FI115633B - Stabiilia bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa proteiinifragmenttia koodittava DNA, vektori, isäntäsolu ja menetelmä näiden proteiinifragmenttien valmistamiseksi - Google Patents

Stabiilia bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa proteiinifragmenttia koodittava DNA, vektori, isäntäsolu ja menetelmä näiden proteiinifragmenttien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI115633B
FI115633B FI20031199A FI20031199A FI115633B FI 115633 B FI115633 B FI 115633B FI 20031199 A FI20031199 A FI 20031199A FI 20031199 A FI20031199 A FI 20031199A FI 115633 B FI115633 B FI 115633B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
rbpi
protein
bpi
cells
dna
Prior art date
Application number
FI20031199A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20031199A (fi
Inventor
Arnold Horwitz
David Burke
Georgia Theofan
Manik Baltaian
Lynn Grinna
Original Assignee
Xoma Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xoma Corp filed Critical Xoma Corp
Publication of FI20031199A publication Critical patent/FI20031199A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI115633B publication Critical patent/FI115633B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/02—Non-specific cardiovascular stimulants, e.g. drugs for syncope, antihypotensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4742—Bactericidal/Permeability-increasing protein [BPI]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Description

115633
Stabiilia bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa pro-teiinifragmenttia kooditta va DNA, vektori, isäntäsolu ja menetelmä näiden proteiinifragmenttien valmistamiseksi 5 Keksinnön tausta
Esillä oleva keksintö esittää bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa proteiinifragmenttia koodittavan DNA:n, autonomisesti replikoituvan DNA-vektorin, isän-täsolun ja menetelmän bakterisidisen/läpäisevyyttä paranta-10 van biologisesti aktiivisen fragmentin tuottamiseksi.
Lipopolysakkaridi (LPS) on pääasiallinen komponentti gramnegatiivisen bakteerin ulkomembraanissa ja se sisältää serotyyppispesifiset O-sivuketjupolysakkaridit, jotka ovat kiinni ydinoligosakkaridin konservoituneessa 15 alueessa ja lipidi A -molekyylissä. Raetz, Ann. Rev. Biochem., 59: 129 - 170 (1990). LPS on gramnegatiivisen bakteerin aiheuttaman septisen sokin, joka on eräs pääasiallisista kuolinsyistä Yhdysvaltain tehohoito-yksiköissä, patogeneesin tärkeä välittäjä. Morrison et ai., 20 Ann. Rev. Med., 38: 417 - 432 (1987).
... LPS-molekyyliä sitovia proteiineja on tunnistettu • · nisäkkään eri kudoksista. Morrison, Microb. Pathol., 7: * 389 - 398 (1989); Roeder et ai., Infect. Immun., 57: 1054 - ' * 1058 (1989). Eräs laajimmin tutkituista LPS-molekyyliä '·"· 25 sitovista proteiineista on bakterisidinen/läpäisevyyttä • parantava proteiini (BPI), emäksinen proteiini, jota : löydetään polymorfonukleaaristen leukosyyttien atsurofii- lisistä granuloista. Ihmisen BPI-proteiini on eristetty :polymorfonukleaarisista neutrofiileistä happouutolla, johon ,*·. 30 on yhdistetty joko ioninvaihtokromatograf ia [Elsbach, J.
• Biol. Chem., 254: 11000 (1979)1 tai E. coli -affi- * · ♦ i t t : niteettikromatografia [Weiss et ai., Blood, 69: 652 ·...· (1987)], ja sillä on vahva bakterisidinen aktiivisuus laajaa gramnegatiivisten bakteerien joukkoa vastaan.
35 Samalla kun BPI-proteiini on sytotoksinen monia gramnegatiivisia bakteereita vastaan, sillä ei ole mitään 2 115633 julkaistua sytotoksista aktiivisuutta grampositiivisia bakteereita, homeita tai nisäkässoluja vastaan. Ihmisen koko BPI-proteiinin aminohapposekvenssi kuin myös proteiinia koodittava DNA on esitetty kuviossa 1 julkaisussa 5 Gray et ai., J. Biol. Chem., 264: 9505 (1989), joka on liitetty tähän viitteeksi (SEQ ID -numerot 1 ja 2) . Julkaisu Gray et ai. kuvaa ihmisen BPI-proteiinia koodattavan cDNA:n eristyksen cDNA-kirjastosta, joka on peräisin DMSO-indusoiduista ihmisen HL-60-promyelosyytti-10 leukemiasolulinjan soluista (ATCC CCL 240). Useat juuri valmistetun cDNA-kirjaston, joka on peräisin sellaisista DMSO-indusoiduista HL-60-soluista, DNA:n PCR-amplifikaatiot ovat paljastaneet ihmisen BPI-proteiinia koodittavien cDNA:den olemassaolon, joissa aminohappoa väliini 15 spesifioiva kodoni kohdassa 151 on joko GTC (kuten on kuvattu sekvenssissä SEQ ID -numero 1) tai GTG. Lisäksi sellaisten cDNA-lajien, joissa GTG spesifioi valiinia kohdassa 151, on havaittu spesifioivan joko lysiiniä (AAG) kohdan 185 aminohapoksi (kuten sekvenssissä SEQ ID -numerot 20 1 ja 2) tai glutamiinihappoa (GAG) tähän kohtaan.
,, Ihmisen BPI-holoproteiinin N-pään osaa vastaava ; _ proteolyyttinen fragmentti sisältää luonnollista alkuperää • · '· ‘ olevan ihmisen 55 kDa BPI-proteiinin bakteerin vastaisen ‘ * tehokkuuden. Päinvastoin kuin N-pään osa, ihmisen eristetyn : 25 BPI-proteiinin C-pään alue sisältää ainoastaan heikosti j .* tunnistettavan bakteerin vastaisen aktiivisuuden. Ooi et : ai., J. Exp. Med., 174: 649 (1991). BPI-proteiinin N-pään fragmentti, joka sisältää noin 199 ihmisen BPI-holoproteiinin ensimmäistä aminohappoa, on tuotettu yhdis- t * 30 telmä-DNA-menetelmillä 23 kDa:n proteiinina. Gazzano- i Santoro et ai., Infect. Immun., 60: 4754 - 4761 (1992).
Suunniteltu BPI-tuotteiden kliininen käyttö gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman sepsiksen hoitamiseksi ihmisillä on saanut aikaan merkittäviä yrityksiä tuottaa ··, 35 suuria määriä BPI-rekombinanttiproteiinituotteita (rBPI), jotka ovat sopivia sisällytettäväksi stabiileihin homo- 3 115633 geenisiin farmaseuttisiin valmisteisiin. Esimerkiksi yhteisomistettu yhtä aikaa haettava US-patenttihakemus, jonka sarjanumero on 08/072 063, jota hakee Grinna, kuvaa uudet menetelmät sellaisten BPI-rekombinanttituotteiden 5 puhdistamiseksi, joita ekspressoidaan ja eritetään geneet tisesti transformoidussa nisäkäsisäntäsoluviljelmässä. Siinä on puhdistusmenetelmien tehokkuus osoitettu tuotteiden yhteydessä sellaisissa transformoiduissa CHO-soluissa, jotka ekspressoivat DNA:ta, joka koodittaa 31 10 aminohapon pituista ihmisen BPI-proteiinin "leader"- sekvenssiä ja kypsän proteiinin 199 ensimmäistä aminopään aminohappoa (se tarkoittaa sellaisia, jotka vastaavat sekvenssin SEQ ID -numero 2 aminohappoja -31 - 199). Yhteisomistettu yhtä aikaa haettavana oleva US-patent-15 tihakemus, jonka sarjanumero on 08/064 693, jota hakevat
Theofan et ai., koskee uusia yhdistelmä-DNA-menetelmillä tuotettuja BPI-proteiinianalogituotteita, jotka ovat tulosta sellaisen DNA:n ekspressiosta, joka sisältää BPI-leader-sekvenssin ja joko 191 tai 199 ihmisen BPI-20 proteiinin aminopään jäännöstä yhdistettynä DNA:hän, joka koodittaa immunoglobuliinin raskasketjun vakioaluetta.
*;'/ Yritykset tuottaa farmaseuttisen laadun BPI- *·* ’ tuotteita gramnegatiivisten bakteerien aiheuttaman sep- • : siksen hoitamiseksi ihmisillä ei ole antanut kauttaaltaan 25 tyydyttäviä tuloksia. Pääasiallinen syy tähän on ihmisen : ‘ : BPI-proteiinin aminohapposekvenssin luonne ja sen rekombi- nantti-isäntäsolun, joissa tuotteet tuotetaan, ympäristön luonne. Eräänä esimerkkinä biologisesti aktiiviset rBPI-: .*. tuotteet, jotka sisältävät BPI-proteiinin 199 ensimmäistä ,··*[ 30 jäännöstä [rBPI(l - 199)] tuotettuna transfektoitujen CHO- isäntäsolujen eritystuotteina, voidaan puhdistaa hyvillä • ’,· saannoilla. Eristetyt BPI-tuotteet sisältävät kuitenkin alunperin dimeerisiä BPI-muotoja kuin myös kysteii-;·, niadduktilajeja. Lisäksi BPI-tuotteet voivat olla epä- 35 stabiileja säilytettäessä fysiologisessa lämpötilassa ja pH:ssa, joka johtaa edelleen dimeeristen ja adduk- 4 115633 tituotteiden muodostumiseen. Samalla kun sellaiset dimee-riset ja adduktituotteet ovat biologisesti aktiivisia, niitä ei suositella sisällytettäviksi farmaseuttisiin valmisteisiin, joita tarkoitetaan käytettäväksi ihmisillä.
5 Dimeerimuodostus ja kysteiiniadduktien muodostus johtuu mahdollisesti siitä tosiasiasta, että BPI-proteiini sisältää kolme kysteiiniaminohappojäännöstä, jotka kaikki sijaitsevat BPI-proteiinin biologisesti aktiivisen amino-pään alueen sisällä, se tarkoittaa kohdissa 132, 135 ja 10 175. Yhden disulfidisidoksen muodostuminen kahden kys- teiinin välillä näistä kolmesta kysteiinistä sallii di-meerin muodostumisen tai kysteiiniadduktien muodostumisen jäljelle jäävän kysteiinin kanssa isäntäsolun sytoplasmassa ja/tai soluviljelmäsupernatantissa.
15 Jopa monomeerisilla rBPI-tuotteilla on vaihtelevat mikroheterogeenisyystasot mitä tulee sellaisissa tuotteissa läsnäolevien karboksipään jäännösten määrään. On vaikeaa esimerkiksi tunnistaa täyspitkä ekspressiotuote alustassa, joka sisältää isäntäsolut, jotka on transformoitu tai 20 transfektoitu DNA:11a, joka koodittaa rBPI(1—199)— , . proteiinia. Sen sijaan sellaisista soluista saadut ; _ ekspressiotuotteet edustavat rBPI-proteiinin N-pään frag- • · * ' mentin heterogeenistä joukkoa, joissa karboksipää on t « I | ' ' lyhentynyt. Tosiasiassa odotetun täyspitkän tuotteen (1 - '· 25 199) ei usein tunnisteta olevan läsnä heterogeenisessä • .* joukossa läsnäolevien rBPI-lajien joukossa. rBPI(1-199)- : tuotteiden karboksipään aminohapposekvenssin heterogeeni syys tuntuu johtuvan isäntäsolun sytoplasmassa ja/tai :viljelysupernatanteissa läsnäolevien karboksipeptidaasien
* « I
,··>, 30 aktiivisuudesta.
Lisäongelma, joka kohdataan valmistettaessa farma-: \* seuttista laatua olevia BPI-tuotteita, on sellaisten ‘•"t· makroskooppisten partikkeleiden muodostuminen, jotka alen- ;·, tavat tuotteen homogeenisyyttä kuin myös alentavat sen i i » 35 aktiivisuutta. Suositeltava farmaseuttinen koostumus, joka sisältää keksinnön mukaisia rBPI-tuotteita, sisältää pin- 5 115633 ta-aktiivisten poloksameeri (polyoksipropyleeni-polyoksi-etyleeniryhmistä koostuva kopolymeeri) -yhdisteiden ja polysorbaattiyhdisteiden (polyoksietyleenisorbitaanin ras-vahappoesteri) yhdistelmän. Sellaisilla yhdistelmillä on 5 yhteisomistuksessa yhtä aikaa haettavana olevassa saman aikaisesti rekisteröidyssä US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 08/012 360, kuvattu olevan synergistisiä vaikutuksia farmaseuttisesti aktiivisten polypeptidien stabiloimisessa partikkelimuodostusta vastaan. Suositelle) tavin on yhdistelmä, jossa rBPI-tuotteet ovat läsnä
konsentraationa, joka on 1 mg/ml, sitraatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (0,02 M sitraatti, 0,15 M NaCl, pH 5,0), joka sisältää 0,1 paino-% poloksameeri 188 -yhdistettä (Pluronic F-68, BASF Wyandotte, Parsippany, NJ) ja 0,002 15 paino-% polysorbaatti 80 -yhdistettä (Tween 80, ICI
Americas Inc., Wilmington, DE).
Alalla on olemassa jatkuva tarve parannetuista rBPI-tuotteista, jotka sopivat sisällytettäviksi stabii-leihin homogeenisiin farmaseuttisiin valmisteisiin. Sel-20 laiset tuotteet olisi ideaalisesti saatavissa suurina ... saantoina transformoiduista isäntäsoluista, niiden tulisi säilyttää BPI-proteiinin bakterisidiset ja LPS-molekyyliä • * t '·' * sitovat biologiset aktiivisuudet ja niillä tulisi olla » I * l » ‘ ‘ rajoitettu kapasiteetti muodostaa dimeerisiä lajeja ja '"· 25 kysteiiniaddukte j a ja niille tulisi olla ominaista • ’ 1 rajoitettu vaihtelu karboksipäässä.
Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö esittää uudet biologisesti ' aktiiviset yhdistelmä-DNA-menetelmillä tuotetut BPI-pro- * > 30 teiini- ("rBPI") ja BPI-proteiinifragmenttituotteet, joil-le on ominaista resistenssi dimerisaatiolle ja kyste- ! .‘ iiniadduktimuodostukselle, jotka tekevät sellaiset tuotteet erittäin sopiviksi farmaseuttista käyttöä varten. Eräässä » keksinnössä esitetään rBPI-tuotteet, joille on ominaista ,···, 35 alentunut molekyylien heterogeenisyys karboksipäässä. Uudet DNA-sekvenssit, jotka koodittavat rBPI-tuotteita ja ana- 6 115633 logituotteita, plasmidivektorit, jotka sisältävät DNA:n, isäntäsolut, jotka on stabiilisti transformoitu tai trans-fektoitu plasmideilla ja preparatiiviset yhdistelmä-DNA-menetelmät, on myös esitetty keksinnössä.
5 Hakemuksessa esitetään rBPI-proteiinianalogeja, jotka sisältävät BPI-proteiinin N-pään fragmentin, joissa kysteiiniaminohappo kohdassa 132 tai 135 on korvattu muulla aminohapolla, suositeltavasti ei-polaarisella aminohapolla, kuten seriinillä tai alaniinilla. Edullisessa esimerkissä 10 polypeptidin, joka sisältää BPI-proteiinin 199 ensimmäistä N-pään jäännöstä, kysteiinijäännös kohdassa 132 korvataan alaniinijäännöksellä rekombinanttituotteessa, jonka nimi on "rBPI(1-199)ala132”. Suositeltavassa esimerkissä BPI-frag-mentin, joka sisältää 199 ensimmäistä BPI-proteiinin N-pään 15 jäännöstä, kysteiini kohdassa 135 korvataan myöskin seriinillä, joka johtaa rekombinanttituotteeseen, jonka nimi on "rBPI (1-199) ser135". Erittäin suositeltava on tuote, jon-ka nimi on "rBPI(1-193)ala ", jolle on ominaista alentunut heterogeenisyys mitä tulee sen karboksipään jäännöksen 20 identtisyyteen. Keksinnön suositeltavassa suoritustavassa esitetään myös polypeptidi, joka sisältää BPI-proteiinin ;' ’ 193 ensimmäistä aminopään jäännöstä ja jossa on lope- ’ tuskodoni välittömästi kohdan 193 leusiinikodonin jälkeen.
* ’ Hakemuksessa esitetään DNA-sekvenssit, jotka koo- '·"! 25 dittavat yllä kuvattuja rBPI-proteiini- ja BPI-proteiini- * · > .* fragmenttituotteita, sisältäen analogituotteet. Sellaiset DNA-sekvenssit voivat myös koodittaa 31 jäännöksen pituista i · < BPI-leader-sekvenssiä ja BPI-polyadenylaatiosignaalia. On ; myös esitetty autonomisesti replikoituvat DNA-plasmidivek- « * t .·<·[ 30 torit, jotka sisältävät DNA:ta, joka koodittaa yllä mainit- » i tuja tuotteita ja analogeja, kuin myös isäntäsolut, jotka I * i i ’,· on stabiilisti transformoitu tai transfektoitu sillä !|t>! DNA: 11a sellaisella tavalla, joka sallii niiden ekspressi- ;·, on. Keksinnön mukaiset transformoidut tai transfektoidut • » » 35 isäntäsolut ovat selvästi käyttökelpoisia menetelmissä kek- 7 115633 sinnön mukaisten rBPI-proteiinituotteiden laajamittakaavai-sessa tuotossa.
Lisäksi tuodaan esille rBPI-proteiini-analogi-tuotteet fuusioproteiinien muodossa, jotka sisältävät ami-5 nopäässä rBPI-proteiini-analogituotteet ja karboksipäässä immunoglobuliinin raskasketjun vakioalueen tai sen alleeli-sen variantin. Luonnollisen sekvenssin sisältävät BPI/im-munoglobuliinifuusioproteiinit on esitetty yhtä aikaa haettavana olevassa yhteisomistuksessa olevassa US-patentti-10 hakemuksessa, jonka sarjanumero on 08/064 693, jota hakevat Theofan et ai. ja jonka sisältö on liitetty tähän viitteeksi. Hakemuksessa tarkastellaan edelleen menetelmiä yllä kuvattujen fuusioproteiinien tuottamiseksi.
Hakemuksessa esitetään myös DNA-sekvenssejä, jotka 15 koodittavat biologisesti aktiivisia rBPI-proteiinifragment-tituotteita, joissa on noin 176 - noin 198 BPI-proteiinin N-pään aminohappoa. Nämä DNA:t sallivat BPI-tuotteiden tuoton eukaryoottisissa isäntäsoluissa, kuten CHO-soluissa, joissa tuotteissa on vähemmän heterogeniaa mitä tulee läs-20 näoleviin karboksipään jäännöksiin. Keksinnössä annetaan , käyttöön sellaiset DNA:t, jotka koodittavat BPI-proteiinin ; t N-pään 193 jäännöstä (esim. DNA:t, jotka koodittavat BPI- '· ‘ proteiinin 31 aminohapon pituista leader-sekvenssiä, 193 ensimmäistä N-pään aminohappoa ja yhtä tai useampaa lope-• * 25 tuskodonia). Esille tuodaan myös sellaiset DNA:t, jotka li- • '/> säksi koodittavat proteiineja, jossa kysteiini joko kohdas- : : sa 132 tai 135 on korvattu [esim. rBPI (1-193)132] .
