PT914144E - Utilizacoes terapeuticas de produtos de proteinas bip contra a meningococcemia humana - Google Patents

Description

Descrição “Utilizações terapêuticas de produtos de proteínas BIP contra a meningococcemia humana”

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito genericamente a métodos e materiais para tratar seres humanos que padeçam de meningococcemia, mediante a administração de produtos de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade (BIP). A meningococcemia é uma doença infecciosa provocada pelos microrganismos Neisseria meningitidis (também designados por meningococos), em que as bactérias e os seus produtos se encontram na circulação sistémica. As suas manifestações clínicas variam desde um processo relativamente suave até uma infecção grave e fulminante de início repentino e progressão extremamente rápida, com um intervalo desde a ocorrência do primeiro estado febril até à ocorrência da morte da ordem das 12 horas. Esta última forma dramática da doença ocorre em cerca de 10% dos pacientes infectados com N. meningitidis. Os pacientes podem ter um estado mental normal e apresentar apenas sintomas de febre e petéquias, mas podem sofrer rapidamente um colapso hemodinâmico, falta de ar e coma, conjuntamente com uma grave coagulopaíia, trombose intravascular e insuficiências orgânicas. Em alternativa, nas últimas fases da doença, os doentes podem ficar inconscientes e sem resposta no momento de observação. A taxa de mortalidade devida a doenças meningocócicas agudas não se alterou de forma significativa nas últimas dccadas, apesar dos avanços tecnológicos no domínio dos ***>,> antibióticos e dos cuidados de saúde intensivos. Um estudo rctrospectivo permitiu concluir que a taxa de mortalidade devida a infecções meningocócicas não se alterou significativamente durante mais de 30 anos, mesmo após ajustamentos em função da gravidade da doença [Havens et al., Pediatr. Infect. Dis. J., 5:8-11 (1989)]. Um outro estudo prospectivo sobre infecções meningocócicas [Powars <?/#/., Clin lrtfècl Dis., 77:254-261 (1993)] efectuado entre os anos de 1986 el991 assinala a observação de 113 pacientes com infecção bacteriologicamente confirmada de N. meningitidis, dos quais 15 (13%) morreram. Esta taxa de mortalidade de 13% não se alterou de forma apreciável em relação à taxa de mortalidade de 16% verificada cinco décadas antes numa epidemia que ocorreu no Chile.

Define-se uma “epidemia” como sendo o aumento da frequência de uma doença provocada por um único clone bacteriano disseminado por uma população. Embora as epidemias de meningococcemia seja vulgares nos países em desenvolvimento, não houve nenhuma epidemia nacional nos Estados Unidos da América do Norte desde 1940. No entanto, nos meados da década de 90 teve lugar um aumento significativo da ocorrência endémica de meningococcemia conjuntamente com epidemias localizadas. A doença continua a ser sazonal, com uma incidência máxima no final do Inverno e no início da Primavera. Entre 60% e 90% de todos os casos ocorrem em crianças, sendo a incidência máxima nas crianças com idades inferiores a 2 anos. O microrganismo N. meningitidis é um coccus gram-negativo encapsulado, que ocorre tipicamente aos pares (diplococos), responsável por um espectro de doenças graves, incluindo a meningococcemia. Os meningococos dividem-se em 9 serogrupos, com base nos seus polissacáridos capsulares, sendo os serogrupos A, B, C, Y e W135 os responsáveis pela maior parte das doenças manifestadas. Estes sexogi upos ainda se dividem cm scrotipos antigeneticamente distmtosm, com base na expressão das proteínas membranares exteriores. Os clones específicos de cada serognrpo ainda podem ser diferenciados por padrões electroforéticos das proteínas. As membranas exteriores dos meningococos também contêm uma forma de lipopolissacáridos (LPS), isto é, “lipooligossacáridos” (LOS), que são um componente vulgar da membrana exterior de uma bactéria gram-negativa. Sábe-se que os meningococos colonizam a nasofaringe de 5% a 15% dos indivíduos; no entanto, apenas uma pequena ffacção dos indivíduos colonizados irá experimentar uma doença invasiva. A transição da colonização para uma doença invasiva é multifactorial e não está completamente esclarecida. A presença de infecções virais das vias respiratórias superiores, que também atingem um máximo durante o final do Inverno e na Primavera, podem danificar o epitélio nasofaríngico e permitir a translocação bacteriana através de uma barreira alterada. Nas crianças com idades inferiores a 2 anos, presume-se que seja o desenvolvimento inadequado de anticorpos contra a cápsula do polissacárido meningocócico a razão da elevada taxa de ocorrência nesta população. O espectro de doenças provocadas pelos meningococos inclui a meningite, artrite, pericardite, endocardite, conjunctivite, endoflalmite, infecções do tracto respiratório, infecções abdominais e pélvicas, uretrite e uma síndroma bacterémica crónica. As síndromas clínicas predominantes que exigem o internamento numa unidade pediátrica de cuidados intensivos (UPCI) são a meningite e a meningococcemia (com ou sem meningite). A observação clínica vai depender do compartimento do corpo em que estiverem localizadas primordialmente a infecção e as suas sequelas inflamatórias.

Ao contrário da meningococcemia, a meningite é uma doença em que as bactérias se encontram localizadas no compartimento meníngeo, com sinais consistentes com a irritação das meninges. Em termos clínicos, a meningite meningocócica é extraordinariamente diferente da meningococcemia; no entanto, pode ser indistinguível de outras formas de meningite e ser apenas diferenciada por meio de ensaios em cultura ou imunológicos. Os sinais hemodinâmicos sistémicos, coagulopatia grave e trombose intravascular, estão notavelmente ausentes. Quando tratada convenientemenle, a mortalidade é rara e as sequelas neurológicas, incluindo as perdas auditivas sensineurais, são invulgares. As formas de diagnóstico e de tratamento da meningite meningocócica são iguais às das outras formas de meningite bacteriana.

Se os pacientes forem examinados nos primeiros estádios de evolução das suas doenças, quando são apenas evidentes as petéquias e os sintomas inerentes ligeiros, o diagnóstico da meningococcemia pode ser complicado, dada a existência de diversas doenças que se revelam com febre e petéquias nas crianças, incluindo, por exemplo, as infecções provocadas por enterovírus, rotavírus, vírus sinciciais respiratórios, Haemophilus influenzae ou Streptococcus pneumonia?, faringite estreptocócica; febre com pintas das Montanhas Rochosas; púrpura de Henoch-Schoenlein; ou doenças malignas. No entanto, dado que o aparecimento das doenças meningocócicas é altamente dependente de um diagnóstico rápido e da administração de antibióticos, a suspeita de existência de meningococcemia tem de ser energicamente combatida e tem de ser feito o tratamento, em particular tendo em conta que a meningite provocada por H. influenza diminuiu extraordinariamente nos Estados Unidos da América do Norte devido à utilização de vacinas contra esta bactéria. À semelhança de outras infecções provocadas por bactérias gram-negativas, a patogénese da meningococcemia grave começa por acção da endotoxina associada à bactéria ou por ela libertada. Esta endotoxina bacteriana activa a cascata da citoquina pró-inflamatória. Nos casos de meningococcemia grave, está documentalmente comprovado que os níveis de endotoxinas bacterianas, detectados na circulação por meio do ensaio de LAL, são da ordem de 50 a 100 vezes superiores aos níveis comprovados com outras infecções provocadas por bactérias gram-negativas. A cascata do complemento também é activada pela bactéria e pela sua endotoxina na circulação sistémica, produzindo anafilotoxinas que podem intervir indirectamente na hipertensão precoce e nos derrames capilares.

Em estudos até agora realizados, os níveis de endotoxinas no plasma [Brandtzaeg et al., J. lrfec. Dis., 159:195-204 (1989)], FNT [Van Deuren et al., J. Irfect. Dis., 172:433-439 (1995)], IL-6 [Van Deuren et al, supra] e de fibrinogénio e também o período da protrombina (PPT, o mesmo que PTT) [McManus et al, Criticai Care Med., 21:706-711 (1993)] em pacientes com meningococcemia foram correlacionados com a gravidade e com os efeitos da doença, embora tal correlação seja imprecisa. Foi já sugerido que uma combinação de valores ordenados para a endotoxina e para as substâncias FNT, IL-1 e IL-6 pode proporcionar um indicador que reflicta rigorosamente o efeito no paciente [Bone, Criticai Care Med., 22:S8--Sll (1994)]. A coagulopatia grave e a trombose intravascular podem progredir rapidamente e conduzir a lesões isquémicas de órgãos vitais e das extremidades em pacientes meningococcémicos. Eventualmente podem ocorrer insuficiências respiratórias, insuficiências renais, insuficiências das supra-renais e coma As petéquias e as manchas púrpura podem espalhar-se e confluírem, caso a que tem sido aplicada a expressão “purpura fidminarrf\ Em pacientes meningococcémicos com doença grave, também foram já observadas reduções significativas dos inibidores de coagulação antitrombina ΙΠ, proteína C activada e proteína S. Estas reduções podem reflectir um desequilíbrio relativo de factores anticoagulantes, comparativamente com os factores procoagulantes, mas também podem reflectir o consumo geral de todas as classes de factores.

As deficiências de natureza quantitativa também podem reflectir uma hemodiluição e derrames capilares de proteínas.

No momento de internamento é vulgar haver disfunções cardíacas graves, ou então podem ocorrer ao fim das primeiras 24 horas. São frequentes fracções de ejecção de 20% ou inferiores. A disfunção cardíaca pode ser secundária cm relação a diversos factores, incluindo: 1) a miocardite que está presente em graus variáveis na maior parte dos indivíduos autopsiados; 2) substâncias depressivas miocardianas; 3) trombose intravascular e subsequente isquémia do miocárdio; 4) edema intersticial do miocárdio, dando origem a um ventrículo descomandado; 5) lesão hipóxica do miocárdio; e 6) anomalias metabólicas. A hipotensão e a insuficiência circulatória são multifactoriais, com contributos significativos provenientes do esvaziamento do volume intravascular, derrames capilares, vasodilatação profunda (secundária em relação às anafilotoxinas, óxido nítrico, histamina e outros mediadores) e uma resposta incorrecta do miocárdio. No momento da observação podem ser evidentes lesões orgânicas secundárias em relação à hipotensão, à trombose intravascular e à inflamação directa. A doença fulminante pode estar associada a uma hemorragia ad-renal, necrose cortical ad-renal e morte rápida (síndroma de Waterhouse Friederickson). No entanto, nem mesmo as hemorragias intensas ad-renais traduzem necessariamente uma insuficiência ad-renal, uma vez que foi comprovada e está documentada a existência de níveis normais ou mesmo elevados de cortisol sistémico. Numa minoria de pacientes com doença rapidamente progressiva, as hemorragias ad-renais estão associadas aos níveis de cortisol sérico, que são normais ou subnormais (num cenário em que são previsíveis níveis elevados). Frequentemente também ocorrem outros desarranjos metabólicos, tais como a acidose metabólica, a hipoglicemia, a hipocalcemia e a hipomagnesemia.

