JP2656098B2 - 可溶性両親媒性タンパク質ならびにその製造および精製法 - Google Patents

可溶性両親媒性タンパク質ならびにその製造および精製法

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Description

【発明の詳細な説明】 集合体の形にある両親媒性細胞タンパク質およびこれ
らタンパク質の製造、精製法 発明の分野 本発明は細胞内でつくられる両親媒性可溶性タンパク
質ならびにこれらタンパク質の単離および精製法に関す
る。
発明の背景 生理活性のあるすべての細胞は、細胞の生活機能を維
持するために必要なタンパク質をつくり出している。合
成されたこれらタンパク質は種々な機能をもち、あるも
のは酵素として作用し（即ち、これらは細胞内の代謝反
応を触媒する）、他のものはその細胞が属している生体
の生命過程の役割を果し、また他のものは細胞構造を形
づくることがある。しかし、これら細胞内でつくられる
タンパク質は他の生体に対して抗原効果も具えている、
即ちそれら生体に免疫反応を誘発することができる。ウ
イルスもまた、例えばその外被に抗原として作用しうる
タンパク質を含む。
タンパク質合成の指令は細胞の遺伝子に見出され、こ
れは遺伝学的物質の機能単位とみられている。現在、例
えば動物またはヒトの細胞から遺伝子を他の細胞、しば
しば細菌の細胞へと移すことによつて、細胞、例えば細
菌の遺伝子構成を変える技術が進歩して来ている。この
ようにして、その細菌は導入された外来遺伝子によりコ
ード化されたタンパク質を合成するであろう。この技術
の最もよく知られた例の一つはインシユリン合成であ
る。インシユリンはヒトの膵臓でつくられるタンパク質
であるが、これがインシユリン合成の遺伝子を含む細菌
Escherichia coliにより合成されている。
天然につくられるタンパク質ならびに細胞の遺伝子操
作によりつくられるタンパク質は、細胞から分泌される
かまたは細胞内に蓄積される。つくられたタンパク質を
単離し精製するためには、細胞を溶解し、タンパク質を
単離し、そして必要に応じ、この分野で公知の方法によ
り溶解する。この過程に対して、幾つかの分別と精製工
程の後で、一般に洗浄剤が使用される。これは単離、精
製すべき個々のタンパク質に非常に特異的に適合しなけ
ればならない。従つて、望むタンパク質の単離および精
製のために正しい洗浄剤を見付けることが引続きこの分
野の一つの問題となつている。
発明の要約 本発明の目的は、生理活性のある細胞内でつくられた
タンパク質を単離し精製することができると同時にその
タンパク質の生物活性を維持または向上させる方法を提
供することにある。
この目的は本発明方法に従つて達成されるが、本法
は、洗浄剤欠如下では電子顕微鏡下で見えるほぼ扁球状
の電気泳動で移動しない第一の集合体形Ｉとして存在
し、第一の非変性性洗浄剤の存在下では、電子顕微鏡下
で見える電気泳動で移動しない第二のゆるい集合体形II
として存在し、そして第二の非変性性洗浄剤の存在下で
は電子顕微鏡下で見えない電気泳動移動形IIIとして存
在し、そして前記形Ｉ、II、およびIIIは洗浄剤の存否
の関数として一つの形から他の形へと可逆的に変換でき
るというタンパク質を入手できるようにするものであ
る。
本発明は特定的には糖タンパク質GP160およびその製
造方法に関る。
図面についての簡単な記述 第１図は糖タンパク質160のトリス緩衝液中の電子顕
微鏡写真（278,640倍に拡大）を示す。このタンパク質
は緻密な球状集合体形Ｉとして存在する。
第２図は１％DOCを含む緩衝液中のHIVの糖タンパク質
160の電子顕微鏡写真を示す。このタンパク質はゆるい
雲状の集合体形IIとして存在する。
発明の詳細な記述 タンパク質の単離過程で、非変性性洗浄剤を使用した
とき、両親媒性タンパク質が分散形でなく集合体形で存
在することが意外にも示された。これら集合体形は有利
