse wurden alle Proben auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml in entweder 50 mM Kaliumphosphat oder 20 mM Citratpuffer bei pH 7,0 verdünnt. Turbiditäts-Messungen wurden erhalten, indem Proben in Quarzküvetten zur Verwendung in einem Shimadzu UV-160 UV-Vis- Spektrophotometer (Shimadzu, Pleasanton, CA), ausgerüstet mit einem Temperaturkontrollierten Küvettenhalter, der an ein rezirkulierendes Wasserbad angeschlossen ist, gegeben wurden. Nach Equilibrieren des Küvettenhalters auf die gewünschte Temperatur (57ºC, 65ºC oder 85ºC, siehe unten) wurde die Absorbanz bei 280 nm gemessen, um zu bestätigen, daß die Proben auf die richtige Konzentration verdünnt worden waren. Danach wurde die Absorbanz der Proben bei 350 nm alle 2 Minuten für eine Stunde gemessen, um die Änderung der Absorbanz über die Zeit zu bestimmen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt; worin "formuliert" das rBPI-Produkt in Citratpuffer bezeichnet, der die Poloxamer/Polysorbat-Kombination enthält, auf die oben hingewiesen wurde, und "unformuliert" rBPI-Verbindungen in Citratpuffer alleine bezeichnet. Eine geringere Änderungsrate der Turbidität (d. h. eine geringere Rate der Erhöhung der Absorbanz über die Zeit) zeigt erhöhte Stabilität gegenüber Entfaltung und Partikelbildung an. Wie in Fig. 7 gezeigt, führte das Hinzufügen der vorerwähnten Kombination aus Oberflächenaktiven Verbindungen zu erhöhter Stabilität (Resistenz gegenüber Partikelbildung und Entfaltung) bei allen getesteten Zusammensetzungen. Darüber hinaus zeigten rBPI(1-199)ala¹³² und rBPI(1-193)ala¹³² eine stark erhöhte Resistenz gegenüber Entfaltung und Partikelbildung verglichen mit den Zusammensetzungen des Wildtyps - unabhängig davon, ob die Kombination aus Oberflächenaktivem Mittel vorhanden war. Ähnliche Ergebnisse wurden jeweils bei pH 5,0 und 65ºC, bei pH 5,0 und 75ºC und bei 85ºC erhalten.
Zusammengefaßt zeigten die Zusammensetzungen mit der Kombination aus Oberflächenaktiven Mitteln und/oder der Cysteindeletion eine stark erhöhte Stabilität über die Zeit und bei Temperaturerhöhungen, verglichen mit Zusammensetzungen, die kein Oberflächenaktives Mittel enthielten und/oder die N-terminale BPI(1-199)- Wildtyp-Konstruktion enthielten.
B. Charakterisierungen der in vitro-Aktivität
In vitro-Aktivität von rBPI(1-199)ala¹³²-Produkten wurde durch Bindung der Produkte an LPS, durch den LAL-Inhibitionstest und durch die bakterizide Potential der Produkte bestimmt.
1. Bindung von rBPI(1-199)ala¹³² an LPS
Proben (jeweils 20 ug bis 60 ug) von E. coli (Stamm 0111-B4) oder S. minnesota (Rd- Mutante)-Lipopolysaccharid (Sigma Chemical, St. Louis, Mo) wuiden verwendet, um die Fähigkeit von rBPI(1-199)ala¹³²-Produkten an LPS zu binden zu bestimmen.
Die LPS-Proben wurden der Größe nach durch SDS-PAGE fraktioniert und zur Sichtbarmachung Silber-gefärbt oder auf eine Nitrozellulosemembran (BA25, Schleicher und Schuell, Keene, N. M.) mit geeigneten vorgefärbten Standards elektrotransferiert. Die LPS-Blots wurden verarbeitet durch Eintauchen der Membran in 50 mM Tris, 0,2 M NaCl (TBS) und 30 mg/ml bovines Serumalbumin (BSA) bei pH 7,4 für 30 Minuten bei 37ºC behandelt. Die Membranen wurden dann in einer Lösung, die 2-4 ug gereinigtes oder teilweise gereinigtes rBPI(1-199)ala¹³² oder ein Kontrollprotein (entweder rBPI(1-199) oder rBPI-Holoprotein) enthielten für 12-18 Stunden bei 21ºC bis 42ºC inkubiert. Nach Inkubation wurden die Membranen dann mit TBS-BSA gewaschen. Die Lösung wurde mindestens dreimal in einer Zeit von 30 Minuten ausgetauscht. Die gewaschenen Membranen wurden dann für drei Stunden in einer Verdünnung von 1 : 1000 von Kaninchen-anti-rBPI(1-199) in TBS, das 1 mg/ml BSA enthält, inkubiert. Die Membranen wurden als nächstes mindestens dreimal gewaschen und unter Verwendung des chemilumineszenten Nachweissystems (Tropix Systems, Bedford, MA), entsprechend den Anweisungen der Hersteller, unter Verwendung von Sx PBS und 0,25 % Gelatine (Bio-Rad) anstelle von I-Block entwickelt.