Os pacientes com doença grave enfrentam um risco elevado de morrerem. Se sobreviverem, sofrem frequentemente outras doenças graves, incluindo uma destruição intensa de tecidos e ossos, que exige o desbridamento e/ou a amputação, seguindo-se procedimentos de enxerto de pele. Num determinado estudo [Powars et a.., supra], entre os 28 pacientes com purpura fulminam, a manifestação suprema da meningococcemia grave, 14 pacientes (50%) morreram. Dos 14 pacientes sobreviventes que tinham purpura fulminam, 10 tiveram gangrena dos tecidos moles com autoamputação deformante. De acordo com outro estudo [Genoff et al, Plastic Recomtructive Surg., 59:878:881 (1992)], houve 6 pacientes com meningococcemia e purpura fulminam que foram acompanhados e entre eles houve 4 pacientes em que foi necessário efectuar amputações graves (no pulso ou mais acima, no caso dos membros superiores, ou nos tornozelos ou mais acima, no caso dos membros inferiores). Genoff et cd. verificaram que continua a haver complicações, mesmo depois de ter passado a fase aguda da doença com risco de vida, e que é necessário efectuar inspecções para se decidir sobre um nível mais elevado de amputação e sobre múltiplos procedimentos de enxerto. Sheridan et al., Burm. 22:53-56 (1996) confirmaram que a meningococcemia com purpura fulminam tem uma taxa de mortalidade de 50%, com níveis elevados de amputações importantes nos sobreviventes. Nas suas experiências os pacientes sobreviventes ficaram frequentemente com ferimentos a envolver a toda a espessura a pele, o tecido subcutâneo e muitas vezes os músculos subjacentes e os ossos; em metade dos pacientes sobreviventes foi necessário realizar amputações importantes.

Os pacientes com doenças meningocócicas também podem desenvolver sequelas neurológicas, incluindo as anomalias observadas por electroencefalograma (EEG), as anomalias detectadas por varrimento tomográfico computadorizado (TC), dificuldades auditivas e insuficiências reveladas nos testes ncuropsicológicos. Num estudo realizado foram utilizados consecutivamente 99 crianças e pacientes adultos com doença meningocócica aguda bacteriologicamente confirmada, os quais foram acompanhados e testados para investigação de sequelas neurológicas 1 ano após as suas enfermidades. [Naess et d., Acta Neurol. Scand, 59:139-142 (1994)]. Na categoria dos pacientes que padeciam de meningococcemia com hipotensão e/ou equimoses, mas sem sinais de meningite, foram observadas sequelas neurológicas em 5 dos 12 pacientes. Na categoria dos pacientes que padeciam de meningococcemia com hipotensão e/ou equimoses, e com sinais de meningite, foram observadas sequelas neurológicas em 7 de 13 pacientes. O efeito clínico pode ser razoavelmente previsto, classificando os factores de risco originalmente identificados em grandes grupos de pacientes com meningococcemia. Em 1966, Stiehm e Damrosh, J. Pediatrics, 68Α5ΊΑ6Ί (1966), estudaram 63 casos de infecção meningocócica e identificaram os aspectos clínicos associados a sintomas fracos. Os factores de prognóstico fracos foram: o aparecimento de petéquias nas 12 horas anteriores ao internamento, ausência de meningite (NGB < 20 no fluído cerebrospinal (FCS)), choque (pressão sanguínea sistólica < 70), número de leucócitos (glóbulos brancos) normal ou inferior ao normal (NGB < 10 000) e velocidade de sedimentação dos eritrócitos normal ou inferior ao normal (< 10 mm/hora). A presença de 3 ou mais destes critérios estava associada a um resultado fraco. Niklasson et d.., Scand. J. Infect. Dis., 3:17-25 (1971) utilizaram estes três factores de risco em 1971 e juntaram a temperatura superior a 40°C e a trombocitopenia à lista de sinais de prognóstico fraco. As potencialidades predictivas específicas dos critérios de Stiehm e Damrosh c dos critérios dc Niklasson foram avaliadas numa série de McManus [McManus et ai, supra] em 1993. Nesta série a mortalidade foi significativamente inferior à prevista pelos critérios anteriores e estava relacionada mais provavelmente com a presença ou com a ausência de coagulopatia. 0 sistema de classificação de sépsis meningocócica mais vulgarmente utilizado foi publicado em 1987 por Sinclair et al., Lancet, 2:38 (1987), e passou a ser conhecido por Classificação de Prognóstico de Septicemia Meningocócica de Glasgow (classificação de Glasgow). A sua utilidade advém do facto de assentar em indicadores clínicos de acamados, o que facilita a triagem no terreno ou durante o transporte. São indicados pontos numa escala graduada para sete parâmetros, do seguinte modo: (1) PS < 75 mm Hg, sistólica, idade < 4 anos ou PS < 85 mm Hg, sistólica; idade > 4 anos (3 pontos); (2) diferença de temperaturas da pele/rectal > 3°C (3 pontos); (3) escala de coma modificada < 8, ou deterioração de 3 ou mais pontos em 1 hora (3 pontos); (4) deterioração na horaanterior à classificação (2 pontos); (5) ausência de meningismo (2 pontos); (6) púrpura disseminada ou equimoses generalizadas (1 ponto); e (7) défice básico (capilar ou arterial) >8(1 ponto). O valor máximo da classificação de Glasgow é pois de 15 pontos.

Uma vez que a meningococcemia é frequentemente caracterizada por uma deterioração rápida e fulminante, é imperativa uma permanente observação vigilante. A grande maioria dos pacientes irá ser admitida directamente na unidade de cuidados intensivos, onde é possível a prática de uma observação invasiva e onde é possível administrar uma terapia de emergência. Como complementos específicos à observação e à avaliação em laboratório é possível referir a obtenção de amostras a partir de FCS, culturas de sangue, pele lesionada e esfregaços da garganta. No entanto, apenas será necessário obter o FCS se o estado clínico do paciente for suficientemente estável para tolerar tal procedimento. É conveniente obter culturas de sangue, mas apenas são positivas em 50% dos pacientes não tratados. Também é possível detectar bactérias até 70% dos casos pelo método de contrastação de Gram e criando em cultura o material aspirado dc lesões hemorrágicas de pele (ou obtido por biópsia). O exame de lesões da pele é especialmente importante nos casos em que tenham sido administrados antibióticos antes de terem sido obtidas culturas de sangue. Os esfregaços da garganta, quando obtidos com cuidado e rapidamente aplicados sobre lamelas, também podem constituir um diagnóstico e fundamentar uma hipótese de existência de meningococcemia. Em alternativa, é possível obter o FCS para detecção de autigénios meningocócicos. Se for obtido algum organismo, deve ser serotipificado e enviado para um laboratório de referência para uma subtipificação complementar. O controlo epidémico por meio de imunização apenas pode ser conseguido se forem identificados os organismos específicos responsáveis pela doença No caso invulgar de não ser possível obter culturas de sangue, é necessário administrar antibióticos sem delongas; a investigação microbiológica pode ser feita posteriormente, por métodos alternativos. O tratamento de crianças com meningococcemia assenta numa observação e numa terapia permanentes e enérgicas. Em particular, a protecção oportuna das vias respiratórias, uma enérgica substituição volúmica e a administração conveniente de agentes vasoactivos, v.g. epinefrina, dopamina e doutamina, são factores críticos para restabelecer a perfusão tecidual e o fornecimento de oxigénio. Seguidamente explicita-se de forma abreviada um conjunto de questões específicas no tratamento da meningococcemia, incluindo o tratamento com antibióticos, esteróides, substituição de plasma recente congelado (PRC), heparina e diversos agentes novos.

Continua a haver debate sobre a hipótese de os antibióticos deverem ser administrados logo após as conclusões do diagnóstico ou apenas após um período de estabilização. Embora a questão não esteja resolvida por experiências aleatórias, a preponderância de provas sugere que os antibióticos devem ser administrados imediatamente, ao mesmo tempo que forem sendo instituídas terapias auxiliares. Especulações sobre uma libertação da endotoxina bacteriana após a administração dos antibióticos, nos casos de meningococcemia, não foram comprovadas por dados humanos. A quantificação periódica dos níveis de endotoxinas bacterianas em amostras de plasma retiradas de seres humanos com meningococcemia não permitiram demonstrar um aumento repentino dos níveis de endotoxinas no plasma após a administração dos antibióticos.

Presentemente recomenda-se que a terapia inicial dos casos suspeitos seja a administração de uma cefalosporina de terceira geração (v.g. ‘Ceftriaxona’), até serem excluídas outras causas de púrpura infecciosa grave com choque {H. influenza, S. pneumoniae ou outras bactérias gram-negativas). Então a terapia pode ser substituída por uma administração parentérica de penicilina ou de ampicilina.

Até ao momento presente ainda não há nenhuns dados aleatórios obtidos por contraprova com placebo para fundamentar a utilização rotineira de corticosteróides em pacientes com meningococcemia. No entanto, há dados que permitiram demonstrar que uma minoria de pacientes com doença grave e hemorragia ad-renal revelam níveis normais ou subnormais de cortisol no plasma, numa situação durante a qual são previsíveis níveis elevados. Embora a feita de dados impeça uma recomendação quer afirmativa quer negativa, o médico deve tomar em consideração a administração de esteróides de substituição ad-renais (hidrocortisona, 1-2 mglcg i.v.) numa situação clínica de choque rapidamente progressivo, ou seja, não responsivo aos fluídos e aos inotropos.

Até ao momento presente também não há dados aleatórios controlados por contraprova com placebo para se determinar em que condições e até que ponto a coagulopatia bioquímica deve ser tratada com PRC. Embora a correcção de anomalias bioquímicas possa parecer lógica, a administração de PRC tem sido considerada por muitos especialistas, no que diz respeito à coagulopatia, como “lançar achas para a fogueira”. Num caso de uma experiência de contraprova realizada com 336 pacientes em Norway, o tratamento com plasma ou com produtos derivados do sangue (em contraposição aos substitutos da albumina ou do plasma) foi associada independentemente com resultados mais fracos. Também foi documentado um aparecimento súbito de endotoxina num ser humano deficiente em C6 a seguir à administração de PRC durante O tratamento de meningococcemia. Estes dados sugerem que a administração de PRC pode ser nociva em alguns casos e por tal motivo deve ser realizada cuidadosamente e apenas quando houver sintomas clínicos que obriguem a isso.

Embora pequenos estudos retrospectivos recomendem a utilização de heparina como tratamento da purpura fulminas, a preponderância de dados (pequenas experiências aleatórias e estudos de contraprova em grande escala) não indica um efeito benéfico da terapia com heparina. Presentemente não há provas que fundamentem a utilização corrente de heparina no tratamento da meningococcemia. Foi efectuado na Europa um estudo de Fase ΙΠ em grande escala, duplamente cego, utilizando placebo como contraprova, com um anticorpo monoclonal anti-Iípido A (HA-1A), sobre a meningococcemia. Até ao momento presente ainda não foram publicados os resultados.