な特徴をもつ。非変性性洗浄剤の欠如下で、この集合体
形は固く詰つた構造を示す。本明細書中でこの構造を集
合体形Ｉと呼ぶことにする。この形でこれら集合体形の
表面に存在する不純物をタンパク質から除去できる。そ
れ故に集合体形の緻密な形状によつて活性タンパク質の
変性が保護される（酵素活性または免疫反応をひき起こ
すエピトープが保護される）。集合体形Ｉにおける緻密
なタンパク質は生物活性があるが、電気泳動で移動しな
い。
非変性性洗浄剤の存在下で、集合タンパク質の緻密な
球状形Ｉは、多少ゆるんだ形に変換できる。単離および
精製過程の進行中では、集合体形Ｉが開いて形IIになる
と、不純物が一層容易に処理し易くなり不純物を更に除
去できるのでこのゆるんだ形は有利である。集合体タン
パク質の形IIでは意外にもタンパク質の生物学的活性も
増加する。例えば、これらの単離されたタンパク質の生
物学的特性が免疫化の抗原としてであるならば、単離タ
ンパク質の免疫発現性が増加する。それ故に、生物活性
タンパク質あるいは生物活性を示すこれらタンパク質の
部分も膨張形IIで特に活性がある。前記の理由のため、
ほぼ雲状の集合体形の中に封じ込まれた成分からタンパ
ク質を容易に精製できる。集合体形IIのタンパク質も電
気泳動で移動しない。
本発明方法により処理された粒状集合体タンパク質に
ついての特に驚くべきことは、集合体形ＩとIIを第一の
非変性性洗浄剤の存否の関数として相互に可逆的に変換
できるという事実である。記載の粒状集合体タンパク質
形は幾つかの付随する実際的な利点をもつ。これら集合
体形ＩおよびIIの相互変換の可逆性のため、精製過程が
単純化され、貯蔵性が向上し、単離タンパク質の生物活
性が増加する。
第二の非変性性洗浄剤を、目標を定めて用いると、集
合体形IIからタンパク質の分散形IIIにタンパク質を変
換できる。この予期せざる状態は、もし第二の非変性性
洗浄剤を除去するとこの状態から元に戻る。それ故に、
生理活性細胞から単離されるタンパク質は、非変性性洗
浄剤の存否の関数として、意図した特定の工程または用
途に最適の望む形に変換できる。
貯蔵のため、あるいは単離されたタンパク質の生物学
的活性低下の尺度として、ほぼ球形構造をもつ集合体形
Ｉが好ましい。更にまた、球形は精製工程中に変性を起
こす可能性のある処理から敏感な生物活性中心を保護す
る。
集合体形IIは、処理の継続時間と非変性性洗浄剤の濃
度とにより、およそ雲状の構造を示すであろう。このタ
ンパク質は、広がりの度合により、例えばタンパク質製
造に用いた宿主細胞またはベクター系から生じうる不純
物に関してそれ以上の精製が行ない易くなる。タンパク
質の生物活性は形IIで増加する。
扁球状集合体形Ｉおよびほぼ雲状の集合体形IIの両方
共、もしつくられた個々のタンパク質の分子量が少なく
とも10,000ドルトンであれば電子顕微鏡下で見ることが
できる。しかし、もし例えば遺伝子操作によつてごく少
数のアミノ酸を含むタンパク質のある抗原決定子だけが
発現されるとすれば、集合体形ＩおよびIIは電子顕微鏡
で可視度以下となるであろう。
集合体形ＩおよびIIにおける電気泳動で移動しないタ
ンパク質集合体は80％、なるべくは98％の純度で存在す
るのがよい。即ち、集合体形ＩとIIは望むタンパク質を
比較的均一な集合体として含むのがよい。
もしタンパク質が遺伝子工学により操作された細胞の
発現生成物であるなら、そして特にもし生成物が公知の
方法によりこれら細胞中で産生過多であるならば、細胞
内のタンパク質の凝集が特に適当な程度に起こる。
望むタンパク質を発現する遺伝子を含む幾つかのベク
ターが存在するか、またはもし相当する遺伝子の前に特
別強いプロモーターが置かれているならば、過剰生産が
起こりうる。もし発現されたタンパク質が細胞内で可溶
性のものであれば、それらは集合して記載の球状粒子を
形成するであろう。
遺伝子操作された宿主細胞により発現されるタンパク
質は抗原機能を示すことが好ましい。これらタンパク質
はもし生きている接種材をつくろうとするならば、ある
いは対応する活性抗原による活性免疫化を意図するなら
ば、遺伝子操作されたタンパク質発現に特に適してい
る。これはとりわけヒト病原性または動物病原性のウイ
ルスの外被タンパク質を含む。
なるべくは、単離されたタンパク質が糖タンパク質、
例えばHIVの糖タンパク質GP160またはＢ型肝炎ウイルス
の表面抗原であるのがよい。各場合におけるタンパク質
の発現用遺伝子は、例えば哺乳動物細胞系でワクシミア
ウイルスベクターにより発現させることができる。如何
にして特異的遺伝子をワクシニアウイルスベクター中に
挿入するかの方法はMackett等、J.Virol.49、857（198
4）により記述されている。この分野で公知の方法によ
り、先ず外来遺伝子をワクシニアの転写制御エレメント
（7.5Kプロモーター）から下流のプラスミドベクターに
挿入する。組み変えプラスミド中のこのキメラ遺伝子の
側に、ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（TK）の遺伝
情報を指定するワクシニアの配列が位置している。それ
によつてこのプラスミドは野生型ワクシニアウイルス
（WR株）で前以て感染させた細胞中に導入される。この
ようにしてTK領域で組み変えが起こる。この領域はウイ
ルスDNAおよびプラスミドの両方に対して相同であり、
ワクシニアウイルスのゲノム中にキメラ遺伝子を挿入で
きるようにする。この方法で得られた組み変え体ウイル
スは、表現型TKを示す。換言すれば、このものは最早チ
ミジンキナーゼを産生せず、５−ブロミンデオキシウリ
ジンを含む選択的培地中で発育する。この方法で、タン
パク質を恐らく過剰生産的につくり出し、従つてこれが
哺乳動物細胞中で凝集して記載の集合体形を形成する遺
伝子をもつた組み変え体ワクシニアウイルスをつくるこ
とができる。この集合体形は多数の個々のタンパク質を
含む。同様な発現系が他の抗原タンパク質に対して知ら
れている。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原の遺伝
暗号を指定する幾つかのワクシニアウイルス組み換え体
が設計されている。この目的のため、ワクシニアウイル
スの調整機構の下で、幾つかのワクシニア特異的プロモ
ーターを使用して、外来遺伝子に対する発現レベルを増
加させるという目標でＢ型肝炎ウイルス表面抗原を発現
させた。更にまた、一つ以上のＢ型肝炎ウイルス遺伝子
を発現させるワクシニアウイルス組み換え体をつくつ
た。
望むタンパク質の遺伝子工学による生産のための組み
換え体発現系の製造は、Winnackar,E.L.［Gene und Klo
ne,eine Einfhrung indie Gentechnologie（Genes an
d Clones,An Introduction to Gene Technology）,VCH
−Verlagsgesellschaft mbH,Weinheim（1984）］に一般
的に記載されている。
多くのタンパク質を含有する集合体形で存在しうる、
細胞内で発現したタンパク質の生物学的機能は酵素機能
であるのがよい。特に集合体形IIにおいては酵素機能増
加が得られる。この増加は、酵素活性中心がゆるんだ集
合体形IIで露出しているという事実と関連すると考えら
れ、そしてこれにも拘らずすべての酵素活性タンパク質
の空間的なつながりが存在する。従つて、タンパク質の
酵素活性により変換される物質が酵素活性域と出会う確
率の増加がある。
もし酵素タンパク質が凝固因子VIIIであれば、とりわ
け好ましい。F VIIIの遺伝子工学生産はこの分野で数回
記述されて来た。粒子形で集められたタンパク質は、も
う一つの物質、特に高分子量タンパク質へ抱合により結
合させることが好ましい。この結果、安定性、活性、in
vitro回収率、およびタンパク質の生物学的半減期が改
善される。望むタンパク質と高分子量の別の物質とのこ
のような抱合の例は、凝固因子VIIIとWillebrands因子
のそれにより代表される。
粒子状集合体タンパク質は真核細胞、とりわけ動物ま
たはヒトの細胞で発現するのがよい。
もし望むタンパク質を初代細胞培養で、あるいは細胞
系から得たベロー細胞、CHO細胞、または初代ニワトリ
胚繊維芽細胞で発現させることができるなら特に好まし
い。例えば、発現されたタンパク質のグリコシル化とい
つた翻訳後に生ずる最終生成物の修飾のため、記載の宿
主細胞は発現系として特に好ましい。これらのグリコシ
ル化タンパク質は次に凝集して粒子形を形づくり、この
ものは記載の球状形Ｉとなるか、あるいは第一の非変性
性洗浄剤での処理後に雲状の形IIとなることができ、ま
た第二の非変性性洗浄剤での処理後に第三の集合体形II
Iに変化することができる。
前述したように、HIVの糖タンパク質160の製造にはベ
ロー細胞が特に好ましい。この細胞系が特によいのは、
発育速度が比較的早く、ヒトの接種材の製造によく適合
するからである。本発明方法により単離しようとする望
むタンパク質を発現する遺伝子を含む組み換え体ワクシ
ニアウイルスによるベロー細胞の感染の結果として、望
むタンパク質の正常な合成、そのグリコシル化ならびに
可能なそれ以上の処理工程が生れる。二つの組み換え体
による二重感染方式の使用により、望むタンパク質の量
を有意に増すことができる。この方式は、ワクシニアの
P7−６プロモーターの制御下でフアージT7のポリメラー
ゼを発現する組み換え体を含む。この組み換え体をT7プ
ロモーターおよびHIVの糖タンパク質160遺伝子を含む組
み換え体で一緒に感染させる。T7プロモーターは非常に
強いプロモーターであり、高レベルの、例えば望むタン
パク質量の10倍の発現を確実にする。
記載の方式は特に適当な方式として理解される筈であ
る。望む遺伝子の組み換えに幾つかのベクターを使用し
たしてこれらのベクターを望む細胞中で増殖させ、そし
て外来遺伝子により発現されたタンパク質をつくる多く
の異なる可能性の一般的要約は、Genetic Engineering
3、Academic Press,R.Williamson編（1982）またはSpek
trum der Wissenschaft（Spectrum of Science）、Indu
strielle Mikrobiologie（Industrial Microbiology）
（1985）に見出される。
その存否が、異なる集合体形またはタンパク質の分散
形における生理活性細胞から単離されたタンパク質の存
在に、有意に影響を及ぼす非変性性洗浄剤はなるべく非
イオン性、非イオン性、または混成イオン性洗浄剤であ
るのがよい。望むタンパク質を、一方においては高純度
の形で、また他方では生物学的に活性ある状態で回収す
るための洗浄剤の選択が常に挑戦を意味するということ
は、タンパク質化学でまたタンパク質精製法で公知の問
題である。ある種のイオン性、非イオン性、または混成
イオン性の非変性性洗浄剤を使用すると、タンパク質精
製法に対する上記の必要条件が完全に満されることが意
外にもここに発現された。その上、予想外の進歩はタン
パク質集合体の構造であり、これらタンパク質をつくり
出す細胞内にそれらが存在するままで記載の要件を非常
によく満足する。前記のように、とりわけゆるんだ構造
または雲のような構造をもつ集合体形IIにおいては、個
々のタンパク質に本来備なわつている生物活性が、それ
が酵素活性であれ抗原活性であれ、明らかに増加する。
特に適当な非イオン洗浄剤は、オクチルグルコシドあ
るいはこの洗浄剤の誘導体の一つであり、濃度はなるべ
く0.25から５％、特に１％がよい。
また、胆汁酸の塩、ならびにその誘導体の一つの洗浄
剤、なるべくは洗浄剤デオキシコーレート（DOC）を用
いるのがよい。この洗浄剤はHIV糖タンパク質160の球形
の多くのタンパク質の単離および精製に、なるべくは0.