Esillä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyt-j , , töön DNA, jolle on tunnusomaista, että se koodittaa bakte- 30 risidisen/läpäisevyyttä parantavan proteiinin biologisesti > aktiivista fragmenttia, jossa on leusiinitähde kohdassa .* 193 sen karboksipään tähteenä.
Lisäksi annetaan käyttöön autonomisesti replikoi- » ;·, tuva DNA-vektori, joka käsittää keksinnön mukaisen DNA: n, t ,*·, 35 isäntäsolu, joka on transformoitu keksinnön mukaisella DNA:11a ja menetelmä bakterisidisen/läpäisevyyttä paranta- 8 115633 van biologisesti aktiivisen fragmentin tuottamiseksi, jolle on tunnusomaista, että se sisältää vaiheet, joissa kasvatetaan isäntäsolua, joka on stabiilisti transformoitu tai transfektoitu keksinnön mukaisella DNA:11a, sopivassa 5 viljelyalustassa ja eristetään mainittu fragmentti mainitusta isäntäsolusta tai mainitusta viljelyalustasta.
Useat muut keksinnön lisäkohdat ja edut tulevat ilmeisiksi alan asiantuntijoille tutustuttaessa seuraavaan yksityiskohtaiseen keksinnön kuvaukseen, jossa kuvataan sen 10 tällä hetkellä suositeltavat suoritustavat.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 edustaa rBPI(1-199)-tuotteiden SDS-PAGE-analyysiä.
Kuvio 2 edustaa rBPI (1-193)- ja rBPI (1-199) ala132-15 tuotteiden SDS-PAGE-analyysiä.
Kuvio 3 kuvaa rBPI(1-199)-tuotteiden kationin-vaihto-HPLC-analyysiä.
Kuvio 4 esittää rBPI (1-199) ala132-tuotteiden katio-ninvaihto-HPLC-analyysiä.
20 Kuvio 5 edustaa rBPI(1-199)-tuotteiden käänteis- ,,, faasi-HPLC-ajoa.
’· ’ Kuvio 6 edustaa rBPI (1-199) ala132-tuotteiden kään- ' ’ teisfaasi-HPLC-a j oa.
* · Kuvio 7 edustaa sellaisten farmaseuttisten koos- "· · 25 tumusten turbiditeettitutkimusten tuloksia, jotka sisäl- ! : tävät rBPI-tuotteita yhdessä pinta-aktiivisten poloksa- ,· meeri/polysorbaatti-täyteaineiden kanssa tai ilman niitä pH:ssa 7,0 ja 57 °C:ssa.
; . . Yksityiskohtainen kuvaus ’’’/ 30 Seuraava yksityiskohtainen kuvaus koskee sellaisten ’/ eri rBPI-tuotevalmisteiden tuottoa ja ominaisuuksia, jotka ; sisältävät aminohapposubstituution kysteiinijäännöksessä : _ : ja/tai erittäin tasalaatuisen karboksipään. Erikoisemmin ;·’ esimerkki 1 koskee esimerkkitapoja, joilla emässubsti- 35 tuutiot sisällytetään nukleiinihapposekvenssiin, joka 9 115633 koodittaa BPI-proteiinin esimerkkinä olevaa N-pään fragmenttia, ja sellaisten mutatoitujen sekvenssien sisällyttämistä plasmidivektoreihin. Esimerkki 2 osoittaa esimerkin 1 vektoreiden sisällyttämisen sopiviin 5 isäntäsoluihin ja kuvaa edelleen keksinnön BPI- rekombinanttiproteiinipolypeptidituotteiden ekspression. Esimerkki 3 koskee sellaisten DNA:in rakentamista, jotka koodittavat keksinnön kysteiinikorvausanalogituotteita, ja niiden käyttöä in vitro transkriptio/translaatio-10 menetelmissä. Esimerkki 4 koskee keksinnön rBPI-polypep- tidituotteiden ominaisuuksia.
Esimerkki 1 BPI-kysteiinikorvausanalogeja sisältävien vektoreiden rakennus 15 A. Plasmidien pING4519 ja pING4520 rakennus
Ekspressiovektoria pING4503 käytettiin sellaisen DNA:n lähteenä, joka kooditti rekombinanttieks-pressiotuotetta, jonka nimi oli rBPI(1-199), se tarkoittaa, että se kooditti polypeptidiä, jolla oli 31 jäännöksen 20 pituinen signaalisekvenssi ja ihmisen kypsän BPI-proteiinin N-pään 199 ensimmäistä aminohappoa, kuten on kuvattu '·' * sekvensseissä SEQ ID -numerot 1 ja 2, paitsi että valiinia V * kohdassa 151 spesifioi mieluummin GTG kuin GTC ja jäännös ’· * 185 on glutamiinihappo (jota spesifioi GAG) mieluummin kuin 25 lysiini (jota spesifioi AAG).
Plasmidi pING4503 on kuvattu yhtä aikaa haettavassa yhteisomistuksessa olevassa US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 08/064 693, jota hakevat Theofan et ai. ja ; joka on liitetty tähän viitteeksi mitä tulee keksinnön 30 taustaan. Lyhyesti, plasmidin pING4503 rakennus perustuu plasmidiin pING2237N, joka sisältää hiiren immunoglobulii-: nin raskasketjun tehostajaelementin, hiiren Abelson- : leukemiaviruksen (A-MuLv) DNA:n LTR-tehostaja-promoottori- / elementin, SV40 19S/16S -silmukointikohdan ekspressoitavan 1 » 35 geenin 5'-päässä ja ihmisen genomisen gamma-1- polyadenylaatiokohdan ekspressoitavan geenin 3'-päässä.
115633 ίο
Plasmidissa pING2237N on myös hiiren selektoitava dihydrofolaattireduktaasimerkkigeeni (DHFR). DNA, joka koodittaa rBPI(1-199)-proteiinia, joka sisältää 30 emäs-paria luonnollista transloimatonta 5'-pään aluetta ja 5 emäkset, jotka koodittavat 31 aminohapon pituista signaalisekvenssiä kuin myös BPI-proteiinin 199 N-pään aminohappoa koodittavat emäkset, insertoidaan uniikkien Sali- ja Sstll-restriktiokohtien väliin plasmidissa pING4 503.
10 Kaksi vektoria, pING4519 ja pING4520, rakennettiin plasmidiin pING4503 perustuen rBPI(1-199)-kysteiinikor-vausanalogien ekspressoimiseksi, joissa yksi kolmesta BPI-proteiinissa luonnollisesti esiintyvästä kysteiinijäännöksestä korvattiin toisella aminohapolla. PvuII-kohtaa 15 (CAGCTG), joka sijaitsee ainoastaan kerran DNA:ssa, joka koodittaa rBPI(1-199)-proteiinia, ja joka sijaitsee kysteiinien 132 ja 135 välissä, käytettiin hyväksi näissä rakennuksissa. Koska plasmidissa pING4503 sijaitsee useita PvuII-lisäkohtia, oli tarpeen eristää se Sall-Sstll-20 fragmentti, joka sisälsi rBPI(1-199)-proteiinia koodittavan ... insertin, plasmidista pING4503 digestoimalla se Sali- ja
Sstll-entsyymeillä. Sitten puhdistettu Sall-Sstll rBPI(l-* 199) -fragmentti digestoitiin PvuII-entsyymillä, joka johti • noin 529 emäsparin pituisen Sall-PvuII-fragmentin 25 syntymiseen ja noin 209 emäsparin pituisen PvuII-Sstll- : * : fragmentin syntymiseen, joista kumpikin puhdistettiin erikseen.
Plasmidi pING4519 on identtinen plasmidin pING4503 :,·, kanssa, paitsi että plasmidi pING519 sisältää DNA-insertin, 30 joka koodittaa rBPI (1-199)-proteiinia, jossa luonnollista • * 'h kysteiiniä kohdassa 132 spesifioiva kodoni on korvattu • » / • alaniinikodonilla. Kuten yllä on mainittu, isäntäsolueks- : : pressiolla ja sellaisen insertin eritysprosessoinnilla >.‘ syntynyttä rekombinanttituotetta nimitetään "rBPI(l- 35 199)ala132-proteiiniksi". Plasmidin pING4519 muodostamiseksi ’ * ‘ * BPI-DNA-sekvenssit amplifioitiin PCR-menetelmällä plasmi- 11 115633 dista pING4503 käyttäen aluketta BPI-6: AAGCTTGTCGACCAGGCCTTGAGGT (SEQ ID -numero 3), jossa oli Sall-restriktiokohta 30 emäsparin pituisen BPI-proteiinin transloimattoman alueen 5'-päässä, ja aluketta BPI-14: 5 CTGGAGGCGGTGATGGTG (SEQ ID -numero 4), jossa oli PvuII-kohdan puolikas ja sellaiset emässubstituutiot, jotka olivat tarpeen alaniinin koodittamiseksi kohtaan 132. PCR-amplifikaatio suoritettiin käyttäen GeneAmp PCR -käyttö-pakkausta (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) valmistajan 10 ohjeiden mukaisesti. Tuloksena syntynyt PCR-fragmentti digestoitiin Sali-entsyymillä, joka johti noin 529 emäsparin pituisen tasapäisen Sali-fragmentin syntyyn, jota sitten käytettiin kolmen palan ligaatiossa yhdessä yllä kuvatun noin 209 emäsparin pituisen PvuII-SstII-fragmentin 15 ja plasmidin pING4503 Sali- ja Sstll-digestion muodostaman suuren fragmentin kanssa muodostamaan plasmidi pING4519.
Plasmidi pING4520 on identtinen plasmidin pING4519 kanssa sillä poikkeuksella, että plasmidi pING4520 sisältää DNA-insertin, joka koodittaa rBPI(1-199)-analogia, jossa 20 luonnollista kysteiiniä kohdassa 135 koodittava kodoni on ... korvattu seriinikodonilla. Kuten yllä on mainittu, ';’f* sellaisen insertin isäntäsoluekspression rekombinantti- V ’ tuotetta nimitetään "rBPI(1-199)ser135-proteiiniksi". Plas- • ' midin pING4520 muodostamiseksi BPI-DNA-sekvenssit ampli- ‘•'d 25 fioitiin PCR-menetelmällä plasmidista pING4513, joka on : ' : oleellisesti samanlainen kuin plasmidi pING4503, paitsi että selektiomerkkigeeni on gpt DHFR:n sijasta ja että cDNA-insertti koodittaa signaalisekvenssiä ja täyspitkää : . , BPI-proteiinia (456 jäännöstä) ainoastaan rBPI(1-199)-osan 30 sijasta.
12 115633 PCR-amplifikaatio suoritettiin käyttäen aluketta BPI-15: CT C CAGCAGCCACAT CAAC (SEQ ID -numero 5), jossa 5'- pää sisältää mutatoidun PvuII-kohdan puolikkaan (jossa "CTG" on vaihdettu tripletiksi "CTC") ja emässubstituutiot, 5 jotka ovat tarpeen seriinin koodittamiseksi kohtaan 135, ja aluketta BPI-7: GAACTTGGTTGTCAGTCG (SEQ ID -numero 6), joka edustaa rBPI-proteiinia koodittavia sekvenssejä, jotka sijaitsevat alavirtaan BPI-proteiinin jäännöstä 199 koodittavasta alueesta. Tämä PCR-fragmentti digestoitiin 10 BstBI-entsyymillä, joka katkaisee alavirtaan kysteiinin 135 mutageneesikohdasta, ja tuloksena syntynyt noin 100 emäsparin pituinen tasapäinen BstBI-fragmentti puhdistettiin geelissä. Sitten suoritettiin kolmen palan ligaatio yllä kuvatun 529 emäsparin pituisen Sall-PvuII-BPI-15 restriktiofragmentin, 100 emäsparin pituisen tasapäisen BstBI-fragmentin ja plasmidin pING4503 BstBI-Sall-digestion seurauksena syntyneen suuren fragmentin kesken niin, että muodostettiin plasmidi pING4520.
B. Plasmidin pING4530 rakennus 20 Rakennettiin toinen vektori, pING4530, joka sisälsi ... samanlaisen alaniini-kysteiini-korvauksen kuin plasmidi *** ‘ pING4519, mutta joka sisälsi gpt-selektiomerkin (joka • « · V * muodosti mykofenolihapporesistenssin) DHFR-merkin sijasta, ’·"· joka oli tuotu plasmidista pING4503 plasmidiin pING4519.
G": 25 Plasmidin pING4530 rakentamiseksi plasmidista pING4519 eristettiin 1629 emäsparin pituinen Sall-Dralll-restriktiofragmentti. Tämä fragmentti sisälsi koko rBPI(l- * 1 "32 199)ala -proteiinia koodittavan alueen kuin myös noin 895 ; y, emäsparin pituisen vektorisekvenssin koodittavan alueen 3'- ’!!.* 30 päässä. Tämä fragmentti ligoitiin suureen (noin 7230 « » 'D emäsparia) Dralll-Sall-vektorifragmenttiin, joka eristet- - tiin plasmidista pING4513, plasmidin pING4530 muodos- ; : tamiseksi.
* t 13 115633 C. Plasmidin pING4533 rakennus
Plasmidi pING4533 rakennettiin sellaisen rBPI(l-199) ala132-proteiinin ekspressoimiseksi, jossa BPI-signaali-sekvenssin viidettä aminohappoa metioniinia spesifioiva 5 kodoni (ATG) kohdassa -27 sijoitettiin Kozakin translaation aloituksen konsensussekvenssin GCCACCRCCATGG (SEQ ID -numero 7) [Kozak, Nucl. Acid. Res., 15: 8125 (1987)] ympäristöön ja jossa DNA-sekvenssi, joka kooditti BPI-signaalin neljää ensimmäistä aminohappoa, poistettiin. Tämä 10 suoritettiin BPI-sekvenssien PCR-amplifikaatiolla plasmi-dista, joka sisälsi ihmisen täyspitkän BPI-cDNA:n [plasmidissa pGEM7Zf(+)], käyttäen PCR-aluketta BPI-23: ACTGTCGACGCCACCATGGCCAGGGGC (SEQ ID -numero 8), joka sisällyttää Sall-restriktiokohdan ja nukleotidit GCCACC 15 ATG-kodonin (metioniini) eteen BPI-signaalin kohtaan -27, ja aluketta BPI-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID
-numero 9), joka vastaa rBPI(1-199)-proteiinia koodittavan sekvenssin 3'-päätä.
Noin 700 emäsparin pituinen PCR-amplifioitu DNA 20 digestoitiin Sali- ja EcoRI-entsyymeillä ja tuloksena syntynyt 270 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisälsi noin ensimmäisen kolmanneksen BPI (1-199) -proteiinia '·’ ' koodittavasta sekvenssistä, puhdistettiin. Tämä Sall-EcoRI- * ’ fragmentti ligoitiin kahteen muuhun fragmenttiin: (1) 420 ’·"· 25 emäsparin pituiseen EcoRI-SstII-fragmenttiin plasmidista : ' : pING4519, joka koodittaa jäljellä olevaa BPI(1-199)- proteiinia, jossa alaniini korvaa kysteiinin kohdassa 132; i * · (2) noin 8 000 emäsparin pituiseen Sstll-Sall-vek-: torifragmenttiin plasmidista pING4502 (vektori, joka on » i ► 30 oleellisesti samanlainen kuin plasmidi pING4503, paitsi että se ei sisällä 30 emäsparin pituista 5'-pään • I 4 • transloimatonta sekvenssiä ja että siinä on gpt-merkki mieluummin kuin DHFR), sellaisen plasmidin pING4533 muodostamiseksi, joka sisältää gpt-merkkigeenin.
35 14 115633 D. Plasmidien pING4221, pING4222 ja pING4223 rakennus
Rakennettiin samanlaiset vektorit kuin pING4533, joissa oli insertti, joka sisälsi optimoidun Kozakin 5 translaation aloituskohdan, joka vastasi signaalisekvenssin metionyylijäännöstä kohdassa -27, ja alaniini-kysteiini-korvauksen kohdassa 132. BPI-fragmenttia koodittava sekvenssi loppui kuitenkin jäännökseen 193 näissä rakenteissa. Kuten yllä on mainittu, tämän DNA:n 10 isäntäsoluekspressiosta tuloksena syntynyttä rekombi-nanttituotetta nimitetään "rBPI(1-193)ala132-proteiiniksi". Nämä insertit sisältävät vektorit tehtiin digestoimalla ensin plasmidi pING4533 Sali-entsyymillä, joka katkaisee BPI-DNA-insertin 5'-päästä, ja AlwNI-entsyymillä, joka 15 jättää 3 emäksen pituisen 3'-ylimenevän pään jäännökseen 192. Sitten tuloksena syntynyt noin 700 emäsparin pituinen fragmentti puhdistettiin. Tämä fragmentti ligoitiin uudelleen suureen fragmenttiin, joka oli peräisin plasmidin pING4533 Sstll-Sall-digestiosta, yhdessä kahden keskenään 20 hybridisoidun komplementaarisen oligonukleotidin kanssa, BPI-30: CTGTAGCTCGAGCCGC (SEQ ID -numero 10) ja BPI-31: * · · ;!/ GGCTCGAGCTACAGAGT (SEQ ID -numero 11). Tämä korvasi AlwNI- • · t V * ja Sstll-kohtien välisen alueen jäännöksen 193 kodonilla
(leusiini) , lopetuskodonilla ja Sstll-kohdan 5 '-puoleisella 25 Xhol-restriktiokohdalla ja johti sekä AlwNI- että Sstll-: ’ : kohtien uudelleen muodostumiseen ja lopetuskodonin TAG
sijoittumiseen juuri aminohappokodonin 193 (CTG)(leusiini) perään. Tuloksena syntynyt plasmidi nimettiin plasmidiksi ; ,·, pING4223 ja siinä oli gpt-merkkigeeni. Tehtiin juuri I t t 30 samanlaiset rakenteet kuin on kuvattu plasmidille pING4223, paitsi että käytettiin erilaisia Sstll-Sall-vekto-* rifragmentteja sellaisten vektorien muodostamiseksi, jotka sisälsivät eri selektiomerkit. Esimerkiksi plasmidi pING4221 on identtinen plasmidin pING4223 kanssa, paitsi 35 että se sisältää his-merkkigeenin (joka saa aikaan resistenssin histidinolille) qpt-merkkiqeenin sijasta, ja 15 115633 plasmidi pING4222 on identtinen plasmidin pING4223 kanssa, paitsi että se sisältää DHFR-merkkigeenin qpt-merkkigeenin sijasta.