Além disso, há um conjunto de outros agentes biológicos possíveis para o tratamento de coagulopatia grave e da trombose intravascular. Entre tais agentes refere-se: antitrombina Hf proteína C e o inibidor do circuito do factor tecidual. Foram já publicadas experiências não significativas com proteína C e antitrombina 1Π, aguardando-se as experiências definitivas. Foram estudadas outras intervenções clínicas, mas não foram sistematicamente testadas, incluindo: substituição de plasma e de sangue integral, leucaplasmaferese, bloqueio caudal contínuo para mitigar a isquémia das extremidades inferiores e ainda a aplicação tópica de nitroglicerma para vasodfiatar o leito vascular periférico.

A proteína BIP é uma proteína isolada a partir de grânulos de leucócitos poli-morfomicleares dos mamíferos (PMN ou neutrófilos) que são células do sangue essenciais na defesa contra microrganismos invasores. A proteína BIP humana foi isolada a partir dos leucócitos PMN por extracção em meio ácido, combinada com a cromatografia de permuta iónica [Elsbach, J. Biol. Chem., 25-/:11000 (1979)] ou com a eiomatografia por afinidade de E. coli [Weiss, et d., Blood, 69:652 (1987)]. A proteína BIP assim obtida recebe a designação de proteína BIP natural e comprovou-se que possui uma poderosa actividade bactericida contra um largo espectro de bactérias gram-negativas. O peso molecular da proteína BIP humana é aproximadamente de 55 000 Daltons (55 kD). A sequência de aminoácidos da proteína BIP humana intacta e a sequência de ácidos nucleicos do ADN que codifica essa proteína estão ilustradas na figura 1 da obra de Gray et al., J. Biol. Chem., 264: 9505 (1989). Na presente memória descritiva, a sequência de aminoácidos de Gray et al. recebe a designação de SEQ ID NO:l. A patente de invenção norte-americana n° 5 198 541 descreve genes recombinantes que codificam as proteínas BIP e os métodos para a sua expressão, incluindo a holoproteína BIP e os fragmentos da proteína BIP. A proteína BIP é uma proteína fortemente catiónica. No terminal N metade da proteína BIP é responsável pelo saldo líquido altamente positivo de carga eléctrica; no terminal C, metade das moléculas tem um saldo líquido de carga igual a -3. [Elsbach e Weiss (1981), supra]. Um fragmento proteolMco de proteína BIP do terminal N com um peso molecular de cerca de 25 kD possui praticamente toda a eficácia antibacteriana da holoproteína BIP humana de 55 kD obtida por via natural [Ooi et al., J. Bio. Chem., 252:14891-14894 (1987)]. Ao contrário da parcela do terminal N, a região do terminal C da proteína BIP isolada revela apenas uma actividade antibacteriana ligeiramente detectável contra os organismos gram-negativos [Ooi, et ai, J. Exp. Meá, 174:649 (1991)]. Foi produzido um fragmento de proteína BIP do teiminal N aproximadamente com 23 kD, designado por “ΒΙΡΓ23” (o mesmo que “rBPI^”), por meios recombinantes, o qual conserva também a actividâde antibacteriana contra organismos gram--negativos. Gazzano-Santoro etal., Infect. Immun. 60:4754-4761 (1992). O efeito bactericida da proteína BIP foi considerado altamente específico contra as espécies gram-negativas, v.g. na obra de Elsbach e Wiess, Inflammation: Basic Principies and Clinicai Correlates, eds. Gallin et al., Capítulo 30, Raven Press, Ltd. (1992). O mecanismo exacto segundo o qual a proteína BIP aniquila as bactérias gram-negativas ainda não está completamente esclarecido, mas presume-se que a proteína BIP se ligue em primeiro lugar à superfície das bactérias por meio de interacções electrostáticas e hidrofóbicas entre a proteína BIP catiónica e os locais negativamente carregados existente nos LPS. Nas bactérias gram--negativas sensíveis, admite-se que a ligação da proteína BIP destrua a estrutura dos LPS, conduzindo à activação de enzimas bacterianas que degradam os fosfolípidos e os peptido-glicanos, alterando a permeabilidade da membrana exterior das células e dando início a fenómenos que em última instância conduzem à morte da célula [Elsbach e Weiss (1992), supra], O LPS recebeu a designação de “endotoxina” devido à poderosa resposta inflamatória que estimula, isto é, a libertação de mediadores pelas células inflamatórias hospedeiras, o que em última instância pode levar a um choque endotóxico irreversível. A proteína BIP liga-se ao lípido A, considerado como sendo o componente mais tóxico e mais biologicamente activo do LPS.

Nunca antes a proteína BIP havia sido utilizada para o tratamento de pacientes infectados com N. meningitidis, incluindo os pacientes a padecer de meningococcemia. Nos pedidos de patentes de invenção norte-americanas co-pendentes e de que somos co-proprietários, com os números de série 08/378 228, depositado a 24 de Janeiro de 1995, 08/291 112, depositado a 16 de Agosto de 1994, e 08/188 221, depositado a 24 de Janeiro de 1994, publicado com o n° WO 95/19784 (pedido de patente de invenção europeia n° 95908723.0), vem descrita a administração do produto proteína BIP aos seres humanos com endotoxinas na circulação [ver também von der MOhlen ei al, J. Infiel. Dis. 772:144-151 (1995); von der Mõhlen et ai, Blood 85:3437-3443 (1995); de Winter et al, J. Inflam. 45:193-206 (1995)]. Thomton et cã., na obra FASEB J. 8(4):A137, 1994, afirmam que a proteína BIP inibiu a libertação do FNT in vitro pelas células inflamatórias humanas em resposta ao LOS obtido a partir de duas espécies de Neisseria, designadamente N. meningitidis e N. gonorrhea, e a memória descritiva da publicação do pedido de patente de invenção internacional WO 94/25476, publicado a 10 de Novembro de 1994, descreve métodos para tratar doenças associadas às endotoxinas, incluindo a meningite provocada por bactérias gram-negativas.

Apesar do tratamento com antibióticos e da terapia de cuidados intensivos do actual estado da técnica médica, a mortalidade e a morbidade associadas à meningococcemia nos seres humanos continuam a ser significativas e sem solução com as terapias actuais. São necessários novos métodos terapêuticos que permitam reduzir ou melhorar os fenómenos adversos e proporcionar melhores efeitos clínicos da meningococcemia dos seres humanos, incluindo, por exemplo, a redução da mortalidade, das amputações, dos procedimentos de enxerto, das lesões neurológicas permanentes e um aumento dos níveis dos resultados pediátricos.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção descreve métodos novos para o tratamento de seres humanos que padeçam de meningococcemia, os quais implicam a administração dos produtos de proteína BIP para se conseguir uma mitigação clinicamente verificável dos efeitos adversos ou das complicações associadas a esta doença humana, incluindo a mortalidade e a morbidade.

De acordo com a presente invenção, esta proporciona a utilização de um produto de proteína BIP para a preparação de um medicamento para o tratamento de meningococcemia nos seres humanos. Dc acordo coma invenção, os produtos de proteína BIP, tais como BJPr2], são administrados aos seres humanos que padeçam de meningococcemia em quantidades suficientes para evitar a mortalidade e/ou para reduzir o número ou a gravidade dos casos de doença numa população (morbidade), incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, as amputações, os procedimentos de enxerto e/ou as lesões neurológicas permanentes. Há muitos outros aspectos e vantagens da invenção que passarão a ser evidentes para os especialistas na matéria depois de terem lido a descrição pormenorizada subsequente da invenção que explicita as suas variantes actualmente preferidas.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS

As figuras 1, 3 e 5 ilustram respectivamente os níveis plásmicos de endotoxina, de FNT e de 1L-6 ao longo do tempo para os 10 pacientes iniciais que participaram no estudo com a proteína BIP.

As figuras 2,4 e 6 ilustram os níveis plásmicos de endotoxina, de FNT e de IL-6 indicados respectivamente nas figuras 1, 3 e 5, desfasados para cada paciente pelo tempo decorrido entre o início do tratamento com antibiótico e o início da terapia com um produto de proteína BIP.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA A meningococcemia dos seres humanos é uma doença debilitante e cada vez mais dominante que ameaça a vida para a qual são inadequados os antibióticos convencionais e os cuidados intensivos. Em particular, tem-se mantido uma taxa de mortalidade significativa e uma taxa de morbidade grave, apesar dos cuidados intensivos do actual estado do conhecimento médico. Descobriu-se agora inesperadamente que a administração de produtos de proteína BIP aos seres humanos que padeçam de meningococcemia fez baixar eficazmente a mortalidade e reduziu ataxa e a gravidade da morbidade, incluindo as amputações, o desbridamento de tecidos mortos a seguir a procedimentos de enxerto intenso e/ou as lesões neurológicas permanentes que têm como consequência um enfraquecimento significativo e de longo prazo da actividade neurológica (v.g. acidentes cerebrovasculares, atrofia cerebral ou ataques apopléticos que exigem medicação). Os efeitos imprevistos sobre a mortalidade e a morbidade associadas à meningococcemia ou delas resultantes demonstraram que os produtos de proteína BIP interferiram (ou bloquearam) com diversos processos patofisiológicos múltiplos, deficientemente compreendidos, que têm conduzido a resultados fracos no domínio desta doença humana.

Prevê-se que os produtos de proteína BIP proporcionem outros efeitos benéficos aos pacientes que padeçam de meningococcemia, tais como um número reduzido de episódios de hipotensão ou de arritmia ou paragem cardíaca, uma redução do período de terapia de manutenção em regime de ventilação e do período de terapia inotrópica (vasoactiva), uma redução da duração e da gravidade da coagulopatia associada, uma permanência reduzida nas UCI e uma incidência reduzida de complicações tais como insuficiência respiratória, insuficiência renal, coma, necrose cortícal ad-renal, pericardite, endocardite, cardiomiopatia, endofralmite e artrite.

Os produtos de proteína BIP demonstraram que possuem um efeito bactericida m vitro contra os serogrupos A, B, C e W135 da bactéria gram-negativa Neisseria meningitidis que provoca a meningococcemia. Os produtos de proteína BIP podem exercer eventualmente o seu efeito na meningococcemia dos seres humanos através de tal acção bactericida directa ou graças ao facto de melhorarem a eficácia da terapia com antibióticos, conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 523 288. Os produtos de proteína BIP também podem exercer eventualmente o seu efeito na meningococcemia dos seres humanos graças à neutralização da endotoxina LOS que tenha sido libertada pelas bactérias ou pelos fragmentos bacterianos ou que esteja associada a essas bactérias ou a esses fragmentos bacterianos. Os efeitos dos produtos de proteína BBP nos seres humanos com endotoxinas em circulação, incluindo os efeitos sobre o FNT, a DL-6 e a endotoxina, estão descritos no pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários, com o número de série 08/378 228, depositado a 24 de Janeiro de 1995, que por sua vez é uma continuação parcial do pedido de patente de invenção norte-americana com o número de série 08/291 112, depositado a 16 de Agosto de 1994, que por sua vez é uma continuação parcial do pedido de patente de invenção norte-americana com o número de série 08/188 221, depositado a 24 de Janeiro de 1994 e publicado como sendo o documento WO 95/19784 (pedido de patente de invenção europeia n° 95908723.0). Os produtos de proteína BIP possuem simultaneamente efeitos anticoagulantes e fibrinolíticos, conforme descrito no pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários, com o número de série 08/644 290 em simultaneidade com o presente documento e publicado como sendo o documento WO 97/42967 (pedido de patente de invenção europeia com n° 97924680.8). Os produtos de proteína BIP podem actuar sobre outros processos patológicos que estejam associados à meningococcemia, incluindo, por exemplo, as coagulopatias.

