JP2535066B2 - 組換え体タンパク質製造のためのリ―ダ―配列 - Google Patents

組換え体タンパク質製造のためのリ―ダ―配列

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JP2535066B2 JP63502689A JP50268988A JP2535066B2 JP 2535066 B2 JP2535066 B2 JP 2535066B2 JP 63502689 A JP63502689 A JP 63502689A JP 50268988 A JP50268988 A JP 50268988A JP 2535066 B2 JP2535066 B2 JP 2535066B2
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    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 本発明は遺伝子工学技術を用いて製造されるポリペプ
チドの製造および精製に関する。特に高発現の促進およ
び融合生成物の単離および精製に有益な新規アルファら
せん両親媒性アミノ酸配列を含む遺伝子工学による融合
ポリペプチドに関する。
外来性遺伝子を種々の細胞に取込まれる事ができる組
換え体DNA技術の進歩により、細胞にとって外来性であ
る生成物の発現が可能になってきた。しかし、関心ある
タンパク質は細胞内酵素によりしばしば分解されるであ
ろうし、それを宿主微生物により発現される他の物質お
よび宿主の構造物質を含む他の物質から分離するのは困
難であろう。細胞内分解からの防御は、細胞内酵素によ
る消化を避けるため標的タンパク質にアミノ酸配列を融
合する事により達成される。さらに、もし所望のタンパ
ク質が精製の際利用できる特徴を持つポリペプチドと融
合されるなら、単離および精製を容易にするように工夫
できる。
関心あるタンパク質をコードする遺伝子の関心あるタ
ンパク質以外のポリペプチドをコードしているDNA配列
への結合を特徴とするDNAにより融合生成物はコードさ
れている。融合方法論は一般的に先行技術により詳細に
議論されている。例えばヨーロッパ特許出願第0047600
号は融合タンパク質を産生し、宿主微生物の培養培地か
ら成長ホルモンを精製するウシ成長ホルモンの合成方法
について記載していると理解される。他のタンパク質も
融合技術を用いて産生されてきた。
先行技術は一般的に、切断部位をコードしている遺伝
物質を所望のタンパク質をコードしているDNAと付加的
な融合物質をコードしているDNAの間に取り込ませる事
を教えている。発現により、選択的切断部位を決定して
いる一つまたはそれ以上のアミノ酸およびその他のアミ
ノ酸配列に結合した標的ポリペプチドのアミノ酸配列を
含む前駆体タンパク質を得る。例えば、EPO 0035384,EP
O 0161937およびEPO 0163573を参照されたい。
融合生成物はまたその単離を容易にするように工夫さ
れた部分を含む事もできる。例えばPCT/84/03103および
米国特許出願第4,431,739号を参照されたい。
本発明の目的は、遺伝子工学によるタンパク質の産
生、単離および精製のための方法を提供する事である。
関心ある組み換え体タンパク質をより良い収率で得るた
めの方法を提供する事も目的である。宿主微生物のため
にコードでき発現される任意の関心あるポリペプチドに
適用できる方法を提供するのもほかの目的である。高水
準の発言を誘導し、細胞性宿主中で不溶性会合体（封入
体）を形成する事を特徴とする融合ポリペプチド生成物
をつくり、融合ポリペプチドの再可溶化および精製を可
能にする先導配列の新規の群を提供するのも目的の一つ
である。さらに、効率的で安価なそのような方法を提供
するのも目的の一つである。
本発明のこれらおよびその他の目的は以下の記述、図
および請求の範囲から明らかになるであろう。
〔発明の開示〕
広くいえば、標的ポリペプチドを発現できる組換え体
宿主細胞内で、関心ある標的ポリペプチドに富んだ不溶
性会合体または封入体の自発的形成を促進する方法を本
発明は特色とする。本発明には種々の様相があり、形質
転換体中の組換え体DNAにより発現可能な融合タンパク
質、融合タンパク質をコードしている組換え体DNAおよ
びこれらの試薬を用いて関心あるポリペプチドを製造す
る方法を提供する。リーダーまたはトレーラー配列でも
よく（標的のアミノまたはカルボキシル末端に各々結合
している）、また水溶液中では中心軸および向いあった
親水性および疎水性横表面を持つ両親媒性アルファらせ
ん構造を持つペンダントポリペプチドに結合した標的ポ
リペプチドを融合タンパク質は含んでいる。疎水性表面
はヘリックスの胴上の軸方向の円周のすぐ次に非極性ア
ミノ酸が配置されているのを特徴とする。親水性表面は
軸方向の円周のすぐ次が荷電したアミノ酸からなってい
る。
原核細胞発現系で先導配列として使用した場合、両親
媒性ヘリックスをコードしているDNAは高発現原水準を
誘導する、即ち、少くとも細胞の総発現タンパク質の10
パーセント、典型的には30から40パーセント、場合によ
っては50パーセントの高率の水準での融合ポリペプチド
の産生がみられた。融合タンパク質はそれが発現される
宿主細胞内で不溶性の凝集体（会合体）を自発的に形成
する能力により特徴付けられ、それにより生成物の製造
および単離を容易にする。
好適な実施例においては、融合タンパク質のペンダン
トポリペプチドはプロリンを含まない次の構造： （Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｃ−Ｎ）ｂ 〔式中Ｎは各々非極性アミノ酸残基であり、Ｃは各々荷
電アミノ酸残基であり、Ｓは各々中性アミノ酸残基であ
り、ｂは１から30の整数である。〕 のポリペプチドであり、各々の反復セグメント中のアミ
ノ酸残基の２つまではヒスチジンであろう。ポリペプチ
ドがヘリックスコンホメーションをとったと仮定した場
合、荷電したアミノ酸残基は一緒になって親水性表面を
決定し、非極性アミノ酸残基は一緒になって疎水性表面
を決定する。
好適な非極性、荷電および連結残基は残基の型（例え
ばN,CまたはＳ）、およびタンパク質２次構造の文献中
で定義され、表１に示したそのらせん形成能力の両方に
より決定される。
1FasmanおよびChou（アニュアル レビュー オブ
バイオケミストリーAnn.Rev.Biochem,1978,47:251−7
6）によるタンパク質２次構造文献中で定義されている
ヘリックス形成傾向。1.00以下の値では、残基はヘリッ
クス領域を崩壊させる傾向が強い。
アルファらせんの両親媒構造中で使用される好適な非
極性残基には、メチオニン、アラニン、ロイシン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、イソロイシンおよびバ
リンが挙げられる。この組の中で、アラニンおよびロイ
シンがヘリックス−ヘリックス会合間の立体的充填上の
考察から好適である。好適な荷電残基としてはグルタミ
ン酸、リジンおよびアスパラギン酸が挙げられる。好適
な側残基（前記参考式中Ｓと称されている）はグルタミ
ンである。アスパラギンが使用されてきたけれどもそれ
は貧弱なヘリックス形成残基である。一般的に、大部分
のヘリックスが既知の良好なヘリックス形成剤からなっ
ているが、ヘリックス形成剤が低い残基も許容される。
しかしながら、らせん領域を中断する事が知られている
プロリンはこの場合ではない。
多くの例において、両親媒性ヘリックスの胴の一つの
