CN117106808A - 一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用 - Google Patents
一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117106808A CN117106808A CN202310921993.5A CN202310921993A CN117106808A CN 117106808 A CN117106808 A CN 117106808A CN 202310921993 A CN202310921993 A CN 202310921993A CN 117106808 A CN117106808 A CN 117106808A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- recombinant human
- human collagen
- recombinant
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 94
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 94
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102000006010 Protein Disulfide-Isomerase Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 108020003519 protein disulfide isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 17
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000007433 bsm medium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 16
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 5
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 abstract description 4
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 abstract description 3
- 101150070377 PDI gene Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 6
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 3
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 3
- 101150051118 PTM1 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- -1 and meanwhile Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 101710145505 Fiber protein Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589540 Pseudomonas fluorescens Species 0.000 description 1
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002792 antioxidant assay Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000000723 mammalian artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
- C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
- C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用。具体的，本发明通过将重组人源胶原蛋白胞外分泌表达载体与经密码子偏好性优化的蛋白质二硫键异构酶PDI基因胞内表达载体构建到毕赤酵母上，得到共表达伴侣蛋白PDIopt和重组人源胶原蛋白的重组菌株，该菌株较优化前发酵上清液目标蛋白的浓度提高了3.5倍，高密度诱导发酵72h重组人源胶原蛋白产量达到15.3g/L。发酵上清液经中空纤维及卷式膜过滤，结合一步离子层析，即可得到纯度大于95％、收率大于70％的重组人源胶原蛋白。本发明与现有技术相比产量更高，纯化方法更简单，更适合产业化生产，因此应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程和基因工程技术领域，具体涉及一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白，占体内蛋白质含量的25％～35％，其广泛分布于人体各个组织器官，如皮肤、骨骼、角膜、血管等，尤其在皮肤等组织中，含有大量的胶原蛋白，胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能具有重要作用。重组人源胶原蛋白以其低毒性、低抗原性、低免疫性、能引导细胞再生和生物相容性较好等优点，而广泛应用于生物医药、化妆品、食品等行业中。
在现有技术中，生产胶原蛋白最主要的方法是利用酸、碱法处理动物来源的组织，为提高胶原蛋白的生物安全性、纯度及活性，拓宽其在化妆品和医疗器械等领域的应用。基因工程技术被广泛应用。国内外一些研究机构及生物公司相继投入研究开发重组人源胶原蛋白，其中毕赤酵母表达系统被广泛应用，但在生产过程中，重组人源胶原蛋白的产量及纯化方法成为主要难点。
增加毕赤酵母中外源基因的拷贝数通常可以获得更高的蛋白表达水平，但基因的过表达往往会引起细胞在合成和分泌途径的负担，导致细胞内可用分子伴侣的不足，进而造成未正确折叠蛋白的不断聚集。蛋白质二硫键异构酶(PDI)可以发挥分子伴侣的特性帮助蛋白质正确折叠，也可以帮助蛋白质形成二硫键，从而缓解重组菌内部压力，提高蛋白表达量。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用。本发明得到一株共表达伴侣蛋白PDIopt和重组人源胶原蛋白的重组菌株，并对其发酵生产的重组人源胶原蛋白进行进一步纯化。经试验证明，本发明获得的重组胶原蛋白与现有技术相比产量更高，纯化方法更简单，且工业化大规模生产成本更低。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种编码蛋白质二硫键异构酶的核酸分子，所述核酸分子具有(a1)-(a4)中任一所述核苷酸序列：