As composições terapêuticas que contenham um produto de proteína BIP podem ser administradas por via sistémica ou tópica. As vias sistémicas de administração compreendem as vias oral e a injecção intravenosa, intramuscular ou subcutânea (incluindo um implante para uma libertação a longo prazo), as vias intraocular e retrobulbar, intratecal, intraperitoneal (y g por lavagem intraperitoneal), intrapulmonar por meio de um fãrmaco em aerossol ou nebulizado ou ainda a via transdermal. A via preferida de administração é a intravenosa Quando administradas por via parentética, as composições que contenham um produto de proteína BIP são geralmente injectadas em doses compreendidas enue lpg/kg e 100 mg/kg por dia, dc preferência em doses compreendidas entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg por dia, mais preferencialmente em doses compreendidas entre 1 mg/kg e 20 mg/kg por dia e ainda mais preferencialmente em doses compreendidas entre 2 mg/kg e 10 mg/kg por dia. O tratamento pode prosseguir por infusão contínua ou por injecção ou infusão intermitente, com a mesma dose, com uma dose reduzida ou com dose aumentada por dia, v.g. durante 1 a 3 dias, e além disso conforme determinado pelo médico assistente. Os produtos de proteína BEP são administrados preferencialmente por via intravenosa por meio de um bolus inicial (ampola grande) seguindo-se então uma infusão contínua. O regime preferido é o da administração de 1 a 20 mg/kg por meio de um bolus intravenoso de produto de proteína BIP, seguindo-se uma infusão intravenosa à razão de 1 a 20 mgfcg por dia, prosseguindo assim até perfazer uma semana O regime de dosagem de maior preferência consiste em administrar 2 a 10 mg/kg por meio de um bolus inicial, seguindo-se a infusão intravenosa de uma dose de 1 a 10 mg/kg por dia, prosseguindo até perfazer 72 horas. As vias de administração tópica compreendem a administração sob a forma de unguentos, gotas oftálmicas, gotas para os ouvidos, fluídos para irrigação (v.g., para irrigar ferimentos) ou champôs medicados. Por exemplo, para administração tópica, sob a forma de gotas, é possível aplicar cerca de 10 a 200 pL de uma composição de produto de proteína BIP uma a várias vezes por dia, conforme determinado pelo médico assistente. Os especialistas na matéria podem optimizar facilmente as doses eficazes c os regimes dc administração das composições terapêuticas que contenham um produto de proteína BIP, conforme determinado pela boa prática médica e consoante o estado clínico de cada paciente.

Tal como aqui utilizada, a expressão “produto de proteína BIP” abrange as proteínas BIP obtidas naturalmente ou produzidas por via recombinante; os fragmentos polipeptídicos das proteínas BIP dc origem natural, sintética e recombinantes que sejam biologicamente activos; as variantes polipeptídicas da proteína BIP ou dos seus fragmentos que sejam biologicamente activas, incluindo as proteínas híbridas de fusão e os dímeros; os análogos polipeptídicos de proteínas BIP ou dos seus fragmentos e variantes biologicamente activos, incluindo os análogos com a cisterna substituída; e ainda os péptidos derivados da proteína BIP. Os produtos de proteína BIP administrados de acordo com a presente invenção podem ser gerados e/ou isolados por quaisquer meios conhecidos na especialidade. A patente de invenção norte-americana n° 5 198 541 descreve genes recombinantes que codificam a expressão de proteínas BIP e descrevem também os métodos para a sua expressão, incluindo a holoproteína BIP recombinante, designada por BIPr50 (ou simplesmente BIPr) e os fragmentos recombinantes da proteína BIP. O pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários com o n° de série 07/885 501 e uma sua continuação parcial, o pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/072 063, depositado a 19 de Maio de 1993 e o correspondente pedido de patente de invenção PCT com o n° 93/04752 depositado a 19 de Maio de 1993 e publicado como sendo o documento WO 93/23540 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 93913992.9) descrevem métodos novos para a purificação de produtos de proteínas BIP recombinantes, expressos e segregados em células hospedeiras de mamíferos, geneticamente transformadas, criadas em cultura, e descrevem a forma para se produzir grandes quantidades de produtos de proteínas BIP recombinantes, adequados para a incorporação em preparações farmacêuticas estáveis e homogéneas.

Os fragmentos biologicamente activos da proteína BIP (fragmentos de BIP) compreendem as moléculas biologicamente activas que tenham a mesma ou idêntica sequência de aminoácidos de uma holoproteína BIP humana natural, com a excepção de à molécula fragmentária faltarem aminoácidos no terminal amino, aminoácidos internos e/ou aminoácidos do terminal carboxi da holoproteína. Como exemplos não limitativos de tais fragmentos rcfcre-se um fragmento do terminal N da proteína BIP humana natural que tem aproximadamente 25 kD, descrito por Ooi et al. em J. Exp. Med, 174:649 (1991), e o produto de expressão recombinante de ADN que codifica os aminoácidos do terminal N que vão desde 1 até cerca de 193 ou 199 da proteína BIP humana natural, descrito por Gazzano-Santoro et al. em lnfèct. Immun. 60:4154--4761 (1992), que recebeu a designação de BlPr^. Nessa obra publicada afirma-se que foi utilizado um vector de expressão como fonte de ADN codificador de um produto de expressão recombinante (BÍPr^) que possui a sequência de sinal do resíduo 31 e os primeiros 199 aminoácidos do terminal N da proteína BIP humana perfeitamente desenvolvida, conforme ilustrado na figura 1 da obra de Gray et al., supra, com a excepção de a valina na posição 151 estar especificada pelas letras GTG em vez de GTC e o resíduo 185 ser o ácido glutâmico (especificado pelas letras GAG) em vez da lisina (especificada pelas letras AAG). Também foi produzida a holoproteína recombinante (BIPtío) que possui a sequência (SEQ1D NOS: 1 e 2) ilustrada na figura 1 da obra de Gray et al., supra, com as excepções assinaladas para a ΒΙΡΓ23 e com a excepção de o resíduo 417 ser alanina (especificado pelas letras GCT) em vez de valina (especificado pelas letras GTT). Há outros exemplos que incluem as formas diméricas dos fragmentos de proteína BIP, conforme descrito no pedido de patente de invenção norte--americana co-pendente e de que somos co-proprietário com o n° de série 08/212 132 depositado a 11 de Março de 1994 e no correspondente pedido de patente de invenção PCT com o n°

PCT/US95/03125 publicado como sendo o documento WO 95/24209 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 95913668.0). Os produtos diméricos preferidos compreendem os produtos de proteína BIP dimérica em que os monómeros são fragmentos de proteína BIP do terminal amino que possuem os resíduos do terminal N compreendidos entre cerca de 1 a 175 até cerca de 1 a 199 da holoproteína BIP. Um produto dimérico partícularmente preferido é a forma dimérica do fragmento de proteína BIP que possui os resíduos do terminal N desde 1 até 193, designado por dímero ΒΙΡΓ42.

As variantes biologicamente activas da proteína BIP (variantes da BIP) compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as proteínas de fusão híbridas recombinantes, compreendendo a holoproteína BLP ou 0 seu fragmento biologicamente activo e pelo menos uma parcela de um outro polipeptido, pelo menos, e as formas diméricas das variantes de proteínas BIP. Como exemplos de tais proteínas de fusão híbridas e de tais formas diméricas refere-se as que foram descritas por Theofan et al. no pedido de patente de invenção norte--americana co-pendente e de que somos co-proprietários com o n° de série 07/885 911 e numa sua correspondente continuação parcial que é o pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/064 693 depositado a 19 de Maio de 1993 e no correspondente pedido de patente de invenção PCT com o n° US93/04754 depositado a 19 de Maio de 1993 e publicado como sendo o documento WO 93/23434, onde estão contidas as proteínas de fusão híbridas que compreendem, na extremidade do terminal amino, uma proteína BIP ou um seu fragmento biologicamente activo e também, na extremidade do terminal carboxi, pelo menos um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina ou uma sua variante alélica. Para os efeitos da presente invenção também estão previstas as proteínas de fusão híbridas de configuração idêntica, envolvendo uma parte ou a totalidade da proteína de ligação dos lipopolissacáridos (PLL).

Os análogos biologicamente activos da proteína BIP (análogos da BIP) compreendem, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os produtos de proteína BIP em que um ou vários aminoácidos tenham sido substituídos por um aminoácido diferente. Por exemplo, o pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários com o n° de série 08/013 801 depositado a 2 de Fevereiro de 1993 c o correspondente pedido de patente de invenção PCT com o n° US94/01235 depositado a 2 de Fevereiro de 1994, publicado como sendo o documento WO 94/18323 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94908704.3) descrevem análogos polipeptídicos da proteína BIP e de fragmentos de proteína BIP em que um resíduo cisteína é substituído por um aminoácido diferente. Um produto de proteína BIP preferido, descrito neste pedido de patente de invenção, é o produto de expressão de ADN que codifica desde o aminoácido 1 até cerca dos aminoácidos 193 ou 199 do terminal N da holoproteína BIP, mas em que a cisteína correspondente ao resíduo com o número 132 é substituída com alanina e que recebeu a designação de BIP^iAcis ou BIPr2i (o mesmo que rBPl2iAcis ou rBPki). Há outros exemplos que incluem as formas diméricas dos análogos de BIP; v.g. conforme consta do pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários com o n° de série 08/212 132 depositado a 11 de Março de 1994 e do correspondente pedido de patente de invenção PCT com o n° PCT/US95/03125 publicado como sendo o documento WO 95/24209 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 95913668.0).

Outros produtos de proteína BIP úteis de acordo com os métodos da presente invenção são os péptidos obtidos a partir de proteína BIP ou à base de proteína BIP, produzidos por meios recombinantes ou sintéticos (péptidos derivados de proteína BIP), tais como os descritos no pedido de patente de invenção norte-americana co-pendente e de que somos co-proprietários com o n° de série 08/504 841 depositado a 20 de Julho de 1995 e publicado como sendo o documento WO 96/08509 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 95928105.6) e no pedido de patente de invenção PCT co-pendente e de que somos co-proprietários com o n° PCT/US/94/10427 depositado a 15 de Setembro de 1994 e publicado como sendo o documento WO 95/19372 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94930435.6) que corresponde ao pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/306 473 depositado a 15 de Setembro de 1994, e no pedido de patente de invenção PCT n° US/94/02465 depositado a 11 de Março de 1994, publicado como sendo o documento WO 94/20532 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94911490.4), que corresponde ao pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/209 762 depositado a 11 de Março de 1994, que é uma continuação parcial do pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/183 222 depositado a 14 de Janeiro de 1994, que é uma continuação parcial do pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/093 202 depositado a 15 de Julho de 1993 (para o qual o correspondente pedido de patente de invenção internacional é o pedido de patente de invenção PCT com o n° US94/02401 depositado a 11 de Março de 1994, publicado como sendo o documento WO 94/20128 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94910854.2)), que é uma continuação parcial do pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/030 644 depositado a 12 de Março de 1993.

