JP2010534477A - 生物活性ペプチドの発現および精製のための可溶性タグ - Google Patents
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Abstract
Description
(式中、
Xaa1=Arg、His、またはLys;
Xaa2=Gln、His、またはLys;
Xaa3=Gln、His、またはLys;
Xaa4=GluまたはGln;
Xaa5=GlnまたはLys;
n=1〜10;
m=n−1;かつ
スペーサーはプロリン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、およびシステインからなる群から選択されるアミノ酸を含むペプチドである)
を含む封入体タグを提供する。
a)目的のペプチドをコードする第2の部分に作動可能に連結された、本発明の封入体タグをコードする第1の部分を含む、融合ペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを合成するステップと、
b)発現宿主細胞を(a)の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
c)(b)の形質転換宿主細胞を、遺伝子コンストラクトが発現されかつコードされた融合ペプチドが不溶性形態で生成される条件下で成長させるステップと、
d)前記不溶性形態での前記融合ペプチドを回収するステップと、
を含む、方法を提供する。
a)目的のペプチドを含む第2の部分に作動可能に連結された、本封入体タグを含む第1の部分を含む、融合ペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを合成するステップであって、前記第1の部分および前記第2の部分は少なくとも1つの切断可能なペプチドリンカーにより分離されるステップと、
b)発現宿主細胞を(a)の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
c)(b)の形質転換宿主細胞を、遺伝子コンストラクトが発現されかつコードされた融合ペプチドが不溶性形態で生成される条件下で成長させるステップと、
d)前記不溶性形態での融合ペプチドを回収するステップと、
e)融合ペプチドの前記第1の部分がもはや前記第2の部分に融合されないように、前記少なくとも1つの切断可能なペプチドリンカーを切断するステップと、
f)前記目的のペプチドを回収するステップと、
を含む、方法が提供される。
以下の配列は、米国特許施行規則第1.821−1.825条(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に従い、世界知的所有権機関(World Intellectual Property Organization)(WIPO)基準ST.25(1998年)、ならびにEPCおよびPCTの配列表の要件(規則5.2および49.5(aの2)、ならびに実施細則の第208節および付録C)に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第1.822条に示される規則に従う。
配列番号2はプラスミドpSF032のヌクレオチド配列である。
配列番号3は毛髪結合ペプチドA09のアミノ酸配列である。
配列番号4は毛髪結合ペプチドKF11のアミノ酸配列である。
配列番号5は毛髪結合ペプチドD21’のアミノ酸配列である。
配列番号6はHC77607をコードする核酸配列である。
配列番号7はHC77607のアミノ酸配列である。
配列番号8はHC77638をコードする核酸配列である。
配列番号9はHC77638のアミノ酸配列である。
配列番号10はHC77643をコードする核酸配列である。
配列番号11はHC77643のアミノ酸配列である。
配列番号12はHC77681をコードする核酸配列である。
配列番号13はHC77681のアミノ酸配列である。
配列番号14はIBT103をコードする核酸配列である。
配列番号15はIBT103のアミノ酸配列である。
配列番号16はIBT136をコードする核酸配列である。
配列番号17はIBT136およびAggeliら(PNAS 98(21):11857−11862頁(2001年))に記載のP11−IIペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号18はIBT138をコードする核酸配列である。
配列番号19はIBT138のアミノ酸配列である。
配列番号20はIBT139をコードする核酸配列である。
配列番号21はIBT139のアミノ酸配列である。
配列番号22はHC776124をコードする核酸配列である。
配列番号23はHC776124のアミノ酸配列である。
配列番号24は融合ペプチドIBT139.HC776124をコードする核酸配列である。
配列番号25はIBT139.HC776124のアミノ酸配列である。
配列番号26はIBT186をコードする核酸配列である。
配列番号27はIBT186のアミノ酸配列である。
配列番号28は融合ペプチドIBT186.HC776124をコードする核酸配列である。
配列番号29はIBT186.HC776124のアミノ酸配列である。
配列番号30はIBT139.CCPGCCをコードする核酸配列である。
配列番号31はIBT139.CCPGCCのアミノ酸配列である。
配列番号32は架橋可能なシステイン部分CCPGCCをコードする核酸配列である。
配列番号33は架橋可能なシステイン部分CCPGCCのアミノ酸配列である。
配列番号34〜35はIBT139.CCPGCCの調製に用いられるオリゴヌクレオチドの核酸配列である。
配列番号36は融合ペプチドIBT139.CCPGCC.HC776124の核酸配列である。
