JP2004520403A - ヘリコバクター・アドヘシン様タンパク質ａ（ａｌｐａ）の精製方法 - Google Patents
ヘリコバクター・アドヘシン様タンパク質ａ（ａｌｐａ）の精製方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、ヘリコバクター（Helicobacter）・アドヘシン様タンパク質Ａ（ＡｌｐＡ）を精製する方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡ調製物および２.５〜３.５Ｍのグアニジンを疎水的相互作用クロマトグラフィー材料と接触させて該材料にＡｌｐＡを吸着させること；および（ii）ＡｌｐＡを３.５〜４.５Ｍのグアニジンを含有する溶液で溶出させることを含む方法に関する。精製されるべきＡｌｐＡ調製物は、特に、高レベルに組換え体においてＡｌｐＡを発現する能力を有するイー・コリ（E. coli）培養物から得ることができる。ここで、ｒＡｌｐＡは封入体の形態であり、該封入体を回収し、グアニジンの存在下にて可溶化し、予備精製のために硫酸アンモニウム沈殿させてもよい。疎水的相互作用クロマトグラフィーの後に、８Ｍの尿素の存在下にて陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。
Description
【０００１】
本発明の主題は、工業規模にて使用するのに必要とされる特徴を有するヘリコバクター（Helicobactor）ＡｌｐＡタンパク質の精製方法である。
【０００２】
ヘリコバクターはグラム陰性らせん細菌により特徴付けられる細菌の属である。いくつかの種は哺乳類の胃腸管にコロニー形成する。特に、ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori）、ヘリコバクター・ヘイルマニイ（H. heilmanii）、ヘリコバクター・フェリス（H. felis）およびヘリコバクター・ムステレ（H. mustelae）が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリはヒト感染に最も一般的に付随する種であり、稀に、ヒトからヘリコバクター・ヘイルマニイおよびヘリコバクター・フェリスを単離することもできた。ヘリコバクター型の細菌であるガストロスピリルム・ホミニス（Gastrospirillum hominis）もまたヒトに関して記述されている。
【０００３】
ヘリコバクターは先進国においては５０％を超える成人が感染しており、開発途上国においてはほぼ１００％の成人が感染しており、それにより世界中で優勢な感染因子の１つとなっている。
【０００４】
ヘリコバクター・ピロリは現在までのところもっぱらヒトの胃の粘膜の表面、特に、胃潰瘍および十二指腸潰瘍のクレーター病変の周囲で見つけられている。この細菌は、現在、幽門洞胃炎の病因因子として認識されており、潰瘍の発生に必要とされる補助因子の１つであるようである。さらにまた、胃癌の発生はヘリコバクター・ピロリの存在に付随していると考えられている。
【０００５】
したがって、ヘリコバクター感染の予防または治療のためにワクチンを開発することが非常に望まれている。
【０００６】
現在までのところ、ワクチン抗原としていくつかのヘリコバクタータンパク質、特に、膜起源のリポタンパク質ＡｌｐＡ（アドヘシン様リポタンパク質Ａ）が既に提案されている。初めにＡｌｐＡおよびそれをコードする遺伝子がWO96/41880に開示された。医薬用のバッチの調製を可能にする製造および精製方法は開発されていない。
【０００７】
かくして、本発明の主な目的は工業規模で使用され得る簡単かつ確固たる方法を提供することである。この方法により、特に、高価な投資を行うことなく多量の抗原の生産が可能になるにちがいない。
【０００８】
イー・コリは、組換え手法によりあらゆる種類の異種タンパク質を生成するために宿主生物として使用される特に優れた細菌である。これらのタンパク質がどうしても可溶性ではないかまたは排出されない場合、それらは封入体の形態で蓄積し得る。これらの封入体はイー・コリに特異的な細胞質内小体である。これらの封入体の出現は高レベルの発現（過剰発現）により促進される。組換えタンパク質を封入体から精製するには、特に、これらの封入体を予め可溶化することが必要である。この可溶化は慣用的にはカオトロピック剤（尿素、グアニジン）または界面活性剤により得られる。
【０００９】
イー・コリにおいて意図的に非脂質化形態で産生された組換えタンパク質ｒＡｌｐＡでも依然として高い疎水性を保持している。この高い固有の疎水性により、慣用的な手段によるその精製が困難となる。さらにまた、ｒＡｌｐＡタンパク質はイー・コリの封入体中にあり、実際、精製の間、高濃度のカオトロピック剤の存在が必要である。
【００１０】
ＡｌｐＡの高い疎水性のために中性ｐＨで可溶化するには高濃度のグアニジンが必要である；したがって、この薬剤は封入体を可溶化するための操作において必須の因子であると考えられる。それにもかかわらず、イオン的および疎水的相互作用を抑制するこの薬剤は、通常、クロマトグラフィーによる精製にはあまり使用されておらず、したがって、排除されるべきである。
【００１１】
一般に、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、著しい疎水性を有するタンパク質を精製するために一般的に使用される。しかしながら、上記したように、通常、グアニジンの存在が吸着を妨げるので、かかるタンパク質が高濃度のグアニジンを含有する媒質中に存在している場合にはこの種のクロマトグラフィーの使用は非常に問題となる。実際、慣用的な条件下でＨＩＣ支持体上に吸着され得るタンパク質の非常に多くが高濃度のグアニジンで溶出されると考えられる。
【００１２】
しかしながら、ＡｌｐＡに関して、この度、ＡｌｐＡを可溶性形態に維持させ、かつ、ＨＩＣ支持体上に吸着させる非常に狭いグアニジン濃度範囲が存在することを見出した。この範囲は、約２.５〜３.５Ｍである。
【００１３】
したがって、本発明の主題は、ヘリコバクター（例えば、ヘリコバクター・ピロリ）・アドヘシン様タンパク質Ａ（ＡｌｐＡ）の精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび２.５〜３.５Ｍのグアニジンを含有する調製物を疎水的相互作用クロマトグラフィー材料と接触させて該材料にＡｌｐＡを吸着させること、および（ii）３.５〜４.５Ｍのグアニジンを含有する溶液でＡｌｐＡを溶出させることを含む方法である。
【００１４】
好ましくは、クロマトグフィー材料と接触させられる調製物は３Ｍのグアニジンを含有しており、Ａｌｐは中性ｐＨ（６〜８；例えば、６.５〜７.５）で４Ｍのグアニジンで溶出される。
【００１５】
上記したとおり、グアニジンの存在下でＡｌｐを含有する調製物は、特に、（ａ）組換え形態でＡｌｐＡを発現する能力を有するグラム陰性細菌、特に、イー・コリ（E. coli）を培養すること、（ｂ）該培養物から細菌細胞を回収し、それらを溶解すること、（ｃ）該細胞中に含有される封入体を回収し、それらを洗浄し、それらを可溶化すること、および（ｄ）所望により、該封入体を沈殿させ、上清を除去し、沈殿物を可溶化することを含む製造方法により得られる。
【００１６】