E. Plasmidien pING4537, pING4143, pING4146, 5 pING4150 ja pING4154 rakennus
Rakennettiin sarja vektoreita, jotka sisälsivät insertin, joka kooditti rBPI(1-193)ala132-proteiinia, optimoidun Kozakin translaation aloituskohdan ja erilaiset selektiomerkit, jotka olivat oleellisesti identtisiä 10 kuvattujen plasmidien pING4221, pING4222 ja pING4223 kanssa, paitsi että ihmisen genominen gamma-l-raskasketjun polyadenylaatiokohta ja transkription terminaatioalue Sstll-kohdan 3'-puolella korvattiin ihmisen kevytketjun polyadenylaatiosekvenssillä, jota seurasi hiiren kevyt-15 ketjun (kappa) genomiset transkription terminaatiosek- venssit. Vastaanvanlaisissa geeniekspressiotutkimuksissa kevytketjun polyadenylaatiosignaali ja transkription terminaatioalue tuntuivat olevan vastuussa 2,5 - 5-kertaisesta BPI-ekspressiotasojen kohoamisesta Sp2/0- ja CHO-K1-20 soluissa.
Yllä mainitut vektorit rakennettiin rakentamalla ' ensin plasmidi pING4537, joka on samanlainen kuin plasmidi V · pING4533, joka sisältää rBPI(1-199)ala132-insertin. Plasmidi pING4537 sisältää kuitenkin ihmisen kevytketjun poly- 25 adenylaatiosekvenssit ihmisen raskasketjusekvenssin sijas- i‘·': ta. Hiiren 3'-kappasekvenssit saatiin plasmidista pING3170, • » joka on ekspressiovektori, joka koodittaa ihmisen kevyt-ketjun cDNA:ta ja sisältää hiiren genomisen kevytketjun . transkription 3'-terminaatiosekvenssin. Tämä saatiin aikaan 30 digestoimalla Sstl-entsyymillä, joka katkaisee 35 emäsparia ylävirtaan hiiren kevytketjun lopetuskodonista, käsit-j ‘ : telemällä T4 DNA -polymeraasilla päät tasaisiksi, sitten katkaisemalla BamHI-entsyymillä ja puhdistamalla noin 1 350 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisältää hiiren 35 kappaketjun 3'-sekvenssit. Tuloksena syntynyt fragmentti sisältää noin 250 emäsparia ihmisen kevytketjun vakioalueen 16 115633 3'-osan cDNA:sta ja polyadenylaatiosignaalin, jota seuraa BamHI-linkkeri, kuten on kuvattu rakenteelle Λ8 julkaisussa Lui et ai., J. Immunol., 139: 3521 (1987).
Jäljelle jäänyt osa noin 1 350 emäsparin pituisesta 5 fragmentista sisältää hiiren kappaketjun genomisen 3'-puoleisen BglII-BamHI-fragmentin [fragmentti "D" julkaisussa Xu et ai., J. Biol. Chem., 261: 3838 (1986)], joka sisältää transkription terminaatiosekvenssit. Tätä fragmenttia käytettiin kolmen palan ligaatiossa, jossa oli 10 kaksi palaa plasmidista pING4533: 3044 emäsparin pituinen fragmentti, joka sisältää koko BPI-insertin ja osan vektoria saatuna Sstll-digestiolla, T4-polymeraasi-käsittelyllä ja NotI-digestiolla (joka sisältää koko BPI-insertin ja osan vektoria) , ja noin 4 574 emäsparin 15 pituinen BamHI-NotI-fragmentti. Tuloksena syntynyt vektori, pING4537, on identtinen plasmidin pING4533 kanssa lukuun ottamatta yllä mainittuja eroja 3'-puoleisella trans-loimattomalla genomisella alueella.
Rakennettiin lisävektorit, jotka sisälsivät kappa-20 ketjun 3'-puoleiset transloimattomat sekvenssit, käyttäen ... plasmidia pING4537 kappaketjun 3'-fragmentin lähteenä.
'·* ’ Kappaketjun transloimattomat 3'-sekvenssit eristettiin ' digestoimalla plasmidi pING4537 Xhol-entsyymillä (uniik- kikohta, joka sijaitsee juuri BPI-lopetuskodonin jälkeen) N".‘ 25 ja BamHI-entsyymillä. Tuloksena syntynyttä noin 1 360 !'·*: emäsparin pituista XhoI-BamHI-fragmenttia käytettiin sarjassa ligaatioita, joissa ligoitiin kolme palaa yhteen seuraavien neljän vektorin muodostamiseksi, joissa kaikissa ; on insertit, jotka koodittavat rBPI (1-193) ala132-proteiinia 30 ja joissa on optimoitu Kozakin translaation aloituskohta signaalin jäännöksessä -27: (1) plasmidi pING4143 (gpt- ‘ ' merkki) saatiin ligoimalla pING4223 plasmidin 4574 ; emäsparin pituinen BamHI-Notl-fragmentti (gpt-merkki), plasmidin pING4223 BPI-insertin sisältävä noin 3 019 35 emäsparin pituinen Notl-XhoI-fragmentti ja plasmidin pING4537 XhoI-BamHI-fragmentti; (2) plasmidi pING4146 17 115633 (DHFR-merkki) saatiin ligoimalla plasmidin pING4222 noin 4 159 emäsparin pituinen BamHI-Notl-fragmentti (DHFR-merkki), plasmidin pING4223 BPI-insertin sisältävä noin 3 019 emäsparin pituinen Notl-XhoI-fragmentti ja plasmidin 5 pING4537 XhoI-BamHI-fragmentti; (3) plasmidi pING4150 (his- merkki) saatiin ligoimalla plasmidin pING4221 his-merkin sisältävä noin 4 772 emäsparin pituinen BamHI-Notl-fragmentti, plasmidin pING4222 BPI-insertin sisältävä Notl-Xhol-fragmentti ja plasmidin pING4537 XhoI-BamHI-fragmentti 10 ja (4) plasmidi pING4154 (neo-merkki) saatiin ligoimalla plasmidin pING3174 neo-merkin sisältävä noin 4 042 emäsparin pituinen BamHI-Bsal-fragmentti, plasmidin pING4221 BPI-insertin sisältävä noin 3 883 emäsparin pituinen Bsal-XhoI-fragmentti ja plasmidin pING4537 Xhol-15 BamHI-fragmentti. Plasmidi pING3174 sisältää insertin, joka koodittaa vasta-aineen raskasketjun DNA:ta ja siinä on neo-merkki. Neo-geeni ja sen viereiset sekvenssit saatiin plasmidista pSv2 neo, jonka ovat kuvanneet Southern et ai., J. Mol. Appi. Genet., 1: 327 (1982).
20 F. Plasmidien pING4144 ja pING4151 rakennus ,,, Rakennettiin kaksi plasmidia, pING4144 ja pING4151, ‘ jotka olivat identtisiä plasmidien pING4143 ja pING4150 *·' ' kanssa, vastaavasti, paitsi että rBPI-proteiinia * '· koodittavien sekvenssien ekspressio oli ihmisen 25 sytomegaloviruksen (hCMV) erittäin aikaisen tehostaja/- promoottorin säätelyn alaisia hiiren Abelson-leukemiaviruksen (A-MuLv) LTR-promoottorin sijasta. Sen vuoksi sekä plasmidi pING4144 ja pING4151 sisälsivät ; ,*, kysteiinimutaation kohdassa 132 alaniiniksi, optimoidun « i » 30 Kozakin translaation aloitussekvenssin ja ihmisen
t I
‘F kevytketjun poly-A-alueen/hiiren kappaketjun genomisen • V terminaatioalueen. Alue alkuperäisten vektorien (pING4143 : : ja pING4150) nukleotidien 879 ja 1 708 välissä korvattiin .F hCMV-tehostaja/promoottorialueella, joka vastasi nukleo- • ; « 35 tideja -598 - +174, kuten on esitetty kuviossa 3 julkaisussa Boshart et ai., Cell 41: 521 (1985), joka on 18 115633 liitetty tähän viitteeksi. hCMV-promoottorialueen sisällyttämiseksi BPI-ekspressiovektoreihin rakennettiin ensin plasmidi pING4538 korvaamalla A-MuLv-promoottorin sisältävä plasmidin pING4222 noin 1 117 emäsparin pituinen EcoRI-5 Sali-fragmentti hCMV-promoottorin sisältävällä noin 1 054 emäsparin pituisella EcoRI-Sall-fragmentilla plasmidista pING2250, joka sisältää hCMV-promoottorin ohjaaman vasta-aineen kevytketjuinsertin ekspression. Plasmidin pING4144 rakentamiseksi ligoitiin kolme fragmenttia yhteen: (1) noin 10 2 922 emäsparin pituinen rBPI(1-193)-sekvenssin sisältävä
NotI-XhoI-fragmentti plasmidista pING4538; (2) noin 1 360 emäsparin pituinen XhoI-BamHI-fragmentti plasmidista pING4537; ja (3) noin 4770 emäsparin pituinen his-geenin sisältävä BamHI-Notl-fragmentti plasmidista pING4221.
15 G. Plasmidien pING4145, pING4148 ja pING4152 ra kennus
Rakennettiin plasmidit pING4145, pING4148 ja pING4152, ja ne olivat identtisiä plasmidien pING4143, pING4146 ja pING4150 kanssa, vastaavasti, paitsi että ne 20 sisälsivät villityypin (luonnollisen sekvenssin) kysteiinin kohdassa 132 alaniinisubstituution sijasta. Näin ollen * kaikki sisälsivät rBPI (1-193)-insertin, optimoidun Kozakin V ‘ translaation aloitussekvenssin ja ihmisen kevytketjun poly- * · A-alueen/hiiren kappaketjun genomisen transkription ter- f 25 minaatioalueen. Nämä kolme plasmidia rakennettiin seu- raavasti. Plasmidin pING4145 rakentamiseksi kolme frag-menttia ligoitiin yhteen: (1) noin 3 000 emäsparin pituinen * » * BPI(1-193)-insertin sisältävä Notl-XhoI-fragmentti plas-; midista pING4140 (plasmidi pING4140 on identtinen plasmidin 30 pING4221 kanssa, paitsi että se sisältää villityypin kysteiinin kohdassa 132); (2) noin 1 360 emäsparin pituinen f V XhoI-BamHI-fragmentti plasmidista pING4537; ja (3) noin : ; 4570 emäsparin pituinen gpt-geenin sisältävä BamHI-Notl- ;·’ fragmentti plasmidista pING4223. Plasmidin pING4148 35 rakentamiseksi ligoitiin kolme fragmenttia yhteen: (1)
Notl-XhoI-fragmentti plasmidista pING4140; (2) XhoI-BamHI- 19 115633 fragmentti plasmidista pING4537; ja (3) noin 4 150 emäsparin pituinen DHFR-geenin sisältävä BamHI-Notl-frag-mentti plasmidista pING4222. Plasmidin pING4152 rakentamiseksi ligoitiin kolme fragmenttia yhteen: (1) noin 5 3 000 emäsparin pituinen Notl-XhoI-fragmentti plasmidista pING4142 (plasmidi pING4142 on identtinen plasmidin pING4223 kanssa, paitsi että se sisältää villityypin kysteiinin kohdassa 132); (2) XhoI-bamHI-fragmentti plas midista pING4537; ja (3) noin 4 770 emäsparin pituinen his-10 geenin sisältävä BamHI-Notl-fragmentti plasmidista pING4221.
Alla olevassa taulukossa 1 on yhteenveto niiden plasmidien sisällöistä, joiden valmistus on kuvattu yllä kohdissa A - G.
15
Taulukko I
Plasmidi BPI-tuote Signaali- Merkki- 3'-pää Promoot-I
sekvenssi geeni tori f pING45l9 (l-199)Ala‘” 31 amino- DHFR* Ihmisen 8e" A-MuLv 20 happoa "ominen raskasketju ,, gamma-1
’ poly-A
! pING4S20 (l-199)Ser135 31 amino- DHFR* Ihmisen ge- A-MuLv ! happoa nominen ‘ raskasketju * 25 gamma-1 ____poly-A ___ 1 PING4530 (l-l99)Ala‘“ 31 amino- gpl A-MuLv ; happoa kasketju gamma-1
, poly-A
7 ; 30 pING4533 (l-199)Ala132 Kozakin gpl Ihmisen ge- A.(^uLv . r ' ' λ or nominen ras- ·,. * aloitus- , , , . kasketju sekvenssi; r Γ, . gamma-1 • · 27 amino- , .
• , . poly-A
hapon sig- ’ . *__naali______ ; PING4223 (l-193)Alam Kozakin gpt Ihmisen ge- A_MuLv ! 35 aloitus- nominen ras- ; sekvenssi, kasketju 27 amino- gamma-1 hapon sig- P°Iy ^ __naali_______
Taulukko l jatkuu 20 115633 pING4221 (l-193)Alam Kozakin his Ihmlsen ge" A-MuLv , . nominen ras- aloitus- , , , .
. . kasketiu c sekvenssi, , J gamma 1 2 7 amino- ,
1 . poly-A
hapon sig- y _naali____ pING4222 (l~193)Ala132 Kozakin DHFR Ihmisen ge- A-MuLv aloitus- nominen ras- sekvenssi, kasketju 27 amino- gamma-1
hapon poly-A
signaali __ pING4537 (l~199)Ala132 Kozakin gpt Ihmisen kap- A-MuLv aloitus- paketjun po- sekvenssi, ly-A/hiiren 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen naali transkrip tion termi-naatio pING4143 (l'193)Ala132 Kozakin gpt Ihmisen kap- A-MuLv aloitus- paketkun po- sekvenssi, ly-A/hiiren 20 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen naali transkrip tion termi-naatio j pING4146 (l'193)Ala132 Kozakin DHFR Ihmisen kap- A-MuLv aloitus- paketjun po- • 25 sekvenssi, ly-A/hiiren , 27 amino- kappaketjun * * hapon sig- genominen ; ; naali transkrip tion termi- ____naatjio__
Taulukko 1 jatkuu 21 115633 pING4150 (J-193)Ala132 Kozakin his Ihmisen kap- A-MuLv aloitus- paketjun po- sekvenssi, ly-A/hiiren 5 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen naali transkrip tion termi- ___naatio_
pING4144 (l-193)Ala132 Kozakin gpt Ihmisen kap- hCMV
aloitus- paketjun po- 10 sekvenssi, ly-A/hiiren 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen naali transkrip tion termi- _ naatio_ pING4145 (1-193) Kozakin gpt Ihmisen kap- A-MuLv 15 aloitus- paketjun po— sekvenssi, ly-A/hiiren 27 amino— kappaketjun hapon sig- genominen naali transkrip tion termi-naatio 20 pING4148 (1-193) Kozakin | DHFR Ihmisen kap- A-MuLv ,,, aloitus- paketjun po- V ' sekvenssi, ly-A/hiiren . 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen ; ; naali transkrip tion termi- 25 _ naatio_ pING4152 (1-193) Kozakin his Ihmisen kap- A-MuLv aloitus- paketjun po- sekvenssi, ly-A/hiiren 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen : naali transkrip- , 30 tion termi- naatio
Taulukko 1 jatkuu 22 115633
pING4I51 (1-193)aJa132 Kozakin his Ihmisen kap- hCMV
aloitus- paketjun po- sekvenssi, ly-A/hiiren 27 amino- kappaketjun c hapon sig- genominen naali transkrip tion termi- _____naatio__ pING4154 G-193)ala132 Kozakin neo Ihmisen kap- A-MuLv aloitus- paketjun po- sekvenssi, ly-A/hiiren 1Q 27 amino- kappaketjun hapon sig- genominen naali transkrip tion termi-naatio
Il I III I » *Muutettu DHFR-geeni, joka on kuvattu yhtä aikaa haet-15 tavassa yhteisomistuksessa olevassa US-patenttihake-muksessa, jonka sarjanumero on 08/064 693 ja joka on liitetty tähän viitteeksi.
Esimerkki 2
Solujen transfektio rBPI-kysteiinikorvausanalogien 20 ekspressoimiseksi
Nisäkässolut ovat suositeltavia isäntiä keksinnön '·' ' mukaisten rBPI-proteiinianalogien tuottamiseksi, koska ' sellaiset solut sallivat ekspressoituneiden proteiinien oikean erityksen, laskostumisen ja translaation jälkeiset 'f.’ 25 modifikaatiot. Tällä hetkellä suositeltavat nisäkäsi- säntäsolut keksinnön mukaisten analogien tuottamiseksi sisältävät fibroblasti- ja lymfoidialkuperää olevat solut, kuten: CHO-Kl-solut (ATCC CCL61); CHO-DG44-solut, jotka : _.t ovat CHO Toronto -mutantteja, joista puuttuu 30 dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) , jotka on saatu tohtori Lawrence Chasinilta Columbian yliopistosta; CHO-DXB-11-j solut, jotka ovat CHO-Kl-solujen DHFR""mutantteja, jotka on : : saatu tohtori Lawrence Chasinilta; Vero-solut (ATCC CRL81); hamsterin poikasen munuaissolut (BHK)(ATCC CCL10); Sp2/0- 35 Agl4-hybridoomasolut (ATCC CRL1581); ja NSO-myeloomasolut (ECACC numero 85110503).
23 115633
Nisäkässolujen transfektio voidaan suorittaa eri menetelmillä. Yleinen lähestymistapa sisältää ekspressio-vektori-DNA:n kalsiumfosfaattisaostuksen, joka seuraavaksi menee isäntäsolujen sisään. Toinen yleinen lähestymistapa, 5 elektroporaatio, aiheuttaa sen, että solut ottavat DNA: n sisäänsä membraanihuokosten läpi, jotka muodostuvat vahvan sähkökentän vaikutuksesta [(Sambrook et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 16.30 - 16.31 (1989)]. Transfektoitujen solujen 10 selektiota auttaa sellaisen geenin sisällyttäminen ekspressiovektoriin, jonka tuote sallii transfektoitujen solujen eloonjäännin ja kasvun selektiivisissä olosuhteissa. Useita sellaisia geenejä on tunnistettu. Nämä sisältävät muiden muassa: (1) neo-geenin, joka on 15 prokaryoottinen geeni, joka koodittaa resistenssiä aminoglykosidiantibiootille G418; (2) E. coli -bakteerin guaniinifosforibosyylitransferaasigeenin (gpt), joka koodittaa resistenssiä mykofenolihapolle (MPA) ksantiinin läsnä ollessa [Mulligan et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 20 78: 2072 - 2076 (1981)]; (3) dihydrofolaattire- ... duktaasigeenin (DHFR) , joka sallii DHFR~'solujen kasvun • * * *;' * nukleosidien poissa ollessa ja geeniamplifikaation f ‘ metotreksaatin kohoavien konsentraatioiden läsnä ollessa; '·’ · (4) Salmonella typhimurium -bakteerin hisD-geenin, joka U“: 25 sallii kasvun histidinolin läsnä ollessa [Hartman et ai., ·'* : Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8047 - 8051 (1988)]; (5) E.
coli -bakteerin trpB-geenin [Hartman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8047 - 8051 (1988)], joka sallii kasvun ; indolin läsnä ollessa (ilman tryptofaania) ; ja (6) [!!.’ 30 glutamiinisyntetaasigeenin, joka sallii kasvun alustassa, josta puuttuu glutamiini. Näiden selektiivimerkkien • ’,· saatavuus, joko yksinään tai eri yhdistelminä, muodostaa ; ; joustavuuden sellaisten nisäkässolulinjojen muodostuksessa, jotka ekspressoivat rekombinanttituotteita korkeina 35 tasoina.
