PT1310558E - Produtos estáveis de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade e composições farmacêuticas que os contêm - Google Patents
Produtos estáveis de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade e composições farmacêuticas que os contêm Download PDFInfo
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Description
f&ODuíôt ismwis m iiofiimi mcmmmms
XiTOfOmS S& PEIME^BILID^E I ÇOMfOSIÇÔES
CO$TEM immmmmn m mmmçm A presente invenção proporciona novos produtos de proteínas bactericidas indutoras aa permeabilidade e composições farmacêuticas estáveis que os contém. 0 lipopolissacârida (LPS) é um componente importante da membrana exterior das bactérias gram-negativas e e constituído pelos polissacâridos da cadeia lateral 0, específicos do serotipo, ligados a uma região conservada do aligossacârido cuclear e ao lipido A. Ratz, Ann. Rev. Biochem. 59: 129-170 (1990). 0 LPS e um mediador importante na patogénese do choque séptico gram-negativo, que é uma das causas principais de marte nas unidades de cuidadas intensivos nos Estados Unidos da América do Norte. Morrison et al., Ann. Rev. Med. 38:417-432 (1987).
As proteínas que se ligam ao LPS foram já identificadas em diversos tecidos de mamíferos. Morrison, Microb, Pathol., 7: 389-398 (1998); Raeder, et al.f Infect. Immun., 57: 1054-1058 (1989). Entre as proteínas mais exaustivamente estudadas que se ligam ao LPS esta a proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP), ggs è uma proteína básica existente nos azurofílicos dos iáftoécisos poli mo rfo nucleares. A proteína BIP kisaiSS foi ig&Iâd:;·:: .> partir te reerittfiíc® per extracçâo em meie: ácido combinada ter; a cromatografía de ou por cromatogafia ae afinidade de E. coli [Weiss, et &.i», Blood, 69: 652 (1987)1 e possui uma actividade bactericida poderosa contra um espectro amplo de bactérias gram- negatívas.
Embora a proteína BIP seja citotóxica contra muitas bactérias gram-negativas, cáts há nenhuma referência sobre a actividade citotóxica contra bactérias gram-positivas, fungos cu células de mamíferos. A sequência aos aminoácidos de toda a proteína BIP humana e fc&mfcêm da sequência do ADN que codifica tal proteína estdto ilustradas na figura 1 da obra de Gray et ai., J. Biol. Chem., 264: 9505 (1989) que aqui se considera incorporada por referência (SEQ ID MCr 1 e 2) . 0 trabalho publicado de Gray et al. descreve o isolamento do ADNc que codifica a BIP humana a partir de um banco de ADNc obtido a partir de células induzidas com DMSO, pertencentes a linhagem celular HL-60 da leucemia promiolocítica humana (ATTC CCL. 240) . Amplificações efectuadas por múltiplas RCP com o ADN proveniente de um banco de ADNc recentemente preparado, obtidas a partir de tais células HL-60 induzidas com DMSO, revelaram a existência de vários ADNc que codificam a BIP humana em que o codão que especifica a vaiína na posição 151 dos aminoácidos ou e GTC (conforme ilustrado na SEQ ID l!B 1) ou GTG. Mléííi disso, comprovou-se também que as espécies de M;:io que utilizam GTG para especificar a valina na posição 151 também especificam quer a lisina (AAG) para a pttlçMís do aminoácido 185 (conforme ilustrado ncs sequências 1 e 2) um hbtk.hdó hs Móidtí clvttlstmçt (hMb nehMM po-sitao. : ; : U:1;.'·'. " ; -:- - -:,- :,-- y': X·:· ,ΐ: v-v-,::: pxóbélMM hbMtst-t pmie-ii & ahi-Mbcóg v. v-, ç v ϊ ·.·.· . ·.·.* .·. .·. V. -W .·. Sb t t < .·.*.· v- ·! ·: *> P·· .è. Ç.- ct '-.7 ·:;5- yq ir · ?; g’ k> tbt.tii)bsl -c-: M d* ha a y ti: hg q t s: t; t da té: esè 1 ftmtihe, hm região dc tetisimél C da proteína BIP humana isolada revela apenas eme actividade ligeiramente detectável. Oci et al., J. Exp. Med., 174: 649 (1991). Foi já produzido um trornSdutò do t^rssIhdX d da BIP, constituído aproximadamenue pelos primeiros 199 da holoproteína BIP humana, por métodos recombinantes, formando uma proteína de 23 kDa. Gazzanc-Santoro et ai., 60: 4754-4761 :/1//92: da patente de invenção WO 92/03535 i 2·£§·1 que desereve análogos e variantes da proteína BIP. A planeada utilização clínica de produtos de BIP para o tratamento de sépsia gram-negativa ncs seres humanos instigou esforços significativos para a produção de grandes quantidades de produtos de BIP recombinante (BIPr), adequados para incorporação em preparações farmacêuticas homogéneas e estáveis. Por exemplo, o pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que os requerentes são co-proprietários, com o número de série 08/072.063, publicada como patente de invenção WO 93/23540 [pedido de patente de invenção europeia n° 97010362./;, da autoria de Grinna, divulga métodos novos para a purificação de produtos de BIP recombinante, expressos e segregados por células hospedeiras de mamíferos transformadas geneticamente e criadas em cultura. A eficácia dos processos de purificação é ali demonstrada o propósito de produtos de células de CHC (em inglês CHO; transformadas que expressam Sbu qab codifica a sequência "líder" sfe 31 d® BIL humana e os 199 resíduos iniciais do terminal amino da proteína peibhii/iís:ç:çc:t« desenvolvida (isto é, correspondentes acs amínoácídos desde -37 e ’ 199 úã ID N° 2) . 0 pedido do patente de invenção co-pendente, de o® requerentes são co-proprietários, com o número d® Sólio publicado s»o sendo a prtércívi Pe autoria ás Theofan et ai. invenção 93/23434, d;s autoria da Theofan et ai., vis® novos produtos análogos da |>r * BIP produzida por via recombinante, resultantes da expressão do ADN que codifica S: gcd-iihíiiv i idcr is BIP ::· ÍJiSs: 191 Q;; -· t 19:9 BMldiOB ÍS t;ríuvlBi.l amino da BIP humusa fundidos som o 1199 ouc codifica região constante de uma cadeia pesaaa da imunoglobulina.
Os esforços desenvolvidos para a produção de produtos ae BIP ae qualidade farmacêutica para o tratamento d® sepsia gram-negativa em seres humanos ainda não permitiram obter resultados uniformemente satisfatórios. Is® razão fundamental para isso έ a natureza da sequência de amínoácídos da BIP humana e a natureza do ambiente da célula hospedeira recombinante em que os produtos são produzidos. Coma exemplo, é possível purificar com bons rendimentos produtos de BIPr biologicamente activas que contenham os 199 resíduos iniciais da BIP [BIPr (1-199)]
produzidos como produtos secretórios de células hospedeiras de OHC transfectadas. No entanto, os produtos de BIP isolaàos contêm inicialmente formas diméricas da EIP e também uma espécie de aducto de cisteína. Além disso, os pro dutos de BIP podem ser instáveis durante a armazenagem para valores de temperatura e de pH fisiológicos, daí resultando a fçsmsçla de outras formas diméricas e de aductos. Tais formas diméricas e de aductcs, apesar de conservarem a actividaae biBiôgi/Bm não são adequadas para incorporação em preparações farmacêuticas destinadas a utilização pelos seres kvi%@à£m-i A formação de dímeros o a :o9llyãvlT de aductos de cisteína são provavelmente uma consequência do facto de a BIP e três resíduos de de cisteína, tidos sloo celotâdoí dsvitxo d® r&gíb# do timmíuil oodsoo ú& BIP activa, loto
β, ' , S 1/5. tistilOÇ-SiC UV OÍTsíS ÍOitOS ponte de díssulfureto entre dois àos três resíduos císteína permite a formação de dímeros ou a formação de . .os de lioteruo o rosto oto rodíooí cisteína litro :vt citoplasma da célula hospedeira t/tt: uo sobrenadante da oír itera celular.
Os próprios produtos monoméricos da BIPr revelam :,00000 tsriâttit <g» td;its.„heterogeneidade em termos ÚQ número de resíduos do terminal carboxi presente em tais produtos. Pai exemplo, e difícil detectar o pio^oto de expressão de comprimento completo num meio que contenha as células hospedeiras transformadas ou transfectâdas com o ADN que codifica a BIPr 1-19 Em vez disso, os produtos de expressão obtidos a partir de tais células representam um conjunto heterogéneo de formas truncadas no terminal carboxi do fragmento do terminal N da BIPr. Com efeito, o produto previsível de comprimento completo (1-199) não é frequentemente detectado como substância que esteja entre as Formas de BIPr presentes nesse conjunto heterogéneo. Presume-se que a heterogeneidade da sequência de amínoácidos do terminal carboxi dos produtos de BIPr (1-199) resulte da actividade das carboxipeptidases no citoplasma das células hospedeiras e/ou no sobrenadante da cultura.
Um outro problema observado aquando da preparação de produtos de BIP de qualidade farmacêutica é a Poitorofo e partículas macroscópicas que fazem diminuir a homogeneidade do produto e tooirpê-o fazem diminuir a sua actividade. Uma ooo|iO:ti;plo farmacêutica preferida, contendo produtos do BIPr em conformidade com s presente invenção, ç-oopooioriua a poobmoaçdo de um agente tensioactivo que é um pblSdiw.ro i 0·:ρ.ioe:: ..· dó òdoooà de pol õO;OÍ|roopi.I;ioç - po J. .boai-Stiiãhod e um
::.-·**· .-::---:1 ·*· fv ··'· ·· V ·;· .··' v-.i /·>:: u ·····*·;····:·····-· ·;· -···· oo um ácido gordo com pclioxietileno e » Tçis combinações estão explicadas no pedido de pooouto da ií-Wdiyâo norte-americana depositado «imulcaneamente, co-oendente e de que os requerentes são co-proprietários, com
invenção europeia n" 94907963.6) e o i i afirma que possuem efeitos sinêrgicos na estabilização dê ptíiipopv/iddií farmaceuticamente activos, contra a iaumiççáb de partículas. A preferência máxima vai para uma csmòi mmu? lo em que o produto de BIPr se encontra presente numa concentração de 1 mg/mL em scluto salina tamponada com citrato (citrato 0,02 M, NaCl 0,15 M a pH 5,0), a quaL contem 0,1 % em peso de poloxâmero 188 (Pluronic F-68, BASF Wyandctte, Parsippany, NJ) e 0, 002 % em psso de polissorbato 80 (Tween 80, ICI Américas Inc., Wilmington, DE).
Nesta especialidade continua a ser necessário dispor de produtos aperfeiçoados de BIPr adequados para incorporação em preparações farmacêuticas homogéneas e estáveis. Tais produtos deveriam, de forma ideal, poder ser obtidos em grandes quantidades e rendimentos a partir de células hospedeiras transformadas, deveriam conservar as actividades biológicas bactericidas e de ligação ao LPS típicas da EIP e deveriam possuir uma capacidade limitada para constituírem formas diméricas e ϊ os de cisteína e ainda deveriam ser caracterizados por uma variação limitada no terminal carboxi. caracterizam por uma resistência á dímerização e à formação de de cisteína, o que faz com que tais produtos sejam muitíssimo convenientes para fins fgrtíttDSoí imo»:. A i:à?tnq;:âs tombfe fmmsomddlOmS orodotdm d* BIPr noe «s caracterizam per oro; maron heterogeneidade molecular no terminal carbcxi. A novíA; também proporciona novas sequências de ADN que codificam produtos de BIPr e produtos análogos, vectcres plasmídicos que contêm esse ADN, hospedeiras estavelmente transformadas ou transfectadas com os plasmidos, métodos preparatéríos recombinantes, composições farmacêuticas estáveis e métodos de tratamento. A presente invenção também tem por objecto análogos proteicos de BIPr que contêm um fragmento do terminal N da BIP em que um resíduo de cisteína na posição 132 ou 135 dos arninoácidos é substituído por outro resíduo de aminoácido, de preferência um aminoácido não polar, tãl coma a çerina ou a alanina. De acordo com um exemplo preferido da presente invenção, o resíduo de cisteína na posição 132 de um polipéptido que compreenda os primeiros 199 resíducs do terminal N da BIP é substituído por um resíduo de alanina num produto recornbinante designado por "BIPr (1-199) ala1" Também num exemplo preferido a cisteína na posição 135 de um fragmento de BIP constituído pelas primeiros 199 resíduos do terminal N da BIP é substituído por um resíduo de serina, dai resultando um produto recornbinante designado por MM: :1-1 3M reM'::!S · Sonsidera-se muitMMMao preferível um produto recornbinante designado per {1-193 ; que se caracteriza por uma menor heterogeneidade em termos da identidade do seu resíduo do terminal carboxi. Mas disso, a presnete . também áiqMga um polipéptido que compreende os primeiros 1ôb resíduos do teo:;:oio,M, amimo alP e que oooouai um codão de o a :;· a ο ο;·· na 193 . A presente invenção t&s&éfó 'cem por objecto sequências de AON que codificam a ersteinu Blêr e os produtos de fragmentos prdtèiées descritos supra. Tais sequências de ADN também podem codificar a sequência ildçç da BIP de 31 rauidadS a a aiaál aa da BIP. A presente invenção proporciona vectores plasmídicos ae ADN que se replicam de farsa aatônírra e que contêm ADN que aadifira os produtos mencionados supra e os seus anifioqõs e ainda células hospedeiras que são transformadas ou transfectadas estavelmente com esse ADN de uma forma suficiente para permitir a sua expressão. As célul as hospedeiras transformadas ou transfectadas de acordo com a presente invenção têm urra utilidade manifesta em métodos para a produção, em grande escala, de produtos da presente invenção que contêm a proteína BIPr. A presente invenção contempla também produtos análogos da proteína BIPr, sob a forma de proteínas de fusão que compreendem, no terminal amino, os produtos análogos da proteína BIPr da presente invenção e que compreendem, no terminal carboxi, urra região constante de uma cadeia pesada da imunoglobuiina ou uma sua variante alelica. As proteínas de fusão de tipo imunoglobulina/BIP de sequência natural vêm explicadãs no pedido de patente de invenção norre-amerrcana co-pendente, de que os requerentes são co-proprietários, com o número de série 08/064.693, publicada como féAífe a patente do invenção WO 13123434, da autoria de
Theofan, et ai. A presnete * wmipMts contempla oambérr de mencionadas
métodos para a produção oas ptíitéinsB cerca d* 176 e cerca de 198 dos ssMnoácI.db·* 13 terminal N da B11 r. Estes ADNs permitem produção de produtos do BIP em células hospedeiras eucarióticas, tais como a.s células;? dà 12-7,. qcddiiaéo tais aratutou tmt ms-rior der---1001 ntiludi em ternos dos nSdiifuas presentes no teaMiiusl carboxi. Preferem-se actualmente os ddmí que codificam 193 resíduos do terminal N da BIP (por exemplo, os ADNs que codificam a sequiduia líder de trinta 0 um aminoácídos £&ic£-«i>& do terminal N e um ou msis codões de paragem). Mais preferidos são os ADN que também codificam proteínas em que o resíduo de cisteína na posição 172 ou 135 está éáddiiéaldo (por exemplo, BIPr (1-193) ala13")
De acordo com um outro aspecto, a presente invenção tem por objecto proteínas bactericidas que aumentam a permeabilidade de SEQ ID N° 2 em que o resíduo de aminoácido na posição 185 é seleccionado entre lisina ou ácido glutâmico ou um seu fragmente, com uma actividade bactericida e que aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de cisteína na posição 132 está substituído por um aminoácido diferente.
De acordo com um outro aspecto da presente iaaèreiâò, proporcicna-se uma composição farmacêutica que baoséti uma proteína bactericida que aumenta a permeabilidade ou *ss seu fragmento com uma actividade bactericida que aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de cisteína na posição 13:2 e .ri 1 euu,·:!* ·;. UOC mínObdidO ulItltuS: u um i:*;il.4ddii Sidd O PObtb d* aluiu 1 iuiduuiutimé para
Ui .:01.: .. U , vi.’i j QU J :·· i ::· >· ·; f :S Γϊ’ίύο V::.í^-.-00 Í Ô V í U.::: USU» â negativas as 1 v: i d tu. 11 ú u 1 tOil a .tuuu" u ds luftutiuíS tdtdt suas sequelas, incluindo dddtdtdtdd t ara ou m&k
USSitlU: Ípiu u r dituinui u.tdt t síndroma do sofrimento anemia, trombocitopénia, respiratório do adulto, insuficiência renal, b ipbt&n mi o, febre e acidose metabólica.
