JP3391453B2

JP3391453B2 - 内毒素結合タンパク質の調製のための方法

Info

Publication number: JP3391453B2
Application number: JP50361794A
Authority: JP
Inventors: グリナ，リン，エス．
Original assignee: ゾーマコーポレイション
Priority date: 1992-05-19
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 2003-03-31
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: WO1993023540A2; EP0642579A1; ES2132239T3; CN1096822A; CA2136208A1; JP2003125794A; WO1993023540A3; EP0642579B1; DK0642579T3; DE69324359T2; HK1014198A1; CA2276548C; CA2276548A1; AU4382093A; CN1060216C; JPH08500730A; ATE178652T1; GR3030419T3; CA2136208C; US5439807A

Description

【発明の詳細な説明】本願出願は、1992年５月19日に出願された米国特許出
願No.07/885,501の一部継続出願である。

発明の分野本発明は、一般に、組換法による内毒素結合タンパク
質の調製のための改善された手順に関し、具体的には、
発酵槽での培養を含む培養において遺伝子的に形質転換
した宿主細胞を用いた、殺菌性／浸透性促進（BPI）タ
ンパク質、リポ多糖類結合タンパク質（LBP）、高密度
リポ多糖類、Limulus抗−LPS因子、タキプレシン、およ
び構造的に関連するタンパク質などの組換内毒素結合タ
ンパク質の大規模製造のための方法に関する。

発明の背景内毒素あるいはリポ多糖類は、グラム陰性細菌の細胞
壁の構成成分であり、急性細菌感染の発現に関与する。
内毒素あるいはリポ多糖類（LPS）の一次形状に結合す
る無数のタンパク質が報告されている。かようなLPS−
結合タンパク質の例には、本明細書に参考までに取り入
れた、殺菌性／浸透性促進タンパク質（BPIタンパク
質）、リポ多糖類結合タンパク質（LBP）、高密度リポ
多糖類およびタキプレシン〔本明細書に参考までに取り
入れたNakamura et al.,J.Biol.Chem.,263:16709−1671
3（1988）〕がある。

これらタンパク質のある種は、構造上の重要な相同性
を共有している。例えば、BPIとLBP双方は、LPSの脂質
Ａ部分に結合する各分子の領域である約25kDaの陽荷電
したアミノ末端領域を有する。Schumann et al.,Scienc
e,249:1429−1431（1990）を参照のこと。

膜結合したLPSへのBPIタンパク質の結合は、感受性の
グラム陰性細菌のエンベロープ透過性を増大させる。Oo
i et al.,J.Biol.Chem.,262:14891（1987）。BPIタンパ
ク質は、可溶性LPSにも結合し、そして、ヒトBPIタンパ
ク質は、イオン交換クロマトグラフィーあるいは大腸菌
アフィニティークロマトグラフィーを組み合わせた酸抽
出によって、多形核好中球（PMNs）から単離されてい
る。Elsbach et al.,J.Biol.Chem.,254:11000（1979）;
Weiss et al.,Blood,69:652（1987）。ヒトPMNsから単
離したホロBPIタンパク質は、グラム陰性細菌の広範な
種に対して強い殺菌活性を有している。Elsbach et a
l.,J.Biol.Chem.,254:11000（1979）。この抗細菌活性
は、単離したヒトのホロBPIタンパク質のアミノ末端領
域に関連しているものと思われる。これに対して、単離
したヒトのBPIタンパク質のカルボキシ末端は、わずか
に検出可能な抗細菌活性を示したに過ぎなかった。Ooi
et al.,J.Exp.Med.,174:649（1991）。

BPIをコードするヒトDNAがクローニングされ、組換え
BPIおよびその生物学的に活性な（例えば、アミノおよ
びカルボキシ末端）断片の大量生産を許容する、コード
しているタンパク質のアミノ酸配列を解明されている
〔本明細書にて参考までに採り上げたGray et al.,J.Bi
ol.Chem.,264:9505（以下、「Gray」と称する）および
米国特許No.5,198,541を参照〕。従来のタンパク質精製
法を利用した形質変換した細胞の培地から組換えBPIお
よびBPI−関連タンパク質を精製するための最初の試み
は、低収率を招くのみであった。³⁵S標識したメチオニ
ンを用い、成熟BPIタンパク質のアミノ末端の199個のア
ミノ酸〔以下、「rBPI（１−199）」と称する）を含む
組換え生成物を発現する形質変換したチャイニーズハム
スター卵巣（CHO）細胞の細胞培養にて実施されるパル
ス追跡実験は、組換えBPI断片が、追跡の3.5〜７時間に
て培地から消失していたことを示した。この生成物の低
収率の根拠を決定するための予備実験にて、タンパク生
成物は顕著な「粘着性」を示し、そして実際のところ、
それ自体、（宿主細胞を含む）他の培地成分、およびプ
ラスチックならびにガラス培養器に接着していた。しか
しながら、タンパク質損失に関する詳細な理由は、未だ
明らかにされていない。