配列番号37は融合ペプチドIBT139.CCPGCC.HC776124のアミノ酸配列である。
配列番号38はIBT182をコードする核酸配列である。
配列番号39はIBT182のアミノ酸配列である。
配列番号40はIBT183をコードする核酸配列である。
配列番号41はIBT183のアミノ酸配列である。
配列番号42はIBT184をコードする核酸配列である。
配列番号43はIBT184のアミノ酸配列である。
配列番号44はIBT185をコードする核酸配列である。
配列番号45はIBT185のアミノ酸配列である。
配列番号46はIBT187aをコードする核酸配列である。
配列番号47はIBT187aのアミノ酸配列である。
配列番号48はIBT187bをコードする核酸配列である。
配列番号49はIBT187bのアミノ酸配列である。
配列番号50はプラスミドpSF043の核酸配列である。
配列番号51はプラスミドpLR186の核酸配列である。
配列番号52はKSI(C4)の核酸配列である。
配列番号53はKSI(C4)のアミノ酸配列である。
配列番号54は融合ペプチドKSI(C4)−HC7643をコードする核酸配列である。
配列番号55は融合ペプチドKSI(C4)−HC77643のアミノ酸配列である。
配列番号56〜57は本封入体タグ中で用いられるスペーサーのアミノ酸配列である。
配列番号58は本封入体タグ中に見出されるコア配列のアミノ酸配列である。
配列番号59〜147は毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号148〜155は皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号156〜157は爪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号158〜186は抗菌ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号187〜211は色素結合ペプチドのアミノ酸配列である。詳細には、配列番号187〜190はカーボンブラックに結合し、配列番号191〜199はCROMOPHTAL(登録商標)イエロー(Ciba Specialty Chemicals(Basel、Switzerland))に結合し、配列番号200〜202はSUNFAST(登録商標)マゼンタ(Sun Chemical Corp.(Parsippany、NJ))に結合し、かつ配列番号203〜211はSUNFAST(登録商標)ブルーに結合する。
配列番号212〜217はセルロース結合ペプチドである。
配列番号218〜244はポリマー結合ペプチドのアミノ酸配列である。詳細には、配列番号218はポリ(エチレンテレフタレート)に結合し、配列番号219〜229はポリ(メチルメタクリレート)に結合し、配列番号230〜235はナイロンに結合し、かつ配列番号236〜244はポリ(テトラフルオロエチレン)に結合する。
配列番号245〜260はクレー結合ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号261はカスパーゼ−3切断配列のアミノ酸配列である。
配列番号262はスペーサーを含む本発明の好ましい封入体タグのアミノ酸配列である。
配列番号263はプラスミドpLR435の核酸配列である。
配列番号264は封入体タグIBT139(5C)をコードする核酸配列である。
配列番号265は封入体タグIBT139(5C)のアミノ酸配列である。
配列番号266は融合ペプチドIBT139(5C).HC776124をコードする核酸配列である。
配列番号267は融合ペプチドIBT139(5C).HC776124のアミノ酸配列である。
配列番号268〜307は歯結合ペプチド(米国特許出願第11/877,692号明細書)のアミノ酸配列である。
アミロイド様タンパク質はアミロイド線維の形態を有する傾向があり、かつ凝集タンパク質はβシートテープ構造を示すことが多い。水中でβシートテープ、リボン、微小繊維、および線維に自己組織化可能な11のアミノ酸合成ペプチド(すなわちペプチド「PII−2」;ペプチド「DN1」としても知られる)についての記載がなされている(Aggeliら、J.Amer.Chem.Soc.、125:9619−9628頁(2003年);Aggeliら、PNAS、98(21):11857−11862頁(2001年);Aggeliら、Nature、386:259−262頁(1997年);およびAggeliら、J.Mater Chem、7(7):1135−1145頁(1997年))。
式1
Gln−Gln−Xaa1−Phe−Xaa2−Trp−Xaa3−Phe−Xaa4−Xaa5−Gln−スペーサー−[[Gln−Gln−Xaa1−Phe−Xaa2−Trp−Xaa3−Phe−Xaa4−Xaa5−Gln]−[スペーサー]m]n
(配列番号262)
(式中、
Xaa1=Arg、His、またはLys;
Xaa2=Gln、His、またはLys;
Xaa3=Gln、His、またはLys;
Xaa4=GluまたはGln;
Xaa5=GlnまたはLys;
n=1〜10;
m=n−1;かつ
スペーサーはプロリン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、およびシステインからなる群から選択されるアミノ酸を含むペプチドである)
IBT−CS−POI
または
POI−CS−IBT