(a1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(a2)如(a1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上的同一性，且编码所述蛋白质二硫键异构酶的核酸分子；
(a4)在严格条件下能够与如(a1)-(a3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同或相近功能蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列。
本发明的第二个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第一方面所述的核酸分子。
本发明的第三个方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的重组表达载体或染色体整合有本发明第一方面所述的核酸分子；
进一步的，所述宿主细胞还包含编码重组人源胶原蛋白的核酸分子或者含有包含重组人源胶原蛋白的第二重组表达载体或者能够表达重组人源胶原蛋白。
其中，所述重组人源胶原蛋白选自：
(b1)SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将(b1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(b3)与(b1)或(b2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到90％或90％以上并且具有与(b1)或(b2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白。
所述编码重组人源胶原蛋白的核酸分子具有(c1)-(c4)中任一所述核苷酸序列：
(c1)如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(c2)如(c1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；
(c3)与(c1)或(c2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上的同一性，且编码所述蛋白质二硫键异构酶的核酸分子；
(c4)在严格条件下能够与如(c1)-(c3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同或相近功能蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列。
具体的，本发明获得一株毕赤酵母GS115/colopt-PDIopt，已于2023年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20231325。
本发明的第四个方面，提供一种生产重组人源胶原蛋白的高密度发酵方法，所述方法包括：发酵培养本发明第三个方面所述的宿主细胞，从而表达出所述重组人源胶原蛋白；和分离纯化所述重组人源胶原蛋白。
本发明的第五个方面，提供一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括：采用中空纤维及卷式膜过滤，并结合一步离子层析对所述重组人源胶原蛋白进行纯化。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案中重组人源胶原蛋白胞外分泌表达载体与经毕赤酵母密码子偏好性优化的蛋白质二硫键异构酶PDI基因胞内表达载体构建到毕赤酵母的不同染色体上，得到共表达伴侣蛋白PDIopt和重组人源胶原蛋白的重组菌株，该菌株较优化前发酵上清液目标蛋白的浓度提高了3.5倍，高密度诱导发酵72h重组人源胶原蛋白产量达到15.3g/L。发酵上清液经中空纤维及卷式膜过滤，结合一步离子层析，即可得到纯度大于95％、收率大于70％的重组人源胶原蛋白。上述技术方案得到的重组人源化胶原蛋白与现有技术相比产量更高，纯化方法更简单，更适合产业化生产且生产成本低。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明优化的蛋白质二硫键异构酶PDI基因与野生型基因的核苷酸序列比对图。
图2为本发明共表达菌株GS115/colopt-PDIopt及高拷贝菌株GS115/pPIC9K-colopt和组合菌株GS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt摇瓶发酵上清液SDS-PAGE蛋白电泳结果图；其中，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1代表空白对照菌GS115/pPIC9K发酵上清液；泳道2代表高拷贝菌株GS115/pPIC9K-colopt发酵上清液；泳道3代表组合菌株GS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt发酵上清液；泳道4代表共表达菌株GS115/colopt-PDIopt发酵上清液。
图3为本发明实施例5中共表达菌株GS115/colopt-PDIopt进行5-L发酵罐高密度培养诱导阶段每隔12h取样的SDS-PAGE蛋白电泳结果图；其中，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1代表甲醇诱导12h；泳道2代表甲醇诱导24h；泳道3代表甲醇诱导36h；泳道4代表甲醇诱导48h；泳道5代表甲醇诱导60h；泳道6代表甲醇诱导72h；泳道7代表BSA标准蛋白。
图4为本发明实施例7中样品DPPH自由基清除率的数据图。其中，对比例1代表空白对照组；对比例2代表以专利申请号202310882902.1中的重组胶原蛋白做的对比实验组；col代表使用本发明方法生产的重组人源胶原蛋白实验组。
图5为本发明实施例8中重组人源化Ⅲ型胶原蛋白的促细胞迁移活性结果图；其中，对比例1代表空白对照组；对比例2代表以专利申请号202310882902.1中的重组胶原蛋白做的对比实验组；样品col代表使用本发明方法生产的重组人源胶原蛋白实验组。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种编码蛋白质二硫键异构酶的核酸分子，所述核酸分子具有(a1)-(a4)中任一所述核苷酸序列：
(a1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(a2)如(a1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上的同一性，且编码所述蛋白质二硫键异构酶的核酸分子；