BPIタンパク質と同様、LBPは、LPSの脂質Ａ部分に結
合する。ホロ−LBPタンパク質は、肝臓から分泌された6
0kDaのタンパク質であり、LPSをマクロファージに誘導
する機能を担っていることが報告されている。Ooi et a
l.,J.Exp.Med.,174:649−65（1991）。BPIタンパク質と
は異なり、LBPは一般に、LPSによって生じた炎症反応を
増幅する。例えば、LBPは、LPS−誘発した腫瘍壊死因子
（TNF）の生成を刺激する。

本発明での興味ある事項は、タンパク質の単離および
精製における交換物質および関連物質の使用にある。例
えば、Prior et al.,による国際出願の公開公報 No.WO
89/05157は、免疫グロブリンが交換物質に吸着されて
いるクロマトグラフィーカラムに細胞の培養培地を通過
させることによる、組換え免疫グロブリンの精製と単離
を報告している。そして、免疫グロブリンを、カラムの
塩濃度を上げることによって溶出した。他の例として、
Robins,et al.,による国際出願の公開公報 No.WO 90/0
8159は、アニオン交換物質の存在下でのインキュベーシ
ョンによるタンパク調製物からのDNAの除去を報告して
いる。Ann.N.Y.Acad.Sci.,413:313−321（1983）にてWa
ngは、非イオン性樹脂を用いて、発酵槽培養物から、標
準抗生物質、シクロヘキシミドの生成と単離のための
「ハイブリッド」発酵抽出法の結果を示し、そして、あ
る樹脂（XAD−４、Rohm and Haas、フィラデルフィア、
ペンシルベニア州）に関して、樹脂から生成物を回収
「できる」程度にまで、樹脂表面に生成物が吸着される
ことを付言している。

細菌感染およびその後遺症の調節剤としての、BPIタ
ンパク質およびLBPのような内毒素結合タンパク質の有
用性がために、細胞培養物からかようなタンパク質を単
離するための改善された方法を、当該分野では要望され
ている。

発明の概要本発明は、内毒素結合タンパク質、特に、脂質Ａ結合
タンパク質の高収率での単離を促す改善された方法を提
供する。

改善された方法は一般に、内毒素結合タンパク質をコ
ードするDNAで遺伝子的に形質変換された宿主細胞を含
む細胞の培養培地に特定のカチオン交換物質を組み込む
ことを含む。前記宿主細胞によって細胞の培養培地に分
泌されたかようなタンパク質は、前記カチオン交換物質
に可逆的に結合することができる。そして、結合したタ
ンパク質を有するカチオン交換物質は、細胞の培養培地
から分離される。最後に、所望の内毒素結合タンパク質
は、カチオン交換物質から単離される。

改善された方法は、内毒素結合タンパク質あるいはそ
の断片の発現のためのDNAで遺伝子的に形質転換した宿
主細胞（好ましくは、CHO−K1あるいはCHO−DG44細胞）
を含む細胞の培養培地に特定のカチオン交換物質（好ま
しくは、Ｓ−セファロース粒子）を組み込むことを含
む。前記宿主細胞によって細胞の培養培地に分泌された
タンパク質は、前記カチオン交換物質に可逆的に結合す
る。そして、結合したタンパク質を有するカチオン交換
物質は、細胞の培養培地から分離される。最後に、タン
パク質は、カチオン交換物質から単離される。

本発明の実施において、目下のところ好ましいカチオ
ン交換物質はＳ−セファロースであり、そして、目下の
ところ好ましい単離手順は、カチオン交換物質を勾配的
あるいは段階的に増加させたイオン強度と連続的に接触
することを含む。

本発明の好ましい態様において、殺菌性／浸透性向上
タンパク質およびその生物学的に活性な断片、ならび
に、アミノ末端にBPIタンパク質もしくはその生物学的
に活性な断片、そして、カルボキシ末端に免疫グロブリ
ンＨ鎖領域の少なくとも一つの定常領域あるいはその対
立遺伝子変異体を含む融合タンパク質のようなBPI−関
連タンパク質、これらに限定する意図はないが、を含む
組み換えBPI生成物の生成のために、改善された方法は
適用される。所望のタンパク質は、宿主細胞の成長なら
びにタンパク生成物の分泌に適した培養培地にて成長お
よび維持される遺伝子的に形質転換した宿主細胞によっ
て分泌される。