Os produtos de proteínas BIP actualmente preferidos compreendem os fragmentos do terminal N da proteína BIP, produzidos por via recombinante, especialmente aqueles que possuem um peso molecular compreendido aproximadamente entre 21 kD e 25 kD, tais como BIPr# ou BIPr2i, ou as formas diméricas de tais fragmentos do terminal N (v.g. o dímero ΒΙΡΓ42). Além disso, há outros produtos de proteínas BIP preferidos, entre os quais estão incluídos os fragmentos ΒΓΡγ50 e os péptidos derivados de proteínas BIP.

A administração de produtos de proteínas BIP é realizada preferencialmente com uma composição farmacêutica que contenha um produto de proteínas BIP e um diluente, um adjuvante ou um veículo aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. O produto de proteínas BIP pode ser administrado com ou sem agentes tensioactivos conhecidos, outros agentes quimio- terapêutícos ou outros agentes antimicrobianos conhecidos. Uma composição farmacêutica que contenha produtos de proteínas BIP (v.g. BIPr5o, BlPr^) contém o produto de proteínas BIP com uma concentração de 1 mg/mL em soluto salino tamponado com citrato (citrato 5 ou 20 mM, NaCl 150 mM, pH 5,0), contendo 0,1% em peso de poloxâmero 188 (Pluronic F-68, BASF Wyandotte, Parsippany, NJ) e 0,002% em peso de polissorbato 80 (Tween 80, ICI Américas Inc., Wilmington, DE). Outras composições farmacêuticas que contenham produtos de proteínas BIP (v.g. BIPr2i) contêm o produto de proteínas BIP com uma concentração de 2 mg/mL em citrato 5 mM, NaCl 150 mM, 0,2% em peso de poloxâmero 188 e 0,002% de polissorbato 80. Tais composições estão descritas no pedido de patente de invenção PCT co--pendente e de que somos co-proprietários com o n° US94/01239 depositado a 2 de Fevereiro de 1994, publicado como sendo o documento WO 94/17819 (pedido de patente de invenção europeia com o n° 94907963.6) que corresponde ao pedido de patente de invenção norte--americana com o n° de série 08/190 869 depositado a 2 de Fevereiro de 1994 e no pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 08/012 360 depositado a 2 de Fevereiro de 1993.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção irão ser compreendidos tomando em consideração os exemplos ilustrativos subsequentes. O exemplo 1 explica o efeito da administração de um produto de proteínas BIP sobre a mortalidade associada à meningococcemia. O exemplo 2 explica o efeito da administração de um produto de proteínas BIP sobre a

morbidade associada à meningococcemia. Os exemplos 3 e 4 descrevem o efeito da administração de um produto de proteínas BTP sobre a evolução da meningococcemia em dois indivíduos particulares.

Exemplo 1

Protocolo de estudo clínico - efeito do produto de proteínas BIP sobre a mortalidade

Concebeu-se um estudo clínico com seres humanos para se examinar o efeito de um exemplo de um produto de proteínas BIP, o BIPr2i, sobre os resultados clínicos em pacientes pediátricos que padeciam de doença meningocócica sistémica grave. Os resultados clínicos (mortalidade, amputações, enxertos, lesões neurológicas permanentes) foram avaliados por meio de um estudo realizado ao fim de 28 dias ou por concessão de alta hospitalar, consoante o que tivesse ocorrido em primeiro lugar. Além disso, avaliou-se também a segurança e os efeitos fannocinéticos e hemodinâmicos do produto de proteínas BIP.

Assim, implementou-se um estudo multicentros, de fase I exposta, sobre os efeitos do produto de proteínas BIP em pacientes pediátricos com meningococcemia grave que receberam cuidados convencionais. Os pacientes que satisfizeram os critérios de elegibilidade foram registados em consonância com a autorização expressa dos pais ou do tutor legal. Os critérios de elegibilidade foram tais que os pacientes registados tinham uma taxa prevista de 90% de resultados subsequentes adversos graves, definidos em termos de morte, colapso, amputação ou enxerto de pele. Todos os pacientes receberam cuidados intensivos pediátricos de tipo exaustivo, consistentes com os padrões habituais de cuidados médicos, e receberam a sua primeira dose de antibióticos não mais do que 8 horas após o inicio da administração do produto dc proteínas BIP.

Os primeiros 4 pacientes receberam uma infusão de BlPr^ à razão de 0,5 mg/kg durante 30 minutos, seguindo-se imediatamente uma infusão contínua de BlPrn à razão de 0,5 mg/kg/dia, durante 24 horas. Os 6 pacientes seguintes receberam uma infusão de BIPr2i à razão de 1,0 mg/kg, durante 30 minutos, seguindo-se imediatamente uma infusão de BIPr2i à razão de 1,0 mg/kg/dia, durante 24 horas. Os pacientes restantes receberam uma infusão dc BIPr2i à razão de 2,0 mg/kg, durante 30 minutos, seguindo-se imediatamente uma infusão de BIPr2i à razão de 2,0 mg/kg/dia, durante 24 horas. Todos os centros de estudo fizeram aumentos escalonados em simultaneidade, até aos níveis de doseamentos mais elevados.

Efectuou-se uma avaliação da farmocinética do produto de proteínas BIP e dos níveis das endotoxinas em circulação, verificando sequencialmente o plasma para pesquisa do BIPr2j e das endotoxinas, por meio do ensaio com o lisado de amebócitos de Limulus (LAL). Foram descritos todos os efeitos hemodinâmicos agudos associados à administração de BIPr2i, mediante o registo dos parâmetros hemodinâmicos convencionais, incluindo: ritmo cardíaco, pressão sanguínea arterial sistémica invasiva, electrocardiograma, saturação em oxigénio e medições hemodinâmicas invasivas obtidas por meio de um cateter inserido na artéria pulmonar. Não foram aphcados nenhuns outros dispositivos invasivos para efeitos do estudo; a aplicação dos dispositivos médicos ficou à exclusiva discrição do médico assistente e do pessoal paramédico e apenas com o objectivo de se observar a compatibilidade entre o paciente e os padrões normais de cuidados médicos.

Verificou-se a segurança por meio da medição contínuas dos sinais vitais e da hemodinâmica e pelos exames fisicos e por avaliações laboratoriais de segurança pré- e pós--tratamento. Por razões de segurança os pacientes foram acompanhados até à morte, até terem alta hospitalar ou até ter terminado o estudo de 28 dias, consoante aquilo que ocorresse em primeiro lugar.

Para participarem no estudo foram escolhidos pacientes com meningococcemia grave se satisfizessem os critérios seguintes de inclusão e de exclusão. Os critérios de inclusão foram: (1) idades entre 1 ano e 18 anos inclusive; (2) diagnóstico presumível de meningococcemia, com base em algumas ou na totalidade das observações seguintes: (a) petéquias ou púrpura, febre e instabilidade hemodinâmica num contexto clínico consistente com um diagnóstico de meningococcemia; (b) demonstração da existência de diplococos gram-negativos no sangue, no fluído cerebroespinal ou existência de lesões da pele num contexto clínico consistente com um diagnóstico de meningococcemia; e/ou (c) demonstração da existência de antigénios meningocócicos por determinação imunológica num contexto clínico consistente com um diagnóstico de meningococcemia; (3) classificação de prognóstico de septicemia meningocócica à moda de Glasgow igual a 8 ou superior [Sinclair et al., supra\, (4) historial do paciente na hipótese de ter recebido a primeira dose de antibióticos não mais do que 8 horas antes do início da administração do produto de proteínas BIP; (5) teste negativo de gravidez no caso das mulheres púberes ou pós-púberes; (6) autorização expressa fornecida por escrito pelos pais ou pelo tutor legal; e (7) recolha de informação confidencial de acompanhamento do paciente. Os critérios de exclusão foram: (1) insuficiência de acesso vascular para se administrar o produto de proteínas BIP sem comprometer os cuidados rotineiros da UCI; (2) exposição a agentes investigacionais durante os últimos 30 dias antes de participarem no estudo; e (3) qualquer doença que na opinião do médico assistente pudesse fazer com que o paciente não servisse para participar no estudo, incluindo a morte iminente.

Foram efectuados os seguintes actos nas 24 horas anteriores à participação no estudo: (1) obtenção do historial médico, (2) exame físico completo, (3) radiografia torácica, (4) avaliação laboratorial: hematologia: CSC (o mesmo que CBC), diferencial; coagulação: TP, // 29 ΤΤΡ (respectivamente ο mesmo que PT, PTT), fibrinogénio, dímeros D; microbiologia: culturas, estirpes Gram, serologia conforme indicado; análises clínicas: sódio, potássio, cloretos, bicarbonatos, glicose, AUS (o mesmo que BUN), creatinina, cálcio ionizado, fósforo, magnésio, bilirrubina, AST, ALT, CPK (com isoenzimas), LDH; gases no sangue arterial; análise da mina: química e microscópica; e (5) obtenção de autorização expressa por escrito e recolha de informação confidencial de acompanhamento. O BIPr2i foi fornecido sob a forma de uma solução límpida, incolor, estéril e não pirogénica em fiascos de vidro de 10 mL de uma só utilização, com uma concentração de 2 mg/mL em tampão de cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 5 mM a pH 5,0 contendo 0,2% de poloxâmero 188 e 0,002% de polissorbato 80 sem nenhum agente conservante. A armazenagem do fiasco de BIPr2) foi feita com refrigeração para 2°C-8°C em todos os momentos antes da administração. Antes da infusão deixou-se a temperatura do produto aumentar até à temperatura ambiente e administrou-se através de uma veia central ou por qualquer outra veia adequada. Determinou-se a conveniência do acesso intravenoso pela facilidade de se retirar sangue pela via de acesso e também pela facilidade de infusão de fluídos intravenosos sem infiltração. O BIPr2i foi o único agente administrado pelo ponto de admissão escolhido durante o protocolo de infusão. O ponto de acesso venoso não foi heparinizado, mas foi lavado sempre que necessário com soluto salino fisiológico.

Depois de ter sido iniciada a infiisão do produto de proteínas BIP, os pacientes foram observados para pesquisa da possível ocorrência de fenómenos adversos. Foram retiradas amostras de plasma, para determinação dos níveis de BlPr2i imediatamente após o início da infiisão (instante 0) e nos momentos a seguir indicados após o início da infiisão: 30 minutos, 90 minutos, 240 minutos, 720 minutos, ate ao momento de se terminar a infusão ao fim de 24 horas e 30 minutos, 24 horas e 37 minutos, 24 horas e 45 minutos, 25 horas, 25 horas e 30 minutos, 26 horas e 30 minutos, 27 horas e 30 minutos e 48 horas. Foram retiradas amostras de plasma, para determinação dos níveis de endotoxinas, imediatamente antes do início da infusão (instante 0) e nos momentos a seguir indicados após o início da infusão: 30 minutos, yU minutos, 240 minutos, 720 minutos e 48 horas. Foram determinadas as concentrações séricas do cálcio ionizado mediatamente antes do início da infusão (instante 0) e nos momentos a seguir indicados após o início da infusão: 30 minutos, 2 horas, 6 horas, 12 horas e 24 horas. A observação das concentrações do cálcio ionizado é a prática habitual a ter em conta nos casos de meningococcemia e tem lugar normalmente em cada 4 horas. Todas as amostras foram obtidas através de um tubo que não foi utilizado para a infusão do produto de proteínas BIP.

