CN103304663B - 一种鸡源性抗鸡新城疫病毒p蛋白的单链抗体、其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用分子生物学手段制备鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的基因工程单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。ELISA实验证明，获得的抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体能与原核表达的鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合，显示了该单链抗体具有一定的结合新城疫病毒P蛋白的活性，可以用于鸡新城疫的预防和/或治疗。

Description

一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗鸡新城疫病毒的基因工程单链抗体、表达该单链抗体的表达载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法，所述单链抗体能与鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合活性。 

背景技术

鸡新城疫是新城疫病毒引起的禽类急性、高度接触性和致死性的传染病，对我国乃至世界养禽业的危害及其严重，被国际兽医局确定为A类传染病，也是我国禽肉出口检疫的重要疾病之一。对于病毒性传染病，目前尚没有特异性治疗药物。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒作用及可以大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗病毒药物的潜力，受到该领域高度重视。 

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的基因工程单链抗体，该单链抗体能够与鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合，可用于鸡新城疫的预防和/或治疗。 

一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体，其至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽，所述中间连接肽为(Gly4Ser)3。 

上述单链抗体具有如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。 

本发明的另一目的是提供一种编码所述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体的基因，其具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。 

为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步设计酶切位点和识别序列，优选进一步含有内切酶位点NotI、NcoI 和识别序列。其中包括NcoI：CCATGG NotI：GCGGCCGC。 

本发明的再一目的是提供一种含有编码上述单链抗体的基因的表达载体。上述表达载体为原核表达载体，优选为pOPE101-XP载体。 

本发明的再一目的是提供一种制备上述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体的方法，包括以下步骤： 

（1）采用RT-PCR直接从ND GA/VA疫苗免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因； 

（2）利用SOE-PCR法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体编码基因； 

（3）将步骤（2）的鸡源性单链抗体基因克隆到原核表达载体pOPE101-XP中，构建重组质粒； 

（4）将步骤（3）的原核表达载体pOPE101-XP转化入E.coli JM109感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），培养、表达单链抗体； 

（5）将步骤（4）表达的单链抗体用以原核表达的新城疫病毒P蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA进行筛选，阳性克隆即为抗新城疫病毒P蛋白的单链抗体； 

（6）分离纯化步骤（5）所得阳性克隆培养产物，即获得所述鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体。（按照上海意泓生物科技有限公司纯化柱说明书操作进行） 

需要说明的是,以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料,所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例),各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得,其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的发法准确获得. 

本发明的再一目的是提供上述鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体在用于制备鸡新城疫的预防、治疗药物中的应用。 

本发明的技术原理是采用RT-PCR直接从ND（新城疫）GA/VA疫苗株免疫的鸡脾脏RNA中扩增出抗体编码基因的重链可变区（VH）基因和轻链可变区（VL）基因。利用SOE-PCR（重组链延伸反应）法将linker与VH基因和VL基因相连构建鸡源性单链抗体（ScFv）基因，并将其克隆到原核表达载体 pOPE101-XP中，构建重组质粒并转入大肠杆菌表达，间接ELISA筛选原核表达的抗NDV单链抗体的阳性克隆，测序后进行Clustalw多序列比较，证明该单链抗体属于鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体。 

本发明的有益效果是：抗鸡新城疫病毒的基因工程抗体能与鸡新城疫病毒P蛋白特异性结合，能够用于鸡新城疫的预防和治疗。 

附图说明：

图1是实施例1的pOPE101-XP重组载体的结构图。 

图2是单链抗体的编码基因及其对应的氨基酸序列。 

具体实施方式：

实施例1鸡源性抗鸡新城疫病毒的单链抗体的制备 

1：将鸡新城疫疫苗（Bio ND VG/GA购自梅里亚集团）按使用说明免疫鸡（罗曼母鸡，4月龄、体重1.5kg，购自上海思甜家禽养殖专业合作社），用常规（参照F.M.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》）ELISA法检测血清抗体效价大于1:20000时，收获鸡脾脏，经匀浆研磨后，用Trizol法（TRIZOL Reagent购自TaKaRa公司）提取总RNA。以提取的总RNA为模版，采用Oligo primer，根据反转录试剂盒（cDNA第1链合成试剂盒购自TaKaRa公司）的产品说明操作步骤，合成第1链cDNA。 