24 115633 A. CHO-K1-solujen transfektio plasmidilla pING4533
Plasmidi pING4533 sisältää geenisekvenssit, jotka koodittavat rBPI (1-199)ala132-proteiinia fuusioituna A-MuLv-promoottoriin, optimoidun Kozakin translaation aloitus-5 sekvenssin, ihmisen gamma-l-raskasketjun 3'-pään trans-loimattoman alueen ja gpt-merkin MPA-resistenttien solujen selektoimiseksi.
CHO-Kl-solulinjaa pidetään yllä Ham's F12 -alustassa, jossa on 10 % naudan sikiön seerumia (FBS), 10 johon on lisätty glutamiini/penisilliini/streptomysiini- liuosta (Irvine Scientific, Irvine, CA) . Solut transfektoitiin elektroporaatiolla käyttäen 40 pg:aa plasmidin pING4533 DNA:ta, joka ensin digestoitiin Notl-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin 15 etanolilla. Elektroporaation jälkeen solujen annettiin toipua 24 tuntia ei-selektiivisessä Ham's F12 -alustassa. Sitten solut trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen kon-sentraatioksi 5 x 104 solua/ml Ham's F12 -alustaan, johon oli lisätty MPA:ta (25 pg/ml) ja ksantiinia (250 pg/ml), ja 20 sitten ne maljättiin tiheytenä 104 solua/kuoppa 96- kuoppaisille levyille. Transfektoitumattomat CHO-Kl-solut * > * ’·' * eivät kykene kasvamaan tässä alustassa johtuen pyrimi- ' diinisynteesin inhibitiosta MPA:n johdosta.
Kahden viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka sisälsivät ’“H 25 transfektoituneita soluja, havaittiin 96-kuoppaisilla ·'·*: levyillä. Sellaisten kuoppien supernatantit, jotka sisäl- sivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin BPI-proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen anti-BPI-; i*i ELISA-systeemillä käyttäen rBPI(1-199)-proteiinia standardi , ‘ 30 dina. Tässä testissä 96-kuoppaiset Immulon-II-levyt (Dynatech, Chantilly, VA) esipäällystettiin affinitteet-I tipuhdistetulla kanin anti-rBPI(1-199)-antiseerumilla.
;" ; Supernatanttinäytteet lisättiin ja tunnistus suoritettiin käyttäen af f initeettipuhdistettua, biotinyloitua kanin 35 anti-rBPI(1-199)-antiseerumia ja peroksidaasileimattua avidiinia.
25 115633
Noin 800 pesäkettä seulottiin tällä tavalla. 31 pesäkettä, joissa oli korkein tuotto, siirrettiin 24-kuoppaisille levyille tuottoarviota varten. Solut kasvatettiin konfluenteiksi 24-kuoppaisella levyllä Ham's F12 5 -alustassa, johon oli lisätty 10 % FBS:ia. Kun solut olivat saavuttaneet konfluentin asteen, Ham's F12 -alusta poistettiin ja lisättiin 1 ml seerumivapaata HB-CHO-alustaa (Irvine Scientific) ja 40 μΐ steriilejä S-Sepharose-helmiä (Pharmacia, Piscataway, NJ) , kuten on kuvattu yhtä aikaa 10 haettavassa yhteisomistuksessa olevassa US-patentti- hakemuksessa, jonka sarjanumero on 08/072 063 ja jota hakee Grinna. Sitten soluja inkuboitiin 7 vuorokautta, jonka jälkeen S-Sepharose-helmet poistettiin ja pestiin liuoksella, joka oli 0,1 M NaCl 10 mM Tris-puskurissa (pH 15 7,5). Tuote eluoitiin helmistä lisäämällä liuosta, joka oli 1,0 M NaCl Tris-puskurissa, ja kvantitoitiin ELISA-menetelmällä, kuten on kuvattu yllä. Huipputuot-tajatransformantti, jolle annettiin nimi A153, eritti noin 3 pg/ml tässä kokeessa ja se sopeutettiin kasvamaan 20 seerumivapaassa Excell 301 -alustassa (JRH Scientific, ,,, Lenexa, KS) . Sopeutettuja soluja kasvatettiin 1,5 1 * * · ’·’ ' fermentoreissa Excell 301 -alustassa S-Sepharose-helmien ’·' ‘ läsnä ollessa. Tuotto arvioitiin 120 - 140 tunnin kuluttua sen tuotteen C4 HPLC -analyysillä, joka eluoitui S-25 Sepharose-helmistä (50 ml määrinä). Tuotto oli 15 - 25 pg/l näissä fermentointivaiheissa.
B. CHO-DG44-solujen transfektio plasmidilla pING4222 ; (-t Plasmidi pING4222 sisältää DNA:ta, joka koodittaa ,,, 30 rBPI (1-193) ala -analogia fuusioituna A-MuLv-promoottorim, 'F optimoidun Kozakin aloitusekvenssin, ihmisen gamma-1- • '/ raskasketjun 3'-pään transloimattoman alueen ja hiiren : : DHFR-geenin transfektoituneiden solujen selektiota varten ./ nukleosidivapaassa alustassa.
35 Solulinjaa CHO DG44 ylläpidettiin Ham's F12 -alustassa, jossa oli 10 % FBS:ia yhdessä gluta- 26 115633 miini/penisilliini/streptomysiini-liuoksen kanssa. Solut transfektoitiin linearisoidun plasmidin pING4222 DNA:11a (40 pg digestoituna Pvul-entsyymillä, uutettu fenoli-kloroformilla, saostettu etanolilla) käyttäen kal-5 siumfosfaattimenetelmää, jonka ovat kuvanneet Wigler et ai., Cell, 11: 223 (1977). Kalsiumfosfaattikäsittelyn jälkeen solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheyteen, joka oli noin 104 solua/ml, ja transfektantit saatiin kasvattamalla selektiivisessä alustassa, joka 10 sisälsi οίΜΕΜ-alustaa, josta puuttui nukleosidit (Irvine Scientific) ja johon oli lisätty dialysoitua FBS:ia (100 ml seerumia, joka oli dialysoitu 4 litraa vastaan kylmää 0,15 M NaCl-liuosta käyttäen 6 000 - 8 000 MW cutoff-arvon dialyysimembraania, 16 tuntia, 4 °C:ssa). Transfektoi- 15 tumattomat CHO-DG44-solut eivät kykene kasvamaan tässä alustassa johtuen DHFR-mutaatiosta ja nukleosidien puutteesta alustassa, johon oli lisätty dialysoitua seerumia.
Kahden viikon kuluttua kukin kuoppa sisälsi noin 20 2-3 pesäkettä. 96-kuoppaisen levyn kuoppien supernatantit ... analysoitiin rBPI (1-193) ala -proteiinin läsnäolon suhteen ’ ELISA-menetelmällä, kuten kohdassa A. 24 korkeimmin I I > V * tuottavaa pesäkettä laajennettiin 24-kuoppaisille levyille selektiivisessä αΜΕΜ-alustassa, johon oli lisätty 0,05 μΜ 25 metotreksaattia rBPI-analogia koodittavan geenin DNA:n ί * : amplifioimiseksi. Kun kasvua havaittiin, solut siirrettiin uudelle 24-kuoppaiselle levylle ja tuotto arvioitiin > I r
S-sepharose-eluaateista, kuten on kuvattu osassa A
; ,·, pING4533/CHO-Kl-transfektanteille. Viisi korkeimmin tuot- 30 tavaa kloonia yhdistettiin ja ne jatkokloonattiin F’ rajoittavalla laimennoksella 96-kuoppaisille levyille.
• *.· Supernatanttikuopat, jotka sisälsivät yksittäisen pe- : ; säkkeen, testattiin rBPI(1-193)ala -proteiinin tasojen suhteen ELISA-menetelmällä. Kaksikymmentä korkeimmin 35 tuottavaa jatkokloonia laajennettiin seuraavaksi 24- kuoppaisille levyille ja ne altistettiin lisä- 27 115633 amplifikaatiolle 0,4 μΜ metotreksaatin läsnä ollessa ja tuotteen ekspressiotasot amputoiduille soluille määritettiin ELISA-menetelmällä. Huipputuottajat, kloonit 4, 75 ja 80, erittivät 25 - 37 pg/ml seitsemänä vuorokautena 24-5 kuoppaisella levyllä, joka sisälsi S-sepharose-resiiniä.
C. Sp2/O~solujen transfektio plasmidilla pING4223 ja pING4221
Strategia, jota käytettiin yritettäessä saada aikaan haluttujen rBPI-tuotteiden optimaalinen ekspressio, 10 sisälsi sellaisten solujen transfektion, joissa oli ensimmäinen ekspressioplasmidi, jossa oli ensimmäinen merkkigeeni, huipputuottajien seulonnan ja sitten samojen solujen transfektoimisen toisella ekspressioplasmidilla, jossa oli eri merkkigeeni. Tämä strategia on kuvattu alla 15 käyttäen Sp2/0-soluja.
Plasmidi pING4223 sisältää DNA:n, joka koodittaa rBPI (1-193)ala132-BPI-proteiinia fuusioituna A-MuLv-pro- moottoriin, optimoidun Kozakin translaation aloitus- sekvenssin, ihmisen gamma-l-raskasketjun 3'-pään trans- 20 loimattomat sekvenssit ja gpt-merkin MPA-resistenssien ... solujen selektoimiseksi.
* > · * Sp2/0-solulinjaa ylläpidettiin DMEM-alustassa, *·* ' johon oli lisätty 10 % FBS:ia yhdessä glutamiini/- ’ ' penisilliini/streptomysiini-liuoksen kanssa. Sp2/0-solut 25 transfektoitiin elektroporaatiolla käyttäen 40 yg:aa j : plasmidin pING4223 DNA: ta, joka oli digestoitu Notl- entsyymillä, uutettu fenoli-kloroformilla ja saostettu etanolilla. Elektroporaation jälkeen solujen annettiin : ,·, toipua 48 tuntia ei-selektiivisessä DMEM-alustassa. Sitten
» I I
30 solut sentrifugoitiin ja ne suspensoitiin uudelleen ", konsentraationa 5 x 104 solua/ml DMEM-alustaan, johon oli ; ‘ · lisätty MPA:ta (6 pg/ml) ja ksantiinia (250 pg/ml) , ja ne !)t ; maljattiin tiheytenä 104 solua/kuoppa 96-kuoppaisille ;·, levyille. Transfektoitumattomat Sp2/0-solut eivät kykene 35 kasvamaan tässä alustassa johtuen pyrimidiinisynteesin inhibitiosta MPA:n johdosta. 1,5 - 2 viikon kuluttua 28 115633 pesäkkeitä, jotka sisälsivät transfektoituneita soluja, havaittiin 96-kuoppaisilla levyillä. Supernatantit kuopista, jotka sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin tuotteen kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen 5 ELISA-menetelmällä. Huipputuottajat siirrettiin 24- kuoppaiselle levylle ja tuotto arvioitiin loppuun kasvaneissa 24-kuoppaviljelmissä soluille, joita oli kasvatettu niin, että läsnä oli 10”7 M deksametasonia tai sitä ei ollut, joka aiheuttaa kohoamisen A-MuLv- 10 promoottorin aiheuttamassa ekspressiossa johtuen interaktioista glukokortikoidireseptorin kanssa. Paras tuottaja, klooni 2X3, eritti noin 3 gg/ml ja 7 gg/ml silloin, kun deksametasonia ei ollut läsnä ja sitä oli läsnä, vastaavasti.
15 Seuraavaksi klooni 2X3 transfektoitiin elektro- poraatiolla plasmidilla pING4221, joka sisältää his-geenin transfektanttien selektiota varten. Kun oli annettu toipua 48 tuntia DMEM-alustassa, jossa oli 10 % FBS-alustaa, solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheytenä, joka oli 20 noin 104 solua/kuoppa, DMEM/FBS-alustassa, johon oli
lisätty 6 gg MPA:ta/ml, 250 gg ksantiinia/ml ja 8 mM
• r # histidinolia. Transf ektoitumattomat solut eivät kykene • « **’ * kasvamaan histidinolin ja MPA:n läsnä ollessa. 1,5 - 2 ‘ ’ viikon kuluttua transfektoituneita soluja havaittiin 96- ’·' * 25 kuoppaisilla levyillä. Supernatantit kuopista, jotka | ' sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin rBPI- ; proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä.
; Huipputuottajat siirrettiin 24-kuoppaiselle f·* 30 levylle. Tuotto arvioitiin loppuun kasvaneissa 24- kuoppavil j elmissä soluille, joita kasvatettiin niin, että • ‘ ’ läsnä oli 10-7 M deksametasonia tai sitä ei ollut. Paras : tuottaja, klooni 2X3-130, eritti noin 15 gg/ml ja 30 gg/ml y, silloin, kun läsnä ei ollut deksametasonia tai sitä oli, 35 vastaavasti. Seuraavaksi tämä isolaatti jatkokloonattiin rajoittavalla laimennoksella 96-kuoppaisille levyille.
29 115633
Kuopat, jotka sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, seulottiin ELISA-menetelmällä ja parhaat tuottajat laajennettiin ja ne testattiin uudelleen 24-kuoppaviljelmissä niin, että läsnä oli 1CT7 M deksametasonia tai sitä ei ollut. Korkeimmin 5 tuottava jatkoklooni, numero 25, eritti noin 16 pg/ml ja 33 pg/ml silloin, kun läsnä ei ollut deksametasonia tai sitä oli läsnä, vastaavasti.
D. Sp2/0-solujen transfektio plasmidilla pING4143 ja pING4150 10 Plasmidi pING4143 sisältää DNA:n, joka koodittaa rBPI (1-193)ala132-proteiinia fuusioituna A-MuLv-promoot-toriin, optimoidun Kozakin translaation aloitussekvenssin ja hiiren kappakevytketjun 3'-pään transloimattomat sekvenssit yhdessä gpt-geenin kanssa MPA-resistenttien 15 solujen selektoimiseksi. Sp2/0-solut transfektoitiin elektroporaatiolla käyttäen 40 pg:aa plasmidin pING4143 DNA:ta, joka digestoitiin ensin Notl-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Elektro-poraation jälkeen solujen annettiin toipua 48 tuntia ei-20 selektiivisessä DMEM-alustassa. Sitten solut sentri-fugoitiin ja ne suspensoitiin uudelleen konsentraationa 5 x ’ 104 solua/ml DMEM-alustassa, johon oli lisätty MPA:ta (6 ** * pg/ml) ja ksantiinia (250 pg/ml), ja ne maljattiin '·’ ’ tiheytenä, joka oli noin 104 solua/kuoppa, 96-kuoppaisille : 25 levyille.
i * : Noin kahden viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka sisälsivät transfektoituneita soluja, havaittiin 96-kuoppaisilla levyillä. Supernatantit kuopista, jotka : ,·, sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin BPI- 30 proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. Huipputuottajat siirrettiin 24- kuoppaiselle levylle. Tuotto arvioitiin loppuun kasvaneissa
: 24-kuoppaviljelmissä soluille, joita kasvatettiin 10"7 M
deksametasonin läsnä ja poissa ollessa. Paras tuottaja, ’ , 35 klooni 134, eritti noin 12 pg/ml ja noin 28 pg/ml silloin, 30 115633 kun deksametasonia ei ollut läsnä ja kun sitä oli, vastaavasti.
Klooni 134 transfektoitiin elektroporaatiolla vektorilla pING4150, joka sisältää DNA:ta, joka koodittaa 5 rBPI(1-193)ala132-proteiinia fuusioituna A-MuLv-promoot- toriin ja hiiren kevytketjun 3'-pään transloimattoman alueen yhdessä his-geenin kanssa transfektanttien selektoimiseksi. Ennen elektroporaatiota vektori diges- toitiin ensin ja uutettiin fenoli-kloroformilla ja 10 saostettiin etanolilla. Kun oli annettu toipua 48 tuntia DMEM-alustassa, jossa oli 10 % FBS:ia, solut maljattiin 96- kuoppaisille levyille tiheytenä, joka oli noin 104 solua/kuoppa, DMEM/FBS-alustassa, johon oli lisätty 6 pg MPA:ta/ml ja 250 pg ksantiinia/ml ja 8 mM histidinolia.
15 Transfektoitumattomat solut eivät kykene kasvamaan MPA:n ja histidinolin läsnä ollessa. Noin kahden viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka sisälsivät transfektoituneita soluja, havaittiin 96-kuoppaisilla levyillä. Supernatantit kuopista, jotka sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, 20 analysoitiin BPI-proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. Huipputuottajät ·’ ' siirrettiin 24-kuoppaiselle levylle. Tuotto arvioitiin '·’ ‘ loppuun kasvaneissa 24-kuoppaviljelmissä soluille, joita ’* · kasvatettiin 10~7 M deksametasonin läsnä- tai poissa N": 25 ollessa. Huipputuottaja, klooni 134-11, nimettiin uudelleen : * : klooniksi C1770. Klooni C1770 eritti 36 pg/ml ilman • * deksametasonia ja enemmän kuin 42 pg/ml deksametasonin kanssa. Tämä klooni (cl770) talletettiin kokoelmaan ; ,·, American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, 30 Rockville, MD 20852, koodinumerolla HB 11247.
t » E. CHO-Kl-solujen transfektio plasmidilla pING4143 • \· CHO-Kl-solulinja transfektoitiin plasmidin pING4143 : ; DNA:11a samalla tavalla kuin on kuvattu osassa A, jossa CHO-Kl-solut transfektoitiin plasmidilla pING4533. Noin , 35 kahden viikon kuluttua supernatantit noin 800 kuopasta, jotka sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin BPI- 31 115633 proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. Huipputuottajat, jotka erittivät noin 9 - 13 pg/ml, voidaan seuraavaksi sopeuttaa seerumi- vapaaseen alustaan, kun niitä valmistetaan fermentorissa 5 kasvatettavaksi. Nämä voidaan myös transfektoida uudelleen vektorilla, kuten pING4150 tai pING4154, joissa on merkkigeeninä his tai neo, vastaavasti, sellaisen solulinjan saamiseksi, joka tuottaa jopa korkeampia rBPI-tuotteen tasoja.
