CN104311660A - 非洲猪瘟病毒vp73蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗体的制备方法，旨在提供一种腹水效价高，亲和力高，抗原用量少、操作简便的新型多克隆抗体的制备方法。所述的非洲猪瘟病毒多克隆抗体的制备包括：对ASFV VP73基因序列PCR扩增、抗原的制备、动物免疫、腹水多克隆抗体提取的步骤。本发明提供的非洲猪瘟病毒VP73蛋白多克隆抗体与常规兔源、鼠源抗血清的制备方式相比，该制备方式具有抗原用量少、操作简便,非洲猪瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗体可以用于非洲猪瘟病毒VP73抗体的检测，为我国非洲猪瘟病的防控提供重要的技术手段。

Description

非洲猪瘟病毒VP73蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术和免疫学技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒抗原性结构蛋白VP73蛋白特异性腹水多克隆抗体，以及制备方法和用途。

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)主要是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病,是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告动物疫病。临床上以高热、皮肤充血、内脏器官出血、高死亡率为特征。非洲猪瘟自1921由肯尼亚首次报道以来，已蔓延至非洲、欧洲、美洲加勒比海地区和欧亚接壤地区的49个国家。无论在非洲猪瘟新发地区还是流行地区，疫情的爆发和流行都会对发病国家产生严重的社会经济影响。非洲猪瘟虽然不感染人，但对于那些把猪肉及其相关猪制品作为主要动物蛋白来源的国家，非洲猪瘟的流行大大降低了猪产品的供应能力，改变当地居民的饮食结构，间接对人体健康造成危害。

ASFV属于双链DNA病毒目(dsDNA)、非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)，而且是其唯一已知的代表物种。ASFV有囊膜呈二十面体对称，平均直径200nm，结构复杂。基因组约为170-192kb，与痘病毒相似，具有发夹结构、末端反向重复序列以及早期RNA合成所必需的酶。整个基因组有151个ORF，其编码的蛋白中有131种病毒蛋白的结构和功能已有报道。

ASFV可以编码34种以上的结构蛋白，VP73蛋白作为ASFV主要的抗原性结构蛋白，包含396个氨基酸，分子量约为44.8KDa，抗原性稳定，能够诱导机体产生中和抗体，选择ASFV VP73蛋白作为免疫原制备特异性的单克隆抗体、多克隆抗体，从而建立ELISA、免疫印迹技术、间接免疫荧光等方法来检测ASF具有明显的优势性。

2007年至2014年7月，越来越多的国家遭受到非洲猪瘟的侵袭，先后在格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯、乌克兰、白俄罗斯等国暴发，造成巨大的经济损失，也严重威胁我国的养猪业。俄罗斯：6月20日-7月8日在卡卢加州、斯摩棱斯克州、普斯科夫州、诺夫哥罗德州发生12起非洲猪瘟疫情，发病野猪5头，病死野猪4头，野猪病死率80％，扑杀野猪1头；发病猪34头，病死猪23头，病死率67.65％。拉托维亚：7月2日-13日发生11起非洲猪瘟疫情，发病野猪10头，病死野猪9头，销毁野猪1头；发病猪4头，扑杀猪47头。波兰：6月-7月在波德拉谢省发生4非洲起猪瘟疫情，发病野猪12头，病死野猪12头。立陶宛：2014年7月底，在立陶宛伊格纳利纳区一家大型农场发现大规模非洲猪瘟疫情，该农场约2万头猪都被宰杀，以防止疫情扩散。8月，立陶宛又在乌泰纳区一家私人农场发现非洲猪瘟疫情。

随着非洲猪瘟流行的区域在逐渐扩大并有蔓延至我国的风险，已经引起我国的兽医工作者们的高度重视并开展相关储备性研究，针对ASFV相关基因的多克隆抗体的制备已有相关报道，多是采用将抗原免疫兔或大鼠收获抗血清，如李洪利等(2012)利用原核表达的VP73蛋白免疫新西兰大白兔获得抗VP73蛋白多克隆抗体的高免血清；如何提供一种快速、经济、特异性良好的多克隆抗体制备方法无疑会加速我国对非洲猪瘟免疫学研究以及及早的建立非洲猪瘟血清学检测方法奠定基础。