(a4)在严格条件下能够与如(a1)-(a3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同或相近功能蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第一方面所述的核酸分子。
根据本发明，所述重组表达载体通过上述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体。本发明的又一具体实施方式中，所述表达载体为质粒，更具体的，所述表达载体为pPIC9K或pPICZA质粒。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组表达载体或染色体整合有上述核酸分子；
本发明的又一具体实施方式中，所述宿主细胞还包含编码重组人源胶原蛋白的核酸分子或者含有包含重组人源胶原蛋白的第二重组表达载体或者能够表达重组人源胶原蛋白。
所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。
本发明的又一具体实施方式中，所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞；
其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任一种；
本发明的又一具体实施方式中，所述细菌细胞为大肠杆菌(如大肠杆菌BL21)、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。
所述真菌细胞包括酵母菌。
进一步的，所述酵母菌为巴斯德毕赤酵母(如毕赤酵母GS115、KM71或SMD1168)。
其中，所述重组人源胶原蛋白选自：
(b1)SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将(b1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(b3)与(b1)或(b2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到90％或90％以上并且具有与(b1)或(b2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白。
所述编码重组人源胶原蛋白的核酸分子具有(c1)-(c4)中任一所述核苷酸序列：
(c1)如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(c2)如(c1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；
(c3)与(c1)或(c2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上的同一性，且编码所述蛋白质二硫键异构酶的核酸分子；
(c4)在严格条件下能够与如(c1)-(c3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同或相近功能蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列。
需要说明的是，术语“同一性”指与核苷酸/氨基酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述90％以上同一性，可以为91％、93％、95％、97％或99％以上的同一性。
具体的，本发明获得一株毕赤酵母GS115/colopt-PDIopt，已于2023年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20231325。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种生产重组人源胶原蛋白的高密度发酵方法，所述方法包括：发酵培养本发明第三个方面所述的宿主细胞，从而表达出所述重组人源胶原蛋白；和分离纯化所述重组人源胶原蛋白。
所述发酵培养过程中，所选用的培养基可以为BSM培养基，同时可以以甲醇作为碳源来进行发酵生产。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，所述纯化方法包括：采用中空纤维及卷式膜过滤，并结合一步离子层析对所述重组人源胶原蛋白进行纯化。
即可获得上述纯化方法后，可得到纯度大于95％、收率大于70％的重组人源胶原蛋白。
其中，所述重组人源胶原蛋白选自：
(b1)SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将(b1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(b3)与(b1)或(b2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到90％或90％以上并且具有与(b1)或(b2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白。
需要说明的是，采用上述方法分离纯化获得的重组胶原蛋白，具有良好的抗氧化性和促细胞迁移活性，表明其具有良好的生物学活性，因此同样可广泛应用于食品、药品及化妆品等诸多领域。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。本发明实施例中构建的毕赤酵母GS115/colopt-PDIopt，已于2023年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20231325。
实施例1伴侣蛋白PDI表达载体的构建
本发明是在专利申请号202310882902.1的基础上展开的，重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-colopt蛋白表达量较低，是因为其在高浓度抗生素的筛选下获得的，其内部目的基因拷贝数过高，会导致重组菌中外源基因不正确折叠从而被降解掉，导致目的蛋白产量低。因此，发明人经研究发现，将蛋白质二硫键异构酶与目的蛋白共表达可帮助目的蛋白的正确折叠，提高蛋白表达量。
基于NCBI数据库公开的蛋白质二硫键异构酶全长基因序列(Genbank：EU805807.1)，根据毕赤酵母密码子偏好性对其进行了密码子优化，图1所示，优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示，与野生型基因序列同源性为76.32％。优化后的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，与野生型基因编码的氨基酸序列一致。密码子优化的蛋白质二硫键异构酶PDI序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPICZA上，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框不移码的前提下获得重组表达载体pPICZA-PDIopt，经DNA测序比对，伴侣蛋白PDI表达载体pPICZA-PDIopt构建成功。