以下に、さらに詳細に記載する。まず第一に、培養後に採集した細菌を溶解させる。細胞溶解は、種々の方法で、特に、顕微溶液化により行われ得る。特定の実施態様によると、溶解の間に細胞をベンゾナーゼで処理することも可能であり、その結果、イー・コリＤＮＡが消化される。次いで、封入体を、好ましくは、高濃度の塩を含有する緩衝液で、連続洗浄して、核酸を除去し、できる限り多くのｒＡｌｐＡを夾雑物から解離させる；適当には、該緩衝液は、ナトリウム緩衝液、例えば、０.５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液であり得る。最後に、封入体を、非常に高濃度、例えば、５.５〜６.５Ｍ、好ましくは、６Ｍのグアニジンに溶解させる。特定の実施態様によると、好ましくは、この段階で、硫酸アンモニウムを使用して「塩析」させることによってｒＡｌｐＡを選択的に沈殿させることにより（例えば、イー・コリ由来の）夾雑細菌タンパク質の一部を除去する。好ましくは、硫酸アンモニウムは、０.４〜０.６Ｍ、例えば、０.５Ｍである。ｒＡｌｐＡを含有する沈殿物を再度高濃度のグアニジン、例えば、５.５〜６.５Ｍ、好ましくは、６Ｍのグアニジンに可溶化させる。疎水的相互作用クロマトグラフィーを使用するために調製物を２倍に希釈し、次いで、適当なカラムに負荷する。
【００１７】
疎水的相互作用クロマトグラフィーは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM（ファルマシア（Pharmacia））およびＦｒａｃｔｏｇｅｌTM（メルク（Merck））のような支持体、またはトーソーハース（Tosohaas）もしくはバイオラド（Biorad）から入手される支持体のような後者と同等の支持体を使用して慣用手段にて行われ得る。配位子は、ブチル、オクチルまたはフェニルであり得る。ＨＩＣは、特に、ＡｌｐＡタンパク質をその分解物から分離させることができる。
【００１８】
好ましい実施態様によると、ＨＩＣから得られた溶出液を種々の方法で、特に、限外濾過により、濃縮することができ、毒性物質であるグアニジンを除去することもまた好ましい。このために、モル濃度４Ｍまたはそれ以上、好ましくは、６Ｍまたはそれ以上、好ましくは、８Ｍの尿素を含有する数倍の容量の中性緩衝溶出液に対してダイアフィルトレーション工程、例えば、タンジェンシャル・ダイアフィルトレーション（diafiltration tangentielle）工程を使用することが可能である；尿素はｒＡｌｐＡを確実に可溶性形態で維持するために存在している。有利な実施態様によると、６〜１０倍の容量の７.５〜８.５Ｍの尿素を使用する。
【００１９】
最後に、精製を完了させるために、イオン交換クロマトグラフィー、特に、陰イオン交換クロマトグラフィーによる「研磨（polissage）」を行ってイー・コリ由来の残存夾雑物を除去することが可能である。適当な実施態様によると、後者の工程は、８Ｍの尿素の存在下にて行われる。次いで、ダイアフィルトレーションから得られたｒＡｌｐＡ調製物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に負荷する；夾雑物はこの材料に吸着されるが、一方、ｒＡｌｐＡは吸着されず、濾液（直接溶出液とも称される）中にて見出される。８Ｍの尿素の存在は、以下の理由により不可欠である：ＡｌｐＡは、陽性荷電タンパク質（非常に高いｐＩ）であり、したがって、通常、陰イオン交換クロマトグラフィー材料に吸着されないはずである。しかしながら、その疎水性は非常に著しく、８Ｍの尿素が調製物にない場合には吸着されるであろう。
【００２０】
この点について、本発明は、また、ＡｌｐＡの精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび７.５〜８.５Ｍ、好ましくは、８Ｍの尿素を含有する調製物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料と接触させてこの材料に夾雑物を吸着させること、および（ii）濾液からＡｌｐＡを回収することを含む方法に関する。
【００２１】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM（ファルマシア）およびＦｒａｃｔｏｇｅｌTM（メルク）のような支持体、またはトーソーハースもしくはバイオラドから入手される支持体のような後者と同等の支持体を用いて慣用手段にて行われ得る。該配位子は、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）のような３級アミン、またはＱ（４級、ヒドロキシプロピルジエチルアミノエチル）およびＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）のような４級アミンであり得る。
【００２２】
本発明の主題であるＡｌｐＡの精製方法は、総体的に、特に、最初に多量に処理する場合を考慮すると、目的のタンパク質が前例のないレベルの純度に達することを可能にする。したがって、本発明は、また、以下のものに関する：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定法により測定した場合に純度９０％またはそれ以上の単量体により特徴付けられるＡｌｐＡタンパク質。単量体形態以外の残部は多量体形態のＡｌｐＡタンパク質からなる。全体的な純度は、９９％またはそれ以上である。
ＡｌｐＡタンパク質を少なくとも５ｇ、好ましくは、少なくとも１０ｇ、最も好ましくは、少なくとも１５ｇ含有する調製物であって、該ＡｌｐＡタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定により測定した場合に純度９０％またはそれ以上の単量体により特徴付けられる調製物。この調製物が１つのバッチを構成し、すなわち、単一の培養物および精製方法の個別の実行により得られたことは全く明白である。
【００２３】
別法として、封入体が、グアニジンの代わりに塩基性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ１０.５またはそれ以上、例えば、ｐＨ１１の緩衝液中の７.５〜８.５Ｍ、好ましくは、８Ｍの尿素を使用することにより可溶化され得ることもまた見出された。有利には、リン酸緩衝液を使用する。可溶化が達成されると、尿素のモル濃度を４.５〜５.５Ｍ、例えば、５Ｍに減少させ、ｐＨもまた中性付近、例えば、７.５に低下させる。これはＴｒｉｓ緩衝液で希釈することにより行われ得る。次いで、ＨＩＣを行ってＡｌｐＡを７.５〜８.５Ｍ、例えば、８Ｍの尿素で希釈する。
【００２４】
したがって、本発明の主題は、また、ヘリコバクター・アドヘシン様タンパク質Ａ（ＡｌｐＡ）の精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび４.５〜５.５Ｍの尿素を含有する調製物を疎水的相互作用クロマトグラフィー材料と接触させて該材料にＡｌｐＡを吸着させること、および（ii）７.５〜８.５Ｍの尿素を含有する溶液でＡｌｐＡを溶出させることを含む方法である。
【００２５】
（実施例）
発現系
誘導発現系を構築してイー・コリ（E. coli）中にてヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）ＡｌｐＡタンパク質を生産させた。使用したベクターは、プラスミドｐＥＴ２８ｃ（ノバジェン（Novagen））由来のものであった。このベクターは、
Ｔ７バクテリオファージ・プロモーターの制御下での発現カセット、
該プロモーターの下流での目的遺伝子のクローニング用のポリリンカー、
Ｔ７バクテリオファージ由来の転写ターミネーター、および
カナマイシン耐性遺伝子
を含む。
【００２６】
該プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下にて正に調節される。
【００２７】
発現のために、種々の遺伝的に修飾されたイー・コリ株、とりわけ、ＢＬ２１λＤＥ３株（Studier, F. W. et al., 1990 Meth. Enzymol 185, 60-69）を使用することができる。これらの株は、ＩＰＴＧの添加により誘導可能な、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含有する。さらにまた、ＢＬ２１λＤＥ３株は、ＯｍｐＴおよびＬｏｎプロテアーゼ活性を欠損している。
【００２８】
ＤＮＡ供給源としてヘリコバクター・ピロリＸ４７−２（ＯＲＶ ２００１）株を使用したＰＣＲ増幅法により、成熟ＡｌｐＡタンパク質をコードしている配列を含有する１.６ＫｂのＤＮＡフラグメントを得た。クローニングのために使用されるＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位は、各々、５'（ＨＰ３ Ｎｃｏ Ｃ−）および３' ＨＰ３（Ｘｈｏ）ＰＣＲプライマーに含まれている。脂質化部位［システインコドン（ＴＧＣコドン）］をＡＴＧ開始コドン（Ｍｅｔ）に置換した。まず、ＰＣＲ増幅フラグメントをシャトルベクターＴｏｐｏ ＴＡ（インビトロジェン（Invitrogen））中にクローン化し、次いで、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を使用してｐＥＴ２８ｃ中に移した。
【００２９】
ＰＣＲ増幅条件は以下のとおりであった：９７℃／３０秒；５５℃／１分；７２℃／５０秒；Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ − ２５サイクル。
【化１】
ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位はイタリック体で示されており、ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ終止コドン（逆ストランド）は下線を引いた太字で示されている。
【００３０】
前培養および培養
各々、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた改変２Ｘ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地（ペプトンに代えて３０ｇ／Ｌの酵母エキスを使用した）５００ｍｌを入れた２リットルのエルレンマイヤーフラスコにイー・コリＢＬ２１ＤＥ３／ｐＭＨｐ３.１接種物のバッチ５００μＬを接種し、１７５ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１５〜１８時間インキュベートする。
【００３１】
この前培養物を、４４ｇ／ｌのグルコース・一水和物および５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＳＫＹＥ ４培地（１リットルあたり、酵母エキス４０ｇ；１ＭのＭｇＣｌ2 ３ｍｌ；Ｋ2ＳＯ4 ５３０ｍｇ；ＮａＣｌ １ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4 ８４４ｇ）を入れた３０Ｌの発酵槽（ベー・ブラウン（B Braun））に接種する。該接種物は、全容量の５％に相当する。培養パラメーターは以下のとおりである：ｐＨ：７.００；調節：１０％Ｈ3ＰＯ4および２８％ＮＨ4ＯＨ；温度：３７℃；初期撹拌：２００ｒｐｍ；初期空気流速：１ ｌ／ｌ培養物／分；ＰＯ２：３０％、調節：（１）２００ｒｐｍ〜７００ｒｐｍでの撹拌、（２）空気流速２０％〜６０％、（３）Ｏ2流速０％〜１００％。
【００３２】
培養を３時間以上続ける。６００ｎｍでのＯＤが２５〜３５の時点で、１ｍＭの最終濃度を得るために必要な容量のＩＰＴＧ（２００ｍＭ）を添加することによりＡｌｐＡの発現を誘導する。２時間の誘導後、すぐに培養物を冷却する。７０００ｇで２０分間遠心分離することにより細胞を得、ペレットを−３５℃で貯蔵する。
封入体の調製
微生物の懸濁および湿ペレットの処理
細胞ペレット５００ｇ（湿重量）（約５Ｌの培養物に相当）を５±３℃で一夜解凍し、予め５±３℃に冷却した５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８.０に、細胞ペレット１ｇあたり緩衝液７ｍｌの割合で、すなわち、５００ｇあたり３.７５Ｌの割合で懸濁させる。この懸濁液の予想容量は４.２５Ｌである。この懸濁液を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて、氷浴上にて５±３℃に温度を維持して３０〜６０秒のサイクルを２〜３回繰り返してホモジナイズする。
【００３３】
−２０℃で貯蔵していた２５０ＩＵ／μＬの貯蔵液から２.５ＩＵ／μＬのベンゾナーゼの溶液を新しく調製する（すなわち、２０μＬ＋１９８０μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８.０）。次いで、この溶液１７００μＬを１００ｍＭのＭｇＣｌ2 ４２.５ｍｌに添加する。この調製物を全て、微生物の懸濁液に注ぐ。該混合物を５±３℃でマグネチックスターラーで撹拌しながら少なくとも３０分間インキュベートする。
【００３４】
細胞の破砕
ホモジナイズされた細胞を、１０００バールの固定した圧力下にてＰＡＮＤＡ細胞ディスインテグレーターを使用して、冷却系（＋５℃に調節したクリオスタット）を使用して、１５℃以下の温度で破砕サイクルを３回繰り返して破砕する。破砕前のＯＤ／最終破砕後のＯＤの比率は≧４.５となるべきである。
【００３５】
封入体の洗浄
破砕サイクルを３回繰り返した後の封入体の懸濁液を５±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離して夾雑物（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびリポ多糖など）を除去する。
遠心分離後、ペレットを回収し、次いで、５±３℃に冷却した、０.５ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）４.２５Ｌに再懸濁する。タンパク質濃度は約８ｇ／Ｌである。この懸濁液を、該懸濁液を５±３℃に維持するように氷浴上にてＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズし、次いで、５±３℃で３０分間マグネチックスターラーで撹拌する。このようにして洗浄した懸濁液を５±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離する。
洗浄操作を２回繰り返す。かくして、洗浄した封入体１１０ｇ（洗浄した封入体１ｇあたりタンパク質約０.３ｇ）を得る。−２０℃で貯蔵可能である。
【００３６】
封入体からの精製
封入体の可溶化
次いで、封入体を、６Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）に可溶化させる。得られる最終タンパク質濃度は２０ｇ／Ｌである。したがって、添加される緩衝液の容量は約１.６５Ｌである。
この懸濁液を１６０００ｒｐｍでＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズし、次いで、完全な可溶化が得られるまで温度を２２±３℃に維持してマグネチックスターラーで撹拌する。該混合物を２２±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離して溶液を透明にする；次いで、該溶液を無菌的にＳｐｉｒａｌ Ｃａｐ ０.８／０.２μｍで濾過する。濾過した上清の容量は約１.６Ｌである。
【００３７】
硫酸アンモニウムでの沈殿
上清を、マグネチックスターラーで撹拌しながら、１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７.５の溶液で２倍希釈する。遅くてかつ均一な流速でペリスタポンプの助けにより、得られた溶液を３０分間にわたって添加して最終的に０.５Ｍの(ＮＨ4)2ＳＯ4を含有するタンパク質１０ｇ／Ｌの溶液を得る。該媒質を２２±３℃で３０分間マグネチックスターラーで撹拌し続ける。次いで、実験室温度で一夜（１５時間）撹拌せずにインキュベーションを続けて、沈殿物を成熟させる。