De acordo com um outro OitpoOl::: da presente invenção, providencia-se uma oo:mpottlcd* téTSiêzêxtleà que iispiiu;la uma proteína de fusão híbrida e um diluente, adjuvante ou ttb-Oubt aceitáveis sob o pant-o de vista farmacêutico, em que a proteína de fusão híbrida compreende, no seu terminai amino, uma proteína bactericida que aumenta α permeabilidade ou um seu fragmento com uma actividade bactericida que aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de císteína na posição 132 está substituído por um aminoácido diferente e, no seu terminal carboxi, pelo menos um domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina ou uma sua variante alélica, em que a composição farmacêutica se destina a ser usada no tratamento de infecções bacterianas gram-negativas e as suas sequelas, incluindo o choque relacionado com a endotoxina e uma ou mais condições associadas, incluindo coagulação intravascular disseminada, anemia, trombocitopénia, leucopénia, síndroma do sofrimento respiratório do aaulto, insuficiência renal, hipotensão, febre e acidose metabólica. presente invenção, Proteínas bacteri-PQ 1:0 N° 2 mi me e ã ·:: i >1 ç:o ;i eeeáe %e t :m tom <me F1 ddld db 1 ipi dá, et! «ιοί úlílb
De acordo com um outro aspecto da proporciona-se um ADN que codifica uma Sv í íil S 10¾ 1 Ϊ5» VfiVS S: í 1. i Ul 1 resbbto de aminoácido na posição 185 | iibtíts: ou abldit; slilílMiit oo cts tat dctiTid&sfe bactericida e que que um mtdldca dá lisLdbbás na r gíferente. por um mimmmãe
De acordo com um outro aspecto da presente proporciona-se um ADN que codifica uma protéiaiss bactericidas que aumentam a MtsdMlidudfc de 33Q τη 2 ..·om ssít com uma actividade bactericida e que aumenta a permeabilidade, em que un: resíduo dd cisterna na ÚCík :;};ç 131 ddti tubõmltuldò por rm dMddáoi.Stt· dáfbOnntõ ·: em que o codão para o resíduo de valina na posição Ϊ5Ι se selecciona r;\d.; ·?. dTC oo 3T"d
Se acordo com a outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um ADN que codifica a ctrqyêrcla líder do aminoácido 31 e os primeiros 193 resíduos de terminal N de uma proteína bactericida que aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de cisteina na posição 132 esta substituído por um aminoácido diferente e em que c ADN tem um codão de paragem Imediatamente a seguir ao ífádà-o para o resíduo de ieucina na posição 193 e em que a sequência que codifica os quatro primeiros aminoácidos dos 31 aminoácidos da sequência líder foi eliminada.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se um ACN que codifica a sequência líder do aminoácido ol e os primeiros i99 resíduos de terminal N de uma proteína bactericida que aumenta a permeabilidade, em que um residuo de cisteina na posição 132 está substituído por um aminoácido diferente e em que o ADN tem um codão de paragem a seguir ao codão para o residuo íte
Ieucina na posição 199 e em que a sequência que codifica os qvstro primeiros ãMird^&didí:;·® doo 31 aminoácidos â& ; ' ; ,;V, ^.: :·. ·. ί· : '·'· · ' - ' ---- 0:0:·:0·ΐ.'·ί5ν: ' OvíS ÇiÇ: ΟΡΡί'Ο
que aumenta ou um seu fragmento, com umõ actividade bacterícida e que ooooois a permeabilidade, em que um booxobu; de cisteína na p&ê-lçã4> 132 ootá substituído por um em que o ceitil:' attbi ua gene marcador selectivo.
De acordo com um outro aspecto da presente incooçbo,. proporciona-se uma célula hospedeira de OHC tsausfPubUda nu transfectada de forma estável com um M;:u que codifica uma proteína bacterícida gue aumenta ou um seu fragmento com uma actividade bacterícida que aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de cisteína na posição 132 está substituido por um aminoácido diferente, de uma forma que permite a expressão na referida célula hospedeira do referido polipéptido.
De acordo com um outro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma célula de insecto, transformada ou transfectada de forma estável com um ADN que codifica uma proteína bacterícida que aumenta a permeabilidade ou um seu fragmento com uma actividade bacterícida que aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de cisteína na posição 132 está substituído por um aminoácido diferente, de una forma que permite a expressão na referida célula hospedeira do referido polipéptido.
De acordo cu?s um outro aspecto da presente intunuãu, proporciona-se uma proteína bacterícida que aumenta e
;cs urualbb 1 ou uo soo iougmeoòo com; orno ; v; ó-H bacterícida goo aumenta a permeabilidade, em que um resíduo de cisteína oc posição 135 está substituído por um OÍSi íidá-O óuO boio o oo co. lo acordo com um outro aspecto da presente iqiençáo, proporciona-se um ADN que codifica uma proteína bactericida oos aumenta a permeabilidade o um seu fragmento com uma ímtiíjdâdt oaccericida que a em que u;;. resíduo de cisterna na gc::; 1 çit 135 divtá stbsti-ttiúb por ;;c omllOlPldl PlllltlOt®» Fínalmente, a presente ipvãonlo também tem por objectc dCdtpvci.coió farmacêuticas estáveis compreendendo o produtb de proteína ElPr da presnete invenção no seio de diluentes, adjuvantes e veiculou aceitáveis sob o ponte de vista farmacêutico. Essas composições farmacêuticas são resistentes à formação de partículas oe produtes de BIPr. Essas composições são úteis no tratamento de infecções bacterianas gram-negativas e das suas sequelas, incluindo o choque relacionado com a endotoxina e uma ou mais condições associadas, incluindo coagulação intravascular disseminada, anemia, trombocitopénia, leucopénia, síndroma do sofrimento respiratório do adulto, insuficiência renal, hipotensão, febre e acidose metabólica. Há muitos outros aspectos e vantagens da presente invenção que se tornarão evidentes para os especialistas na matéria tomando em cousideração a memória descritiva pormenorizada subsequente, respeitante as suas variantes presentemente preferidas.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
A os por resultados da análise des EGPA-DSS (o nasalo que SDS- A figura 2 tlitofr ·.íV de BIPfi 1-193) e os efírctuâds per de BIPr (1-199) efectuada por CLER de .. de permuta por CLER de produtos de por CLER de produtos de
A figura 4 mostra os resultados tía análise de produtes de EI 9\ί:ο; 1··Α(Ρ9;; alaiJ£ efectuada por E catiónica. A figura 5 mostra os resultados obtidos fase inversa numa experiência efectuada com BIPr(1-199). A figura 6 mostra os resultados obtidos fase inversa numa experiência efectuada com BIPr(1-199) A figura 7 mostra os resultados de estudos de turbídez efectuados em composições farmacêuticas que contêm produtos de BIPr e que podem conter ou não ingredientes tensicactivos de tipo poloxâmero/polissorbato a pH 7,0 e a assàoçfto MmiasÃ. A descrição detalhada subsequente incide sobre o fabrico e as poopriodÉdos de diversas prEpitiçdor do produtos de BIEo que cobttteetdoo amu substituição do au: itujidlEsiidO uEltotEssii, Pito de forma mais específica, o acdoicrc 1 descreve um vEbtouo siuimpldlictstuvç soguobo o qual uo eoooioíd no bsdEEI i.cuou que cuouoto: a permeabilidade básici;* sáS introduzidas na sequência nitoltotidicâ. que codifica um fragmento exemplar do terminal N da proteína BIP e descreve ttmbfe a incorporação ae tais sequêrcias que sofreram mutação dentro dos vectores plasmídiccs. C exemplo 2 tem por objecto a incorporação de vectores do exemplo i em células hospedeiras adequadas e descreve ainda a expressão de produtos polipeptídicos do proteínas 31P recombínantes de acordo cor, s presente invenção. 0 exemplo 3 descreve a Construção dos ADNs que codificam os produtos análogos de ooíriti/tutÍpao do resíduo de císteína, de acorde com a presente invenção e a sua utilização com procedimentos de transcrição/tradução in vitro. 0 exemplo 4 diz respeito as propriedades do polipéptidos de produtos de BIPr incluindo polipéptidos de produtos de BIPr da presente invenção. EXEMPLO 1
Construção de vectores que contêm os análogos de BEP por ãubAitituiçád da cisteína A. Construção dos plasmidos pING4519 e PING4520
Utilizou-se o vectcr de expressão pING4503 como uma fonte de ADN que codifica um produto de expressão recombinante designado por i isto que codifica ur?í pôlipèptido que 31 resíduos e os primeiros 199 aminoácidos do terminal N da BIP humana perfeitamente desenvolvida, conforme é explicitado n: tCQ CD hci .. ·.·; , com η çxcepçJc tg c vtíctiã adi
v. r a·:.:· lisina ittidi por MG; . 0 plasmido pING4503 está descrito no pedido de patente de invenção norte-americana cs-pendente, de que os requerentes sâo co-proprí etários, com c de aév ié
Ok/Soí 693, publicado como sendo o documente da patente de 30 ^ da sotessla oo Osscos. éí: ai, Dite do forma obsoadadlác a construção do SÒUiOOÚote dllslded ib.siOSrisse no plasmido 0:0:0112334 e contém c elemento intensificador da cadeia pesada 3.a imunoglobulina do murganho, o elemento LTR retirado do ilidi do vírus da leucemia dos murinos de Abelson (A-MuLv), a junção da união 19S/16S do SV40 na extremidade 5' do gene que se pretende exprimir e c local de poliadenilação y-1 gencmicc humano na extremidade 3' do gene que se pretende exprimir. 3 plasmido pING2237N possui também um marcador seleccionável di-hidrofolato-redutase de murganho (DHE'R). 0 ADN que codifica a BIPr (1-199), incluindo 30 pb da região natural não traduzida em 5' e as bases que codificam a sequência de sinal de 31 aminoácidos e também os 199 aminoácidos do terminal N da BIP, e inserido entre os locais de restrição exclusivos SaJI e Sstll no pING4503.
Foram construídos dois vectores, designadamente o pING4519 e o pING4520, com base no plNG45G3, para a expressão de análogos por substi tuíção da cisteina da BIFrl 1-11¾ : em que um dos três resíduos de cisteina que ocorrem naturalmente, pertencentes a BIP foi substítu ido com outro aminoácido. Para a coílst S5sgte destes arquèti pos S/y V -í ! ·> ίν.,ί. .·» ο «de ;.ísí idbil Fvdll íClOCIO 3 qu.e e:sex,ss r: :·' SB Ví?.:;: se s.De sus codifica a iXsr (1-1:4: 1 S SK e eídtá Idlliom entre s e ístslsi 131 s a ad/iteioo -v .%·· ·.·: ; :'ji.V.w; ” vVVv::·;·:·. ·, ·, ·;..ν λ >* .·>. ···; .¾ :>>·-*·; V /
Stttv:: M -mm: r-:m icOdia Pvuli t o • :··;.·>· :h >* .·"· ·>’ -v ·: pr:UT:^.··. ·χ·ν tf): 3. ::*rcsi::tr GeS Ídídlflel 1111 proveniente de pING4503, por lií ÕO® iatebc:®Lar pUBitictat as EI?r (1-199} i&ll-S&tJ! foi depois d;.a®oM® oaa iottllo dai raatltar^a aa fragmento de SaIX~ fvíiil que possui ttr ixttmdó" ;n': :;à 52 9 ob e um fragmento de PvuII-SstlI que possui aproximadamente 209 pb, tende cada um deles sida purificado separadamente. v:·. 0 a·· com a watBftto de o pING4519 conter um segmento intercalar de ADN que codifica mm BIPr (1-199) em que c codão que especifica a cisteína natural na posição 132 é substituido pelo codão para a alaninà. Conforme se disse antes, o produto recombinante resultante da expressão da célula hospedeira e da transformação secretória de tal segmento intercalar recebe a designação de "BIPr (1-199) ala13. Para se gerar o pING4519, as sequências de ADN da EIP foram amplificadas por RCP a partir do pltitiiCI, utilizando os iniciadores BIP-6: AAGCTTGTCGACCAGGCCITGAGGT (SEQ ID ?·Γ 3), que incorporou um local de restrição Sall na extremidade 5' da região não traduzida da BIP de 30 pb e o BIP-14: CIGGAGGCGGTGATGGTG (SEQ ID H* 4), que incorporou metade do local PvuII e as substituições de bases necessárias para codificar a alar.ina na posição 132. A amplificação por RCP foi realizada utilizando o kit de RCP SBá&fep (Ferkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) em conformidade com as instruções do fabricante. O fragmente de RCP resultante foi digerido com Sall, dai resultando um fragmento de Sall com aproximadamente 529 pb com ilades a condizer, ;pe foi ·" ' * Λ -í com 0 f : descrito .1;tato ruvmv. oiçoçõç d® 1.; l.t peças, «
PvulI-SstII com aproximadamente ÔÍ19 pb supra e com c fragmento grande resultante da tò ::· i. o· ·.· ,i C O® 5 to. 9 e Ço ό I .m pot'9 00:0x 0 0 9- p Ufsríà.dw prilliSdi: e idênLico ao p1'h-'m11 excepção de o pING452Q conter ur: segmento intercalar de ABN que íPadifiae um análogo de 3IPr (1-199) em que 5 cedio que especifica is c iate lo a da tonal ta posição 135 é SubPoi/toliio por um codão da serina. Conforme se disse antes, o produto recombínante que resulta da expressão da célula hospedeira ο e ídênLíco ao com a de tal teípiOnro intercalar recebe a designação de !Xt ..;·. : efectuou-se a
Para se gerar o ilKpÍltf:btsç:;l:o das sequência da ADN da BIP por RCL a partir do pING4513 que é um plasmido essencialmente idêntico ao PING45Q3, com a excepção do o marcador seleccionâvel sei c gpt em vez de DHFR e d o segmento intercalar de ADNc codificar a sequência de sinal e a BIP de comprimento completo (456 resíduos) em vez de codificar apenas a parte da BIPr(1-199) . A amplificação por RCP foi realizada utilizando o iniciador BIL-15: CTCCAGCAGCCACATCAAC (SEQ ID 5), em que a extremidade 5' incorpora metade de um local PvuII que sofreu mutação (em que "CTG" ê trocado por "CTC") e as substituições de bases necessárias para codificar a serina na posição 135; e 0 iniciador BIF-7: GAACTTGGTTGTCAGTCG (SEQ ID ef 6) que representa as sequências que codificam a BIPr, localizadas a jusante da região que codifica 0 resíduo ill da EIP. Este fragmento resultante da RCP foi digerido com BstBI, que corta a jurante do local da mutagénese da cisteína 135, tendo o fragmento BstBl, com aproximadamente 100 pb de extremidades abrupta, sido putifícado em gel. Realizou-se então uma ligação de três peças com 0 fragmento de restrição de 529 pb da BIP, descrito supra, com o .... BstBl d-s 1.30 pb de exv.re:?n.dadeá cbrújvmr e com um fragmento grande remei-.1¾¾¾ se , nsre 1¾ ler .
Q. Construção do plaãPi.do nlRGvSSG
Construíu-se um outro rocoiorç c rIICS4r30? qmt continha a substituição da cisteína por alanina, tal come no pIGN4519, roa que continha c ãaçrcçdtr splwttb sriíJviíi gpt (que confere resistência ao ácido ídoí em vez do marcador DHFR, partindo do pING4503 para chegar ao pING4519. Para se construir o pING4530 isolou-se um fragmente de restrição SalI-DralII de i629 pb a partir dc pING4519. Este fragmento cOttiths a tçtãiidPd* da região codificadora de BlPr (1-199) ala132 e também mais uma sequência vectorial com aproximadamente 895 pb na extremidade 3' da região de codificação. Ligou-se este fragmento ao fragmento vectorial grande flrui 11~da.21 (com aproximadamente 7230 pb) isolado a partir do pING4513 para gerar o pING4530. C. Construção do plasmido pING4533
Construiu-se o plasmido pING4533 para a expressão de em que o codão que especifica o quinto arninoácido da sequência do sinal da BIP, a metionina (ATG) , na posição -27 foi substituído no contexto da sequência de consenso de Kozak de inicio da tradução GCCACCRCCTGG (SEQ ID N° 7) [Kozak, Nucl. Ãcid Res., 15: 8125 (1987)] e em que a sequência de ADN que codifica os primeiros quatro arninoácidos do sinal da BIF foi removida. Isto foi realizado amplificando por RCP as sequências da BIP E partir de plasmido qu e continha a ADNc da BIP ΥίΉϊ.ΓΗΐ ΟΘ comprimento completo t: o" : r : : '.λ C. ..C v. ..b'«h k3'·.! o para e
r r :v de ta -27 do da BIP, e o .a dor BIP-2: 9 9 •scur.-sds:':.: e i ” O 0--,3 ¾¾ · de codificação da ç-\ ,-v . ,.V. J.>. vv ». v vv -X .v w.»\.»< :./\AS’\A?Ví\.· i ·:· ·.*'*: Λ.:ν:·Τ.::.':Λ i. extremidade 3' da sequência i3 -cnp.' νο Λ' o ' pb, >:· ·?·’ 1 ,·'·:· :· m fraçmieppe resultante, de 270 pb, bino® aproximadamente ?:> ;:u: .:.10.1 tc cerco da seoalncia de
Ligou-se este de a outros dois fragmentos: íl.) um fragmento de PcoRI-SstlI de 420 obtido a partir de pING4519, que codifica a parte restante da Ei::t ib-listi , em que a alanina substitui a cisteína na posição 132 e (2) um fragmento vectorial de Sstlí-Sall aproximadamente o o 8000 pb obtido a partir de pING45G2 (um vector essencialmente semelhante ao pING45Q3, com a excepção de não conter a sequência de 3C pb não traduzida em 5' e de possuir um marcador gpt em vez do marcador DHFR), para gerar o pING4533 que contérn um marcador gpt. D. Construção dos plasmidos pING4221, plNG4222 e pING4223
Foram construídos vectores semelhantes ao pING4533 possuindo um segmento intercalar que continha o local de Kozak optimizado de inicio da tradução correspondente ao resíduo de metionilo -27 da sequência de sinal e com uma substituição da cisteína por alanina na posição 132. No entanto, nestes arquétipos assim construídos, a codificadora do fragmente da BIP terminava no resíduo 193. Cttcfctiiti CP dtí: ti icccs, o produto rsbi;ibissíÇf s que rsiuius
cl; ccmuCic: ámtm ?: 11 d 1 céitd. s: hDSpsddilS i C -yC C í dssigiibçds de '•dli i-r Ί-199 pb!Ul dl cu- cr C qUS ·:···: .···:··.·:· ~ u ·\ <·-. ·· .·.·, O- u--'t 4 O .: ;U 1:P Ç c os segmentes i s t.s t Pb 1 e rss foram est idut fazendo c.: - ; t sc pili-suss lugsr o 11. ure C S1.:. 11C C P-SSbP US :;:StrsPÍbtbf 5 1 p: <1 •'tçc·':'Pi ''‘ li r ··'*;‘17i:p'i‘u;':v>h. : ç: ;*-· ç,. 4-:1 1· ; C :v -V t . ror ..... .· .·.·. >·.· ·> ·: 3 sb 3
192. A seguir codificcu-se o í.t&sp&ht© resuleante que possui aproximadamente ISO pb. Ligou-se este frs-pisrrr dentro do fragmente grande resultante as ao com Sstll-Sail, conj 00:0 d-tis oligonucleótidos complementares recombinados, designada-
55555.5: os locais .0i**\e Sstll com: o codão 5,55..:55 o rótiou; 0· 193 (leucina), umi codão de paragem e um local de restrição Xhol de 5' para o local Sstll, dai resultando a regeneração dos dois locais lUíd-ll e SstI e a colocação do codão de paragem, TAG, imediatamente a seguir ao codão (CTG) para o aminoácido 193 (leucina;. 0 plasmido resultante recebeu a designação de pING4223 e tinha um marcador gpt. Foram produzidos arquétipos exactamente conforme descrito para o caso do pING4223, com a excepção de se ter utilizado fragmentos vectoriais SstII-sall diferentes para gerar vectores com diferentes marcadores de seiecçâo. For exemplo, 0 pING4221 & idêntico ao pING4223, com a excepção de conter 0 marcador his (que confere resistência ao histidinol) em vez do marcador gpt e 0 pING4222 é idêntico ao pING4223, com a excepção de conter um marcador DHFR em vez do marcador gpt. : £. ,4 :· v:·
Construiu-se um conjunto ds vectores que continham 55:0 ooogp;:·:55:.0 que codifica 0 Bife aio': ’u q X0-ta,, si® Ítptíiiiindc d® ioio:;:Uí dc dxadgddít c diferentes marcadores d® seiecçâo asa &U0.55:5.150¾ â 05555::0:55550,55.555 dos 050 55 55 0 5 5.COO® j5o:.5O:05 ,5.5 5. 0>i.4ÍdâOidòi i55 d5 :000 0.,5 0 : 0:'5ν'Γ o. 5:55 500:.-:: S.55: S 55 55 55.5.55 55 5555 '5.55 55:55: 55 0:.55 0555555 55 de na :550d.i5555055 55:5. 5 55Ϊ5550 550 05:00 λ .5 55 *5 05:55:.; ;g·" 1 50"::5:0:.:.C5i 5555:055::550: extremidade 3' do local SstII ter sido substituída por uma vtuuò;:vxu de poliadenilação da cadeia leve humana seguida pelas sequências de terminação da transcrição gescerloe da SãSSSw ; os e ik) ÍO .···=;:ç·;μ·::r:í;:;·.. Em estudos colaterais oe expressão dos genes, concluiu-se que a região de bessvmesde da transcrição e o sinal de poliadenilação da cadwia leve eram aparentemente responsáveis por aumentos de 2f6 a 5 vezes nos nieeis de expressão da BIP em íõiliuoa e 0HC-K1 (em inglês CH0-K1).