本発明の他の態様においても、本発明の改善された方
法は、リポ多糖類結合タンパク質およびそのアミノ末端
断片の単離に適用される。

前述の簡単な要約は、本発明の好ましい態様を示して
いる。

本願発明の他の無数の態様および利点は、当業者であ
れば、以下の詳細な説明を考慮することで明らかになる
であろう。

図面の簡単な説明図1A、1B、1Cおよび1Dは、rBPI（１−199）タンパク
質を単離するための、本願発明の方法および従来のクロ
マトグラフィー法を用いた比較実験の結果を示してい
る。

図２は、Ｓ−セファロースからのrBPI（１−99）の段
階的溶出の結果を示している。

図３は、本発明に従って調製した生成物のウェスター
ンブロット分析の結果を示している。

図４は、本発明の方法に従って調製したrBPI−Ig融合
生成物を示すすウェスターンブロットの結果を示してい
る。

図５は、本発明の方法に従って調製したLBPの単離を
示すクーマシー染色したゲルの結果を示している。

発明の詳細な説明以下の詳細な説明は、動物細胞の培養培地からの、三
つの特定の内毒素を結合したタンパク質の組換え生成、
組換えBPIタンパク質（rBPIタンパク質）のアミノ末端
部分、組換えLBPタンパク質（rLBPタンパク質）のアミ
ノ末端部分、およびrBPI免疫グロブリン融合タンパク質
（rBPI−Ig融合体）に関する本発明の実施例を示すもの
である。本発明の実施例を、特定の内毒素結合タンパク
質に関して説明するが、そのタンパク質の一般構造なら
びに機能の類似性からして、当業者であれば、本発明の
方法を用いて、いかなる内毒素結合タンパク質を単離し
うるのは明らかである。かようなタンパク質には、これ
に限定されるものではないが、ポリミキシンＢ、高密度
リポ多糖類、Limulus抗−LPS因子、およびタキプレシン
が含まれる。より具体的には、実施例１は、細胞の培養
培地へのカチオン交換物質、Ｓ−セファロースの添加
が、rBPIタンパク質の収率を向上することを実証してい
る。実施例２は、カチオン交換物質の細胞培養物への添
加が、rBPIタンパク質の収率を向上せしめる結果を実証
する結果をさらに示している。実施例３は、rBPI免疫グ
ロブリン融合タンパク質の単離への本発明の方法の応用
を示し、また、実施例４は、LBPの単離におけるカチオ
ン交換物質の使用を実証している。

実施例１組換えBPI生成物の単離本発明の方法を、31残基のシグナル配列および、配列
番号:1および２に示した、最初の199個のアミノ酸をコ
ードするDNAの発現生成物であり、本明細書にて「rBPI
（１−199）」と称する組み換えBPIタンパク質を単離す
るために用いた。使用したDNA配列は、前出のGray,et a
l.,の文献で報告されたBPIをコードするDNA配列とは、r
BPI（１−199）発現生成物の第151位のバリンがGTGによ
って特定されているのに対し、Gray,et al.,の文献では
GTCによって特定されており、また、rBPI（１−199）
は、第185位にグルタミン酸（GAGによって特定された）
がコードされているのに対し、Gray,et al.,の文献では
リジン（AAGによって特定された）がコードされている
点で相違している。rBPI（１−199）タンパク質の組換
え生成が、「rBPI−23」と称するタンパク質として、Ga
zzano−Santoro,et al.,Infection and Immunity,60:47
54−4761（1992）にて報告されている。

本実施例で使用した宿主細胞は、内因性の31残基の分
泌シグナル配列によって先行したヒトBPIの最初の199個
のアミノ末端アミノ酸をコードするDNAを含むDNAベクタ
ーで形質転換したCHO−K1細胞であった。所望の発現生
成物、rBPI（１−199）は、宿主細胞による翻訳後分泌
処理の過程にて除去されるシグナル配列残基での最初の
199個のアミノ酸残基を含むヒトBPIタンパク質の生物学
的に活性な断片である。

５％胎児ウシ血清を補充したHamsのF12培地に形質変
換したCHO宿主細胞を含む二つのローラーボトルを調製
し、そして、集落が形成されるまで成長させた（約３日
間）。集落が形成されると、HamsのF12培地を除去し、5
00mlのHB−CHO血清を含まない培地（Irvine Scientific
社、イルビン、カリフォルニア州）と交換した。最初の
ローラーボトルにて、約8g（湿潤重量）の殺菌したＳ−
セファロース（ファーマシア、速流、＃17−0511−01、
アップサラ、スウェーデン）に、３日間、ローラーボト
ルの一つに添加した。そして、第一カラムを調製するた
めに、Ｓ−セファロースを単離した。成長培地とＳ−セ
ファロース樹脂を、ローラーボトルから除去し、プール
し、そして、容器の底にＳ−セファロースが定着するよ
うに、少なくとも15分間放置した。樹脂を含まない培地
を、傾けて除去し、そして、細胞を除去すると共にＳ−
セファロースが保持されるように、フリットディスクの
ような、装置に通して濾過した。培地の除去に続いて、
Ｓ−セファロースを、0.1M塩化ナトリウムを含み、pH4.
0にて、20mMの酢酸ナトリウム／酢酸を含んだ酢酸緩衝
液にて懸濁し、ゆっくりと攪拌し、そして、10分間放置
した。緩衝液を除去し、そして、略サイズの液体クロマ
トグラフィーカラム（１×10cm、Econocolumn、BioRad
社、リッチモンド、カリフォルニア州）に移した。

第二ローラーボトルは、Ｓ−セファロースを用いず
に、上述した条件下にて成長させた細胞を含んでいた。
この第二ローラーボトルからの培地を、ローラーボトル
から除去した。CHO細胞を遠心分離によって除去し、清
澄化した培地を、pH4.0にて、20mMの酢酸ナトリウム／
酢酸を含むように調整した。培地を、10〜15mS/cmの導
電率になるまで希釈し、そして、rBPI（１−199）タン
パク質の結合を最大ならしめるために、0.1M塩化ナトリ
ウムを含む、pH4.0の20mM酢酸ナトリウム／酢酸（酢酸
緩衝液）で平衡化した第二の従来のＳ−セファロースカ
ラムに適用した。

第一および第二のＳ−セファロースカラム双方を、溶
出物のA280吸光度が、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液
のみで洗浄した場合と同様の吸光度になるまで、0.1M塩
化ナトリウム−酢酸緩衝液で洗浄した。そして、各カラ
ムに結合したタンパク質バンドを、1.0M塩化ナトリウム
−酢酸緩衝液を用いて単一工程にて溶出した。

双方のカラムからの溶出物を、溶出物からの試料を、
PBSの存在下にて、４℃で、終夜にわたって、イムロン
−２平板マルチウェルプレート（Dynetech Labs）に結
合する、ELISA分析に適用した。そして、プレートをPBS
中の0.05％ Tween−20にて洗浄し、0.05％ Tween−20を
含むPBSによるウサギ抗rBPI（１−199）抗血清の1:1000
希釈液で、室温にて、１時間、インキュベートした。イ
ンキュベーション後、プレートをPBS中の0.05％ Tween
−20にて再度洗浄し、製造業者の指示に従ってTMB試薬
（Pierce社、ロックフォード、イリノイ州）を用いてEL
ISAを行い、EL309ミクロプレートリーダー（Biotek Ins
truments社、ウィノースキ、バーモント州）を用いて45
0nmにて測定を行った。

ELISAの結果は、細胞の培養培地から誘導したＳ−セ
ファロースカラムからの溶出物が、培地を添加したＳ−
セファロースカラムからの溶出物と比較して、３〜８倍
の大きな反応性を呈することを示した。

実施例２は、形質変換したCHO細胞と共にＳ−セファ
ロースを培養することで、形質変換した細胞によって産
生されるrBPI（１−199）タンパク質の収率が増大す
る、ことを実証する結果を提示するものである。

実施例２単離物あるいはrBPI（１−199）の定量分析細胞の培養培地にカチオン交換物質を添加した場合
に、実施例１のCHO細胞培養物から得たrBPI（１−199）
タンパク質の収率が大きくなることを定量的にさらに実
証するために、以下の溶出試料に関する、染色ゲルおよ
びウェスターン分析を行った。

実施例１に記載の1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液に
よる溶出物から得たタンパク質試料を、SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）によって分離し
た。rBPI（１−199）の試料を、まず0.5M以下の塩化ナ
トリウムを含むように調整し、そして、75％の最終濃度
になるように氷冷したアセトンを添加することで沈殿せ
しめた。得られたタンパク質沈殿物を、10,000rpm以上
にて、５〜10分間、遠心分離することでペレット化し
た。上清を除去し、そして、pH6.8で、8M尿素、２％SD
S、60mM Tris−HClを含むゲル試料緩衝液に沈殿物を懸
濁した。懸濁した試料ならびに適切なタンパク質分子量
標準（BioRad社、リッチモンド、カリフォルニア州、お
よびBRL社、ベセスダ、メリーランド州）を、95℃にま
で、３〜５分間加熱し、そして、均一割合あるいは勾配
割合のポリアクリルアミドゲル（BioRad社）に適用し、
ミニプロテインIIゲル電気泳動装置（BioRad社）を用い
て分離した。電気泳動に続いて、ゲルを直接的にクーマ
シー染色（0.05％クーマシー・ブリリアント・ブルー−
Ｒ、25％イソプロパノール、10％メタノール、10％酢
酸）あるいは電気転移に用いた。SDS−PAGEによって分
離されたタンパク質を、適切な前染色した標準タンパク
質（BioRad社）によって、ニトロセルロース（BA85、Sc
hleicher and Schuell、キーン、ニューハンプシャー
州）あるいはPVDF（イモビロン−Ｐ、Millipore社、ベ
ッドフォード、マサチューセッツ州）膜のいずれかに電
気転移した。転移を、10％CAPS（シクロヘキシルアミノ
−１−プロパン−スルホン酸）、10％メタノール、pH1
1.5にて、0.5アンペアーで、20分間行った。得られた染
みを、ウサギ抗ヒトBPI（ホロタンパク質）抗血清の1:1
000希釈液、および製造業者の指示に沿って、ウェスタ
ーンライト化学ルミネセンス検出システム（Tropix Syt
em社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて
処理した。0.25％にてゲラチン（BioRad社）を、Tropix
I−Blockの代わりに用い、電気転移後に膜は乾燥させ
なかった。処理した膜を、Cronex4フィルム（Dupont
社、ウィルミントン、デラウェア州）に曝した。

染色ゲルおよびウェスターン分析の結果を、図1A〜1D
に示し、図1Aおよび1Bそれぞれは、培養培地でインキュ
ベートしたＳ−セファロースビーズから形成したカラム
の、0.1M塩化ナトリウムおよび1.0M塩化ナトリウム溶出
物の流過物（FT）のクーマシー染色およびウェスターン
ブロット分析の結果を示している。図1Aおよび1C中の矢
印は、rBPI（１−199）タンパク生成物の分子量に対応
する領域を示している。rBPI（１−199）タンパクの収
率は、細胞成長中にカチオン交換樹脂、Ｓ−セファロー
スが、培養培地に添加した時に、少なくとも10倍以上に
なるものと推定される。

後続の実験には、３〜５ローラ−ボトルから得た20〜
40gのＳ−セファロースからのrBPI（１−199）の単離が
含まれる。結合した試料を、酢酸緩衝液中の塩化ナトリ
ウムの濃度を上げることで溶出した。図２に示したよう
に、クーマシーブルー染色によって視覚化されたrBPI
（１−199）生成物は、Ｓ−セファロースカラムから
の、0.8、0.9、1.0および1.5M塩化ナトリウム−酢酸緩
衝液溶出物中の23kDタンパク質として認められた。0.2
〜0.7M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液溶出物中には、rBPI
（１−199）タンパク質は、ほとんどあるいは全く認め
られなかった。ウェスターンブロットの結果（図３）
は、最も強い検出可能なrBPI（１−199）タンパク質シ
グナルが、Ｓ−セファロースカラムの0.8〜1.0M塩化ナ
トリウム−酢酸緩衝液溶出物にて得られたことを示して
いる。

Ｓ−セファロースカラムからの1.5M塩化ナトリウム溶
出物も、rBPI（１−199）（図２、右レーンを参照）と
して表示したタンパク質も含んでいた。Ｓ−セファロー
スカラムからの1.5M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液溶出物
は、ジチオトレイトールによる処理で約23kDaの単一バ
ンドに変化する。約40kDaおよび66kDaを超える分子量を
有するタンパク質を含んでいた（図２）。変化したタン
パク質は、抗BPI抗血清と交差反応し、正当に処理され
たrBPI（１−199）のＮ末端配列を有していた。約40kDa
および66kDaを超えるタンパク質は、ジスルフィド結合
したrBPI（１−199）の多量体であると思われる。

上記した結果は、細胞の培養培地へのカチオン交換物
質の添加が、rBPI（１−199）タンパク質の回復を改善
する。Ｓ−セファロースの至適濃度を決定するために、
Ｓ−セファロースの1.25〜10gの量を、500mlの培養培地
を含むローラーボトルに添加し、CHO細胞を形質変換
し、そして、上述したようにしてインキュベートした。
カチオン交換物質を含む培地を、上述したようにしてカ
ラムに注いだ。0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、次い
で0.7M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液でカラムを洗浄し、
そして、rBPI（１−199）試料を、1.0M塩化ナトリウム
−酢酸緩衝液で溶出した。rBPI（１−199）の収率を、C
4逆相HPLCでのクロマトグラフィーによって決定し、そ
して、2.5g、5.0gおよび10gのＳ−セファロースでは実
質的に一定であった。ローラーボトル当たり1.25gのＳ
−セファロースしか含んでいないローラーボトルでは、
収率は約50％減少していた。

実施例３では、本発明の方法を用いて取得したrBPI融
合タンパク質の向上した収率を実証する結果を示してい
る。

実施例３ rBPI−Ig融合タンパク質の単離本実施例で用いた宿主細胞は、免疫グロブリンＨ鎖の
少なくとも一つの定常領域に融合したBPIタンパク質の
最初の199個のアミノ酸をコードするDNAを含むDNAベク
ターで形質変換したCHO−DG44細胞である。かような「r
BPI融合体」の構築は、双方共に本明細書に参考として
採り入れた、係属中の共有に係る米国特許出願No.07/88
5,911、ならびに、係属中の共有に係る出願を終えたば
かりの一部継続出願No. （代理人整理番号27129/3
1429）にて言及されている。形質変換したCHO−DG44細
胞を、ローラーボトルにて成長させた。各ローラーボト
ルについて、T150フラスコ（ヌクレオシドを有さない50
mlのα−MEMと10％の透析した胎児ウシ血清）に形質転
換した細胞を接種し、集落を形成するまで細胞を（約３
〜４日間）成長させた、そして、細胞をトリプシン処理
し、500mlのHam's F12培地と10％の胎児ウシ血清を含む
900cm²のローラーボトルに移し、集落を形成するまで細
胞を約３日間成長させた。集落が一旦形成されれば、Ha
m's F12培地は除去され、500mlの血清を含まないHB−CH
O培地（Irvine Scientific社、イルビン、カリフォルニ
ア州）と交換した。

Dulbeccoの燐酸緩衝化生理食塩水（PBS）でまず洗浄
し、120℃で、20分間、オートクレープしたＳ−セファ
ロースビーズを、無菌的にローラーボトルに添加した。
そして、ビーズと成長培地を除去し、少なくとも15分間
静置した細胞を、37℃で、３日間インキュベートした。
樹脂を含まない培地の塊を除去し、細胞の除去とＳ−セ
ファロースの保持を許容する、フリットディスクのよう
な装置に通して濾過した。培地の除去に続いて、Ｓ−セ
ファロースを、pH4.0にて20mM酢酸ナトリウム／酢酸、
0.1M塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液に懸濁し、ゆっく
りと攪拌し、そして、10分間放置した。次に、緩衝液を
除去し、Ｓ−セファロースを、略サイズの液体クロマト
グラフィーカラムに移した。３〜５のローラーボトルか
ら回収したＳ−セファロースの20〜40gのプールした試
料のために、Econocolumn（2.5×10cm、BioRad社、リッ
チモンド、カリフォルニア州）を用いた。充填したＳ−
セファロースカラムを、溶出物のA280吸光度が、0.1M塩
化ナトリウム−酢酸緩衝液のみで洗浄した場合と同様に
なるまで、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、0.5M塩化
ナトリウム−酢酸緩衝液、1.0M塩化ナトリウム−酢酸緩
衝液、そして、1.5M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液で再度
洗浄した。

培養培地にＳ−セファロースビースを添加しないこと
を除き、上述のようにして、CHO−DG44細胞をさらに調
製した。その代わりに、二つの異なるタンパク質Ａカラ
ムを用いてrBPI融合発現物を精製する試みがなされた。
HB−CHO培地（上記参照）の第一試料を、残りの培地か
らCHO−DG44細胞を分離するために、0.45μｍフィルタ
ーに通して濾過した。試料をpH8.0に調整し、ProSepA
（生物処理用）カラムに適用した。第二調製物を、Avid
Gel（生物処理用）カラムに適用した。双方のカラムの
溶出を、pH5.5の25mMクエン酸緩衝液で行った。いずれ
のタンパク質Ａカラムからも、rBPI融合生成物は回復し
なかった。還元後のProSepAカラムからも視覚化できる
生成物は得られなかった（図４、レーン１）。しかしな
がら、ProSepAおよびAvidGelカラムを、pH3.0の100mMク
エン酸緩衝液で処理した場合、rBPI融合タンパク質は、
図４のレーン２および３にそれぞれ示したように検出さ
れた。図４のレーン４〜６は、Ｓ−セファロースカラム
からの、0.5M、1.0Mおよび1.5M溶出物を示している。Ｓ
−セファロースカラムからの溶出物の内、1.5M溶出物
は、約100kDの融合二量体に相当する物質を含んでい
た。

実施例４は、LBPをコードするDNAで形質変換した細胞
を、カチオン交換樹脂と共にインキュベートすれば、向
上したLBPの収率が得られることを実証する結果を示し
ている。

実施例４リポ多糖類結合タンパク質の単離 LBPの25kDアミノ末端のために取得したDNA配列を、配
列番号:3に示した。その配列は、二つの領域において、
Schumann et al.,Science,249:1429−1431（1990）（配
列番号:4）に報告された配列と相違する。これら相違点
は、129〜132位および149位のアミノ酸の相違に至って
いる（148位のアスパラギン残基が、前出のSchumannの
文献ではGATによって、配列番号:3ではGACによってコー
ドされている）。公開されたPCT出願93/06228も参照の
こと。

本実施例にて使用した宿主細胞は、発現生成物である
LBPの最初の197個のアミノ酸をコードするDNAを含むDNA
ベクターで形質変換されたCHO−DG44細胞である。

形質変換したDG44細胞を、ローラーボトルにて成長さ
せた。各ローラーボトルについて、T150フラスコ（ヌク
レオシドを有さない50mlのα−MEMと10％の透析した胎
児ウシ血清）に形質転換した細胞を接種し、集落を形成
するまで細胞を（約３〜４日間）成長させた。そして、
細胞をトリプシン処理し、500mlのHam's F12培地と10％
の胎児ウシ血清を含む900cm²のローラーボトルに移し、
集落を形成するまで細胞を約３日間成長させた。集落が
一旦形成されれば、Ham's F12培地は除去され、500mlの
血清を含まないHB−CHO培地（Irvine Scientific社、イ
ルビン、カリフォルニア州）と交換した。

PBSでまず洗浄し、120℃で、20分間、オートクレープ
したＳ−セファロースビーズを、無菌的にローラーボト
ルに添加した。そして、ビーズと成長培地を除去し、少
なくとも15分間静置した細胞を、37℃で、３日間インキ
ュベートした。樹脂を含まない培地の塊を除去し、細胞
の除去とＳ−セファロースの保持を許容する、フリット
ディスクのような装置に通して濾過した。培地の除去に
続いて、Ｓ−セファロースを、pH4.0にて20mM酢酸ナト
リウム／酢酸、0.1M塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液に
懸濁し、ゆっくりと攪拌し、そして、10分間放置した。
次に、緩衝液を除去し、Ｓ−セファロースを、略サイズ
の液体クロマトグラフィーカラムに移した。３〜５のロ
ーラーボトルから回収したＳ−セファロースの20〜40g
のプールした試料のために、Econocolumn（2.5×10cm、
BioRad社、リッチモンド、カリフォルニア州）を用い
た。充填したＳ−セファロースカラムを、溶出物のA280
吸光度が、0.1M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液のみで洗浄
した場合と同様になるまで、0.1M塩化ナトリウム−酢酸
緩衝液、0.7M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液、そして、1.
0M塩化ナトリウム−酢酸緩衝液で再度洗浄した。

Ｓ−セファロースビーズが添加された細胞培養物から
のrLBPの収率を、上述した0.7M溶出物（レーン１および
３）および1.0M溶出物（レーン２および４）のクーマシ
ー染色したゲルに関する図５に示した。図に示したよう
に、著量のLBPが1.0Mにて溶出した。Ｓ−セファロース
が、細胞培養物からのLBP生成を促進できることは、算
出されたそのpI値（6.6）からは予想できないものであ
る。pHが約7.0である、先に使用した培養培地にて、LBP
が、そのpI値からして、非荷電あるいはわずかに陰荷電
を帯びると考えられ、よって、Ｓ−セファロースのよう
なカチオン交換樹脂とは反応しないものと思われる。

本発明の実用における様々な修正と変更が、好ましい
態様について述べた先の説明を考慮すれば、当業者であ
れば容易に想到できるものと思われる。例えば、本発明
に用いたカチオン交換物質を、使用する細胞のタイプと
数（すなわち、組換生成物の生産効率）に従って変更す
ることができる。他の例では、Ｓ−セファロース以外の
カチオン交換物質〔例えば、Biorex70、およびSP−セフ
ァデックスのようなSP（スルホプロピル）型物質ならび
にCM−セファデックスおよびCM−セファロースのような
CM（カルボキシメチル）型物質〕が、本発明の方法に使
用できるが、Ｓ−セファロースが、取扱易さ、殺菌工程
等への適用において最も好ましい。さらに他の例とし
て、上記実施例では、ローラーボトルでの内毒素結合タ
ンパク質の組換生成物について述べたが、本発明の方法
は、発酵槽での生成規模にまで容易に「大規模」化でき
る。rBPI（１−199）の生成のための方法における典型
的な発酵条件は、0.05％FBSおよび0.01％Anti−foam（U
Carfermアジュバント27、ユニオンカーバイド社）、お
よび１％SP−セファロース「大粒ビーズ」（100〜300ミ
クロンの直径、ファーマシア社）が添加されたExCell 3
01培地（JRHScientific社）にて成長したプラスミドpIN
G4502〔前出のGazzano et al.,の文献を参照〕で形質変
換したCHO−K1細胞が投入された、600の稼働体積を有
する750のChemap（ウッドベリー、ニューヨーク州）
発酵槽の使用を含む。最後に、本発明に従って単離した
組換内毒素結合したタンパク質の正確な溶出は、包含さ
れるタンパク質の厳密な同一性によって変化するものと
思われる。その一例として、rBPI（１−199）は、0.7M
塩化ナトリウム−酢酸緩衝液での洗浄により、容易に樹
脂ビーズから単離することができる。しかしながら、Th
eofan et al.,による係属中の、共有に係る、米国特許
出願No.08/013,801に記載されたような、BPIのシステイ
ン置換類似体の収率は、0.6M塩化ナトリウム−酢酸緩衝
液での洗浄による単離により向上する。従って、本発明
の範疇に課すべき限定は、添付の請求の範囲に記した限
定にとどめるべきである。