Foram registados os sinais vitais a seguir indicados em cada 5 minutos durante 30 minutos antes do início da infusão, em cada 5 minutos durante os 30 minutos de administração da dose e depois em cada 30 minutos durante 24 horas: (a) ritmo cardíaco; (b) pressões sanguíneas arteriais sistémicas: sistólica, diastólica e média; e (c) ritmo respiratório (se o paciente estivesse a respirar espontaneamente). Para além dos dados recolhidos manualmente, conforme se disse antes, os dados também foram registados digitalmente e guardados em cada minuto na unidade de memória do monitor instalado à cabeceira durante a permanência na UC1. Depois de o paciente ter saído da UCÍ, foram recolhidos os sinais vitais diariamente até o paciente ter alta hospitalar.

Foram registados os seguintes parâmetros hemodinâmicos invasivos em cada 10 minutos durante 30 minutos antes do início da infusão, em cada 10 minutos durante os 30 minutos de administração da dose e a seguir em cada 2 horas, durante 24 horas: (a) saturação em oxigénio venoso misturado (apenas com cateteres oximétricos); (b) pressão da cunha arterial pulmonar; (c) pressões arteriais pulmonares: sistólica, diastólica e média; (d) índice cardíaco (1C); (e) índice de resistência vascular sistémica (ÍRVS); (f) índice de resistência vascular pulmonar (IRVP); e (g) índice volúmico da pulsação (TVP). Registou-se um perfil completo de administração de medicamentos e de infusões vasoactivas até à alta hospitalar. Os parâmetros a seguir indicados foram documentados com uma frequência determinada pelo médico que prestou os cuidados de saúde primários, consistentes com o tratamento convencional da doença meningocócica grave: (a) gases no sangue arterial, (b) gases no sangue venoso, (c) fornecimento de oxigénio (D02), (d) consumo de oxigénio (VO2), (e) hematologia, (f) coagulação e (g) análises químicas do sangue. Calculou-se também uma classificação ‘PRISM’ (Pediatric Risk of Mortality Score - Risco Pediátrico de Classificação de Mortalidade) e registou-se no final do primeiro dia de internamento hospitalar. O quadro 1 subsequente mostra os factores com 0 número correspondente de pontos utilizados para o cálculo da classificação ‘PRISM’ (Pollack et al., “The pediatric risk of mortality (PRISM) score”, Criticai Care Medicine 16:1110,

Quadro 1 Risco Pediátrico de Classificação de Mortalidade (Pediatric Ride of Mortality Score) (Classificação PRISM) FACTORES RESTRIÇÕES E INTERVALOS ETÁRIOS Pts P.S. sistólica (mm/Hg) Só crianças Só adolescentes Todas as idades 130 -160 150-200 2 55-65 65-75 2 >160 >200 6 40-54 50-64 6 <40 <50 7 P.S. diastólica (mm/Hg) >110 6 Ritmo cardíaco (batidas/minuto) >160 >150 4 <90 <70 4 Ritmo respiratório (inspirações/minuto) 61-90 51-70 1 >90 >70 5 APNEIA APNEIA 5 Pa02/Fi02 200 - 300 2 <200 3 PaC02 (mm Hg) 51-65 1 >65 5 Classificação de Glasgow <8 6 Reacções pupilares desiguais ou dilatadas 4 fixas e dilatadas 10 TP/TTP > 1,5 x contraprova 2 Bilirrubina total (mg/dL) >3,5 idade > 1 mês 6 Potássio (meq/L) 3,0-3,5 1 6,5-7,5 1 <3,0 5 >7,5 5

Quadro 1 Risco Pediátrico de Classificação de Mortalidade (Pediatric Risk of Mortality Score) (Classificação PRISM) FACTORES RESTRIÇÕES E INTERVALOS ETÁRIOS Pts Cálcio (mg/dL) 7,0 - 8,0 2 12,0-15,0 2 <7,0 6 > 15,0 6 Glicose (mg/dL) 40-60 4 250-400 4 <40 8 >400 8 Bicarbonato (meq/L) <16 3 >32 3

No final do estado (isto é, no fim do 28° dia ou no momento da alta hospitalar, consoante aquilo que ocorreu em primeiro lugar), foi realizado um exame físico, incluindo os sinais vitais, e uma recapitulação de todos os fenómenos adversos. Também foram avaliados os seguintes resultados clínicos: (a) mortalidade; (b) amputações; (c) procedimentos de enxerto; (d) lesões neurológicas permanentes, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os acidentes cerebrovasculares, a atrofia cerebral e as doenças repentinas que exigissem medicação, que se tivessem manifestado como um funcionamento neurológico deficiente; e (e) classificações dos resultados pediátricos (com base na Escala de Categorias dos Resultados Cerebrais Pediátricos e/ou com base na Escala de Categorias dos Resultados Globais Pediátricos, conforme descrito por Fiser na obra “Assessing the outcome of pediatric intensive care”, J Pediatrics 121:1 68- -74, 1992).

Efectuou-se uma recapitulação dos registos médicos dos pacientes admitidos num centro clínico participante, o Centro 1 de Estudos, durante os dois anos imediatamente anteriores ao início do estudo com a proteína BIP. A partir desses registos» foram escolhidas 14 crianças para uma análise comparativa, uma vez que satisfizeram os três primeiros critérios de inclusão anteriormente descritos, respeitantes a idade, diagnóstico presumível de meningococccmia c classificação à moda de Glasgow. Seis destas 14 crianças de “contraprova histórica” morreram. Esta elevada taxa de mortalidade era previsível, tendo em conta os critérios de inclusão para satisfazer uma classificação à moda de Glasgow igual a 8 ou superior. Uma classificação à moda de Glasgow igual a 8 ou superior significa sempre uma doença grave.

Em contraste surpreendente, não morreu nenhum dos 10 pacientes no estudo com a proteína BIP efectuado no Centro 1 de Estudos. Assim, a administração do produto de proteínas BIP reduziu extraordinariamente a taxa de mortalidade de meningococcemia pediátrica grave no Centro 1 de Estudos, passando de 43% para 0%. Quando foram incluídos os resultados de todos os centros clínicos participantes, da totalidade dos 14 pacientes que participaram no estudo com a proteína BIP até ao momento presente apenas morreu um paciente - uma taxa de mortalidade apenas de 7%. Esta diminuta taxa de mortalidade é particularmente notável tendo em conta que 12 dos 14 pacientes tinham uma classificação à moda de Glasgow igual a 10 ou superior quando foram admitidos no estudo. Análises múltiplas que permitiram calcular uma taxa previsível de mortalidade para os 14 pacientes que participaram no estudo com a proteína BIP, com base em indicadores (níveis de endotoxinas, FNT, IL-6 e fihrinogénio, e TTP) para os quais se demonstrou que estavam correlacionados com a gravidade da doença e com resultados obtidos em diversos estudos [Brandtzaeg et al., supra, Van Deuren et ai, supra, McManus ei al., supra c Bone, supra] levavam a prever uma taxa dc mortalidade compreendida entre cerca de 20% e cerca de 50% para esta população. Os níveis de endotoxmas, FNT e IL-6 para os 10 pacientes iniciais que participaram no estudo com a proteína BIP estão indicados nas figuras 1 a 6.

Exemplo 2

Efeito do produto de proteínas BIP sobre a morbidade

Os resultados clínicos dos pacientes tratados em conformidade com o protocolo de estudo com o produto de proteínas BIP descrito no exemplo 1 anterior estão agrupados no quadro 2 subsequente e são comparados com os resultados clínicos das 14 crianças de “contraprova histórica” do Centro 1 de Estudos que satisfizeram os critérios de inclusão no estudo durante os 2 anos imediatamente anteriores ao início desse estudo. A história natural da evolução clinica da meningococcemia teria sido bastante semelhante; as crianças anteriormente saudáveis manifestaram um prodromo de 12 a 24 horas semelhante à gripe, desenvolveram púrpura e depois morreram ou ficaram moribundas ao fim de 4 a 6 horas. De forma típica, tais pacientes com meningococcemia continuaram a ficar cada vez mais doentes na UPCI, pelo menos durante as primeiras 12 horas, e frequentemente sucumbiram a um choque irreversivelmente progressivo. Não houve diferenças conhecidas no padrão de cuidados médicos administrados aos pacientes que participaram no estudo com a proteína BIP comparativamente com os 14 pacientes anteriores de “contraprova histórica” do Centro 1 de Estudos, com a excepção de se ter administrado um produto de proteínas BEP.

1 Quadro 2 “Contraprova histérica” Crianças do estudo Crianças do estudo Crianças do Centro 1 de com a proteína BIP no ccmaprotemaBIP Estudos Centro 1 de Estudos an todos os oaitros Número de crianças que satisfizeram os critérios de ridusao cu que participaram no estudo oom a 14 10 14 proteína BIP Numero dementes 6(43%) 0(0%) 1(7%) Morbidades Número de sobreviventes com 2/8 1/10 1/13 anputações graves (25%) (10%) (8%) Número de sobreviventes com lesões 2/8 0/10 0/13 neurológicas permanentes (25%) (0%) (0%) Fenómenos totais de moibidade (amputação 4/8* 1/10 1/13 grave ou lesão neurológica permanaite) (50%) (10%) (8%) * houve um paciente com amputações graves e também com lesão neurológica permanente

Os resultados agrupados no quadro 2 revelam que a administração do produto de proteínas BIP não só reduziu imenso a taxa de mortalidade no Centro 1 de Estudos como também reduziu a incidência de morbidades graves de 50% para 10% no Centro 1 de Estudos. Quando foram considerados todos os resultados dos centros clínicos participantes, a taxa global de morbidade grave continuou a ser baixa, da ordem de 8%. A interpretação dos dados de morbidade é algo complicada pelo facto de o tratamento com o produto de proteínas BIP ter tido um efeito significativo sobre a redução do número de mortes associadas à doença, isto é, houve um número de pacientes gravemente doentes que foram salvos e que de outra forma teriam sucumbido à doença. Não foi feita nenhuma análise par se prever as morbidades que os pacientes poderiam ter tido se não tivessem morrido. Para esta análise dos resultados de morbidade, as amputações pelo pulso ou mais acima, ou pelo tornozelo ou mais acima, foram consideradas como amputações graves. As anomalias neurológicas que tiveram como consequência diminuições significativos e permanentes das funções motoras, cognitivas ou sensoriais foram consideradas como lesões neurológicas permanentes. Outros quatro pacientes que participaram no estudo com a proteína BIP (todos eles do Centro 1 de Estudos) sofreram amputações menores dos dedos dos pés ou das mãos (e uma amputação parcial de pé). Outros 4 pacientes de “contraprova histórica” do Centro 1 de Estudos manifestaram outras anomalias neurológicas, incluindo acidentes cerebrovasculares, doenças súbitas, anomalias do EEG ou do varrimento TC e paralisia do nervo craniano. Um paciente do estudo efectuado com a proteína BIP (no Centro 1 de Estudos) manifestou uma anomalia neurológica (ver o exemplo 4).