目前，实验室制备多克隆抗体一般采用将提纯的病毒核芯颗粒或表达抗原免疫大白兔或大鼠后获得相应的兔源、鼠源的抗血清多克隆抗体，但未见利用腹水制备多克隆抗体的制备方法。本发明首次提出了抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体的制备，制备的腹水多克隆抗体特异性效果等同于常规抗血清制备方法获得的多克隆抗体，但与常规方法相比，腹水多克隆抗体的制备有着抗原用量少、经济、易操作、腹水可反复抽取等优点，制备的腹水多克隆抗体已通过本实验在Western blot、ELISA等检测技术上成功应用。制备的ASFV VP73蛋白腹水多抗能与VP73原核表达蛋白发生特异性结合，而对照无蛋白带出现，说明所获得的多抗对VP73原核表达蛋白具有良好的特异性。因此，腹水多克隆抗体的制备方法可以代替常规抗血清制备多克隆抗体方法，不仅对研究ASFV VP73蛋白的功能有重大意义，而且对建立特异、敏感、快速的ASFV免疫学检测方法(如ELISA)也有重要的意义。

【发明内容】

本发明的目的在于，提供一种经济、易操作、抗体特性好的抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体的制备方法。腹水多克隆抗体的制备方法可以代替常规抗血清制备多克隆抗体方法。

本发明的内容涉及一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

a)制备VP73蛋白重组抗原：将VP73基因序列扩增至原核表达载体GEX-KG中，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达获得重组蛋白抗原；

b)动物免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30μg与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化制成免疫原,选择8周龄雌性Balb/c小鼠，分别在第1、15、30天对小鼠进行第一、二、三次免疫；

c)加强免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30μg作为免疫原，在步骤b)中第三次免疫后45天，对小鼠进行免疫；

d)对步骤c)加强免疫7天后的小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7天后，接种1×10⁵个SP2/0细胞；

e)步骤d)接种P2/0细胞7～10天后采集腹水，腹水中含有所述非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体。

本发明的内容还包括根据方法制备获得的非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体。

本发明的内容还包括所述的非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂中的应用。

具体的，本发明是通过以下技术方案实现的：

1.抗原的制备和纯化：对ASFV VP73基因序列PCR扩增，并插入BamHI/XhoI酶切位点，将扩增的片段克隆至原核表达载体pGEX-KG中，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取经PCR和测序鉴定后的阳性克隆进行诱导表达；将提取的表达产物用SDS-PAGE分析，Western blot检测免疫原性，6×his标签蛋白纯化试剂盒纯化表达的VP73蛋白，BCA法测定蛋白浓度作为抗原备用。

2.动物免疫和多克隆抗体制备：以纯化的原核表达可溶性重组VP73蛋白为免疫抗原，其制备方法包括如下步骤：

(1)选择8周龄雌性Balb/c小鼠，取30μg重组蛋白抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后第一次免疫，皮下3～4点注射；

(2)在第一次免疫后的第15天和第30天，分别进行第二次、第三次免疫，均取30μg重组蛋白抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化做皮下3～4点注射；

(3)第三次免疫后45天，第四次加强免疫注射抗原溶液，不加佐剂；

(4)加强免疫7天后，腹腔注射0.5mL降植烷，7天后，腹腔注射1×10⁵个SP2/0细胞；

(5)接种SP2/0细胞7～10天后采集腹水，腹水中含有非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体。

3.多克隆抗体的应用：制备的多克隆抗体可用于ELISA、Western blot、间接免疫荧光等检测。

本发明的抗非洲猪瘟病毒VP73蛋白腹水多克隆抗体特异性强、腹水效价高，得到的腹水多克隆抗体效价可以达到1：50000以上。本发明提供的非洲猪瘟病毒VP73蛋白多克隆抗体，与常规兔源、鼠源抗血清的制备方式相比，该制备方式具有抗原用量少、操作简便,非洲猪瘟病毒VP73蛋白小鼠腹水多克隆抗体可以用于非洲猪瘟病毒VP73抗体和抗原的检测方法，为我国非洲猪瘟病的防控提供重要的技术手段。

附图说明

图1为重组原核表达质粒pKG-VP73的酶切鉴定；图中：M为DNA Marker，1为阳性克隆酶切鉴定；

图2为原核表达重组蛋白pKG-VP73的SDS-PAGE及Western blot分析；

图3为ASFV VP73融合表达蛋白的SDS-PAGE纯化分析；

图4为抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体的效价测定；

图5为抗ASFV VP73蛋白腹水多克隆抗体与VP73原核表达蛋白Western blot结果图。

具体实施方式

下面结合实施对本发明的腹水多克隆抗体的制备方法作进一步描述。

实施例1、非洲猪瘟病毒VP73抗原的制备和纯化

1.通过检索Genebank上发表的ASFV VP73基因序列(Genebank登录号：S89966.1)，优化设计VP73基因全长序列，氨基端加入起始密码子ATG，羧基端加入6×His标签及终止密码子。合成含有VP73基因全长序列的质粒，合成的VP73基因长度为1188bp。利用Primer Premier5.0设计一对特异性引物(分别在上下游引物引入BamHI和XhoI酶切位点)，通过PCR扩增得到1188bp的非洲猪瘟病毒VP73基因片段。

2.对ASFV VP73基因序列PCR扩增，并插入BamHI/XhoI酶切位点，将扩增片段克隆至原核表达载体pGEX-KG中，连接克隆至大肠杆菌感受态BL21(DE3)菌株，提取质粒后，经测序、PCR和双酶切鉴定，选取VP73基因读码框正确的阳性克隆(简称pKG-VP73)；

3.无碱基突变的重组质粒pKG-VP73转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)后，将所得阳性菌液接种到含相应抗生素(1:1000)的LB液体培养基中，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导3h。以1:100的接种量接入到含相应抗生素(Amp)的LB液体培养基中，置于37℃摇床上，180r/min振荡培养12h,第二天以相同的处理方式，振荡培养使培养基OD600值达到0.6～0.8之间，加入IPTG诱导剂至终浓度为1.0mmol/L，继续振荡诱导3h。BL21菌液和空载体菌液同时以1.0mmol/LIPTG诱导表达3h。

4.6×his标签蛋白纯化试剂盒纯化表达的VP73蛋白，BCA法测定蛋白浓度作为抗原备用。按照Thermo公司B-PERTM6×His Fusion Protein Purification Kit说明书对诱导表达的VP73蛋白纯化，加入适量的Protein Stabilizing Cocktail，使用分光光度仪或Pierce BCA Protein Assay kit测定蛋白浓度，适量分装后置于-80℃保存备用。使用Pierce BCA Protein Assay kit测定纯化后VP73蛋白的蛋白质浓度，读取562纳米处的吸光光度值，根据标准曲线计算出VP73纯化蛋白的浓度为2.24mg/mL。

5.试验结果

(1)VP73重组原核表达质粒的构建

图1所示pKG-VP73阳性克隆酶切鉴定结果，经测序鉴定分析后，全长1188bp的VP73基因连同基因末端His标签与载体上的GST标签融合，且阅读框正确。

(2)VP73重组蛋白的表达及纯化

将pKG-VP73阳性克隆转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达的SDS-PAGE结果(图2)，融合蛋白的相对分子量为71KDa，与预期结果相符，Western blot结果显示，在VP73融合表达的蛋白带处出现特异性反应，而空载体蛋白对照没有反应，表明融合表达产物对ASFV标准阳性血清具有良好的免疫反应性(图2)。表达产物经6×his标签蛋白纯化试剂盒纯化(图3)，BCA法测定蛋白浓度为2.24mg/mL，置于-80℃保存作为抗原备用。

实施例2、非洲猪瘟病毒VP73蛋白特异性小鼠腹水多克隆抗体的制备；

1.用提纯的重组蛋白抗原免疫Balb/c小鼠：选择8周龄的雌性Balb/c小鼠，初次免疫取30μg重组蛋白抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化做皮下3～4点注射，免疫剂量0.2mL。第二次免疫、第三次免疫时用等量的表达抗原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化，作皮下多点注射。每次免疫间隔两周。免疫后45天，每只小鼠用30μg提纯的表达抗原作腹腔注射进行加强免疫。每次免疫期结束后对免疫小鼠和对照小鼠(未免疫)断尾采血，以5ug/mL的纯化蛋白VP73作包被抗原包被酶标板，检测血清效价。

