JPH09503395A - エリトリナ・カフラ由来の組換え阻害物質のセリンプロテアーゼ精製への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 エリトリナ・カフラ（Erythrina caffra）由来の阻害物質 DE-3 の活性をもつ固定化ポリペプチドへのセリンプロテアーゼの結合，タンパク質の混合物からの非結合成分の除去，可溶性セリンプロテアーゼからの固定化阻害物質の分離及びセリンプロテアーゼの単離によってタンパク質混合物からセリンプロテアーゼを精製するために，前記ポリペプチドとして外因性核酸の原核及び真核発現生成物であって陰イオン交換体，陽イオン交換体又はニッケルキレートカラムを通してクロマトグラフィー的に精製したポリペプチドを使用することを特徴とするセリンプロテアーゼの精製方法。前記阻害物質は，改良された比活性により区別され、そしてプラスミノーゲン アクチベーター、例えば組織型プラスミノーゲンアクチベーター（t-pA及び誘導体）の精製のために特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 エリトリナ・カフラ由来の組換え阻害物質のセリンプロテアーゼ精製への使用 この発明は，エリトリナ・カフラ（Erythrina caffra）由来の組換え阻害物質 DE-3 を使用してセリンプロテアーゼを精製する改良された方法に関する。エリ トリナ・カフラ由来の固定化トリプシン阻害物質（ＥＴＩ）は，セリンプロテア ーゼ，特にプラスミノーゲンアクチベーター（C.Heussen，J.Biol.Chem.，259（ 1984）11635-11638），β-トリプシン，α-キモトリプシン及びトロンビン（S.O nesti et al.，J.Mol.Recogn．５（1992）105-114）をアフィニティークロマト グラフィーにかけて精製するために有効な試薬である。これらのトリプシン阻害 物質は以前から公知である（C.Heussen，Haemostasis 11（1982）P47（補遺）； F.J.Joubert，Phytochemistry 21（1982）1213-1217，F.J.Joubert，Int.J.Bioc hem．14（1982）187-193）。 エリトリナ・カフラ由来の阻害物質 DE-3 はアフィニティークロマトグラフィ ーによってプラスミノーゲンアクチベーターを精製するのに特に優れている（F. J.Joubert in Trom-bosis and Haemostasis 57（1987）356-360）。本文献には 該阻害物質の完全なアミノ酸配列も記載されている。DE-3はエリトリナ・カフラ の種子から単離，精製され得る（F.J．Joubert，Int.J.Biochem．14（1982）187 -193）。 Teixeiraら、Teixeira et al.，Biochemica et Biophysica Acta 1217（1994 ）16-22，により組換えＥＴＩが記載されており，その組織型プラスミノーゲン アクチベーターに対する比阻害活性は1.7 ×10⁹ U/mmolである。これに対して天然のＥＴＩの比阻害活性は1.94×10⁹ U/mm olである。同様に表すとトリプシンに対する阻害活性は（2.63×10¹²/3.21×10^{1 2} ）である。Teixeiraが合成した組換えＥＴＩのトリプシン及び組織型プラスミ ノーゲンアクチベーターに対する比阻害活性は天然のＥＴＩの比べて２０％だけ 小さい。 組換えＥＴＩはTeixeiraの抽圧出法により得られ，硫酸アンモニウム沈殿（８ ０％飽和），水に対する透析及び臭化シアン分離で精製され，ここでメチオニン を含むＮ末端配列が開裂される。引き続いてアフィニティークロマトグラフィー のカラム上でクロマトグラフィー処理される（Sephadex G50）。 発明の課題は，ＥＴＩを使用してセリンプロテアーゼを精製する方法の効率を 改良することにある。 発明の対象は，エリトリナ・カフラ由来の組換え阻害物質 DE-3 の活性をもつ 固定化ポリペプチドへのセリンプロテアーゼの結合，タンパク質の混合物からの 非結合成分の除去，阻害物質からのセリンプロテアーゼの分離，可溶性セリンプ ロテアーゼからの固定化阻害物質の分離及びセリンプロテアーゼの単離によって タンパク質混合物からセリンプロテアーゼを精製する方法であり，その特徴は， ポリペプチドとして外因性核酸（好ましくはＤＮＡ）の原核及び真核発現生成物 であるポリペプチドを使用し，陰イオン交換体，陽イオン交換体又はニッケルキ レートカラムを通してクロマトグラフィー的に精製したポリペプチドを使用する ことにある。 エリトリナ・カフラ由来の阻害物質 DE-3 の活性をもち発明の方法で製造した 組換えポリペプチドは，天然源から単離されたエリトリナ・カフラ由来の阻害物 質 DE-3 に比べて驚くべきことにセリンプロテアーゼに対する比アフィニティが 明らかに高いことが見出された。 エリトリナ・カフラ由来の阻害物質 DE-3 の「活性」とは，本質的にセリンプ ロテアーゼ，特に組織型プラスミノーゲンアクチベーターに対する比阻害活性を 意味する。ここで阻害物質の比阻害活性はトリプシンに対して1.07 U/mg又はこ れより高い。阻害作用は，阻害物質とセリンプロテアーゼの間の結合によって起 こる。 発明の方法は，組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）及びその 誘導体 （例えば，突然変異及び欠失）などのプラスミノーゲンアクチベーターの精製に 特に優れた適性を示す。ｔ−ＰＡ及びその誘導体は，例えば欧州特許EP-B 0 093 619，米国特許USP 5,223,256，国際特許WO 90/09437及びT.J.R.Harris，Protei n Engi-neering 1（1987）449-458に記載される。 組換え阻害物質の製造は当業者によく知られる方法で行うことができる。 この目的のためにまず、これは阻害物質 DE-3 の活性を示すタンパク質を生産 することができる核酸（好ましくはＤＮＡ）が製造される。ＤＮＡはベクター中 にクローニングされ，これは宿主細胞に伝達されて複製される。この種のベクタ ーはさらに阻害物質配列のためのオペレーター要素を含有するが，これはＤＮＡ の発現のために必要とされる。この阻害物質ＤＮＡ及びオペレーター要素を含む ベクターは，阻害物質のＤＮＡを発現することができるベクターへ伝達される。 宿主細胞は，阻害物質の発現を許容する条件下で培養される。これらの細胞から 阻害物質が得られる。このとき適切な処置をとればアクチベーターが活性三次構 造をとり確実に阻害物質の性質を示すことができる。 ここで阻害物質が配列番号：２に相当する正確なアミノ酸配列をとる必要はな い。同様に本質的に同様な配列をもち，エリトリナ・カ フラ由来の阻害物質 DE-3 の活性（セリンプロテアーゼ，特にｔ−ＰＡに対する 結合能力）を示すポリペプチドである阻害物質が適している。アミノ酸配列の類 似性が８０％，好ましくは９０％であれば有利であることが分かった。しかし， 配列番号：２によるアミノ酸配列を使用すると有利であり，ここで原核宿主細胞 が発現する場合にはＮ末端メチオニンが含まれるが，真核発現の場合にはＮ末端 メチオニンが含まれない。 さらに発明の対象は，本質的に配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 と同 一であり，エリトリナ・カフラ由来の阻害物質E-3 の活性をもつポリペプチドを コードする核酸，又は遺伝コドンの縮生する枠内において同じポリペプチドをコ ードする核酸である。これにはＤＮＡが優れているが，特に配列番号：１記載の 配列 9〜527 のＤＮＡが好ましい。真核又は原核宿主細胞において発現するため に，核酸は５’−末端に当業者によく知られる真核又は原核の転写及び翻訳シグ ナルを含む。 阻害物質の核酸配列は配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 に一致するこ とが好ましい。いずれにしてもベクターの作製を簡易にし，発現を最適にするた めに修飾が施される。この種の修飾には次ぎの例がある： - 連結，クローニング及び突然変異の過程を容易にする目的で制限酵素の種々の 認識配列を導入するための核酸の修飾。 - 宿主細胞に対し好ましいコドンを構築するための核酸の修飾。 - 宿主細胞における発現を最適にするための追加のオペレーター要素による核酸 延長。 阻害物質の発現は大腸菌のような微生物内で起こることが好ましい。酵母，Ｃ ＨＯ細胞又は昆虫細胞のような真核細胞における発現もまた可能である。 ここで生物学的に機能できるプラスミド又はＤＮＡウイルスベクターが使用さ れるが，これらは本質的に配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 又は遺伝暗 号が縮退する枠内において同種のポリペプチドをコードする核酸を含む。この種 のベクターにより原核及び真核宿主細胞は安定したトランスフォーメイション又 はトランスフェクションされる。 発現ベクターは，宿主生物の中で阻害タンパク質の発現を可能にするプロモー ターをもたなければならない。この種のプロモーターは当業者に知られ，例えば lacプロモーター（Chang et al.，Nature 198（1977）1056），trp（Goeddel e t al.，Nuc.Acids Res．８（1980）4057）,λPLプロモーター（Shimatake et al .，Nature 292（1981）128）及びＴ５プロモーター（米国特許US 4,689,406）が ある。同様に，例えばtacプロモーター（米国特許US 4,551,433）のような合成 プロモーターも適している。同じように，例えばＴ7-RNA-ポリメラーゼ/ プロモ ーターシステム（Studier et al.，J.Mol.Biol．189（1986）113）のようなプロ モーターシステムの組合せが適する。同様に細菌ファージプロモーター及び微生 物のオペレーター部位から成るハイブリッドプロモーターが適する（欧州特許 E P-A 0 267 851）。これに加えてプロモーターには効果的に働くリボソーム結合 部位が必要である。大腸菌についてはこのリボソーム結合部位配列はシャイン・ ダルガーノ（SD）配列として記載される（Shineet al.，Nature（1975）25434; J.Sambrook et al.，“Expression of cloned genes in E．coll”in Molecular Cloning; A laboratory manual（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press ，USA）。 阻害タンパク質を融合タンパク質として発現すれば発現の改良が可能である。 この場合は，ふつう内因性細菌タンパク質のＮ末端部又は他の安定型タンパク質 をコードするＤＮＡが，阻害タンパク質 をコードする配列のS'末端に融合される。この例としてlacZ，trpE がある。 発現のあとで融合タンパク質は好ましくは酵素（例えば，因子Xa）により開裂 される（Nagai et al.，Nature 309（1984）810）。開裂部位のほかの例としてI gA-プロテアーゼ-開裂部位（国際特許 WO 91/11520）及びユビキチン開裂部位（ Miller et al.，Bio/ Technology７（1989）698）がある。 最初に不活性な封入体として得られる組換えタンパク質は，当業者がよく知る 方法によって可溶性の活性タンパク質に転換される。このために封入体は，例え ば還元剤の存在下で塩酸グアニジン又は尿素によって可溶化され，還元され，還 元剤は，例えば透析により除去され，おもに還元型及び酸化型グルタチオンのよ うなレドックス系を使用して再生される。 この種の方法は，例えば米国特許 US-P 4,933,434，欧州特許 EP-B 0 241 022 及び欧州特許EP-A 0 219 874に記載される。 同様にタンパク質を活性タンパク質として微生物から分泌させることが可能で ある。このためにも融合タンパク質が使用されるが，これは使用する宿主生物の 中でタンパク質の分泌に適したシグナル配列及び阻害タンパク質をコードする核 酸から構成される。ここでタンパク質は，培地（グラム陽性菌の場合）又はペリ プラズム空間（グラム陰性菌の場合）へ分泌される。シグナル配列と阻害物質を コードする配列の間には目的に応じ開裂部位が付けられ，これはプロセッシング 又は追加の過程において阻害タンパク質の開裂を可能にする。この種のシグナル 配列は，例えばompA（Ghrayeb et al.，EMBO J.3（1984）2437）,及びphoA（Oka et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82（1985）7212）である。 ベクターはさらにターミネーターを含有する。ターミネーターは 転写過程の終わりをシグナル化するＤＮＡ配列である。ターミネーターはたいて い２種の構造特性で表されるが，これは分子内に二重らせんを形成することがで きる逆位反復Ｇ／Ｃリッチ部位並びに若干数のＵ残基（乃至はＴ残基）である。 この例として trp-アテニュエーター並びにファージfd 及び ＢのＤＮＡの中 のターミネーターがある（Brosius et al.，J．Mol．Biol．148（1981）107-127 ）。 そのほか発現ベクターはふつう選択遺伝子を含有して形質変換細胞を選択する 。この種の選択遺伝子には，例えばアンピリシン，クロラムフェニコール，エリ スロマイシン，カナマイシン，ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する抵抗 性遺伝子がある（Davies et al.，Ann.Rev.Microbiol．32（1978）469）。同様 に適切な選択マーカーとは，例えばヒスチジン，トリプトファン及びロイシンな どの細胞に必要な物質を生合成するための本質的な物質に対する遺伝子である。 多数の適当な細菌ベクターが知られている。例えば，次ぎの細菌ベクターの記 述がある：枯草菌（Palva et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79（1982）558 2），大腸菌（Aman et al.，Gene 40（1985）183，Studier et al.，J．Mol．Bi ol．189（1986）113），ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus crem oris）（Powell et al.，Appl．Environ．Microbiol．54（1988）655），ストレ プトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividuns）及びストレプトマイカス ・リビダンス（米国特許 US 4,747,056）。 阻害タンパク質の発現は，原核微生物のほかに真核微生物（例えば，ＣＨＯ細 胞，酵母又は昆虫細胞など）でも可能である。酵母細胞又は昆虫細胞は真核発現 システムとして優れている。酵母の発現は，３種類の酵母ベクターで起こり，こ れらは内在YIp（酵母内在プ ラスミド）ベクター，複製YRp（酵母複製プラスミド）ベクター及びエピソーム 性YEp（酵母エピソーム性プラスミド）ベクターである。さらに詳しくは文献［S .M.Kingsman et al.，Tibtech 5（1987）53-57］に記載される。 このほか好適なベクターを製造，発現する遺伝子工学的方法は，文献［J.Samb rook et al.，“Expression of cloned genes in E．coli”in Molecular Cloni ng: A laboratory manual（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA ］に記載される。 組換えＥＴＩを製造した後で精製を行うが，例えばQ-Sepharose^R−カラムの陰 イオン交換体，陽イオン交換体（例えば，スルホプロピルベース）又はニッケル キレートカラムを使用したクロマトグラフィーにより，これらは，例えば文献〔 Porath，J．& Olin，B.，Biochemistry 22 （1983），1621-1630］に記載され る。この精製の方法で得られた組換えＥＴＩは，トリプシン，組織型プラスミノ ーゲンアクチベーターなどのセリンプロテアーゼに対する阻害活性が天然のＥＴ Ｉに比較して驚くほど高い本質的な阻害活性を示している。 このように製造されそして精製されたポリペプチドは，エリトリナ・カフラ由 来の阻害物質 DE-3 の活性をもち，原核及び真核宿主細胞の培養により得られ， 宿主細胞は本質的に配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 の配列に相当する か又は遺伝コドンの縮生の枠内で同種のポリペプチドをコードする核酸に相当す る外因性核酸（好ましくはＤＮＡ）によりトランスフォーメイション又はトラン スフェクションを受け，この方法により宿主細胞は適切な培養物質条件のもとで ポリペプチドを発現することができ，所望するポリペプチドが単離され，ポリペ プチドの比阻害活性はトリプシンに対して1.07 U/mg又はこれを超える値（好ま しくは1.07〜1.8 U/mg） をもつ。組換えＥＴＩに種々のチャージを与えると比活性が，例えば 1.2，1.5 及び1.6 U/mgを示す結果が得られた。このような活性は，陰イオン交換体，陽イ オン交換体又はニッケルキレートカラムを使用したクロマトグラフィーによる精 製で得られる。 さらに発明は，エリトリナ・カフラ由来の阻害物質DE-3の活性をもつ，組換え ポリペプチドの製造方法であり，これは原核及び真核宿主細胞の培養により行わ れ，宿主細胞は本質的に配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 の配列に相当 するか又は遺伝コドンの縮生の枠内で同種のポリペプチドをコードする核酸に相 当する外因性核酸（好ましくはＤＮＡ）によりトランスフォーメイション又はト ランスフェクションを受け，この方法により宿主細胞は適切な培養物質条件のも とでポリペプチドを発現することができ，宿主細胞からポリペプチドが単離され ，陰イオン交換体，陽イオン交換体又はニッケルキレートカラムを使用したクロ マトグラフィーで精製される。 セリンプロテアーゼの精製は組換えＥＴＩを使用して当業者に知られた方法で 行う（例えば、F.J.Joubert（1987）を参照）。ここでＥＴＩはマトリックス（ 例えば，CNBr-Sepharose-カラム）と共有結合的に結合し，セリンプロテアーゼ が含まれる混合タンパク質は中性又は弱アルカリ性の条件でカラムに供給されて クロマトグラフィーの処理を受ける。溶離はpHを5.5以下に下げて行い，又はＫ ＳＣＮのようなカオトロピック試薬を含む緩衝液を使用する。溶離液のタンパク 質純度はセリンプロテアーゼに関して95％を超える。さらに使用するためにセリ ンプロテアーゼを目的に応じてそのつど透析により所望の緩衝液へ供給する。 セリンプロテアーゼとｔ−ＰＡを精製するための阻害物質の固定化，及びその 後の全工程は，エリトリナ・カフラから阻害物質 DE- 3 を単離するのと類似の方法で行われる。この種の方法は，例えば欧州特許EP-B 0 218 479，欧州特許EP-B 0 112 122,米国特許USP 4,902,623に記載される。固 定化は，不活性担体，好ましくは CNBr-Sepharose^Rに対して目的にあうように行 う。 以下の実施例及び配列表は発明をさらに詳しく説明するものである。実施例１．大腸菌におけるＥＴＩの発現 a) 遺伝子の合成 対応する核酸配列は、大腸菌に有利なコドンを利用してエリトリナ・カフラ由 来のＥＴＩのアミノ酸配列（Joubert und Dowgle，Thrombosis and Haemostasis 57（3）（1987）356-360）に由来し，そしてBeattieとFowlerの方法（Nature 3 52（1991）548-549）により合成調製した。クローニングを容易にするために5’ -末端には制限酵素EcoRIのための切断部位を，3'-末端には制限酵素Hind IIIの ための切断部位を挿入した。合成した核酸は，酵素EcoRI及びHind IIIを用いて 制限酵素処理され，前もって同様にEcoRI及びHind IIIで消化されているクロー ニングベクターpBS＋（層遺伝子，米国カタログNo．211201, ファージflの誘導 体並びにＴ₃及びＴ₇プロモーター遺伝子，アンピリシリン抵抗性遺伝子，flオリ ジン，ColE-1オリジン，lacI遺伝子，lacZ遺伝子及び多重クローニングサイト遺 伝子をもつ層遺伝子pBSのプラスミド）と連結された。連結反応物は大腸菌に形 質変換された。得られたそしてアンピリシリンで選択されたクローンは，酵素Ec oRI及びHindIIIの制限酵素処理によって分析された。結果として得られたそして クローン pBS＋ETI は配列番号：１配列のサイズ539 bpの追加の EcoRI/Hind II I-フラグメントを有する。b) 発現ベクター プラスミド pBS＋ETI は，制限酵素 EcoRI及びHindIIIにより制限酵素処理さ れ，サイズ539 bpのフラグメントが単離された。発現ベクター pBTacl（ベーリ ンガー マンハイム有限会社，カタログナンバー1081365，pUC8に基づく。文献 H.Haymerle et al.，Nucl．Acid Res．14（1986）8615-8624）は同様に酵素 Eco RI及びHindIIIにより消化され，サイズが約4.6kbのベクターフラグメントが単離 された。いずれのフラグメントも連結反応を受け，lac-リプレッサーを含む補助 プラスミド pUBS520（Brinkmann et al.，Gene 85（1989）109-114）と共に大腸 菌（DSM 5443）に形質変換された。クローンは，プラスミドによって仲介された アンピリシリン及びカナマイシンの耐性によって選択される。得られたプラスミ ド pBTETIは，出発ベクター pBTaclに比べてサイズが 539 bpの追加のフラグメ ントEcoRI/HindIIIを含有する。 類似の方法により DSM 5443に代わり，すでにIqプラスミドを含む DSM 3689を 使用することができる。この場合には補助プラスミド pUB520は必要でない。c) 大腸菌における組換えＥＴＩ（recＥＴＩ）の発現 発現能力を試験するために、大腸菌ＤＭＳ５４４３をＬＢ培地（Sambrook et al.,Molecular Cloning（1989）Cold Spring Harbor）の中でプラスミド pBTETI 及び pUBS520と共に、アンピリシリン及びカナマイシン（いずれも最終濃度 50 μg/ml）の存在下で550 nm における光学濃度（ＯＤ）が0.6 になるまで培養し た。５ mM のIPTG を加えて発現を開始させた。培養液をさらに４時間インキュ ベートした。引き続いて遠心により大腸菌を集めて緩衝液（50 mM トリス塩酸緩 衝液，pH 8，50 mM EDTA）に再懸濁してから超音波をかけて大腸菌を溶解させた 。新たに遠心をかけて不溶性タンパク 質部分（封入体）を集めて上に述べた緩衝液中に再び超音波懸濁した。懸濁液を 1/4容の指定緩衝液（250 mMトリス塩酸緩衝液，pH 6.8，0.01 M EDTA，５％SDS ，５％メルカプトエタノール，50％グリセリン及び0.005％ブロムフェノールブ ルー）と混合し，12.5 ％のSDS-ポリアクリルアミドゲルを用いて分析した。コ ントロールとして大腸菌（pBTETI/pUBS520）の培養による同じ調製物をIPTG を 添加しないで使用してポリアクリルアミドゲルに入れた。IPTGにより誘導された 培養調製物には，0.2％のクーマシーブリリアントブルーR250（30％メタノール 及び10％酢酸に溶解）によりゲルを染色しそしてメタノール・酢酸混合液で脱色 した後分子量が約22 kDの明らかなバンドが識別できる。IPTGにより誘導されな い大腸菌細胞による調製物にはこのバンドが見られない。実施例２．recＥＴＩの再生及び精製 封入体（IBs）50ｇを0.1 Mトリス塩酸，pH 8.5，6 M グアニジン，0.1 M DTE ，１mM EDTAによって可溶化（25℃で90分，Ｃ_prot.＝10 mg/ml）してからpHを2. 5（塩酸使用）に調整して３mol/lのグアニジン/ 塩酸に対して透析した。透析液 を遠心（SS34，13 000回転/分）してYM 10上でＣ_prot.＝39.9mg/mlにまで濃縮し た。１リットルの反応タンクに0.1 M トリス塩酸緩衝液，pH 8.5，1mM EDTA，１ mM GSH，0.1mM GSSG を充満した。20℃において30分の時間をおいて透析液を16 回（そのつどタンパク質 600μg/ml緩衝液）添加して再生を行った。 再生により2.8 U/mlの活性ＥＴＩが生成する。recEＴＩの精製 a) 陰イオン交換体によって recＥＴＩを0.1 M トリス塩酸緩衝液，pH 8.5，１mM EDTA，1mM GSH，0.1 mM GSSGの中で再生する。再生液を水で1:2に希釈し， 塩酸でpHを8.0に調整し，pH8.0の50 mMのトリス塩酸緩衝液に対して透析し，pH 8.0により平衡化させたQ-Sepharose ^R-カラムに注ぐ（５mｇタンパク質/ml ゲル ）。カラムを平衡緩衝液及び50 mM のNa₂HPO₄/H₃PO₄，pH 8.0（それぞれ５個の カラム容積）により洗浄してからNa₂HPO₄/H₃PO₄，pH 8.0，0.2 M NaClを用いて て溶出を行う。b) 陽イオン交換体によって 再生ＥＴＩに塩酸を加えてpHを4.0に調整し，pH4.0，50 mMのNaOAc/HClに対し て透析（クロスフロー方式）した。透析液を遠心（13000回転/分，30分，SS34） してから50 mMのNaOAc/HClでpH 4.0により平衡化させたTSK-SP-カラム（スルホ プロピル側鎖基をもつ陽イオン交換体，メルク製，ドイツ，容量15 ml）に添加 した。平衡緩衝液及び50 mMのNaOAc/HCl，pH 4.0，0.1 M NaClによりカラムを洗 浄したのち50 mMのNaOAc/HCl，pH 4.0，0.2 M NaClで溶出する。 溶出物の純度はSDS-PAGE及びRP-HPLCを用いて試験した。 結果： 実施条件のもとでＥＴＩはTSK-SP-カラムに捕捉され，0.2 M NaClで溶出され る。SDS-PAGE及びRP-HPLC の分析による純度は95％を超える。実施例３．エリトリナ・カフラの種子から得たrecＥＴＩとＥＴＩ の比活性の比較 エリトリナ・カフラの種子から単離したrecＥＴＩとＥＴＩを50mMのNa₂HPO₄/H₃ PO₄，pH 8.0，0.2 M NaClに対して透析してタンパク質濃度を0.8mg/mlとした。 タンパク質濃度は280 nmにおける紫外吸収を測定して定量した（ε＝1.46 cm²/m g）。ＥＴＩ活性の測定 ＥＴＩによるトリプシンの阻害作用をＮ−α―ベンゾイルエチルエステル（Ｂ ＡＥＥ）を基質として測定する。40μｌのトリプシン溶液（0.13mg/ml，２mM HC l）を石英セルの中で60μｌの試験緩衝液（0.1 Mトリス塩酸緩衝液，pH 8.0）と 100μｌのＥＴＩ溶液と混合して30℃で５分間インキュベートする。800μｌのＢ ＡＥＥ溶液（ＢＡＥＥ20 mg×塩酸/100 ml試験緩衝液）を添加したのち253 nmに おける分当たりの吸光係数の増加を測定する。 ＥＴＩ活性は次ぎの式で求める。 U/ml ＝〔１−Ｅ_probe／Ｅ_Trypsin〕・Ｃ_Trypsin・0.328・Ｖ Ｅ_Probe ： 阻害された試験体における分当たりの吸光係数の増 加 Ｅ_Trypsin ： 阻害されないトリプシンにおける分当たりの吸光係 数の増加 Ｃ_Trypsin ： 試験溶液のトリプシン濃度 Ｖ： ＥＴＩ溶液の前希釈 結果: recＥＴＩの比活性は，古典的方法でエリトリナ・カフラの種子から単離 したＥＴＩに比べて20％だけ高い値を示す。 組換えＥＴＩをさらにチャージすると比活性は，例えば1.2，1.5及び1.6U/mg になることが見出された。実施例４．recＥＴＩのＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^Rへのカップリング 精製した170 mgのrecＥＴＩを，0.05 M H₃BO₃/NaOH，pH 8.0，0.5 M NaCl（カップリング緩衝液）に対して透析し，7.5ｇのCNBr-Sepharo se^R（1 mM塩酸の500 mlで一夜，膨潤させたのちに吸引濾過してカップリング緩 衝液へ懸濁させる）と混合した。