側面上の親水性表面が正味中性荷電を持つようにヘリッ
クスの各々の７つのアミノ酸セグメントが陰イオン性ア
ミノ酸および陽イオン性アミノ酸の両方を含む事が好適
である。他の例において、特に標的ポリペプチドへ正味
の荷電を集団的に与えるアミノ酸残基を特徴とする標的
ポリペプチドの場合、ヘリックス中の一つまたはそれ以
上のセグメント内の荷電は逆の荷電が選択されるべきで
ある。結局、融合タンパク質は中性である。さらに、ポ
リペプチドのＮ−末端（＋）への負に荷電した基の配
置、およびＣ−末端（−）への正荷電基の配置により、
ヘリックスに沿ったペプチド結合を通して双極子モーメ
ントの形成を生み、そのためヘリックス安定性を促進す
る（Shoemakerら、1985,プロシーディング オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス〔Proc.Nat
i.Sci〕USA,82:2349−2353）。
ヒスチジンは酸性または中性溶液中で荷電した陽イオ
ン形、および塩基性溶液中で中性の形をとるのでヘリッ
クスセグメント中の種々の部位に使用できる。荷電した
ヒスチジンはまた親水性である。ヒスチジン含有オリゴ
マーからなるヘリックスは容易に精製できる封入体を形
成できる。例えば、２つの異ったpHでイオン交換体中を
封入体を溶解した溶液を続けて通過せしめる事によりか
なりの濃度の融合タンパク質を得る。
融合タンパク質をコードし、発現できるDNAを細胞性
宿主に挿入する事を含む本発明の方法は、宿主に融合タ
ンパク質を封入体の形で発現せしめ、細胞性宿主から封
入体を分離し、標的ポリペプチドの放出のため融合タン
パク質を切断する事ができる。
融合タンパク質の先導部がHisを含んでいる場合、融
合タンパク質は、第２の異ったイオン強度または異った
pHを持つ媒体に封入体を溶解せしめる事により、細胞内
の他の異種タンパク質から都合よく分離される。
中性両親媒性ヘリックスの凝集（会合）傾向は、高イ
オン強度媒質中では疎水性表面の相互作用の増加によ
り、低イオン強度媒質中では親水性表面の相互作用の増
加により促進される。pH変化によりHis−含有ヘリック
スの総荷電を変動させる能力はこれらの両方の会合効果
を変化させる。ヒスチジン含有ヘリックスの溶解性はし
ばしばpHに依存している。
現在、好適ならせん構造は以下のアミノ酸配列であ
る： （Ala−Lys−Asn−Leu−Asn−Glu−Ala）d; （Ala−Lys−Gln−Leu−His−Asp−Ala）d; （Ala−His−Asn−Leu−Asn−Glu−Ala）d; （Ala−Lys−Gln−His−Gln−Glu−Ala）d; 〔式中、ｄは１から10までの整数である〕。
本発明の他の利点および特色は以下の記載、図および
請求の範囲から明らかになるであろう。
〔図の簡単な説明〕
図１は性質の説明に有用な、本発明の両親媒性ヘリッ
クスの２次構造の概略図であり； 図２は本発明のヘリックスの非極性および極性表面を
図示している図１のヘリックスの概略図であり； 図３は融合DNA、融合タンパク質および標的タンパク
質生成物の構造を図示したもので、本発明の実施の間に
分子レベルで起こる現象を連続的に示しており； 図４は本発明の全過程の概略図であり；および 図5,6および７はpHの関数としての３つの原型ヘリッ
クスの溶解度のグラフであり、溶解度はHPLC疎水性媒質
カラムの水性移動相中へ分配されるペプチドの割合とし
て示してある。この事は特定のヘリックスの溶解性のpH
の効果を例示している。これらのグラフにおいて点記号
は使用された以下の緩衝系に対応している：▽−10mMリ
ン酸塩、ナトリウムイオンを10mMから20mMで変化；△−
10mM酢酸塩、ナトリウムイオンを5.3mMから9.5mMで変
化；○−10mMリン酸塩、10mM酢酸塩、ナトリウムイオン
を0mMから20mMで変化；＋5mMリン酸、5mMピロリン酸、
ナトリウムイオンを10mMから20mMで変化；□−5mMリン
酸、5mMピロリン酸、20mMナトリウムイオン、酢酸イオ
ンを12mMから0.8mMで変化。
〔発明を実施する為の最良の形態〕
関心ある種々のタンパク質の製造は、融合タンパク質
を宿主細胞中で発現し、それを集め、精製した後分子の
無関係部分を除去するめに切断する事により以前は達成
されていた。本発明はこの一般法の自明でない改良精製
法である。本発明の方法は、適した宿主中（例えば大腸
菌のごとき原核細胞）での発現により多量に融合タンパ
ク質を産生する組み換え体DNAの遺伝子操作を一般的に
含む。この融合タンパク質は数ある好都合な性質の中
で、宿主細胞微生物中で細胞内封入体を自発的に形成す
るという利点がある。また、融合タンパク質は以下に議
論する分子の他の性質の力で効果的に切断されるように
設計できるであろう。
本発明は融合タンパク質の細胞内安定性および採集の
容易さが、もし関心あるポリペプチドが好適にはアミノ
末端で直接または結合配列を通して特異な性質を持つペ
ンダントポリペプチドへ結合されると改良できるという
考えに基づいている。特に、ペンダントポリペプチドは
高水準の発現を誘導でき、産生宿主細胞内の不溶性封入
体の形成を促進でき、切断に先立つ融合タンパク質の精
製の助けとなるように開発された。本発明の一般的な方
法では、融合タンパク質をコードしており、発現される
事により標的タンパク質（即ち、潜在的または論証可能
な有用性を持つ興味あるタンパク質）へ結合した両親媒
性アルファらせんポリペプチド構造を発現する組換え体
DNAを構成する。このように発現された水性溶液に放出
された場合、好適には確実にアルファヘリックスを形成
するようなアミノ酸配列をコードするようにDNAは工夫
されている。ヘリックスは好適には一つまたはそれ以上
のユニットまたはセグメントを含み、それは一般構造の
NCSNSCNの７つのアミノ酸からなる。文字Ｎは一般的に
非極性、疎水性アミノ酸残基を意味し；文字Ｃは一般的
に荷電した親水性アミノ酸残基を意味し；および文字Ｓ
は側アミノ酸残基を意味する。
このようにヘリックス構造のこの型の各々のセグメン
トは３つの非極性残基および２つの荷電残基を持つ。も
しくは、ヘリックスがCNSCSNC構造を持つ事もでき、そ
の場合各々のセグメントは２つの非極性残基および３つ
の荷電残基を持水性性質が増し、この性質は本質的に水
不溶性標的タンパク質に溶解性を与える利点を持つよう
にできる。もし望むならヘリックスの異ったセグメント
は異った特性のアミノ酸配列を含んでいてもよい。もち
ろん、、本発明の一般的なヘリックスの式はまた“位相
のづれた”という呼称で表わす事ができる。このように
例えば式CSNSCNNまたはSNSCNNCで表わされるヘリックス
はここに記載した好適な構造呼称と均等である。また各
々のセグメント中の各々のＣは荷電アミノ酸、各々のＮ
は非極性アミノ酸からなるのが良好であるが、もし置換
アミノ酸が適度に良好なヘリックス形成剤およびそれゆ
えペンダントポリペプチドのアルファらせん構造を有意
に変えないと仮定するならアミノ酸の他の型の置換が許
容される。
このタンパク質がその２次構造をとる場合、異った性
質の相対する表面を持つアルファヘリックスとなる。一
つの表面は荷電残基をすぐ近くに備え、それによりヘリ
ックスの胴のその面に親水性性質を与える。反対側はす
ぐ近くに疎水性アミノ酸残基を備え、それにより反対表
面に疎水性性質を与える。結合またはＳ（側）残基は好
適には非荷電、親水性アミノ酸であり、その第一の機能
はヘリックスの疎水性および親水性横表面を結合する事
である。
ヒスチジン（His）はアミノ酸の中で独特であり、そ
れが配置された媒質に依存して陽イオン性にも中性にも
なりうる。それはヘリックスを構成する７個のアミノ酸
セグメント中の中心非極性残基の代わりに、ヘリックス
の所望の性質に依存して荷電基として、側基としてまた
はそうではなくても使用できる。酸性媒質中では、ヒス
チジン残基はプロトンを受けとり、陽性に荷電し親水性
になる。塩基性媒質中では、ヒスチジン残基は中性のま
ゝであり幾分疎水性となる。ヘリックス構造中にHisを
使用すると溶液のpHを変える事により、個々のヘリック
ス分子の総荷電および溶解性を変える事ができる。
ヘリックスの一般構造は図１に描いてある。図示した
ごとく、ヘリックスは円柱または“胴"10について巻い
たものとして視覚化される。巻きは先に示したごとくN,
CおよびＳと名付けられたアミノ酸の鎖からなってい
る。タンパク質の構造は以下のごとくで、円柱10の斜交
平行線文様表面上にはＣまたはＳ残基のみが現れ、一方
反対表面にはＮまたはＳ残基が現れ、一般的にＳ残基は
Ｃまたは荷電残基が優勢な一つの表面とＮまたは非極性
残基が優勢な他の表面の間に配置される。
反復単位として７つのアミノ酸セグメントを使用する
効果は、荷電した親水性表面（ヘリックス上空間的に隣
接する荷電アミノ酸残基で規定される）、および非極性
表面（ヘリックス上空間的に隣接する非極性残基により
規定される）の胴の中心軸14について最小の回転が得ら
れる事である。それゆえ、親水性荷電表面を規定するア
ミノ酸および非極性表面を規定するアミノ酸が図２で概
略的に示したごとく、ヘリックスの胴の反対側にいつも
配置されるようになるが、アルファヘリックスの幾何学
的形のため、両表面はわずかな左へのらせん状ねじりを
持っている。
ヘリックスに使用される好適な非極性残基はフェニル
アラニン（Phe）、ロイシン（Leu）、アラニン（Ala）
およびトリプトファン（Trp）である。イソロイシン（I
le）、バリン（Val）およびメチオニン（Met）もまた使
用してもよい。プロリン（Pro）もまた非極性である
が、主鎖に再結合し輪のようになる側鎖を持っており、
そのため主鎖のわん曲を強制し、そのペプチド結合窒素
のプロトン（水素結合を起こすのに必須）を除去し、そ
れにより、アルファヘリックス構造を破壊する。従って
それはヘリックスの構造には使用しないのが望ましい。
ヘリックスの構造に有用な親水性アミノ酸にはグルタミ
ン酸（Glu）およびアスパラギン酸（Asp）および陽イオ
ン性アミノ酸リジン（Lys）（これはアルギニンより好
適である）が含まれる。ヘリックスの構成に有用な側基
としてはアスパラギン（Asn）およびグルタミン（Gln）
が良好である。シスチン（Cys）もまた有用な親水性ア
ミノ酸であるが、ジスルフィド結合形成能力（それによ
りらせん構造を強力に破壊する）および最終生成物の切
断および精製を複雑にする事により側基としては通常用
いられない。
ヘリックスの設計は以下のごとくで、例えば相対的に
高濃度の荷電種を含む水性溶液のごとき高イオン強度媒
質中では別の分子のヘリックスの疎水性表面が相互作用
をしてミセルを形成する。逆に低イオン強度媒質中では
イオン性または静水性相互作用が優性となり再び会合体
が形成される。これらの極端な条件の間に融合タンパク
質が可溶性となる条件がある。
一つのＣが陽イオン性アミノ酸であり他のものが陰イ
オン性である場合、Ｓアミノ酸としてヒスチジンを使用
するとヘリックスは低pHでは総計で陽イオン荷電を持つ
事になり、従って静電的反撥のため会合体の形成が阻害
される。pHが高くなると（例えはpHが７以上）、ヒスチ
ジン部分は水素イオンを失い、中性となる。ヘリックス
は全体で中性となり疎水性会合体の形成が許される。大
腸菌で発現されたようなヘリックスは、細胞内pH範囲
（例えば7.6）で封入体を形成する事になろう。これら
を採取し、酸性媒質（例えばpH5）に分散すると、融合
タンパク質が溶解するであろうし、それにより切断を含
む更なる処理工程を容易にする。
特定の場合に使用されるヘリックスの単位の数は標的
ポピペプチドの大きさおよび溶解特性などを考慮して経
験的に決定される。一般的には、ヘリックスが支配する
溶解性を確かにするため十分数の単位を用いるべきであ
る。例えば、大きな本質的に中性の標的タンパク質で最
良の結果を得るには少くとも10セグメントを含むヘリッ
クスと結合されるのがよいであろう。逆により小さいタ
ンパク質（例えば50アミノ酸）は少ない反復単位しか必
要としない。
ヘリックス構成で他に考慮すべきものは個々のヘリッ
クス間のイオン性反撥の効果である。多くの場合、総荷
電が中性となるように荷電アミノ酸の一つは陰イオン性
で他は陽イオン性である。前に示したごとく、ヒスチジ
ンの導入により荷電特性をpH依存性とする事ができる。
この一般則の例外は標的タンパク質自身が有意な総荷電
を持っている場合である。この場合、Ｃ残基の適切な選
択により標的タンパク質上の荷電を中和するような荷電
基を含むヘリックスを設計する事により封入体の細胞内
形成を促進できる。
融合タンパク質がコードされており、標的ペプチド生
産物を生じる本発明の好適なDNAの全構造が図３に図式
的に示してある。DNA中の対照形質はタンパク質内へ対
応する原始形質として繰越される。DNAは２つの明瞭な
配列が互いに結合したものから成り立っている。第一の
配列は最終的には大部分またはすべてが捨てられるポリ
ペプチドをコードしている。第一の配列の３′または
５′末端に結合しているのは標的ポリペプチド（関心あ
るタンパク質で最終的に採取される）をコードしている
DNAである。図中、制御配列の３′は第一のDNA配列８で
３つの副配列をコードしているヌクレオチドを含む:1）
前記本発明の両親媒性ヘリックスを含む配列18、２）本
明細書で“蝶番”または“蝶番領域"16と称される配列
および３）切断部位14を規定するアミノ酸またはアミノ
酸配列。更なるアミノ酸をコードしているDNA（示され
ていない）もまた含んでもよい。切断部位14をコードし
ているDNAに結合しているのは関心あるタンパク質をコ
ードしているDNA22、である。
コードされている融合タンパク質はペンダント両親媒
性ヘリックス18′、蝶番領域16′、切断部位14′および
標的タンパク質22′を含む。融合タンパク質を採取およ
び精製した後、ヘリックス18′の性質を随意に利用して
融合タンパク質を切断部位14′で切断して生産物22″を
得る。ヘリックス18′同様蝶番16′、および切断部位1
4′もDNAの遺伝子工学により取り込まれている。切断個
所14′の機能は前もって選択されている切断剤の作用個
所として働く事である。蝶番領域16′の機能は切断反応
の速度および／または特異性を改良するためである。
関心あるアミノ酸配列をコードしているDNAの取扱
い、増幅および組換えの方法は、一般的に当業者にはよ
く知られており、ここでは詳細には記述しない。関心あ
るタンパク質をコードしている遺伝子の同定および分
離、またはそのような遺伝子の構築はよく理解されまた
発展中でもある。これらの方法は特許および他の文献に
記載されている。例えば米国特許第4,431,739号を参照
されたい。一般的に、遺伝子コードに従って関心あるポ
リペプチドを規定するアミノ酸をコードしている遺伝物
質の選択がその方法に含まれる。
従って、平滑端または相補端を作るためのDNA中の配
列特異性切断をする種々の制限酵素の使用、DNAリガー
ゼ、DNA平滑末端への相補末端の酵素的付加を可能にす
る技術、短いオリゴヌクレオチドの組み立てによる合成
DNAの構成、cDNA合成技術および特定の機能を持つ遺伝
子の分離のための合成プローブを含む既知の構成技術を
使用して、ここに記載されたDNA構成原理が利用でき
る。発現の達成に種々のプロモーター配列および他の制
御DNA配列が使用され、また種々の型の宿主細胞も既知
であり利用できる。通常のトランスフェクション技術お
よびDNAのクローニングおよびサブクローニングのため
の同様の通常技術が本発明の実施に有用であり、当業者
にはよく知られている。プラスミドおよび動物ウイルス
およびバクテリオファージを含むウイルスのごとき種々
の型のベクターが使用できる。ベクターの組換え体DNA
をうまく取り込んだ細胞の群を同定するのに使用できる
検出可能な表現型の性質をうまくトランスフェクトされ
た細胞に与える種々のマーカー遺伝子をベクターは利用
できる。前述の遺伝子工学技術の状態を与えると、当業
者はこの発表を考慮して、ここに記載した本発明の実施
ができる。
ここに記載した種々のヘリックス構造をコードしてい
るDNAを得る一つの方法は適当なリガーゼで結合した後
合成オリゴヌクレオチドを通常の自動化されたポリヌク
レオチド合成装置中で組み立てる事である。例えば、15
塩基からなる重複、相補DNAフラグメントが、結合中の
重合を防ぐため未リン酸化のまゝ残した末端セグメント
を用いるホスホラミダイト化学を使用して合成される。
合成DNAの一つの末端は特定の制限酵素の作用部位に対
応する“相補末端”で残してあり、他の末端は他の制限
酵素の作用部位に対応する末端として残してある。もし
くは、例えばバイオサーチ（Biosearch）オリゴヌクレ
オチド合成装置中より長い単一鎖フラグメント（例えば
50−100ヌクレオチド長）を合成し、続いてフラグメン
トをアニール化する事により、ヘリックスをコードして
いるDNAを製造できる。
図３に示したごとく、蝶番領域16′はDNAセグメント1
6によりコードされている。発現された蝶番領域16′
は、酵素的または他の消化に対し切断部位をさらすよう
に働く少くとも２つのアミノ酸を含む切断部位14′に隣
接するか、または近くにいる未構造のセグメントである
のが良好である。この蝶番の性質は切断反応環境下酵素
または他の切断試薬への切断部位の到達性を増大し、切
断部位でのアミノ酸残基（類）の好適な消化のための動
力学的利益を提供する。
蝶番領域を含むアミノ酸配列は広範囲に変異できる。
それはしばしば切断部位の近くの融合ポリペプチド部分
に緩和し、一般的にたたまれていない配位をとる能力を
与える可撓性のあるセグメントを含んでいる。それゆえ
融合タンパク質が切断環境にさらされた時、構成するポ
リペプチドの部分に特定の２次的性質を与える能力で蝶
番を規定するアミノ酸の組合せを選択する。
切断剤がその作用隣接部位へ到達するのを立体的に阻
害するであろう固定された３次構造を形成しないアミノ
酸から蝶番領域はなっている。この理由で、ヘリックス
と伴に使用する蝶番は典型的には少くとも一つのプロリ
ン残基を持ち、シスチン残基は含まれない。一つまたは
それ以上のプロリン残基の存在により蝶番領域における
アルファらせん構造の形成が本質的に排除される。この
場合プロリンは最も近いヘリックスの先頭により引起こ
されるかもしれない切断に対する立体的妨害を制限する
のに働く。一方シスチンは反応性が高くジスルフィド結
合を形成できるスルフヒドリルまたたはチオール基を含
んでいる。シスチンの存在は望まれる固定されない蝶番
領域の２次または３次コンホメーションに対し反対に働
くのでその使用は避けられる。
好適には、蝶番領域は約２から20のアミノ酸を含むポ
リペプチド鎖である。シスチンが含まれれいないのに加
え、典型的には少くとも一つのプロリン残基を含んでお
り、蝶番の配列は前もって選択された切断環境下、効率
的切断を促進するような設計戦略を利用している。特
に、前もって選択された切断剤がエンドペプチダーゼの
場合、蝶番領域が水性環境に可溶な事が重要である。溶
解性促進のため、蝶番には荷電側鎖および親水的性質を
持ったアミノ酸が含まれる。これらには陰イオン性残基
GluおよびAsp、陽イオン性残基ArgおよびLysおよび中性
親水性残基SerおよびThrが含まれる。
蝶番領域の更なる特徴は本明細書と同じ日付で出願さ
れた、相互係続中の連続出願番号（代理人管理番号CRP
−008）のものに記載されており、その記載は参考文献
として含まれている。
標的タンパク質は残りの融合物質から、好適には活性
型22″としてまたは選択された切断剤により切断部位1
4′が加水分解されると容易にその本来のコンホメーシ
ョンを再びとれるような形で放出される。切断剤の特異
性は加水分解されるペプチド結合またはその近くのアミ
ノ酸の配列の同一性により決定される。与えられた切断
剤は２つの特定のアミノ酸間の結合を認識するのであろ
うし、またはそれに続く結合またはアミノ酸の特定の配
列を認識すれであろう。
多くの切断剤の特異性が知られている。以下に示した
表は種々の既知の切断剤およびその第１次の（ある場合
は第２次の）作用部位を掲げている。
他の切断剤も知られている。本発明での使用に好適で
あるのは、切断部位残基のＣ−末端（標的ポリペプチド
のアミノ側に結合しているかぎの手）または切断部位残
基のＮ−末端部（標的ポリペプチドのカルボキシ側に結
合しているかぎの手）を切断する第一次作用部位を持つ
酵素である。現在最も好適な切断剤／切断部位は黄色ブ
ドウ球菌Ｖ−８プロテアーゼ/Gluである。この系を使用
する場合、ヘリックス中のＣ残基としてGluの代わりにA
spを使用せねばならない。
融合タンパク質中の切断部位には一般的、適当な環境
下部位に特異的な切断剤により接残されうるアミノ酸ま
たはその配列が含まれる。標的タンパク質には存在しな
い作用部位を持つ切断剤を選択する事により切断の特異
性を上げる事ができ、標的タンパク質中または融合タン
パク質の他の場合での望まれない切断を減少させる見込
みがある。
融合ポリペプチドはその元来のコンホメーションをと
る条件下で好適に切断される。この事は標的ポリペプチ
ド中に存在する潜在的切断部位を覆う効果がある事を示
す。シスチンなしでは（または対になったCys残基を持
っていると）、ペンダントポリペプチドは外来性混入物
に対しジスルフィド結合なしで残っており、蝶番により
助けられその切断部位は切断剤による消化に対して開い
た状態で残っている。融合ポリペプチドが復元され酸化
された後もし切断を実施すると、標的ポリペプチド一つ
またはそれ以上のジスルフィド結合によりその３次元コ
ンホメーションを保つであろう。
本発明はここに記載されている方法および構成法を使
用して製造される標的タンパク質22′の同一性に関して
は本質的に制限されていない。本当に、本発明の重要な
特色は、任意の望まれるタンパク質の組換え的製造を容
易にするためにすぐに適用できる一般的な方法を提供す
る事である。それゆえ、本発明は成長因子、ホルモン、
リンホカイン、酵素、抗体または酵素的に活性および不
活性なタンパク質を含むそれらの種々のフラグメント、
短いポリペプチドおよび上記すべてのものの種々の類似
物に使用される。非制限的例にはEGF、IGF−１、TGFア
ルファおよびベータ、ヒトコラゲナーゼインヒビター、
PDGF、CTAP、インターロイキン、インターフェロン、工
業酵素、トロンボン性薬剤、ウイルス被膜タンパク質、
細菌膜タンパク質、プロテインＡおよびそのフラグメン
トおよび種々の合成ペプチドが含まれる。
本発明に従って実施されるタンパク質製法の全方法が
概略的に図４に例示してある。切断部位および蝶番領域
を作る両親媒性ヘリックスおよび他の組換え体DNA、適
当な制御配列および標的タンパク質をコードしている遺
伝子は、前に概述した型の多くの種類の既知の技術を用
いて構成される。DNAを組み立てた後通常の技術を用
い、大腸菌のごとき適した宿主細胞中に取り込まれるよ
うに設計された発現ベクターを構成する。
発現ベクター（図４中100）は典型的には、図３のDNA
に対応する転写ユニット102および形質転換が成功して
いるクローンの選択を可能にする表現型特色を宿主細胞
に与えるマーカー遺伝子104を含むであろう。融合タン
パク質を発現しているクローンを大量培養し、細胞内封
入体（図６中106）を含む多数の細胞を産生する。細胞
を常法により溶菌し、封入体を例えば遠心分離により採
取する。上澄液中の可溶性タンパク質から封入体を分離
後、封入体は一般的に前に議論したごとく標的タンパク
質を付けたまゝ両親媒性ヘリックスの会合が解離するよ
うに計画された適当なイオン強度および／またはpHを持
つ溶液にさらす事により再溶解される。いくつかの場
合、これらの溶解封入体は更に精製する異なく切断で
き、切断フラグメントは関心ある生成物を採取するため
分離される。もしくは、ヘリックスの独特の性質と異っ
た溶解特性を持つ不純物の分離のために計画された一連
の溶解および沈殿過程に融合タンパク質をかける。精製
された封入体は続いて切断し、生成物を得る。
もし標的ポリペプチドのアミノ酸配列中に潜在的切断
部位が存在するならば、前に記載したごとくペンダント
ポリペプチドの設計で部位14′で切断され易くする。そ
のような環境下、反応が完全に進行するとすると両方の
部位が切断されその結果無傷の標的ポリペプチドはほと
んどまたは全く採取されない。
このような場合、切断反応は完了前に終了され、標的
ポリペプチドを反応混合物から除き、残りの融合ポリペ
プチドは再び切断にかけるか、または事実上再回収す
る。この戦略はプロテアーゼが第２のより反応性の低い
切断部位を攻撃する前に反応液から標的ポリペプチドを
除去するのでその損失を減じる事ができる。本再回収切
断法は相互係続中の米国特許出願の連続番号（代理人管
理番号第CRP−014号）のものに（これと同じ日付で出
願）記載されており、その記載はここに参考文献として
含まれている。
もしくは、その構造において切断を受ける残基を切断
反応条件下、切断を受けない化学的に同等な残基と置換
するためDNAレベルでそのアミノ酸配列を変化さる事に
より標的ポリペプチドの切断を避ける事ができよう。類
似の戦略により望まれない両親媒性ヘリックスの切断も
避ける事ができる。このようにして、黄色ブドウ球菌Ｖ
−８プロテアーゼが前もって選択された切断剤の場合、
ヘリックスの構造中Glu残基は荷電残基（Ｃ）として使
用されるべきではない。切断反応は黄色ブドウ球菌Ｖ−
８プロテアーゼがGlu残基を切断するがAsp残基は切断し
ないまたはより遅い速度で切断する条件下で実施され
る。例えばアルカリ性媒質中（例えばpH約8.0）、酢酸
または炭酸イオンが存在するとGlu切断を促進し、Asp切
断を最小にする。このアミノ酸置換技術を用いた場合、
しばしば標的タンパク質中の全ての潜在的切断部位を置
換する必要はない、なぜなら多くの場合これらは復元さ
れた標的タンパク質の立体化学的障害によりエンドプロ
テアーゼ加水分解されないであろうからである。
以下の実施例はより十分に本発明の良好な特色を例示
している。
〔実 施 例〕
ヒト表皮増殖因子およびカルシトニンのごとき比較的
短い標的ポリペプチドの産生に有用な両親媒性ヘリック
スの設計において、オリゴヌクレオチドを合成し、それ
らを一緒に結合し、以下に示したタンパク質をコードし
ている組換え体DNAを産生する事により一連の両親媒性
ヘリックス原型を構成し評価した。
Ah4AおよびAh5AリーダーのためのDNAコード配列は、
ホスホラミダイト化学を用い各々15塩基の重なり、相補
DNAフラグメントを合成する事により生成する。内部フ
ラグメントはリン酸化されており（５′OHヘリン酸基が
付加）、一方、フラグメントの結合の間遺伝子セグメン
トの重合を防ぐため末端フラグメントはリン酸化しない
で残してある。左の（アミノ末端）合成遺伝子末端はEc
oRI相補末端として残し、一方右手側末端は典型的にはB
amHI相補末端を持つ。
Ah3リーダーのためのDNAコード配列はバイオサーチ
（Biosearch）オリゴヌクレオチド合成装置中ホスホラ
ミダイト化学を使用し、各々74塩基の２つの相補DNAフ
ラグメントから生成される。ヘリックス領域のヌクレオ
チド配列の設計においては、アミノ酸配列AlaLysのため
の可能なコドンが配列中のそのような位置でのEspI制限
部位の介在を可能にする。この部位は遺伝子の更なる修
飾に非常に有用である、なぜならそれは高度に特異的で
あり使用されるクローニングベクターには存在しないか
らである、pUC8（VieraおよびMessing（1982），ジーン
（Gene）19:259）。その結果、第３のヘリックスセグメ
ントのためのコード領域の始めの部分に単一のEspI部位
が含まれる事になる。続いて、EspI末端を持つモデルＢ
二量体のためのDNAを合成し、それを独特のEspI部位でD
NA配列を切断する事によりAh3Bリーダーのための配列に
挿入し、Ah5Bヘリックスの為のコード配列を形成する。
合成DNAはリンカー突然変異誘発法を用いてクローン
化する。最初のAh3Bコード配列のためのDNAはそのよう
にして作製し、二量化せしめると二重らせんを形成し、
重なり末端は残り、最初のNcoI制限部位および末端BamH
I部位に一致する。合成DNAはこれらの部位およびNcoI部
位のすぐ次のEcoRI部位を含むpUCプラスミド内へクロー
ン化する。Ah3BおよびAh5Bコード領域はいくつかの前か
ら存在する切断部位を持つEGF遺伝子の前に移動させる
事ができ、リーダー切断部位−EGF構成物を形成する。
一連のヘリックス多量体領域のためのDNAコード配列
を生成する別の方法は、３つの組のDNA領域を合成する
事である：一つは最初のMetコドン（ATG）および左方に
隣接するクローニングのための制限部位を含む、第一の
らせん状セグメントをコードしており、一つの組は一つ
の最初のセグメント（例えばAlaからAla）をコードし、
および一つの組は切断部位および標的タンパク質遺伝子
のためのDNAへヘリックスのためのDNAを連続するため、
右方に隣接する制限部位を持った最後のらせん状セグメ
ントをコードしている。DNAセグメントの末端は、らせ
ん状セグメント間のAlaAla領域をカバーする相補５′張
り出し末端が残るように設計されている。末端セグメン
トおよび内部セグメントをコードするDNAの相対量を変
化させる事により、フラグメントの結合の間に生成され
るらせん状ポリマーDNAの長さを調節できる。得られる
クローンの実際の大きさはDNAレベルでの配列決定によ
り決定される。
前のヘリックス構造のリストから評価できるように、
Ah5Aは５つのセグメントオリゴマーの各々のセグメント
が総計で荷電を持たないように、Asnを側アミノ酸基、L
euおよびAlaを非極性アミノ酸、Lysを陽イオン性アミノ
酸、およびGluを陰イオン性アミノ酸として用いてい
る。発現されたポリペプチドの配列決定は、第四のセグ
メントの中のGlu残基および第一のセグメント中の第二
のAsn残基が合成の間に各々LysおよびSer残基で置換さ
れていた事を示している。ヘリックスAh4Aはただ４反復
単位が用いられている事を除いてAh5Aと同一である。配
列決定は第一セグメントの第一のAla残基が合成の間にV
alに置換されていた事を明らかにした。ヘリックスAh3B
は３つの反復単位を用い、Ah5Bは５つの反復単位を用い
ており、その中でHisを側アミノ酸として使用してあ
り、Ah5AおよびAh4Aヘリックスの構造ではAspがGluで置
換されGlnがAsnで置換されている。
ヘリックス5h5Aは以下のアミノ酸配列を持つ融合タン
パク質として発現される： Met−（Ah5A）−Asp−Pro−Pro−Pro−Glu−Arg−Arg−
（EGF） 〔式中EGFはヒト表皮増殖因子のアミノ酸配列である〕 Asp−Pro−Pro−Pro−Gluは蝶番として働き、Leu−Ar
g−Arg配列は1M尿素中pH8でトリプシ消化ができる切断
部位を含む。この融合タンパク質は発現により容易に封
入体を形成し、それは25％の全細胞性タンパク質および
80％の不溶性タンパク質からなる。理論から予測される
ように、融合タンパク質はpHの変動による溶解性の有意
な変化を示さなかった。
封入体を含む凍結細胞を約100mg/mlの濃度で洗浄溶液
（25％ショ糖,25mMトリス,pH8および10mM EDTA）に懸
濁する。細胞を遠心分離し、ペレットを前述の溶液に１
％界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えた溶液
に再懸濁し、０℃にて30分間維持する。遠心分離後界面
活性剤を除くため洗浄溶液で細胞ペレットを再び洗浄
し、遠心分離し、0.01％リゾチームを加えたトリス−ED
TA緩衝液に再懸濁し、一度凍結して融解し、氷上で30秒
２度超音波処理する。封入体および細胞破片は遠心分離
により再び分離し、ペレットを6M尿素、20mMトリス、pH
8に再懸濁し封入体を溶解する。残った固体は遠心分離
により分離し、溶解された融合タンパク質を含む上澄液
は尿素で希釈し、最終濃度1Mとなす。
可溶化タンパク質の試料はトリプシン（２μg/mlおよ
び10μg/ml）で各々15分および１時間消化する。低プロ
テアーゼ濃度での15分間の消化によりEGF融合タンパク
質が100％切断される。EGFの５つのＣ−末端アミノ酸も
またこの反応で部分的に切断される。
第２の実験においては、超音波処理の前に１％CHAPS
緩衝液（３〔（３−クロラミドプロピル）ジメチルアン
モニモ〕−プロパンスルホナート）を加える事を除いて
前に示したごとく封入体が調製および切断される。消化
生成物はポリアクリルアミドゲル上で分離される。EGF
抗体にイムノブロッティング処理によりほゞ正しいEGF
分子量の消化フラグメントが生成されていた事が示され
る。より大きい分子量夾雑物および消化フラグメントは
C18カラムに10％CH3CNで充填、洗浄し、60％CH3CNで溶
出する事によりEGF生成物から容易に除去できる。
両親媒性ヘリックスとしてAh4Aを用いる前記と類似の
融合ポリペプチドはらせん構造の４つの反復単位の為溶
解性が上がる事が証明されるのを期待して発現された。
融合タンパク質は下記の構造を持つ： Met−（AH4A）−Asp−Pro−Leu−Pro−Glu−Leu−Ser−
Arg−EGF この構成物において、蝶番中のトリペプチドPro−Leu
−Proはアルギニル切断部位へのトリプシンの到達性を
増加させている。
この修飾融合タンパク質は発現により容易に封入体を
形成し、それは20％の全細胞タンパク質からなり、中程
度のイオン強度の媒質に可溶性である。したがって、そ
れは1M尿素中pH8でトリプシンにより連続的に切断され
る。
25mg/mlの細胞を使用し、第２工程においてドデシル
硫酸ナトリウムの代わりにCHAPS緩衝液（10mM）を使用
する事を除いて前記のごとくして封入体が調製される。
期待されるごとく融合ポリペプチドAh5A構成物よりも溶
解性が高く、より強い界面活性剤前洗浄により有意な生
成物の損失が起こる。その結果、封入体はより多くの夾
雑物を含み、その中のある物はジメチルスルホキシドの
ごとき溶媒および0.1M酢酸により除去できる。
1M尿素、2mMトリス、pH8、0.1mM EDTAに可溶化した
封入体からのタンパク質は直接消化するかまたはフェニ
ルシリカから30％CH3CNおよび5mMホウ酸緩衝液（pH8〜
９）で溶出して精製される。消化は100,10,1.0および0.
1μg/mlトリプシン（pH8）を用い、37℃で３または10分
実施する。１μg/mlトリプシンでの３分間の消化でシリ
カ精製物質の半分以上の切断に明らかに十分である。
Ah3B両親媒性ヘリックスは下記の配列を持つ融合タン
パク質として発現される： ShLE−Met−（Ah3B）−Asp−Pro−Asp−Pro−Asp−Ala
−Ala−Ile−Glu−Gly−Arg−EGF 〔式中、ShLEは短いTrpリーダー配列 （Met−Lys−Ala−Ile−Phe−Val−Leu−Lys−Gly−Ser
−Leu−Asp−Arg−Asp−Leu−Glu−Phe） を表わす〕 Asp−Pro−Asp−Pro−Asp−Ala−Ala配列は蝶番領域を
含み、Ile−Glu−Gly−Arg配列はファクターXa切断の認
識部位である。
３つのセグメントのヘリックスリーダー部ではTrpリ
ーダーが構成物の一部を構成していないと封入体は形成
されない。Ah5Bリーダー構成物はShLEリーダーに結合し
ていてもいなくても細胞内封入体を産生する。細胞を25
％ショ糖、25mMトリス、10mM EDTAおよび100mM NaCl
にて０℃１時間洗浄してタンパク質を回収する。細胞を
遠心分離し、一度5mMトリス、2mM EDTAで洗浄し、凍結
し、融解し、10mM EDTAとなし、0.01％リゾチームと混
合し、氷上で30秒超音波処理した後再び遠心分離して封
入体を採取する。
封入体を8M尿素およびゲル試料緩衝液に溶解し、得ら
れた溶液を15ポリアクリルアミドゲル上に充填する。構
成されたハンドを切り出し、タンパク質は室温で16時間
受動的に水中へ溶出する。ベーターメルカプトエタノー
ル（BME）をそのまゝで溶液に添加して0.1％の濃度と
し、2M濃度にするのに十分量の尿素および0.1％の濃度
にするのに十分量のコール酸ナトリウムを添加する。こ
の溶液はその後ａ）5mMトリス、pH7.5、0.1％コール酸
ナトリウム、2M尿素、1mM還元型グルタチオンおよび100
mM酸化型グルタチオン;b）コール酸ナトリウムを除いた
同じ溶液;c）コール酸ナトリウムおよび尿素を除いた同
じ溶液；およびｄ）50mMトリスpH8.4に対して透析す
る。
切断は14μ容量で約１μｇタンパク質150mMトリ
ス、pH8、5mM Ca++および7.5μU,75μＵおよび750μＵ
ファクターXaで37℃にて１時間実施する。低ファクター
Xa濃度では自然のままのEGFの明瞭なバンドが産生され
た。
溶解特性に関して両親媒性ヘリックス構造を更に評価
するため、バイオサーチ固相ペプチド合成装置を用いて
以下の合成二量体が合成された。
ヘリックスＰ−72はヘリックスAh5Aの二量体型から成
る。ヘリックスＰ−81もまたヘリックスAh5Aの二量体型
から成っている。荷電アミノ酸として陽イオン性Lys残
基がHisで置き換えられている事を除いて各々の単位はA
h5Aと同一である。Ｐ−87もまたGlnがAsnの代わりに側
アミノ酸残基として使用され、Ah5Aの中心の非極性Leu
残基がHisに置き換えられている事を除いて、Ah5Aと類
似の２つの反復単位を含んでいる。
この３つの合成ペプチド二量体は異った溶液条件下非
極性相と異った相互作用すると期待される。
二量体Ｐ−72は総荷電がゼロで、中性付近のpH範囲で
滴定される残基を含まない；それ故、Ｐ−72はpHに依存
しない方法で非極性総と会合または相互作用をすると期
待される。
ペプチドＰ−81は一方、低pH（７以下）でHisが荷電
されると総荷電がゼロになり、高pHでHisが荷電を失っ
ている場合は陰イオン的に荷電するようになる。その結
果、Ｐ−81は高pHより低pHで非極性相とより強く相互作
用すると予想される。逆にペプチドＰ−87は低pHでは正
に荷電し、高pHでは中性となると期待されるので、His
が滴定され中性となる高pHにおいて非極性相とより強く
相互作用すると予想される。大腸菌の細胞内pHは約7.6
であるので、Ｐ−87は生理的条件下では会合すると予想
される。さらに、Hisは非極性領域に位置しているの
で、Hisが荷電した場合、非極性会合相互作用は強く阻
害されるべきであろう。
合成ヘリックスの性質がそれらの予想される性質に対
応しているかどうかを決定するため、非極性（Ｃ−18）
固定相を用いてHPLCカラム上で各々を試験した。
合成ペプチド溶液の試料を注入し、溶出時間（カラム
の底から出てくる時間）を測定した。カラムの空げき時
間はクエン酸塩または酢酸塩のごとき小さな荷電分子を
注入する事により測定した。水性移動相に可溶化した試
料の割合は（疎水性固定相に結合したものに対し）は空
げき時間を試料溶出時間で割る事により決定した。空げ
き時間で出てくる試料は完全に移動相可溶性であり、一
方もし２倍の空げき時間で出てくるものは半分移動相に
溶解し、半分は固定相に結合しているものである。この
方法により、各々の合成ペプチドの疎水性固定相と比較
した親水性移動相への親和性をpHの関数として測定でき
る。
HPLCカラムはいくつかの異った緩衝液の一つを使用
し、アイソクラティック（一定の溶出）に操作する。合
成ペプチドの溶出時間は使用したアセトニトリルの濃度
に非常に敏感であった。このため、すべての緩衝系に対
し13％の値が用いられ、その濃度でのペプチドの溶出時
間が結成され、空げき時間の２から20倍程度であった。
使用された特定の緩衝液系のランニングpHは液Ａおよび
Ｂの比を変える事により調製し、ここで溶液Ａは低pHで
あり、溶液Ｂは高pHである。カラムは214nm吸光度ベー
スライン安定性により判断されながら平衡化される。平
衡時間はある場合には数時間まで変化し、特に緩衝液系
のpH緩衝化能力が低い場合は長い。
使用された緩衝液系は以下のごとくである:pH範囲6.8
から8.0には:Aは10mMナトリウムイオンを含む10mMリン
酸塩およびＢには20mMナトリウムイオン;pH範囲4.0から
5.5には:Aには5.3mMのナトリウムイオンを含む10mM酢酸
塩およびＢには9.5mMナトリウムイオン;pH4.0から8.0に
は:Aに0mMのナトリウムイオンの10mMリン酸塩、10mM酢
酸塩およびＢには20mMナトリウムイオン;pH範囲6.0から
9.0には:Aには10mMナトリウムイオンを含む5mMリン酸
塩、5mMピロリン酸塩およびＢには20mMナトリウムイオ
ン;pH範囲4.0から10.0には:Aには12mM酢酸イオンを含む
5mMリン酸塩、5mMピロリン酸塩、20mMナトリウムイオン
およびＢには0.8mM酢酸イオン。pHを変化させるため荷
電イオンの濃度を変えねばならないので、pHの変化に付
随するこれらの緩衝液系における移動相のイオン強度の
変化がある。これらの系において、陽イオンが変化する
とpHの増加に伴いイオン強度が増加し、一方陰イオンが
変化する系ではpHが増加するとイオン強度は減少する。
図５はヒスチジンを含まないＰ−72ペプチド二量体の
これらの実験の結果を示している。グラフは分配係数の
変化を示しており、それはpHの関数として、移動相へ分
配されるヘリックスの割合を表わしている。図示したご
とく、pHが増加するとペプチドは疎水性（固定）相内へ
の分配が増す。実験したpH範囲内で滴定されるアミノ酸
残基を含まないのでそのような効果はこのペプチドにお
いては予想されない。この効果は使用された緩衝液のイ
オン強度がpHの増加により幾分増加し、それによりヘリ
ックスおよび疎水性固定相間の疎水性相互作用が増加し
たためであろう。
図６はヒスチジン含有ヘリックスＰ−81のデータを示
している。このデータは移動相内へ分配されたヘリック
スの割合がpHの増加と伴に増加している事を示してい
る。高pHではＰ−81は総計で負の荷電を持つと予想さ
れ、それゆえ非極性固定相に比較して水性移動相に親和
性を持っているのでこれは予想された結果と一致する。
図７はヘリックスＰ−87を用いたこれらの実験の結果
を図示している。図示したごとく、および予想される振
舞いと一致して、ヒスチジン残基が低pHで荷電されてい
る場合らせん状二量体はイオン性媒質（移動相）に高親
和性を持ち、一方約pH6.5以上では比較的低いが本質的
に一定のイオン性媒質への親和性が観察された。
別の実験においては、入射光に対し90゜の合成ペプチ
ド溶液による光散乱の量の変化を、pHおよびイオン強度
変化の結果としての自己会合の程度の変化の追跡に使用
した。散乱光はパーキン−エルマーLS5ルミネセンス分
光光度計を用い、励起および発光モノクロメーターの両
方を300nmの波長に調整して観察された。各々のペプチ
ドを蒸留水に加え濃度を増加させるか、もしくは酸およ
び塩基性条件間の変化のため酢酸および水酸化ナトリウ
ムを添加した。これらの滴定の結果は以下の表Ａに示し
てある。その中の値は同一条件溶媒により散乱される光
の量に対し相対的な溶液の散乱光の量を反映している。
Ｐ−81に対するデータで観察されるごとく、pHが中性
より低下した場合（ペプチドは総計で荷電がなくなり会
合しやすいと予想される）、一つの例において散乱光の
増加が観察された。逆にpHが中性より上がると（ペプチ
ドは負の総荷電を持ち解離すると予想される）、散乱光
の減少が観察された。一方、Ｐ−87は余分の荷電を運ん
でおり、Ｐ−81のちょうど反対に振舞う事が予想され
る。Ｐ−87の溶液からの散乱光変化は予想されたごとく
変化している。
本発明はその精神および範囲から離れる異なく他の特
定の形で具体化する事ができるであろう。
従って、他の具体例も以下の請求の範囲に含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ハストン，ジェームズ・エス アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02158，ニュートン，ホイットモアー・ ロード 41 (72)発明者 リッジ，リチャード・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01720，アクトン，デービス・ロード 23，シー２

Claims (14)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】形質転換体中の組換え体DNAにより発現可
    能な、標的ポリペプチドおよびこれと連結したペンダン
    トポリペプチドからなる融合タンパク質であって、 前記ペンダントポリペプチドは、水性溶液中で中心軸、
    相対する親水性および疎水性横表面を持つ両親媒性のア
    ルファヘリックス構造を有し、該疎水性表面は軸方向に
    関して互いに近く位置するいくつかの非極性アミノ酸残
    基を含み、該親水性表面は軸方向に関して互いに近く位
    置するいくつかの荷電したアミノ酸残基を含み、 前記ペンダントポリペプチドは下記の構造式： （Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｃ−Ｎ）ｂ 〔式中、ｂは１ないし30の整数であり;Nは非極性アミノ