2：根据GenBank已公布的鸡抗体编码基因可变区序列(AJ298107.1)的FR区设计扩增抗体轻、重链的引物（表1），其中VH1F和VH1R用于扩增VH区；VL1F和VL1R用于扩增VL区；VH2R、VH2F用于VH基因加入酶切位点和Linker序列；VL2R、VL2F用于VL基因加入酶切位点和Linker序列。其中，VH2F、VL2R分别含有NotI和NcoI酶切位点；VH2R、VL2F含互补的Linker序列(酶切位点和Linker序列在表1中用下划线标示出)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 

表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小 

3：VH和VL基因的扩增 

以cDNA为模版，VH1F、VH1R为引物扩增VH基因；VL1F、VL1R为引物扩增VL基因。PCR反应体系为25μL：2×PCR mix12.5μL，模版cDNA2μL，上下游引物（25μM）各1μL，ddH₂O8.5μL。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因（根据AxyGEN公司提供的胶回收说明书操作）。 

4：单链抗体编码基因的获得 

分别以VH和VL基因为模版，VH2R、VL2F为引物PCR扩增带有Linker的重链可变区和轻链可变区基因，PCR条件同上。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收目的基因（含有Linker序列的VH和VL基因）。通过重组链延伸反应(SOE-PCR)将含有Linker序列的VH和VL基因连接为ScFv基因，并加入NotI和NcoI酶切位点。 

5：单链抗体编码基因原核表达质粒的构建 

根据常规分子克隆方法（参照J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》），单链抗体编码基因和pOPE101-XP载体分别经NotI和NcoI双酶切后，将单链抗体编码基因插入pOPE101-XP载体（常州安比森生物科技有限公司提供），构建重组表达质粒（参见图1），并将其转化E.coli JM109感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），得到重组表达宿主。转化的克隆进行菌液PCR鉴定和质粒 双酶切鉴定。 

6：单链抗体编码的诱导表达 

将鉴定后的阳性克隆在含Amp+（终浓度为100μM）的LB液体培养基中培养至菌液OD600至0.6。将菌液分为三份，分别为诱导组、TES处理组和非诱导组。诱导组和TES处理组在菌液中加入IPTG(终浓度100μM)，于30℃诱导4h，收集菌液。菌液经离心收集沉淀，一份为诱导组，另一份用冰冷的TES(50mmol/L Trils-HCl，1mmol/L EDTA,250g/L Sucrose)重悬，冰上放置15min，离心收集上清为TES处理组。根据默克公司的《pET System Manual》进行分离纯化。 

实施例2抗原特异性ScFv的间接ELISA筛选 

取纯化的原核表达的NDV P蛋白（常州安比森生物科技有限公司提供），用50mmol/L碳酸氢钠盐溶液(pH9.6)于4℃包被过夜，5%脱脂奶粉溶液封闭1h后用PBST(含0.1%Tween20，以下同)洗涤3次；取TES处理菌液上清50μL，与4%脱脂奶粉溶液50μL混匀后加入上述包被好的P蛋白，37℃反应2h，PBST洗涤；加入Myc-Tag Mouse mAb（Myc-标签鼠单克隆抗体购自Ray Biotech公司）100μL(1:2000)37℃反应2h，PBST洗涤；加入Peroxidase-conjugated Affinipure Goagt Anti-Mouse IgG（购自Abmart公司）100μL(1:4000)，37℃反应1h，PBST洗涤；TMB显色，2mol/L硫酸终止反应，酶标仪读取OD450值，同时设未诱导菌液上清为表达阴性对照，BSA为抗原阴性对照。间接ELISA结果的判定以P/N(P为阳性孔的OD450值，N为阴性孔的OD450值)表示，P/N≥2.1为阳性；1.5≤P/N＜2.1为可疑；P/N＜1.5为阴性。阳性克隆经3次重复性试验验证（参照姚火春主编《兽医微生物学实验指导》），同时设传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒等，为抗原对照验证单链抗体的特异性。间接ELISA结果显示,相同条件下，单链抗体与包被的新城疫病毒P蛋白的反应OD值平均值为0.663，而与包被的对照组抗原的反应OD值平均值为0.106，证明单链抗体能够特异地识别鸡新城疫病毒P蛋白，而不与鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒等发生交叉免疫反应。 