配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：（Ａ）名称：ゾーマコーポレイション（Ｂ）番地:2910 セブンスストリート（Ｃ）都市名：バークレイ（Ｄ）州名：カリフォルニア（Ｅ）国名：米国（Ｆ）郵便番号:94710 （ii）発明の名称：内毒素結合タンパク質の調製のた
めの方法（iii）配列の数:4 （iv）連絡先住所：（Ａ）名宛人：マーシャル、オトゥール、ジェース
ティン、マレーアンドボーラン（Ｂ）番地:233 サウスワッカードライブ、63
00 シアーズタワー（Ｃ）都市名：シカゴ（Ｄ）州名：イリノイ（Ｅ）国名：米国（Ｆ）郵便番号:60606−6402 （ｖ）コンピューター読取形式：（Ａ）媒体：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター:IBM PC 互換機（Ｃ）操作システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース
＃1.0、バージョン＃1.25 （vi）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）先行出願データ：（Ａ）出願番号:US 07/885,501 （Ｂ）出願日:19−５月−1992 （viii）弁護士／弁理士情報：（Ａ）氏名：メイアーズ、トーマスシー（Ｂ）登録番号:36,989 （Ｃ）参照／事件番号:31405 （ix）通信情報：（Ａ）電話：（312）474−6300 （Ｂ）ファックス：（312）474−0448 （Ｃ）テレックス:25−3856 （２）配列番号:1の情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）配列の長さ:1813塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:31..1491 （ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号:mat peptide （Ｂ）存在位置:124..1491 （xi）配列：配列番号:1 （２）配列番号:2の情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）配列の長さ:487アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号:2 （２）配列番号:3の情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）配列の長さ:591塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA （ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号:CDS （Ｂ）存在位置:1..591 （xi）配列：配列番号:3 （２）配列番号:4の情報（ｉ）配列特徴：（Ａ）配列の長さ:197アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号:4

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子的に形質転換された宿主細胞が細胞
の成長と維持において適切な培地で培養され、そして、
所望のタンパク質が該培地に分泌される、内毒素結合タ
ンパク質の生成のための方法であって、ここで、該内毒
素結合タンパク質は、細菌性リポ多糖類に結合し得る陽
荷電した領域を有し、該方法は、以下の工程：カチオン交換物質に該内毒素結合タンパク質が可逆的に
結合することを許容する条件下にて、該培養培地に該カ
チオン交換物質を組み込む工程；内毒素結合タンパク質が結合した該カチオン交換物質を
該培地から分離する工程；および該カチオン交換物質から、該内毒素結合タンパク質を単
離する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記カチオン交換物質は、Ｓ−セファロー
スである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記内毒素結合タンパク質は、細菌性リポ
多糖類の脂質Ａ領域に結合する、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記内毒素結合タンパク質は、殺菌性／浸
透性促進タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記内毒素結合タンパク質は、殺菌性／浸
透性促進タンパク質のアミノ末端断片であり、該アミノ
末端断片はリポ多糖類に結合できる、請求項１に記載の
方法。
【請求項６】前記内毒素結合タンパク質は、殺菌性／浸
透性促進タンパク質と免疫グロブリンＨ鎖の定常領域を
含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記内毒素結合タンパク質は、リポ多糖類
結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記内毒素結合タンパク質は、リポ多糖類
結合タンパク質のアミノ末端断片であり、該アミノ末端
断片はリポ多糖類に結合できる、請求項１に記載の方
法。
【請求項９】前記単離工程は、前記カチオン交換物質を
イオン強度を段階的あるいは勾配的に増大させた培地と
連続的に接触させる工程を含む、請求項１に記載の方
法。