Os vectores antericrmente referidos fcram construídos preparando em primeiro lugar o piasmido pING4537 que é um vector semelhante ao pING4533 que sentém o segmento intercalar da 3IPr (1-199) No entsstbq o pING4537 contém as sequências de poliadenilação da cadeia leve humana em vez da sequência da cadeia pesada humana. As sequências k do murganho na extremidade 3' foram obtidas a partir do pING3170 que é um vector de expressão que codifica um ADNc da cadeia leve humana e contém uma sequência de terminação da transcrição em 3' da cadeia leve genómica do murganho. Isto foi conseguido fazendo a digestão com SstI que efectua o corte 35 pb a montante do codão de paragem da cadeia leve do nurganho, realizando o tratamento com polimerase ao ADN das T4 para pôr as extremidades abruptas e ccrtando depois com BamHI e purificando um fragmento ae aproximadamente 1350 pb que contém as sequências k de 3' do murganho. O fragmento resultante é constituído aproximadainante per 250 pb dá oarte de 3! do dDdo o a i constante da cadeia leve
Ivemadè e pelo sinal de poliadenilação seguido por um iissdor dotíli, soebtsms descrits a propôsdta do arquôtieò u . . ... .· pai iJ na νΐνού q® Lí.b. st: . , j.. Idevaesb 132: soss (1937). A parte stsdsnts do fragmento, sue pesssi 1350 pb, e constituída por um fragmento genómico BglII-BamRI da cadeia k de 3' do garis nesga [fragmento "D" de Xu et al., J. Biol. Chem. 261:
UddtU que fornece as sequeo·:: ::a;> de transcrição. Este fragmento tí?i ysii.Máò numa ligação 'á% trto peças com dois fragmentos provenientes de plNG4533: um fragmento de 3044 pb que contém todo o intercalar da BIP e uma parte do vector obtido por digestão com ryrl·· tratamento com a polimerase das 14 e digestão com Notl 1¾¾ compreende a totalidade do segmento intercalar da BIP e uma parte do vector) e um fragmento de BamHI-iVotl que possui aproximadamente 4574 pb. O vector resultante, o pING4537, é idêntico ao pING4533, com a excepçãe das diferenças anteriormente assinaladas na região gencmica não traduzida em 3 ' .
Foram construídos outros vectores contendo as sequências não traduzidas da cadeia k em 3', utilizando o plasmido pING4537 como fonte do fragmento k em 3'. às sequências não traduzidas da cadeia k em 3' foram isoladas por digestão do pING4537 com Xhol (um local único que ocorre imediatamente a seguir ao codão de paragem da BIP) e com BamRl. O fragmento de Xhol-BamRl resultante, possuindo aproximadamente 1360 pb, foi utilizado u m conjunto de ligações de três peças para gerar os quatros vectcres a seguir indicados, possuindo tcdos eles segmentos intercalares que codif íââm a BIPr (1-193) ala"" e que possuem 0 local de Kozak optímizado de início de tradução no rç.slduo -27 do sita.is (1) o " ' ' , obtido mediante a ligação de um fragmento SmtHl-dbfi de 4574 pb do PING4223 &pt\, um fragmento que contém 0 segmento iotebCraUr dã Bom roil BBío do ρΠΐ:Βί223 gy« pos.soi aproximadamente 3019 o b e c Xhol-Bamtíl do que possui idJdilll; 12) o pljiGilóB (marcador DbFBJ cbtido asedlànte a lipídio lo um Frapadio Fadai--030:11 úõ POPB21 ãpmxírr*8damest 4159 pb (marcador DHFR), um fragmento que contém o segmento intercalar de tbp Notl Xhol do pING4223 que pomaui aproxímadamente 3013 pb e o fragmento M.àc-X~êã&WÍ do pldSumbl.; p3 j o pniubiGÇ (marcador hís) , oíXX.áo moditrdní; a ligação de um ilíãPtãfdtb de BamHJ-Notl que Seutetl aproxímadamente 4772 pb que contém c mmrcmbor his do P1NG4221, im fragmento que contém o segmento iPièsrPiâLar de B1B Uotl Xhol do pING4222 e o fragmento a XnoI-BamHI do pING4537 ; e (4) o pTB^A IM (marcador neo) , obtido mediante a ligação de um fragmento de BamEl-Bsal que possui aproximaaamente 4042 pb que contém o marcador neo do pING3174, im fragmento que possui aproximdamerite 3883 pb que contém o fragmento intercalar de BIP Bsa I Xhol do pING4221 e o fragmento Χ&ϋΧ~£&&ΗΧ do pING4537. 0 plasmido pING3174 contém um segmento intercalar que codifica o ADN da cadeia pesada de anticorpos e possui um marcâdor neo, 0 gene neo e as suas sequências de flanqueio foram obtidos a partir do plasmido pSv2 neo divulgado por Southern et al., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1382).
Construção dos plasmidos pING4144 e pING4151
Foram construídos dois plasmidos, pING4144 e plNG41Si, que são idênticos respectivamente aos plasmidos pING4143 e pING4150, com a excepçao de as sequências de codificação d® BIPr estarem sed o controlo do íntensíficador cuja expressão ê imediata e ocorre em primeiro lagar do
A entre os nucleótídos $>'8 e 1708 dos vectores originais
Ip.Itetete -v: p!NG4150) tei ivtevY. .1 ;.u :.te por ·.;··:£: . d® idídasil: 1 óA:·:® ir/ prcdíteí:® do CMVh, correspondente aos nucleótídos desde -598 até ψ'ΙΉ^ conforme ilustrado na figura 3 da teve te te tear n et 1.te:.dl 41: 521 (ItfSte data se incrvteí; ir a região do promotor do CMVh nos vectores de expressãz da BIP, construiu-se em primeiro lugar o plasmido piWH%M substituindo o fragmento de pING4222f aproximadamente com 1117 pb, que contém o promotor EcoRI-Sail/IA-MuLv, por um fragmento obtido a partir do plasmido p±NG2250, que possui aproximadamente 1054 pb, que contém o promotor EcoRl-Sall/CMVh, o qual possui o promotor de CMVh que comanda a expressão de um segmento intercalar da cadeia leve de um anticorpo. Para se construir o plasmido pING4144 foram ligados conjuntamente três fragmentos: (I) o fragmento Notl-Xhol, obtido a partir do plasmido pING4538, que contém a BIPr(l-193), que possui aproximadamente 2955 pb; (2) o fragmento Xhol-BamRl, obtido a partir do plasmido pING4537, que possui aproximadamente 1360 pb; e (3) o fragmento de BamEl -Notl que possui aproximadamente 4770 pb e que contém o gene hís do plasmido pING4221. G. Construção aos plasmidos pING4145, pING4148 e pING4152
Foram construídos também os plasmidos pING4145, pING4148 e pING4152 respectivamente idênticos aos plasmidos pING4143, pING4146 e com a excepção de conterem te te te si te te; «tetete. ' sequência natural) .·_ ..... 132, e·:·: vez d® ime cte.vii r rlçte dt
Assim, os três possuíam um segmento intercalar de BIPr íl- .teib s teqteste® de Kvvte tetlterte.;;: te dv todartev
Os S « η®®CuV díí: Vs?CCe.,;:*®::®:; uC i.CA:SASUte.:Lv&® deeste®?::® a* c-a.·®'·®r a d áe tete®te:te/tetete;.íte d« poll-A da cadeia leve três plasmídos foram construídos conforme :g seguir iifqmpr três fragmentos: (1) o f ta cr:'0:: τ t qro conter a cisteína de tipo natural na |:uvxi:Ç;âo 132); (2) o fragmento * . ; possui aproximadamente 1360 pb, obtido a partir do plasmido pltituialt 1 í e (3) 0
BamRI~NotI que possui aproximadamente 4570 pb e que contém 0 gene gpt, obtido a partir do plasmido pING4223. Para se construir 0 plasmido pING4148 foram ligados conjuntamente três fragmentos: (1) 0 fragmento NotI-Xhol obtido a partir do plasmido pING4140; (2) 0 fragmento de XhoI-BamWI obtido a partir do plasmido pING4537; e (3) 0 fragmento BamRl-Notl qg® possui aproximadamente 4150 pb e que contém 0 gene DHFR, obtido a partir do plasmido pING4222, Para se construir 0 plasmido pING4152 foram ligados conjuntaraente três fragmentos: (1) 0 fragmento NotI-Xhol que possui aproximadamente 3000 pb, obtido a partir do plasmido pING4142 (0 plasmido pING4142 é idêntico ao plasmido PING4223, com a excepção de conter a cisteína de tipo natural na posição 132); (2/ o fragmento XnoI-BamHl obtido a partir do plasmido pING4537; e (3) o fragmento BamEI-Notl que possui aproximadamente 4770 pb e que contém 0 gene his, cbfiqç a partir do plasmido pING4221. C quadro I subsequente agrupa, de forma abreviada, 0 Ksçssa A a G anteriores.
QUADRO I
Enr 1 1 ρ,.,ν.οΐ ·:··:· v ^ DHFR* Apêndice poli-A da cadeia pesada γ-l genómica humana AMuLv : f DHFR* Apêndice poli-A da cadeia AMuLv j : : R>i Sei i pesada γ-l genomxca humana 1 i 3:- gpt Apêndice poli-A da cadela AMuLv : 199 *; ·:· pesada y-1 genomrca humana 1 t—--- - ! i Seq de gpt Apêndice poli-A da cadela AMuLv ] : 0 de pesada γ-l genómica humana : : Kozak; sinal ! 1 § 1 de 27ΑΛ I pING4223 j íi- | Seq de gpt Apêndice poli-A da cadeia AMuLv ϊ pesada γ-l genómica humana I
de 27AA ! í "í" iniciação de i I; Kozak; sinal ; de 27AA j hls | Apêndice poli-A da cadeia ί pesada γ-l genómica humana AMuLv i'"" 1 í 2l ·Α;: :i;· iniciaçao de : Kozak; sinal
CtR......PÃpêSdi ce poli-A da caãeia ·: pesada γ-l genómica humana ss-:’: iihi ·:Ά:· : Kozak; sinal ; Terminação da transcrição da ·: cadeia k do i í ϊ í cadeia k humana i AMuLv $:· i: i Kozak; sinal ;· Kozak; sinal • Terminação da transcrição da i cadeia k do : Ϊίίΐϊΐ φ SÍ&. í cadeia k humana AMuLv
Terminação da transcrição da cadeia k domurganho/apêncide poli-A dasáa d* cadeia k do AMuLv iniciação de ί ‘ í : ; »1 Λ n kh?:.·:. 1 j'A.hdl dA plUS * ' cadeia k humana i Seq de 11::-0 i : Terminação da transcrição da í cadeia k do murganho/apêncide poli-A da ; cadeia k humana 1 AMuLv '.......... i I Sec de ] 1 Terminação da transcrição da 1 : cadeia k dc I AMuLv í Kozak; SloS..: ! ΐ murganho/apêncide poli-A da ;_i_ :'ÍS oiK* 1 cadeia k humana ; í' l'v:,: v <: v ttts Sea ar- -DHFR 1 Terminação da transcrição cia AMuLv i i cadeia k do ; Kozak; sinal ! murganho/apêncide polx-A da de j cadeia k humana όίκώί Oi .í .i-197; Seq de his : Terminação da transcrição da AMuLv i- : cadeia k do • | ÍOu-ãÍg liçlii i murganho/apêncide poli-A da ! S»: líii 1 cadeia k humana stt:o:r:o Seq de his i Terminação da transcrxção da AMulv : iit: ibit" .....-:/...:,7 t; : cadeia k do i I Kozak; áiiét : murganho/apêncide poli-A da i ae 27AA i cadera k humana ’· Seq se neo | Terminação da transcrição da AMuLv Ιύύΐΐύ o."'" ' cadeia k do Kczak; sinal i murganho/apêncide poli-A da de 27AA j cadeia & humana * Um gene DHFR alterado conforme descrito no pedido ét j patente de itmtçât norte-americana co-pendente, de ipt tsp jrequerentes são cc-proprietdrios, com o número de série: iôSúSêl 693, publicada como sondo a patente de invenção éci
EXEMPLO 2
Transfecção de Células para Expressão dos Análogos de BIPr por Substituição da Cisteina
Os melhores hospedeiros para a produção dos análogos ás proteína BIPr de acordo com a presente invenção são as células de mamíferos, uma vez que pevítiitóm uma secreção conveniente, a e a modificação pós- tráducitsçô.l das proteínas expressas. As células hospedeiras preferidas, de tttá.ferae, para a -•mmi.Aio de imélocct ds IbYsmçãb sàc cu rélulã* de r-:t eu a νι νί, tris como; té.' :c tt de ái C DG1í dt Dé|4j, qt: ííC (O rttttt fj t í ;U: : 0 d.S T: v ;; ::· téiOd to o .· iótiét-tiO do ds . :X :: X ÍX ί 1ii (o mesir:o p&lo Dr. í;v: d d rio. reductase [DHFR], forecido pelo Dr. Lawrence ( Universidade de Columbia; células DXB-11 de OHC que i f que são células 1:1 de OHC de u: i ..is em UíUFK 3 for euid-i .OSOí U OtrtS OtOOS X Oí XXO X Λ.; x. iS V XOSOS : : X .:v XUbOO Λ X ΟΟΧ’ΧΟΙ· ‘.0 . . ... 'λ; X. '. ...... ; :: ::: : : X1 ; . X- X.; I ; : 1 : ' v ':; λ
Òi .-is -si: U. ::¾ :-U oixidlét m MhTÍâom. Sp2!S~%$!4 í&TCS Clliliê:d61; . e (ECACC n° οΐοΐιουό nso A trançfeccáo das células de mamíferos pode ser efectuada segundo vários métodos. Um processo vulgar ccnsiste em recorrer a precipitação, com fosfato de cálcio, do ADN do vector de expressão, o qual é depois incorporado pelas células hospedeiras. Outro processo também vulgar é a electroporação que faz com que as células incorporem ADN através dos poros das membranas, criados graças à geração de un forte campo eléctrico [(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Harbor Press, 16.30-16.3 1 (1989)1. A selecção das células transfectadas é facilitada incorporando no vector de expressão un gene cujo proauto peimita a sobrevivência e o crescimento das células transfectaaas em condições selectivas. Foram jú identificados diversos genes desses. Entre áPtros., é possível referir os seguintes: (1) neo, que é un gene procaríóticc que codifica a resistência ao antibiótico aminoglicosídico G 418; (2) gpt, que é a guanina-fosforibosil-transferase de E. coli, que codifica a resistência ao ácido niav-.i%nélico (AMF) na presença de Μ.ΐί'ϊίίΡ ί·β íSK-fX: '5' '5 >í >::-:·> *.« Ο’·'· !.;θ·: V S ::: V í W;? 1h- 2ϋ?2:-207 6 (trÓI-J, (3) , voa v c crescimento de tldta r a ttip] .lio :;xvs. fixei oecie vez óei células DHFR .t géníca na na de de presença í (4) v g 'í ':·
Proc. Nat. presença de hísLidinoi [Hartman et ai.,
Sei. USA, 85: 8047-8051, i [5- o gene trpB d:t E. coli IMmm et ai., fetou Nat. Acad. Sei. EUA, 85: 8047-8051, ufSOíj que permite o crescimento na presença de indol (sem triptofano); e (6) o gene da sintetase, que permite v crescimento em mcloa c que falta glutamina. A disponibilidade destes selectivos, por si sós du «jk combinações diversos, confere flexibilidade a geração de linhagens de células de mamíferos que exprimem produtos recombinantes em quantidades elevadas. A. Transfecção das células Kl de OHC (CH0-K1) com o PIUG4533 O plasmido pING4533 contém sequências génicas que codificam a BlPr(1-199) alalj2 fundida com o promotor A-MuLv, a sequência de Kozak optimizada de início da tradução, a região não traduzida em 3' da cadeia pesada y-1 humana e o marcador gpt para selecção de células resistentes ao AMP. A linhagem de células Kl de OHC é mantida em meio F12 de Ham com mais 10% do soro fetal de bovino (SFB) enriquecido com glutamina/penicilina/estreptomicina (Irvine Scientific, Irvine, GA), As células foram transfectadas Ptr
electroporaçâo com 4 0 pg de ADN de pl rii331 que havia sido dig&r-Mà sm; primeiro lugar com Noti e havia sido extraído depois com e precipitado com et anal. A seguir à electroporaçâo deixas-se as células em repouso guta.tcc 24 boras em meio F12 de Ham não selectivo. As r?» :; íoram então tripsinizadas, colocadas em 5 v 13:: u ;;:;. , \ . “A ·.(:? i-í.i. ióiÁÍ Àb.nllU SO. Ov; 3. tv:v 1.-0.314: .íÁrV· pç.;: ; ηΐ ·,·.. Λ ; ; :ύ: (250 e depois foram aplicadas placas à rorlc do 104 células/cavidade, em placas com 96 * ia; células Kl de OHC não transfectadas não conseguiram crescer ·!··;·<:· íí: íy :*; w·;;* ·· * ·/ ·/ y: \ 4;: Ί ··· <· οχ :.:-1:.:-, d :···· ·-:1 y / :·ν.; 1 // -rsn Τ ii1 -.30 /-/ν'; 1'
Decorridas 2 :rcçcc::,s.sy. foram observadas o:a/.í/ni.Mi constituídas pelas células transfectadas nas placas ae 36 continham colónias singulares foram analisados para se pesquisar a presença de proteína reactiva à EIP, em conformidade com um protocolo de EISLE (o mesmo que ELISA) anti-BIP, utilizando como padrão a BIPr(l-199). Nesta experiência, as placas de 96 cavidades de tipo Immunolon-II (Dynatech, Chantilly, VA) foram pré-recobertas com anti-soro de coelho :,:/.1--.112: )--) ,· purificado por afinidade.