翌朝、該混合物を２２±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離する。沈殿物を回収し、次いで、マグネチックスターラーで撹拌しながら、６Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７.５でタンパク質１０ｇ／Ｌに可溶化する（可溶化後の予想容量は約３.２Ｌ）。この懸濁液を１６０００ｒｐｍでＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズし、次いで、温度を２２±３℃に維持しながら可溶化が完了するまでマグネチックスターラーで撹拌する。
【００３８】
疎水的相互作用クロマトグラフィー
次いで、マグネチックスターラーで撹拌しながら、１.４ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）を添加することにより懸濁液を２倍希釈する。遅くてかつ均一な流速でペリスタポンプを使用してこの緩衝液を３０分間にわたって添加して最終的に５０ｍＭのＴｒｉｓ、０.７ＭのＮａＣｌ、３Ｍのグアニジンを含有するタンパク質５ｇ／Ｌの溶液（ｐＨ７.５）を得る。該媒質を２２±３℃で１５分間マグネチックスターラーで撹拌し続ける。
該混合物を２２±３℃で３０分間１００００ｇで遠心して溶液を透明にする；次いで、無菌的にＳｕｐｏｒ Ｃａｐ ０.８／０.２μｍで濾過する。濾過した上清の容量は約６Ｌである。
【００３９】
使用したカラムは以下の特徴を有する：
直径２０ｃｍおよび表面積３１４ｃｍ2のカラム（Ｈｉ Ｐｒｅｐ ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ Ｐｈａｒｍａｃｉａ − Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ゲル高さ：約２６ｃｍ；ゲル容量：約８Ｌ、ゲル１ｍＬあたりタンパク質３.２ｇの収容能力に相当。
【００４０】
カラムは以下のとおり調製される：
ゲルを洗浄し、次いで、（ｉ）５カラム容量の限外濾過した水で、次いで、（ii）３カラム容量の、３Ｍのグアニジン、０.７ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で、約６０ｍＬ／ｃｍ2・時（１９Ｌ／時）の流速で平衡化させる。カラムの流出口での緩衝液の伝導率およびｐＨ値は、以下の使用のための仕様に相当するべきである：２０℃での伝導率＝１３５ｍｓ／ｃｍ±１５％、および（ii）ｐＨ＝７.５±０.３。
【００４１】
クロマトグラフィーは以下のとおり行われる：
６０ｍＬ／ｃｍ2・時（１９Ｌ／時）の流速で濾液（全タンパク質２２〜２５ｇに相当）を注入することによりカラムに負荷する。次いで、ベースラインに戻るまで３Ｍのグアニジン、０.７ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で流速９０ｍＬ／ｃｍ2・時（２８Ｌ／時）で該カラムをすすぐ（２カラム容量）。次いで、ベースラインに戻るまで４Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で流速９０ｍｌ／ｃｍ2・時（２８Ｌ／時）でＡｌｐＡを溶出させる（１カラム容量）。溶出液の容量は約８Ｌである。
【００４２】
３０ｋＤａでの濃縮およびダイアフィルトレーション
限外濾過モデルを以下のとおり調製する：
表面積５０００ｃｍ2（合計表面積２００００ｃｍ2）を有し、３０ｋＤａのカットオフを有するポリエーテルスルホンで作製された４つの限外濾過カセットを使用してタンパク質約２０ｇを濃縮する。これらのカセットを０.５Ｎ ＮａＯＨで１時間洗浄し、次いで、限外濾過した水ですすぐ。
次いで、それらを、約８０Ｌ／時の出力を有するポンプを用いて、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で５分間平衡化させる。
ｒＡｌｐＡ溶出液を、４Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）中にてタンパク質約５ｇ／Ｌに濃縮する（濃縮率≒２.５）。限外濾過条件は以下のとおりである：（ｉ）流入圧力：約１バール、および（ii）限外濾液の流速：リテンテートの流速の半分。濃縮溶出液の容量は約３.５Ｌである。
濃縮したｒＡｌｐＡ溶出液を、濃縮と同一の条件下にて、流速約３０Ｌ／時で、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）１０容量（３５Ｌ）に対して、以下のものが得られるまでダイアフィルトレーションする：
（ｉ）８Ｍの尿素緩衝液の伝導率に相当するリテンテートの２０℃での伝導率：約２.８ｍＳ／ｃｍ±１５％；および
（ii）ダイアフィルトレーション緩衝液で限外濾過器を最後に連続２回すすいだ後のタンパク質濃度：約５ｇ／Ｌ。
ダイアフィルトレートされた濃縮溶出液の容量は約３.７Ｌである。
【００４３】
イオン交換クロマトグラフィー
使用したカラムは以下の特徴を有する：直径７ｃｍおよび表面積３８.５ｃｍ2を有するカラム（ＥＭＤ ＴＭＡＥ メルク（Merck））；ゲル高さ約１８ｃｍ；ゲル容量約７００ｍｌ。
【００４４】
クロマトグラフィーカラムは以下のとおり調製される：
ゲルを洗浄し、次いで、（ｉ）５カラム容量の限外濾過した水で、次いで、（ii）３カラム容量の、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で、流速約４Ｌ／時で平衡化する。カラムの流出口での緩衝液の伝導率およびｐＨの値は、使用のための以下の仕様に相当するべきである：２０℃での伝導率＝２.８ｍｓ／ｃｍ±１５％、およびｐＨ＝７.５±３。
【００４５】
クロマトグラフィーは以下のとおり行われる：
合計タンパク質１５〜１７ｇに相当するダイアフィルトレーション溶出液を流速１００ｍＬ／ｃｍ2・時（４Ｌ／時）で注入することによりカラムに負荷し、次いで、ベースラインに戻るまで８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で同じ流速ですすぐ（６カラム容量）。回収した濾液（約４Ｌ）は、エンドトキシンの不在下にて純度９０±５％のｒＡｌｐＡタンパク質を含有している。
【００４６】
濾過滅菌０.２μｍおよび最終生成物のバルク貯蔵
精製したｒＡｌｐＡ溶出液を、層流キャビネット中にて表面積１０００ｃｍ2のＳｕｐｏｒ Ｃａｐ １００ ０.８／０.２μｍタイプの濾過器にて濾過する。濾過滅菌した濃縮バルク容量は約４Ｌである。
得られたＡｌｐＡバッチの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定法により慣用的に評価され、９０％を超えるものである。全収率は、約５０％と推定される。
本発明の主題は、工業規模にて使用するのに必要とされる特徴を有するヘリコバクター（Helicobactor）ＡｌｐＡタンパク質の精製方法である。
【０００２】
ヘリコバクターはグラム陰性らせん細菌により特徴付けられる細菌の属である。いくつかの種は哺乳類の胃腸管にコロニー形成する。特に、ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori）、ヘリコバクター・ヘイルマニイ（H. heilmanii）、ヘリコバクター・フェリス（H. felis）およびヘリコバクター・ムステレ（H. mustelae）が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリはヒト感染に最も一般的に付随する種であり、稀に、ヒトからヘリコバクター・ヘイルマニイおよびヘリコバクター・フェリスを単離することもできた。ヘリコバクター型の細菌であるガストロスピリルム・ホミニス（Gastrospirillum hominis）もまたヒトに関して記述されている。