懸濁液は室温で90分インキュベートしてから吸 引濾過，一夜の間，400 mlの0.1 M トリス塩酸緩衝液，pH 8.0と共に振とうした 。recＥＴＩ―Sepharose^Rを吸引濾過して0.7M アルギニン/H₃PO₄，pH 7.5の溶 液により平衡化させた。実施例５．組換えプラスミノーゲンアクチベーターの精製 54 mgの組換えプラスミノーゲンアクチベーターK2P（国際特許WO 90/09437 又は米国特許USP 5,223,256 によって製造）を0.7 M アルギニン/H₃PO₄，PH 7 .5 の溶液により平衡化したrecＥＴＩ―Sepharoseに加えた。平衡緩衝液及び0. 3 M アルギニン/H₃PO₄，pH 7.0（それぞれ５個のカラム容積）を用いて洗浄し たのち0.3Mアルギニン/H₃PO₄，pH 4.5により溶出した。溶出液中のプラスミノー ゲンアクチベーター含量をS2288を基質として定量した（Kohner et al.，Prot． Engineer．５（1992）93-100）。 結果：プラスミノーゲンアクチベーターに対するrecＥＴＩ−Sepharoseの結合 能は，ml recＥＴＩ―Sepharose当たりプラスミノーゲンアクチベーター 1.2mg （0.63 MU相当）を示している。

【手続補正書】 【提出日】１９９６年９月３日 【補正内容】 請求の範囲 １． エリトリナ・カフラ（Erythrina caffra）由来の阻害剤 DE-3 の活性を もつ固定化ポリペプチドへのセリンプロテアーゼの結合，タンパク質の混合物か らの非結合成分の除去，可溶性セリンプロテアーゼからの固定化阻害剤の分離及 びセリンプロテアーゼの単離によってタンパク質混合物からセリンプロテアーゼ を精製するために，前記ポリペプチドとして外因性核酸の原核及び真核発現生成 物であって陰イオン交換体，陽イオン交換体又はニッケルキレートカラムを通し てクロマトグラフィー的に精製したポリペプチドを使用することを特徴とするセ リンプロテアーゼの精製方法。 ２．外因性核酸の原核及び真核発現生成物であり，陰イオン交換体，陽イオン 交換体又はニッケルキレートカラムを通してクロマトグラフィー的に精製され， エリトリナ・カフラ由来の阻害剤 DE-3 の活性をもつポリペプチドの，アフィニ ティークロマトグラフィーによるセリンプロテアーゼ精製のための使用。 ３．エリトリナ・カフラ由来の阻害剤 DE-3 の活性をもつポリペプチドを原核 及び真核宿主細胞の培養により製造し，宿主細胞が本質的に配列番号：１記載の ヌクレオチド 9〜527 の配列又は遺伝コドンの縮生の枠内において同じポリペプ チドをコードする核酸に相当する外因性核酸によりトランスフォーメイション又 はトランスフェクションを受け，この方法により宿主細胞は適切な栄養条件のも とでポリペプチドを発現することができ，そして所望するポリペプチドが単離さ れ，該ポリペプチドがトリプシンに対して約1.07 U/mg又はこれを超える比阻害 活性を有することを特徴とするポリペプチド。 ４．エリトリナ・カフラ由来の阻害物質 DE-3 の活性をもつ組換 えポリペプチドを原核及び真核宿主細胞の培養によって製造するとき，宿主細胞 が本質的に配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 の配列に相当又は遺伝コド ンの縮生の枠内において同じポリペプチドをコードする核酸に相当する外因性核 酸によりトランスフォーメイション又はトランスフェクションを受け，この方法 により宿主細胞は適切な栄養条件のもとでポリペプチドを発現することができ， 宿主細胞から所望するポリペプチドが単離され，陰イオン交換体，陽イオン交換 体又はニッケルキレートカラムを用いてクロマトグラフィー的に精製される組換 えポリペプチドの製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/64 9152−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ (72)発明者 フィッシェル，ステファン ドイツ連邦共和国，デー−82398 ポーリ ンク，ヤコビフェルトベク 11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．エリトリナ・カフラ（Erythrina caffra）由来の阻害剤 DE-3 の活性をも つ固定化ポリペプチドへのセリンプロテアーゼの結合，タンパク質の混合物から の非結合成分の除去，可溶性セリンプロテアーゼからの固定化阻害剤の分離及び セリンプロテアーゼの単離によってタンパク質混合物からセリンプロテアーゼを 精製するために，前記ポリペプチドとして外因性核酸の原核及び真核発現生成物 であって陰イオン交換体，陽イオン交換体又はニッケルキレートカラムを通して クロマトグラフィー的に精製したポリペプチドを使用することを特徴とするセリ ンプロテアーゼの精製方法。 ２．セリンプロテアーゼがプラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴 とする請求項１記載の方法。 ３．プラスミノーゲンアクチベーターが組織型プラスミノーゲンアクチベータ ー又はその誘導体であることを特徴とする請求項２記載の方法。 ４．阻害剤が一つの不活性担体に固定化されていることを特徴とする請求項１ 〜３のいずれか１項記載の方法。 ５．外因性核酸が本質的に配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 の配列又 は遺伝コドンの縮生の枠内において同じポリペプチドをコードする核酸に相当す ることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載の方法。 ６．外因性核酸の原核及び真核発現生成物であり，陰イオン交換体，陽イオン 交換体又はニッケルキレートカラムを通してクロマトグラフィー的に精製され， エリトリナ・カフラ由来の阻害剤 DE-3 の活性をもつポリペプチドの，アフィニ ティークロマトグラフィーによるセリンプロテアーゼ精製のための使用。 ７．セリンプロテアーゼがプラスミノーゲンアクチベーターであることを特徴 とする請求項６の使用。 ８．プラスミノーゲンアクチベーターが組織型プラスミノーゲンアクチベータ ー又はその誘導体であることを特徴とする請求項７の使用。 ９．エリトリナ・カフラ由来の阻害剤 DE-3 の活性をもつポリペプチドを原核 及び真核宿主細胞の培養により製造するとき，宿主細胞が本質的に配列番号：１ 記載のヌクレオチド9 〜527 の配列又は遺伝コドンの縮生の枠内において同じポ リペプチドをコードする核酸に相当する外因性核酸によりトランスフォーメイシ ョン又はトランスフェクションを受け，この方法により宿主細胞は適切な栄養条 件のもとでポリペプチドを発現することができ，所望するポリペプチドが単離さ れ，該ポリペプチドがトリプシンに対して約1.07 U/mgの比阻害活性を有するこ とを特徴とするポリペプチドの製造方法。 10．核酸として配列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 配列の核酸又は遺伝 コドンの縮生の枠内において同じポリペプチドをコードする核酸を使用すること を特徴とする請求項９の方法。 11．宿主細胞が大腸菌細胞であることを特徴とする請求項９又は10の方法。 12．宿主細胞が酵母細胞又はＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項９又は 10の方法。 13．エリトリナ・カフラ由来の阻害物質 DE-3 の活性をもつポリペプチドをコ ードする配列番号：１記載のヌクレオチド9 〜527 の核酸。 14．請求項13の核酸を含む生物学的に機能するプラスミド又はＤＮＡウイルス ベクター。 15．請求項14のＤＮＡベクターと安定にトランスフォーメイション又はトラン スフェクションされる原核及び真核宿主細胞。 16．エリトリナ・カフラ由来の阻害剤 DE-3 の活性をもつポリペプチドを原核 及び真核宿主細胞の培養により製造し，宿主細胞が本質的に配列番号：１記載の ヌクレオチド 9〜527 の配列又は遺伝コドンの縮生の枠内において同じポリペプ チドをコードする核酸に相当する外因性核酸によりトランスフォーメイション又 はトランスフェクションを受け，この方法により宿主細胞は適切な栄養条件のも とでポリペプチドを発現することができ，そして所望するポリペプチドが単離さ れ，該ポリペプチドがトリプシンに対して約1.07 U/mg又はこれを超える比阻害 活性を有することを特徴とするポリペプチド。 17．発現が原核宿主細胞で行われ，ポリペプチドが配列番号：２記載のアミノ 酸配列を有することを特徴とする請求項16のポリペプチド。 18．発現が真核宿主細胞で行われ，ポリペプチドがＮ末端基にメチオニンを含 まない配列番号：２記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項16のポ リペプチド。 19．エリトリナ・カフラ由来の阻害物質 DE-3 の活性をもつ組換えポリペプチ ドを原核及び真核宿主細胞の培養によって製造するとき，宿主細胞が本質的に配 列番号：１記載のヌクレオチド 9〜527 の配列に相当又は遺伝コドンの縮生の枠 内において同じポリペプチドをコードする核酸に相当する外因性核酸によりトラ ンスフォーメイション又はトランスフェクションを受け，この方法により宿主細 胞は適切な栄養条件のもとでポリペプチドを発現することができ，宿主細胞から 所望するポリペプチドが単離され，陰イオン交換体，陽イオン交換体又はニッケ ルキレートカラムを用いてクロマトグラ フィー的に精製される組換えポリペプチドの製造方法。