Juntou-se as amostras de sobrenadante e efectuou-se a deteccão utilizando anti-soro de coelho anti-BIPr (1-199), biotinilado e purificado por afinidade, e ainda avidina marcada com peroxidase.
Por este processo foram pesquisadas aproximadamente 800 colónias. Foram trõnsfectadas 31 colónias, para as quais a produção atingiu os valores máximos, para placas de 24 cavidaaes para se fazner uma avaliação da produtividade. Deixou-se as células crescerem até -à confluência numa placa de 24 cavidades em meio F12 de Ham enriquecido ca® 10% de SFB. No aaaaanéa em que as células chegaram à confluência, retiroA-se o meio F12 de Ham e acrescento:-se 1 mL d& aaia H a -· ..a u ro a.a aaa caas a/-·····//·// adanta aa aara íXaaiãa i/uáaTVlifla:: tais: lâ μ,/ da eaiVaaiat da s-aapdara.aa Estéreis :P h a rma c x a, ^ - ·. patente de invenção aa---í::í:ai,da:ata a da aaa oa :ua:a,:ía:.aa aas pdbliaada: aaa a a/aat-a de • ;χόχ;:Μ; de patente de 1¾¾¾¾¾.¾ europeia n° 93913992.9), ãa xx: c.rχ,·: de xir.lnfxxm dxx déldlds fiaxxrssx a-atiç s Incnber durante 7 dias, após c «nus se efectuou a ramxxçlo das esférulas de S-sepharose e se fez a lavagem com NaCl 0,1 M am ' Iria 10 [pH 7,5). Macxxxx-x.·· xa Malaix: dc produto a partir das asférMãs: por edição de deli 1,0 M em tampão Tris e fez-se eme avaliação çventddev ivg em cí>:ixlsdiid,:dddd com c protocole de EISLE, conforme descrito supra. O transformante produtor, da parte de cima, d*:eMba.do por iulb, segregou aproximadamente 3 ng/«L nesta experiência e foi adaptado para crescer em meio Exceli Ml isento de soro (JRH Scientific, Lenexa, KS) . As células adaptadas cresceram em f ermentadores de 1,5 L em meio Exceli 301 na presença de esférulas de S-sepharose. Jççsl.lb'Sense a produtividade ao fim de 120 a 140 horas, por análise através de CLER em C4 efectuada ac produto resultante da eluição das esférulas de 'S-sepharose1 (aliquotas de 50 mL) . ?! produtividade foi de 15 a 25 pg/L nestas fases da fermentação. E. Transfecção de células DG44 de OHC ( o mesmo que CHQ-DG44) com o pING4222 O plasmido plNG4222 contem ACN que codifica o análogo de !ΙΡΜΙ·ΜΜί'Μ·8Μ'? fundido com o promotor A-MuLv, a leeçuixxxxlç de Kczak optimizada de inicio da traMbd-cn a çmgiic; Μ λ ΜμΗ:Μ.Μ em 3' da cadeia pesada y-1 humana e o gene DHFR do murganho, para selecção de células transiectadas em meio isento de wclseiyOs,
® Xx tíhi&mm x;á Μίνιων MM p.HÇ ÇÇ ;ÇX;j.X MI lã Ha® ÍSS.ÍS 11 :1 é& MB xx x:: g xáxÇ X; xx x. ç,e /; :.· e :x 1 - cl..·.·.?.Iaatrepçamíxin 3.·,.· M nc.-sxx· X--::- * Mabebxxaes ,.o das .xaMiae xxeç -MM Hf: > x r 1 xç... ir çIWB4 XXX jiÇ; X> X Ç-% I X. ΧίΧΧ X com trt; al em. etanol) , PIO de Wígler r.omaltc o
PfldCií; por meio MEMa a e com .Ε,ν,αΐ, tendo a extracção sido e a precipitação realizada utilizando ~ a tal e- ditado do fosfato de cl ' et til, Clii, 11: 223 (1977) . A espiir et tir íotristd de ãd s fez-se cea a elite ·;1.o dei eleaes da 96 OAel dêia, a retia ipiailínedi e cavidade, te ndo os transfectantes sido crescimento em meio selectivo constituído j que faltavam os nucleósidos (Irvine enriquecido oas SFB díalisado (100 mL de soro díalisado em presença de 4 L de NaCl 0,15 a frio. utilizando para tal uma membrana a deixar passar até ao valoi de ti 6000-8000, durante 16 horas a 4 °C) . As células DG44 de OHC não transfectadas não conseguem crescer neste meio devido a mutação do DHFR e à falta de nucleósidos num meio enriquecido com e soro díalisado.
Ao fim de 2 semanas, cada cavidade continha aproxima-damente 2-3 colónias. Efectuou-se uma análise dos sobrena-dantes das cavidades de uma placa de 96 cavidades para se pesquisar a presença da 111 r ;; Ί em conformidade com o protocolo de EISLE referido na secção A. Efectuou-se uma ampliação dos clones que mais produziram em 24 horas, em placas de 24 cavidades com meio MEMa aeidetlao enriquecido com 0,5 μΜ de metotrexato para induzir a amplificação génica do ADN que codifica o análcgo da BIPr. At observar o crescimento, efectucu-se a transferência das células para uma nova placa de 24 cavidades e avaliou-se a pra-dtt.:itioao;e a partir dos: pradotols da tloiSla das sadlértitt de S-sepharose, conforme descrito na secção A a oe siasctãAt ta -et aaeá tat iiaia prddirío ararass- ae a vp- ν·:;::: por diida.alo em piacise da ti cavidades, detttrasdo oa piotoocxte de rittl aíeaãuoa-ça wm dos sdwftis; «ο BdrO (1-193) islah"' nãs cavidades coo: os sobrenadantes que continham colónias singulares. Os 20 clones que ma is d&u«rs a expandidos em placas de 24 cavidades e submetidos a nova amplificação para se pesquisar a presença de metotrexato 0,4 glí,, te-oéo sido determinados pelo prob-ocalo de BISM os níveis de expressão do produto das células amplificadas. Os :..-..1-.1.0165, a saber, os clones 4, 75 e 80, segregaram 25-37 gg/od, em 1 dias numa pisca de 24 cavidades ove continha m esférulas de ' S-sepharose'. C. Transfecção dos células oploQ com o plNG4223 e o PING4221
Uma estratégia adoptada rtísraa tentativa para se conseguir a expressão óptima dos produtos de BIPr desejados implicou a transfecção de células, possuidoras de um primeiro plasmido de expressão, com um primeiro marcador, a pesquisa dos produtores de níveis mais elevados e a subsequente transfecção das mesmas células com um segundo plasmido de expressão, possuidor de um marcador diferente. Seguidamente descreve-se tal estratégia, utilizando células Sp2/0. de Kozak 0 plasmido pING4223 contém o ADN que fucdioa Cí® o promotor Λ-'όΙ.; Lv ;. de inicio da tradução, as 3' aa cadeia pesada y-i codi humana e e
pIWZ4:22$ eme 7077:2¾ 7 ida íl.lís775::2. dP “:,:r. 2251-:.:., realizou-se ;* extracção com f enoi-clorofórmio e fez-se precipitar coís etanol. % seguir à electroporação deixou-se as ... em repggg?:: durante 4 8 haras em AIPI: hão saelesetite·, A iéíHili efectuou-se a cimtidas células que foram 77777777:777777: colocadas em snuipAbíAld secundo um concentração de 5 x 1 Ó,;í ítti/ulserimi de MEMD enriquecido cem AMP (6 qf/mLl e AAntiriâ (250 qmdmld f tendo tide feita áApals utia ^píic-éçào d-e 104 iOèidtl&è/ cavidade em placas com 96 cavidades. Ao ollulea Spt/O não transfectadas tât foram capazes de crescer neste meio, devido à inibição da síntese da pirimidina por acção do AMP. Ao fim de 1,5 - 2 semanas foram observadas nas placas de 96 cavidades colónias constituídas pelas células transfectadas. Efectuou-se uma análise dos sobrenadantes das cavidades que continham colónias singuiares para se pesquisar a presença da proteína reactiva ao produto, utilizando o protocolo de EIÇLE. As colónias de produção mais elevada foram transferidas para uma placa de 24 cavidades e avaliou-se a sua produtividade em culturas extintas das 24 cavidades onde havia células a crescer na presença e na ausência de dexametasona 1.12' M, que é uma substância que induz um aumento da expressão pelo promotor A-MuLv em consequência das interacções com o receptor glicocorticoide. C melhor produtor, o clone 2X3, segregou aproximadamente 3 pg/rVÒ e 7 pço/mll respectivamente na ausência e na presença de dexametasona. A seguir transferiu-se o clone 2X3 por electroporação, conjuntamente com ο pllll 4 2 21, que ihíhtém o gene his para seleccão de transfectantes. Após a recolha, por um período 2a $3 Amfmg siri 77171:1 ímís 10 de Γ^1 .7 a o Ai.:; :iv y .V. v. :;< ;· ->7 7 X·: 5 vim 55754:71,, r fí 55 7, í;7 :Sp5!5;?:5 74:047:-:5 :17 777 o :---.::- a na imii: e hl st idlíiDl 8 tll> As céluJas não transfectadas não foram capazes de crescer na presença do histidinol e do AMP. Ao fim de um período de 1,5 a 2 semanas, foram observadas células transfectadas nas placas chi; 96 cavidades. ficcim® ctcs attttit· aa re ti nados das cavidades que continham colónias singulares pcri oSs r c· t -t 1 i t a i. :.¾ ρΓ5Μΐ:Α-«ι CCCt. .;.Va à BIPr, em t cr; fim Midi com o protocolo de EISLE.
Os produtores que mais produziram foram transferidos para una placa de 24 cavidades. Avaliou-se a produtividade nas cuituras extintas das 24 cavidades para células a crescerem na presença e na ausência de dexametasona 10~7 d., 0 melhor produtor, a saber, o clone 2X3-130, segregou aproximadamente 15 pg/mL e 30 pg/mL respectivamente na ausência e na presença de dexametasona. Este isolado foi depois sub-clonado por diluição limitativa em placas de 96 cavidades. As cavidades que continham colónias sinçulares foram analisadas em conformidade coin o protocolo de EISLE e os melhores produtores foram expandidos e novamente testados em culturas de 24 cavidades, na presença e na ausência de dexametasona i. u M. 3 sub-cione que mais produziu, ou seja, o n° 25, segregou aproximadamen te 16 iiMh e 33 pg/mL respectivamente na ausência e na presença de dexametasona. D. de célul as com piNG4143 e
O b: f siçcicc plasmido iIMiMl cutèi M ·« dirM': fiMidi cit: 1 C;V Klclk IpliftlSVlM; ç-e VíV v:.: :.C. :v: ..d;': t C : corn o aer.e o h M codifica ϊ p-mc ICPCf Mfclv, a ili.lil da t hcáiiMM, as lidcd 1 11 v i d dc fimi::.— gpt para i iliiMo dm transf ectadas por electroporação com 4C \iq de ADN ac pING4243 que foi digerido primeiro lagar com t
com fenol-clorofórmio e precipitado com etanol. A seguir à electroporação deixou-se ficar as células em repouso feasii 4 8 boras em AAilD não do :01:1.010.¾ foram então centrifugadas e novamente colocadas om suspensão, segundo orno concentração de 5 x 10’ ççl de llioo enriquecido corn Alt na concentração de 6 yg/snL e ooo; xantina na concentração de 250 qq/tio, s ó tolo sido aplicadas em placas de 96 cavidades a razão de 1 O OCO: . ·.:. 0 U / :1:: V j :.; -1 00: Λ
Decorridas aproximadamente 2 semanas cbservou-se nas placas de 96 cavidades colónias constituídas per células transfectadas. Efectuou-se uma analise dos sobrenadantes retirados das cavidades que continham colónias singulares para se pesquisar a presença da proteína reactiva a BIP, em conformidade com o protocolo de EISLE. As colónias que mais produziram foram transferidas para uma placa de 24 cavidades. Avaliou-se a produtividade em culturas extintas das 24 cavidades efectuadas com células a crescerem na presença e na ausência de dexametasona 10"' M. 0 melhor produtor, isto é, o clone 134, segregou apreximadamente 12 pg/mL e aproximadamente 28 pg/mu respectivamente na ausência e na presença de dexametasonâ.
Efectuas-se a oçniqlltçqii co clone 134 por eiectropo-racãc com um vector, a saber o pllllIStç que contém c 111 que codifica a ÍX-Px,|!~I1fundido com o promotor A-luLp u ccs'; t riçqtcSC: -cuc; ttooi .:·.·· o?'· 3' ii:S cadeia utos tc
lOliíSl.O00:::1 ÇUÇ O O 1:':: ;. O 0 tΠ 0 1: O 0.1.1 t U j. S; 1 1' U :1 C.S ··. ftvtãtlum.: · Antes da cictcsuqvu· iicão fez-se uigoosr
de 48 horas em MIKVJD mais 10 % de SLB, as células foram aplicadas em placas de 96 cavidades à razãc aproximada de i O* ;Bi 1 o 1 o o / sm pi do Ou em MKd D·/ 5 BB e: u ^ . c·: Ι. Κρ'ρΐ'ΐ . v:l 71: o" CCS na C00:Ç.í:UAtr'oÇ|o de 6 odudBB medo χ·ρ; clioa na concentração de 250 oíp>ÍPl, o hiótiíKimu! 8 mM. Ba cê K K; f-; Γ Β;: Π B r->> ô;*' .·· dik! d; não ddd&m capazes de crescer oo s do o,ec e do hist :idinoi. Ao fim de 2 semanas aproximadamente, fo r cim l-ídiidd colidi·!:toldso por délúkloõ nas placas de 96 cavidades. Efectuou-se uma análise dcs sobrenadantes retirados das cavidades que continham colónias singulares para se pesquisar a presença da proteína reactiva à BIP, em conformidade com o protocolo de EISLE. As colónias que mais produziram foram transferidas para uma placa de 24 cavidades. Avaliou-se â produtividade em culturas extintas de 24 cavidades em que havia células a crescer na presença e oa ausência de dexametasona 10"' Μ. O clone que mais produziu, isto é, o clone 134-11, recebeu a nova designação de C 1770. O clone C1770 segregou 36 pg/mL sem dexametasona e segregou mais de 42 ug/mL na presença de dexametasona. Este clone (C1770) foi depositado na colecção americana de culturas tipo (American Type Culture Collection, 21301 Parklawn Drive, Rockville, MD 26852) com o número de acesso HB 11247. E. Transfecção das células Kl de QHC com o pING4143
Transfectou-se a linhagem de células Kl de OHC ' , do p!N::3:4!43 conforme doscmloo na A a propósito da v. ::a a.: cocção das ç ç D:;: i o c Kl d··:· OHK com c pXKGKciÔ ,
Decorridas cerca de 2 semanas efectuou-se uma análise dos
·' .·:·:· χ,-,ρ ·>: ·.·:- U· > A- ·.·.· .v. ·.·. -,0..0. ·:·.·. U\:· x po 00000 1.0c ç oB:Í COV l-OOlOiO ·.; \\· Λ"·-.'-'·,·./. ··" .1 ·"· S CÓOÇ ..:1:00-: A paro *·*.*. ps:scco:oo;:·: o aa proteína reactiva g ~i r ,em oç: Π ! OBBd 1o de com v de EISLE. As sõKohc&c que ú-BÀ :o' .'X AO \v transferidas para placas de 24 cavidades. As colónias que mais produziram, tendo segregado aproximadamente entre 9 e 13 pç/rnL, pedem ser adaptadas depois a um titio sem soro rasas preparação para crescimento em fermentadores. Tdmiéó podem ser novamente transi ectadas com cm çmcfo p., por m.pópíp!o, o qltlQinSO ou c ρΙΡίΟΟ,ΟΙ oas oosevperpectivis"· merts cr ttlsssrv/vas his ou neo, para se obtar rms ii-Êià· psra :ás tèlvúm que pressa: nifti.s risada mais elevados do produto BI Pr.