实施例2构建重组人源胶原蛋白基因高拷贝的重组毕赤酵母表达系统
如专利申请号202310882902.1所示，利用NCBI网站获取天然人III型胶原蛋白α1链蛋白氨基酸序列(序列号NP_000081)，依据天然胶原蛋白为不溶性纤维蛋白且氨基酸序列高度重复的特点，拼接成为一段447个氨基酸的全新胶原蛋白序列，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示，该序列与人Ⅲ型胶原蛋白序列100％同源；根据毕赤酵母密码子偏好性对人源化Ⅲ型胶原蛋白进行序列优化，优化后的人源化Ⅲ型胶原蛋白核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，包括EcoR I酶切位点、Not I酶切位点、起始密码子、终止密码子及6×His标签序列，克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组表达载体pPIC9K-colopt。经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pPIC9K-colopt经SalI快切酶线性化后电转入P.pastoris GS115表达宿主细胞中，重组转化子经含4g/L遗传霉素G418的YPD平板培养基筛选获得高拷贝重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-colopt。
实施例3伴侣蛋白PDI与重组人源胶原蛋白共表达的工程酵母菌株的构建
将伴侣蛋白PDI表达载体pPICZA-PDIopt用SacI快切酶线性化，后电转入重组人源胶原蛋白基因高拷贝的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-colopt中，重组转化子经含100μg/mL博来霉素Zeocin的YPD平板培养基筛选获得共表达毕赤酵母菌株P.pastorisGS115/colopt-PDIopt。
实施例4重组人源胶原蛋白工程酵母菌株摇瓶发酵
对本发明获得的共表达毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/colopt-PDIopt及专利专利申请号202310882902.1中的高拷贝菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-colopt和组合菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-colopt/pGAPZαA-colopt进行摇瓶发酵培养。
发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40mL的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24h。按10％的接种量转接于40mL的初始表达培养基BMGY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甘油10g/L)中，30℃，200rpm培养24h。离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后更换至40mL诱导表达培养基BMMY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO4 11.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10-4g/L，甲醇10mL/L)，30℃、200rpm培养，每隔24h向培养基中添加纯甲醇至终浓度为1.0％(v/v)，诱导表达96h。
重组工程菌发酵上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，理论蛋白分子量为51kDa，结果如图2所示，共表达毕赤酵母菌株发酵上清液(泳道4)与组合菌株(泳道3)相比，蛋白含量更高。经BioAnaly生物分析软件得，共表达菌株的蛋白表达量相比组合菌株提高了1.5倍，相比无伴侣蛋白的高拷贝菌株提高了3.5倍。
实施例5共表达菌株5-L发酵罐高密度培养
将共表达毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/colopt-PDIopt进行5-L发酵罐高密度培养。接YPD平板上的单菌落至50mL YPD液体培养基中，30℃、220rpm培养24h，将培养液按10％接种至200mL BMGY培养基中，30℃、220rpm培养24h；将培养24h的200mL种子液接入到含有2L BSM发酵培养基(甘油40g/L，K2SO4 18g/L，KOH 4.13g/L，85％H3PO4 26.7mL/L，CaSO4·2H2O0.93g/L，MgSO4·7H2O 14.9g/L，4.4mL/L过滤除菌的PTM1；PTM1配方：CuSO4·5H2O 6g/L，KI 0.09g/L，MnSO4·H2O 3g/L，H3BO3 0.02g/L，MoNa2O4·2H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.92g/L，ZnCl2 20g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，生物素0.2g/L，H2SO4 5.0mL)的5-L发酵罐中。初始发酵参数设置为温度30℃，pH 5.5，通气量2.0vvm和转速500rpm；发酵过程中通过自动添加氨水将pH控制在5.5；待BSM培养基中的甘油被耗尽后，进入分批补料阶段，以指数流加的方式补加50％(v/v)甘油(含12mL/L PTM1)，同时设置转速与溶氧DO偶联，补料速率为前6h分别为13.5、16.2、19.2、22.8、27.2和32.4mL/h/L，随后6h的补料速率设置为30mL/h/L；补料结束后进入饥饿培养阶段，饥饿培养2-3h，至残余甘油耗尽；进入甲醇诱导阶段，流加含12mL/L PTM1的纯甲醇并且终浓度维持在1.8％(v/v)，同时将发酵温度调整至25℃，转速提高至1000rpm，甲醇流加速率和培养基中的甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。进入甲醇诱导阶段后每隔12h取样，8000rpm离心，发酵上清液进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测结果如图3所示，随着诱导时间的延长，发酵上清液中重组人源胶原蛋白产量逐渐增加，经BioAnaly生物分析软件分析，判定标准蛋白及重组人源胶原蛋白的灰度值，计算得甲醇诱导72h时重组人源胶原蛋白产量为15.3g/L。
