CN104513298B - 一种表达鸡传染性法氏囊可溶性vp 2-4-3多肽的方法 - Google Patents

一种表达鸡传染性法氏囊可溶性vp 2-4-3多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP 2‑4‑3多肽的方法，能够克服目前鸡传染性法氏囊可溶性VP 2‑4‑3蛋白重组表达时主要以包涵体方式表达的问题，从而弥补现有技术的不足。本发明提供一种改造的鸡传染性法氏囊VP 2‑4‑3多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明优化获得的VP 2‑4‑3抗原保持了其主要抗原性，且经过了细胞周质的加工和修饰过程，结构上比单纯的原核表达的包涵体更接近于原蛋白结构，抗原特异性更强。并且该抗原为分泌表达，抗原纯化无需裂解细胞，避免了内毒素的引入回避了内毒素去除程序。该抗原更适于低成本大规模工业化生产。

Description

一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肽的方法
技术领域
本发明属于蛋白重组表达技术领域，具体涉及一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP2-4-3多肽的方法。
背景技术
传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒感染，引起幼鸡发病的一种急性高度传染性疾病。该疾病发病率高，病程较短，对养殖业的危害巨大。发病鸡主要表现为腹泻、颤抖、极度虚弱严重者引起死亡。而且幼鸡感染之后可导致免疫抑制，诱发多种疫苗免疫失效。该病毒为双链RNA病毒，有单层衣壳，无囊膜。IBDV病毒颗粒有五种蛋白构成，其中VP2蛋白可以诱导产生具有保护性的中和抗体，是发展亚单位疫苗的理想抗原。目前临床上常用IBDV弱毒活疫苗及灭活疫苗进行免疫，应用弱毒活疫苗需准确把握免疫时期，母源抗体水平降低时免疫，过早免疫效果不佳，已被中和，免疫时期延后，由于其免疫抑制影响其他疫病免疫接种。灭活苗不利与长期维持较高抗体水平。发展VP2蛋白的重组疫苗可以很好地解决传染性法氏囊病免疫抑制问题，但目前原核表达VP2抗原多以包涵体的形式存在，导致获得蛋白的量达不到要求，且免疫效果欠佳。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肽的方法，能够克服目前鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3蛋白重组表达时主要以包涵体方式表达的问题，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种改造的鸡传染性法氏囊VP 2-4-3多肽，其氨基酸序列为SEQID NO:1；
本发明还提供一种编码上述鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肽的基因；作为实施例的优选，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明还提供一种重组质粒，所述的重组质粒携带有上述的基因；
作为优选，上述的重组质粒中，在基因片段的前面来连接有OmpA信号肽。
本发明再一个方面提供生产鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3多肽的方法，是用转化有上述重组质粒的大肠杆菌发酵来制备的；
本发明再提供一种疫苗，所述的疫苗中是用其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的鸡传染性法氏囊可溶性VP 2-4-3作为抗原。
本发明优化获得的的VP 2-4-3抗原保持了其主要抗原性，且经过了细胞周质的加工和修饰过程，结构上比单纯的原核表达的包涵体更接近于原蛋白结构，抗原特异性更强。并且该抗原为分泌表达，抗原纯化无需裂解细胞，避免了内毒素的引入回避了内毒素去除程序。该抗原更适于低成本大规模工业化生产。
附图说明
图1：质粒构建示意图。
图2：分泌表达纯化后的VP2-4-3多肽PAGE图；
图3：以抗传染性法氏囊病毒抗血清为抗体识别VP2-4-3多肽抗原的Westernblotting图。
具体实施方式
本发明提供了一种优化后的鸡传染性法氏囊(IBDV LN 5/13)VP 2-4-3基因，通过优化使VP 2-4-3更适用于分泌表达。并用大肠杆菌的Ⅰ型跨膜转运分泌系统，在重新构建VP2-4-3基因序列的5′端连接能被大肠杆菌的Sec系统识别OmpA信号肽序列，引导转运到细胞间质。把构造好的片段克隆到pET-28a质粒，转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导即可制备分泌表达IBDV LN 5/13株VP 2-4-3可溶性抗原。
鸡传染性法氏囊(IBDV LN 5/13)VP 2-4-3基因，其原始核苷酸序列为SEQ ID NO:3，氨基酸序列为SEQ ID NO:4。但申请人发现VP 2-4-3多肽柔性较低不利于分泌表达，因此对该多肽的氨基酸序列进行优化，使其更适于分泌表达，而且抗原特异性更强，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：VP 2-4-3多肽的优化
首先分析VP 2-4-3基因(SEQ ID NO:3)序列指导合成的肽链(SEQ ID NO:4)的特征，发现C-score、S-score、Y-score的水平较低，肽链的前70个氨基酸序列不含有极性较强的疏水区，没有明显的剪切位点，由此可认为该多肽链前段无特征性信号肽。肽链的抗原特征显示亲水区多集中于肽链的前段及末端，中级为一段比较长的核心疏水区。该多肽链的抗原特征区和肽链的亲水区大体相同，也集中与肽链的两端。肽链可翻转的角度较低，柔性较低不利于分泌表达。申请人修改VP 2-4-3基因的基因序列，修改方法如下：