Xransfecção de C-éXuiM Kl de OHC com o pING4l44 C piasmido pING4144 é semelhante ao plasmido pING4143 com a excepção de conter o promotor de citomegalovírus humano (CMVh) em vez do promotor A-MuLv. Efectuou-se a transfecçào da linhagem de células de OHG com ADN do pING4144 pelo processo descrito supra na secção A. Decorridas cerca de 2 semanas, efectuou-se uma análise dos sobrenadantes retirados de aproximadamente 200 cavidades que continham colónias singulares para se pesquisar a presença da proteína reactiva a BIP, em conformidade com o protocolo de EISLE. As colónias que mais produziram foram transferidas para placas de 24 cavidades e determinou-se a expressão da BIPr em placas de 24 cavidades que continham butirato de sódio. O clone que mais produziu: (c clone 174) segregou aproximadamente entre 3 a 5 pg/mL sem butirato e segregou aproximadamente 15 a 18 pg/mL na presença de butirato 5 mM nesta experiência. Este clone, redenomínado C Π“ v de culturas tipo í si:, ass. rã a: x ir mu barre, . . 'n 20852 5 como asmas; a arsísdibiso M:CIC com o a mm:;··-·: de acesso CRL 1124 6. Os cionpr qps asais i;bdedri2imsas podem ser adaptados depois ã u-s» meio rnss soro na preparação ?·.% ---/: o cci::rsr.is!s.íqr·;;. f ermentadores. tmi&êm rssssss: ser ;·:...... * -· novamente transfectados com um vector, tal como o pING4151 ou o pING4155, que contenha o gene da ElPr scb o controlo do oromotor CMVh, mas respectivamente com os marcadores his oo nm-x paro se obter 000¾ linhagem de células que produzam s:;aaaia ainda maís elevados de BIP. a transfecção de aélalas NSO com ADN do pING4143 por electroporação. Decorridas aproximadamente 3 semanas foram observadas colónias de células transfectadas nas placas de 96 cavidades. Zfectuou-se uma análise dcs sobrenadantes rei-irados das cavidades que caaaqi;:mã;P colónias singulares para se pesquisar a presença da proteína reactiva a BIP, em conformidade com o protocolo de EISLE. As colónias que mais produziram foram transferidas para uma placa de 24 cavidades. Avaliou-se a produtividade em culturas extintas de 24 cavidades. As colónias que mais produziram segregaram entre 15 a 16 pg/mL. As colónias que mais produziram podem ser novamente transfectadas com um vector, tal como 0 plasmido pING4150, conforme descrito supra, para se obter colónias que produzam ainda mais. H. Transfecção de células NSO com 0 pING4232
Efectuou-se a transfecção de células NSO por electroporação com o pING4132 que contém 0 ADN que codifica a 01 Pr (1-193) ϊΗνκΙΜρ com a sequência da Kozak optimízada de início da tradução, PlPitsdP dentro do vector pEEll et ai. Biotechnology, 10; XPv-lcf
Giclçfu j „ P dadtar pp£13 oòucéts o gene da g iiateídiáá -AirAaaccaa ata® a selecçâo a a transf ectantes que são capazes colónias aa cr sacar aam aaa.o carca c cicau a:: r 3 a aça a:a.a::a foram asas. a· raaaas&a células transfectadas nas placas de 96 cavidades. :·: y.vcd. se una análise dos sobrenadantes retirados das cavidades que continham colónias singulares, em confonnidade com o protocole de EISLE. As colónias que produziram foram ttrt cm o placa d* 14 davldíidéd, âYíSisitd-st a produtividade em culturas extintas do 24 cavidades. Ao colónias que mais produziram, tendo segregado ente 7 e is pg em culturas extintas de 24 cavidades, podem ser submetidas seguidamente a uma na presença de diversas concentrações de metionina-sulfoximina. "d Transfecção de células Sp2/Q com o PING4145 0 plasmido pING4145 contem ADN que codifica a BIPr(l-193)alal32 fundida com o promotor A-MuLv, a sequência de Kozak optimizada de inicio da tradução, as sequências não traduzidas em 3' da cadeia leve k do murganho e um gene gpt para selecção de células resistentes aos AMF. As células Sp2/0 foram transfectadas por electroporação com 40 pg de ADN o pING4145 que foi digerido em primeiro lugar Not I, extraído com fenol-ciorofórrnio e precipitaao em etanol. A seguir a electroporação, deixou-se as células em repouso durante 48 horas em MEMD não selectivo, efectuou-se a centrifugação e colocou-se as células novamente em suspensão, a uma concentração de 5 x 104 células/m.L em MEMD enriquecido com AML numa concentração de 6 tíg/wh e xantina na rzcã·:;: de 250 pg/mL. Depois fez-se uma aplicação das células em placas de 96 cavidades à razãc aproximada de 7D': o-ciui. soa •diuvm.dnio. Decorridas aproximadamente 2 semanas zοχ o;;:. observadas colónias constituídas por transfectadas nas placas de 96 cavidades. dispisis caio asoái tts ttiftõtstiffia toa scocísoò:ío;í s 0';i: W, XCXCOí; pesquisa -.n.-S.CX.CX. 0010-.0 0 0.-:: j X XX :j ·-: X:.-X PO Γ t 00 a presença Ma proteína reactiva à B-IP, em conformidade com o protocolo de EISLE. As uue ρ,οίο produziram foram transferidas para ama placa á& 24 cavidades e avaiiou-se a orooot ioiòufiois a™: e®:® ? u.tu* ® de z4 cavidades para as células a crescerem na presença e na ausência de dexametasona 10~' M.
Com o intuito de maximizar a expressão da BIP, o tçaçiiiitctaaiíi EpúifO que mais o rluíu :000 pode ser transfectado por electroporação com um vector que contém as sequências génicas que codificam a BIPr(t-193)ala^32 fundida com o promotor A-MuLv e com a região não traduzida em 3' da cadeia leve do our^opsoo-o que possui o gene his para selecçâo de transfectantes.
Transfecção das células Kl de OHC com c pING4145
Efectuou-se a transfecção da linhagem de células Kl de OHC com ADN do pING4145, conforme descrito supra na secção A. Decorridas cerca de 2 semanas é possível analisar os sobrenadantes provenientes de aproximadamente 500 a 100 cavidades que contêm colónias singulares para se pesquisar a presença da proteína reactiva à BIP, em conformidade com o protocolo de EISLE. As colónias que mais produziram foram transferidas para placas de 24 cavidades e determinou-se a expressão da BIP emplacas de 24 cavidades que continham 'S-sepharose’. As colónias que mais produziram foram depois adaptadas a um mLú sem soro na preparação para o CtíStçitittf;;: em fermentadores. Estas colónias também podem ooípppko selectivo diferente, para se obter uma liohogoP; c®que produza níveis oiooiõ mais ebíUvodoo du produto κ.
Expressão dos produtos de BIPr a partir de células de
Um otiSP::; sistema eucariótico em que os produtos de BIPr podem ser expressos é constituído por oéiaiso de insectos que tenham sido infectadas c c bacuiovírus rccombinante que contenha o ADN que codifica um r - ' de BIPr. Os sistemas para gerar vírus recombinantes e para se conseguir a expressão de produtos recombinantes a partir deles encontram-se comercialmente οΙορΟοιίν&Ιο (Invitrogen, Bso, Díego, CAd 1 0 ADN que codifica a t incluindo a sequência de sinal de 31 aminoácidos, foi clonado dentro de um local num vector de transferência pBlueBac (Invitrogen). As células de insectos Sf9 (BRL; ATCC CRL 1711) foram co-tranrfectadas com este vector e com o VPNMAc (o mesmo que AcMNPV) de tipo selvagem (vírus da poli-hidrose nuclear múltipla Autographa californica) (Invitrogen). As placas virais recombinantes foram depois identificadas, purificadas e utilizadas para se obter lotes virais recombinantes de elevada concentração, conforme descrito nos protocolos fornecidos por BRL. 0 bacuiovírus recozbinante produzido foi utilizado para infectar mais células Sf9. Pera se fazer isso foram utilizados 8 pratos independentes de 60 mm que continham células Sf9 infectadas com o bacuiovírus. De cada um desses 8 pratos foram retiradas amostras em momentos diferentes durante o dia, sendo para tal colhido o meio de um prato com odloldos infectadas. Após a colheita, centrífugou-se o morto «5 10Ό rpm durante 10 . e guardou-se o sobrenadante a 4 :r0 As células foram depois οοοόοοο;®®®: oma vez com 4 ;ho do: STP e submetidas o® grouetooo do ítitdl 00® ΟΟόροΟί.·: de oiOólhrte NP40 d rtríôí;· de 100 rd bat-Miiutdd poro ο I de &p:40··, dodl 110 ooo Ίο 1.r-HC,;. 10 Mi 'ptooo; de 1,'Sii efectuando a sobre gelo durante 3C minutos. As células foram depois recolhidas para dentro de um tubo de Eppendorf com um raspador de células. Os lísados celulares foram então ú&tõJàii&d·#* numa rnícrocentrífuga-dbfís SPrsPt® 2 minut:.-;.. TrÃuSÍSxib-mS« o OC t:..do lisado para um novo tubo a guardou-se a -20°C. As amostras médias de cada altura ao dia foram analisadas para pesquisa do teor cm BIP, em conformidade com protocolo ae EISLE, e os lisados foram analisados pelo método de Western, utilizando para tal um anticorpo anti-BIP. Não houve nenhum produto de BIPr detectável nesses meios, em conformidade com o protocolo de EISLE, nos dias 1 a 4 após a infecção. No entanto, nos dias 5 a 6 após a infecção, detectou-se nas amostras dos meios um pico de produto de BIPr da ordem de 200 a 500 ng/mL. A análise pelo método de Western efectuada aos lisados revelou a existência de uma banda reactiva a BIP que tinha aproximadamente 23 kDa, no segundo dia após a infecção. Essa banda revelou cmo intensidade crescente até ao 6° dia. O quadro II subsequente agrupa, de forma resumida, as transfecções pormenorizadas aescritas nas secções A a J supra
QUADRO II Célula hospedeira jTransfactada com
OiiCHlíÚb -,:v :b Ά puxcsxerr 11 OB λ!v!.1 itbi ,b;>: ,i· x.UiiV l.o: v ;yí: ASCi. ssss«WsspssssWssssW«w pf i;i G: 1.1 i ò ji p 11 -11 i i f biÍhbfú : V pi;b’ t ' ' r :· t cxópo.tt p.i.prs çtt. ,. ρ uttjs p:? p o btpocp plipli 1 ti, plPPbltS EXEMPLO 3
Construção de plasmidos para transcrição e traduçução in vitro dos produtos BIPr (1-199) ^ e BIPr (1-199) ser "5 rats.it realizados ©alados • rao.o • a-; âfy Λ / v·· V-.;; .·.·< vo .·>·. *. Λν*\V V ' ·.· ·Λ·. ·Λ V.’ vitro, utilizando o piasMdç pIC i27 como a fonte de ADN COdítiardor.a de : ' ' ' ' , 12 7 foi efectuada ranflPtasi a seguir se descreve. Amplificou-se por RCP o ADN que codifica a incluindo a sequência de sinal de 31 aminoácidos, a partir de um plasmido que continha o ADNc ae comprimento completo que codifica a BIP em paiiP-GGuf ;j , A amplificação foi realizada de tal modo que o local SalI foi incorporado na extremidade 5' e os locais Xhol e SstII foram incorporados na extremidade 3' da sequência que codifica a BIPr, mediante a utilização dos iniciadores BIP-3: GTCGACGCATGCGAGAGAACATGGC (SEQ ID d' 12) e BIP-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID IA 9) . C fragmento resultante amplificado por RCL foi cortado com as extremidades a condizer e clonado dentro do local SmaI da região d© clonagem múltipla do plasmido pT7T3 18u (Pharmacia LKB Technology, Piscataway NJ), com a finalidade de se gerar o pIC 102. O segmento intercalar pIC102 que codifica a MPrdfa 199) e a sequência de sinal de 31 aminoácidos foi depois excisado por digestão do pl&míds com BamEI e Aspl 181. Há um local Bar·Hl a ftàKrrasr r i ocaX Sail nc pTC ; 7 i ο 1:1 um local Aspl 181 a flsjunteat o Icarl \·ϊμ A--u-.-u·.· :G.d. < Ad extremidades do fragmento excisado foram cortadas com as po-dftt a condizer, dl 1 liando puru u .¾ I pr-lira; .·ν·:α· do ABP das T4, e o fragmento com as pontas cortadas a candimr foi havia sido digerido previamente mo® PstI e EcoRI e cortado cc-m ísíi ροχχχίχ a condizer com a polímerase do ADN das T4 . 0 arquétipo rtpyltMiió recebeu a designação de pIC124 e comtéjfc xeie o segmento intercalar que codifica a BlPríl-msbmnoaao da; Pai amdo que a sua extremidade 5' fica adjtcattÈ a aí pr-::.'Vd; cr Sp6 ao pAEili
Excitou-a* depois a moiplocix do pípo.1 d* 31 aminoácidos existente no segmento intercalar pidlEi removendo a região entre os deis locais Hindi existentes no pIC124 para se criar o pIC127. A região excisada foi substituída com um ligador que reconstituiu o codão de início (ATG) e a sequência codificadora do primeiro aminoácido da BIP. Foram isolados dois fragmentos a partir da digestão do pIC 124 com Hindi e SstI: (1) o fragmento Hindl-Sstll que contém a região de codificação da BIPr{l-199), com exclusão do codão do primeiro aminoácido; e (2) o fragmento SstII-HincIl ccnstituido pela parte restante do piasmido. 0 primeiro ccdão na sequência de codificaçãc da BIP e um codão para metionina em frente da sequência da BIP foram inseridos mediante a utilização do ligador formado a partir dos dois oligonucleótidos complementares recombina-dos, designadamente o BIP-28: GACGCCACCATGGTC (SEQ ID N° 13) e o BIP-29: GACCATGGTGGCGTC (SEQ ID N° 14). Esses dois oligonucleótidos foram ligados conjuntamente com os fragmentos Hincl-Sstll e SstlI-ffincII provenientes de pIC 124 para proporciona o pIC < PCeiam construídos dois plasmidos, a saber v pELIbl e o
Pb>*·:·: : ·. '.·· ';··· b'' '·. ·:: '··: ··'·. :··'·'< · : V ·;· ·>··. ·;; y« y <·*·. ;-:>· ..*·>:;·.>: > -y. --y. .-· <· ··* :··->> x ·*·· :·£.··:· 3 ,v·: ···.'··:· -:·>-·-·· ··· ·>·:·· í ·.·’· V. V. -X..-· X-; .λ ;-x>.·: X'. — -· ,·χ·: X- .s .... UvA·.··.·· .· <.· tv...- ·*··'·' vir.da BIPr Q-slEd ; s do E" P{ A- ; i); · r >a. 0.4-.::- fazer isto, fez-se digarir o pIC 12/ -crid.erll e EcoRI e otiidii b .Sb-· aa frapasAdq gda/raia da , Fama ,<·® um segmento construir o piasmido pAbldl,, gmo co;________ ·' ·; -1' \\·. y y‘ ·; ;·; ··;-· y-· ;·' ·*· ; ·.·.···.,;· > λ . ..... C... <·;. . . v ,.y -. :¾. y ·:· -./0-/1.-:-.-: "V:·: .Pí/trtp, «uéí >5 p :r i 1 <'/ iv! 1:¾ 5.;·:4 -4: 4 Í4 ;- PP//· f’: 1'oPoS/T/ti.;··;' fi/f Pp/Pl" v 5:00:/ 555 :</ p:i:c , *P 'u, FfuoS -/-5-: 5': móS t;;/ir : 5. .:::.55:5:5.::..:5:/íj pML POP:, . ::?.OP :;:p: 5t.5 Sm Pu: .ροβ/ΐΐ’:1 i.-íos ->v- ; -ίΐν'50, pr:; íí/'!:.·».::';. /'1 1, 'y .·. ·,/ .1:' 1 / :,//:.1 Ρ.,,/. /χ :-0-:0.:: :5 55. 5.:5: O;::) p.55PO% Oi:;- / í Ou ; :55:ό5|5ϊ:^ ¥ 5>:.?:":'51 λ- ó-cc/PS. ptWViú.&n /::0 -:¾. :V> >''1.1 Pó substâncias >/;" /.; v :: ^ ·'·. · ·. ·.· .· ·.·. . · 3 P -r-55-Ç 5 , ;· ·: V : " / - J. W ! S β Γ Boro i · ~ i PP; ·;:Ρ.ν'fora- - expressas in vitro a partir os 051 c eò:5:.5 :-v- PlC 127, -/,/:.. .; SP e pML 102 utilizando o Sistema do Lisado Tf .y,Çv .*: /...5 - ’Ί r.- v da (Madison, WI) acoplado ao SP 6 do çiptt Tal sistema permite a transcrição e a tradução acopladas de genes clonados in vitro, utilizando um sistema de tradução eucaríótico. Cada transcrição/tradução soopifÍiia foi efectuada em conformidade com os protocolos dos fabricantes, utilizando 2 pg de ADN plasmídico num volume total de 25 pL, idt::iu:Ísdc· a "Smo-c ti agi,:?:: g(. para gerar a proteína marcada. Os produtos proteicos marcados foram acrescentados em alíquotas de 5 pL a td pL dm: tocrpad dá amestra de ureia e foram aquecidos a 95°C durante 3 minutos. Foram aplicadas alíquotas de 10 pL de cada gmpptdd sobre um gel de poliacrilamida com 15 % de D8S,d na presença ou na ausência de DTT (50 mM). Depois de se fixar e secar o gel, as bandas proteicas marcadas foram visualizadas por demonstram que o :/PS;Sc qo:t codifica a BIPr ti-19ad , a EIPr(l-
Ido) c a S/P/S: ::,1-mppmii pPppuioê íoiuvtoiítod ,,,,,, o previsto de PP kDa para /o:;: çddtt;:f ç:.:¥ Se Bi dr : P>rl-PP; 5 P-IPc iPl-PS ::P: «líd " E r - r pcoiuoíUs de r PMpèriMM $de -:.¾. νο- mítlddtlBsuperior, cop o srupç:rud::o: vou;. ο-εο pors dtitotitt da /P/p iPP-IPP, e t:ttd.-pc: espécies maiores, oppípp desaparecido todas por redução com FFf, Presume-se . expressão de esoécíes yd ··: ·/· à y · ;>. ·>> ν:::··;χ: ··": 'b'' x> í yV.Í.vV.;·:: • .· ·.· . r X<*· .1 d; 01.0"""tí Fr il-ldd) .¾>in mx" i&mxl i adv se ter utilizado r::m sistema •b t: gnscr|.gp/rrM::gpc àn g p f i: " c isento de cêl.x las.. b;r. tal sistema a d; gg:rrd.tq gm £ ggggggfa gg a - d mâm immlt r « mmt i ff 1 çd o f Fdc.. , qyg η o rina lme rt t e iriam acs rr ® g na tgadugdíJ ggFgFM: P í pode suceder que as pontes de •d :>--:d í g r g t o ,·: d g g d o d s: g : • ·Χ· .Τ:-'·χ·ν·. -*··· ;·:> v v·' w se formam no in vitro, levando à fdOMçfc d« dírneros em alguns casos.