10 F. CHO-Kl-solujen transfektio plasmidilla pING4144
Plasmidi pING4144 on samanlainen kuin plasmidi pING4143, paitsi että se sisältää ihmisen sytome- galoviruksen (hCMVj promoottorin A-MuLv-promoottorin sijasta. CHO-Kl-solulinja transfektoitiin plasmidin 15 pING4144 DNA:11a samalla tavalla kuin on kuvattu yllä olevassa kohdassa A. Noin kahden viikon kuluttua supernatantit noin 200 kuopasta, jotka sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin BPI-proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. 20 Huipputuottajat siirrettiin 24-kuoppaisille levyille ja rBPI-proteiinin ekspressio määritettiin 24-kuoppaisilta • · · ‘ levyiltä, jotka sisälsivät natriumbutyraattia. Huippu- • * · ’·' ‘ tuottaja (klooni 174) eritti tässä testissä noin 3-5 • * pg/ml ilman butyraattia ja noin 15 - 18 μg/ml silloin, kun 25 läsnä oli 5 mM butyraattia. Tämä klooni, jolle annettiin 1 uusi nimi C1771, talletettiin kokoelmaan American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, ATCC-koodinumerolla CRL 11246. Huipputuottajat ; ,·, voidaan seuraavaksi sopeuttaa seerumivapaaseen alustaan, 30 kun niitä valmistellaan kasvatettavaksi fermentorissa. Ne t · voidaan myös transfektoida uudelleen vektorilla, kuten ; pING4151 tai pING4155, jotka sisältävät rBPI-geenin hCMV- > promoottorin säätelyn alaisuudessa, mutta joissa on his tai neo selektiivisenä merkkigeeninä, vastaavasti, sellaisen 35 solulinjan saamiseksi, joka tuottaa jopa korkeampia rBPI- tasoja.
32 115633 6. NSO-solujen transfektio plasmidilla pING4143 NSO-solut transfektoitiin plasmidin pING4143 DNA:11a elektroporaatiolla. Noin kolmen viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka sisälsivät transfektoituneita soluja, 5 havaittiin 96-kuoppaisilla levyillä. Supernatantit kuopista, jotka sisälsivät yksittäiset pesäkkeet, analysoitiin BPI-proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. Huipputuottajat siirrettiin 24-kuoppaiselle levylle. Tuotto arvioitiin loppuun kasvaneilla 10 24-kuoppaisilla viljelmillä. Huipputuottajat erittivät 15 -16 pg/ml. Huipputuottajät voidaan transfektoida uudelleen vektorilla, kuten pING4150, kuten on kuvattu yllä jopa parempien tuottajien aikaansaamiseksi.
H. NSO-solujen transfektio plasmidilla pING4232 15 NSO-solut transfektoitiin elektroporaatiolla plasmidilla pING4132, joka sisältää DNA:ta, joka koodittaa 132 · rBPI (1-193)ala -proteiinia fuusioituna optimaaliseen
Kozakin translaation aloitussekvenssiin, joka on kloonattu vektoriin pEE13 [Bebbington et ai., Biotechnology, 10: 20 169 - 175 (1992)]. Vektori pEE13 sisältää glutamii- ,,, nisyntetaasigeenin sellaisten transfektanttien selektoi- * > · ’ miseksi, jotka kykenevät kasvamaan alustassa, josta puuttuu • » » V ‘ glutamiini. Noin kolmen viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka ' sisältävät transfektoituja soluja, havaittiin 96- : 25 kuoppaisilla levyillä. Supernatantit kuopista, jotka i ' : sisälsivät yksittäisiä pesäkkeitä, analysoitiin ELISA- menetelmällä. Huipputuottajat siirrettiin 24-kuoppaiselle * > < levylle. Tuotto arvioitiin loppuun kasvaneina 24-; ,·, kuoppaviljelminä. Huipputuottajat, jotka erittivät 7-15 k.V 30 pg/ml loppuun kasvaneissa 24-kuoppaviljelmissä, voidaan t · seuraavaksi altistaa amplif ikaatiolle eri metioniini-• sulfoksimiinin konsentraatioiden läsnä ollessa.
' : I. Sp2/0-solujen transfektio plasmidilla pING4145 ' Plasmidi pING4145 sisältää DNA:ta, joka koodittaa 35 rBPI(1-193)ala132-proteiinia fuusioituna A-MuLv-promoot-toriin, optimoidun Kozakin translaation aloitussekvenssin, 33 115633 hiiren kappakevytketjun 3'-pään transloimattomat sekvenssit ja qpt-qeenin MPA-resistenttien solujen selektoimiseksi. Sp2/0-solut transfektoitiin elektroporaatiolla käyttäen 40 pg:aa plasmidin pING4145 DNA:ta, joka digestoitiin ensin 5 Notl-entsyymillä, uutettiin fenoli-kloroformilla ja saostettiin etanolilla. Elektroporaation jälkeen solujen annettiin toipua 48 tuntia ei-selektiivisessä DMEM-alustassa, sentrifugoitiin ja ne suspensoitiin uudelleen konsentraationa 5 x 104 solua/ml DMEM-alustaan, johon oli 10 lisätty MPA:ta (6 pg/ml) ja ksantiinia (250 pg/ml) . Solut voidaan sitten maljata tiheytenä, joka on noin 104 solua/ml, 96-kuoppaisille levyille. Noin kahden viikon kuluttua pesäkkeitä, jotka sisältävät transfektoituneita soluja, havaitaan 96-kuoppaisilla levyillä. Supernatantit 15 kuopista, jotka sisältävät yksittäiset pesäkkeet, voidaan sitten analysoida BPI-proteiinin kanssa reagoivan proteiinin läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. Huippu-tuottajat siirretään 24-kuoppaiselle levylle ja tuotto arvioidaan loppuun kasvaneissa 24-kuoppaisissa viljelmissä 20 soluille, joita kasvatetaan deksametasonikonsentraation ,,, 10"7 M läsnä ja poissa ollessa.
’·' * BPI-proteiinin ekspression maksimoimiseksi kor- ’ keimmin tuottavat Sp2/0-transfektantit voidaan trans- fektoida elektroporaatiolla vektorilla, joka sisältää *P'.‘ 25 geenisekvenssit, jotka koodittavat rBPI (1-193) ala132- proteiinia fuusioituna A-MuLv-promoottoriin ja hiiren kappakevytketjun 3'-pään transloimattoman alueen yhdessä his-geenin kanssa transfektanttien selektoimiseksi.
; ,·, J. CHO-Kl-solujen transfektio plasmidilla pING4145 30 CHO-Kl-solulinja transfektoitiin plasmidin pING4145 DNA: 11a samalla tavalla kuin on kuvattu yllä osassa A. Noin ; '/· kahden viikon kuluttua supernatantit noin 500 - 800 : kuopasta, jotka sisältävät yksittäiset pesäkkeet, voidaan ’ analysoida BPI-proteiinin kanssa reagoivan proteiinin 35 läsnäolon suhteen ELISA-menetelmällä. Huipputuottajat siirretään 24-kuoppaisille levyille ja BPI-proteiinin 34 115633 ekspressio määritetään 24-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät S-sepharose-resiiniä. Seuraavaksi huippu-tuottajat sopeutetaan seerumivapaaseen alustaan valmisteltaessa niitä fermentorikasvatusta varten. Ne voidaan 5 myös transfektoida uudestaan vektorilla, joka sisältää erilaisen selektiomerkin niin, että saadaan aikaan solu-linja, joka tuottaa jopa korkeampia rBPI-tuotteen tasoja.
K. rBPI-tuotteiden ekspressio hyönteissoluissa
Toinen eukaryoottinen systeemi, jossa rBPI-10 tuotteita voidaan ekspressoida, on hyönteissolut, jotka on infektoitu rekombinanttibakuloviruksella, joka sisältää rBPI-tuotetta koodittavan DNA:n. Systeemit rekombi-nanttiviruksen muodostamiseksi ja rekombinanttituotteiden ekspression aikaansaamiseksi niissä ovat kaupallisesti 15 saatavissa (Invitrogen, San Diego, CA) . rBPI(1-199)- proteiinia koodittava DNA, joka sisältää 31 aminohapon pituisen signaalisekvenssin, kloonattiin Nhel-kohtaan pBlueBac-siirtovektoriin (Invitrogen). Sf9-hyönteissolut (BRL; ATCC CRL 1711) transfektoitiin yhdessä tällä 20 vektorilla ja villityypin AcMNPV-viruksella (Autographa ... californica multiple nuclear polyhedrosis -virus,
Invitrogen) . Sitten tunnistettiin rekombinanttivirusplakit, ’*' * ne puhdistettiin ja niitä käytettiin muodostamaan ’ * korkeatiitteriset rekombinanttiviruksen varastoliuokset, '·"· 25 kuten on kuvattu ohjeissa, jotka on saatavissa tuottajalta iv: BRL.
Yhdistelmä-DNA-menetelmällä tuotettua bakulovirusta käytettiin infektoitaessa lisää Sf9-soluja. Tämän ; ,·, suorittamiseksi kahdeksan erillistä 60 mm:n maljaa Sf9- 30 soluja infektoitiin bakuloviruksella. Kustakin kahdeksasta ''' maljasta otettiin näyte eri aikoina päivän aikana • V keräämällä alusta infektoitujen solujen maljalta. Keräyksen : aikana alusta sentrifugoitiin nopeudella 1 000 kierrosta ;·’ minuutissa 10 minuutin ajan ja supernanatantti säilytettiin 35 4 °C:ssa. Sitten solut huuhdeltiin kerran 4 ml:11a PBS:ää ja ne lyysattiin lisäämällä 100 μΐ/malja NP40- 35 115633
lyysispuskuria (1 % NP40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH
8,0) inkuboimalla jäissä 30 minuuttia. Sitten solut kerättiin Eppendorf-putkeen solukaapimella. Sitten solulysaatti ajettiin pohjaan mikrofuugissa kahden minuutin 5 ajan. Lysaatin supernatantti siirrettiin uuteen putkeen ja se säilytettiin -20 °C:ssa. Kustakin päivittäisestä aikapisteestä peräisin oleva alustanäyte analysoitiin BPI-sisällön suhteen ELISA-menetelmällä ja lysaatit analysoitiin Western-menetelmällä käyttäen anti-BPI-vasta-10 ainetta.
Mitään rBPI-tuotetta ei ollut havaittavissa alustassa ELISA-menetelmällä vuorokausina 1-4 infektion jälkeen. Kuitenkin vuorokausina 5-6 infektion jälkeen havaittiin alustanäytteissä huippu, joka vastasi määrää 15 200 - 500 ng rBPI-tuotetta/ml. Lysaattien Western-analyysi osoitti noin 23 kDa kokoisen BPI-reaktiivisen rintaman läsnäolon vuorokautena 2 infektion jälkeen. Tämä rintama osoitti kohoavan intensiteetin vuorokauteen 6 saakka.
Alla olevassa taulukossa II on yhteenveto 20 transfektioista, jotka on kuvattu yksityiskohtaisesti yllä olevissa kohdissa A - J.
Taulukko II
, Isäntäsolu Transfektoitu plasmidilla 25-- :v. _CHO-DG44__pING4222_ ; ’ . CHO-K1 pING4533, pING4143, _pING4144, pING4145_ . NSO pING4143, pING4232_ . SP2/0 pING4223, jonka jälkeen plasmidilla pING4221, ·'1 pING4l43, jonka jälkeen plasmidilla pING4150, pING4145 • · _ _ __ ____________ * I * 36 115633
Esimerkki 3
Plasmidien rakennus rBPI (1-199) ala132- ja rBPI(l-199) ser135-proteiinien in vitro transkriptiota ja translaatiota varten 5 In vitro transkriptio-translaatio-tutkimukset suoritettiin käyttäen plasmidia pIC127 sellaisen DNA:n lähteenä, joka kooditti rBPI(1-199)-proteiinia. Plasmidin pICl27 rakennus suoritettiin seuraavasti. rBPI(1-199)-proteiinia koodittava DNA, joka sisälsi 31 aminohapon 10 pituisen signaalisekvenssin, amplifioitiin PCR-menetelmällä plasmidista, joka sisälsi täyspitkän cDNA:n, joka kooditti BPI-proteiinia pGEM-72Z(+)-plasmidissa. Amplifikaatio suoritettiin niin, että Sali-kohta sisällytettiin rBPI-proteiinia koodittavan sekvenssin 5'-päähän ja XhoI- ja 15 Sstll-kohdat sisällytettiin 3'-päähän käyttäen alukkeita BPI-3: GTCGACGCATGCGAGAGAACATGGC (SEQ ID -numero 12) ja BPI-2: CCGCGGCTCGAGCTATATTTTGGTCAT (SEQ ID -numero 9).
Tuloksena syntynyt PCR-amplifioitu fragmentti tehtiin tasapäiseksi ja kloonattiin Smal-kohtaan plasmidin pT7T3 20 18u (Pharmacia LKB Technology, Piscataway, NJ) usean kloonauskohdan sisältävässä alueessa plasmidin pIC102 *** ’ muodostamiseksi.
* Plasmidin pIC102 insertti, joka kooditti rBPI(l- 199)-proteiinia ja 31 aminohapon pituista signaalia, G": 25 irrotettiin digestoimalla plasmidi BamHI- ja Asp718I- entsyymeillä. BamHI-kohta on plasmidin pIC102 Sali-kohdan * vieressä ja Asp718I-kohta on plasmidin pIC102 Sstll-kohdan vieressä. Irrotetun fragmentin päät tehtiin tasaisiksi T4 ; DNA -polymeraasilla ja tasapäinen fragmentti kloonattiin ‘ V.30 sitten plasmidiin pGEMl (Promega, Madison, WI) , joka oli • * ensin digestoitu PstI- ja EcoRI-entsyymeillä ja tehty • 'y tasapäiseksi T4 DNA -polymeraasilla. Tuloksena syntynyt : : rakenne nimettiin plasmidiksi pIC124 ja siinä on rBPI(l- 199)-proteiinia koodittava insertti orientoitu niin, että 35 sen 5'-pää on plasmidin pGEMl SP6-promoottorin vieressä.
37 115633
Sitten plasmidin pIC124 insertti, joka sisälsi 31 aminohapon pituisen signaalisekvenssin, irrotettiin poistamalla plasmidin pIC124 kahden HincII-kohdan välinen alue muodostaen plasmidi pIC127. Irrotettu alue korvattiin 5 linkkerillä, joka muodosti uudelleen aloituskodonin (ATG) ja sekvenssin, joka kooditti BPI-proteiinin ensimmäistä aminohappoa. Kaksi fragmenttia eristettiin digestoimalla plasmidi pIC124 Hindi- ja Sstll-entsyymeillä: (1) HincII-
Sstll-fragmentti, joka sisälsi rBPI(1-199)-proteiinia koo-10 dittavan alueen lukuun ottamatta ensimmäisen aminohapon kodonia; ja (2) SstII-HincII-fragmentti, joka sisälsi
plasmidin jäljellä olevan alueen. BPI-proteiinia koo-dittavan sekvenssin ensimmäinen kodoni ja BPI-sekvenssin edessä oleva metioniinikodoni insertoitiin käyttäen 15 linkkeriä, joka muodostettiin hybridisoimalla yhteen kaksi komplementaarista oligonukleotidia, BPI-28: GACGCCACCATGGTC (SEQ ID -numero 13) ja BPI-29: GACCATGGTGGCGTC (SEQ ID
-numero 14). Nämä kaksi oligonukleotidia ligoitiin yhteen plasmidin pIC124 HincII-Sstll- ja SstII-HincII-fragmenttien 20 kanssa muodostaen plasmidi pIC127.
Rakennettiin kaksi plasmidia, pMLIOI ja pML102, ' ’ käyttäen plasmidia pIC127 rBPI (1-199) ala132- ja rBPI(l- ‘ ’ 199)ser135-proteiinin in vitro transkriptio/translaatiossa.
: * Tämän suorittamiseksi plasmidi pIC127 digestoitiin Sstll- ’f: 25 ja EcoRI-entsyymeillä ja suuri Sstll-EcoRI-fragmentti : ’ : puhdistettiin. Plasmidin pMLIOI, joka sisältää rBPI(l- « 199) ala132-insertin, rakentamiseksi plasmidin pING4519 EcoRI-Sstll-fragmentti ligoitiin plasmidin pIC127 Sstll-; ,·, EcoRI-fragmenttiin. Plasmidin pML102, joka sisältää rBPI(l- 30 199) ser135-insertin, rakentamiseksi plasmidin pING4520
EcoRI-SstII-fragmentti ligoitiin plasmidin pICl27 Sstll-• EcoRI-fragmenttiin.
rBPI (1-199)-, rBPI (1-199) ser135- ja BPI (1-199) ala132-proteiineja ekspressoitiin imi vitro plasmideista pIC127, 35 pMLIOI ja pMLl02 käyttäen TNT SP6 Coupled Reticulocyte Lysate System -käyttöpakkausta, jota valmistaa Promega 38 115633 (Madison, WI). Tämä systeemi sallii kloonattujen geenien yhteenliitetyn in vitro transkription ja translaation käyttäen eukaryoottista translaatiosysteemiä. Kukin yhteenliitetty transkriptio/translaatio suoritettiin käyt-5 täen tuottajan ohjeita 2 pg:lla plasmidi-DNA:ta 25 μ1:η kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 35S-metioniinia leimatun proteiinin aikaansaamiseksi. Leimatut proteiinituotteet lisättiin 5 ylin määrinä 20 μΐ:aan urea-näytepuskuria ja niitä kuumennettiin 95 °C:ssa kolme minuuttia. Pienet 10 määrät (10 μΐ) kustakin näytteestä ajettiin 15 % SDS- polyakryyliamidigeelissä joko DTT:n kanssa (50 mM) tai ilman sitä. Kun geeli oli fiksattu ja kuivattu, leimatut proteiinirintamat tehtiin silmin näkyviksi autoradio-grafialla. Autoradiografiatulokset osoittavat, että rBPI(l-15 199)-, rBPI (1-199) ala132- ja rBPI (1-199) cys135-proteiineja koodittavat cDNA:t ekspressoivat proteiineja, joilla oli odotettu BPI-proteiinin N-pään fragmentin koko, joka oli noin 23 kDa. Lisäksi kaikki kolme ekspressiotuotetta, rBPI (1-199), rBPI (1-199) ala132 ja rBPI (1-199) cys135, kyke-20 nivät muodostamaan korkeamman molekyylipainon sisältäviä lajeja, joiden koko oli odotettu dimeerisille BPI (1-199)-proteiineille kuin myös suurempia lajeja, jotka kaikki '·* ’ hävisivät DTTrllä pelkistettäessä. Ajatellaan, että ’ * dimeeristen muotojen ekspressio rBPI (1-199) cys135- ja * · 25 rBPI(1-199)ala -tuotteissa voi olla tulosta soluvapaan in : ‘ ; vitro transkriptio/translaatiosysteemin käytöstä. Sellainen systeemi ei salli oikeata translaation jälkeistä prosessointia, laskostumista jne., joka normaalisti tapahtuu : ,·, solutranslaatiossa. Näin ollen voi olla, että oikeat !!.’ 30 disulfidisidokset eivät aina muodostu jLn vitro systeemissä, • t joka johtaa joissain tapauksissa dimeerien muodostumiseen.
