CN103091489B - 感染vsv的动物体内m蛋白抗体的elisa检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种感染VSV动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括重组蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、酶标二抗、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清；所述检测方法包括以下步骤：包被重组蛋白；将待测血清倍比稀释后孵育；加入酶标二抗；显色；加入终止液终止反应；检测OD值，以P/N值＞2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为样品的抗体滴度。本发明可对大量样品同时进行检测，操作方便，能够快速稳定检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，适用于感染VSV动物的快速诊断，有利于及时监测入境动物的VSV感染情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗体检测试剂盒及其检测方法，具体地，涉及一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
水泡性口炎(Vesicular stomatitis，VS)是由水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitis virus，VSV)引起的一种急性高度接触性传染病，马、牛、猪等动物较易感。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水泡病变为主要特征。VS在临床症状上很难与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SV)、猪水疱性疹(VES)区别开来。据国际兽医局(OIE)报道，南美、中美几乎所有的国家和地区以及北美的美国等国家在1996-2002年暴发了大面积的VS流行，造成严重的经济损失。VS常呈季节性暴发，多在夏秋季(7～8月)发生，秋末趋于平息。节肢动物可能在病毒的传播中起到一定的作用，许多病例还表现为地方流行性及易感动物间的直接传播，水泡性口炎被OIE列为A类疾病，在我国其为外来动物传染病，还未有大规模爆发的报道，国家进出境动物检疫对象中将VSV列为二类疫病。
VSV分为两个血清型，一是印地安那型(VSVIND)，另一是新泽西型(VSVNJ)。VSV基因组为线状单股负链RNA，全长约11Kb，从RNA的3’到5’端依次排列着5个相互不重叠的基因，分别编码病毒的核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、囊膜蛋白(G)和病毒RNA复制酶(L)。
VSV M蛋白是一个分子量约26kDa的非糖基化的蛋白，是导致VSV致病性的重要毒力因子，M蛋白在细胞内具有多重功能，包括稳定病毒囊膜上的G蛋白三聚体；参与病毒体装配；抑制病毒RNA合成等，更重要的是，它可以阻遏宿主细胞mRNAs由胞核向胞外的转运，并以此有效地干扰宿主细胞表达抗病毒I型干扰素，使得病毒得以在宿主内有效复制。
目前，监测VSV感染动物抗体主要采用中和实验，而对重要毒力因子M蛋白的抗体还无有效的监测方法，因此，开发出一种能够快速诊断VSV感染的试剂盒成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒及其检测方法，本发明提供的试剂盒能够快速检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，耗时少，使用方便，而且结果特异性强、敏感性高，有利于及时监测入境动物的VSV感染情况。
本发明的第一个目的通过以下技术方案实现，一种感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒，包括重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。
优选的，所述重组M蛋白抗原为TrxA-M重组蛋白抗原或含GST标签的重组M蛋白抗原。
优选的，所述TrxA-M重组蛋白抗原通过以下步骤制备：
步骤一，根据VSV基因组序列设计引物对VSV M基因进行PCR扩增；
步骤二，将质粒pET32a(+)和PCR扩增得到的所述M基因分别用BamHI与HindIII双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态菌株，37℃培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行BamHI与HindIII双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得pET32a-M质粒；
步骤三，将所述pET32a-M质粒转化大肠杆菌BL21表达宿主菌，以终浓度为1mM的IPTG诱导TrxA-M重组蛋白的表达；
步骤四，超声破碎所述宿主菌，12000rpm离心30min，对破碎菌体上清及沉淀分别采用12％的SDS-PAGE检测目的蛋白；
步骤五，采用Ni-NTA Resin纯化所述重组蛋白，采用12％的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSV小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白。
优选的，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液。
优选的，所述封闭缓冲液由含3％的脱脂奶粉的PBS和0.05％Tween20组成，所述百分比为重量体积百分比。
优选的，所述洗涤缓冲液为pH7.4的0.15M PBS。
优选的，所述样品稀释液由0.1gBSA加所述洗涤缓冲液至100mL而获得。
优选的，所述多孔酶联板为40孔或96孔的聚苯乙烯塑料板。
优选的，所述终止液为2M硫酸。
本发明的第二个目的通过以下技术方案实现，一种应用上述试剂盒检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体的方法，包括以下步骤：
步骤一，重组M蛋白抗原用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液稀释，4℃包被过夜，洗涤缓冲液洗涤；
步骤二，用封闭缓冲液37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
步骤三，将待测血清用样品稀释液倍比稀释后，37℃孵育2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
步骤四，加入用封闭缓冲液稀释为1∶5000的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5h，用洗涤缓冲液洗涤；