【０００３】
ヘリコバクターは先進国においては５０％を超える成人が感染しており、開発途上国においてはほぼ１００％の成人が感染しており、それにより世界中で優勢な感染因子の１つとなっている。
【０００４】
ヘリコバクター・ピロリは現在までのところもっぱらヒトの胃の粘膜の表面、特に、胃潰瘍および十二指腸潰瘍のクレーター病変の周囲で見つけられている。この細菌は、現在、幽門洞胃炎の病因因子として認識されており、潰瘍の発生に必要とされる補助因子の１つであるようである。さらにまた、胃癌の発生はヘリコバクター・ピロリの存在に付随していると考えられている。
【０００５】
したがって、ヘリコバクター感染の予防または治療のためにワクチンを開発することが非常に望まれている。
【０００６】
現在までのところ、ワクチン抗原としていくつかのヘリコバクタータンパク質、特に、膜起源のリポタンパク質ＡｌｐＡ（アドヘシン様リポタンパク質Ａ）が既に提案されている。初めにＡｌｐＡおよびそれをコードする遺伝子がWO96/41880に開示された。医薬用のバッチの調製を可能にする製造および精製方法は開発されていない。
【０００７】
かくして、本発明の主な目的は工業規模で使用され得る簡単かつ確固たる方法を提供することである。この方法により、特に、高価な投資を行うことなく多量の抗原の生産が可能になるにちがいない。
【０００８】
イー・コリは、組換え手法によりあらゆる種類の異種タンパク質を生成するために宿主生物として使用される特に優れた細菌である。これらのタンパク質がどうしても可溶性ではないかまたは排出されない場合、それらは封入体の形態で蓄積し得る。これらの封入体はイー・コリに特異的な細胞質内小体である。これらの封入体の出現は高レベルの発現（過剰発現）により促進される。組換えタンパク質を封入体から精製するには、特に、これらの封入体を予め可溶化することが必要である。この可溶化は慣用的にはカオトロピック剤（尿素、グアニジン）または界面活性剤により得られる。
【０００９】
イー・コリにおいて意図的に非脂質化形態で産生された組換えタンパク質ｒＡｌｐＡでも依然として高い疎水性を保持している。この高い固有の疎水性により、慣用的な手段によるその精製が困難となる。さらにまた、ｒＡｌｐＡタンパク質はイー・コリの封入体中にあり、実際、精製の間、高濃度のカオトロピック剤の存在が必要である。
【００１０】
ＡｌｐＡの高い疎水性のために中性ｐＨで可溶化するには高濃度のグアニジンが必要である；したがって、この薬剤は封入体を可溶化するための操作において必須の因子であると考えられる。それにもかかわらず、イオン的および疎水的相互作用を抑制するこの薬剤は、通常、クロマトグラフィーによる精製にはあまり使用されておらず、したがって、排除されるべきである。
【００１１】
一般に、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、著しい疎水性を有するタンパク質を精製するために一般的に使用される。しかしながら、上記したように、通常、グアニジンの存在が吸着を妨げるので、かかるタンパク質が高濃度のグアニジンを含有する媒質中に存在している場合にはこの種のクロマトグラフィーの使用は非常に問題となる。実際、慣用的な条件下でＨＩＣ支持体上に吸着され得るタンパク質の非常に多くが高濃度のグアニジンで溶出されると考えられる。
【００１２】
しかしながら、ＡｌｐＡに関して、この度、ＡｌｐＡを可溶性形態に維持させ、かつ、ＨＩＣ支持体上に吸着させる非常に狭いグアニジン濃度範囲が存在することを見出した。この範囲は、約２.５〜３.５Ｍである。
【００１３】
したがって、本発明の主題は、ヘリコバクター（例えば、ヘリコバクター・ピロリ）・アドヘシン様タンパク質Ａ（ＡｌｐＡ）の精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび２.５〜３.５Ｍのグアニジンを含有する調製物を疎水的相互作用クロマトグラフィー材料と接触させて該材料にＡｌｐＡを吸着させること、および（ii）３.５〜４.５Ｍのグアニジンを含有する溶液でＡｌｐＡを溶出させることを含む方法である。
【００１４】
好ましくは、クロマトグフィー材料と接触させられる調製物は３Ｍのグアニジンを含有しており、Ａｌｐは中性ｐＨ（６〜８；例えば、６.５〜７.５）で４Ｍのグアニジンで溶出される。
【００１５】
上記したとおり、グアニジンの存在下でＡｌｐを含有する調製物は、特に、（ａ）組換え形態でＡｌｐＡを発現する能力を有するグラム陰性細菌、特に、イー・コリ（E. coli）を培養すること、（ｂ）該培養物から細菌細胞を回収し、それらを溶解すること、（ｃ）該細胞中に含有される封入体を回収し、それらを洗浄し、それらを可溶化すること、および（ｄ）所望により、該封入体を沈殿させ、上清を除去し、沈殿物を可溶化することを含む製造方法により得られる。
【００１６】
以下に、さらに詳細に記載する。まず第一に、培養後に採集した細菌を溶解させる。細胞溶解は、種々の方法で、特に、顕微溶液化により行われ得る。特定の実施態様によると、溶解の間に細胞をベンゾナーゼで処理することも可能であり、その結果、イー・コリＤＮＡが消化される。次いで、封入体を、好ましくは、高濃度の塩を含有する緩衝液で、連続洗浄して、核酸を除去し、できる限り多くのｒＡｌｐＡを夾雑物から解離させる；適当には、該緩衝液は、ナトリウム緩衝液、例えば、０.５ＭのＮａＣｌを含有する緩衝液であり得る。最後に、封入体を、非常に高濃度、例えば、５.５〜６.５Ｍ、好ましくは、６Ｍのグアニジンに溶解させる。特定の実施態様によると、好ましくは、この段階で、硫酸アンモニウムを使用して「塩析」させることによってｒＡｌｐＡを選択的に沈殿させることにより（例えば、イー・コリ由来の）夾雑細菌タンパク質の一部を除去する。好ましくは、硫酸アンモニウムは、０.４〜０.６Ｍ、例えば、０.５Ｍである。ｒＡｌｐＡを含有する沈殿物を再度高濃度のグアニジン、例えば、５.５〜６.５Ｍ、好ましくは、６Ｍのグアニジンに可溶化させる。疎水的相互作用クロマトグラフィーを使用するために調製物を２倍に希釈し、次いで、適当なカラムに負荷する。
【００１７】
疎水的相互作用クロマトグラフィーは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM（ファルマシア（Pharmacia））およびＦｒａｃｔｏｇｅｌTM（メルク（Merck））のような支持体、またはトーソーハース（Tosohaas）もしくはバイオラド（Biorad）から入手される支持体のような後者と同等の支持体を使用して慣用手段にて行われ得る。配位子は、ブチル、オクチルまたはフェニルであり得る。ＨＩＣは、特に、ＡｌｐＡタンパク質をその分解物から分離させることができる。
【００１８】
好ましい実施態様によると、ＨＩＣから得られた溶出液を種々の方法で、特に、限外濾過により、濃縮することができ、毒性物質であるグアニジンを除去することもまた好ましい。このために、モル濃度４Ｍまたはそれ以上、好ましくは、６Ｍまたはそれ以上、好ましくは、８Ｍの尿素を含有する数倍の容量の中性緩衝溶出液に対してダイアフィルトレーション工程、例えば、タンジェンシャル・ダイアフィルトレーション（diafiltration tangentielle）工程を使用することが可能である；尿素はｒＡｌｐＡを確実に可溶性形態で維持するために存在している。有利な実施態様によると、６〜１０倍の容量の７.５〜８.５Ｍの尿素を使用する。
【００１９】
最後に、精製を完了させるために、イオン交換クロマトグラフィー、特に、陰イオン交換クロマトグラフィーによる「研磨（polissage）」を行ってイー・コリ由来の残存夾雑物を除去することが可能である。適当な実施態様によると、後者の工程は、８Ｍの尿素の存在下にて行われる。次いで、ダイアフィルトレーションから得られたｒＡｌｐＡ調製物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料に負荷する；夾雑物はこの材料に吸着されるが、一方、ｒＡｌｐＡは吸着されず、濾液（直接溶出液とも称される）中にて見出される。８Ｍの尿素の存在は、以下の理由により不可欠である：ＡｌｐＡは、陽性荷電タンパク質（非常に高いｐＩ）であり、したがって、通常、陰イオン交換クロマトグラフィー材料に吸着されないはずである。しかしながら、その疎水性は非常に著しく、８Ｍの尿素が調製物にない場合には吸着されるであろう。
【００２０】
この点について、本発明は、また、ＡｌｐＡの精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび７.５〜８.５Ｍ、好ましくは、８Ｍの尿素を含有する調製物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料と接触させてこの材料に夾雑物を吸着させること、および（ii）濾液からＡｌｐＡを回収することを含む方法に関する。
【００２１】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM（ファルマシア）およびＦｒａｃｔｏｇｅｌTM（メルク）のような支持体、またはトーソーハースもしくはバイオラドから入手される支持体のような後者と同等の支持体を用いて慣用手段にて行われ得る。該配位子は、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）のような３級アミン、またはＱ（４級、ヒドロキシプロピルジエチルアミノエチル）およびＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）のような４級アミンであり得る。
【００２２】
本発明の主題であるＡｌｐＡの精製方法は、総体的に、特に、最初に多量に処理する場合を考慮すると、目的のタンパク質が前例のないレベルの純度に達することを可能にする。したがって、本発明は、また、以下のものに関する：
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定法により測定した場合に純度９０％またはそれ以上の単量体により特徴付けられるＡｌｐＡタンパク質。単量体形態以外の残部は多量体形態のＡｌｐＡタンパク質からなる。全体的な純度は、９９％またはそれ以上である。
ＡｌｐＡタンパク質を少なくとも５ｇ、好ましくは、少なくとも１０ｇ、最も好ましくは、少なくとも１５ｇ含有する調製物であって、該ＡｌｐＡタンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定により測定した場合に純度９０％またはそれ以上の単量体により特徴付けられる調製物。この調製物が１つのバッチを構成し、すなわち、単一の培養物および精製方法の個別の実行により得られたことは全く明白である。
【００２３】
別法として、封入体が、グアニジンの代わりに塩基性ｐＨ、好ましくは、ｐＨ１０.５またはそれ以上、例えば、ｐＨ１１の緩衝液中の７.５〜８.５Ｍ、好ましくは、８Ｍの尿素を使用することにより可溶化され得ることもまた見出された。有利には、リン酸緩衝液を使用する。可溶化が達成されると、尿素のモル濃度を４.５〜５.５Ｍ、例えば、５Ｍに減少させ、ｐＨもまた中性付近、例えば、７.５に低下させる。これはＴｒｉｓ緩衝液で希釈することにより行われ得る。次いで、ＨＩＣを行ってＡｌｐＡを７.５〜８.５Ｍ、例えば、８Ｍの尿素で希釈する。
【００２４】
したがって、本発明の主題は、また、ヘリコバクター・アドヘシン様タンパク質Ａ（ＡｌｐＡ）の精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび４.５〜５.５Ｍの尿素を含有する調製物を疎水的相互作用クロマトグラフィー材料と接触させて該材料にＡｌｐＡを吸着させること、および（ii）７.５〜８.５Ｍの尿素を含有する溶液でＡｌｐＡを溶出させることを含む方法である。
【００２５】
（実施例）
発現系
誘導発現系を構築してイー・コリ（E. coli）中にてヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）ＡｌｐＡタンパク質を生産させた。使用したベクターは、プラスミドｐＥＴ２８ｃ（ノバジェン（Novagen））由来のものであった。このベクターは、
Ｔ７バクテリオファージ・プロモーターの制御下での発現カセット、
該プロモーターの下流での目的遺伝子のクローニング用のポリリンカー、
Ｔ７バクテリオファージ由来の転写ターミネーター、および
カナマイシン耐性遺伝子
を含む。
【００２６】
該プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下にて正に調節される。
【００２７】
発現のために、種々の遺伝的に修飾されたイー・コリ株、とりわけ、ＢＬ２１λＤＥ３株（Studier, F. W. et al., 1990 Meth. Enzymol 185, 60-69）を使用することができる。これらの株は、ＩＰＴＧの添加により誘導可能な、ｌａｃ ＵＶ５プロモーターの制御下でＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含有する。さらにまた、ＢＬ２１λＤＥ３株は、ＯｍｐＴおよびＬｏｎプロテアーゼ活性を欠損している。
【００２８】
ＤＮＡ供給源としてヘリコバクター・ピロリＸ４７−２（ＯＲＶ ２００１）株を使用したＰＣＲ増幅法により、成熟ＡｌｐＡタンパク質をコードしている配列を含有する１.６ＫｂのＤＮＡフラグメントを得た。クローニングのために使用されるＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位は、各々、５'（ＨＰ３ Ｎｃｏ Ｃ−）および３' ＨＰ３（Ｘｈｏ）ＰＣＲプライマーに含まれている。脂質化部位［システインコドン（ＴＧＣコドン）］をＡＴＧ開始コドン（Ｍｅｔ）に置換した。まず、ＰＣＲ増幅フラグメントをシャトルベクターＴｏｐｏ ＴＡ（インビトロジェン（Invitrogen））中にクローン化し、次いで、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位を使用してｐＥＴ２８ｃ中に移した。
【００２９】
ＰＣＲ増幅条件は以下のとおりであった：９７℃／３０秒；５５℃／１分；７２℃／５０秒；Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ − ２５サイクル。
【化１】
【００３０】
前培養および培養
各々、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた改変２Ｘ Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地（ペプトンに代えて３０ｇ／Ｌの酵母エキスを使用した）５００ｍｌを入れた２リットルのエルレンマイヤーフラスコにイー・コリＢＬ２１ＤＥ３／ｐＭＨｐ３.１接種物のバッチ５００μＬを接種し、１７５ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１５〜１８時間インキュベートする。
【００３１】
この前培養物を、４４ｇ／ｌのグルコース・一水和物および５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたＳＫＹＥ ４培地（１リットルあたり、酵母エキス４０ｇ；１ＭのＭｇＣｌ2 ３ｍｌ；Ｋ2ＳＯ4 ５３０ｍｇ；ＮａＣｌ １ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4 ８４４ｇ）を入れた３０Ｌの発酵槽（ベー・ブラウン（B Braun））に接種する。該接種物は、全容量の５％に相当する。培養パラメーターは以下のとおりである：ｐＨ：７.００；調節：１０％Ｈ3ＰＯ4および２８％ＮＨ4ＯＨ；温度：３７℃；初期撹拌：２００ｒｐｍ；初期空気流速：１ ｌ／ｌ培養物／分；ＰＯ２：３０％、調節：（１）２００ｒｐｍ〜７００ｒｐｍでの撹拌、（２）空気流速２０％〜６０％、（３）Ｏ2流速０％〜１００％。