• *,· Leimatut proteiinit, joita muodostui yllä kuvatussa : : in vitro ekspressiosysteemissä, testattiin seuraavaksi LPS- sitoutumisaktiivisuuden suhteen. Mikrotiitterilevyjen 35 kuopat päällystettiin Salmonella minnesota R7 -bakteerin (Rd-mutantti) LPS:llä (5 mg/ml metanolivarastoliuoksessa) , 39 115633 joka oli 0,1 M Na2CC>3/20 mM EDTA -liuoksessa (ety-leenidiamiinitetraetikkahappo), pH 9,4 (kaiken kaikkiaan 2 pg LPS:ää 50 μ1:η kuopassa). Kun oli inkuboitu yli yön 4 °C:ssa, kuopat huudeltiin vedellä ja kuivattiin 5 37 °C:ssa. Sitten kuopat blokeerattiin 215 pl:lla
Dulbecco's-PBS/0,1 % BSA -liuoksessa kolme tuntia 37 °C:ssa. Sitten blokeerausliuos kaadettiin pois ja kuopat pestiin PBS/0,2 % Tween-20-liuoksella. Sitten lisättiin rBPI-näytteet (2 μΐ translaatioreaktanttia) 50 μ1:η 10 kokonaistilavuudessa PBS/0,2 % Tween-liuoksessa. Kun oli inkuboitu yli yön 4 °C:ssa, kuopat pestiin kolme kertaa PBS/0,2 % Tween-liuoksella ja kuhunkin kuoppaan jäljelle jääneen leimatun proteiinin määrä määritettiin tuikenestelaskennalla. Tulokset osoittivat, että kaikki 15 kolme yllä viitattua BPI-proteiinilajia sitoivat suurinpiirtein ekvivalentit määrät LPSria. rBPI (1 — 199) — proteiini sitoi 48 690 cpm:ää, rBPI(1-199)ala132-proteiini sitoi 59 911 cpm:ää ja rBPI (1-199) cys135-proteiini sitoi 52 537 cpmrää. Kukin yllä mainituista arvoista edustaa kolmen 20 rinnakkaisen määrityksen keskiarvoa. Verrokin (ei DNA:ta) keskimääräinen sitoutuminen oli 5 395 cpm.
Esimerkki 4 ' ‘ Tuotteen karakterisointi > A. Fysikaalinen karakterisointi 25 rBPI-tuotteiden karakterisointi suoritettiin käyt- i’*‘; täen käänteisfaasi-HPLC: tä (C4) , kationinvaihto-HPLC: tä (MA7C), SDS-PAGE-geeliä ja elektronisuihkuionisaatio-massaspektrometriä (ESI-MS). Karakterisoitavat rBPI-. tuotteet puhdistettiin pyöritettävistä kasvatuspulloista 30 tai 10 litran fermentorierästä joko yksivaiheisella i » puhdistusmenetelmällä tai monivaiheisella menetelmällä, j ' ; Yksivaiheinen menetelmä oli oleellisesti sellainen, joka on kuvattu yhtä aikaa haettavassa yhteisomistuksessa olevassa ,/ US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 08/072 063, 35 jota hakee Grinna ja joka on liitetty tähän viitteeksi niin, että lisänä oli toinen pesuvaihe. Lyhyesti, rBPI- 40 115633 tuotteita sisältävään kasvualustaan lisättiin S-Sepharose-helmiä. Sitten S-Sepharose poistettiin alustasta ja ne pestiin liuoksessa, joka oli 20 mM natriumasetaatti ja 100 mM natriumkloridi, pH 4,0. Toinen pesu suoritettiin 5 liuoksella, joka oli 20 mM natriumasetaatti ja 700 mM natriumkloridi, pH 4,0. Puhdistetut rBPI-tuotteet eluoitiin liuoksella, joka oli 20 mM natriumasetaatti ja 1000 mM natriumkloridi, pH 4,0.
Monivaiheinen puhdistusmenetelmä sisälsi rBPI-tuot-10 teiden yhdistettyjen erien, jotka oli ensin puhdistettu yllä kuvatulla tavalla, puhdistamisen. Kun kukin 20:stä yksittäisestä rBPI-tuote-erästä oli puhdistettu yksivaiheisella menetelmällä, erät yhdistettiin ja ne puhdistettiin uudelleen laimentamalla ensin erien suola-15 konsentraatio 200 mMrksi. Sitten yhdistetty näyte ladattiin S-Sepharose-pylvääseen ja se pestiin pH:ssa 4,0 liuoksella, joka oli 20 mM natriumasetaatti ja 200 mM natriumkloridi, jonka jälkeen pestiin 700 mM natriumkloridilla. rBPI-tuotteet eluoitiin käyttäen liuosta, joka oli 20 mM 20 natriumasetaatti ja 1 000 mM natriumkloridi, pH 4,0. Sitten puhdistetut rBPI-tuotteet analysoitiin niiden fysikaalisten ominaisuuksien määrittämiseksi.
1. rBPI-tuotteiden SDS-PAGE-analyysi • rBPI-tuotteiden SDS-PAGE-analyysi suoritettiin ‘ : 25 käyt-täen 14 % polyakryyliamidigeelejä ja Tris-glysiini- puskurisysteemiä pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olo- * suhteissa. Proteiinirintamat värjättiin joko Coomassie Blue -värillä tai hopeavärjättiin niiden silmin tarkastelua ; varten.
I I I
30 Kuten kuviossa 1 on esitetty, pelkistämätön rBPI(l- 199)-proteiini ilmeni pääasiallisena rintamana, jonka koko \· oli 23 kDa ja vähäisempänä rintamana, jonka koko oli noin : 40 kDa. Pääasiallinen rintama tunnistettiin rBPI(1-199)- ./ proteiiniksi vertaamalla sitä samanaikaisesti ajettuihin 35 standardeihin ja vähäisempi rintama tunnistettiin rBPI(l-199)-proteiinin dimeerimuodoksi immunovärjäyksellä. Kun 41 115633 erilliseen rBPI(1-199)-proteiinin näytteeseen lisättiin 1/20-tilavuus 0,4 M ditiotreitolia (DTT), SDS-PAGE paljasti yksittäisen hyvin määritellyn rintaman, joka vastasi 23 kDa monomeerisiä rBPI(1-199)-proteiinilajeja, jotka tunnis-5 tettiin yllä kuvatuissa ei-pelkistävissä olosuhteissa.
rBPI (1-199) ala132-tuotteen SDS-PAGE-analyysi paljasti yksittäisen rintaman, joka liikkui yksittäisenä 23 kDa rBPI(1-199)-rintamana pelkistävissä olosuhteissa. Ei-pelkistävissä olosuhteissa rBPI (1-199) ala132-proteiini kulki 10 yhdessä nopeammin kulkevan kahden lähekkäin sijaitsevan rintaman, jotka havaittiin rBPI(1-199)-proteiinille, kanssa (vastasi 23 kDa rintamaa). Nämä tulokset, jotka on esitetty 132 kuviossa 2 osoittavat, että rBPI(1-199)ala -proteiini on oleellisesti monomeerisena muotona puhdistuksen jälkeen.
15 Näin ollen rBPI-tuotteet, joissa kysteiinijäännös on korvattu alaniinilla, osoittavat merkittävän resistenssin dimeerin muodostusta vastaan.
2. rBPI-tuotteiden kationinvaihto-HPLC
Kationinvaihto-HPLC:tä MA7C-pylväällä käytettiin 20 myös mittaamaan rBPI-tuotteiden dimeerisisältöä. Käytettiin
Bio-Rad MA7C -patruunaa (4,6 x 30 mm, Bio-Rad luettelonumero 125-00556), joka oli tasapainotettu 40 % ‘ puskuri B:llä (20 mM MES, 1 M NaCl, pH 5,5) nopeudella 1,0 • ’ ml/minuutti. rBPI(1-199)-tuote analysoitiin laimentamalla > h".’ 25 1 ml:n näyte konsentraatioksi 100 pg/ml ja 200 μΐ laimennettua näytettä injektoitiin pylvääseen. rBPI- » i proteiini eluoitiin gradientilla, joka oli 40 - 100 % puskuri B, 6 minuutin aikana. Puskuri A sisälsi 20 mM ; MES: ia, pH 5,5. Absorbanssia tarkkailtiin 229 nm:ssa.
'!! ’ 30 rBPI (1-199) -proteiinin analyysi paljasti kaksi h huippua. Ensimmäinen huippu eluoitui retentioajalla, joka • oli noin 3 minuuttia, kuten on esitetty kuviossa 3. Toinen, : pienempi huippu eluoitui noin kuudessa minuutissa.
Ensimmäinen huippu, joka on esitetty kuviossa 3, edustaa * · 35 rBPI(1-199)-monomeeriä ja toinen huippu kuviossa 3 edustaa rBPI(1-199)-dimeeriä määritettynä vertaamalla puhdis- 42 115633 tettujen monomeeri- ja dimeeristandardien retentioaikoihin. Toinen (dimeeri) huippu ei ilmestynyt, kun näytteet pelkistettiin DTT:lla ennen niiden injektoimista pylvääseen .
1 "32 5 Identtisiä menetelmiä käytettiin rBPI(1-199)ala proteiinin eluutiokuvion määrittämiseksi. Kuten kuviossa 4 on esitetty, rBPI(1-199)ala132 eluoituu yksittäisenä huippuna, jonka retentioaika vastaa sitä, joka havaitaan rBPI(1-199)-monomeerihuipulle. rBPI(1-199)ala132-näytteessä 10 ei ollut mitään todistetta dimeeristä.
3. rBPI-tuotteiden käänteisfaasi-HPLC- (C4) ja elektronisuihkuionisaatiomassaspektrometrianalyysit rBPI-tuotteiden mikroheterogeenisyys paljastettiin käänteisfaasi-HPLC-analyysillä ja elektronisuihkuionisaa- 15 tiomassaspektrometrianalyysillä (ESI-MS). HPLC-analyysiä varten Brownlee BU-300 C4 -pylväs tasapainotettiin 37 %
Mobile Phase B -puskurilla (80 % asetonitriili/O,065 % TFA) virtausnopeudella 0,5 ml/min. rBPI(1-199)-näytteet (1 ml kutakin) laimennettiin konsentraatioksi 100 pg/ml ja 50 μΐ
20 näytettä injektoitiin. Pylväs pestiin 37 % Mobile Phase B
,,, -puskurilla 2,5 minuuttia ja sitten se eluoitiin käyttäen • * · * gradienttia, joka oli 37 - 50 % Mobile Phase B -puskuri, 20 *·' * minuutin ajan. Mobile Phase A -puskuri oli 5 % • · asetonitriili/O,1 % TFA ja absorbanssia tarkkailtiin 220 M": 25 nm:ssa.
;”· : rBPI (1-199)-tuotteiden käänteisfaasi-HPLC-tulokset on esitetty kuviossa 5. rBPI(1-199)-tuotteet eluoituvat toisena (pääasiallisena) huippuna niin, että toisen huipun ; johtavassa reunassa on osittain erottunut ensimmäinen 30 (vähäisempi) huippu. Kun pelkistetään DTT:lla, ainoastaan yksi huippu, joka vastaa toista huippua, eluoituu •V pylväästä.
( : Samanlaisia menetelmiä käytettiin rBPI (1-199) ala132- tuotteiden analysoimiseksi. Kuten kuviossa 6 on esitetty, * * 1 7? ,,, 35 rBPI (1-199) ala -proteiini eluoitui yksittäisenä huippuna, 43 115633 joka vastasi toista (pääasiallista) huippua, johon viitattiin yllä.
Eluaatit, jotka vastasivat yllä kuvattuja ensimmäistä ja toista HPLC-huippua kolmesta erillisestä rBPI(l-5 199)-proteiinierästä, eristettiin ja ne analysoitiin niiden sisällön määrittämiseksi ESI-MS-menetelmällä. Eluaatin, joka tuotti toisen (pääasiallisen) huipun rBPI(1—199)— ajosta, analyysi paljasti hiukan alemman massan kuin olisi odotettu 199 aminohapon kokoiselle proteiinille. Nämä 10 tulokset osoittavat, että toisen huipun eluaatissa löydetty runsain massa vastasi l-193rBPI-proteiinifragmenttia. Kuitenkin muita lajeja, jotka vaihtelivat kooltaan 1:stä 198 taan - ltstä 194 tään aminohappoon, on myös läsnä. Yhden huipun tuottavan eluaatin, joka saatiin rBPI (1-199) ala132-15 proteiinin HPLC-ajosta, analyysi paljasti samanlaiset tulokset kuin ne, jotka saatiin eluaatista, joka tuotti toisen (pääasiallisen) huipun, joka on kuvattu yllä. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia peptidikartoitustulosten kanssa, jotka paljastavat lyhentyneet rBPI(1-199)-tuot-20 teiden karboksipäät.
Kun sama analyysi suoritettiin rBPI(1-193)-tuotteille, havaittiin merkittävästi alentunut C-pään hetero-* genia. rBPI(1-193)-tuotteista saadut ESI-MS-tulokset • * paljastivat, että noin 85 % proteiinista sisältää BPI- 25 proteiinin N-pään joko 191, 193 tai 193 (+ N-pään alaniini) : · : ensimmäistä aminohappoa. Tulokset on esitetty taulukossa III.
> I
» I I i 44 115633
Taulukko lii
Elektronisuihkuionisaatiomassaspektrometritulokset rBPI(1-193)- ja rBPI (1-199)-proteiinien HPLC-monoraeerihuipuille 5 Odotettu rBPI- Likimääräinen Ennustetut ami- Likimääräinen tuote molekyylimassa nohappojäännök- suhteellinen set intensiteetti* 21407 1-193__50,9% 21606__1-195__28,9% 10 rBPI(l-199) 21505__1-194__20,1% 21738__1-196__< 10% 21846 1-197__< 10% 21966__1-198__< 10% 15 21408__1-193__36,2% 21193__1-191__34,1 % rBPI(l-193) 21293__1-192__<10% 21477 1-193 + N- 14y5% pään alaniini 20--- 20924 1-189 15,2% ’·' ' ^Ainoastaan lajit, joiden havaittiin olevan läsnä suu- * · rempina määrinä kuin 10 %, kvantitoitiin. Sitten nämä lajit 25 normalisoitiin 100 prosentiksi.
• * » • » • * Nämä tulokset osoittavat, että samalla kun rBPI(l-199)-proteiinia koodittava DNA ei tuottanut yhtään : ,·, täyspitkää (se tarkoittaa BPI-proteiinin N-pään 1 - 199 30 aminohappoa) proteiinia, rBPI(1-193)-proteiinia koodittava DNA tuotti merkittäviä määriä rBPI(1-193)-proteiinia.
Näihin ja muihin tuloksiin perustuen tuntuu siltä, että t ) merkittävät alentumiset tarkoitetun proteiinin (se tarkoittaa sitä proteiinia, jota DNA koodittaa) 35 heterogeenisyydessä ja merkittävät kohoamiset sen tuotossa voidaan saada aikaan samalla säilyttäen optimaaliset 45 115633 bakterisidiset ja LPSrään sitoutumisaktiivisuudet, käyttämällä rBPI-proteiinia koodittavien DNArden lyhennettyjä muotoja. On odotettavissa, että ekspressoitavan DNA: n lyhentäminen tuottaisi merkittävät alentumiset ekspres-5 siotuotteen heterogeenisyydessä siinä laajuudessa, että ekspressoitavaa DNA:ta ei lyhennetä aminohappokohdassa 175 olevan kysteiinin ohi. Lyhennettyjen DNA-muotojen, jotka koodittavat rBPI-proteiineja, jotka ovat pituudeltaan BPI-proteiinin N-pään ensimmäisten 176 ja ensimmäisen 193 10 aminohapon pituisia, ekspressiotuotteiden odotetaan myös säilyttävän täyden bakterisidisen ja LPS:ää sitovan aktiivisuuden.
ESI-MS-tulokset paljastivat myös rBPI-tuotteiden aminopään mikroheterogeenisyyden. Havaittiin rBPI-tuote-15 muotoja, joissa oli alaniinijäännös aminopäässä, ja ne varmistettiin tryptisten peptidien sekvenoinnilla.
Kuten kuviossa 5 on esitetty, sen eluaatin ESI-MS-tutkimus, joka tuotti ensimmäisen (vähäisemmän) kään-teisfaasi-HPLC-huipun, paljasti proteiinit, joiden massa-20 jakautuma oli samanlainen kuin niiden, jotka muodostivat toisen (pääasiallisen) huipun, paitsi että kukin massa-arvo oli noin 119 - 120 daltonia korkeampi. Nämä tulokset ’ antavat ehdottaa, että eluaatti, joka tuotti ensimmäisen ' ’ (vähäisemmän) yllä kuvatun HPLC-huipun, sisältää di- '·“· 25 sulfidisidoksellisen kysteiiniadduktin, koska tämä j ’ selittäisi massa-arvojen vakiosiirtymisen.
Sen hypoteesin testaamiseksi, että rBPI (1—199) — proteiinin tuottama ensimmäinen (vähäisempi) käänteisfaasi-HPLC-huippu edustaa kysteiiniaddukteja, rBPI(l-199)-30 proteiini altistettiin Ellmanin reagenssille (ditioni- '1 trobentseenihappo, DTNB), joka sitoutuu vapaisiin sulf- • ’t: hydryyliryhmiin jotakuinkin molaariekvivalentteina. Sel- : lainen käsittely osoitti, että on olemassa vähemmän kuin yksi mooli vapaata sulfhydryyliä per mooli rBPI(1-199)-35 proteiinia. Kun tiedetään kolmen kysteiinijäännöksen olemassaolo BPI-proteiinissa (kohdissa 132, 135 ja 175), 46 115633 nämä tulokset tukevat sitä oletusta, että rBPI-tuotteissa on olemassa joko molekyylin sisäinen disulfidisidos tai että kaksi sulfhydryyliryhmää ovat steerisesti mahdottomia. rBPI (1-199) ala132-proteiini ei osoittanut mitään reaktii-5 visuutta Ellmanin reagenssilla.
4. rBPI(1-199)-tuotteiden säilytysstabiilisuus Puskurissa, joka on 20 mM natriumsitraatti, 0,15 M natriumkloridi, 0,1 % poloksameeri ja 0,002 % polysorbaatti 80, pH 5,0, olevat rBPI (1-199)-proteiininäytteet (1 mg/ml) 10 analysoitiin niiden säilytysstabiilisuuden määrittämiseksi kahdeksan viikon aikana suositellussa säilytyslämpötilassa 2 - 8 °C ja korkeammissa lämpötiloissa 22 °C ja 37 °C.