本方法を用いる生成のために標的化される目的のペプチド(「発現可能なペプチド」)は、正常な生理的条件下、宿主細胞内および/または宿主細胞溶解液中で可溶性が高い線状ペプチドである。好ましい態様では、目的のペプチドは一般に短く(300未満のアミノ酸長)、タンパク質分解により十分な量で生成することが困難である。タグを形成する本封入体の少なくとも1つに対する目的のペプチドの融合により、正常な生理的条件下、宿主細胞内および/または宿主細胞溶解液中で不溶性である融合ペプチドが作成される。目的のペプチドの生成は、典型的には、不溶性封入体の形態で発現され蓄積される場合、ペプチドが一般にタンパク質分解からより十分に保護されることから増大する。さらに、不溶性融合タンパク質は、遠心分離または濾過を用い、宿主細胞溶解液から容易に分離されうる。
切断可能なペプチドリンカー(すなわち切断部位または切断配列)の使用は当該技術分野で周知である。本封入体タグを含む融合ペプチドは、典型的には、封入体タグを目的のポリペプチドから分離する少なくとも1つの切断可能な配列を含むことになる。切断可能な配列は、封入体タグの目的のペプチドからの分離を促進する。一実施形態では、切断可能な配列は、封入体タグおよび/または目的のペプチドの一部により提供されうる(例えば、酸切断可能なアスパラギン酸−プロリン部分の封入)。好ましい実施形態では、切断可能な配列は、(融合ペプチド内に)封入体タグと目的のペプチドの間に少なくとも1つの切断可能なペプチドリンカーを含むことで提供される。
本封入体タグの使用により、宿主細胞内で不溶性のキメラポリペプチド(「融合ペプチド」または「融合タンパク質」)が作成され、封入体が形成される。本封入体タグを所与とすると、本融合ペプチドをコードする発現可能な遺伝子コンストラクトの合成および発現は当業者に周知である。
本封入体タグを用い、生成宿主内で封入体を形成する融合ペプチドが作成される。この方法は、(1)細胞溶解液の他の可溶性成分からの単離が困難であり、および/または(2)標的生成宿主内での有意な量での生成が困難である、有意な量の可溶性の目的のペプチドの生成にとって特に興味深い。
一旦、封入体タグが同定され、適切な目的のペプチドと対を成していると、適切な発現宿主に形質転換されているカセットおよびベクターの作成は、当該技術分野で一般的で周知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連キメラ遺伝子の転写および翻訳を誘導する配列、選択可能マーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を有する。適切なベクターは、転写開始制御を有する遺伝子の5’領域および転写終結を制御するDNA断片の3’領域を含む。両方の制御領域が形質転換宿主細胞に対して相同な遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、かかる制御領域は生成宿主として選択される特定種に固有の遺伝子に由来する必要がないことを理解されるべきである。
本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有する必要がある。適切な基質が、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー(cornsteep liquor)、砂糖液(sugar beet molasses)、および大麦モルト(barley malt)などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。さらに、炭素基質はまた二酸化炭素または主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの1炭素基質でありうる。メチロトローフ(methylotrophic)生物が、1炭素基質および2炭素基質に加え、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性における種々のアミノ酸などの化合物を含有する他の多数の炭素を用いることでも知られている。例えば、メチロトローフ酵母がメチルアミン由来の炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することで知られている(Bellionら、Microb.Growth C1 Compd.、[Int.Symp.]、7th(1993年)、415−32頁、Murrell J.Collin;Kelly,Don P.編、Intercept(Andover、UK)発行)。同様に、カンジダの様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝することになる(Sulterら、Arch.Microbiol. 153:485−489頁(1990年))。それ故、本発明で用いられる炭素源が基質を有する多種多様な炭素を包含する場合があり、生物の選択によってのみ限定されうると考えられる。
適切な培養条件は、選択される生成宿主に応じて選択されうる。典型的には細胞が、適切な培地内、約25℃〜約40℃の範囲内の温度で成長される。適切な成長培地としては、ルリア・ベルターニ(Luria Bertani)(LB)培養液、サブロー・デキストロース(Sabouraud Dextrose)(SD)培養液または酵母培地(YM)の培養液などの一般的な商業的に調製された培地が挙げられる。他の限定または合成された成長培地が用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適した培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン2’:3’一リン酸(cAMP)の使用についても発酵培地内に取り込まれうる。
バッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に望ましい生物が接種され、系に何も添加しなくても発酵の生成が可能である。典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関連したバッチであり、pHおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、最大で発酵が停止する時間まで常時変化する。バッチ培養物内では、細胞が、変化のない誘導期(lag phase)から高成長の対数期(log phase)、最終的に成長率が減少または停止する定常期(stationay phase)にかけて抑制される。定常期における細胞が、未処理の場合、最終的に死滅することになる。対数期における細胞が、一般に最終生成物または中間体の生成の大部分に関与する。
本明細書で用いられる標準の組換えDNAおよび分子クローン化技術は当該技術分野で周知であり、Sambrook, J.およびRussell, D.、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor、NY)(2001年);およびSilhavy, T.J.、Bennan, M.L.およびEnquist, L.W.、「Experiments with Gene Fusions」、Cold Spring Harbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY)(1984年);およびAusubel, F.M.ら、「Short Protocols in Molecular Biology」、第5版、John Wiley and Sons,Inc.(N.Y.)(2002年)により記載がなされている。
発現プラスミドの作成
いくつかの発現系を用い、大腸菌(E.coli)宿主細胞内で融合タンパク質を生成した。1つの発現系は、T7に基づく発現ベクター(pLX121;配列番号1;図2)を伴う大腸菌(E.coli)株BL21−AI(Invitrogen)に基づくものであり、ここでT7 RNAポリメラーゼの発現はaraBADプロモーターにより制御される。別の発現系は、pBADに基づく発現ベクター(pSF032、図3、配列番号2およびpLR186、図4、配列番号51)を伴う大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC46076(商標))由来の株に基づくものであり、ここでaraBADオペロンの内因性染色体のコピーは欠失された(内因性araBADオペロンにおける破壊を含む修飾された大腸菌(E.coli)MG1655株は本明細書中で大腸菌(E.coli)株KK2000と称される)。各ベクター内で各プロモーターの下流でそれに作動可能に連結される3’領域を、各封入体タグおよび/または目的のペプチドをコードするDNAの単純なスワッピングを促進するように設計した。NdeIおよびBamHI制限部位を封入体タグ(IBT)をコードする領域に隣接させた。BamHIおよびAscI制限部位を目的のペプチド(POI)をコードする領域に隣接させた。
封入体タグが可溶性の目的のペプチドに融合される場合にその性能を評価するため、遺伝子コンストラクトを調製した。pBR322複製起点およびアンピシリン耐性を付与するためのbla遺伝子を有するプラスミド(pLX121;図2;配列番号1)を用いた。キメラ遺伝子の発現をT7プロモーターにより駆動した。このプラスミドの作成については、同時係属中の米国特許出願第11/516362号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に過去に記載がなされている。
ベクターpKSI(C4)−HC77623は市販のベクターpDEST17(Invitrogen)に由来するものであった。このベクターの作成については、同時係属中の米国特許出願第11/389948号明細書(参照により本明細書中に援用される)中に過去に記載がなされている。それは、酵素ケトステロイドイソメラーゼ(KSI;Kuliopulos, A.およびWalsh, C.T.、J.Am.Chem.Soc.116:4599−4607頁(1994年))の断片をコードする市販のベクターpET31b(Novagen(Madison,WI))に由来する配列を含む。KSI断片を封入体タグとして用い、大腸菌(E.coli)内でペプチドの不溶性封入体への分割を促進した。pET31b由来のKSI配列をコードする核酸分子を、標準の突然変異誘発方法(QuickChange II、Stratagene(La Jolla,CA))を用い、野生型KSI配列内に見出される1つのシステインコドンに加えて3つの追加的なシステインコドンを含むように修飾した結果、封入体タグKSI(C4)(配列番号52および53)を得た。プラスミドpKSI(C4)−HC77623を当業者に周知の標準の組換えDNA方法を用いて作成した。BamHIおよびAscI制限部位は様々な目的のペプチドをコードする核酸分子のスワッピングを促進した。挿入物を、封入体タグの目的のペプチドからの分離において有用な酸切断可能なDP部分をコードするように設計した。
プラスミドpSF032(配列番号2;図3)は、ColE1タイプの複製起点およびアンピシリン耐性を付与するためのbla遺伝子を有する。タグ/ペプチド融合コンストラクトをaraBADプロモーターにより駆動する。プラスミドはまた、araC調節因子における遺伝子をコードする。
プラスミドpLR186(配列番号51;図4)は、ColE1タイプの複製起点、アンピシリン耐性を付与するためのbla遺伝子、およびスペクチノマイシン(Spec)耐性を付与するためのaadA−1遺伝子を有する。タグ/ペプチド融合コンストラクトをaraBADプロモーターにより駆動する。プラスミドはまた、araC調節因子における遺伝子をコードする。
様々な目的のペプチドの作成