步骤五，于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，37℃保温10～30分钟；
步骤六，于各反应孔中加入0.05mL终止液；
步骤七，在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，以待测血清OD值/阴性对照OD值(P/N)＞2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清样品的抗体滴度。
优选的，所述重组M蛋白抗原的包被浓度为12.5μg/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的试剂盒，可对大量样品同时进行检测，操作简单方便，结果特异性强、敏感性高，能够快速稳定检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，适用于各种感染VSV动物的快速诊断，有利于及时监测入境动物的VSV感染情况。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是VSV M基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果图，其中泳道1为DNA Marker，泳道2为扩增的VSV M基因；
图2是重组VSV M基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE结果图，其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为pET32a诱导表达，泳道3为pET32a-M未诱导，泳道4为pET32a-M诱导；
图3是TrxA-M重组蛋白纯化产物的SDS-PAGE结果图，其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为pET32a-M表达产物纯化；
图4是重组蛋白采用抗His的Western-Blotting鉴定结果图，其中泳道1为pET32a空质粒表达产物，泳道2为pET32a-M未诱导表达，泳道3为pET32a-M诱导表达，泳道4为pET32a-M表达产物纯化；
图5是重组蛋白采用VSV康复血清的Western-blotting鉴定结果图，其中泳道1为pET32a空质粒表达产物，泳道2为pET32a-M未诱导表达，泳道3为pET32a-M诱导表达，泳道4为pET32a-M表达产物纯化；
图6是不同M蛋白包被稀释度的P/N值变化规律图；
图7是不同剂量VSV感染的BALB/c小鼠体重变化图；
图8是不同剂量VSV感染的BALB/c小鼠体内的M蛋白抗体消长规律图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
DNA分子量marker、pfu DNA聚合酶、DNA T4连接酶购自Fermentas公司(美国)；限制性内切酶BamH I-HF、HindIII购自NEB公司(美国)；DNA胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒与质粒DNA提取试剂盒购自Axygen公司；His单克隆抗体购自康为世纪公司；His标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA Resin)购自北京鼎国昌盛生物技术公司。
实施例1、M重组蛋白的原核表达质粒的构建与鉴定
根据GenBank中收录的VSVIND的M蛋白基因序列(690bp，登录号为NC_001560.1)设计上游引物(如SEQ ID NO.1所示)和下游引物(如SEQ ID NO.2所示)，上游和下游引物的的BamH I与HindIII酶切位点如下所示(下划线为上、下游引物的BamH I与HindIII酶切位点)：
上游引物：5′-ggccggatccatgagttccttaaagaagattc-3′，(SEQ ID NO.1)
下游引物：5′-ggccaagctttcatttgaagtggctgatag-3′，(SEQ ID NO.2)
并以克隆VSVIND全长基因组的质粒pVSV-GFP为模板，用高保真PCR试剂盒扩增得到了目的大小的M基因片段，如图1所示；
将pET32a及PCR扩增得到的纯化M基因产物分别用BamHI与HindIII双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化DH5α感受态细菌，37℃培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA后，进行BamHI与HindIII双酶切鉴定正确，并由上海杰李公司DNA测序，获得质粒pET32a-M。
实施例2、VSV M重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定
将pET32a-M质粒转化BL21(DE3)表达宿主菌，以终浓度为1mM的IPTG诱导重组M蛋白的表达，超声破碎表达蛋白的宿主菌，12000rpm下离心30min，对破碎菌体上清及沉淀分别采用12％的SDS-PAGE检测目的蛋白是否表达以及是否以包涵体形式存在；采用Ni-NTA Resin纯化该重组蛋白，纯化流程按照北京鼎国公司的纯化说明书进行，采用12％的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSVIND小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白是否表达正确；
质粒pET32a(+)表达的蛋白N末端可偶联分子量约17KDa的硫氧还蛋白(TrxA)，所以将VSV M蛋白基因克隆至表达质粒pET32a(+)后，可得到理论分子量为46KDa左右的TrxA-M重组蛋白，在1mM IPTG诱导后，相比pET32a质粒，pET32a-M转化的菌体中在46KDa左右相应的位置有目的大小的新蛋白得到表达，电泳结果如图2所示；为了进一步验证IPTG诱导后新表达的蛋白为目的蛋白，用Ni2+亲和层析纯化对表达产物进行了纯化，纯化后的TrxA-M重组蛋白的SDS-PAGE结果如图3所示；
纯化的TrxA-M蛋白用感染VSV小鼠康复血清及抗His标签的单克隆抗体分别进行了Western-blotting鉴定，实验结果表明该蛋白是正确表达的重组M蛋白，VSV小鼠康复血清检测到M蛋白呈阳性，而健康小鼠则反应呈阴性，如图5所示；抗His tag的单克隆抗体检测到的TrxA-M重组蛋白，而TrxA则为17KDa左右有条带显示，如图4所示。以上结果表明，利用原核表达质粒pET32a(+)，VSV M蛋白得到了正确表达。
实施例3、M蛋白抗体的ELISA检测
将纯化的TrxA-M重组蛋白倍比稀释为：1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320、1/640、1/1280、1/2560、1/5120，进行包被抗原，不同M蛋白稀释度的P/N值变化规律如图6所示，以1∶200的VSV康复血清作为一抗，1∶5000的HRP标记IgG作为二抗，确定蛋白稀释度为1/320；后用1/100和1/200的一抗稀释度以确定最佳的一抗的工作浓度，结果表明为1/100为最佳的一抗工作浓度；