Die Ergebnisse zeigen, daß rBPI(1-199)ala¹³² ebenso gut wie oder besser als rBPI(1-199) an LPS bindet, das an Nitrozellulose gebunden ist.
2. E. coli-Wachstums-Inhibitionstest
Der E. coli-Kulturmedium-Wachstumstest wurde durchgeführt, um die bakterizide Potenz der rBPI-Produkte zu ermitteln, durch Behandlung von E. coli mit rBPI(1-199) oder rBPI(1- 199)ala¹³²-Analoga und Überwachung der Inhibierung von Mediumwachstum als ein Maß der bakteriziden Aktivität. Ein "rauher" Stamm von E. coli mit Kurzketten-LPS, bezeichnet als JS (eine rauhe UDP-4-Epimerase-lose-Mutante von E. coli-Stamm 0111:B4), wurde in dem Test verwendet. Die Zellen wurden in einem mit Triethanolamin gepufferten Mineralsalzmedium angezogen (Simon, et al., Proc. Nat. Acad Sci, 51: 877 (1964), das E. coli besonders empfindlich für BPI machte. Die Zellen wurden gewaschen und in 0,9% NaCl auf eine Dichte von etwa 5 · 10 &sup8; Zellen/ml resuspendiert.
Etwa 5 · 10&sup6; bis 1 · 10&sup7; E. coli-Zellen wurden für 30-60 Minuten mit entweder rBPI(1-199) oder mit rBPI(1-199)ala¹³²-Analogen bei einer Konzentration von 5 ug/ml mit einer gepufferten Lösung (10% Hanks Balanced Salts, 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% Casaminosäuren) in einem Volumen von 200 bis 400 ml inkubiert. Zusätzlich wurde der Test mit entweder rBPI(1-199) oder rBPI(1-199)ala¹³²-Analog und 100 mM MgCl&sub2; parallel durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit 10 Volumen Nutrient Broth verdünnt, der mit 0,9% NaCl supplementiert war. Kulturmedium-Wachstum wurde dann für mehrere Stunden überwacht.
Die Ergebnisse zeigten, daß rBPI(1-199)ala¹³²-Analoge bakterizide Aktivität genauso potent wie oder potenter als rBPI(1-199) besitzen. Die bakterizide Aktivität von sowohl rBPI(1- 199)ala¹³²-Analoga und derjenigen von rBPI(1-199) wurde, wie erwartet, von MgCl&sub2; verringert.
3. LAL-Inhibierungstest
Der LAL-Inhibierungstest wurde verwendet, um die Fähigkeit von rBPI(1-193)ala¹³² an LPS zu binden, zu bestimmen. Ein LAL-Inhibitionstest ist in Gazzano-Santoro, Infect. Immun., 60: 4754-4761 (1992) beschrieben. Die Ergebnisse des LAL-Tests zeigen, daß rPBI(1-193)ala¹³² einen IC-50-Wert von 10 aufweist, der gleich ist zu dem von rBPI(1-199) ist. Diese Daten zeigen an, daß das Analog ebenso wie das Wildtyp-rBPI-Produkt um die Bindung an LPS kompetitiert.
C. Wirksamkeit von rBPI(1-199)ala¹³² in einem Tiermodell von lethaler Endotoxämie
Ein Tiermodell für Endotoxämie wurde verwendet, um die vergleichende Wirksamkeit von rBPI(1-199)ala¹³² und rBPI(1-199) gegen endotoxischen Schock zu bewerten.
Männliche ICR-Mäuse erhielten intravenöse Injektionen von 800 ug/kg Actinomycin-D und entweder 0,5 ug/kg oder 1,0 ug/kg eines Endotoxins (E. coli, Stamm 0111: B4). Unmittelbar nach der Injektion von Endotoxin erhielten die Mäuse eine intravenöse Injektion (0,5 mg/kg oder 5,0 mg/kg) von entweder rBPI(1-199) oder rBPI(1-199)ala¹³². Gepufferter Träger wurde als Kontrolle verwendet. Todesfälle wurden dann über eine 7-tägige Zeitspanne aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VI gezeigt. TABELLE VI
Wie aus Tabelle VI ersichtlich, wurde sowohl durch rBPI(1-199)ala¹³² als auch durch rBPI(1- 199) ein wesentlicher Schutz gegen die lethale Wirkungen des Endotoxins erreicht. Obwohl die vorliegende Erfindung hinsichtlich ihrer bevorzugten Ausführungsformen dargestellt wurde, erkennt der Fachmann, daß viele Modifikationen und Substitutionen im Schutzumfang der vorliegenden Lehre enthalten sind. So wird beispielsweise die Substitution des Cysteins an Position 132 oder 135 des N-terminalen BPI-Fragmentes durch nicht-polare Aminosäuren, die verschieden sind von Alanin oder Serin, durch die Erfindung in Betracht gezogen. Demgemäß der Schutzumfang der beigefügten Ansprüche und zukünftiger Änderungen daran.