5種のマルチブロック毛髪結合ペプチドを以下のアミノ酸配列で消化した。マルチブロック毛髪結合ペプチドの作成については報告されている(同時係属中の米国特許出願第11/389948号明細書および米国特許出願第11/074473号明細書を参照)。可溶性のマルチブロックペプチド(すなわち「目的のペプチド」)を用い、本封入体タグを評価した。各マルチブロック毛髪結合ペプチドは1つ以上の毛髪結合ドメインを含む。機能結合ドメインを表1に提供する。毛髪結合ドメイン(太字)は、A09(IPWWNIRAPLNA;配列番号3;ポリメタクリル酸メチルに結合することも見出された)、KF11(NTSQLST;配列番号4)、およびD21’(RTNAADHP;配列番号5)を含む。マルチブロックペプチドを有する親和性ドメインは、典型的には短いペプチドスペーサーにより分離される。酸切断可能なDP部分をイタリック体で示す。
封入体タグの同定
いくつかの融合パートナー配列(「封入体タグ」)の、得られる融合ペプチドを(短い、一般に可溶性の目的のペプチドに作動可能に連結される場合に)細胞内の不溶性封入体へと駆動する能力について評価した。様々な毛髪結合ペプチドコンストラクト(HC77607、HC77638、HC77643、およびHC77681)をタグライブラリー(親プラスミドpLX121、下記の配列を参照)にクローン化した。融合産物の発現はT7プロモーターから駆動される。大腸菌(E.coli)BL21−AIにおいては、T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現はaraBADプロモーターの制御下にある(すなわちアラビノース誘発性発現)。さらに、HC77638はまた、araBADプロモーターから融合産物の発現を駆動する異なる親プラスミド(親pSF032、下記の配列を参照)ではない、同じタグからなるタグライブラリーにクローン化した。可溶性の毛髪結合ペプチド(例えば目的のペプチド)をコードする遺伝子を、制限酵素部位の、5’末端でのBamHIおよび3’末端でのAscIを用いるバッチクローニングアプローチで、タグ配列の下流にクローン化した。
追加的な目的のペプチドの封入体への駆動のためのIBT139の使用
タグのこのファミリーがタンパク質の封入体への駆動において一般に有用であるか否かを判定するため、このファミリーの最大のメンバーであるIBT139を、タグライブラリーを用いたスクリーニングプロセスを経ていないタンパク質を用いてさらに評価した。
HC776124(配列番号23)をコードする核酸分子(配列番号22)をDNA2.0(Menlo Park,CA)から注文し、親プラスミドpLR042の制限部位BamHI(5’)およびAscI(3’)にクローン化し、プラスミドpLR186(配列番号49)を作成した。IBT139をコードする核酸分子(配列番号20)を制限部位NdeI(5’)およびBamHI(3’)にクローン化し、融合タンパク質IBT139.HC776124(配列番号25)をコードするキメラ遺伝子(配列番号24)を得た。
ペプチドHC776124の設計を表3に提供する。ペプチドHC776124(HC77643の二量体)は、A09(配列番号3)およびKF11(配列番号4)(太字)を含むいくつかの毛髪結合ドメインからなる。酸切断可能なDP部分をイタリック体で示す(表3)。
LB(+100μg/mLのアンピシリン)中の成長物3mLに各コンストラクトの一晩培養物30μLを接種した。培養物を約0.4のOD600まで成長させ、0.2%アラビノースで誘発し、3時間成長させた。可溶性細胞含量対不溶性細胞含量を測定するため、細胞を溶解し、可溶性および不溶性画分をSDS−PAGEゲル上で走らせた。
融合タンパク質IBT139.HC776124は不溶性封入体の形態で生成された。
架橋可能なシステインの有効数を含む小さい封入体タグ(IBT186)は酸化架橋および沈殿による切断されたペプチド混合物から分離されうる
本実施例の目的は、架橋可能なシステイン残基の有効数を有する小さいタグの封入体タグ(例えばIBT186;配列番号26および27)(IBT186は4つのシステイン残基を有する)が、酸化架橋を用いて容易に分離される間に両方の封入体形成を駆動できることを示すことである。本実施例はまた、封入体形成の誘発に有効であることが予め示された小さい封入体タグが、封入体形成を有効に駆動するその能力を維持しつつ、架橋可能なシステイン残基の有効量を有するように修飾されうることを示す(IBT186は、配列内に4つの架橋可能なシステインが分布された小さいタグIBT139(実施例3〜4)に由来する)。4つのシステインの存在は、タグおよびペプチドの切断後でのタグの単純な沈殿を可能にする。
IBT186をコードする核酸分子(配列番号26)はDNA2.0(Menlo Park,CA)により合成され、それをプラスミドpLR186の制限部位NdeI(5’)およびBamHI(3’)にクローン化し(pBADプロモーターから駆動された発現)、HC776124コンストラクトとの融合体を作成し、融合ペプチドIBT186.HC776124(配列番号29)をコードするキメラ遺伝子(配列番号28)を作成した。得られたプラスミド(pLR238)を、araBADオペロンが欠失した大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC46076(商標))に形質転換した。
成長条件:
特に断りのない限り、大腸菌(E.coli)細胞を10Lの容器内で発酵させた。発酵を3段階で進行させた。
1.種子接種物125mLの調製。目的のコンストラクトを有する細胞を2YT種子培地(10g/Lの酵母抽出物、16g/Lのトリプトン、5g/LのNaClおよび適切な抗生物質)125mL中に接種し、37℃で数時間成長させた。