2.SP2/0细胞注射入Balb/c小鼠腹腔制备多抗腹水：小鼠加强免疫7天后，腹腔注射0.5mL Pristane(降植烷)，7天后，腹腔注射1×10⁵个SP2/0细胞，接种细胞7～10天左右后可产生腹水，而小鼠濒于死亡之前，采集腹水，处死小鼠。用滴管将腹水吸入试管中，腹水可反复收集数次。一般一只小鼠可获5～10mL腹水。

3.Western blot检测：将VP73原核表达的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，同时设空载体蛋白为阴性对照，电泳结束后，采用湿法转印硝酸纤维素膜(NC膜)，以待检的腹水为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Westem blot分析，经辣根过氧化物酶标记的DAB底物显色液显色后并拍照。结果如图5所示，VP73腹水多抗能与VP73原核表达蛋白发生特异性结合，而对照无蛋白带出现，说明所获得的多抗对VP73原核表达蛋白具有良好的特异性。蛋白大小分别约为71KDa,VP73原核表达蛋白与该多抗具有良好的免疫反应性，

4.腹水多克隆抗体的提取及效价测定：待免疫小鼠腹水征象明显时采集腹水，将所得的腹水做倍比稀释，纯化蛋白作包被抗原，采用间接ELISA方法检测多抗的效价，结果显示，该多抗经1:50000稀释后的OD450值仍可达到1.392，说明制备的鼠源ASFV VP73腹水多克隆抗体效价可以达到1：50000以上(图4)。

表1ASFV VP73多克隆抗体效价的测定

实施例3、ASFV VP73特异性小鼠腹水多克隆抗体的应用

应用ASFV VP73特异性多克隆抗体建立了检测非洲猪瘟病毒VP73抗体的竞争ELISA方法,操作步骤如下：

1)以纯化的VP73融合蛋白作为包被抗原，用碳酸盐缓冲液(CBS，pH9.6)稀释后包被96孔酶标板，37℃孵育1h，4℃过夜；

2)PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤三次；

3)加入含1％BSA的PBS 200uL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤三次；

4)加入1:10稀释的ASFV阳性猪血清、阴性血清和待检血清，100uL/孔，37℃作用1h，PBST洗3次；

5)加入1:50000稀释的腹水多克隆抗体，100uL/孔，37℃作用30min，PBST洗3次；

6)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，100uL/孔，37℃作用30min，PBST洗3次；

7)加入TMB底物，100uL/孔，显色15min；

8)加入50uL/孔2mol/L的H₂SO4终止反应，读取OD450值；

9)结果判读：用该ELISA检测85份猪阴性血清样品和标准阴性血清测定OD450值，计算抑制百分率PI：

计算检测样品的平均抑制率(PI')和标准偏差(SD)。若PI≥PI'+3SD，则判定为阳性，PI＜PI'+3SD，则判定为阴性。

竞争ELISA结果显示，该方法除了对非洲猪瘟阳性血清检测结果为阳性外，对猪传染性胸膜肺炎阳性血清、猪瘟阳性血清、猪伪狂犬病阳性血清、猪口蹄疫阳性血清及猪蓝耳病阳性血清的检测结果均为阴性，与商品化ASFV抗体检测ELISA试剂盒的平行检测结果一致，说明特异性ASFV VP73腹水多克隆抗体可用于竞争ELISA方法检测ASFV抗体。

本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

a)制备VP73蛋白重组抗原：将VP73基因序列扩增至原核表达载体GEX-KG中，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，诱导表达获得重组蛋白抗原；

b)动物免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30μg与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化制成免疫原,选择8周龄雌性Balb/c小鼠，分别在第1、15、30天对小鼠进行第一、二、三次免疫；

c)加强免疫：取步骤a)获得的重组蛋白抗原30μg作为免疫原，在步骤b)中第三次免疫后45天，对小鼠进行免疫；

d)对步骤c)加强免疫7天后的小鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7天后，接种1×10⁵个SP2/0细胞；

e)步骤d)接种SP2/0细胞7～10天后采集腹水，腹水中含有所述非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的方法制备获得的非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体。

3.权利要求2所述的非洲猪瘟病毒VP73蛋白的特异性多克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒抗体检测试剂中的应用。