【００３２】
培養を３時間以上続ける。６００ｎｍでのＯＤが２５〜３５の時点で、１ｍＭの最終濃度を得るために必要な容量のＩＰＴＧ（２００ｍＭ）を添加することによりＡｌｐＡの発現を誘導する。２時間の誘導後、すぐに培養物を冷却する。７０００ｇで２０分間遠心分離することにより細胞を得、ペレットを−３５℃で貯蔵する。
封入体の調製
微生物の懸濁および湿ペレットの処理
細胞ペレット５００ｇ（湿重量）（約５Ｌの培養物に相当）を５±３℃で一夜解凍し、予め５±３℃に冷却した５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８.０に、細胞ペレット１ｇあたり緩衝液７ｍｌの割合で、すなわち、５００ｇあたり３.７５Ｌの割合で懸濁させる。この懸濁液の予想容量は４.２５Ｌである。この懸濁液を、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて、氷浴上にて５±３℃に温度を維持して３０〜６０秒のサイクルを２〜３回繰り返してホモジナイズする。
【００３３】
−２０℃で貯蔵していた２５０ＩＵ／μＬの貯蔵液から２.５ＩＵ／μＬのベンゾナーゼの溶液を新しく調製する（すなわち、２０μＬ＋１９８０μＬの５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８.０）。次いで、この溶液１７００μＬを１００ｍＭのＭｇＣｌ2 ４２.５ｍｌに添加する。この調製物を全て、微生物の懸濁液に注ぐ。該混合物を５±３℃でマグネチックスターラーで撹拌しながら少なくとも３０分間インキュベートする。
【００３４】
細胞の破砕
ホモジナイズされた細胞を、１０００バールの固定した圧力下にてＰＡＮＤＡ細胞ディスインテグレーターを使用して、冷却系（＋５℃に調節したクリオスタット）を使用して、１５℃以下の温度で破砕サイクルを３回繰り返して破砕する。破砕前のＯＤ／最終破砕後のＯＤの比率は≧４.５となるべきである。
【００３５】
封入体の洗浄
破砕サイクルを３回繰り返した後の封入体の懸濁液を５±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離して夾雑物（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびリポ多糖など）を除去する。
遠心分離後、ペレットを回収し、次いで、５±３℃に冷却した、０.５ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.０）４.２５Ｌに再懸濁する。タンパク質濃度は約８ｇ／Ｌである。この懸濁液を、該懸濁液を５±３℃に維持するように氷浴上にてＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズし、次いで、５±３℃で３０分間マグネチックスターラーで撹拌する。このようにして洗浄した懸濁液を５±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離する。
洗浄操作を２回繰り返す。かくして、洗浄した封入体１１０ｇ（洗浄した封入体１ｇあたりタンパク質約０.３ｇ）を得る。−２０℃で貯蔵可能である。
【００３６】
封入体からの精製
封入体の可溶化
次いで、封入体を、６Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）に可溶化させる。得られる最終タンパク質濃度は２０ｇ／Ｌである。したがって、添加される緩衝液の容量は約１.６５Ｌである。
この懸濁液を１６０００ｒｐｍでＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズし、次いで、完全な可溶化が得られるまで温度を２２±３℃に維持してマグネチックスターラーで撹拌する。該混合物を２２±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離して溶液を透明にする；次いで、該溶液を無菌的にＳｐｉｒａｌ Ｃａｐ ０.８／０.２μｍで濾過する。濾過した上清の容量は約１.６Ｌである。
【００３７】
硫酸アンモニウムでの沈殿
上清を、マグネチックスターラーで撹拌しながら、１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７.５の溶液で２倍希釈する。遅くてかつ均一な流速でペリスタポンプの助けにより、得られた溶液を３０分間にわたって添加して最終的に０.５Ｍの(ＮＨ4)2ＳＯ4を含有するタンパク質１０ｇ／Ｌの溶液を得る。該媒質を２２±３℃で３０分間マグネチックスターラーで撹拌し続ける。次いで、実験室温度で一夜（１５時間）撹拌せずにインキュベーションを続けて、沈殿物を成熟させる。
翌朝、該混合物を２２±３℃で３０分間１００００ｇで遠心分離する。沈殿物を回収し、次いで、マグネチックスターラーで撹拌しながら、６Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７.５でタンパク質１０ｇ／Ｌに可溶化する（可溶化後の予想容量は約３.２Ｌ）。この懸濁液を１６０００ｒｐｍでＵｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズし、次いで、温度を２２±３℃に維持しながら可溶化が完了するまでマグネチックスターラーで撹拌する。
【００３８】
疎水的相互作用クロマトグラフィー
次いで、マグネチックスターラーで撹拌しながら、１.４ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）を添加することにより懸濁液を２倍希釈する。遅くてかつ均一な流速でペリスタポンプを使用してこの緩衝液を３０分間にわたって添加して最終的に５０ｍＭのＴｒｉｓ、０.７ＭのＮａＣｌ、３Ｍのグアニジンを含有するタンパク質５ｇ／Ｌの溶液（ｐＨ７.５）を得る。該媒質を２２±３℃で１５分間マグネチックスターラーで撹拌し続ける。
該混合物を２２±３℃で３０分間１００００ｇで遠心して溶液を透明にする；次いで、無菌的にＳｕｐｏｒ Ｃａｐ ０.８／０.２μｍで濾過する。濾過した上清の容量は約６Ｌである。
【００３９】
使用したカラムは以下の特徴を有する：
直径２０ｃｍおよび表面積３１４ｃｍ2のカラム（Ｈｉ Ｐｒｅｐ ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ Ｐｈａｒｍａｃｉａ − Ａｍｅｒｓｈａｍ）；ゲル高さ：約２６ｃｍ；ゲル容量：約８Ｌ、ゲル１ｍＬあたりタンパク質３.２ｇの収容能力に相当。
【００４０】
カラムは以下のとおり調製される：
ゲルを洗浄し、次いで、（ｉ）５カラム容量の限外濾過した水で、次いで、（ii）３カラム容量の、３Ｍのグアニジン、０.７ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で、約６０ｍＬ／ｃｍ2・時（１９Ｌ／時）の流速で平衡化させる。カラムの流出口での緩衝液の伝導率およびｐＨ値は、以下の使用のための仕様に相当するべきである：２０℃での伝導率＝１３５ｍｓ／ｃｍ±１５％、および（ii）ｐＨ＝７.５±０.３。
【００４１】
クロマトグラフィーは以下のとおり行われる：