通过方阵滴定确定重组蛋白最佳包被浓度为12.5μg/mL，纯化重组的蛋白用0.05MpH9.6碳酸缓冲液稀释，4℃包被过夜；用含3％的脱脂奶粉的PBS-0.05％Tween20封闭缓冲液在37℃条件下封闭2h；待测血清经倍比稀释后，37℃孵育2h；加入用封闭缓冲液稀释为1∶5000的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5h；之后用洗涤缓冲液洗涤；于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，37℃保温10～30分钟；于各反应孔中加入0.05mL终止液；在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，以未免疫的血清做阴性对照，以待测血清OD值/阴性对照OD值＞2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清样品的抗体滴度。
实验采用健康的BALB/c雄性小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，体重约为18～24g，采用滴鼻攻毒VSVXN2，接种的小鼠分3组，每组3只，分别为对照组(用PBS50μL)、高剂量组(106PFU/只)、低剂量组(103PFU/只)(plaque forming unit，PFU)，分别在攻毒前，攻毒后每周取血一次，连续4周；每只小鼠取血20μL，稀释至180μLPBS中，采用前述方法检测抗体滴度；
如图7所示，106PFU剂量组的动物的体重在攻毒后第一周下降显著，可达20％，与之对应的是，感染该剂量病毒动物体内M抗体滴度在VSV攻毒第一周后变化不明显，但从第二周至第四周抗体滴度稳步上升，如图8所示，而103PFU组动物在病毒攻击后未显现出显著下降，而M抗体水平直至接种后第四周亦变化不显著。PBS组动物的体重则稳步上升，体内检测不到特异的M抗体。
综上所述，本发明提供的试剂盒，可对大量样品同时进行检测，操作简单方便，结果特异性强、敏感性高，能够快速稳定检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体，适用于各种感染VSV动物的快速诊断，有利于及时监测入境动物的VSV感染情况。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途。
2.根据权利要求1所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述用途具体指，用所述重组M蛋白抗原制备包括如下组分的试剂盒：重组M蛋白抗原、多孔酶联板、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、样品稀释液、HRP标记的羊抗鼠IgG、终止液、TMB底物溶液、阴性对照血清和阳性对照血清。
3.根据权利要求2所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述重组M蛋白抗原为TrxA-M重组蛋白抗原或含GST标签的重组M蛋白抗原。
4.根据权利要求3所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述TrxA-M重组蛋白抗原通过包括以下步骤的方法制备而得：
步骤一，根据VSV基因组序列设计引物对VSV M基因进行PCR扩增；
步骤二，将质粒pET32a(+)和PCR扩增得到的所述M基因分别用BamHⅠ与HindⅢ双酶切并分别回收，用T4连接酶连接，连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌菌株，37℃培养过夜后，挑取菌落进行培养后抽提质粒DNA，进行BamHⅠ与HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序鉴定，获得pET32a-M质粒；
步骤三，将所述pET32a-M质粒转化大肠杆菌BL21表达宿主菌，以终浓度为1mM的IPTG诱导TrxA-M重组蛋白的表达；
步骤四，超声破碎所述宿主菌，12000rpm离心30min，对破碎菌体上清及沉淀分别采用12％的SDS-PAGE检测目的蛋白；
步骤五，采用Ni-NTA Resin纯化所述重组蛋白，采用12％的SDS-PAGE胶鉴定纯化产物，并用VSV小鼠康复血清及His单克隆抗体进行Western-blotting鉴定M蛋白。
5.根据权利要求2所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述包被缓冲液为pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液；所述封闭缓冲液由含3％的脱脂奶粉的PBS和0.05％Tween20组成，所述百分比为重量体积百分比。
6.根据权利要求2所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述洗涤缓冲液为pH7.4的0.15M PBS。
7.根据权利要求2所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述样品稀释液由0.1g BSA加所述洗涤缓冲液至100mL的比例配制而得。
8.根据权利要求2所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述终止液为2M硫酸。
9.根据权利要求2所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，用所述试剂盒检测感染VSV的动物体内M蛋白抗体的方法包括以下步骤：
步骤一，重组M蛋白抗原用0.05M pH9.6的碳酸缓冲液稀释，4℃包被过夜，洗涤缓冲液洗涤；
步骤二，用封闭缓冲液37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
步骤三，将待测血清用样品稀释液倍比稀释后，37℃孵育2h，用洗涤缓冲液洗涤3次；
步骤四，加入用封闭缓冲液稀释为1：5000的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1.5h，用洗涤缓冲液洗涤；
步骤五，于各反应孔中加入TMB底物溶液0.1mL，37℃保温10～30分钟；
步骤六，于各反应孔中加入0.05mL终止液；
步骤七，在ELISA检测仪上，于450nm处以空白对照孔调零后测各孔OD值，以待测血清OD值/阴性对照OD值＞2.1作为阳性标准，以出现阳性反应的最高稀释度作为该血清样品的抗体滴度。
10.根据权利要求9所述的重组M蛋白抗原在制备感染VSV的动物体内M蛋白抗体的ELISA检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述重组M蛋白抗原的包被浓度为12.5μg/mL。
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