Exemplo 3

Evolução clínica de um indivíduo no estudo com a proteína BIP

Este paciente (com o número 2 no estudo com a proteína BIP) era um rapaz branco com 7 anos de idade que anteriormente era saudável. Na noite anterior à admissão na unidade pediátrica de cuidados intensivos (UPC1), deu entrada na sala de urgências com sintomas de febre, vómitos e dores de cabeça. O seu número de leucócitos (NLC) era de 17500, mas foi no entanto enviado para casa porque o exame que lhe foi feito não sugeriu a existência de nenhuma doença significativa. Foi visto novamente na manhã seguinte, altura em que foi observada uma erupção difusa de petéquias. O seu NLC havia caído para 6300 e a febre e as dores de cabeça tinham aumentado. Suspeitou-se da existência de meningococcemia e após um período inicial de administração de antibióticos e de infusão de fluidos foi internado na unidade pediátrica de cuidados intensivos (UpCI) do Centro 1 de Estudos.

Foi entubado e ventilado mecanicamente, ressuscitado com fluídos e mantido em suporte inotrópico com uma infusão de epinefrina. Foi tratado com o antibiótico ceflriaxona.

Antes de ser admitido no estudo com a proteína BIP, a sua classificação à moda de Glasgow era de 14/15, a sua classificação de tipo ‘PRISM’ era de 17 e o seu exame físico revelou uma temperatura de 38,8°C, um ritmo cardíaco de 145, um ritmo respiratório de 16 no ventilador e uma pressão sanguínea de 107/46. O seu valor de TTP era de 25,2 e o seu nível de fibrinogénio era de 480. As culturas sanguíneas revelaram a existência do serótipo C de N. meningitidís. Aplicou-se um cateter na artéria pulmonar para verificação e obteve-se informação expressa e escrita para poder participar no protocolo de tratamento com a proteína BIP, conforme anteriormente descrito no exemplo 1.

Iniciou-se uma infusão com a proteína ΒΙΡΓ21 às 14:35 do dia de admissão na UPC1 (Γ Dia). O paciente recebeu uma dose de BIPr2i à razão de 0,5 mg/kg durante 30 minutos, seguindo-se uma infusão à razão de 0,5 mg/kg durante as 24 horas subsequentes. O paciente tolerou bem esta infusão, sem nenhumas alterações hemodinâmicas e sem nenhumas outras complicações. A sua estadia na UPCI foi relativamente sossegada; interrompeu-se o apoio inotrópico na noite do 4o dia, após o que se desligou rapidamente o seu ventilador. O paciente foi retirado do ventilador durante o 5o dia sem quaisquer problemas. O paciente foi transferido para os cuidados pediátricos gerais na tarde do 6o dia e teve alta hospitalar ao 9° dia sem quaisquer complicações.

Exemplo 4

Evolução clínica de outro indivíduo no estudo com a proteína BIP

Este paciente (com o número 6 no estudo com a proteína BIP) era um rapaz branco com 18 anos de idade que anteriormente tinha uma saúde excelente. Antes de ter sido admitido teve uma inflamação de garganta durante 2 dias e letargia. Na noite em que foi admitido, o seu companheiro de quarto encontrou-o no canto do dormitório, inconsciente e recoberto com uma erupção de petéquias púrpura. Foi transportado de ambulância para o hospital no momento em que a sua temperatura era de 101°F e estava em estado de choque fulminante. Foi tratado com fluidos de ressuscitação, com o antibiótico ceftriaxona e com uma infusão de dopamina para melhorar a circulação. Foi transportado de helicóptero para o Centro 1 de Estudos. À chegada, foi entubado e ventilado. Antes de ser admitido no estudo com a proteína BIP, a sua classificação à moda de Glasgow era de 12/15, a sua classificação de tipo ‘PRISM’ era de 16. Estava moribundo. O seu exame físico revelou uma expansão rapidamente significativa de púrpura difusa, um reenchimento capilar superior a 8 segundos e uma pulsação quase indetectável. Os seus pés estavam azuis, frios, sem pulsação, o mesmo acontecendo com os 10 dedos. A sua temperatura era de 37,7°C, o ritmo cardíaco era de 150, o ritmo respiratório era de 20 no ventilador e a pressão sanguínea era de 133/66. A avaliação laboratorial que lhe foi feita indicou um valor para o NLC igual a 7500 com um diferencial de 73% segs e 14% de faixas. O seu TP era de 26, o seu TTP era superior a 114, o seu nível de fíbrinogénio era de 121 e os seus dímeros D eram superiores a 8. As culturas sanguíneas revelaram a existência do serótipo C de K meningitidis. À chegada apresentava sinais bioquímicos de insuficiência sistémica multiorgânica. A ressuscitação ccan fluídos prosseguiu e deu-se início a uma infusão com epinefiina. Obteve-se autorização expressa por escrito e foi admitido no estudo com a proteína BIP, conforme anteriormente descrito no exemplo 1. Às 07:15 horas do dia de admissão na UPCI (Io dia), teve início uma infusão de BIPr2i segundo uma dose de 1 mg/kg durante 30 minutos, seguindo-se uma dose de 1 mg/kg nas 24 subsequentes. As infusões de BIPr2i foram bem toleradas, sem efeitos liemodinâmicos adversos. Foi necessário apoio hemodinâmico com infusões inotrópicas de dopamina, dobutamina e epinefrina. Suspendeu-se a administração de epinefrina e de dopamina na manha do 3o dia, seguindo-se a suspensão rápida da administração de dobutamina. Uma avaliação invasiva do seu estado hemodinâmico com um cateter de Swan-Ganz revelou um estado hiperdinâmico que não evoluiu para uma transição para o estado hipodinâmico, conforme seria dc admitir num rapaz muitíssimo doente ao fim de dois dias de terapia. Embora a sua coagulopatia fosse inicialmente grave e necessitasse de transfusões múltiplas de plasma recente congelado, células acondicionadas e plaquetas, a coagulopatia tinha sido rapidamente resolvida ao 3o dia de hospitalização. Pelo 3o dia também os seus pés, inicialmente frios e descorados, começaram a voltar a uma cor rosa normal, permitindo concluir que havia restabelecimento da circulação e aquecimento. Teve então início uma terapia adicional com antibióticos em que se utilizou vancomicina e tobramicina. Ao 4o dia o seu estado clínico tinha melhorado até ao ponto de se desligar o seu ventilador. A supressão do ventilador prosseguiu durante todo o dia, mas foi interrompida ao 5o dia devido a um edema pulmonar transitório. Admite-se que este edema pulmonar tivesse sido devido à ressorção de um terço do fluído e à cicatrização do seu derramamento vascular. A supressão do seu ventilador prosseguiu mais tarde no 5° dia. A circulação nas suas extremidades inferiores tinha melhorado nitidamente até ao ponto de ter alta da UPC1 ao 8o dia, as lesões teciduais apenas eram visíveis no seu calcanhar esquerdo que foi desbridado, e no segundo dedo do pé esquerdo que foi finalmente amputado. Durante a sua permanência no hospital, a seguir a um episódio de hipertensão transitória, foi-lhe feita uma análise por varrimento TC que revelou sinais de um acidente cerebrovascular (ACV) temporal parietal direito que tinha oconido aproximadamente na data do seu internamento na UPCI. O ACV estava ncurologicomente calmo e não comprometeu nenhumas das funções // r motoras, cognitivas ou sensoriais. A sua estadia pós-UPCI nos cuidados pediátricos gerais consistiu essencialmente numa terapia física, numa terapia ocupacional e numa nutrição enriquecida. Foi-lhe dada alta ao 14° dia e foi enviado para uma instituição de reabilitação para continuar a trabalhar no seu fortalecimento e reabilitação geral.

Os especialistas na matéria podem conceber inúmeras modificações e variantes da invenção anteriormente descritas. Assim sendo, apenas devem ser tomadas em conta as limitações explicitadas nas reivindicações anexas.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Xoma Corporation (ia) INVENTORES: Giroir, Brett P.

Scannon, Patrick J. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Utilizações terapêuticas de produtos de proteínas BIP contra a meningococcemia humana” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Marshall, 0’Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) RUA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) CIDADE: Chicago (D) ESTADO: Illinois (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 60606-6402 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO. (C) CLASSIFICAÇÃO: (vi) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Sharp, Jeffiey S. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 31 879

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO:27129/33248 PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 312/474-6300 (B) TELEFAX: 312/474-0448 (C) TELEX: 25-3856 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1813 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGTA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) PARTICULARIDADE:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 31.1491 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: péptidomat (B) LOCALIZAÇÃO: 124.1491 (ix) PARTICULARIDADE: (A) NOME/CÓDIGO: particularidademisc (D) OUTRA INFORMAÇÃO: £CBIPi” Á'*á (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 1: CAGGCCTTGA GGTTTTGGCA GCTCTGGAGG AIG AGA GAG AAC AIG GOC AGG GGC 54 Met Alg Glu Asn Met Ala Alg Gfi -31 -30 -25 CCT TOC AC GCG OGG AA TOG GIG TOC CIG ATC GIG CIC GIC GOC ATA 102 PTO Qs Asn Ala PTO Aig Tip Vai Str Leu Met Vai Leu Vai Ala Ilc -20 -15 -10 GGC AGC GOC GIG ACA GCG GCG GIC AAC OCT GGC GIC GIG GIC AGG ATC 150 GB Thr Ala Vai Thr Ala Ala Vai Asn Pro Gfi Vai Vai Vai Arg He -5 1 5 TOC CAG AAG GOC CIG GAC TAC GGC AGC CAG CAG OGG AOG GOC GCT CIG 198 So- Gin Lis GB Leu Asp Tir Ala Ser Gin Gn GB Thr Ala AJa Leu 10 15 20 25 CAG AAG GAG CIG AAG AGG ATC AAG ATT OCT GAC TAC TCA GAC AGC TTT 246 Gin Lis Ghi Leu Lis Aig He Lis He Pro Asp Tir Ser Asp Ser Phe 30 35 40 AAG TC AAG CAT crr GOG AAG GGG CAT TAT AGC TIC TAC AGC AIG GAC 294 Lis He Lis His Leu Gfi Lis GS Hs Tir Sa- Phe Tir Ser Met Asp 45 50 55 ATC CGT GAA 1TC CAG CTT COC AGT TOC CAG ATA AGC AIG GIG COC AAT 342 He Aig Glu Phe Gin Leu Pro Ser Ser Gn He Ser Met Vai Pro Asn 60 65 70 GIG GGC crr AAG TTC TOC ATC AGC AAC GGC AAT ATC AAG ATO AGC GGG 390 Vai GB Leu Lis Phe Ser He Ser Asi Ala Aai He Lis He Ser Gfi 75 80 85 AAA TOG AAG GCA CAA AAG AGA TIC ΤΓΑ AAA AIG AGC GGC AAT ΤΤΓ GAC 418 Lis Tip Lis Ala G3n Lis Aig Rb Leu Lis Met Ser Gfi Asn Rb Asp 90 95 100 105 CIO AGC ATA GAA GGC ATC TOC ATT TOG GCT GAT CIG AAG CIG GGC AGT 486 Leu Ser He Glu ca Met Sa- He Ser Ala Asp Leu Lis Leu Gfi Ser 110 115 120 AAC GOC AGG TCA GGC AAG ccc ACC ATC ACC TOC TOC AGC TOC AGC AGC 534 Asn Pro Ur Ser Gfi lis Pro Thr He Thr Qs Ser Ser Cis Ser Ser 125 130 135 CAC ATC AAC AGT GIC CAC GIG CAC ATC TCA AAG AGC AAA GIC GGG TOG 582 His He Asn Ser Vai His Vai Hs He Ser Lis Ser Lis Vai Gfi Tip 140 145 150 CIO ATC CAA CIC TTC CAC AAA AAA ATT GAG TCT GCG CTT CGA AAC AAG 630 Leu He Gin Leu Phe His T la Lis He Glu Ser Ala Leu Aig Asn Lis 155 160 165