Claims

1. Ein bakterizides/Permeabilität-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon mit bakterizider/Permeabilität-erhöhender Aktivität, wobei ein Cysteinrest an Position 132 durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.

2. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure, die den Cysteinrest ersetzt, eine nicht-polare Aminosäure ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Alanin und Serin umfaßt.

3. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei der Cysteinrest an Position 132 durch Alanin ersetzt ist.

4. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 umfassend, mit Ausnahme des Cysteinaustauschs an Position 132, von 176 bis 199 der ursprünglichen aminoterminalen Aminosäurereste von bakterizidem/Permeabilität-erhöhendem Protein.

5. Ein Polypeptid nach Anspruch 4, das weiter die anfänglichen 193 aminoterminalen Aminosäurereste von bakterizidem/Permeabilität-erhöhendem Protein umfaßt.

6. Eine DNA, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert.

7. Eine DNA, die bakterizides/Permeabilität-erhöhendes Protein oder ein Fragment davon codiert, das bakterizide/Permeabilität-erhöhende Aktivität aufweist, wobei ein Cysteinrest an Position 132 ersetzt ist durch eine andere Aminosäure.

8. Eine DNA nach Anspruch 7, die die Leader-Sequenz aus 31 Aminosäuren und die ersten 193 N-terminalen Reste von bakterizidem/Permeabilität-erhöhendem Protein codiert und ein Stopp-Codon aufweist unmittelbar nach dem Codon für den Leucin-Rest an Position 193.

9. Eine DNA nach Anspruch 7, die die Leader-Sequenz aus 31 Aminosäuren und die ersten 199 N-terminalen Reste von bakterizidem/Permeabilität-erhöhendem Protein codiert und ein Stopp-Codon aufweist unmittelbar nach dem Codon für das Isoleucin an Position 199.