25から５％、なるべくは１％の濃度で用いるのに適当で
あり、またもしGP160の精製にデオキシコーレートを使
用するとすれば、例えば水酸化アルミニウムと組み合わ
せて用いるのがよい。
タンパク質集合体をII形から単量体形IIIに変換する
ために使用するのに適した非変性性洗浄剤はZwittergen
tRシリーズの混成イオン性洗浄剤で、これを0.25〜５
％、なるべくは１％の濃度で使用する。
ZwittergentR洗浄剤はスルホベタインとして知られる
合成双性イオン型洗浄剤で次の一般構造をもつ： 集合体形Ｉのタンパク質は、タンパク質の安定貯蔵に
特によく適している。しかし、これらはまた望む生物学
的変換あるいは反応にも使用できるのは集合体形Ｉにお
ける組み合わせタンパク質も生物活性を示すからであ
る。
タンパク質をその集合体形IIで用いると、タンパク質
の生物学的機能の強化が起こる。
タンパク質の集合体形はいずれも、記載された扁球
状、雲状または非集合形で、また高分子量の他のタンパ
ク質との前記抱合形で、治療、予防または診断用に適し
ている。
タンパク質集合体のもう一つは用途は、置き換え処
理、接種材またはモノクローン抗体の生産、ならびに体
液中の物質の定性的検出および定量的測定のための物質
の生産である。
更に、本発明は細胞内で、なるべくは遺伝子操作した
細胞内でつくられた望むタンパク質の単離および精製法
にも関する。この場合、最初の精製工程で、第一の集合
体形Ｉとして存在するタンパク質から、表面に存在する
不純物を取り除き、次に非変性性洗浄剤を用いてこれら
タンパク質を第二の集合体形IIに変換する。二番目の精
製工程で、この集合体形IIにおいて処理し易くなつた不
純物を除去し、そして第二の非変性性洗浄剤の添加によ
りタンパク質を非集合体形IIIに変換できる。このタン
パク質は非変性性洗浄剤を除くことにより、集合した形
ＩまたはIIへ可逆的に変換し戻すことができる。
この方法の利点は本質的に前述して来たが、これはタ
ンパク質の様々な集合形を互に可逆的に変換できること
にある。
例えば、およそ球状の形Ｉは、これらタンパク質の緻
密な構造のため、多少なりとも球形のタンパク質集合体
の表面から、媒地成分を最初に簡単に除いてきれいにす
ることができる。次に、もし第二の不純物除去工程を行
なうならば（開いた構造のため不純物は集合体形IIでは
除去し易くなつている）、非変性性洗浄剤の除去により
集合体形Ｉを再び可逆的につくることができる。例え
ば、形Ｉにおいては、タンパク質の活性中心はタンパク
質の球形配列の内側で特によく保護されている。従つ
て、集合体形Ｉにおいては、特に良いタンパク質貯蔵が
可能である。既に述べたように集合体形IIは、タンパク
質が発現される宿主細胞、あるいは組み換えの仕方で単
離タンパク質に対する遺伝子を含むベクターの細胞成分
除去の単純化ということに関して利点を有するだけでな
く、タンパク質の特別な集合状態により多くの活性中心
の空間的な接近のためタンパク質の生物活性を有意に強
化できるというもう一つの利点をもつ。
実験の構成により、細胞または細胞膜を遠心し、非変
性性洗浄剤ならびにプロテアーゼ阻害系を含む緩衝溶液
で抽出するか、あるいはもし高分子量を望む物質が細胞
から培地の中に分泌されるなら、その培地を非変性性洗
浄剤およびプロテアーゼ阻害系と混合する。この非変性
性洗浄剤は、例えば、デオキシコーレート（DOC）でそ
の濃度は約0.25から５％、なるべくは１％である。
この方法で得られた溶液を濃縮するが、もし単離し精
製しようとする物質が糖タンパク質であるならレクチン
を用いて濃縮する。このものは固体マトリツクスに結合
し、その非炭水化物性不純物を除去する。この段階で用
いる非変性性洗浄剤は、物質を形Ｉに変換する性質に加
えて、非特異的吸着を防止する能力をもつ。グリコシド
で溶離が起こる。
もう一つの重要な意味をもつ精製工程は、高分子量の
予備純化物質を免疫吸着カラムに特別に結合させること
により行なわれる。緩衝液で十分に洗浄後、カオトロピ
ツク剤、例えば尿素またはKSCN（２〜8M、なるべくは3
M）、を溶離に使用する。その後緩衝液に対して透析す
ることにより、物質を粒子形に変換させる。必要に応
じ、ある種の混成イオン性洗浄剤を用いて、高分子量を
もつこの物質を非集合性の形IIIに変え、イオン変換ク
ロマトグラフイーにより精製する。洗浄剤を含まない緩
衝液に対して透析すると、非集合形IIIから集合体形II
またはＩが回復する。