2.バッチ相における成長。接種物125mLを、37℃のバッチ培地(9g/LのKH2PO4、4g/Lの(NH4)2HPO4、1.2g/LのMgSO4.7H2O、1.7g/Lのクエン酸、5g/Lの酵母抽出物、0.1mL/LのBiospumex 153K消泡剤、4.5mg/Lのチアミン.HCl、23g/Lのグルコース、10mL/Lの微量元素、50mg/Lのウラシル、適切な抗生物質、pH6.7)6L中に添加した。
3.フェドバッチ相における成長。バッチ相における成長の約12時間後、フェド−バッチ相を初期化した。フェド−バッチ培地(2g/LのMgSO4.7H2O、4g/Lの(NH4)2HPO4、9g/LのKH2PO4、1〜2g/分のグルコース)を、37℃で約15時間、定速で反応装置に添加した。フェド−バッチ相の終了の4時間前、細胞を誘発し、2g/LのL−アラビノースの添加によりPOIを発現させた。
全発酵培養液を12,000psi(82,700kPa)でのAPVモデル2000 Gaulin型ホモジナイザーに3回通過させた。培養液を各均質化に先立ち5℃未満に冷却した。均質化した培養液を600mL/分および12,000相対遠心力(RCF)でのWestfalia WHISPERFUGE(商標)(Westfalia Separator Inc.(Northvale,NJ))ディスクスタック遠心分離機で直ちに処理し、封入体を懸濁された細胞残渣および溶解不純物から分離した。回収したペーストを水に15g/L(乾燥ベース)で再懸濁し、NaOHを用いてpHを約10.0に調整した。懸濁液を12,000psi(82,700kPa)でのAPV2000 Gaulin型ホモジナイザーに1回通過させ、厳密な混合を行った。均質化したpH10の懸濁液を600mL/分および12,000RCFでのWestfalia WHISPERFUGE(商標)ディスクスタック遠心分離機で直ちに処理し、洗浄した封入体を懸濁された細胞残渣および溶解不純物から分離した。回収したペーストを純水中に15gm/L(乾燥ベース)で再懸濁した。懸濁液を12,000psi(82,700kPa)でのAPV2000 Gaulin型ホモジナイザーに1回通過させ、厳密な洗浄を行った。均質化した懸濁液を600mL/分および12,000RCFでのWestfalia WHISPERFUGE(商標)ディスクスタック遠心分離機で直ちに処理し、洗浄した封入体を残留する懸濁された細胞残渣およびNaOHから分離した。回収したペーストを純水中に25gm/L(乾燥ベース)で再懸濁し、混合物のpHをHClを用いて2.2に調整した。酸性化された懸濁液を70℃に14時間加熱し、DP部位の切断を完了し、融合ペプチドを生成物ペプチドから分離した。生成物のpHを中和し(注:用いられるpHは回収されたペプチドの可溶性に応じて変化しうる)、約5℃に冷却し、12時間保持した。このステップの間、懸濁液を500mLもしくは1Lのボトル内、全量の3/4以下で保持し、酸素が十分に存在することを確認し、ジスルフィド形成によるシステイン架橋を確認した。次いで、混合物を9000RCFで30分間遠心分離し、HPLC分析のために上清をデカントした。
上清を0.2ミクロン膜で濾過した。濾過生成物を、10%アセトニトリル(ACN)、90%水と0.1% v/vのトリフルオロ酢酸(TFA)で前処理(preconditioned)した10ミクロンのC18の媒体を有する22×250mmの逆相クロマトグラフィーカラムGraceVydac(登録商標)(218TP1022)に装填した。生成物を、水とアセトニトリル(ACN)の勾配が室温および約10mL/分で0.1% v/vでのTFAとともに水中で10%〜25%で可変のアセトニトリル(ACN)の場合にカラムを溶出することにより、精製状態で回収した。220nmでの分光光度的検出を用い、生成物ペプチドの溶出を監視し、追跡した。
タンパク質を上記のように精製した。酸の切断およびpHの中和後、混合物を約5℃で約6時間保存し、システインにおける架橋結合を可能にした。外気への暴露により、システイン架橋を引き起こす酸素がもたらされた。混合物を9000RCFで30分間遠心分離し、沈殿した封入体タグを可溶性の目的のペプチドから分離した。
沈殿ペーストと残存する可溶性画分の双方のSDS−PAGEゲル分析によると、不溶性ペースト中にIBT186が存在し、かつHC776124が可溶性画分中に残存することが示された。これをHPLCによりさらに確認し、それから単に可溶性画分中にHC776124が存在することが示された(表4を参照)。
架橋可能なシステインの有効量を含む小さい封入体タグIBT139(5C)は酸化架橋および沈殿により切断されたペプチド混合物から分離されうる
本実施例の目的は、架橋可能なシステイン残基の有効数を有する別の小さいタグの封入体タグ(例えばIBT139(5C);配列番号265)(IBT139(5C)は5つのシステイン残基を有する)が、酸化架橋を用いて分離が容易である間に両方の封入体形成を駆動可能であることを示すことである。本実施例はまた、封入体形成の誘発に有効であることが予め示された小さい封入体タグが、封入体形成を有効に駆動するその能力を維持しながら、架橋可能なシステイン残基の有効量を有するように修飾されうることを示す(IBT139(5C)は5つのシステインが配列内に分布された小さいタグIBT139(実施例4)に由来する)。5つのシステインの存在は、タグおよび目的のペプチドの切断後でのタグの単純な沈殿を可能にする。
IBT139(5C).HC776124のクローニングおよび初期分析:
IBT139(5C)(配列番号265)をコードするコード配列(配列番号264)はDNA2.0(Menlo Park,CA)により合成され、それをプラスミドpLR186の制限部位NdeI(5’)およびBamHI(3’)にクローン化し(pBADプロモーターから駆動された発現)、HC776124(配列番号22)コンストラクトとの融合体を作成し、プラスミドpLR435(配列番号263)を作成した。プラスミドを、天然araBADオペロンが欠失した大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC46076(商標))に形質転換した。5つのシステイン残基(太字)を含むIBT139(5C)の配列を下記に提供する。
IBT139(5C):
MASCGQQRFQWQFEQQPRCGQQRFQWQFEQQPRCGQQRFQWQFEQQPECGQQRFQWQFEQQPC(配列番号265)
上記(実施例5)のようにタンパク質を生成し、処理した。酸切断およびpH中和後、混合物を約5℃で約6時間保存し、システイン残基における酸化および架橋結合の形成を可能にした。外気への暴露により、システイン架橋を引き起こすだけの十分な酸素がもたらされた。次いで、混合物を9000RCFで30分間遠心分離し、沈殿した封入体タグを可溶性の目的のペプチドから分離した。
沈殿ペーストと残存する可溶性画分の双方のSDS−PAGEゲル分析によると、不溶性ペースト中にIBT139(5C)が存在し、かつ可溶性画分中にHC776124が残存することが示された。これをHPLCによりさらに確認し(実施例5に記載の方法を参照)、それから単に可溶性画分中にHC776124が存在することが示された。架橋実験の結果を表4にまとめる。
封入体タグの末端への複数のシステインの導入は融合ペプチドの封入体への有効な駆動能力を保持しながら酸化架橋を促進する
本実施例の目的は、封入体タグの末端に対してシステイン残基の有効数を含む少なくとも1つの架橋可能なシステインモチーフの付加により、システイン同士の間隔が接近している場合であっても架橋可能なIBTが作成されることを示すことである。架橋可能なシステインモチーフを通常は架橋可能なシステイン残基が欠如した封入体タグ(すなわちIBT139;配列番号21)に付加し、システイン修飾タグ「IBT139.CCPGCC」(配列番号30〜31)を作成した。モチーフの付加によりIBTの封入体形成を駆動する能力が改変されなかった一方、修飾により酸化架橋を用いるタグの単純な分離が促進された。架橋実験の結果を表4にまとめる。
架橋を促進するため、テトラシステインタグCCPGCC(配列番号32〜33)を通常はシステイン残基を有しない封入体促進配列IBT139(配列番号21)の末端に導入した結果、IBT139.CCPGCC(配列番号30および31)を得た。CCPGCCテトラシステインタグはLUMIO(商標)二ヒ素染料結合モチーフである。LUMIO(商標) Green検出キットをInvitrogen(Invitrogen(Carlsbad,CA))から入手した。
実施例5に記載のようにタンパク質を生成し、精製した。酸切断およびpH中和後、混合物を約5℃で少なくとも6時間保存し、システインにおける架橋結合の形成を可能にした。外気への暴露により、システイン架橋を引き起こす酸素がもたらされた。混合物を9000RCFで30分間遠心分離し、沈殿したタグを可溶性ペプチドから分離した。
沈殿ペーストと残存する可溶性画分の双方のSDS−PAGEゲル分析によると、不溶性ペースト中に封入体タグ(IBT139.CCPGCC)が存在し、かつ可溶性画分中に目的のペプチド(HC776124)が残存することが示された。これをHPLC分析によりさらに確認し、それから単に可溶性画分中にHC776124が存在することが示された。架橋実験の結果を表4にまとめる。
追加的な封入体タグの調製
追加的な封入体タグをIBT136に基づいて設計した。融合パートナー配列(IBT182、IBT183、IBT184、IBT185、IBT186(さらに上記のようにHC776124で評価)、IBT187a、およびIBT187b)を試験するための全体スキームは、(アニールされる場合)試験発現ペプチドHC77643とインフレームでの融合パートナーの定方向クローニングに必要とされる付着端を生成するDNAオリゴヌクレオチドを設計することであった。
IBT182のアミノ酸配列(QQHFHWHFQQQPRGQQHFHWHFQQQPEGQQHFHWHFQQQ;配列番号39)をコードする核酸分子(配列番号38)を、2つの大腸菌(E.coli)のコドンバイアスがなされた相補的合成オリゴヌクレオチド(Sigma−Genosys)から構築した。制限部位NdeIおよびBamHIに対応するアニール可能な末端の生成に関しては、オーバーハングを各オリゴヌクレオチド内に含めた。
Claims (15)
- 一般構造:Gln−Gln−Xaa1−Phe−Xaa2−Trp−Xaa3−Phe−Xaa4−Xaa5−Gln−スペーサー−[[Gln−Gln−Xaa1−Phe−Xaa2−Trp−Xaa3−Phe−Xaa4−Xaa5−Gln]−[スペーサー]m]n
(式中、
Xaa1=Arg、His、またはLys;
Xaa2=Gln、His、またはLys;
Xaa3=Gln、His、またはLys;
Xaa4=GluまたはGln;
Xaa5=GlnまたはLys;
n=1〜10;
m=n−1;かつ
スペーサーはプロリン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、およびシステインからなる群から選択されるアミノ酸を含むペプチドである)
を含む封入体タグ。 - 配列番号33を含む少なくとも1つの架橋可能なシステイン部分をさらに含む、請求項1に記載の封入体タグ。
- 封入体タグのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに位置する少なくとも1つの架橋可能なシステイン部分をさらに含む、請求項1に記載の封入体タグ。