As proteínas marcadas, geradas no sistema de expressão in vitro descrito supra, foram testadas depois para se pesquisar a sua actividade de ligação ao LPS. As cavidades das placas de microtitulação foram recobertas com LPS proveniente de Salmonella minnesota R7 (mutanre Rd) (5 mg/mL numa cultura de reserva em metanol) em F;.yFTCg 0,1 M/EDTA 2Õ mM (ácido etileno-diamina-tetracético) a pH 9,4 (um total de 2 pg de LPS numa cavidade de 50 pLj . A seguir a incubação efectuada de um dia para o outro a 4°C fez-se o enxaguamento das cavidades com água e a secagem a 37 °C. M cavidades foram entào bloqueadas com 215 pL de meio do Dulbecco - isdWCb Χ·Ι de ASB durante 3 boras a 37 "C. Depois deitou-se fora a SNSliíçâo de bloqueio e efectuou-se uma lavagem das cavidades com oTIbbbí % de Tween 20. A seguir adicionaram-se as amostras de BI Pr 12 ul do reagente de ítàéQçàai a um volume totol do 50 pL um dTy/ígll 1 d-s Fgfegr, r- :: ι·:ν:·ν ::· ·: :-X -'·· ; '· !·'·: >·:· :;v x::: ·:;τ bdd·':b.''·- ·>' -:·· :l: ···:.:·: .d ··::;· ;···· X .·:·: v··. v -g- ---. ·;····.:·.·:· y ··;·*··.·*·. W ·::.·· x< .·.%·. x. x<·;·.·. ·::%% x. s.·.··.·.· >.vbs v. ·:-λ \,· ·.. a-, η \·. ··.,%:;;· \ ;-.b. çg.y.·. :>; ··.; 4 °C o iAUAgom doa g,s vgdg.d;yí: 3 ní sas o·.;:;·- dTd;:df.? 1 d-s Tween e determinou-se, ;7Xvde ..... ..... .....: . : qU0 : -:::: : -:- rví-.ís í;-
LPS supra. revelou uma ligação de 48.690 cpm; a espécie MFr(1-;.3dl da-- revelou uiva .Hfíoçâft rio 59.9Ϊ1 cpm; e i ?··.··· p-n··;·>··· ΒΙΟΙ;-: 1-111mil# ESMliri imo iii|ãç|:U v.:; 52.537 ορη. iiiio ..= y destes valores representa . médio de efectuadas em A ligação iMa à ror roípç a roo roorum·: ADN) foi de 5-395 c.pm. EXEMPLO 4
Caracterização do Produto A. Caracterização Física
Efectuou-se a caracterização dos piDikifis; de BIPr recorrendo â CLER de fase inversa (em C4), a CLER de permuta catiónica ?!SohCl» a EGPA-DSS e à espectrometria de massa por ionização por electropulverízação OEP-Iffe , Os produtos de BIPr que se pretendia caracterizar ferroo purificados a partir de colheitas retiradas de garrafas cilíndricas ou de uma fermentadora de 10 litros, quer -so conformidade com um procedimento de purificação de um só passo, quer em conformidade com um prdtidíifsoirirrt de oup:pgi&sçâd de vários passos. 0 procedimento de purificação de um só Olêll: foi e ssencialinente aquele que está descrito na pedido de patente de invenção norte-americana co- pendente, de que os req uerentes são co-proprietários com 0 de lêlíio 08/ //! n/iol, màníc 8::i8: 81188 8. 10/8/01:8 dl icsro-smçiçí ^ mn%- : 8 ) fdiyi Ò'i.iii’; patente de IdlldildOl i· 93913992 .9) d li; Oiiiltiml itt m toood: iidi realizado ma is um s:ç 1 '8.0: :.8:0 passo de lavagem. Dito de forma d·: d:-· ii V s- -::0:-.1 -ç·. . jOãtaoãSH. 08 sã 88 £ éois .:.:8:- ! 0 8 1---88111811-8¾ máiõ άν i; ·- x;p :··· ii y ;:·\ rn - ///11. do 01 itVi’,::ti Ti':-·>. B ;ΐ P Γ lo :1 li: .1 :-n .1.11 rl: rio: 0-----88:81¾ x -8 8 0 jf Γορ'νΐχΐ: rii'8‘ :i r i; :p .8 ;i. ip.iç .¾ :0: ¾ :d-p.-:,8d Í;/ — iíiOi!:; xj i(i li ?:::8 88; d* 8d0~ Í‘;; d;:j . £ Ρΐϋ.Α í::: t. Om -.'-/d procedimento de implicou a purificação dos lotes reunidos dos produtos de BIPr que haviam sido previamente purificados separadamente, conforme descrito supra. A seguir à purificação de cada um dos 20 lotes individuais de produtos de BIPr pelo método de um só passo, juntaram-se os Lotes e fez-se uma nova purificação realizando em primeiro lugar uma diluição da concentração salina dos lotes saturados, atá se chegar ao valor de 200 mM. Aplicou-se depois uma amostra dessa mistura a uma coluna de S-sepharoçe o lavou-se, a pH 4,0, com acetato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 200 mM segurnáo-se o tratamento com cloreto de sódio 700 mM. A eluição dos produtos de BIPr foi realizada utilizando acetato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 1000 mM a pH Qt Efectuou-se depois a análise dos produtos de BIPr purificados para se determinar as suas caracteristicas físicas .
1Análise dos produtos de BIPr por EGPA-DSS
r(ipAf ,-::,-:.¾¾ o As bandas proteicas f o r a -contrastadas quer COr~ e ooçtiO:'.t toei ot tirovoorovi quer por contraste com οοιοορ, oara
Conforme se observa na fiaura não i surgiu o;:: a forma cie uma iísodu gr .1 ot:Íf:>cÍ o;gcuracrcirÇf:*oL&íccucóíícs> com 23 kDa e ,.::-:¾¾ banda oicrccsrcdária coíO 40 kDa. i banda prinaipái d:n ideddicl-d&d.& como ancabe O aaaíbbfb F dbí: bd^bã a: Por :'Õ. £::=êf:.p.iá: ΐΐιώ. de mmtiimxiti foi dedada:bidada: como seaak: ama :0000:0 í:io;ò:sl:ò'.loo do produto B:I Fr :1-199) pdd' , d bdfdl d: ò íçdópaíí de 1/20 do volume dos -da.: 00::0:. re.;. ú-( 4 d ubbd s uma amostra separada de BIPr (1-199), o análise por FddA-dòid revelou a , - a..·. de uma única banda bem definida correspondente i espécie monomérica de 23 kDa da BIPr (1-1S 9) identificada em condições não redutoras, conforme descrito supra. A análise efectuada por EGPA-DSS ao produto BlPríl-revelou a existência de uma banda única que migrou com a banda única de 23 kDa da BIPr (1-199) em condições redutoras. Em condições não redutoras a BIPr(l-199) ala132 migrou eo-m a banda que migra mais rapidamente, pertencente ao conjunto das duas bandas bastante próximas observadas para a BIPr(1-199) (correspondente 1 banda de 23 kDa) . Estes resultados, ilusttados ria figura 2, indicam que 0 produto BI Pr (1-199) oisb:í: existe essenciaimente sob a forma monomérica após a purificação. Posto isto, os produtos :¾ BIPr em que 0 ássibaa de císteína ostâ substituído por um resíduo de alanina revelam una ^ tlfTil d;a:adi'a:: à formação ba dímeros.
bei :§ t: da rs 3 teor em dímeros :os de BIPr 0.10 :: í:?,:. o.s 0 11 til.· -y :: il i% ί·.;' ··!··" BB Ιοίοδ. f/ol. tw t t gogdgr ·<]; >3 ·· dw: 31 i..-·........ 1d o:d d: st, li' OQÍ. • Ι11···ο1Βορ t— :ddd): ilhrmtt t: at t:i 1 CiS; Otrdd::::: S ÍM. :O ô S* £.·,.· .· ίο;. ): i ::0¾ d pH 0. 0 : , itOír íti:'!. tOSi ,b dl '1 ..·. ç 1; : : :t. 1 ml s :.i; i Cl .· í:· ον·;:- 1:.:3-: t:: ; íio.. S: :0. í:Ot b: : u-osoí;: .to 0 v>..·; :v: 11:-:--:1 :·:’.·>> v·· ::· ·.·.· ·::. -:·, :o ·'· ::: it.tíu:,;:: w,ÇÍv ol: KKi :)0)(:/:0::1 „1 ‘i f;: B "Φ; VO. •V idl- 3.13 V >13: :·> *·.·?· ·.* :ts t dilui ri :a ·.> ÍÍBPÍBíOB:-·- .·»ίϊ .......·>' OvíU M. 3‘- 3 ·, Λ to r/oisg dtB db /..síTOOIo:· s Vi.ri i 3' Vi tJ: á -i to o: 000 s s gp: :o.;.: òsos, 0 lOS:ft m li. dU:; ·, .0.111: -:91 1 1 pd Í t v : t t to.t g-osl Osia/ororótcia •i A analise da BIPr(1-199) revelou a existência de dois picos. A eluição de um primeiro pico ocorreu cora um tempo de retenção de aproximadamente 3 minutos, conforme se observa na figura 3. A eluição de um segundo pico, mais pequeno, ocorreu com un tempo de retenção de aproximadamente 6 minutos. 3 primeiro pico, indicado na figura 3, representa c . ' ' da BIPr (1-199) « c segundo pico, ilustrado na figura 3, representa o dldtnis da o ido = · ··) :oio , conforme determinado por meio de comparações com os tempos de retenção dos padrões monoméricos e diméricos purificados. 0 segundo pico (dimero) não surgitu quando as foram reduzidas com DTT antes de terem sido injectadas na coluna. i-soso/r; praticados procedimentos Idênticos para se o betarão dt 00:0(0::00 do prcdbrtc; %€ Μ1.1Π- ( a dídtf íbtbd g*. gdsdt d s g:s tidgjrg 4, 1 g.osjOxÇgsí 0:0 0:0:)θ:0ο: 1 0 Biiils Π « il; dl: ):.00:. iírooid Svb Si Iffi '( 1;': -:3 çi >3 : ';··: d* : .. :-it s:o: to: odilO o:.ort:0:odo::S :.d 0:0: :00:::0 3 li! í:5. 0::::0.. 0: di-3'il.i: v 3 :i :. 1 |:· :¾ p :::: 3.«- .·>. ':·.·*.·* '·.·:·-"·.·* Ο'·.·**·.·’ ·*· ν.:·.·ν·.....·Λ···..·· *·* ; . ;·' ·: il 1: ;i. :i r ):/ • V; C;i dii Blnie.Btiy ··. s OíSOS ófosis 1λ'χ;: v·: t 3. Análise dos produtos de BIPr por CLER de fase inversa (em Cllç v por espectrometría de massa por ionização 'mi A f;
Por fase e poç 0000:0:::::00:::0^:0(0::010 do massa por ionização por .::00:.: o.o:: : :¾ -.1-- .0000::(: 'Ooovooo : : ; ç ;0 ϊϊ·.:\Μ:&η'ίί.ϊ. 1 iio/iç 0000: I de TFA) , a trabalhar uo;::; um ooooouohçi; 1 uu do 5 t e As amostras b:::uuM unta de i inL) de BIPr (1- 199) foram diluídas até a co oração de 100 pg/rnL, tendo sido injectados 50 pL de cada amostra. Lavou-se a coluna com a fase móvel B a 37 % durante Bló minutos e depois fez-se s ççl.ubi.çniioõ trabalhando com um gradiente de fase móvel a a variar entre 37 % e 50 %, durante 20 minutos. A fase móvel A era constituída por 5 % de acetonitrilo/0,1 8 de TFA, tendo a absorvência sida verificada a 220 mn.
Os resultados da análise dos produtos de BIPr(1-199) por CLER de fase inversa biilb indicados na figura 5. A eluição dos produtos de Bilro h.l--1 ulh ocorre revelando um segundo pico (principal) com um primeiro pico (secundário) parcialmente resolvido no bordo de ataque do segundo pico. Ao ser feita a :.2-:0.((.10 com DTT apenas ocorre a eluição de um pico na coluna, correspondente ao segundo pico. :í ;:::u".::íç: u c r cauvu uo-s PcÇÇã 3ii ·. .·. .·. .· : .·. 1 ΪΧύ Y ·· ··. ·:·: ·>·. ·.-· ·:···; .··:: ·: <··. ·:·: ur ·: :·. S.-: v-v ··.,·:*·..· Blrr · ]- :. i? u iç ;:;:i:;';:v Cçv f: mói:·::: çç rr ·': ns liçuru ò, s çu : ·:; ‘i .····· £ .·>'·; .·.·. ·.·. . .\ . V. ··;.·' çiç prsasto de ;*·* ;/ r' ( .« í :·· : UlUC "' f ççn : · ;·:··: .' UíVVÇ ;r;···.·.· -···-··: * :;-U ;y y- .Ç;.·;·:·. ç Çvbvs ú:::> SS::U :|çí..bm::;í ' iptimxpíii) f .n.1 iVztdO . ->s £:·· ·:·· *··; .· όίοίόοοοό: de «iuigl* K? oooloo:: doo o ao oeiooido p;i.s;és d* CLER descritos supra, a partir Por: tris lotes separados de o 0 ;·· ) ·ν. Ο Ο ϊ foram isolados e poo EM-IEP oara oo νΟο::θ.ό:Μη®ο < 05 OOUa COO '' ·?: 0.00 '.O.vv. da > ' que originaram o óo; ÍPtiocu-oolo ' ' .. „ :1-199) revelaram stra cocos lígeiramerite menor do que aquela que sstis de esperar a partir do uma ;·;.· ···; ;v· ·:>·· 199 aminoácidos. Tais dadas indicam que a massa mais abundante encontrada no produto de eiuição do segundo piro correspondia a um fragmento proteico de BIPr(1-193). No entanto, também estão presentes outras espécies com um tamanho desde 1-198 até 1-194. Ά análise do produto de eiuição que originou o pico único obtido por CLER efectuada ao produto de Brf r i i airevelou resultadas semelhan tes aos que foram obtidos a partir do produto de .: .. que originou o segundo pico {principal) referido supra. Estes resultados são consistentes com os dados de cartografia de péptídos que revelam a existência de terminais carboxi truncados nos produtos de BIPr(l-199).
Quando se fez a mesma análise com produtos de BIPr(l-193) , observou-se uma heterogeneidade do terminal C signi-ficatireduzida. Os dados de EM-ESI obtidos a partir dcs produtos de BIPr (1-193) revelaram que aproximadamente 85 % das proteínas õm&tò quer os primeiros 191, i93 ou 193 i> am resíduo de alanxna no terminal N) fmltioácidos do Γ >Õ;: d: çc:d: > p/i BXP, >o d): '' p:· v:; ip; m . ·.. '·)'dp·· :'ϊ):: ::::1/1 P d; Ç1; O ç ·) rm: :r :d::: ϊρ:Ί III.