記載した細胞内でつくられるタンパク質の種々な集合
体形は電子顕微鏡により見えるようにできる。
本発明は下記の例で詳細に説明する。
例１ HIVの糖タンパク質160の単離と精製 HIVの糖タンパク質160の単離および精製を下記の段階
に従つて行なつた： １） 遺伝子工学により操作したベロー細胞（HIVの糖
タンパク質160をつくる）を望む密度で遠心した。
２） 遠心で得たペレツトをTBS（pH7.4）＋1mM CuSO4
＋0.5mM ZnCl2に再懸濁した。
３） 再懸濁したペレツトを50mHトリスHCl、pH8.3、１
％DOC、1mM CuSO4、および0.5mM ZnCl2で抽出した。
この懸濁液を25℃で30分間遠心することにより清澄させ
た。
４） 一番上の画分を、望むタンパク質をカラムに吸着
させ、DOC緩衝液で洗浄することにより、レンチル−レ
クチンクロマトグラフイーにかけた。このタンパク質を
洗浄用緩衝液中５％メチルグリコシドで溶離した。
５） レクチンカラムからの溶離液をTween緩衝液で希
釈した。次に、免疫アフイニテイークロマトグラフイー
カラム上に吸着させ、これをTS Tween、その後TBSで洗
浄した。これに続いてDNAおよびRNA処理を行なつた。溶
離を3M KSCNで行ない、洗浄剤を含まない緩衝液に対し
て透析した。
６） 透析した溶離液１％混成洗浄剤および５％ベタイ
ンで調節し、次に陰イオン交換体としてのモノ−Q/マト
リツクス上に吸着させ、次にKSCN勾配で溶離し、緩衝液
に対して透析した。
７） 二番目のレンチル−レクチンクロマトグラフイー
は吸着および無洗浄剤緩衝液での洗浄により行なつた。
５％メチルグリコシドで溶離し、その後TBSに対して透
析した。
このプロセス工程はタンパク質の濃縮を行なうもので
ある。
例２ 例１記載の方法に従つて精製したHIVの糖タンパク質
（GP）160を用いて、効力試験を行なつた。この試験
は、緻密な球状形Ｉ、ならびにゆるんだ雲状の形IIの状
態にある糖タンパク質160の免疫発現有効性を示す。
ワクチン当り10μｇ、2.5μｇ、0.625μｇ、0.158μ
ｇ、および0.04μｇ GP160/mlの５通りの希釈液をつく
つた。１希釈液当り10匹のBALBCマウスを皮下免疫化し
た。従つて、ワクチンの型一つ当りの50匹の動物を必要
とした。この実験で、４通りの異なる吸着法を試験し
た。
１） GP160＋0.2％Al（OH）３ ２） /GP160＋0.25％DOC/＋0.2％Al（OH）３ ３） /GP160＋0.25％DOC/＋/0.2％Al（OH）３＋0.25％
DOC/ ４） /GP160＋0.25％DOC/＋/0.2％Al（OH）３洗浄／ 全動物を1mlで皮下免疫化し、６週間後に１匹ずつ採
血した。個々の動物の血清を、抗HIV ELISA（SCRIN）
を用いてGP160抗体の存在について調べた。公知のSpear
man Kaerber法により反応する動物に基づき各型のワク
チンに対してGP160の有効用量50を計算する。
結 果 HIVの糖タンパク質160についての効力試験の結果は、
糖タンパク質160の免疫発現性がその集合体形によつて
種々に変ることを示している。接種動物の50％が血清変
換を起こす使用物質量を示すED50値は、洗浄剤DOCが存
在するとき意味をもつ程に減少した。洗浄剤DOC存在下
で、糖タンパク質160が集合体形IIとして存在すると、
その場合一方においては抗原エピトープが無く、他方に
おいては空間的につながつているので、強い免疫反応を
起こした。
本発明をHIVの糖タンパク質160の例を用いて説明した
が、決してこのタンパク質に限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は糖タンパク質160のトリス緩衝液中の粒子構造
を示す電子顕微鏡写真（278,640倍）であり、第２図は
１％DOCを含む緩衝液中のHIV糖タンパク質160の粒子構
造を示す電子顕微鏡写真である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭61−233700（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−181387（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−198627（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．229，（27 ｓｅｐ．1985），ｐ．1402〜1405