2 - 8 °C:ssa tapahtuneen säilytyksen tulokset, jotka on esitetty taulukossa IV, osoittavat kohoamisen 15 dimeerin läsnäolon suhteen (1 %:sta 4 %:iin), mutta ei mitään merkittävää kohoamista näytteen kysteiiniadduktien tai partikkelimuodostuksen suhteen. 1 · i * t i i 47 115633
•H
0 ι—1
<D
m e M 3
•H ι-H 4-» g LO J-ι ^ CM
fS -2 ai ^ w>
•H
d)
fH
0) ^ e ^ s •H i—I ^ u e o μ v, h o rn tn td cd m — <n PM 4-J A i CM — —
ι—I
Θ 0 ^ •H 60 +J £
•H
A> "
I -HO
H Λ »o _ . <i G υ O — „ ►J vl H »— — O'
•H TO C -n •H <U •H A
_ TO Ai
> A G
H tn ΤΟ .6 <N — q ^ Ai TO — — — 3 -H W> r-i e» e
3 n TO Tt ΓΝΙ fN
«o 2 -3 M <=L R.
H ft G 0 —. — —i
. :TO :TO 1H
Ι 1H ft O
MH» , TO 1 !>>
• TO O ft TO
* B t-J TO G O Γν| Tt -H PL, pj 3 .J' ; b -a EG TO a ^ ^ i ro
, I :TO -H
m a, tn TOTOA- e g
. . TO TO TO
; · a -rl a _ § § H ω a a
^ a a p- 21 Z Z
Pd — O O
; ; ; ft in to in . ’, "o : ; o -v e -v. £ "». c , 3 tn :o en :o tn :o
, , , r TO A TO A TO A
. . g -H AS -H Ai -H Ai Ή
AiA AAAMMM
5 .5 -H :TO -H :TO -H :TO
ö > Ai>A!>A!>
TO I
I Ai “ ’" h ui n « H tn ’rl m ^
:TO ° t® ^ H
CO A rH · Ή TO (ft| ST 00 48 115633
Kuitenkin säilytys kohotetuissa lämpötiloissa 22 °C ja 37 °C osoittaa, että dimeerien ja partikkelien läsnäolo näytteessä kohosi dramaattisesti ja että kysteiiniadduktien määrä kohosi kohtalaisesti. Nämä tulokset on esitetty 5 taulukossa V. Lisäksi, kun rBPI(l - 193) ala132-proteiinia säilytetään 22 - 37 °C:ssa, mitään dimeeriä ei havaittu kahden viikon säilytyksen jälkeen. Samanlaisissa olosuhteissa rBPI(1-199)-proteiini osoittaa merkittävät kohoamiset.
• » > · * • · > • · « * » 49 115633 dj r-ί M 0 g M ^ 3 •H cd *"·»* υ ϋ m _ *H ch __ (2 "a| ^ ^ ^ ™ i “
•H
O)
rH
01 M s r~
On OO
•rl I—1 » f—»» AJ
*-> 0 O o o sd r- ~
ro O Γ'Ί O
cd cd rs — —- — cn
Pm jJ A|____,___ rH" Ö 0
•H tO ♦J F5 •H
. rQ * ·—) rlo < •S'Oj O O rl -> -5 M__- - *>__- ^_
1 I
•H
•H 3 <U T3 4J Ό to * « ·Π ί-ΝΙΓΊ Tf Ό oo fcgt^-Ha) __ _ _Z _ ^ M C 4-* -----1--- •H \ •iH ö0
s» ^ S TT 04 cn NO OO
0 m o o o on jg Pt (j g________ :cd :cd ή
fJ Ή rH O
r-4 M H (Λ 1-4 QJ · · p~\ . , ** nj n i—I cd (0 0 i-q n) p O Ό OO ON ^ t* & £ & g 2 - ^ no· - τί k ni f .__ ] nj
1 :cg *H
iJ Cu to
\ cd cu M
* Θ o qj cd cd
c a Λ QQODQ
*22 1 zz z z z_ * ^ — o o o__ ; cl in' in' in'" ‘n'' m „ i
* · I I I M
: ’ ; -H -H -H td I
. . τ MP M ft, cd Cc td
o :cd :td :cd p cd P
. . ^ > > > cd -H CL -H
* . O t. — Tl «I tl
** g toto tn 0 H d H
p td cd cd cd oi p cu
° T1 MM M P M *H M
£ pqpq u e OM cu M
rj ·£? Ή :o ·Η :o -h :o a -H co -H ; !=>> ,Μρ,ϋΡ M P 0 P 3 P |
* ’ * td I
, , I Cd ‘ * · >vrl * · * t-l cd -rl en :·,·. rd- oo oo * I ______________ 1 *--- 1 ; td :·Τ Ϊ « £ % r. r, , '5 2, :cd t . . Λ 50 115633 5. Farmaseuttisten rBPI-tuotekoostumusten turbi- diteetti
Tehtiin kokeet eri rBPI-proteiineja sisältävien farmaseuttisten koostumusten turbiditeetin määrittämiseksi.
5 Tässä yhteydessä turbiditeetti viittaa farmaseuttisten koostumusten taipumukseen ottaa osaa laskostumisen häviämiseen (se tarkoittaa, tertiaarisen proteiinirakenteen häviämiseen) ja/tai partikkelimuodostukseen [interaktiot yksittäisten proteiinien välillä niin, että muodostuu 10 suuria (> 10 pm) partikkeleita]. Testatut farmaseuttiset koostumukset sisälsivät joko rBPI(1-199)-, rBPI(l- 199) ala132- tai rBPI (1-193) ala132-proteiinia joko sit-raattipuskurissa (20 rtiM natriumsitraatti/150 mM natriumkloridi, pH 5,0) tai sitraattipuskurissa, joka 15 sisälsi 0,1 % poloksameeri 188 -yhdistettä (pinta- aktiivinen poloksameeriyhdiste, joka koostuu polyoksi- propyleeni-polyoksietyleeniryhmistä koostuvasta kopoly-meeristä) ja 0,002 % polysorbaatti 80 -yhdistettä (pinta-aktiivinen polysorbaattiyhdiste, joka koostuu polyoksi- 20 etyleenisorbitaanin rasvahappoesteristä). Kuten yllä on ' » t · mainittu, pinta-aktiivisen poloksameeri/polysorbaatti- » V ·* systeemin käyttö stabiloi farmaseuttisia koostumuksia, kuten on opetettu yhteisomistuksessa olevassa yhtä aikaa haettavassa US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 25 _, joka on rekisteröity 1.2.1993 (asiamies- luttelonumero 27129/31162), jota hakevat McGregor et ai., « i joka on liitetty tähän viitteeksi.
. , Näytteet analysoitiin niiden resistenssin mää-
f » I
‘ rittämiseksi turbiditeettia vastaan ajan funktiona kohoa- 30 vassa lämpötilassa ja joko pH:ssa 7,0 tai 5,0. Ennen analyysiä kaikki näytteet laimennettiin konsentraatioksi
I"; 0,1 mg/ml joko 50 mM kaliumfosfaatti- tai 20 mM
sitraattipuskuriin, pH 7,0. Turbiditeettimittaukset saatiin laittamalla näytteet kvartsikyvetteihin käytettäväksi 35 Shimadzu UV-160 UV-Vis -spektrofotometrissä (Shimadzu, Pleasanton, CA) , joka oli varustettu lämpötilasäädellyllä 51 115633 kyvettitelineellä, joka oli kiinnitetty kiertovesihautee-seen. Samalla kun kyvettiteline tasapainotettiin haluttuun lämpötilaan (57 °C, 65 °C tai 85 °C, katso alla), mitattiin absorbanssi 280 nm:ssa sen varmistamiseksi, että näytteet 5 oli laimennettu oikeaan konsentraatioon. Tämän jälkeen mitattiin näytteiden absorbanssi 350 nm:ssa joka toinen minuutti yhden tunnin ajan absorbanssimuutoksen määrittämiseksi ajan funktiona.
Tulokset on esitetty kuviossa 7, jossa "formuloitu" 10 viittaa rBPI-tuotteeseen sitraattipuskurissa, joka sisälsi yllä mainitun poloksameeri/polysorbaattiyhdistelmän, ja "formuloimaton" viittaa rBPI-yhdisteisiin yksinään sitraattipuskurissa. Matalampi turbiditeettimuutosnopeus (se tarkoittaa, matalampi nopeus absorbanssin kohoamisessa ajan 15 suhteen) osoittaa kohonneen stabiilisuuden laskostumisen häviämistä ja partikkelimuodostusta vastaan. Kuten kuviossa 7 on esitetty, edellä mainitun pinta-aktiivisten aineiden yhdistelmän lisäys johti kohonneeseen stabiilisuuteen (resistenssiin partikkelimuodostusta ja laskostumisen 20 häviämistä vastaan) kaikissa testatuissa koostumuksissa.
‘ Lisäksi rBPI (1-199) ala132- ja rBPI (1-193) ala132-proteiinit V * osoittivat suuresti parantuneen resistenssin laskostumisen häviämistä ja partikkelimuodostusta vastaan verrattuna ’ti villityypin koostumuksiin - riippumatta siitä, oliko pinta- ·*>’. 25 aktiivinen yhdistelmä läsnä. Samanlaiset tulokset saatiin pH:ssa 5,0 ja 65 °C:ssa, pH:ssa 5,0 ja 75 °C:ssa ja * » , 85 °C:ssa, vastaavasti.
. . Kaiken kaikkiaan koostumukset, joissa oli pinta- aktiivinen yhdistelmä ja/tai kysteiinideleetio, osoittivat * > ’;* 30 suuresti kohonneen stabiilisuuden ajan suhteen ja : ‘ : lämpötilan kohoamisen suhteen verrattuna koostumksiin, : joissa ei ollut mitään pinta-aktiivista ainetta ja/tai jossa oli villityypin BPI(1-199)-proteiinin N-pään rakenne.
52 115633 B. In vitro aktiivisuuskarakterisointi rBPI (1-199) ala132-tuotteiden in vitro aktiivisuus määritettiin tuotteiden sitoutumisella LPS:ään, LAL-inhibitiotestillä ja tuotteiden bakterisidisella vahvuu-5 della. 1. rBPI (1-199) ala132-proteiinin sitoutuminen LPS:ään E. coli -bakteerin (kanta 0111-B4) tai S. minnesota -bakteerin (Rd-mutantti) lipopolysakkaridinäytteitä (20 -60 pg kutakin) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) käytettiin määrittämään rBPI(1-199)ala -tuotteiden sitoutumiskykyä 10 LPS:ään.
LPS-näytteet fraktioitiin koon mukaan SDS-PAGE-geelissä ja ne hopeavärjättiin niiden silmin tarkastelua varten tai ne siirrettiin sähkön avulla nitrosellu-loosamembraanille (BA25, Schleicher ja Schuell, Keene, NM) 15 sopivien esivärjättyjen standardien kanssa. LPS-blotteja prosessoitiin liottamalla membraania liuoksessa, joka oli 50 mM Tris, 0,2 M NaCl (TBS) ja 30 mg naudan seerumialbumiinia (BSA)/ml, pH 7,4, 30 minuuttia 37 °C:ssa. Sitten membraaneja inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi 2 -20 4 pg puhdistettua tai osittain puhdistettua rBPI(l- I · 1 *30 199)ala -proteiinia tai verrokkiproteiinia [joko rBPI(1- '. · 199)-proteiinia tai rBPI-holoproteiinia] , 12 - 18 tuntia » ' : 21 - 42 °C:ssa. Inkubaation jälkeen membraanit pestiin sitten TBS-BSA-liuoksella. Liuos vaihdettiin ainakin kolme 25 kertaa 30 minuutin aikana. Sitten pestyjä membraaneja i inkuboitiin kolme tuntia 1:1000 laimennoksessa kanin anti-rBPI(1-199)-vasta-ainetta TBSrssä, joka sisälsi 1 mg . . BSA:ta/ml. Seuraavaksi membraaneja pestiin ainakin kolme
t » I
’“ kertaa ja ne kehitettiin käyttäen Chemiluminescent *·;·’ 30 Detection System -käyttöpakkausta (Tropix Systems, Bedford, ; ’ : MA) valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen 5 x PBS- ; ‘ ; liuosta ja 0,25 % gelatiinia (Bio-Rad) I-blokin tilalla.
Tulokset osoittivat, että rBPI (1-199) ala132-pro-' ” teiini sitoutuu nitroselluloosaan kiinnitettyyn LPS:ään 35 yhtä hyvin tai paremmin kuin rBPI(1-199)-proteiini.
53 115633 2. E. coli -bakteerin kasvun inhibitiotesti E. coli -bakteerin kasvun inhibitiotesti suoritettiin rBPI-tuotteiden bakterisidisen vahvuuden määrittämiseksi käsittelemällä E. coli -soluja rBPI(1—199)— 5 tai rBPI (1-199)ala132-analogeilla ja tarkkailemalla kasvun inhibitiota lihaliemessä, joka on bakterisidisen aktiivisuuden mitta. Testissä käytettiin E. coli -bakteerin "rosoista" kantaa J5 (E. coli -kannan 0111:B4 rosoinen mutantti, josta puuttuu UDP-4-epimeraasi), jolla oli 10 lyhytketjuinen LPS. Soluja kasvatettiin trietanoliamiinilla puskuroidussa mineraalisuola-alustassa [Simon et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 51: 877 (1964)], joka teki E. coli -bakteerin erittäin herkäksi BPI-proteiinille. Solut pestiin ja ne suspensoitiin uudelleen 0,9 % NaCl-liuokseen 15 tiheyteen, joka oli noin 5 x 108 solua/ml.
Noin 5 x 106 - 1 x 107 E. coli -solua inkuboitiin 30 - 60 minuuttia joko rBPI (1-199)- tai rBPI (1-199) ala132-analogien kanssa, joiden konsentraatio oli 5 pg/ml, puskuroidussa liuoksessa (10 % Hank's Balanced Salts, 40 mM 20 Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 % kasaminohappoja), jonka tilavuus * · » * oli 200 - 400 ml. Lisäksi erikseen tehtiin testi, jossa oli
V*’ joko rBPI(l-199)- tai rBPI (1-199) ala132-analogia ja 100 mM
; : MgCl2:ia. Inkubaation jälkeen solut laimennettiin 10 ·; · tilavuudella ravintolihalientä, johon oli lisätty 0,9 % j*.·. 25 NaCl:ia. Sitten lihaliemen kasvua tarkkailtiin useita tunteja.
I « . 1 ·50
Tulokset osoittivat, että rBPI (1-199)ala -analogit , . sisälsivät bakterisidisen aktiivisuuden, joka oli yhtä ·;; vahva tai vahvempi kuin rBPI (1-199)-proteiinin. Sekä 30 rBPI (1-199) ala132-analogien että rBPI (1-199)-proteiinin ’· : bakterisidinen aktiivisuus aleni odotetusti MgCl2:lla.
3. LAL-inhibitiotesti LAL-inhibitiotestiä käytettiin rBPI(1-193)ala132-proteiinin LPS:ään sitoutumiskyvyn määrittämiseksi. LAL-35 inhibitiotesti on kuvattu julkaisussa Gazzano-Santoro,
Infect. Immun., 60: 4754 - 4761 (1992). LAL-testin tulokset 54 115633 osoittavat, että rBPI(1-193)ala132-proteiinin IC-50-arvo on 10, joka on verrattavissa rBPI(1-199)-proteiinin vastaavaan. Nämä tulokset osoittavat, että analogi kilpailee yhtä hyvin kuin villityypin rBPI-tuote LPSrään sitou-5 tumisesta.
C. rBPI (1-199) ala132-proteiinin tehokkuus letaalin endotoksemian eläinmallissa
Endotoksemiaeläinmallia käytettiin rBPI(l- 199) ala132- ja rBPI (1-199)-proteiinien tehokkuuksien suhtei-10 den vertailemiseksi endotoksista sokkia vastaan.
Urospuolisille ICR-hiirille annettiin suonen sisäinen injektio, joka oli 800 pg aktinomysiini D:tä/kg ja joko 0,5 pg tai 1,0 pg endotoksiinia/kg (E. coli, kanta 0111:B4). Heti endotoksiini-injektion jälkeen hiirille 15 annettiin suonensisäinen injektio (0,5 mg/kg tai 5,0 mg/kg) joko rBPI (1-199)- tai rBPI (1-199) ala132-proteiinia. Puskuroitua vehikkeliä käytettiin verrokkina. Sitten merkittiin muistiin kuolemat seitsemän vuorokauden aikana. Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa VI.
20
1 Taulukko VI
>; # kuolleiden mää- . „lln. « ’ BPI-annos rä/kokonaismäärä kuolleisuus Z_
Ainoastaan , 25 puskuri 0 14/15 93 * ’ * * .. .......- — M — -.. , — ^·Ι·-Ι~ ... I. - 1 ' ..........
0,5 mg/kg 7/15 47 5,0 mg/kg 8/15 53 * » > » » ......... ......... ........ - ' " I 1 1 1 ' ' I—-.· : “ ; 0,5 mg/kg 14/15 93 y 30 rBPI2j-cys 5,0 mg/kg 8/16 50 * » « » » i *
Kuten taulukosta VI nähdään, sekä rBPI (1-199) ala132- f » ‘ että rBPI(1-199)-proteiini antoivat merkittävän suojan ; ' 35 endotoksiinin letaaleja vaikutuksia vastaan. Vaikka esillä oleva keksintö on esitetty sen suositeltavien suori- 55 115633 tustapojen valossa, alan asiantuntija ymmärtää, että useat modifikaatiot ja substituutiot kuuluvat esillä olevan opetuksen piiriin. Esimerkiksi kysteiinin substituutiota BPI-proteiinin N-pään fragmentin kohdassa 132 ja 135 muilla 5 ei-polaarisilla aminohapoilla kuin alaniinilla tai seriinillä on tarkasteltu. Näin ollen suojapiiri rajoittuu tähän liitettyihin patenttivaatimuksiin ja mihin tahansa niihin tulevaisuudessa tehtäviin muutoksiin.

Claims (7)

56 115633
1. DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa bakterisidisen/läpäisevyyttä parantavan proteiinin biolo- 5 gisesti aktiivista fragmenttia, jossa on leusiinitähde kohdassa 193 sen karboksipään tähteenä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA, tunnettu siitä, että se koodittaa bakterisidisen/-läpäisevyyt-tä parantavan proteiinin 31 aminohapon pituista leader- 10 sekvenssiä ja 193 ensimmäistä N-pään aminohappoa ja että siinä on lopetuskodoni välittömästi leusiinitähdettä koo-dittavan kodonin jälkeen kohdassa 193.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA, tunnettu siitä, että siitä on poistettu sekvenssi, joka koodit- 15 taa 31 aminohapon pituisen leader-sekvenssin 4 ensimmäistä aminohappoa.