实施例6重组人源胶原蛋白的纯化制备
共表达毕赤酵母菌株P.pastoris GS115/colopt-PDIopt 5-L罐发高密度发酵，甲醇诱导培养72h后的发酵液经8000rpm离心得到发酵上清液，发酵上清液经下列纯化步骤得到重组人源胶原蛋白纯品。
①中空纤维膜：上述发酵上清液经500kDa中空纤维膜过滤，除菌及去除大分子杂质；
②卷式膜：用1kDa的卷式膜进行过滤，除去小分子杂质，收集浓缩液，并对料液进行缓冲液置换，置换成离子A液(20mM Tris，pH 7.4)；
③离子交换层析：使用阳离子交换柱进行离子层析，去除带负电的杂质，用20％离子B液(20mM Tris、500mM NaCl，pH 7.4)洗脱，收集洗脱峰；
④卷式膜：用1kDa的卷式膜进行过滤，脱盐，得到纯化原液。
经过上述步骤纯化的蛋白纯度大于95％，收率大于70％。
实施例7重组人源胶原蛋白的抗氧化实验
取适量纯化的重组人源Ⅲ型胶原蛋白置于试管中，加入2.5mL溶于95％乙醇的DPPH自由基溶液(0.1mmoL/L)，将混合物激烈振荡10s，然后置于室温下反应30min，反应结束后，于517nm下测量反应混合物吸光度，以蒸馏水代替样品液做空白对照(对比例1)，以专利申请号202310882902.1中的重组胶原蛋白做对比实验(对比例2，即本发明实施例2中酵母工程菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-colopt产生的重组胶原蛋白)。样品液对DPPH自由基清除活性＝(空白对照吸光度-样品吸光度)/空白对照吸光度。
结果如图4所示，本发明col与空白对照相比具有明显的DPPH自由基清除能力且其自由基清除率与专利申请号202310882902.1中的重组胶原蛋白自由基清除率相当，故本发明提供的提高重组人源胶原蛋白产量的方法不会影响重组胶原蛋白的抗氧化效果。
实施例8重组人源胶原蛋白的促细胞迁移活性实验
细胞迁移活性是有效表征胶原蛋白生物学活性的指标，迁移率越高，速度越快，说明胶原蛋白的生物学活性越佳。
试验前使用马克笔在6孔板底部画一条横线，做好标记。收集生长状态良好的HaCaT人永生化角质形成细胞并用细胞培养基制备细胞悬液，调整细胞浓度为1x106个/孔，于6孔细胞培养板中加入2mL/孔细胞悬液。实验设置空白对照组、样品col组、市售重组胶原蛋白组，每组设3个平行。置于细胞培养箱(5％ CO2，37℃)中孵育24h，细胞融合率达到100％。在显微镜下检查每个板孔，确保各板孔细胞增长相对相等，吸出原培养基，分别加入1mL PBS洗去未贴壁的细胞。用一根200μL枪头竖着划过细胞形成一条笔直的划痕，划痕与标记相交。吸出PBS，再使用PBS清洗1次，至显微镜下视野清晰。吸出PBS，对比例1为空白对照组只加2mL细胞培养液，对比例2为加入含有1mg/mL专利申请号202310882902.1中重组胶原蛋白的2mL细胞培养液，样品组加入含有1mg/mL样品col的2mL细胞培养液。置于细胞培养箱(5％CO2，37℃)中培养24h后，弃掉培养液，1mL PBS洗一次，至显微镜下视野清晰。加入1mL PBS，显微镜拍照。细胞迁移率(％)＝(A给药前-A给药)/A给药前×100，其中A给药后为实验结束时细胞划痕的面积；A给药前为划痕初始面积。
表1重组胶原蛋白细胞迁移率数据统计表
结果如图5所示，24h拍摄的细胞迁移实际对比图及表1所示的计算出的细胞相对迁移率比较可知，样品col组的细胞迁移率明显高于对照组，并且样品col的细胞迁移率与专利申请号202310882902.1中的重组胶原蛋白细胞迁移率相当，故本发明提供的提高重组人源胶原蛋白产量的方法不会影响重组胶原蛋白的生物活性。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种编码蛋白质二硫键异构酶的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有(a1)-(a4)中任一所述核苷酸序列：
(a1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(a2)如(a1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上的同一性，且编码所述蛋白质二硫键异构酶的核酸分子；
(a4)在严格条件下能够与如(a1)-(a3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同或相近功能蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1所述的核酸分子。
3.如权利要求2所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过所述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒；进一步的，所述表达载体为pPIC9K或pPICZA质粒。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的重组表达载体或染色体整合有权利要求1所述的核酸分子；
所述宿主细胞还包含编码重组人源胶原蛋白的核酸分子或者含有包含重组人源胶原蛋白的第二重组表达载体或者能够表达重组人源胶原蛋白。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述重组人源胶原蛋白选自：
(b1)SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将(b1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(b3)与(b1)或(b2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到90％或90％以上并且具有与(b1)或(b2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白；
所述编码重组人源胶原蛋白的核酸分子具有(c1)-(c4)中任一所述核苷酸序列：
(c1)如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(c2)如(c1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；
(c3)与(c1)或(c2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上的同一性，且编码所述蛋白质二硫键异构酶的核酸分子；