开放阅读框的295-297,340–342,508-510,547-549,553-555,571-573,589-591,607-609,871-873,889-891,910-912的半胱氨酸密码子(UGU、UGC)脯氨酸密码子(CCU、CCC)修改为甘氨酸密码子(GGU、GGC)。
优化后的VP 2-4-3开放阅读框的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，氨基酸序列为SEQID NO:1。
实施例2：VP 2-4-3多肽的分泌表达
在优化后的VP 2-4-3基因(核苷酸序列为SEQ ID NO:2)开放阅读框的最前端加入一段指导合成OmpA信号肽(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA)序列的基因片段ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCAGGTTTCGCTACCGTCGCTCAGGCT，VP 2-4-3优化后的基因片段去掉前段的ATG直接连与OMPA信号肽序列之后。在信号肽的前面加入ATG起始密码子然后连接修改后的VP 2-4-3序列，并把其直接置于质粒启动子的下游，然后加上NcoⅠ，XhoⅠ双酶切位点，、OmpA；获得核苷酸序列为SEQ ID NO:5的片段。NcoⅠ，XhoⅠ分别双酶切基因片段和表达载体pET-28a(+)，并凝胶回收。4μl基因片段、1μl pET-28a(+)载体片段、0.5μl T4DNA酶、1μl连接酶缓冲液、3.5μl ddH2O，4℃连接过夜制成质粒(图1)。将重组质粒转化到感受态E.coli BL21(DE3)中，在含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上培养过夜。挑取单菌落，加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒测序比对正确。
取10μl菌液，加入含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液A600达0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，37℃振荡诱导4h，收集浓缩菌液，加入4.5μl DTT，2μl 5×Loading Buffer，煮沸10min，4℃10000g离心10min，取15μl上清进行SDS-PAGE分析。Western blot分析在47KD处有明显条带，说明分泌表达鸡传染性法氏囊IBDV LN 5/13株VP 2-4-3可溶性抗原疫苗株构建成功。
VP-2-4-3分泌表达及其验证
取经过鉴定正确的上述菌种菌液100μl，涂布含有卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃过夜培养，挑取单菌落接入5ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中。37℃180r/min转摇菌8h后接入1000ml LB培养基中继续培养(卡那霉素浓度50μg/ml、转速180r/min)。3h后菌液浓度达到OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达4h。
取诱导后的1L菌液，8000r/min离心10min收集上清，并加入截留分子量为30KD的透析袋中，放入PEG2000透析过夜，透析袋内容物以10ml双蒸水重新溶解。溶解产物经过Bio-Gel P-200蛋白纯化柱，收集ELISA检测传染性方式囊抗原呈阳性的样品。测试收集液蛋白浓度，最终换算为分泌可溶蛋白产率为240mg/L。该优化后的VP2-4-3基因应用PET-28a启动的表达效率远高与同样应用OpmA信号肽引导表达的糖苷酶8mg/L(Protein ExprPurif,2002,24:90-98)，及应用PhoA信号肽表达鼠内皮抑制素的40mg/L(Protein ExprPurif,2002,24:453-459)的效率。图2为分泌表达纯化后的VP2-4-3多肽PAGE图(左面为纯化的蛋白，右面为marker)。图3为以抗传染性法氏囊病毒抗血清为抗体识别VP2-4-3多肽抗原的Western blotting结果表明明分泌表达的VP2-4-3多肽具有良好的抗原活性。

Claims (2)

1.一种鸡传染性法氏囊VP 2-4-3多肽，其特征在于，是用重组的大肠杆菌发酵得到的；
所述的重组的大肠杆菌，是由重组质粒转化/转染制备得到的；
所述的重组质粒，携带核苷酸序列为SEQ ID NO：2的基因，这种基因片段的前面连接有OmpA信号肽；
核苷酸序列为SEQ ID NO：2的基因编码后得到氨基酸序列为SEQ IDNO:1的多肽，即鸡传染性法氏囊VP 2-4-3多肽。
2.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗是用权利要求1所述的鸡传染性法氏囊可溶性VP2-4-3多肽作为抗原。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7678883B2 (en) * 2007-07-25 2010-03-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Solubility tags for the expression and purification of bioactive peptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1754959A (zh) * 2004-09-27 2006-04-05 长江大学 一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Infectious bursal disease virus mRNA for VP2-4-3 polyprotein, partial cds;Tsukamoto,K. et al.;《Genbank》;19991204;全文 *

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