4. Autonomisesti replikoituva DNA-vektori, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen DNA:n.
5. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on stabiilisti transformoitu tai tranfektoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella DNA:11a niin, että ekspres-sio mainitussa isäntäsolussa tulee mahdolliseksi.
6. Menetelmä bakterisidisen/läpäisevyyttä paran- 25 tavan biologisesti aktiivisen fragmentin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää vaiheet, joissa kasvatetaan isäntäsolua, joka on stabiilisti transformoitu tai transfektoitu jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella DNA:11a, sopivassa viljelyalustassa ja eristetään 30 mainittu fragmentti mainitusta isäntäsolusta tai mainitusta viljelyalustasta.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan eristetty bakte-risidinen/läpäisevyyttä parantava biologisesti aktiivinen 35 fragmentti, jossa on leusiinitähde kohdassa 193 sen karboksipään tähteenä. 1/8 1 1 5633 rBP^^erän BH210001 Coomassie Blue -värjätty SDS-PAGE-geeli Pelkistetty Ei-pelkistetty n 2 3 4 1* _ kD B S =? rBPI^^'dimeeri — —·* rBPI„ „-monomeeri — «m· 23 <*» — »1 . *“14 Kaistat Sisällöt I 1,4 rBP^^-erä BH210001 2.5 rBPl22-standardi 3.6 Molekyylipainostandardit I · * I Fig. 1
FI20031199A 1993-02-02 2003-08-26 Stabiilia bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa proteiinifragmenttia koodittava DNA, vektori, isäntäsolu ja menetelmä näiden proteiinifragmenttien valmistamiseksi FI115633B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1380193 1993-02-02
US08/013,801 US5420019A (en) 1993-02-02 1993-02-02 Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
US9401235 1994-02-02
PCT/US1994/001235 WO1994018323A1 (en) 1993-02-02 1994-02-02 Stable bactericidal/permeability-increasing protein products and pharmaceutical compositions containing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20031199A FI20031199A (fi) 2003-08-26
FI115633B true FI115633B (fi) 2005-06-15

Family

ID=21761817

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953658A FI112367B (fi) 1993-02-02 1995-08-01 Menetelmiä bakterisidisen/läpäisevyyttä parantavan proteiinin tai sen biologisesti aktiivisten fragmenttien polypeptidianalogin tai sitä sisältävän hybridifuusioproteiinin valmistamiseksi sekä menetelmissä käyttökelpoisia DNA-sekvenssejä, vektoreita ja isäntäsoluja
FI20031199A FI115633B (fi) 1993-02-02 2003-08-26 Stabiilia bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa proteiinifragmenttia koodittava DNA, vektori, isäntäsolu ja menetelmä näiden proteiinifragmenttien valmistamiseksi

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI953658A FI112367B (fi) 1993-02-02 1995-08-01 Menetelmiä bakterisidisen/läpäisevyyttä parantavan proteiinin tai sen biologisesti aktiivisten fragmenttien polypeptidianalogin tai sitä sisältävän hybridifuusioproteiinin valmistamiseksi sekä menetelmissä käyttökelpoisia DNA-sekvenssejä, vektoreita ja isäntäsoluja

Country Status (19)

Country Link
US (6) US5420019A (fi)
EP (3) EP1310558B1 (fi)
JP (4) JP4139867B2 (fi)
KR (1) KR100361997B1 (fi)
CN (1) CN1142996C (fi)
AT (3) ATE196650T1 (fi)
AU (1) AU693089B2 (fi)
CA (1) CA2155004C (fi)
DE (3) DE69426019T2 (fi)
DK (2) DK0689592T3 (fi)
ES (2) ES2150983T3 (fi)
FI (2) FI112367B (fi)
GR (1) GR3034492T3 (fi)
HK (1) HK1014548A1 (fi)
NO (3) NO315705B1 (fi)
NZ (1) NZ262284A (fi)
PT (2) PT689592E (fi)
WO (1) WO1994018323A1 (fi)
ZA (1) ZA94703B (fi)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198541A (en) * 1987-08-11 1993-03-30 New York University Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins
US6265187B1 (en) * 1989-02-14 2001-07-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Recombinant endotoxin-neutralizing proteins
US5840836A (en) * 1989-02-17 1998-11-24 Bayer Corporation Pancreatic islet cell antigens obtained by molecular cloning
US6811989B1 (en) * 1989-02-17 2004-11-02 Bayer Corporation Pancreatic islet cell antigens obtained by molecular cloning
US6274348B1 (en) 1992-05-19 2001-08-14 Xoma Corporation Methods for the preparation of positively charged proteins
AU4382193A (en) * 1992-05-19 1993-12-13 Xoma Corporation BPI-immunoglobulin fusion proteins
US5420019A (en) * 1993-02-02 1995-05-30 Xoma Corporation Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
CN1105574C (zh) * 1993-03-12 2003-04-16 爱克索马技术有限公司 杀菌/增强通透性蛋白质产物的治疗用途
US6214789B1 (en) 1993-03-12 2001-04-10 Xoma Corporation Treatment of mycobacterial diseases by administration of bactericidal/permeability-increasing protein products
US5652332A (en) * 1993-03-12 1997-07-29 Xoma Biologically active peptides from functional domains of bactericidal/permeability-increasing protein and uses thereof
AU7175694A (en) 1993-06-17 1995-01-17 Xoma Corporation Lipopolysaccharide binding protein derivatives
AU7330994A (en) * 1993-07-14 1995-02-13 Xoma Corporation Method for potentiating bpi protein product bactericidal activity by administration of lbp protein products
US5770561A (en) * 1993-07-14 1998-06-23 Xoma Corporation Method for potentiating BPI protein product bactericidal activity by administration of LBP protein products
US6759203B1 (en) 1993-09-22 2004-07-06 Xoma Corporation Method for quantifying BPI in body fluids
ES2178656T3 (es) * 1993-09-22 2003-01-01 Xoma Technology Ltd Metodo para tratar infeccion bacteriana gram-negativa por administracion de productos de proteina bactericida que aumenta la permebilidad(bpi) y antibioticos.
CN1133634A (zh) * 1993-09-22 1996-10-16 爱克斯欧玛公司 定量体液中的bpi的方法
CA2181164C (en) * 1994-01-14 2008-01-08 Arnold Horwitz Anti-gram-positive bacterial methods and materials
AU703211B2 (en) * 1994-01-14 1999-03-18 Xoma Corporation Anti-fungal methods and materials
US5447913A (en) * 1994-03-11 1995-09-05 Xoma Corporation Therapeutic uses of bactericidal/permeability-increasing protein dimer products
US5830860A (en) * 1994-03-24 1998-11-03 Regents Of The University Of Minnesota Peptides with bactericidal activity and endotoxin neutralizing activity for gram negative bacteria and methods for their use
US5786324A (en) * 1994-03-24 1998-07-28 Regents Of The University Of Minnesota Synthetic peptides with bactericidal activity and endotoxin neutralizing activity for gram negative bacteria and methods for their use
US5578568A (en) * 1994-04-22 1996-11-26 Xoma Corporation Method of treating conditions associated with intestinal ischemia/reperfusion
US5646114A (en) 1994-07-11 1997-07-08 Xoma Corporation Anti-protozoan methods
US6271203B1 (en) 1994-07-07 2001-08-07 Xoma Corporation Anti-protozoan methods and materials
WO1996014428A1 (en) * 1994-11-08 1996-05-17 Novagen, Inc. Method for in vitro protein synthesis
US5494896A (en) * 1995-03-31 1996-02-27 Xoma Corporation Method of treating conditions associated with burn injuries
JP2001520631A (ja) * 1995-07-20 2001-10-30 ゾーマ コーポレイション 抗真菌性ペプチド
US5686414A (en) * 1995-11-14 1997-11-11 Xoma Corporation Methods of treating conditions associated with corneal transplantation
JP2000501386A (ja) * 1995-11-14 2000-02-08 ゾーマ コーポレイション 角膜損傷に関連する病態を処置するための、殺菌性／透過性増強（ｂｐｉ）タンパク質
US5856159A (en) * 1996-03-27 1999-01-05 Cytel Corporation Production of galactosyltransferase
US5741779A (en) * 1996-05-10 1998-04-21 Xoma Corporation Antithrombotic materials and methods
PT914144E (pt) * 1996-05-10 2001-05-31 Univ Texas Utilizacoes terapeuticas de produtos de proteinas bip contra a meningococcemia humana
EP0907372B1 (en) * 1996-05-23 2003-03-12 XOMA Technology Ltd. Therapeutic uses of bpi protein products in humans with hemorrhage due to trauma
US6486125B1 (en) 1996-05-24 2002-11-26 Regents Of The University Of Minnesota Synthesis of soluble β-sheet forming peptides
US5888973A (en) 1996-08-09 1999-03-30 Xoma Corporation Anti-chlamydial uses of BPI protein products
US6482796B2 (en) * 1996-11-01 2002-11-19 Xoma Corporation Therapeutic uses of N-terminal BPI protein products in ANCA-positive patients
CN1062564C (zh) * 1996-12-20 2001-02-28 周红 猪血中提纯杀菌性/通透性增加蛋白的方法
CA2278924A1 (en) * 1997-01-24 1998-07-30 Avi Biopharma, Inc. Method and conjugate for treating h. pylori infection
US6093573A (en) * 1997-06-20 2000-07-25 Xoma Three-dimensional structure of bactericidal/permeability-increasing protein (BPI)
FR2767323B1 (fr) * 1997-08-12 2001-01-05 Synt Em Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives
US6013631A (en) * 1998-06-19 2000-01-11 Xoma Corporation Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) deletion analogs
US6156514A (en) 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
US6242219B1 (en) 1999-03-18 2001-06-05 Xoma (Us) Llc Methods for recombinant peptide production
US6153584A (en) * 1999-04-01 2000-11-28 Levy; Ofer Therapeutic uses of BPI protein products in BPI-deficient humans
US7041644B2 (en) * 1999-04-01 2006-05-09 Xoma Technology Therapeutic uses of BPI protein products in BPI-deficient humans
WO2001025254A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 University Of Maryland Biotechnology Institute Novel adjuvant comprising a lipopolysaccharide antagonist
WO2002055099A2 (en) * 2000-12-01 2002-07-18 Xoma Technology Ltd Modulation of pericyte proliferation using bpi protein products or bpi inhibitors
US20030049616A1 (en) * 2001-01-08 2003-03-13 Sydney Brenner Enzymatic synthesis of oligonucleotide tags
US20030166063A1 (en) * 2001-03-05 2003-09-04 Harris Robert B. High level insect expression of rage proteins
CA2476427A1 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Regents Of The University Of Minnesota Partial peptide mimetics and methods
CA2480121C (en) * 2002-03-27 2012-02-28 Immunex Corporation Methods for increasing polypeptide production
CA2492008C (en) 2002-03-29 2012-06-26 Xoma Technology Ltd. Multigenic vectors plasmids and methods for increasing expression of recombinant polypeptides
US7906722B2 (en) * 2005-04-19 2011-03-15 Palo Alto Research Center Incorporated Concentrating solar collector with solid optical element
EP1741440A1 (en) 2005-07-08 2007-01-10 Mellitus S.L. Use of BPI protein for the treatment of disorders of the metabolism and cardiovascular disorders
DK2592148T3 (en) 2007-10-12 2018-12-10 Hoffmann La Roche Protein expression from multiple nucleic acids
CN108042807B (zh) 2011-04-05 2020-10-16 达纳-法伯癌症研究所有限公司 作为辐射缓和剂和辐射防护剂的bpi和其同源物的用途
GB201319621D0 (en) 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Antimicrobial agents and their use in therapy
GB201319620D0 (en) 2013-11-06 2013-12-18 Norwegian University Of Science And Technology Immunosuppressive agents and their use in therapy
CA3052357A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing multispecific antibodies

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4853332A (en) * 1982-10-19 1989-08-01 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4816566A (en) * 1983-06-01 1989-03-28 Hoffmann-La Roche, Inc. Polypeptides having interferon activity
US4879226A (en) * 1984-04-06 1989-11-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel human physiologically active polypeptide
US4677064A (en) * 1984-11-09 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5576292A (en) * 1987-08-11 1996-11-19 New York University Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments
EP0652230B1 (en) * 1987-08-11 2005-12-14 New York University Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments
US5198541A (en) * 1987-08-11 1993-03-30 New York University Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins
US5308834A (en) * 1989-02-14 1994-05-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and prevention thereof using a BPI protein
US5234912A (en) * 1989-02-14 1993-08-10 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions comprising recombinant BPI proteins and a lipid carrier and uses thereof
US5171739A (en) * 1989-02-14 1992-12-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and preventation thereof using a BPI protein
US5089274A (en) * 1989-02-14 1992-02-18 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Use of bactericidal/permeability increasing protein or biologically active analogs thereof to treat endotoxin-related disorders
US5770694A (en) * 1990-08-13 1998-06-23 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Genetically engineered BPI variant proteins
US5334584A (en) * 1989-02-14 1994-08-02 Incyte Pharamaceuticals, Inc. Recombinant, non-glycosylated bpi protein and uses thereof
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
EP0563222B1 (en) * 1990-12-03 1998-02-25 New York University Biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments
EP0605653A4 (en) * 1991-09-26 1995-03-15 Incyte Pharma Inc NEW LIPOSACCHARID BINDING PROTEIN (LBP).
JPH06511097A (ja) * 1991-10-31 1994-12-08 リー・クウアン・シル 遠隔自動応答能力を有する電子識別システム及びその自動識別方法
AU4382193A (en) * 1992-05-19 1993-12-13 Xoma Corporation BPI-immunoglobulin fusion proteins
CA2136208C (en) * 1992-05-19 1999-08-10 Lynn S. Grinna Improved methods for the preparation of endotoxin-binding proteins
ES2164098T3 (es) * 1993-02-02 2002-02-16 Xoma Technology Ltd Composiciones farmaceuticas que contienen una proteina bactericida aumentadora de la permeabilidad y un tensioactivo.
US5420019A (en) * 1993-02-02 1995-05-30 Xoma Corporation Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
EP0690721B1 (en) * 1993-03-12 1998-05-13 Xoma Corporation Treatment of mycobacterial diseases by administration of bactericidal/permeability-increasing protein products
CN1105574C (zh) * 1993-03-12 2003-04-16 爱克索马技术有限公司 杀菌/增强通透性蛋白质产物的治疗用途
ES2123134T3 (es) * 1993-03-12 1999-01-01 Xoma Corp Peptidos biologicamente activos de dominios funcionales de la proteina bactericida aumentadora de la permeabilidad y usos de los mismos.
US5348942A (en) * 1993-03-12 1994-09-20 Xoma Corporation Therapeutic uses of bactericidal/permeability increasing protein products
CA2161971A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-10 Randal W. Scott Recombinant bpi-based and lbp-based proteins, nucleic acid molecules encoding same, methods of producing same, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US5674834A (en) 1997-10-07
DE69434980T2 (de) 2008-01-24
JP4139867B2 (ja) 2008-08-27
EP1310558A3 (en) 2003-08-13
ATE363535T1 (de) 2007-06-15
ZA94703B (en) 1994-09-05
FI953658A0 (fi) 1995-08-01
FI20031199A (fi) 2003-08-26
JP2004024276A (ja) 2004-01-29
EP0689592B1 (en) 2000-09-27
FI953658A (fi) 1995-09-07
DE69431995T2 (de) 2003-11-13
US6433140B1 (en) 2002-08-13
US5420019A (en) 1995-05-30
DK1310558T3 (da) 2007-10-08
DE69431995D1 (de) 2003-02-13
EP1310558A2 (en) 2003-05-14
FI112367B (fi) 2003-11-28
DE69426019D1 (de) 2000-11-02
PT1310558E (pt) 2007-09-07
US6828418B2 (en) 2004-12-07
CA2155004C (en) 2010-03-30
DE69426019T2 (de) 2001-05-17
NZ262284A (en) 1997-11-24
US5827816A (en) 1998-10-27
ATE230797T1 (de) 2003-01-15
NO20023224D0 (no) 2002-07-03
CA2155004A1 (en) 1994-08-18
US20030109436A1 (en) 2003-06-12
EP1013760A3 (en) 2000-08-09
GR3034492T3 (en) 2000-12-29
WO1994018323A1 (en) 1994-08-18
NO953033L (no) 1995-10-02
ES2150983T3 (es) 2000-12-16
ATE196650T1 (de) 2000-10-15
KR960700340A (ko) 1996-01-19
US20060009383A1 (en) 2006-01-12
NO20050998D0 (no) 2005-02-24
NO20023224L (no) 1995-10-02
JP2004254697A (ja) 2004-09-16
EP1013760A2 (en) 2000-06-28
NO20050998L (no) 1995-10-02
CN1142996C (zh) 2004-03-24
NO315705B1 (no) 2003-10-13
PT689592E (pt) 2001-03-30
NO953033D0 (no) 1995-08-01
AU6170294A (en) 1994-08-29
DE69434980D1 (de) 2007-07-12
ES2288199T3 (es) 2008-01-01
DK0689592T3 (da) 2000-10-16
EP1013760B1 (en) 2003-01-08
CN1120352A (zh) 1996-04-10
KR100361997B1 (ko) 2003-04-08
AU693089B2 (en) 1998-06-25
HK1014548A1 (en) 1999-09-30
JPH08506586A (ja) 1996-07-16
NO319156B1 (no) 2005-06-27
JP2006321813A (ja) 2006-11-30
EP1310558B1 (en) 2007-05-30
EP0689592A1 (en) 1996-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI115633B (fi) Stabiilia bakterisidista/läpäisevyyttä parantavaa proteiinifragmenttia koodittava DNA, vektori, isäntäsolu ja menetelmä näiden proteiinifragmenttien valmistamiseksi
AU628069B2 (en) Lymphokine production and purification
CA1341361C (en) Human erythropoietin gene: high level expression in stably transfected mammalian cells
US7867973B2 (en) Follistatin variant polypeptide
JPH09510601A (ja) ヒト遺伝子治療用のエピソーム発現ベクター
WO2013161958A1 (ja) 新規な発現ベクター
Lembo et al. Inhibition of cell proliferation by the interferon-inducible 204 gene, a member of the Ifi 200 cluster
JPH02255699A (ja) 新規血液抗凝固物質及びその製法
JP2004536616A (ja) メチル化耐性ベクター
US5700690A (en) Compositions and methods for inhibiting fibrogenesis
CA2413754C (en) Canine hepatocyte growth factor
JPH08510921A (ja) Ｔｐｏ活性を有するタンパク質
AU2001100608A4 (en) Control of gene expression
WO1998029544A9 (fi)
JPH08291196A (ja) Ｔｐｏ活性を有するタンパク質

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 115633

Country of ref document: FI