ATO AAC AGC CAG GIC Met Asn Ser Qn Vai 170 CIG CAA GCT TAT TIC Leu Gin Pro Tír Phe 190 GIG GCT GGA ATO AAC Vai Ala Γ® Se A<37 205 GAG AGC CIG GAT GTA Ou Thr Leu Asp Vai 220 CAC AAT OCA OCT OOC • Hs Asn Pro Pro Pro 235 CAT GAC OOC ATO GTA Hs Asp Aig Met Vai 250 GOC GGG CIT GTA TAC Ala GE Leu Vai Tr 270 GAT GAC ATO ATT OCA Asp Asp Met Se Pro 285 τη· GGA ACC TIC CEA Phe d Thr Phe Leu 300 • ATA CAG ATO CAT GIC Se Gin Be Hs Vai 315 OOC ACC GOC CIT ACC Pro Thr GE Leu Thr 330 GIC CIC GOC AC TOC Vai Leu Pro Asn Ser 350 ACA ACT GGT TCC ATO Thr Thr GE Ser Met 365 GAG CIG AAG CIG GAT Ou Leu Lis Leu Asp 380 TOC GAG AAA GIG ACC AAT Os GEj Tis Vai Thr Asn 175 180 CAG ACT CIG OCA GTA ATO Gin Thr Leu Pro Vai Met 195 TAT GGT CIG GIG OCA OCT Tr GE Leu Vai Ala PTO 210 CAG ATO AAG GGG GAG TTT Gin Met Lis GE Glu Phe 225 ITT GCT OCA OCA GIG ATO Phe Ala Pro Pro Vai Met 240 TAC CIG GGC cic TOA GAC Tír Leu GE Leu Ser Asp 255 260 CAA GAG GCT GGG GIC TEG Qn Ou Ala GE Vai Leu 275 AAG GAG TCC AAA TTT OGA lis Ou Ser Lis Phe Aig 290 OCT GAG GIG GOC AAG AAG Pro Ou Vai Ala Lis Lis 305 TOA GOC TOC ACC COG OCA Ser Ala Ser Thr Pro Pro 320 iro TAC OCT GOC GIG GAT Phe Tr Pro Ala Vai Asp 335 340 TCC CIG GCT TOC CIC TIC Ser Leu Ala Ser Leu Phe 355 GAG GIC AGC GOC GAG TCC Gu Vai Ser Ala Glu Ser 370 AGG CIG CIC CIG GAA CIG Aig Leu Leu Leu Gu Leu 385 TCT GTA TOC TOC AAG 678 Ser Vai Ser Ser Lis 185 ACC AAA ATA GAT TCT 726 Thr Lis Be Asp Ser 200 OCA OCA ACC A£G GCT 774 Pro Ala Thr Thr Ala 215 TAC AGT GAG AAC CAC 822 Tr Ser Qu Asn Hs 230 GAG TTT OOC GCT GOC 870 Qu Phe Pro Ala Ala 245 TAC TIC TIC AAC ACA 918 Tr Phe Phe Asn Thr 265 AAG ATO AGC CIT AGA 966 lis Met Thr Leu Arg 280 CIG ACA ACC AAG TIC 1014 Leu Thr Thr Lis Phe 295 TTT OOC AAC ATO AAG 1062 Phe Pro Asn Met Lis 310 CAC CIG TCT GIG CAG 1110 Hs Leu Ser Vai Qn 325 GIC CAG GOC TTT GOC 1158 Vai Qn Ala Phe Ala 345 CIG ATT GGC ATO CAC 1206 Leu Be GE Met Hs 360 AAC AGG στ GIT GGA 1254 Asi Ag Leu Vai GE 375 AAG CAC TOA AAT ATT 1302 Lis Hs Ser Asn Be 390 yy '46 GGC OOC TIO OOG GTT GAA TIG CIG CAG GAT AIC AIG AAC TAC ATT GEA 1350 Gfi Pro Phe Pro Vai Glu Leu Leu Gin Asp He Met Asn Tir He Vai 395 400 405 OOC ATT CIT GIG CIO OOC AGG GTT AAC GAG AAA CTA CAG AAA GGC TIC 1398 Pro He Leu Vai Leu Pro Aig Vai Asn <3u Lis Leu <3n Lis Gfi Phe 410 415 420 425 GCT CIO GOG AOG OOG GOC AGA GIC CAG CIC TAC AAC GEA GIG CIT CAG 1446 Pro Lai Pro Thr Pm Ala Aig Vai On Leu Tir Asn Vai Vai Leu Gin 430 435 440 ccr CAC CAG AAC nc CIG CIG rrc GGT GCA GAC GTT GIC TAT AAA 1491 Pro Hs Gin Asn Phe Leu Leu Phe ca Ala Asp Vai Vai Tr Lis 445 450 455 TGAAGGCACC AGGGGTGCCG GGGGCTGTCA GCCGCACCTG TTCCTGATGG GCTGTGGGGC 1551 ACCGGCTGCC TTTCCCCAGG GAATCCTCTC CAGATCTTAA CCAAGAGCCC CTTGCAAACT 1611 TCTTCGACTC AGATTCAGAA ATGATCTAAA CACGAGGAAA CATTATTCAT TGGAAAAGTG 1671 CATGGTGTGT ATTTTAGGGA TTATGAGCTT CTTTCAAGGG CTAAGGCTGC AGAGATATTT 1731 CCTCCAGGAA TCGTGTTTCA ATTGTAACCA AGAAATTTCC ATTTGTGCTT CATGAAAAAA 1791 AACTTCTGGT TTTTTTCATG TG 1813 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 487 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína : SEQ ID NO:2:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA

Met -31 Aig -30 Gki Asn Met Ala Aig -25 Gfi Ser -15 Leu Met Vai Leu Vai -10 Ala Be Asn Pio Gfi Vai 5 Vai Vai Aig He Ser On On 20 C3i Thr Ala Ala Leu 25

Pro Gs Asn Ala -20 Pro Aig Tip Vai Gli Thr Ala -5 Vai Thr Ala Ala Vai 1 Ser 10 Gin Lis Gfi Leu Asp 15 Tir Ala On T is Ou Leu Lis 30 Arg He Lis

Be Pro Asp Tir Ser Asp Ser Phe 35 40 His Tir Ser Phe Tff Ser Met Asp 50 55 Ser Gin Be Ser Met Vai Pro Asn 70 Asn Ala Asn Ue 1 is Be Ser Gfi 85 Leu Lis Met Ser Gfi Asn Phe Asp 100 105 Ser Ala Asp Leu Lis Leu Gfi Ser 115 120 • Be 130 Thr Cis Ser Ser Cis 135 Ser S<r Be Ser Lis Ser Lis Vai Gfi Trp 150 Be Ou Ser Ala Leu Arg Asn Lis 165 Vai Thr Asn Ser Vai Ser Ser Lis 180 185 Pro Vai Met Thr Lis Be Asp Ser 195 200 Vai Ala Pro Pro Ala Thr Thr Ala 210 215 Gfi Ou Phe Tr Ser Glu Asn His • 230 Pro Vai Met Gfii Phe Pro Ala Ala 245 Leu Ser Asp Tff Phe Phe Asn Thr 260 265 <3ti Vai Leu Lis Met Thr Leu Aig 275 280 Lis Phe Aig Leu Thr Thr lis Phe 290 295 Ala Lis Lis Phe Pro Asn Met Lis 310 Thr Pro Pro His Leu Ser Vai C3n 325 lis Be Lis His Leu Gfi lis Gfi 45 Be Aig Glu Phe Gin Leu Pro Ser 60 65 Vai Gfi Leu Lis Phe Ser Be Ser 75 80 lis Τφ Lis Ala <3n Lis Aig Phe 90 95 Leu Ser Be Glu Gfi Met Ser Be 110 Asn Pro Thr Ser Gfi lis Pro Thr 125 His Be Asn Ser Vai His Vai His 140 145 Leu Be Gin Leu Phe His Lis Lis 155 160 Met Asn Ser C3n Vai Cis G3u Lis 170 175 Leu G3n Pro Tír Phe Gin Thr Leu 190 Vai Ala Gfi Be Asn Tr Gfi Leu 205 Glu Thr Leu Asp Vai Gin Met Lis 220 225 His Asn Pro Pro Pro Phe Ala Pro 235 240 His Asp Aig Met Vai Tir Leu Gfi 250 255 Ala Gfi Leu Vai Tr Gin Gu Ala 270 Asp Asp Met Be Pro lis Ou Ser 285 lhe Gfi Thr Phe Leu Pro Ou Vai 300 305 Be (3n Be His Vai Ser Ala Ser 315 320 Pro Thr Gfi Leu Thr Phe Tir Pro 330 335 48

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Lisboa, 20 de Fevereiro de 2001 O Agente Oficial da Propriedade industria!

A.O.P.Í. Rua tio Salitre, 195, r/r-Drt. 125·,! LISBOA

Claims (2)

1. Reivindicações Utilização de um produto de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade (BIP) para a preparação de um medicamento para o tratamento da meningococcemia nos seres humanos. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento se destina a evitar a mortalidade e/ou a reduzir a taxa e a gravidade das morbidades associadas à meningococcemia nos seres humanos. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que as morbidades referidas compreendem amputações, procedimentos de enxerto e/ou lesões neurológicas permanentes. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o produto de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade (BIP) é um fragmento do terminal amino da proteína bactericida indutora da permeabilidade (BIP) que possui um peso molecular compreendido entre cerca de 21 kD e 25 kD. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o produto de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade (BIP) é o fragmento BIPr2i ou uma sua forma dimérica. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o produto de proteínas bactericidas indutoras da permeabilidade (BIP) é o fragmento BIPr2]. 2
2. 7. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o medicamento se destina a administração simultânea com qualquer outro agente terapêutico. Lisboa, 20 de Fevereiro de 2001 T?. O Agente Oficial da Propriedade Industrial

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