６０ｍＬ／ｃｍ2・時（１９Ｌ／時）の流速で濾液（全タンパク質２２〜２５ｇに相当）を注入することによりカラムに負荷する。次いで、ベースラインに戻るまで３Ｍのグアニジン、０.７ＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で流速９０ｍＬ／ｃｍ2・時（２８Ｌ／時）で該カラムをすすぐ（２カラム容量）。次いで、ベースラインに戻るまで４Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で流速９０ｍｌ／ｃｍ2・時（２８Ｌ／時）でＡｌｐＡを溶出させる（１カラム容量）。溶出液の容量は約８Ｌである。
【００４２】
３０ｋＤａでの濃縮およびダイアフィルトレーション
限外濾過モデルを以下のとおり調製する：
表面積５０００ｃｍ2（合計表面積２００００ｃｍ2）を有し、３０ｋＤａのカットオフを有するポリエーテルスルホンで作製された４つの限外濾過カセットを使用してタンパク質約２０ｇを濃縮する。これらのカセットを０.５Ｎ ＮａＯＨで１時間洗浄し、次いで、限外濾過した水ですすぐ。
次いで、それらを、約８０Ｌ／時の出力を有するポンプを用いて、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で５分間平衡化させる。
ｒＡｌｐＡ溶出液を、４Ｍのグアニジンを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）中にてタンパク質約５ｇ／Ｌに濃縮する（濃縮率≒２.５）。限外濾過条件は以下のとおりである：（ｉ）流入圧力：約１バール、および（ii）限外濾液の流速：リテンテートの流速の半分。濃縮溶出液の容量は約３.５Ｌである。
濃縮したｒＡｌｐＡ溶出液を、濃縮と同一の条件下にて、流速約３０Ｌ／時で、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）１０容量（３５Ｌ）に対して、以下のものが得られるまでダイアフィルトレーションする：
（ｉ）８Ｍの尿素緩衝液の伝導率に相当するリテンテートの２０℃での伝導率：約２.８ｍＳ／ｃｍ±１５％；および
（ii）ダイアフィルトレーション緩衝液で限外濾過器を最後に連続２回すすいだ後のタンパク質濃度：約５ｇ／Ｌ。
ダイアフィルトレートされた濃縮溶出液の容量は約３.７Ｌである。
【００４３】
イオン交換クロマトグラフィー
使用したカラムは以下の特徴を有する：直径７ｃｍおよび表面積３８.５ｃｍ2を有するカラム（ＥＭＤ ＴＭＡＥ メルク（Merck））；ゲル高さ約１８ｃｍ；ゲル容量約７００ｍｌ。
【００４４】
クロマトグラフィーカラムは以下のとおり調製される：
ゲルを洗浄し、次いで、（ｉ）５カラム容量の限外濾過した水で、次いで、（ii）３カラム容量の、８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で、流速約４Ｌ／時で平衡化する。カラムの流出口での緩衝液の伝導率およびｐＨの値は、使用のための以下の仕様に相当するべきである：２０℃での伝導率＝２.８ｍｓ／ｃｍ±１５％、およびｐＨ＝７.５±３。
【００４５】
クロマトグラフィーは以下のとおり行われる：
合計タンパク質１５〜１７ｇに相当するダイアフィルトレーション溶出液を流速１００ｍＬ／ｃｍ2・時（４Ｌ／時）で注入することによりカラムに負荷し、次いで、ベースラインに戻るまで８Ｍの尿素を含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７.５）で同じ流速ですすぐ（６カラム容量）。回収した濾液（約４Ｌ）は、エンドトキシンの不在下にて純度９０±５％のｒＡｌｐＡタンパク質を含有している。
【００４６】
濾過滅菌０.２μｍおよび最終生成物のバルク貯蔵
精製したｒＡｌｐＡ溶出液を、層流キャビネット中にて表面積１０００ｃｍ2のＳｕｐｏｒ Ｃａｐ １００ ０.８／０.２μｍタイプの濾過器にて濾過する。濾過滅菌した濃縮バルク容量は約４Ｌである。
得られたＡｌｐＡバッチの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定法により慣用的に評価され、９０％を超えるものである。全収率は、約５０％と推定される。
Claims (18)
- ヘリコバクター（Helicobacter）・アドヘシン様タンパク質Ａ（ＡｌｐＡ）の精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび２.５〜３.５Ｍのグアニジンを含有する調製物を疎水的相互作用クロマトグラフィー材料と接触させて該材料にＡｌｐＡを吸着させること、および（ii）３.５〜４.５Ｍのグアニジンを含有する溶液でＡｌｐＡを溶出させることを含む方法。
- 工程（ｉ）で使用する調製物が３Ｍのグアニジンを含有する請求項１記載の方法。
- 工程（ii）で使用する溶液が４Ｍのグアニジンを含有する請求項２記載の方法。
- 工程（ｉ）で使用する調製物が組換え型にてＡｌｐＡを発現する能力を有するグラム陰性細菌、特に、イー・コリ（E. coli）の培養物から得られる調製物である請求項１、２または３記載の方法。
- 細菌細胞を破砕し、封入体を洗浄および可溶化した後に工程（ｉ）で使用する調製物を得る請求項４記載の方法。
- 封入体の可溶化を５.５〜６.５Ｍのグアニジン中にて行う請求項５記載の方法。
- 封入体の可溶化を６Ｍのグアニジン中にて行う請求項６記載の方法。
- 細菌細胞を破砕し、封入体を洗浄および可溶化し、可溶化された封入体を硫酸アンモニウムで沈殿させ、沈殿物を可溶化した後に工程（ｉ）で使用する調製物を得る請求項５、６または７記載の方法。
- 封入体および／または沈殿物の可溶化を５.５〜６.５Ｍのグアニジン中にて行う請求項８記載の方法。
- 沈殿物の可溶化を６Ｍのグアニジン中にて行う請求項９記載の方法。
- 疎水的相互作用クロマトグラフィー材料が、（ｉ）ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌTMである支持体、および（ii）ブチル、オクチルまたはフェニルである配位子を含む請求項１〜１０いずれか１項記載の方法。
- 工程（ii）において行われる溶出の後に得られるＡｌｐＡを７.５〜８.５Ｍの尿素に懸濁させ、次いで、イオン交換クロマトグラフィー材料にて精製する請求項１〜１１いずれか１項記載の方法。
- 工程（ii）において得られ、濃縮されていてもよい溶出液を６〜１０容量の７.５〜８.５Ｍの尿素に対してダイアフィルトレーションすることによりＡｌｐＡを尿素に懸濁させる請求項１２記載の方法。
- 工程（ii）において行われる溶出の後に得られるＡｌｐＡを８Ｍの尿素に懸濁させる請求項１２または１３記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー材料が（ｉ）ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMまたはＦｒａｃｔｏｇｅｌTMである支持体、および（ii）３級アミンまたは４級アミンである配位子を含む請求項１１〜１４いずれか１項記載の方法。
- ＡｌｐＡの精製方法であって、（ｉ）ＡｌｐＡおよび７.５〜８.５Ｍ、好ましくは、８Ｍの尿素を含有する調製物を陰イオン交換クロマトグラフィー材料と接触させて該材料に夾雑物を吸着させること、および（ii）濾液中にＡｌｐＡを回収することを含む方法。
- ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定法により測定した場合に純度９０％またはそれ以上の単量体により特徴付けられるＡｌｐＡタンパク質。
- ＡｌｐＡタンパク質を少なくとも５ｇ含む調製物であって、該ＡｌｐＡがＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色法および濃度測定法により測定した場合に純度９０％またはそれ以上の単量体により特徴付けられる調製物。
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