QUADRO III
Resultados da espectrometria de massa por ionização por electropulverização para os picos monoméricos de CLER da BIPr (1-193) e da BIPr(1-199)
Produto de BIPr | Massa molecular ; Resíduos de I Intensidade previsto aproximada aminoácidos prevxstos ! relativa aproximada 50,9 ··· ;· ό··. > < 10 % i
i 1-193 + U i :V> i: OU
do terminal N
Apenas foram quantificadas as espécies detectadas que estavam! presentes m quantidades superiores a 10%. Estas espécies foram ; USií&S i ioSiiSiiíiú p:
Estes dadas comprovam que o AYN que codifica a BIPr(l-193) tfc produziu quantidades significativas da proteína BIPr (1-1993) de comprimento femylao passo que o MM que codifica. a BIPr(l-199) produziu quootlòiisec significativas da proteína BIPr(1-1993). Com base nestes e noutros dados, p.r- íhc:s:ííívucp que seja possível obter rviluÇôite significativas na heterogeneidade e aumentas significativos na pi:roi:ioçd:õ ¢1:0 pr U O £... ;: v:- ( X t 0 O, íiaro ·:** qual é possível c bter os zéâims de íuíusíuu: Ό do :3:.33:3 o ci i> :··;·.. " ;·:: : '>' ιϊ):,;,>.·> :)·'; gygvgs ;siii?vt:Ida s gesiiosi.dvoiç 1: Si ÍS'3 :¾. v ··; ;3 :: :» de ,:,'vtspe,i; od íoso f lit illivéiadí? fíiuiíiióiS citijicíoci ioi Oq: OCO íldOiliSlS s: vlvr, s Vi;: Opip íOOO :.·: V piiinniuuíle ίϊ,ηρΐη:, 04:33.0:0 u psssdio.usq i Ociiiiliosis: 3 3. 0'Si S S te ·:i:.i. 3·. +]. 393:,: g g;· -mm; ·: d Vi>‘Ç >' ç :γ: ç v: :-,:d úcvpgin ............7: 7, ... V'·. .. ttiç ' -Ú$,$ Mi: í!· i i até-b - is i leS:, et iti; ÚÈ. ϋίΐΐΐ:·:;·'; : S iie : mie t -·: ... Λ. ·,..y. •,e·.,.· .v, ç ·..· ··. n; :.le 1; i c dt is: ' ç:? 1: tnçe i. v;' 11. i ete: 10 ttsa ij: l’ Ç te? .:n·:::: v ':: f'·:';" mlè-ei yni.d)' 'ã t :0¾] V.i^íSSSí;
Os dados obtidos coç EM-IEP rwcl&taee também o presença de micro-heterogeneidade no terminal dos piéebimo;;ç de BI Pr. Foram etteab/t medes formas de produtos da BIPr que possuem um resíduo de alanina no terminal amíno, tendo a confirmação sido realizada por sequencisção dos péptidos tripslnicos.
Conforme se observa na figura 5, o estudo de EM-TEP efectuado com o produto da eluição que produziu o primeiro pico (secundário) na CLER de fase inversa revelou inexistência de proteínas que possuem uma distribuição de massas semelhante às que formaram o segundo pico (principal), com a excepção de cada valor de massa ser mais elevado aproximadamente 119-120 daltons. Estes resultados sugerem que a substância resultante da eluição e que produz o primeiro pico (secundário) na CLER, descrito supra, contém um aducto de cisteína ligado por uma ponte de dissuifureto, na medida cm que isso responderia pela detete ' -- observado nos valores de massa.
ilTlísl que o- :οι «cê ertqusá siitJiiabé;;,, mole de grupos apLtárll-e j . Dada a presença de •kunrront m; que há menos de ar lro'os,s por cada mole de I três rooionooo de eis das no na B1P nona posições 132, 135 o ' ': '.....'' .....' ^ ::v " v,‘ ^ Λ -j t reagence de Ellman. 4. estabilidade dos produtos de
QUADRO IV i mSíSikí V^VS!;. oií Sfesífís ; d&gs# 1 .%iíf í » V '«Wísi» 1 ’’ ’ ...... í: S#síL -,,ΥΪ'.Μ.·, :: í»!Í. ; Mi 3 ! ! ! l | ijj ; .'xo.·; : Cp. í d:v|iV^í; : j: Í&S! !>?! li ΐ· ..γ,. . v.v Λν.ν.ν.·Λ·.ν, ; 1 • ........—.....<........1. 1 1 : i: : '«-SiSSSSS:: ç «ddv f Ψ \ | I; ! ;:::1 ·: r :: : . . > ΐ :! ' ............ f 1 j ; ϊ • .. \ : ji •P: 1 d1· S y ;‘\i \ I j i ddíV : ...............i i | \ Ho entanto, â armaze nagem As temperaturas mais elevadas compreen didas entre 22 e 37 "C çv: i.iV::'.-· ί·: que a presença de dimeros e de partículas na amostra aumentava extraordinariamente e que a quantidade de aducto de cisteína aumentava de forma moderada. Estes resultados «stio agrupados no Quadro V. Além disso, quando a BIPr(1-IW:«1&132 foi guardada a uma temperatura entre 22 '-f: e 37 °C, não foi detectado nenhum dímero após um período de armazenagem de duas semanas. Em condições idênticas, a BIPr (1-199) denota significativos.
QUADRO V
Foram realizadas KXpM:Í:M\y\ii\:íi para ss aeoeváááádás e a tVáUáíái d>í: Íí de d:_í. az íá·. a' ar-ia >j- -c;K.S:|i· í^.í” .s: i a áááeiáêí.áá as z':; iz:;::;. ΐ: ·:;;ι·:ΐ:;: zi-::- e M Ir » õdf fáá eçapseáá O, n t&M. ât·^, .d:4SÍ-ld4: s íieeeiieááOá; ílssã competi iÇítáe Meme.zàútizm· cc edáteiCe ds .dd (isto é, perda da gacrut.·ece pcetecec idátazilriaí e/ee a 1 ceasiáς: i a d e ρ a d 1 i d c I a é ;/;:.c t dc d;::ç dés entre d e a t a· 1 r; g; s individualizadas que vão formar partículas de grandes dimensões (> 10pm)). As composições farmacêuticas testadas continham qualquer uma das substâncias Β10ρρ0"ΐΡ:ϊ; * BIPr(I-yup aiú!;;:'::: ou . 14"% quer em tampão citrato (citrato de sódio 20 mM/cloreto de sódio 100 mM a pH :%% quer num tampão citrato que continha 0,1 % de |K>íbXâSí&sPO 188 (um agente tensioactivo poioxamérico constituído por um copolímero de blocos de polioxipropileno-polioxietileno) e 0,002 % de polisscrbato 80 íum agente tensioactivo polis-sorbatc constituído por um éster de um ácido gordo de polioxietileno-sorbitano). Conforme se disse antes, a utilização de uma combinação de sistemas tensioactivos do tipo poloxâmero/políssorbato estabiliza as composições farmacêuticas, conforme preceituado no pedido de p.s-tesia de invenção norte-americana co-penaente, de que os requerentes sao co-proprietários, com o número de sério 08/012,360, deb<o:nltáPP:á a 2 de lOeáeááeimá de 1993 o publicado oááávo sêMis a patente de ImwnçdPá WO Oô/leccí;· (pedido do bciBBtc de áttáááá áá;i á·: : :: Ο á. á: Π v ::: : ; / Z· . Z : da Z: ·:.!. Z V ; Z U :á :;"á;: :Z ;;-: ai, 1 éC? SíáiÇOáé: : urine;.·:.-Í: á XáítS: f.Z ;i ,;i ÕBCz á: CSC ísi ei:.e ICSá&i sbóe ·οο: Imwo se '·’ á // i' >> / \ •'V u ·>·.. CíáSCá ;;á:á s; >; C íiááiáá :! ossisòrsi foram téU.ul· fl-l.: em símyçjií:; de i de $iitxãt& 20 sPl a até a O:00:0/¾ dea: 7,o. . em-o concentração de 0,1 oip:'s:::, potássio 50 m-i quer em 0::00::1¾ j ^èd:iç:-$:e:í;: Po t orbidoo Ícosd çfetldss colocando as amostras em cadinhos oOc. 1 :: viOdd. S: YUdl íOOplOOrd.ídiPPObd/o dó cipo Μϊΐίΐΐη'ΐ:; UV-1 í>ô uv.v-jfis (Shimadzu, Pleasanton, CA) s::polp:Odo com o suporte de cadinhos ccoo regulação de tO“5p¥:ítíst.:ars ligado a um nli vi ,ίν.ϊ. t. ί· ’ν'ν ΑΙ'ΙΑοΙη: il o.·" çpiçivipi; d ççt'?.,’;. Γ.2';::ç.ç. caTo vti Λ l.iíl í/l:'; 1. ;.U ;d:: ;ç. -ç) colocar era equilíibrio o sntpo-rtc dos cadinhos h temperatura prÇttoo.tP./t?í :õ'- "'Ce ii *:C o:,: 85 , a n&«orçêt:.tta a li d mn para se po?ífiict«T mm as o 0..::0¾¾ hsoiiíi: sida diluídas para uma concentração correcta. Depois dididx efectuou-se a medição do absorvência das amostras a 353 nm de dois em dois minutos durante 1 hora para se determinar as de absorvência ao longo do tempo.
Os resultados esrão apresentados na figura 7 em que o termo "formulado" se refere a um produto de BIPr em tampão de citrato que CiiAUcs a combinação de poloxâme- oofip:oj.it:tvsPaiç referida supra e o termo "não formulado" se refere aos compostos de BIPr em tampão de citrato por si só. Uma taxa reduzida de variação da turbidez (isto é, cou: taxa baixa de aumento da absorvência ao longo do indica um aumento de estabilidade ao desdobramento a à formação de partículas. Conforme se observa na figura 7, a adição da combinação de agentes tensioactivos referida
Mt&riíVfMi. .& origina um mmpiú de estabilidade i idsdosçãP Po m :0:. o-ic ioo e 01 S:i:.i-:01:.10Ϊ. 00 vgro ocoòis as louióiol cio:: Ç.óSlSdSO . Si.-0::: 000::0¾. as sdbM-teolPs ΒΙΓ.:. : v: cio: s ' 1 -1 ÓO : 1 1 0 ' v-;Ç>v ;X ν': -V ';·. <;: Λ:'; 0:0.1¾ odois.ls vime rllço a d ò-osiiabpimoioio: ··.. 1: f /.01-:.0: cie :··.·· ·.;.· .;.· ··. ;.·.· . ·. ·; ; V · .··. \ ·.· VOi^OÇCOCO;:; S.Ç Q-ύΨ·· « i> £-i;0i:;ip de ol;io o: 01: OS 1 ;. i.iSàS:0:-Çsíil€;r ;;; çj; * fsoxw ae ti :s csdibisàml-O · i - o :¾ r« ·-·-'· '·· " ...... .01¾¾¾¾¾.¾ íis.: li::::: si':. obtidos resultados semelhantes com os dsí pi 5,0 o 65 °Q « pi 5,0 g 75 5r · :is P, respectiva- mente.
As οίΐίίφΏ&Ιΐο^ίΐκ com a bçiídPdopdos de agentes 0:0:5:00::0.0--:OC-íu/'¥íO;6 Ο',/οο coít: e ítopsooPo-so;:: do o «sitio o do ciMitits ZW-iíixx^m s-àbró-tPio uma fiíttlttbllidíolo dam. ta u:: e atilo:;:;· ao lonao do tempo e em função dos aumentos do t€dtttd:situod# comparati vamente cora as composições que odo tinham nenhum agente tensioactivc e/ou que oooíAtlod: o arquétipo do terminal N da iiib.i: ; l··· 1 Pç de tipo natural. B. Caracterizações de actividade in vit.ro
Determinou-se a actividade in vitro dos produtos de BPIr(1-199)ala1" mediante a ligação dos produtos ao LFS, pelo teste de inibição de LAL e pela potência bacterici.da dos produtos.
1. b:ldç:edd éa Bi Pr (1-199) aia'" ao LPS
Recorreu-se a o de amostras (cada um com 20 μα a 60 pg) de lipopolissacárido da estirpe 0111-BA de E. coli ou do mutante Rd de 3. xijm&sPiã (Sigma Chemical, St. Louis, Mo) para se determinar a capacidade que têm os produtos de BIPr (1-199) olor'^ para se ligarem ao LPS. ddlll'l:ÍÇ;-ç:ç t&tebht: Ofbb ook; O toAS de t;;tt por i:t:ettoe:tte?»e:iri€:>· e:t. oxittlitidijtdíadç tots: o tiittooolç de ηοοη-DSS, tendo sida contrastada όθβ prata para visualização ou ': 'iS;:··' õleotoíol oeitòdí: rides paro oooo membrana de 00 0 X 0:0:0 j, iOOÓai
•X· ;·< -vi ·:-·: ···:· : :·: 1 1 PVb >,· ··._.·; ;. çy.-g:.:·. .ç, go': ::0 d o ç de o .ovit ·· o osooo: oo o t os o;: d os.- A tv * ib v :
A -·· b
0:0005:0: OOO isíuOoldes do ib 0,2 ϊ; e albumina
Kl» 50 iSoli ::!» iííyViíOO visai a a:a:a ciara: cta ação ia 30 mal ;al y Ϊ; ···; ' :> :.v .··.·<.·/.·. ·' 0· :v 3 ois 30 ;riη.:-: o o 3 >· .οχ-ο·..·:. >· o ··» ··.· ·.. v O a Ú$ 37 °C. ···· ·:> ·· .· -oa a tnyabau.fc òas oa mi·· ta a- aa ncoa οίνο :11:- aa D 0T>t 1 2 a 4 ua i;Y: E1 ; : i -.. :v: i ii... :V: raiaiiçada ou oarcí 1 y. p yí. yg S .UO :U":> ' >;-> Ç;;. ϋΐ,ηιι,ιοΐϊ'ΐνι laoar J;. ; · - - : ali ···*· r o íolourotrir O ilFri ·. ·.......... .. ... ··: ΧΧϋϊΧ uliXul::' Λ.·:'. Λ n: -;V:Í:: Γ;:1 uma te; ovoo 21 °C a 42 "li ;% aaaiai r a lo 1..·ν:· i.· :a; 1.-,:3:- efectuou-se a lavagem das membranas com A solução ívi substituída pelo menos tris vezes ao longo de um período de 30 minutos, ãs membranas lavadas foram iapsís: diluída a 1íWOú em STT que continha ASB na concentração de 1 íóu/tó,. A seguir efectuou-se a lavagem das membranas três vezes e fez-se a revelação utilizando o sistema de detenção quimioluminescente da Tropíx Systems (Bedford, MA), em conformidade com as instruções do fabricante, utilizando para tal STP SX e gelatina a 0,25 % (Bio-Rad) em vez de bloco 1.
Os resultados obtidos demonstram que a Matu~ 199) se liga ao LPS fixado à nitrocelulcse tão bem ou melhor do que a BIPr(1-199). 2. Ensaio de inibição do crescimento de E. coli
0111:Β4 de E. designada ppr á5 (é uma estirpe i :'··,··: g ; >Τ: ί::Γ> 0;·ίϊ: 1¾¾ V. ^ "r-mm?: (iq'(: p ------ d- — Açg ^ gb0 0¾ d· 0 ': > ίΐ;:· C'V;‘ X.''. 3;- 3 srBmCBnmm no meio que continha sais minerais, cem dííigtídvnlagiHm (Simon, et ai., Prcc. Mãt, jkrjoi Scei., 5i: 877 (1964)) gca fer ccm; fte c mi<^rv:efãni*::d5 dm d, cedi ílUsas mcmnivibl .1 BlSb Efdcecoe-----¾¾ o 1¾¾¾¾¾¾ das células que foram novamente eolosiadas em imrrr-dddBd numa iv0 Ϊ g; 0:d:O vç ç.:* :,,0 3(30 aproximada de 5 x ICd' ρΜρΙ&ρΡ&Ι· ,
Efectuou-se a incubação de aproximadamente 5 x JBB" & i x IO7 células de E. coli durante 30 a 60 r com análogos quer de BIPr (1-199) quer de BIP;:' (1-199) ala , para uma concentração ae 5 pp/a-L puma solução tamponada (sais equilibrados de Hanks c 10 %, 4 mM de Tris 40-HC1, pH 7,5; 0,1 '1 de casaminoácidos) num volume entre 200 e 400 mL. Aièrt disso, efectuou-se a experiência separadamente com análogos quer de BIPr (1-199) quer de BIPr í ir-ldSb sir^ e com Êiçdi;.: 100 mM. A seguir a incubação efectuou-se a diluição das dèidlPs em 10 volumes de caldo nutriente enriquecido com 0,9 1 de NaCl. Os caldos de cultura foram depois verificados durante várias horas.
Cs resultados obtidos demonstram que os análogos de a(i(r"" POSBUdis mr.s BCdB-ÇBdBbB bsctn-riciun ν:::η. •Mie p.;.m t-% Bo cue a BB Pr 1.:.---r b:?·.; < d. Mm':'..BB,BíB5;.Bv 5 nrsluí>ív:ç! de cur;:;- λ “ rmípnsrn " e de r-sr::r (1 — 19 9) )'Xifre v‘3 ·--3 3 í:' ;.>
Biçd 0:0:. 0 d:· Y'0 g 0 d-iri/srciiçõ:;; a mtêPÍmM du BíBB (1-193) ni0:;'í: oara se :l.igin: 63: descrita por Gazzano-Santcro em infect. immun. 4754-4761 1177 27: m&últmâm do mimiio ãú do
Lld, d«j?;«d:.atráid u::c; * 777Pt rX-~l'B3 J <ϋον':'': possoX um orlo;;: ¢77--70 a 10 ífso ê iposl as valor obtido para a BIPr(l-199).
;7S
Pis OSOgoris * V S1 dom ·;;v; o aio.
Utilizou-se um modelo de endotoxemia com animais para se avaliar a eficácia comprovativa das sáPOtiOciss BIPr(l-199)alalj2 e ' · ' -4dOi contra o choque endotôxicc.
Em murganhos da estirpe ICR (machos) injectou-se por voa intravenosa actinomicina D à razão &$ 800 pg/kg e também uma endotoxína (estirpe ClllíM de E. coli) à razão de 0,5 070/ò.g ou então 1,0 pokgo Imedí a Lamente a seguir à injecção da orrfetosioo administrou-se aos murqanhcs por iuppdcçPP por via intravenosa as ' BIPr(1-199) ou doses de 0f 5 mg/kg ou de 5,C og/kp) . Utilizou-se como contraprova o veículo tamponado. Depois efectuou-se a contagem dos animais mortos ao longo de rvs período de 7 dias, Os resultados obtidos estão agrupados no quadro VI subsequente.