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】遺伝子工学により操作した細胞、とりわけ
    タンパク質を過剰発現する細胞の発現生成物であり、電
    子顕微鏡下でみることのできる糖タンパク質gp160（形
    Ｉ）を洗浄剤としてデオキシコレートまたはオクチルグ
    ルコシドで処理することにより得ることができる、洗浄
    剤を含有する集合体で、電気泳動で移動しない形の、電
    子顕微鏡下でみることのできるHIV糖タンパク質gp160
    （形II）。
  2. 【請求項２】糖タンパク質は少なくとも80％の純度で、
    望ましくは、98％の純度で存在する、特許請求の範囲第
    １項記載の糖タンパク質gp160。
  3. 【請求項３】抗原機能をもつ、特許請求の範囲第２項に
    記載の糖タンパク質gp160。
  4. 【請求項４】細胞は真核細胞、望ましくは、動物または
    ヒトの細胞である、特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
    か一つに記載の糖タンパク質gp160。
  5. 【請求項５】細胞は初代細胞培養または細胞系、特に、
    ベロー細胞、CHO細胞、または初代ニワトリ胚繊維芽細
    胞由来の、特許請求の範囲第４項記載の糖タンパク質gp
    160。
  6. 【請求項６】形Ｉを形IIへ変換するデオキシコレートま
    たはオクチルグルコシドを、望ましくは0.25〜５％、特
    に１％の濃度で用い、かつ、形IIをモノマー形（形II
    I）へ変換する洗浄剤として、ベタインまたはその誘導
    体、たとえば、スルホベタインを望ましくは0.25〜５
    ％、特に１％の濃度で用いる特許請求の範囲第１項〜第
    ５項のいずれか一つに記載の糖タンパク質gp160。
  7. 【請求項７】治療、予防または診断のための特許請求の
    範囲第１項に記載の形IIのHIV糖タンパク質gp160。
  8. 【請求項８】遺伝子工学により操作した細胞、とりわけ
    タンパク質を過剰発現する細胞の発現生成物であるHIV
    糖タンパク質gp160の単離および精製方法であって、 最初の精製工程で、電子顕微鏡下でみることのできる第
    一の集合体形Ｉの前記糖タンパク質から不純物を除去
    し、次いで 洗浄剤としてデオキシコレートまたはオクチルグルコシ
    ドを用いて同糖タンパク質を、洗浄剤を含有し、電気泳
    動で移動せず、かつ電子顕微鏡下でみることのできる第
    二の集合体形IIに変換し、そして、 第二の精製工程でこの集合体形IIにおいて処理しうる不
    純物を除去し、そしてこの糖タンパク質を場合により洗
    浄剤としてベタインまたはその誘導体、たとえば、スル
    ホベタインを添加することによりモノマー形IIIに変換
    し、 洗浄剤の除去により、上記形IIIは集合体形ＩまたはII
    に可逆的に変換しうる、 上記方法。
  9. 【請求項９】糖タンパク質を精製するため、集合体形
    Ｉ、IIおよびIIIの可逆的変換を数回行なう、特許請求
    の範囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】細胞は真核細胞、望ましくは、動物また
    はヒトの細胞である、特許請求の範囲第８項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】細胞は初代細胞培養または細胞系、特
    に、ベロー細胞、CHO細胞、または初代ニワトリ胚繊維
    芽細胞由来の、特許請求の範囲第10項記載の方法。
  12. 【請求項１２】形Ｉを形IIに変換するデオキシコレート
    またはオクチルグルコシドを、望ましくは0.25〜５％、
    特に１％の濃度で用い、かつ、形IIをモノマー形（形II
    I）への変換にベタインまたはその誘導体、たとえば、
    スルホベタインを、望ましくは0.25〜５％、特に１％の
    濃度で用いる特許請求の範囲第８項〜第11項のいずれか
    一つに記載の方法。
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