10. Ein autonom replizierender DNA-Vektor, der eine DNA entsprechend einem der Ansprüche 6 bis 9 umfaßt.

11. Eine Wirtszelle, die mit DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 9 in einer Art und Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, die die Expression des Polypeptids in der Wirtszelle erlaubt.

12. Eine eukaryotische Wirtszelle nach Anspruch 11.

13. Eine Wirtszelle nach Anspruch 12 mit der ATCC-Zugangsnummer, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die ATCC CRL 11246 und ATCC HB 11247 umfaßt.

14. Ein Verfahren zum Herstellen eines bakteriziden/Permeabilität-erhöhenden Proteins oder eines Fragments davon mit bakterizider/Permeabilität-erhöhender Aktivität, wobei das Verfahren umfaßt Anziehen einer Wirtszelle, die mit DNA nach einem der Ansprüche 6 bis 9 stabil transformiert oder transfiziert ist, in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren des Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium.

15. Ein Verfahren zum Herstellen eines bakteriziden/Permeabilität-erhöhenden Proteins oder eines Fragments davon mit bakterizider/Permeabilität erhöhender Aktivität, wobei das Verfahren umfaßt Anziehen einer Wirtszelle nach Anspruch 11 in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren des Polypeptids aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium.

16. Ein Hybridfusionsprotein, das, an seinem Aminoterminus, ein Polypeptid nach Anspruch 1 umfaßt und, an seinem Carboxylterminus, wenigstens eine konstante Domäne einer schweren Immunglobulinkette oder einer allelischen Variation davon.

17. Eine DNA, die für ein Hybridfusionsprotein nach Anspruch 16 codiert.

18. Ein autonom replizierender DNA-Vektor, der eine DNA nach Anspruch 17 umfaßt.

19. Eine Wirtszelle, die mit einer DNA nach Anspruch 17 in einer Art und Weise stabil transformiert oder transfiziert ist, die die Expression des Fusionsproteins in der Wirtszelle erlaubt.

20. Ein Verfahren zum Herstellen eines Hybridfusionsproteins nach Anspruch 16, das das Anziehen einer Wirtszelle nach Anspruch 19 in einem geeigneten Kulturmedium und Isolieren des Hybridfusionsproteins aus der Wirtszelle oder dem Kulturmedium umfaßt.

21. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, ein pharmazeutisch akzeptables Adjuvans oder einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Hybridfusionsprotein nach Anspruch 16 und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, ein pharmazeutisch akzeptables Adjuvans oder einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.

23. Ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder ein Hybridfusionsprotein nach Anspruch 16 zur Verwendung bei einer medizinischer Behandlung.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Theofan, Georgia

Horwitz, Arnold

Burke, David

Baltaian, Manik

Grinna, Lynn S

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Stabile Bakterizide/Permeabilität- erhöhende Proteinprodukte und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 14

(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:

(A) EMPFÄNGER: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Bicknell

(B) STRASSE: Two First National Plaza

(C) ORT: Chicago

(D) STAAT: Illinois

(E) LAND: USA

(F) POSTLEITZAHL: 60603

(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Diskette

(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release, 1.0, Version 1.25

(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER:

(B) ANMELDETAG:

(C) KLASSIFIKATION:

(viii) INFORMATION ZUM ANWALT:

(A) NAME: Meyers, Thomas C.

(B) REGISTRIERNUMMER: P-36,989

(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 27129/30911

(ix) INFORMATION ZUR TELEKOMMUNIKATION:

(A) TELEFON: 312/346-5750

(B) TELEFAX: 312/346-9740

(C) TELEX: 25-3856

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 1813 Basenpaare

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(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA

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(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS

(B) LAGE: 31..1491

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(A) NAME/SCHLÜSSEL: Met_peptide

(B) LAGE: 124..149

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(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

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