QUADRO VI
| A|&M8 tspifiô | il I Blftvi | <>J me%jç i I " i i | I X® \ fi!?^j-cis | | í 5,03»!% I
Pi» sjfe BIF | W dte«Mb Mrte&f iàM | Vlenall^il® (%·! I ... \ sis MÍ5sá$ | ................ .......... % .................!..,_. im$ 7íl'5 m-$ —1' §.-: iÍ5 .4? 53 “1Γ 30
Con 5 o i't:;.sí 44 iicooioi do 5444dro VI, q&ãlqiwz das bubstâncías ».4':;' 4.-.4441 «]..4'"'" e BIPr (1-199) proporcionou uma :.4.434:.4:4:14 significativa contra ca efeitos letais da endrotx:na . Embora a presente Invenção tenha sida descrita em termos das suas variantes preferenciais, qualquer espe^xaxista na matéria conclui que há inúmeras siri i f i 4 o 4 ti« s 4 4 44 s 11 ç. 4.1- o 4-4' c que estão dentro do 5.:44 ,t. o a do $ preceitos aqui descritos. Por exemplo, a la do
que
feitas ae DA INVENÇÃO: "Produtos estáveis proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade e composições farmacêuticas que os ”
y & Bicknell (B) RUA: Two First National Plaza (C) CIDADE: Chicago (D) Eid'ÂDCc Illinois (E) PAÍS: :ν>. ÒÃ'/ L·*^ .V ύ, õ Õ-T 1 ΝΟΜΕ: Meyers, ΤΤο;::θίθΑ C. (Β) &ÚHERO 00 PEDIDO: Ρ-36.989
Oo PROCESSO: I
íix; -5- OOllÇyO PAPA TELECOMUNICAÇÕES : s /0 '* 'VÀ VOC.^. ;* ./0, :.Ç Ç „/ ·: 31 Λν !/ õ v (C) TELEX: 25-3856 i®rámhç& 0 FAIA T: FEQFlFCXA IP oF:C: : COMPRIMENTO: 1813 pares de bases T i ii:U : 00:01 00 0 00 ,i, 0' i OOO (C) TlPO DE CC?RDâí>: simples (D) 0.0..006/y O\0··:: ο. Αό o : :':"d :· V; ·:>. : : ·, ···. 342 CGT ATA AAT CAG CTT CCC ATT TCC CAG ATA AGC ATG GTG CCC AAT Arg ALg Fen Gin Leu Pro Ser Ser Gin Ile Ser Met Vai Pro Asn 6C 65 10
vai Ala Glí ile Asn Tir Gli Leu Vai Ala Pro Pro Ala Ire Ire Ala 205 210 215
AAI Asn soo sVl..: V*::';: Ala aro Pro Vai lei Glu fen Iró Ala Ala 240 245
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Glu Ser Vá a Arg Leu 370 375 lua LU- Leu Asp Arg Leu Leu Leu Glu Leu Lis Las Ser hm He 380 u'
Cii'l TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Xi) DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NU: 2:
Tf? SOí âi* La.:; :010: L:os Olu Leu 25
40
Lis n-e LU:··: His Lsu 4b Ζιΰ , Asa ' " Glu ;0;í:i 00:.:·;; Usei Pr o Ser
155 ?: Lis 2ί;Γ r 1\«1 11:
Gin 122 Cl::;; CXu Líí 181 x li:: -e .:¾¾ Ser Ia? Ala LEi. L95
Pro 210 215 2 30 1¾¾ Aso Vai ?11 p Met Lis 220 221 Pro Pro 2n 111 Ais 11: 240 ;:2x Asp Tir lli Fen Asn Tre Air Gli 1¾¾ 121 lir Gin Glu Aia 260 L 6 5 270 pi 1H 2Θ0 205 290
Fen Arg leu Tír Tre Lis Fen Feri Gli Tre Fen Lei; Pro Glu Hl 295 300 305
Ais A,,s 12:s IS::;:: Ms 121 Lis Ile Gin Ile lis Vai Ser Ala Ari 390 355 345 ;:isi Hís 11 360 >22 Asn Ser 122 Ala 350 Gli Ser 1X2: Glu 2gl 22;: 365
' ·" ; :X: ·' - ........... --..... .........''" Í^T rCá:?;: DA ; (B) TOPOLOGIA: linear (xi) OAiLOnO DA S£Q8PiCl&; SEQ ID NO: 3 AAGCTTGTCG ACCAGGCCTT C 25 ¢2) immmçh PARA A SEQUENCIA ID 00:· 4: ! i. Í.DOOA .i-o i. Aí. Aíi í (A) COMPRIMENTO: 18 pores de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOLGLOGIA: linear y v·· 00- í, I,: :·.?·. v ÍV: vi,·."; :.S\. v 1.;i ív ·>: ·;· v,v y y;vy λ A-l , ... ;í$:j & í' íí S;.·": ÍÍ-.
1D NO áí'3·'ppÈtí '5Γ.ΐ'ν * .1¾¾.¾.¾ 18 (B) TIPO: âeiiiv mKOpimp {C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear ;11 ii T 1PG DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DEPPAiÇÃô CA ÕPQOilICrA: SEQ GAACTTGGTT GTCAGTCG 18
ID
INFORMAÇÃO PARA A SEQUENCIA ID NO 7: ,:s.k íp (A) COMPRIMENTO: 10 pares bases (B)
DE (D) 8 :
~ Ό’ ' . Ε\ SSQ ID I CAGGGGC 27 ΑΟ&Ο RARA A OITçi-tOC70 ID ΝΟ: 9: 1’àl COMPRIMENTO: 27 pares de bases 76: TIPO: ácido nucleíco íCj TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE OlOjOIOR.: ADNc (xi) D:goC7KlÇÃõ TUA SBOCfKTA; SEQ ID NG: 9: CCGCGGCTCG AGGTATATTT TGGTCAS 27
(3) TIPO: ãciao nucleico (D; IilÃllllllA; linear ;; DiSClUiDÃC) DD. SEQUÊNCIA: SEQ DD NO: GGCTCGAGCT ACAGAGI 17 INFORMAÇÃO PARA 4 SEQUÊNCIA ID NO: 12: (R) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear ; ÇEQ ID NG: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) UlÇlCKlçÃD DA OEÇ pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico m TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPQLOGIA: linear OH) TIDO DE ROObCoIAo ADNc pou DEaiaOPOÃO DO SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14 GACCATGGTG GCGTC 15
Lisboa, 28 de Agosto de 200
Claims (6)
- 2 n dd t n tos í&íí pm ossta h 1.11, o s d s o im è SEQ xd dd:: 2, EÃOSEtsídoadd peio facto de :··. reeidrto iiisiiSo-ècMd 0:¾ dvoiçdí:: 185 ss sêXddCiddso mtm liei ο.·: oío ··:· . : ó ΟίΟΟΧΟ âòid;:· teto tátilCd se :td seu frdddwdd bsdtddixtlda indutora da permeabilidade, em que ;.o í'tÍI:1dò.ít dt disCsiOS; et ptíSipSi; Lid aittli íétidllÉcid:" pso um aminoácido diferente.
- 2. Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo facto de compreender os 193 resíduos aos arninoácidos iniciais com terminal amino da proteína bddts^rictids indutora da permeabilidade. 2 Polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender os 199 resíduos dos arninoácidos iniciais com terminal amino da proteína bacterícída indutora da permeabilidade.
- 4. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um polipéptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 e um diluente, adjuvante m? veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Zimpo&xçm ían-m d ^ :¾¾ oeoeedSeCo Mm&C CCd ptOdC 3t inápt ore tis pá« ab ;· díxèedt vt iit id imwmntp cm ytipiiiãde bavttt ÍOÍíÍOí 1 teto t oítts d λ.-ti $ -:0 qoe te. rSUiUí. UXiO· tit tm.stoSidt cdiOidí:: 131 dé ui >· ·' \·ί ··· ···:·· ; esft t dissottty.tíi * i 0 d> .<·:·: ·:'·;···· :'·. u ν.'.ν.-· v> Λ. i Oei; x.S f ό·': o ϊTs: i tO t •n.ruO': ·,·:··.; yn otite #ft : » ·>; V ó 0' ;Íi:. C Ó ’· : tt,®'.; e as suas sequelas, i ncluindo xmmq: ΐϊ: *:: .1.ui m.hÇ.v:. pok; com endotoxinas e uma 0 ma is mm viu·:!. ircmmipçuus a eia, incluindo coagulação ioirommçurbar :;P, sskãâ, mm:ú 0 f s· .·< ·: %·. .•••vxçt i·. ·-: ·: „ · -'h:> ··-- s·. >;··:·> ·.'-.· v: ·· ·· «····· ··>:-' m -·: ··.-·· 0 ··· '···' ‘ ·. v. v ·,. . ·'····· .ç;:· · v e-e. de é 0- s P. i;i;.η Ο/ .v. ç:: rs;:«plra:tél-è:0 tdvií to, :i.··:: : --U 0:0..:,. a rxo:mm ; uòpíítSio·'·· são, febre 0 òÇlòvtf Beuobóiloe. tUpí mo: i:00 f ê x: x, .· .ca UO:·::.·:'·· CCS 5 pmf viça de rmm lilMídt 0 um ' . õãlífp se? ornou.: to PíUòiÇçáve 1 «Op 0 pCTp .0 Ui? vista mm;. u::m;Pi;m 0: m que 0. proteína de fusão híbrida aotçreíh», no seu mommo.: aromo, uma proteína bactericida indutora da permeabilidade ou ':m seu fragmento com activídade bactericida indutora da permeabilidade, em que um resíduo de císteína correspondendo à posição 132 da SEQ ID No: 2 está substituído por um aminoácido diferente e, no seu terminal carboxilo, poio menos um domínio constante de uma caaeia pesada de imunoglobulina ou uma sua variante aiélica, caracterizada pelo facto de a composição farmacêutica se destinar a ser utilizada no tratamento de infecções bactericidas gram-negativas e as mm sequelas, incluindo choque relacionado coa endotoxinas e uma 00 ma is afecções associadas a ela, iíibiuipdP coagulação intravascular disseminada, anemia, trombocítopénía, lé?ã&típêfú-&t síndroma de distúrbio respiratório do adulto, insuficiência renal, hipoten-spS í itbrç 0 m 1mm «PaPólióp » rorxo táopjpx siií mppõ;:::oipl;ò ΟΡχορρρ^χχΡ,χΟΟ ρ 0 peprdp:.· ; ; rõ .1 LpUo, UU PUC: 0 suo xp :::0: :: '·: õ P:; po ·' -v- .*.* ·· ·' χοο í:ko::t:i:eS:u: pêuodx·: xotu :m ::::::: pedi :::0:50: MK PSOOS « t .sut.em:oxtu :·: \ .· ·. · · · .· ·.· ·;·> Ρ0 ::.: ·:;;όO': x :oi 0 0 xm oos- v·. · x 0 X oxo::: o; o; s; xsx: /•iiK: k-m £, ·. : ·: -> .··: /·. ,p,· ·:\ ço ···: ; ··’·' r: :'Ç .v. > ·:···,···:·.- ··.·:··.·.- .> P-:.;Ç:·.·.·· .0.·:·:·: .;··.>> ··;·:.·..· · ··.··- ·»: ··:· SiXíx: íSp-UotUí?: ÍS: :kcÍ-::Í C: íí usem afivàs .m.smt :u:feo: U m . u 0:0 - p ^ ' : -1 À» letras í'.:s ; Ϋ t; : í|: ií sOt í C • *1* *λ· ... x|«.- ..... -C-. Ί-.· ·.· · v çdarncín::tcy χ, .- v ,-v 1. w .... ·.......... t:::pi n.: u .· ·; tuf MM ·.-··· :·:·. ·:ν·:·*ί y. .·, .%. ·:·:· ç x> ..... :·.ν:·Λ; - ·:>·: .·.·. ·.··< ·. >’ : x ·λ· d·. ·. ·· ·.·>. :·.·.· ··>·- :rc ·· :: ” 1 ϊ : s >.í- i.:: M itÇt. 1 -- .·· ::: .·. o :··: :i «v-;V :.· :··. :: :: ·"· i':';·:·;· jiç y Β, αρρ caracterízado pêlo facto ao codificar um pc'.lIptpc cst; ds acordo oss: c?:;:·; àugl;ro??r das roiciíuticíuíocs 1 a 1.
- 9. A fu que para uma p?&ttín& ta c s t r 1 c .· r.s f cuc?u; u v r ó ta ia SfBQ ID tO;; 2, fMASta-isiS:-S.-Cio :ss:Is: facto de um resíduo ae aminoácido, ca posição 185, asar seieccionado entre uma lisina ou a:;o ácido pIstâMct ou um seu fragmento que tenha actividade ta oito ri cai dá: indutora da peimeabilida.de, em que um resíduo de cisteína correspondendo p po^itoiaj 132 está substituído por um aminoácido diferente.
- 10. ADN que codifica uma proteína bactericida indutora da permeabilidade da SEQ ID No: 2 ou um seu fraqmento com actividade bactericida indutora da permeabilidade, caracterízado pelo Facto de um resíduo de cisteína correspondendo a posição 132 estar substituído por um aminoácido diferente e em que o codão para o resíduo de valina na posição 151 se seleciona entre STC ou GTG. ADN que cod: ifica para a sequência líder de li tr :10:0 áCiçn-KMt: Θ para os primeiras 193 resí d uos de terminal t de uma proteína bactericida icít.C :tra da ί'ί:·ί’·:τ ϊ' .-'ϊ-ϋ a-itrr : ··.··· ·:.·· . ·. ·· vV·.· V, .·. · Λ ·->· ··--· -. .-. í em cu·?: um rsMdsrs tt t d cr ;····..····.; v: y ··.:-··:'·ν· :-*> -:x.:·· ..·? ·:·<: à potlp-t 132 ·*'··: ίΙ.ίΛΓ:· 1 - :·.·:· v;· c..w.;-v:· :|·ν ··'ύ · d: ,·.· ·>. :‘à :M:bs 1 ··: ··:· ·:··: :: -·:χ.··*-·.· >·:····.'·;· .·. ·..·.·> .·:.ν:·.·..·· ·λ·-·\·:-i·.· :···:: ã:fdcftictcç .-•d d '>η;::·.::ρ ςτ:·..:;·:: ·*· :::< ·:>·· >·.:>:·· ·-·· ·>· c-, · ... :.. >·’· '/ In iiui reli; r som de ··· M;t t€ít OCtlrí: ds pç ;<> ; >:· diÀfid f: !·::*: ; :t: v; : .::: " .O':· codão :c x'·····. -:Ç. :ύ · •..Λ·.·· V ·-.* c... ...· r ·. .'· · Lífd ídti :f; ' ·. <.' r;t:i it η-·.···· r;í::rrví.í::arto ............v·: ·· · '··*· ta SEy :. f Ut : .: 2 o pç::··; te !·> p:.iS pp ?:;íí |Í5i:Cie 11ΐί.ίί q C; aC. dC dddd' àa di » na;, rq d ccínbiS: dc)l Í.S c:n:d:lfica para a sequencia dacua::: ãm.Ir-sé;lldd« d os y;:i.:a:n·i adá 199 resíduos do tíaaaaiasil N ds ad-aa ;··τόοϊ.a:ííoa bactericida irododora da asradiidaliaada, ?m que -o· aaaídiia da cisteína correspondendo a paarçaa 132 da SEQ ID No: 2 está substituído por um amínoácido diferente, caracterizado pelo facto de o Aaa ter c;m tadáíí de paragem que se segue imãiitasentJã- ao codão para ° resíduo de isoleucina que corresponde â posição 199 ú'ã SEQ ID No: 2 e em que a sequência que codifica p&Tã os primeiros quatro aminoácidos da sequência lide-dd; 31 aminoácidos Lx eliminada. Vector de ADN de repiícação autónoma caracterizado pelo tãúth de compreender un ADN que codifica para uma proteína bactericida indutora aa permeabilidade ou um seu fragmento com actividade bactericida indutora da permeabilidade, em que um resíduo de cisteína correspondendo a posição 132 da SEQ ID No: 2 está „ ' por un amínoácido diferente em que o vector compreende ainda un gene marcador seiectivo.
- 14. Célula ' ' de OHC transfp:r.:di.4s ou transfectada aa i·:.rmu. u.dT.ávad soí :na dbp qm ·Μύ.'. id d d ccm proteína bs caberá c ida indudord un permeabilicade ou .:,:::¾ anu fl«d:Sd:did· cucn luòdddd· y .: y V y Ϊ; | • * •i 'íà· d caiai a d da Ρ«:\:&ϊΜίϊ11 á%mh U :c n :.·P oú:i AU .cia nu 1 n Ic de um d Ο?'.·: M:p:· 0 ';. í-v :::> ή. ν'; idcdi;,:'; fã nindd 132 dl SEQ IS dó:: 2 errar _ . nrm *;dl:d:ai d i ífd:; di í ηη:ύη ····*: :·::····: .·:·:· : ·.· ··.·.· < idx-f .;>> ç í fivv c ii ^ ;v :·> .-g ;p:;p:.j ;:p : esráv a l c-:.m um » ii qaa codíííca ana* posaras!ta oactericida i ada:0o:-,'aa da ou um seu fragmento com actividade 00:0 to 0:0::000 indutora ;ia P^smii:kr:ãlíimà^s, caracterizada pelo facto de um resíduo ·.!=..· titídltt ír::u::.r>rs|õciro:irri:to ' 132 da SEC : 2 estar substituído por um -j ^sr· diferente, de urra forma que permita a express"o do referido polipéptído na referida célula hospedeira. Lisboa, 28 de Agosto de 2007
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