(c4)在严格条件下能够与如(c1)-(c3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同或相近功能蛋白质二硫键异构酶的核苷酸序列。
7.如权利要求5-6任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115/colopt-PDIopt，其已于2023年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231325。
8.一种生产重组人源胶原蛋白的高密度发酵方法，其特征在于，所述方法包括：发酵培养权利要求5-7任一项所述宿主细胞，从而表达出重组人源胶原蛋白；和分离纯化所述重组人源胶原蛋白。
9.如权利要求8所述的高密度发酵方法，其特征在于，所述发酵培养过程中，所选用的培养基为BSM培养基，同时以甲醇作为碳源来进行发酵生产。
10.一种重组人源胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括：采用中空纤维及卷式膜过滤，并结合一步离子层析对重组人源胶原蛋白进行纯化；
其中，所述重组人源胶原蛋白选自：
(b1)SEQ ID NO.3所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b2)将(b1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
(b3)与(b1)或(b2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到90％或90％以上并且具有与(b1)或(b2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310921993.5A CN117106808A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310921993.5A CN117106808A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117106808A true CN117106808A (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=88797452
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310921993.5A Pending CN117106808A (zh) | 2023-07-25 | 2023-07-25 | 一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117106808A (zh) |
-
2023
- 2023-07-25 CN CN202310921993.5A patent/CN117106808A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5294699A (en) | Inhibition of coloration of human serum albumin | |
| EP0642579B1 (en) | Improved methods for the preparation of endotoxin-binding proteins | |
| CN114805551B (zh) | 一种重组iii型胶原蛋白及其制备方法 | |
| US5945304A (en) | Expression plasmids regulated by an osmB promoter | |
| CN116640206B (zh) | 一种重组人源化ⅲ型胶原蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN101845454B (zh) | 在重组毕赤酵母中表达假黑盘菌素成熟多肽的方法 | |
| CN115975004A (zh) | 一种重组人纤连蛋白、其制备方法和应用 | |
| CN102703457A (zh) | 一种抗菌肽基因的制备及表达方法 | |
| CN110468143B (zh) | 抗菌肽nzx的制备方法及应用 | |
| CN117106808A (zh) | 一株高产人源重组胶原蛋白的工程酵母菌株及其应用 | |
| CA2091636C (en) | Method for suppressing coloring of human serum albumin | |
| CN114540363B (zh) | 一种类人胶原蛋白重组毕赤酵母工程菌的构建和蛋白快速纯化方法 | |
| CN116574172A (zh) | 重组人源化i型胶原蛋白及其制备方法 | |
| CN103641913A (zh) | 一种汉逊酵母hcp抗体制备方法，制得抗体及其应用 | |
| US20220267823A1 (en) | Genetically Engineered Strain for Producing Porcine Myoglobin and Food-grade Fermentation and Purification Thereof | |
| US10563210B2 (en) | Method for producing interleukin-2 protein using methylotrophic yeast | |
| CN102212547A (zh) | 肠三叶因子重组表达载体及肠三叶因子制备方法 | |
| CN115992117B (zh) | 一种重组人溶菌酶及其制备方法和应用 | |
| AU2013266516A1 (en) | Trichoderma hydrophobin production | |
| CN117886923A (zh) | 一种重组人源化胶原蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN102757977B (zh) | 颗粒溶解素的表达和制备方法 | |
| CN108359686A (zh) | 融合标签NusA在大肠杆菌表达PLCG2蛋白中的应用 | |
| CN114409759B (zh) | 一种具有抑菌功能的rp23蛋白 | |
| CN102533841A (zh) | 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法 | |
| CN107129978A (zh) | 耐热赖氨酸氨肽酶的发酵方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |