JPH01503117A

JPH01503117A - 組換え体タンパク質製造のためのリーダー配列

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Publication number: JPH01503117A
Application number: JP63502689A
Authority: JP
Inventors: ケック，ピーター・シー; コーヘン，チャールズ・エム; ハストン，ジェームズ・エス; リッジ，リチャード・ジェイ
Original assignee: クリエイティブ・バイオマリキュールズ・インコーポレーテッド
Priority date: 1987-03-20
Filing date: 1988-03-04
Publication date: 1989-10-26
Anticipated expiration: 2011-09-18
Also published as: EP0305481B1; AU601273B2; AU1482488A; JP2535066B2; DE3884529D1; DE3884529T2; EP0305481A1; WO1988007086A1; CA1334943C

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】組換え体タンパク質製造のためのリーダー配列〔発明の背景〕本発明は遺伝子工学技術を用いて製造されるポリペプチドの製造および精製に関する。特に高発現の促進および融合生成物の単離および精製に有益な新規アルファらせん両親媒性アミノ酸配列を含む遺伝子工学による融合ポリペプチドに関する。

外来性遺伝子を種々の細胞に取込ませる事ができる組換え体ＤＮＡ技術の進歩により、細胞にとって外来性である生成物の発現が可能になってきた。しかし、関心あるタンパク質は細胞内酵素によりしばしば分解されるであろうし、それを宿主微生物により発現される他の物質および宿主の構造物質を含む他の物質から分離するのは困難であろう。細胞内分解からの防御は、細胞内酵素による消化を避けるため標的タンパク質にアミノ酸配列を融合する事により達成される。さらに、もし所望のタンパク質が精製の際利用できる特徴を持つポリペプチドと融合されるなら、単離および精製を容易にするように工夫できる。

関心あるタンパク質をコードする遺伝子の関心あるタンパク質以外のポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列への結合を特徴とするＤＮＡにより融合生成物はコードされている。融合方法論は一般的に先行技術により詳細に議論されている。例えばヨーロッパ特許出願第００４７６００号は融合タンパク質を産生じ、ホルモンの合成方法について記載していると理解される。他のタンパク質も融合技術を用いて産生されてきた。

先行技術は一般的に、切断部位をコードしている遺伝物質を所望のタンパク質をコードしているＤＮＡと付加的な融合物質をコードしているＤＮＡの間に取り込ませる事ができる事を教えている。発現により、選択的切断部位を決定している一つまたはそれ以上のアミノ酸およびその他のアミノ酸配列に結合した標的ポリペプチドのアミノ酸配列を含む前駆体タンパク質を得る。例えば、ＥＰＯ００３５３８４、ＥＰＯ０１６１９３７およびＥＰＯ０１８３５７３を参照されたい。

融合生成物はまたその単離を容易にするように工夫された部分を含む事もできる。例えばＰＣＴ／１４１０３１０３および米国特許出願第４．４３１．７３９号を参照されたい。

本発明の目的は、遺伝子工学によるタンパク質の産生、単離および精製のための方法を提供する事である。関心ある組み換え体タンパク質をより良い収率で得るだめの方法を提供する事も目的である。宿主微生物のためにコードでき発現される任意の関心あるポリペプチドに適用できる方法を提供するのもほかの目的である。高水準の発現を誘導し、細胞性宿主中で不溶性会合体（封入体）を形成する事を特徴とする融合ポリペプチド生成物をつくり、融合ポリペプチドの再可溶化および精製を可能にする先導配列の新規の群を提供するのも目的の一つである。

さらに、効率的で安価なそのような方法を提供するのも目的の一つである。

本発明のこれらおよびその他の目的は以下の記述、図および請求の範囲から明らかになるであろう。

〔発明の開示〕

広くいえば、標的ポリペプチドを発現できる組換え体宿主細胞内で、関心ある標的ポリペプチドに冨んだ不溶性会合体または封入体の自発的形成を促進する方法を本発明は特色とする。

本発明には種々の様相があり、形質転換体中の組換え体ＤＮＡにより発現可能な融合タンパク質、融合タンパク質をコードしている組換え体ＤＮＡおよびこれらの試薬を用いて関心あるポリペプチドを製造する方法を提供する。リーダーまたはトレーラ−配列でもよく（標的のアミノまたはカルボキシル末端に各々結合している）、また水溶液中では中心軸および向いあった親水性および疎水性桟表面を持つ両親媒性アルファらせん構造を持つペンダントポリペプチドに結合した標的ポリペプチドを融合タンパク質は含んでいる。疎水性表面はヘリックスの胴上の軸方向の円周のすぐ次に非極性アミノ酸が配置されているのを特徴とする。親水性表面は軸方向の円周のすぐ次が荷電したアミノ酸からなっている。

原核細胞発現系で先導配列として使用した場合、両親媒性ヘリックスをコードしているＤＮＡは高発現水準を誘導する、即ち、少くとも細胞の総発現タンパク質のｌθペパーント、典型的には３０から４０バーセント、場合によっては５０パーセントの高率の水準での融合ポリペプチドの産生がみられた。融合タンパク質はそれが発現される宿主細胞内で不溶性の凝集体（会合体）を自発的に形成する能力により特徴付けられ、それにより生成物の製造および単離を容易にする。

好適な実施例においては、融合タンパク質のペンダントポリペプチドはプロリンを含まない次の構造：（Ｎ−Ｃ−８−Ｎ−３−Ｃ−Ｎ）　ｂ〔式中Ｎは各々非極性アミノ酸残基であり、Ｃは各々荷電アミノ酸残基であり、Ｓは各々中性アミノ酸残基であり、ｂは１から３０の整数である。〕のポリペプチドであり、各々の反復セグメント中のアミノ酸残基の２つまではヒスチジンであろう。ポリペプチドがヘリックスコンホメーションをとったと仮定した場合、荷電したアミノ酸残基は一緒になって親水性表面を決定し、非極性アミノ酸残基は一緒になって疎水性表面を決定する。

好適な非極性、荷電および連結残基は残基の型（例えばＮ。

ＣまたはＳ）、およびタンパク質２次構造の文献中で定義され、　。

表１に示したそのらせん形成能力の両方により決定される。

表　１アルファへリックス形成傾向の機能によるアミノ酸残基の選択残基群、Ｎ　Ｃ５Ｔｒｐ　１．０８　Ａｒｇ　Ｏ，９８Ａｓｎ　Ｏ，６７１１ｅ　１．０ｇＶａｌ　１．０ＢＨｌｓ　１．００Ｃ１ｙ０．５７ ’　ＦａｓｍａｎおよびＣｈｏｕ　（アニニアル　レビュー　オブ　バイオケミストリーＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　１９７８．４７　：　２５１ −７６）によるタンパク質２次構造文献中で定義されているヘリックス形成傾向。１．００以下の値では、残基はへリックス領域を崩壊させる傾向が強い。

アルファらせんの両親媒構造中で使用される好適な非極性残基には、メチオニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシンおよびバリンが挙げられる。この組の中で、アラニンおよびロイシンがヘリックス− へリックス会合間の立体的充填上の考察から好適である。好適な荷電残基としてはグルタミン酸、リジンおよびアスパラギン酸が挙げられる。好適な側残基（前記参考式中Ｓと称されている）はグルタミンである。アスパラギンが使用されてきたけれどもそれは貧弱なヘリックス形成残基である。一般的に、大部分のへリックスが既知の良好なヘリックス形成剤からなっているが、ヘリックス形成剤が低い残基も許容される。しかしながら、らせん領域を中断する事が知られているプロリンはこの場合ではない。

多くの例において、両親媒性ヘリックスの胴の一つの側面上の親水性表面が正味中性荷電を持つようにヘリックスの各々の７つのアミノ酸セグメントが陰イオン性アミノ酸および陽イオン性アミノ酸の両方を含む事が好適である。他の例において、特に標的ポリペプチドへ正味の荷電を集団的に与えるアミノ酸残基を特徴とする標的ポリペプチドの場合、ヘリックス中の一つまたはそれ以上のセグメント内の荷電は逆の荷電が選択されるべきであり、結局、融合タンパク質は中性である。さらに、ポリペプチドのＮ−末端（＋）への負に荷電した基の配置、およびＣ−末端（−）への正荷電基の配置により、ヘリックスに沿ったペプチド結合を通して双極子モーメントの形成を生み、そのためへリックス安定性を促進する（Ｓｈｏｃａ＋ａｋｃｒら、１９８５゜ヒスチジンは酸性または中性溶液中で荷電した陽イオン形、および塩基性溶液中で中性の形をとるのでヘリックスセグメント中の種々の部位に使用できる。荷電したヒスチジンはまた親水性である。ヒスチジン含有オリゴマーからなるヘリックスは容易に精製できる封入体を形成できる。例えば、２つの異ったｐＨでイオン交換体中を封入体を溶解した溶液を続けて通過せしめる事によりかなりの濃度の融合タンパク質を得る。

融合タンパク質をコードし、発現できるＤＮＡを細胞性宿主に挿入する事を含む本発明の方法は、宿主に融合タンパク質を封入体の形で発現せしめ、細胞性宿主から封入体を分離し、標的ポリペプチドの放出のため融合タンパク質を切断する事ができる。

融合タンパク質の先導部がＨｉｓを含んでいる場合、融合タンパク質は、第２の異ったイオン強度または異ったｐＨを持つ媒体に封入体を溶解せしめる事により、細胞内の他の異種タンパク質から都合よく分離される。

中性両親媒性ヘリックスの凝集（会合）傾向は、高イオン強度媒質中では疎水性表面の相互作用の増加により、低イオン強度媒質中では親水性表面の相互作用の増加により促進される。

ｐＨ変化によりＨｌｓ−含有へリックスの総荷重を変動させる能力はこれらの両方の会合効果を変化させる。ヒスチジン含有へリックスの溶解性はしばしばｐＨに依存している。

現在、好適ならせん構造は以下のアミノ酸配列である＝（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｃｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）ｄ；（＾Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ −Ｈ１ｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ）ｄ；（Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ− Ｇｌｕ−Ａｌａ）ｄ；および：（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｈｌｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）ｄ；〔式中ｄは１からｌＯまでの整数である〕。

本発明の他の利点および特色は以下の記載、図および請求の範囲から明らかになるであろう。

〔図の簡単な説明〕

図１は性質の説明に有用な、本発明の両親媒性ヘリックスの２次構造の概略図であり；図２は本発明のヘリックスの非極性および極性表面を図示している図１のへリックスの概略図であり；図３は融合ＤＮＡ、融合タンパク質および標的タンパク質生成物の構造を図示したもので、本発明の実施の間に分子レベルで起こる現象を連続的に示しており；図４は本発明の全過程の概略図であり；および図５．６および７はｐＨの関数としての３つの原型へリックスの溶解度のグラフであり、溶解度はＨＰＬＣ疎水性媒質カラムの水性移動相中へ分配されるペプチドの割合として示しである。

この事は特定のへリックスの溶解性のｐＨの効果を例示している。

これらのグラフにおいて点記号は使用された以下の緩衝系に対応しているニ−１０ｍＭリン酸塩、ナトリウムイオンを１０ｍＭから２０ｍＭで変化；Δ−１０ｍ　Ｍ酢酸塩、ナトリウムイオンを５．３　ｍＭから９．５ｍＭで変化；○−１０ｍＭリン酸塩、１０ｍＭ酢酸塩、ナトリウムイオンをＯｍＭから２０ｍＭで変化；＋　−５ｍＭリン酸、５ｍＭピロリン酸、ナトリウムイオンを１０ｍＭから２０ｍＭで変化；ロー５ｍＭリン酸、５ｍＭピロリン酸、２０ｍＭナトリウムイオン、酢酸イオンを１２ｍＭから０．８ｍＭで変化。

〔発明を実施する為の最良の形態〕

関心ある種々のタンパク質の製造は、融合タンパク質を宿主細胞中で発現し、それを集め、精製した後分子の無関係部分を除去するために切断する事により以前は達成されていた。本発明はこの一般法の自明でない改良精製法である。本発明の方法は、適した宿主中（例えば大腸菌のごとき原核細胞）での発現により多足に融合タンパク質を産生ずる組み換え体ＤＮＡの遺伝子操作を一般的に含む。この融合タンパク質は数ある好都合な性質の中で、宿主細胞微生物中で細胞内封入体を自発的に形成するという利点がある。また、融合タンパク質は以下に議論する分子の他の性質の力で効果的に切断されるように設計できるであろう。

本発明は融合タンパク質の細胞内安定性および採集の容易さが、もし関心あるポリペプチドが好適にはそのアミノ末端で直接または結合配列を通して特異な性質を持つペンダントポリペプチドへ結合されると改良できるという考えに基づいている。

特に、ペンダントポリペプチドは高水準の発現を誘導でき、産生宿主細胞内の不溶性封入体の形成を促進でき、切断に先立つ融合タンパク質の精製の助けとなるように開発された。本発明の一般的な方法では、融合タンパク質をコードしており、発現される事により標的タンパク質（即ち、潜在的または論証可能な有用性を持つ興味あるタンパク質）へ結合した両親媒性アルファらせんポリペプチド構造を発現する組換え体ＤＮＡを構成する。このように発現され水性溶液に放出された場合、好適には確実にアルファへリックスを形成するようなアミノ酸配列をコードするようにＤＮＡは工夫されている。ヘリックスは好適には一つまたはそれ以上のユニットまたはセグメントを含み、それは−膜構造ＮＣ３ＮＳＣＮの７つのアミノ酸からなる。文字Ｎは一般的に非極性、疎水性アミノ酸残基を意味し；文字Ｃは一般的に荷電した親水性アミノ酸残基を意味し；および文字Ｓは側アミノ酸残基を意味する。

このようにヘリックス構造のこの型の各々のセグメントは３つの非極性残基および２つの荷電残基を持つ。もしくは、ヘリックスがＣＮ５Ｃ５ＮＣ構造を持つ事もでき、その場合各々のセグメントは２つの非極性残基および３つの荷電残基を持つ。そのような構造は好適なＮＣ３ＮＳＣＮ配列に比較して親水性性質が増し、この性質は本質的に水不溶性標的タンパク質に溶解性を与える利点を持つようにできる。もし望むならヘリックスの異ったセグメントは異った特性のアミノ酸配列を含んでいてもよい。もちろん、本発明の一般的なヘリックスの式はまた“ 位相のづれた”という呼称で表わす事ができる。このように例えば式Ｃ３ＮＳＣＮＮまたは５ＮＳＣＮＮＣで表わされるヘリックスはここに記載した好適な構造呼称と均等である。

また各々のセグメント中の各々のＣは荷電アミノ酸、各々のＮは非極性アミノ酸からなるのが良好であるが、もし置換アミノ酸が適度に良好なヘリックス形成剤およびそれゆえペンダントポリペプチドのアルファらせん構造を有意に変えないと仮定するならアミノ酸の他の型の置換が許容される。

このタンパク質がその２次構造をとる場合、異った性質の相対する表面を持つアルファへリックスとなる。一つの表面は荷電残基をすぐ近くに備え、それによりヘリックスの胴のその面に親水性性質を与える。反対側はすぐ近くに疎水性アミノ酸残基を備え、それにより反対表面に疎水性性質を与える。結合またはＳ（側）残基は好適には非荷電、親水性アミノ酸であり、その第一の機能はへリックスの疎水性および親水性横表面を結合する事である。

ヒスチジン（Ｈｉｓ）はアミノ酸の中で独特であり、それが配置された媒質に依存して陽イオン性にも中性にもなりうる。それはへリックスを構成する７個のアミノ酸セグメント中の中心非極性残基の代わりに、ヘリックスの所望の性質に依存して荷電基として、側基としてまたはそうでなくても使用できる。酸性媒質中では、ヒスチジン残基はプロトンを受けとり、陽性に荷電し親水性になる。塩基性媒質中では、ヒスチジン残基は中性のま−であり幾分疎水性となる。ヘリックス構造中にＨｌｓを使用すると溶液のｐｌを変える事により、個々のへリックス分子の総荷重および溶解性を変える事ができる。

ヘリックスの一般構造は図１に描いである。図示したごとく、ヘリックスは円柱または“胴”１０について巻いたものとして視覚化される。巻きは先に示したごと＜Ｎ、ＣおよびＳと名付けられたアミノ酸の鎖からなっている。タンパク質の構造は以下のごとくで、円柱１０の斜交平行線文様表面上にはＣまたはＳ残基のみが現れ、一方反対表面にはＮまたはＳ残基が現れ、一般的にＳ残基はＣまたは荷電残基が優勢な一つの表面とＮまたは非極性残基が優勢な他の表面の間に配置される。

反復単位として７つのアミノ酸セグメントを使用する効果は、荷電した親水性表面（ヘリックス上空間的に隣接する荷電アミノ酸残基で規定される）、および非極性表面ぐヘリックス上空間的に隣接する非極性残基により規定される）の胴の中心軸１４について最小の回転が得られる事である。それゆえ、親水性荷電表面を規定するアミノ酸および非極性表面を規定するアミノ酸が図２で概略的に示したごとく、ヘリックスの胴の反対側にいつも配置されるようになるが、アルファへリックスの幾何学的形のため、両表面はわずかな左へのらせん状ねじりを持っている。

ヘリックスに使用される好適な非極性残基はフェニルアラニン（Ｐｈｅ）　、ｏイシン（Ｌｅｕ）、アラニン（Ａｌａ）およびトリプトファン（Ｔ　ｒｐ）である。イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）およびメチオニン（Ｍｅｔ）もまた使用してもよい。プロリン（Ｐ　ｒｏ）もまた非極性であるが、主鎖に再結合し輪のようになる側鎖を持っており、そのため主鎖のわん曲を強制し、そのペプチド結合窒素のプロトン（水素結合を起こすのに必須）　。

を除去し、それにより、アルファへリックス構造を破壊する。

従ってそれはへリックスの構造には使用しないのが望ましい。

ヘリックスの構造に有用な親水性アミノ酸にはグルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）および陽イオン性アミノ酸リジン（Ｌｙｓ）　（これはアルギニンより好適である）が含まれる。ヘリックスの構成に有用な側基としてはアスパラギン（Ａ　ｓｎ）およびグルタミン（Ｇｉｎ）が良好である。シスチン（Ｃｙｓ）もまた有用な親水性アミノ酸であるが、ジスルフィド結合形成能力（それによりらせん構造を強力に破壊する）および最終生成物の切断および精製を複雑にする事により側基としては通常用いられない。

ヘリックスの設計は以下のごとくで、例えば相対的に高濃度の荷電種を含む水性溶液のごとき高イオン強度媒質中では別の分子のへソックスの疎水性表面が相互作用をしてミセルを形成する。逆に低イオン強度媒質中ではイオン性または静水性相互作用が優性となり再び会合体が形成される。これらの極端な条件の間に融合タンパク質が可溶性となる条件がある。

一つのＣが陽イオン性アミノ酸であり他のものが陰イオン性である場合、Ｓアミノ酸としてヒスチジンを使用するとヘリックスは低ｐＨでは総計で陽イオン荷電を持つ事になり、従って静電的反撥のため会合体の形成が阻害される。ｐＨが高くなると（例えばｐＨが７以上）、ヒスチジン部分は水素イオンを失い、中性となる。ヘリックスは全体で中性となり疎水性会合体の形成が許される。大腸菌で発現されたそのようなヘリックスは、細胞内ｐＨ範囲（例えば７．６）で封入体を形成する事になろう。

これらを採取し、酸性媒質（例えばｐＨ５）に分散すると、融合タンパク質が溶解するであろうし、それにより切断を含む更なる処理工程を容易にする。

特定の場合に使用されるヘリックスの単位の数は標的ポリペプチドの大きさおよび溶解特性などを考慮して経験的に決定される。一般的には、ヘリックスが支配する溶解性を確かにするため十分数の単位を用いるべきである。例えば、大きな本質的に中性の標的タンパク質で最良の結果を得るには少くとも１０セグメントを含むヘリックスと結合されるのがよいであろう。逆により小さいタンパク質（例えば５０アミノ酸）は少ない反復単位しか必要としない。

ヘリックス構成で他に考慮すべきものは個々のへリックス間のイオン性反撥の効果である。多くの場合、総荷電が中性となるように荷電アミノ酸の一つは陰イオン性で他は陽イオン性である。前に示したごとく、ヒスチジンの導入により荷電特性をｐＨ依存性とする事ができる。この−船側の例外は標的タンパク質自身が有意な総荷電を持っている場合である。この場合、Ｃ残基の適切な選択により標的タンパク賃上の荷電を中和するような荷電基を含むヘリックスを設計する事により封入体の細胞内形成を促進できる。

融合タンパク質がコードされており、標的ペプチド生産物を生じる本発明の好適なりＮＡの全構造が図３に図式的に示しである。ＤＮＡ中の対照形質はタンパク質内へ対応する原始形質として繰越される。ＤＮＡは２つの明瞭な配列が互いに結合したものから成り立っている。第一の配列は最終的には大部分またはすべてが捨てられるポリペプチドをコードしている。

第一の配列の３′または５′末端に結合しているのは標的ポリペプチド（関心あるタンパク質で最終的に採取される）をコードしているＤＮＡである。図中、制御配列の３′は第一のＤＮＡ配列８で３つの副配列をコードしているヌクレオチドを含む：１）前記本発明の両親媒性ヘリックスを含む配列１８．２）本明細書で“蝶番”または“蝶番領域°１６と称される配列および３）切断部位１４を規定するアミノ酸またはアミノ酸配列。更なるアミノ酸をコードしているＤＮＡ　（示されていない）もまた含んでもよい。切断部位１４をコードしているＤＮＡに結合しているのは関心あるタンパク質をコードしているＤ　Ｎ　Ａ　２２、である。

コードされている融合タンパク質はペンダント両親媒性ヘリックス１８′、蝶番領域１６′、切断部位１４’および標的タンパク質２２′を含む。融合タンパク質を採取および精製した後、ヘリックス１８′の性質を随意に利用して融合タンパク質を切断部位１４′で切断して生産物２２′を得る。ヘリックス１８’同様蝶番１６′、および切断部位１４′　もＤＮＡの遺伝子工学により取り込まれている。切断個所１４′の機能は前もって選択されている切断剤の作用個所として働く事である。蝶番領域１６’の機能は切断反応の速度および／または特異性を改良するためである。

関心あるアミノ酸配列をコードしているＤＮＡの取扱い、増幅および組換えの方法は、一般的に当業者にはよく知られており、ここでは詳細には記述しない。関心あるタンパク質をコードしている遺伝子の同定および分離、またはそのような遺伝子の構築はよく理解されまた発展中でもある。これらの方法は特許および他の文献に記載されている。例えば米国特許第４．４３１．７３９号を参照されたい。一般的に、遺伝子コードに従って関心あるポリペプチドを規定するアミノ酸をコードしている遺伝物質の選択がその方法に含まれる。

従って、平滑端または相補端を作るためのＤＮＡ中の配列特異性切断をする種々の制限酵素の使用、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡ平滑末端への相補末端の酵素的付加を可能にする技術、短いオリゴヌクレオチドの組み立てによる合成りＮＡの構成、ｃＤＮＡ合成技術および特定の機能を持つ遺伝子の分離のための合成プローブを含む既知の構成技術を使用して、ここに記載されたＤＮＡ構成原理が利用できる。発現の達成に種々のプロモーター配列および他の制御ＤＮＡ配列が使用され、また種々の型の宿主細胞も既知であり利用できる。通常のトランスフェクション技術およびＤＮＡのクローニングおよびサブクローニングのための同様の通常技術が本発明の実施に有用であり、当業者にはよく知られている。プラスミドおよび動物ウィルスおよびバクテリオファージを含むウィルスのごとき種々の型のベクターが使用できる。ベクターの組換え体ＤＮＡをうまく取り込んだ細胞の群を同定するのに使用できる検出可能な表現型の性質をうまくトランスフェクトされた細胞に与える種々のマーカー遺伝子をベクターは利用できる。前述の遺伝子工学技術の状態を与えると、当業者はこの発表を考慮して、ここに記載した本発明の実施ができる。

ここに記載した種々のへソックス構造をコードしているＤＮＡを得る一つの方法は適当なりガーゼで結合した後合成オリゴヌクレオチドを通常の自動化されたポリヌクレオチド合成装置中で組み立てる事である。例えば、１５塩基からなる重複、相補ＤＮＡフラグメントが、結合中の重合を防ぐため未リン酸化のま＼残した末端セグメントを用いるホスホラミダイト化学を使用して合成される。合成りＮＡの一つの末端は特定の制限酵素の作用部位に対応する“相補末端°で残してあり、他の末端は他の制限酵素の作用部位に対応する末端として残しである。

もしくは、例えばバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）オリゴヌクレオチド合成装置中より長い単一鎖フラグメント（例えば、５０−１００ヌクレオチド長）を合成し、続いてフラグメントをアニール化する事により、ヘリックスをコードしているＤＮＡを製造でき図３に示したごとく、蝶番領域１６′はＤＮＡセグメント１６によりコードされている。発現された蝶番領域１６′は、酵素的または他の消化に対し切断部位をさらすように働く少くとも２つのアミノ酸を含む切断部位１４′に隣辺するか、または近くにいる未構造のセグメントであるのが良好である。この蝶番の性質は切断反応環境下酵素または他の切断試薬への切断部位の到達性を増大し、切断部位でのアミノ酸残基（類）の好適な消化のための動力学的利益を提供する。

蝶番領域を含むアミノ酸配列は広範囲に変異できる。それはしばしば切断部位の近くの融合ポリペプチド部分に緩和し、一般的にたたまれていない配位をとる能力を与える可撓性のあるセグメントを含んでいる。それゆえ融合タンパク質が切断環境にさらされた時、構成するポリペプチドの部分に特定の２次的性質を与える能力で蝶番を規定するアミノ酸の組合せを選択する。

切断剤がその作用隣接部位へ到達するのを立体的に阻害するであろう固定された３次構造を形成しないアミノ酸から蝶番領域はなっている。この理由で、ヘリックスと伴に使用する蝶番は典型的には少くとも一つのプロリン残基を持ち、シスチン残基は含まれない。一つまたはそれ以上のプロリン残基の存在により蝶番領域におけるアルファらせん構造の形成が本質的に排除される。この場合プロリンは最も近いヘリックスの先頭により引起こされるかもしれない切断に対する立体的妨害を制限するのに働く。一方シスチンは反応性が高くジスルフィド結合を形成できるスルフヒドリルまたはチオール基を含んでいる。シスチンの存在は望まれる固定されない蝶番領域の２次または３次コンホメーシランに対し反対に働くのでその使用は避けられる。

好適には、蝶番領域は約２から２０のアミノ酸を含むポリペプチド鎖である。シスチンが含まれていないのに加え、典型的には少くとも一つのプロリン残基を含んでおり、蝶番の配列は前もって選択された切断環境下、効率的切断を促進するような設計戦略を利用している。特に、前もって選択された切断剤がエンドペプチダーゼの場合、蝶番領域が水性環境に可溶な事が重要である。溶解性促進のため、蝶番には荷電側鎖および親水的性質を持ったアミノ酸が含まれる。これらには陰イオン性残基ＧｌｕおよびＡｓｐｓ陽イオン性残基ＡｒｇおよびＬｙｓおよび中性親水性残基ＳｅｒおよびＴｈｒが含まれる。

蝶番領域の更なる特徴は本明細書と同じ日付で出願された、相互係続中の連続出願番号（代理人管理番号ＣＲＰ−００８）のものに記載されており、その記載は参考文献として含まれている。

標的タンパク質は残りの融合物質から、好適には活性型２２″としてまたは選択された切断剤により切断部位１４′が加水分解されると容易にその本来のコンホメーションを再びとれるような形で放出される。切断剤の特異性は加水分解されるペプチド結合またはその近くのアミノ酸の配列の同一性により決定される。与えられた切断剤は２つの特定のアミノ酸間の結合を認識するのであろうし、またはそれに続く結合またはアミノ酸の特定の配列を認識するであろう。

多くの切断剤の特異性が知られている。以下に示した表は種々の既知の切断剤およびその第１次の（ある場合は第２次の）作用部位を掲げている。

トリプシン　Ａｒｇ・Ｌｙｓキモトリプシン　Ｔｒｐ、　Ｐｈｃ、　Ｔｙｒ　Ｌｃｕ、　Ｍａｔ、　Ｈ１ｓエラスターゼ　中性脂肪族残基ペプシン　Ｐｈｅ、　Ｌｅｕ、　Ｔｒｐ　Ａｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｇｌｕパパ　イ　ン　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ、　Ｇｌｙ　広範囲の特異性ナーゼＡ　ｒｇ　ＣＡ　ｒｇ（下顎プロテアーゼ）クロストリパイン　Ａｒｇトロンビン　Ａｒｇ他の切断剤も知られている。本発明での使用に好適であるのは、切断部位残基のＣ−末端（標的ポリペプチドのアミノ側に結合しているかぎの手）または切断部位残基のＮ−末端部（標的ポリペプチドのカルボキシ側に結合しているかぎの手）を切断する第一次作用部位を持つ酵素である。現在最も好適な切断剤／切断部位は黄色ブドウ球菌ｖ−Ｂプロテアーゼ／Ｇｌｕである。この系を使用する場合、ヘリックス中のＣ残基としてＧｌｕの代わりにＡｓｐを使用せねばならない。

融合タンパク質中の切断部位には一般的、適当な環境下部位に特異的な切断剤により切断されうるアミノ酸またはその配列が含まれる。標的タンパク質には存在しない作用部位を持つ切断剤を選択する事により切断の特異性を上げる事ができ、標的タンパク質中または融合タンパク質の他の場合での望まれない　・切断を減少させる見込みがある。

融合ポリペプチドはその元来のコンホメーションをとる条件下で好適に切断される。この事は標的ポリペプチド中に存在する潜在的切断部位を覆う効果がある事を示す。シスチンなしでは（または対になったＣｙｓ残基を持っていると）、ペンダントポリペプチドは外来性混入物に対しジスルフィド結合なしで残っており、蝶番により助けられその切断部位は切断剤による消化に対して開いた状態で残っている。融合ポリペプチドが復元され酸化された後もし切断を実施すると、標的ポリペプチド一つまたはそれ以上のジスルフィド結合によりその３次元コンホメーションを保つであろう。

本発明はここに記載されている方法および構成法を使用して製造される標的タンパク質２２′の同一性に関しては本質的に制限されていない。本当に、本発明の重要な特色は、任意の望まれるタンパク質の組換え的製造を容易にするためにすぐに適用できる一般的な方法を提供する事である。それゆえ、本発明は成長因子、ホルモン、リンホカイン、酵素、抗体または酵素的に活性および不活性なタンパク質を含むそれらの種々のフラグメント、短いポリペプチドおよび上記すべてのものの種々の類似物に使用される。非制限的例にはＥＧＦ％ＩＧＦ−１、ＴＧＦアルファおよびベータ、ヒトコラゲナーゼインヒビター、ＰＤＧＦ％ＣＴＡＰ、インターロイキン、インターフェロン、工業酵素、トロンポン性薬剤、ウィルス被膜タンパク頁、細菌膜タンパク質、プロティンＡおよびそのフラグメントおよび種々の合成ペプチドが含まれる。

本発明に従って実施されるタンパク質製法の全方法が概略的に図４に例示しである。切断部位および蝶番領域を作る両親媒性ヘリックスおよび他の組換え体ＤＮＡ、適当な制御配列および標的タンパク質をコードしている遺伝子は、前に概述した型の多くの種類の既知の技術を用いて構成される。ＤＮＡを組み立てた後通常の技術を用い、大腸菌のごとき適した宿主細胞中に取り込まれるように設計された発現ベクターを構成する。

発現ベクター（図４中１００）は典型的には、図３のＤＮＡに対応する転写ユニット１０２および形質転換が成功しているクローンの選択を可能にする表現型特色を宿主細胞に与えるマーカー遺伝子１０４を含むであろう。融合タンパク質を発現しているクローンを大量培養し、細胞内封入体（図６中１０６）を含む多数の細胞を産生ずる。細胞を常法により溶菌し、封入体を例えば遠心分離により採取する。上澄液中の可溶性タンパク質から封入体を分離後、封入体は一般的に前に議論したごとく標的タンパク質を付けたま１両親媒性ヘリックスの会合が解離するように計画された適当なイオン強度および／またはｐＨを持つ溶液にさらす事により再溶解される。いくつかの場合、これらの溶解封入体は更に精製する事なく切断でき、切断フラグメントは関心ある生成物を採取するため分離される。

もしくは、ヘリックスの独特の性質と異った溶解特性を持つ不純物の分離のために計画された一連の溶解および沈殿過程に融合タンパク質をかける。精製された封入体は続いて切断し、生成物を得る。

もし標的ポリペプチドのアミノ酸配列中に潜在的切断部位が存在するならば、前に記載したごとくペンダントポリペプチドの設計で部位１４’で切断され易くする。そのような環境下、反応が完全に進行するとすると両方の部位が切断されその結果無傷の標的ポリペプチドはほとんどまたは全く採取されない。

このような場合、切断反応は完了前に終了され、標的ポリペプチドを反応混合物から除き、残りの融合ポリペプチドは再び切断にかけるか、または事実上再回収する。この戦略はプロテアーゼが第２のより反応性の低い切断部位を攻撃する前に反応液から標的ポリペプチドを除去するのでその損失を減じる事ができる。本再回収切断法は相互係続中の米国特許出願の連続番号（代理人管理番号第ＣＲＰ −０１４号）のものに（これと同じ日付で出願）記載されており、その記載はここに参考文献として含まれている。

もしくは、その構造において切断を受ける残基を切断反応条件下、切断を受けない化学的に同等な残基と置換するためＤＮＡレベルでそのアミノ酸配列を変化させる事により標的ポリペプチドの切断を避ける事ができよう。類似の戦略により望まれない両親媒性ヘリックスの切断も避ける事ができる。このようにして、黄色ブドウ球菌Ｖ−８プロテアーゼが前もって選択された切断剤の場合、ヘリックスの構造中Ｇｌｕ残基は荷電残基（Ｃ）として使用されるべきではない。切断反応は黄色ブドウ球菌Ｖ−８プロテアーゼがＧｌｕ残基を切断するがＡｓｐ残基は切断しないまたはより遅い速度で切断する条件下で実施される。

例えばアルカリ性媒質中（例えばｐＨ約８．０）、酢酸または炭酸イオンが存在するとＧｌｕ切断を促進し、Ａｓｐ切断を最小にする。

このアミノ酸置換技術を用いた場合、しばしば標的タンパク質中の全ての潜在的切断部位を置換する必要はない、なぜなら多くの場合これらは復元された標的タンパク質の立体化学的障害によりエンドプロテアーゼ加水分解されないであろうからである。

以下の実施例はより十分に本発明の良好な特色を例示している。

〔実　施　例〕

ヒト表皮増殖因子およびカルシトニンのごとき比較的短い標的ポリペプチドの産生に有用な両親媒性ヘリックスの設計において、オリゴヌクレオチドを合成し、それらを−緒に結合し、以下に示したタンパク質をコードしている紅換え体ＤＮＡを産生ずる事により一連の両親媒性ヘリックス原型を構成し評価した。

ＮＣ５Ｎ５ＣＮＡｈ５Ａ　（ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ）５（Ａ　１ａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　Ｉａ）５Ａｈ４Ａ　（ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ）４（Ａｌａ− Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）４Ａｈ３Ｂ　（ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ）３（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ −Ｌｅｕ−Ｈｌｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ）３Ａｈ５Ｂ　（ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ）５（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ）５Ａｈ４ＡおよびＡｈ５ＡリーダーのためのＤＮＡコード配列は、ホスホラミダイト化学を用い各々１５塩基の重なり、相補ＤＮＡフラグメントを合成する事により生成する。内部フラグメントはリン酸化されており（５’ＯＲへリン酸基が付加）、一方、フラグメントの結合の間遺伝子セグメントの重合を防ぐため末端フラグメントはリン酸化しないで残しである。左の（アミノ末端）合成遺伝子末端はＥｅＯＲＩ相補末端として残し、一方右手側兼端は典型的にはＢａ５ＨＩ相補末端を持つ。

Ａｈ３ＢリーダーのためのＤＮＡコード配列はバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）オリゴヌクレオチド合成装置中ホスホラミダイト化学を使用し、各々７４塩基の２つの相補ＤＮＡフラグメントから生成される。ヘリックス領域のヌクレオチド配列の設計においては、アミノ酸配列ＡＩａＬｙｓのための可能なコドンが配列中のそのような位置でのＥｓｐｌ制限部位の介在を可能にする。

この部位は遺伝子の更なる修飾に非常に有用である、なぜならそれは高度に特異的であり使用されるクローニングベクターには存在しないからである、ｐ　Ｕ　Ｃ８（ＶｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２）、　ジーン（Ｇｅｎｅ）　１９　：　２５９）。その結果、第３のへリツクスセグメントのためのコード領域の始めの部分に単一のＥｓｐ１部位が含まれる事になる。続いて、ＥｓｐＩ末端を持つモデルＢ二量体のためのＤＮＡを合成し、それを独特のＥｓｐ１部位でＤＮＡ配列を切断する事によりＡｈ３Ｂリーダーのための配列ニ挿入し、Ａｈ５Ｂへリックスの為のコード配列を形成する。

合成りＮＡはリンカ−突然変異誘発法を用いてクローン化する。最初のＡｈ３Ｂコード配列のためのＤＮＡはそのようにして作製し、三量化せしめると二重らせんを形成し、重なり末端は残り、最初のＮｃｏｌ制限部位および末端ＢａｍＨ１部位に一致する。合成りＮＡはこれらの部位およびＮｃｏ１部位のすぐ次のＥｅｏＲ１部位を含むｐＵＣプラスミド内へクローン化する。

Ａｈ３ＢおよびＡｈ５Ｂコード領域はいくつかの前から存在する切断部位を持つＥＧＦ遺伝子の前に移動させる事ができ、リーダー切断部位−ＥＧＦＩ成物を形成する。

一連のヘリックス多量体領域のためのＤＮＡコード配列を生成する別の方法は、３つの組のＤＮＡ領域を合成する事であるニ一つは最初のＭｅｔコドン（ＡＴＧ）および左方に隣接するクローニングのための制限部位を含む、第一のらせん状セグメントをコードしており、一つの組は一つの最初のセグメント（例えばＡｆａからＡｌａ）をコードし、および一つの組は切断部位および標的タンパク質遺伝子のためのＤＮＡへヘリ・ノクスのためのＤＮＡを連続するため、右方に隣接する制限部位を持った最後のらせん状セグメントをコードしている。ＤＮＡセグメントの末端は、らせん状セグメント間のＡ　ＩａＡ　Ｉａ領領域カッく−する相補５′張り出し末端が残るように設計されている。末端セグ変化させる事により、フラグメントの結合の間に生成されるらせん状ポリマーＤＮＡの長さを調節できる。得られるクローンの実際の大きさはＤＮＡレベルでの配列決定により決定される。

′前のへリックス構造のリストから評価できるように、ＡｈＳＡは５つのセグメントオリゴマーの各々のセグメントが総計で荷電を持たないように、Ａｓｎを側アミノ酸基、ＬｅｕおよびＡｌａを非極性アミノ酸、Ｌｙｓを陽イオン性アミノ酸、およびＧｌｕを陰イオン性アミノ酸として用いている。発現されたポリペプチドの配列決定は、第四のセグメントの中のＧｌｕ残基および第一のセグメント中の第二のＡｓｎ残基が合成の間に各々ＬｙｓおよびＳｅｒ残基で置換されていた事を示している。ヘリックスＡｈ４Ａはただ４反復単位が用いられている事を除いてＡｈＳＡと同一である。配列決定は第一セグメントの第一のＡｌａ残基が合成の間にＶａｔに置換されていた事を明らかにした。

ヘリックスＡｈ３Ｂは３つの反復単位を用い、Ａｈ５Ｂは５つの反復単位を用いており、その中でＩ（ｉｓを側アミノ酸として使用してあり、ＡｈＳＡおよびＡｈ４Ａへリツクスの構造ではＡｓｐがＧｌｕで置換されＧｌｎがＡｓｎで置換されている。

ヘリックス５ｈ５Ａは以下のアミノ酸配列を持つ融合タンパク質として発現される：Ｍｅｔ　−（Ａｈ　５Ａ）−Ａｓ　ｐ−Ｐｒｏ−Ｐ　ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉ　ｕ −Ｌｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−（ＥＧ　Ｐ）〔式中ＥＧＦはヒト表皮増殖因子のアミノ酸配列である〕Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕは蝶番として働き、ｔｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ配列はＩＭ尿素中ｐＨ８でトリブシ消化ができる切断部位を含む。この融合タンパク質は発現により容易に封入体を形成し、それは２５％の全細胞性タンパク質および８０％の不溶性タンパク質からなる。理論から予測されるように、融合タンパク質はｐＨの変動による溶解性の有意な変化を示さなかった。

封入体を含む凍結細胞を約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で洗浄溶液（２５％シヨ糖、２５ｍＭ）リス、ｐｎｓおよび１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁する。細胞を遠心分離し、ペレットを前述の溶液に１％界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム）を加えた溶液に再懸濁し、０℃にて３０分間維持する。遠心分離後界面活性剤を除くため洗浄溶液で細胞ペレットを再び洗浄し、遠心分離し、０．０１％リゾチームを加えたトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁し、一度凍結して融解し、氷上で３０秒２度超音波処理する。封入体および細胞破片は遠心分離により再び分離し、ペレットを６Ｍ尿素、２０ｍＭ）リス、ｐＨ８に再懸濁し封入体を溶解する。残った固体は遠心分離により分離し、溶解された融合タンパク質を含む上澄液は尿素で希釈し、最終濃度ＩＭとなす。

可溶化タンパク質の試料はトリプシン（２ｚ　／　ｍｌおよびｆｏｘ／ｍりで各々１５分および１時間消化する。低プロテアーゼ濃度での１５分間の消化によりＥＧＦ融合タンパク質が１００％切断される。ＥＧＦの５つのＣ−末端アミノ酸もまたこの反応で部分的に切断される。

第２の実験においては、超音波処理の前に１％ＣＨＡＰＳ緩衝液（３（（３−クロラミドブロピル）ジメチルアンモニモ〕　−プロパンスルホナート）を加える事を除いて前に示したごとく封入体が調製および切断される。消化生成物はポリアクリルアミドゲル上で分離される。ＥＧＦ抗体によるイムノブロッティング処理によりはり正しいＥＧＦ分子量の消化フラグメントが生成されていた事が示される。より大きい分子量夾雑物および消化フラグメントはＣ１８カラムに１０％ＣＨ３ＣＮで充填、洗浄し、６０％ＣＨ３ＣＮで溶出する事によりＥＧＦ生成物から容易に除去できる。

両親媒性ヘリックスとしてＡｈ４Ａを用いる前記と類似の融合ポリペプチドはらせん構造の４つの反復単位の為溶解性が上がる事が証明されるのを期待して発現された。融合タンパク質は下記の構造を持つ：Ｎｅｔ−（Ａｌ１　Ａ　）−Ａｓ　ｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｕ− Ｌｅｕ−８ｅ　ｒ−Ａ　ｒｇ−ＥＧＦこの構成物において、蝶番中のトリペプチドＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏはアルギニル切断部位へのトリプシンの到達性を増加させている。

この修飾融合タンパク質は発現により容易に封入体を形成し、それは２０％の全細胞タンパク質からなり、中程度のイオン強度の媒質に可溶性である。したがって、それはＩＭ尿素中ｐＨ８でトリプシンにより連続的に切断される。

２５ｍｇ／ｍｌの細胞を使用し、第２工程においてドデシル硫酸ナトリウムの代わりにＣＨＡＰＳ緩衝液（１０ｍＭ）を使用する事を除いて前記のごとくして封入体が調製される。期待されるごとく融合ポリペプチドはＡｈ５Ａ構成物よりも溶解性が高く、より強い界面活性剤前洗浄により有意な生成物の損失が起こる。

その結果、封入体はより多くの夾雑物を含み、その中のある物はジメチルスルホキシドのごとき溶媒および０　、１　Ｍ酢酸により除去できる。

１Ｍ尿素、２ｍＭ）リス、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡに可溶化した封入体からのタンパク質は直接消化するかまたはフェニルシリカから３０％ＣＨ３ＣＮおよび５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８〜９）で溶出して精製される。消化はｉｏｏ　、　１０．　ｉ、ｏおよび０．１　ｕｇ／ｒｎｌ）リプシン（ｐ１１８）を用い、３７℃で３または１０分実施する。ｌｕｇ／ｍｌ’ｐリブシンでの３分間の消化でシリカ精製物質の半分以上の切断に明らかに十分である。

Ａｈ３Ｂ両親媒性ヘリックスは下記の配列を持つ融合タンパク質として発現される：ＳｈＬＥ−Ｍｃｔ−（Ａｈ３Ｂ）−Ａ　ｓ　ｐ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ｐｒｏ−Ａｓ　ｐ−Ａ　Ｉ　ａ−Ａ　ｌ　ａ−１］　ｅ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＥＧＦ〔式中、５ｈＬＥは短いＴｒｐリーダー配列（Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａ　Ｉ　ａ−ｌ　１　ｅ−Ｐｈ　ｅ−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌ　ｙ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｓ　ｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｐｈｅ）を表わす〕Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ配列は蝶番領域を含み、ｌｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ配列はファクターＸａ切断の認識部位である。

３つのセグメントのへリックスリーダ一部ではＴｒｐリーダーが構成物の一部を構成していないと封入体は形成されない。

Ａｈ５Ｅｒリーダー構成物は５ｈＬＥリーダーに結合していてもいなくても細胞内封入体を産生ずる。細胞を２５％ショ糖、２５ｍＭ）リス、ｌｏｍＭ　ＥＤＴＡおよびｌｏＯｍＭ　Ｎａ（Ｊ７にてＯ℃１時間洗浄してタンパク質を回収する。細胞を遠心分離し、一度５ｍＭ）リス、２ｍＭ　ＥＤＴＡで洗浄し、凍結し、融解し、１０ｍＭ　ＥＤＴＡとなし、０．０１％リゾチームと混合し、氷上で３０秒超音波処理した後再び遠心分離して封入体を採取する。

封入体を８Ｍ尿素およびゲル試料緩衝液に溶解し、得られた溶液を１５％ポリアクリルアミドゲル上に充填する。構成されたバンドを切り出し、タンパク質は室温で１６時間受動的に水中へ溶出する。ベーターメルカプトエタノール（ＢＭＥ）をそのま＼で溶液に添加して０．１％の濃度とし、２Ｍ濃度にするのに十分量の尿素および０．１％の濃度にするのに十分量のコール酸ナトリウムを添加する。この溶液はその後ａ）５ｍＭｈリス、ｐＨ７，５，０，１％コール酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１ｍ＋Ｍ還元型グルタチオンおよび１００ｍＭ酸化型グルタチオン；ｂ）コール酸ナトリウムを除いた同じ溶液；Ｃ）コール酸ナトリウムおよび尿素を除いた同じ溶液；およびｄ）５０ｍＭ）リスｐＨ８，４に対して透析する。

切断は１４μＱ容量で約１μｇタンパク質１５０ｍＭ）リス、ｐＨ８，５ｍＭ　Ｃａ”＋および７．５μＩＪ、　７５μＵおよび７５０ｐＵフアクターＸａで３７℃にて１時間実施する。低ファクターＸａ濃度では自然のままのＥＧＦの明瞭なバンドが産生された。

溶解特性に関して両親媒性ヘリックス構造を更に評価するため、バイオサーチ固相ペプチド合成装置を用いて以下の合成二量体が合成された。

ＮＣ３ＮＳＣＮＰ−７２（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）２Ｐ− ８１（Ａｌａ−Ｈｌｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）２Ｐ−８７（Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−１１ｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）２ヘリックスＰ−７２はへリックスＡｈ５Ａの二量体型から成る。

ヘリックスＰ−８１もまたへリックスＡｈ５Ａの二量体型から成っている。荷電アミノ酸として陽イオン性Ｌｙｓ残基がＨｌｓで置き換えられている事を除いて各々の単位はＡｈ５Ａと同一である。Ｐ−８７もまたＧｌｎがＡｓｎの代わりに側アミノ酸残基として使用され、Ａｈ５Ａの中心の非極性Ｌｅｕ残基がＨｌｓに置き換えられている事を除いて、Ａｈ５Ａと類似の２つの反復単位を含んでいる。

この３つの合成ベブチドニ量体は異った溶液条件下非極性相と異った相互作用すると期待される。

二量体Ｐ−７２は総荷電がゼロで、中性付近のｐＨ範囲で滴定される残基を含まない：それ故、Ｐ−７２はｐＨに依存しない方法で非極性相と会合または相互作用をすると期待される。

ペプチドＰ−８１は一方、低ｐＨ（７以下）でＨｉｓが荷電されると総荷電がゼロになり、高ｐＨでＨｉｓが荷電を失っている場合は陰イオン的に荷電するようになる。その結果、Ｐ−８１は高ｐＨより低ｐＨで非極性相とより強く相互作用すると予想される。逆にペプチドＰ−８７は低ｐＨでは正に荷電し、高ｐＨでは中性となると期待されるので、Ｈｌｓが滴定され中性となるＫｐＨにおいて非極性相とより強く相互作用すると予想される。大腸菌の細胞内ｐｎは約７．８であるので、Ｐ−８７は生理的条件下では会合すると予想される。さらに、Ｈｉｓは非極性領域に位置しているので、Ｈｉｓが荷電した場合、非極性会合相互作用は強く阻害されるべきであろう。

合成へリックスの性質がそれらの予想される性質に対応しているかどうかを決定するため、非極性（Ｃ−１８）固定相を用いるＨＰＬＣカラム上で各々を試験した。

合成ペプチド溶液の試料を注入し、溶出時間（カラムの底から出てくる時間）を測定した。カラムの空げき時間はクエン酸塩または酢酸塩のごとき小さな荷電分子を注入する事により測定した。水性移動相に可溶化した試料の割合は（疎水性固定相に結合したものに対し）は空げき時間を試料溶出時間で割る事により決定した。空げき時間で出てくる試料は完全に移動相可溶性であり、一方もし２倍の空げき時間で出てくるものは半分移動相に溶解し、半分は固定相に結合しているものである。この方法により、各々の合成ペプチドの疎水性固定相と比較した親水性移動相への親和性をｐＨの関数として測定できる。

ＨＰＬＣカラムはいくつかの異った緩衝液の一つを使用し、アイソクラティック（一定の溶出）に操作する。合成ペプチドの溶出時間は使用したアセトニトリルの濃度に非常に敏感であった。このため、すべての緩衝系に対し１３％の値が用いられ、その濃度でのペプチドの溶出時間が決定され、空げき時間の２から２０倍程度であった。使用された特定の緩衝液系のランニングｐＨは液ＡおよびＢの比を変える事により調製し、ここで溶液Ａは低ｐｎであり、溶液Ｂは高ｐｌである。カラムは２１４ｎｍ吸光度ベースライン安定性により判断されながら平衡化される。平衡時間はある場合には数時間まで変化し、特に緩衝液系のｐＨ緩衝化能力が低い場合は長い。

使用された緩衝液系は以下のごとくである：　ｐＨ範囲６．８から８．０には：Ａは１０ｍＭナトリウムイオンを含む１０ｍＭリン酸塩およびＢには２０ｍＭナトリウムイオン：　ｐＨ範囲４．０から５．５には二Ａには５．３ｍＭのナトリウムイオンを含む１０ｍＭ酢酸塩およびＢには９．５ｍＭナトリウムイオン；　ｐＨ４，０から８．０には：ＡにＯｍＭのナトリウムイオンの１０ｍＭリン酸塩、１０ｍＭ酢酸塩およびＢには２０ｍＭナトリウムイオン；ｐＨ範囲６．０から９．０には二Ａには１０ｍＭナトリウムイオンを含む５ｍＭリン酸塩、５ｍＭピロリン酸塩およびＢには２０ｍＭナトリウムイオン；ｐＨ範囲４．０から１０．０には：Ａには１２ｍ　Ｍ酢酸イオンを含む５ｍＭリン酸塩、５ｍＭピロリン酸塩、２０ｍＭナトリウムイオンおよびＢには０．８ｍＭ酢酸イオン。ｐｌを変化させるため荷電イオンの濃度を変えねばならないので、ｐＨの変化に付随するこれらの緩衝液系における移動相のイオン強度の変化がある。

これらの系において、陽イオンが変化するとｐＨの増加に伴いイオン強度が増加し、一方陰イオンが変化する系ではｐｎが増加するとイオン強度は減少する。

図５はヒスチジンを含まないＰ−７２ペプチドニ量体のこれらの実験の結果を示している。グラフは分配係数の変化を示しており、それはｐＨの関数として、移動相へ分配されるヘリックスの割合を表わしている。図示したごとく、ｐＨが増加するとペプチドは疏水性（固定）相内への分配が増す。実験したｐＨ範囲内で滴定されるアミノ酸残基を含まないのでそのような効果はこのペプチドにおいては予想されない。この効果は使用された緩衝液のイオン強度がｐＨの増加により幾分増加し、それによりヘリックスおよび疎水性固定相間の疎水性相互作用が増加したためであろう。

図６はヒスチジン含有へリックスＰ−８１のデータを示している。このデータは移動相内へ分配されたヘリックスの割合がｐＨの増加と伴に増加している事を示している。高ｐＨではＰ−８１は総計で負の荷電を持つと予想され、それゆえ非極性固定相に比較して水性移動相に親和性を持っているのでこれは予想された結果と一致する。

図７はへリックスＰ−８７を用いたこれらの実験の結果を図示している。図示したごとく、および予想される振舞いと一致して、ヒスチジン残基が低ｐｌで荷電されている場合らせん状二世体はイオン性媒質（移動相）に高親和性を持ち、一方約ｐ）１６．５以上では比較的低いが本質的に一定のイオン性媒質への親和性が観察された。

別の実験においては、入射光に対し９０＠での合成ペプチド溶液による光散乱の量の変化を、ａｌｌおよびイオン強度変化の結果としての自己会合の程度の変化の追跡に使用した。散乱光はパーキン−エルマーＬＳ５ルミネセンス分光光変計を用い、励起および発光モノクロメータ−の両方を３００ｎｍの波長に調整して観察された。各々のペプチドを蒸留水に加え濃度を増加させるか、もしくは酸および塩基性条件間の変化のため酢酸および水酸化ナトリウムを添加した。これらの滴定の結果は以下の表Ａに示しである。その中の値は同一条件下溶媒により散乱される光の量に対し相対的な溶液の散乱光の量を反映している。

入試料　７．０　０　０．８６　３．８ＢＨＡｅ　３．０　１　０．８０　＋　 −２，５−−ＣＮＨＯＨ８，４４５０，３６−−３，０＋　＋ＤＨＯＡｃ　５．１　４９　０．８４　＋　＋　１．５　−　−ＥＮＨＯＨ８，４６９０，４１− −１，８＋十ＦＨＡｃ　５．１　７４　０．１６　＋　−１，２−−１溶液のイオン強度２相対的９０°散乱信号３散乱において予想される変化４散乱において観測された変化Ｐ−８１に対するデータで観察されるごとく、ｐＨが中性より低下した場合（ペプチドは総計で荷電がなくなり会合しやすいと予想される）、一つの例において散乱光の増加が観察された。

逆にｐＨが中性より上がると（ペプチドは負の総荷重を持ち解離すると予想される）、散乱光の減少が観察された。一方、Ｐ−８７は余分の荷電を運んでおり、Ｐ−８１のちょうど反対に振舞う事が予想される。Ｐ−８７の溶液からの散乱光変化は予想されたごとく変化している。

本発明はその精神および範囲から離れる事なく他の特定の形で具体化する事ができるであろう。

従って、他の具体例も以下の請求の範囲に含まれる。

浄書（内容に変更なし）浄書（内容に変更なし）橡Ｉ７７綱内１τ仝貌つ戴〜創心將ｑ！１Ｊ指内１し４山り槍ゐ５１心浄書（内容に変更なし）手続補正書□ １．事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ８８１００７２９２、発明の名称組換え体タンパク質製造のためのリーダーｉ’？ＩＪ３、補正をする者４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正命令の日付　平成　１年　７月１８日　（発送日）６、補正の対豪（３）タイプ印書により浄書ｔた明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．形質転換体中の組換え体ＤＮＡにより発現可能な融合タンパク質であって、標的ポリペプチド、およびこれと連絡したペンダントポリペプチドを含み、水性溶液中で中心軸、相対する親水性および疎水性表面を持ち、疎水性表面は軸方向のすぐ次に非極性アミノ酸残基を含み、親水性表面は軸方向のすぐ次に荷電したアミノ酸残基を含み、前記融合タンパク質はそれが発現される宿主微生物中で不溶性の会合体（凝集体）を自発的に形成する事により特徴付けられる前記タンパク質。
２．前記ペンダントポリペプチドが下記の構造式：（Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｃ− Ｎ）ｂ〔式中、ｂは１から３０までの整数であり；Ｎは非極性アミノ酸残基からなる群より選択される一員を含み、および式中の複数のＮは一緒になり前記疎水性表面を規定し；Ｃは荷電したアミノ酸残基からなる基から選択される一員を含み；および式中の複数のＣは一緒になり前記親水性表面を規定し；Ｓは親水性の中性アミノ酸残基からなる群から選択される一員を含み、その中で前記Ｎ，ＣおよびＳ残基の少なくとも２つまでが別個にヒスチジンであり得る。〕で表わされるプロリンを含まないポリペプチドである、請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
３．Ｎがフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群より選択される請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
４．Ｃがアスパラギン酸、グルタミン酸およびリジンからなる群より選択される請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
５．Ｓがグルタミンである請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
６．前記Ｃの一つがアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択され、前記Ｃの他方がリジンであり、それにより前記Ｃの一つが陽イオン性アミノ酸残基であり、および他方が陰イオン性アミノ酸残基である請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
７．標的ポリペプチドのアミノ酸残基は全体的に第一の極性の正味の荷電を与え、およびＣのアミノ酸残基はペンダントポリペプチドに前記第一の極性と逆の正味の荷電を与えることを特徴とする請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
８．前記Ｎの少くとも一つがヒスチジンである請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
９．前記Ｃの少くとも一つがヒスチジンである請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
１０．前記Ｓの少くとも一つがヒスチジンである請求の範囲第２項記載の融合タンパク質。
１１．以下の工程：Ａ．請求の範囲第１項記載の融合タンパク質をコードし、発現できるＤＮＡを細胞性宿主に挿入し；Ｂ．前記融合タンパク質の不溶性会合体からなる封入体を産生するため前記宿主に前記融合タンパク質を発現せしめ；Ｃ．前記封入体を前記細胞性宿主から分離し；およびＤ．前記標的ポリペプチドを放出させるため前記融合タンパク質を切断する；からなる標的ポリペプチドの製造方法。
１２．分離工程が前記細胞性宿主から封入体を採取し、前記封入体を第１のイオン強度を持つ媒質に溶解し、前記溶解された封入体を第２の異ったイオン強度を持つ媒質に配置する事により中に含まれる融合タンパク質を再沈殿せしめる工程を含む請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．分離工程が前記細胞性宿主から封入体を採取し、前記封入体を第１のｐＨを持つ媒質中に溶解し、および溶解された封入体を第２の異ったｐＨを持つ媒質中に配置することによりその中に含まれている融合タンパク質を再沈殿せしめる工程を含む請求の範囲第１１項記載の方法。
１４．前記ペンダントポリペプチドが次式：【配列があります】；【配列があります】；【配列があります】；および【配列があります】；〔式中ｄは１から１０までの整数である〕からなる群から選択されるポリペプチド構造を含む請求の範囲第１項記載の融合タンパク質。
１５．請求の範囲第１項記載のタンパク質をコードする組換え体ＤＮＡ。
１６．標的ポリペプチドを発現する細胞性宿主内で前記標的ポリペプチドからなる封入体の形成を促進する方法であって、以下の工程：読みわく内配列でペンダントＤＮＡを前記標的ポリペプチドをコードするＤＮＡへ連結して融合ＤＮＡを産生する、前記ペンダントＤＮＡは中心軸および相対する親水性および疎水性表面を持つアルファらせんポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなり、疎水性表面は軸方向のすぐ次に非極性アミノ酸残基を含み、親水性表面は軸方向のすぐ次に荷電アミノ酸残基を含み、前記アルファらせんポリペプチドは前記細胞性宿主内で不溶性会合体を形成する事により特徴付けられており；および前記細胞性宿主中で前記融合ＤＮＡを発現して前記融合ＤＮＡによりコードされている融合タンパク質を含む不溶性会合体を産生する；よりなる方法。
１７．前記ペンダントＤＮＡが下記の構造式：（Ｎ−Ｃ−Ｓ−Ｎ−Ｓ−Ｃ−Ｎ）ｂ〔式中、ｂは１から３０までの整数であり、Ｎは非極性アミノ酸残基からなる群から選択される一員であり、および式中の複数のＮは一緒になって前記疎水性表面を規定し、Ｃは荷電アミノ酸残基からなる群から選択される一員であり、および式中の複数のＣは一緒になって前記親水性表面を規定し、Ｓは親水性、中性アミノ酸残基からなる群から選択される一員であり、およびその中で前記Ｎ，ＣおよびＳ残基の２つまでは別個にヒスチジンである。〕で表わされる、プロリンを含まないポリペプチドをコードする請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．Ｎがフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、トリプトファンおよびメチオニンからなる群から選択される請求の範囲第１７項記載の方法。
１９．Ｃがアスパラギン酸、グルタミン酸およびリジンからなる群より選択される請求の範囲第１７項記載の方法。
２０．Ｓがアスパラギンおよびグルタミンからなる群より選択される請求の範囲第１７項記載の方法。
２１．前記Ｃの一つがアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択され、前記Ｃの他方がリジンであり、それにより前記Ｃの一つが陽イオン性アミノ酸残基であり、他方が陰イオン性アミノ酸残基である請求の範囲第１７項記載の方法。
２２．標的ポリペプチドが全体的に第１の極性の正味の荷電を与えるアミノ酸残基を含み、Ｃが前記第１の極性の反対の正味の荷電をペンダントポリペプチドに与えるアミノ酸残基で構成されている請求の範囲第１７項記載の方法。
２３．前記Ｎの少くとも一つがヒスチジンである請求の範囲第１７項記載の方法。
２４．前記Ｃの少くとも一つがヒスチジンである請求の範囲第１７項記載の方法。
２５．前記Ｓの少くとも一つがヒスチジンである請求の範囲第１７項記載の方法。
２６．前記発現工程の間、前記融合ＤＮＡがその総重量の少くとも約２０％の前記融合タンパク質を含む前記不溶性会合体を産生する請求の範囲第１６項記載の方法。