- 配列番号15、配列番号19、配列番号21、配列番号27、配列番号31、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、および配列番号265からなる群から選択される、請求項1に記載の封入体タグ。
- 少なくとも1つの関心あるペプチドに作動可能に連結された、請求項1または請求項2に記載の封入体タグを含む融合ペプチド。
- 封入体タグを少なくとも1つの関心あるペプチドから分離する少なくとも1つの切断部位をさらに含む、請求項5に記載の融合ペプチド。
- 関心あるペプチドが、ポリマー結合ペプチド、毛髪結合ペプチド、爪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、歯結合ペプチド、抗菌ペプチド、クレー結合ペプチド、色素結合ペプチド、およびセルロース結合ペプチドからなる群から選択される、請求項6に記載の融合ペプチド。
- 少なくとも1つの関心あるペプチドに作動可能に連結された、請求項1または請求項2に記載の封入体タグを含む融合ペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項8に記載の核酸分子を含む発現カセット。
- 請求項9に記載の発現カセットを含むベクター。
- 請求項10に記載のベクターを含む微生物宿主細胞。
- 宿主細胞が、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピキア(Pichia)、ヤロウィア(Yarrowia)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ザイモモナス(Zymomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、エリスロバクター(Erythrobacter)、緑色硫黄細菌(Chlorobium)、クロマチウム(Chromatium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、サイトファーガ(Cytophaga)、ロドバクター(Rhodobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリア(Corynebacteria)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、デイノコッカス(Deinococcus)、エシェリキア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、パンテア(Pantoea)、シュードモナス(Pseudomonas)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロサイナス(Methylosinus)、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)、メチロシスティス(Methylocystis)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、シネコシスティス(Synechocystis)、シネココッカス(Synechococcus)、アナベナ(Anabaena)、チオバチルス(Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ(Klebsiella)、およびミキソコッカス(Myxococcus)からなる群から選択される、請求項11に記載の微生物宿主細胞。
- 不溶性形態でのペプチドを発現するための方法であって、
a)関心あるペプチドをコードする第2の部分に作動可能に連結された、請求項1または請求項2に記載の封入体タグをコードする第1の部分を含む、融合ペプチドをコードする発現可能な遺伝子コンストラクトを合成するステップと、
b)発現宿主細胞を(a)の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
c)(b)の形質転換宿主細胞を、発現可能な遺伝子コンストラクトを発現させかつコードされた融合ペプチドを不溶性形態で産生する条件下で増殖させるステップと、
d)上記不溶性形態での上記融合ペプチドを回収するステップと、
を含む、方法。 - 関心あるペプチドを生産するための方法であって、
a)少なくとも1つの関心あるペプチドをコードする第2の部分に作動可能に連結された、請求項1または請求項2に記載の封入体タグをコードする第1の部分を含む、融合ペプチドをコードする遺伝子コンストラクトを合成するステップであって、ここで上記第1の部分および上記第2の部分を少なくとも1つの切断可能なペプチドリンカーにより分離するステップと、
b)発現宿主細胞を(a)の遺伝子コンストラクトで形質転換するステップと、
c)(b)の形質転換宿主細胞を、遺伝子コンストラクトを発現させかつコードされた融合ペプチドを不溶性形態で産生させる条件下で増殖させるステップと、
d)上記不溶性形態での融合ペプチドを回収するステップと、
e)上記融合ペプチドの上記第1の部分がもはや上記第2の部分に融合されないように、上記融合ペプチドから上記少なくとも1つの切断可能なペプチドリンカーを切断するステップと、
f)上記関心あるペプチドを回収するステップと、
を含む、方法。 - 関心あるペプチドが、ポリマー結合ペプチド、毛髪結合ペプチド、爪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、歯結合ペプチド、クレー結合ペプチド、色素結合ペプチド、セルロース結合ペプチド、および抗菌ペプチドからなる群から選択される、請求項13または14に記載の方法。
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