实施例3对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其由726个核苷酸及据此推测的244个氨基酸组成，所述核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述氨基 酸序列如SEQ ID No.3所示。 

实施例4细胞攻毒实验检测单链抗体抗病毒活性 

由于NDV F48E9感染BHK21细胞并产生细胞病变，故可根据scFv对细胞病变的影响判定其对NDV F48E9的抑制水平。操作在96孔板中进行，预先将适量浓度BHK21细胞转入96孔板中培养，至细胞单层长至80%左右。 

1)样品分组与前处理试验分为以下五组：A组为空白对照组：100μL PBS缓冲液。B组为阳性血清对照组：1:100稀释的阳性血清加入100TCID50病毒混合，定容至100μL。C组为单链抗体scFv组：将50μL浓度为1mg/mL scFv与100TCID50病毒混合，定容至100μL。D组为感染组对照组：100μL DMEM稀释的病毒液(100TCID50)。E组为阴性血清对照组：1:100稀释的阴性血清加入100TCID50病毒混合，定容至100μL。将各组在37℃孵育1h。 

2)将各组样品加入96孔细胞板中，37℃孵育1h。每份样品10孔重复。 

3)弃去原孔中培养基，加入100μL DMEM维持培养基。37℃培养，培养36h后，每间隔12h观察细胞病变。 

观察48h后发生细胞病变的程度。试验结果表明，单独感染新城疫病毒的细胞株出现严重的合胞体，细胞形态消失；阳性血清对照组在感染NDV48h内能够抑制病毒的感染，仅出现少量的细胞病变；阴性对照组细胞株出现严重的合胞体，细胞形态消失，说明没有抗病毒活性；而单链抗体组，攻毒后细胞出现少量的变化，细胞出现一定程度的形态改变，与阳性血清对照组变化相似。结果表明，本发明提供的单链抗体具有抗新城疫病毒的功能，其活性与阳性血清相当，而与阴性对照及单独攻毒组相比，细胞病变程度差异显著。结果表明，本发明提供的单链抗体具有一定抗新城疫病毒的功能，其活性与阳性血清相当， 

实施例5单链抗体对感染NDV的SPF鸡治疗试验 

选择15日龄白来航鸡60只，随机抽取其中30只为实验组，另30只为对照组。将纯化的鸡抗P蛋白单链抗体注射实验组SPF鸡，同时用无单链抗体的PBS注射对照组SPF鸡，接种抗体2天后，以100TCID50的NDV强毒株F48EP同时鼻腔接种攻毒实验组和对照组SPF鸡。在免疫后第1,3,5,7,9,10,12,15天采集病料（肝脏、肺、 食道、法氏囊、气管），PCR检测病毒在各组织中的分布。结果表明，接种PBS的对照组SPF鸡从攻毒后第3天开始，可以在气管组织中和肺脏组织中检测出病毒的存在，第5天开始即可在肝脏、食道及法氏囊组织中检测出病毒的存在，同时，对照组攻毒2天后就开始发病，至第4天已有5只发病死亡，第30天已有23只发病死亡，死亡率为76.7%；而注射单链抗体的实验组，以NDV强毒株F48EP攻毒后，第3天仅在气管组织中发现病毒的存在，且病毒含量较对照组的低，其余组织则病毒含量极低或没有，且实验组在攻毒4天后有3只鸡出现症状，第6天有3只发病死亡，第30天后共有7只发病死亡，死亡率为23.3%.与对照组相比，死亡率很低，差异显著。 

说明本发明提供的单链抗体具有一定的抗新城疫病毒活性，可以用于鸡新城疫病毒的预防和治疗。 

Claims (5)

1.一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体，是与原核表达的新城疫病毒P蛋白结合的单链抗体，其具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。

2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于其为如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。

3.一种编码如权利要求1所述的单链抗体的基因，其特征在于其为SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于所述核苷酸序列中进一步包含内切酶位点NotI、NcoI，其中NcoI为CCATGG，NotI为GCGGCCGC。

5.如权利要求1或2所述的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的单链抗体在用于制备鸡新城疫的预防和/或治疗药物中的应用。