    酸残基の群から選択される一員であり、および式中の複
    数のＮは一緒になって前記疎水性表面を規定し;Cは荷電
    したアミノ酸残基の群から選択される一員であり；およ
    び式中の複数のＣは一緒になって前記親水性表面を規定
    し;Sは親水性の中性アミノ酸残基の群から選択される一
    員であり、そして前記Ｎ、ＣおよびＳの二つまではそれ
    ぞれ別個にヒスチジン残基であり得る。〕 で表されるプロリンを含まないポリペプチドであり、 前記融合タンパク質はそれが発現される宿主微生物中で
    不溶性の凝集体を自発的に形成することを特徴とする前
    記タンパク質。
  2. 【請求項２】Ｎがフェニルアラニン、ロイシン、イソロ
    イシン、バリン、アラニン、トリプトファンおよびメチ
    オニンからなる群から選択される請求の範囲第１項記載
    の融合タンパク質。
  3. 【請求項３】Ｃがアスパラギン酸、グルタミン酸および
    リジンからなる群から選択される請求の範囲第１項記載
    の融合タンパク質。
  4. 【請求項４】前記のＣの一つがアスパラギン酸およびグ
    ルタミン酸からなる群から選択される、前記Ｃの他方が
    リジンであり、それにより前記Ｃの一つが陽イオン性ア
    ミノ酸残基であり、および他方が陰イオン性アミノ酸残
    基である請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
  5. 【請求項５】標的ポリペプチドのアミノ酸残基は全体的
    に第一の極性の正味荷電を与え、およびＣのアミノ酸残
    基はペンダントポリペプチドに前記第一の極性と逆の正
    味荷電を与えることを特徴とする請求の範囲第１項記載
    の融合タンパク質。
  6. 【請求項６】前記Ｎの少なくとも一つがヒスチジンであ
    るか、前記Ｃの少なくとも一つがヒスチジンであるか、
    前記Ｓの少なくとも一つがヒスチジンもしくはグルタミ
    ンである請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
  7. 【請求項７】前記ペンダトポリペプチドが次式； （Ala−Lys−Asn−Leu−Asn−Glu−Ala）d; （Ala−Lys−Gln−Leu−His−Asp−Ala）d; （Ala−His−Asn−Leu−Asn−Glu−Ala）d; （Ala−Lys−Gln−His−Gln−Glu−Ala）d; 〔式中、ｄは１ないし10の整数である〕 からなる群から選択されるポリペプチド構造を組む請求
    の範囲第１項記載の融合タンパク質。
  8. 【請求項８】標的ポリペプチドを発現する細胞性宿主内
    で前記標的ポリペプチドを含む封入体の形成を促進する
    方法であって、以下の工程からなる方法： 読み枠内でペンダントDNAを前記標的ポリペプチドをコ
    ードするDNAへ連結して融合DNAを産生し、 ここで、前記ペンダントDNAは中心軸および相対する親
    水性および疎水性横表面を持つ、プロリンを含まないア
    ルファらせんポリペプチドをコードするヌクレオチド配
    列からなり、該疎水性表面は軸方向に関して互いに近く
    位置するかいくつかの非極性アミノ酸残基を含み、該親
    水性表面は軸方向に関して互いに近く位置するいくつか
    の荷電アミノ酸残基を含み、前記アルファらせんポリペ
    プチドは下記の構造式： （Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｃ−Ｎ）ｂ 〔式中、ｂは１ないし30の整数であり;Nは非極性アミノ
    酸残基の群から選択される一員であり、および式中の複
    数のＮは一緒になって前記疎水性表面を規定し;Cは荷電
    したアミノ酸残基の群から選択される一員であり；およ
    び式中の複数のＣは一緒になって前記親水性表面を規定
    し;Sは親水性の中性アミノ酸残基の群から選択される一
    員であり、そして前記Ｎ、ＣおよびＳの二つまではそれ
    ぞれ別個にヒスチジン残基であり得る。〕を有するもの
    であり、且つ前記アルファらせんポリペプチドは前記細
    胞性宿主内で不溶性凝集体を形成することを特徴とす
    る； 前記細胞性宿主中に、前記標的ポリペプチドをコードし
    て発現することができる前記融合DNAを導入し； 前記融合DNAを前記細胞性宿主中で発現させて、該融合D
    NAによりコードされる標的ポリペプチドを含む融合タン
    パク質の不溶性凝集体からなる封入体を形成させ； 前記封入体を前記細胞性宿主から分離し；そして 前記融合タンパク質を開裂させて前記標的ポリペプチド
    を遊離させる。
  9. 【請求項９】前記発現工程の間、前記融合DNAがその総
    重量の少なくとも約10％が前記融合タンパク質であるよ
    うに前記不溶性凝集体を産生する、請求項第８項記載の
    方法。
  10. 【請求項１０】前記分離工程が、前記細胞性宿主から封
    入体を集め；該封入体を第一のイオン強度の溶媒に溶解
    し；そして溶解した封入体を第一の溶媒と異なる第二の
    イオン強度の溶媒で処理して、溶液中に含まれる融合タ
    ンパク質を再沈殿させる；ことを含む請求項第９項記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】分離工程が、前記細胞性宿主から封入体
    を集め；該封入体を第一のpHの溶媒に溶解し；そして溶
    解した封入体を第一の溶媒と異なる第二のpHの溶媒で処
    理して、溶液中に含まれる融合タンパク質を再沈殿させ
    る；ことを含む請求項第９項記載の方法。
  12. 【請求項１２】ペンダントポリペプチドに連結した標的
    ポリペプチドからなる融合タンパク質をコードする組換
    えDNAであって、 前記ペンダントポリペプチドは、水性溶液中で中心軸、
    相対する親水性および疎水性横表面を持つ両親媒性のア
    ルファヘリックス構造を有し、該疎水性表面は軸方向に
    関して互いに近く位置するいくつかの非極性アミノ酸残
    基を含み、該親水性表面は軸方向に関して互いに近く位
    置するいくつかの荷電したアミノ酸残基を含み、且つ前
    記ペンダントポリペプチドは下記の構造式： （Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｃ−Ｎ）ｂ 〔式中、ｂは１ないし30の整数であり;Nは非極性アミノ
    酸残基の群から選択される一員であり、および式中の複
    数のＮは一緒になって前記疎水性表面を規定し;Cは荷電
    したアミノ酸残基の群から選択される一員であり；およ
    び式中の複数のＣは一緒になって前記親水性表面を規定
    し;Sは親水性の中性アミノ酸残基の群から選択される一
    員であり、そして前記Ｎ、ＣおよびＳの二つまではそれ
    ぞれ別個にヒスチジン残基であり得る。〕 で表されるプロリンを含まないポリペプチドであり、 前記融合タンパク質はそれが発現される宿主微生物中で
    不溶性の凝集体を自発的に形成することを特徴とする、 上記組換えDNA。
  13. 【請求項１３】請求の範囲第12項記載の組換えDNAで形
    質転換された宿主細胞。
  14. 【請求項１４】請求の範囲第12項記載の組換えDNAを含
    むベクター。
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