CN106443015A - 一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒 - Google Patents
一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术检测领域,具体涉及一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。该试剂盒包括包被有hexon蛋白N端保守区表达产物的ELISA酶标板,HRP标记的兔抗鸡抗体,样品稀释液,洗涤液;所述的hexon蛋白N端保守区序列如SEQ ID NO.5所示。本发明建立的禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出抗禽腺病毒抗体,而不能检测出抗其它病原的抗体。因此,该试剂盒具有良好禽腺病毒的特异性,能用于禽腺病毒感染状况流行病学调查。
Description
技术领域
本发明属于生物技术检测领域,具体涉及一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属,分为5个种(A-E),12个血清型。虽然在世界各地均有报道,FAdV感染一般引起亚临床状况,而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年,国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年,FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡,还发生于10-20周龄的蛋鸡,给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现,目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对4型FAdV血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。在FAdV的编码蛋白中,hexon为FAdV的表面蛋白,且在不同血清型间相对保守,在介导FAdV病毒感染宿主细胞中起重要作用,能有效刺激机体产生体液免疫。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种基于hexon蛋白N端的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了禽腺病毒hexon基因N端保守区原核表达质粒,之后将该质粒转化入BL21细胞进行原核表达并纯化,将纯化的蛋白作为包被抗原建立试剂盒,检测禽腺病毒特异性抗体。
本发明所述的一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒,包括包被有表达hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板,HRP标记的兔抗鸡抗体,样品稀释液,洗涤液;所述的hexon蛋白N端保守区序列如SEQ ID NO.5所示。
其中,所述包被有表达hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板,是通过将纯化的hexon蛋白N端保守区表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。
其中,所述稀释液及洗涤液是10mM pH7.2的磷酸缓冲液。
所述包被有表达hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板,通过下述步骤得到:
(1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏,研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液;经0.45um微孔滤器过滤后,经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚,接种后收取尿囊液;尿囊液经鉴定为禽腺病毒后,-20℃保存。
(2)禽腺病毒基因组的制备:首先将禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解,随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提,最后用无水乙醇沉淀,溶于30uL灭菌超纯水,即得禽腺病毒基因组,置-20℃备用。
(3)禽腺病毒hexon原核表达质粒构建:从GenBank中下载FAdV的5个型的代表株进行氨基酸序列分析,选择了N端1个比较保守的表位片段,设计出扩增禽腺病毒hexon基因N端保守区的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物,具体引物序列见表1,由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板,利用表1中所列相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒hexon基因N端保守区(SEQ ID NO.5);随后利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒hexon基因N端保守区的PCR产物进行快速体外重组克隆(参见图1,图2),重组克隆经序列验证后,命名为p-FAdV-hexon-N。之后将正确的质粒转化入BL21感受态细胞中,经IPTG诱导表达以后超声破碎,上清和沉淀分别跑SDS-PAGE,发现表达的蛋白主要在沉淀中以包涵体的形式存在(参见图3),其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
(4)表达产物的反应原性鉴定:扩增阳性克隆的BL21细胞,1:100接种于加AMP的LB培养基中,250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达,5h后收集细菌,用PBS重悬后40Hz,间隔8s进行破碎,破碎完成后离心分上清和沉淀,图3为SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀,可见表达产物主要表达在沉淀中以包涵体的形式存在,之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(图4)。
(5)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:利用BL21表达的产物沉淀跑SDS-PAGE,之后用预冷的Kcl显色,切下目的条带,真空冷冻干燥以后进行研磨,加入适量的PBS溶解,离心以后去上清获得可溶性hexon蛋白N端保守区表达产物,即为检测禽腺病毒抗体的抗原。图5为SDS-PAGE分析纯化的Hexon蛋白N端保守区表达产物
(6)检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒:该试剂盒成分包括包被有hexon蛋白N端保守区的ELISA酶标板,阳性阴性对照,商品化的HRP标记的兔抗鸡二抗,样品稀释液、显色液以及洗涤液。该试剂盒检测禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下:将阳性血清1:400稀释后,加入A1、A2孔,将阴性血清1:400稀释后加入A3、A4孔,剩下的的孔用于检测待检样品(1:400稀释),37度反应1小时;PBS洗涤3遍后,加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体,37度反应1小时;PBS洗涤5遍后,进行显色10分钟,之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值,OD450大于0.2的孔判为阳性。
本发明的有益效果体现在:本发明建立的禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出抗禽腺病毒抗体,而不能检测出抗其它病原的抗体(图6)。因此,该试剂盒具有良好禽腺病毒的特异性,能用于禽腺病毒感染状况流行病学调查。
附图说明
图1,PCR扩增线性化pGEX-6p-1载体
泳道1:线性化的pGEX-6p-1载体;泳道M:1Kb DNA Ladder。
图2,PCR扩增Hexon基因N端保守区
泳道1:禽腺病毒Hexon基因N端保守区的扩增;泳道M:100bp DNA Ladder。
图3,SDS-PAGE分析p-FAdV-Hexon-N的表达
泳道1、2:分别为p-FAdV-Hexon-N片段上清及沉淀;泳道3、9:GST上清;泳道4、10:GST沉淀;泳道M:蛋白Marker;泳道5、6:分别为p-FAdV-Hexon其它保守片段1的上清及沉淀;泳道7、8:分别为p-FAdV-Hexon其它保守片段2的上清及沉淀;泳道11、12:分别为p-FAdV-Hexon其它保守片段3的上清及沉淀。
图4,Western-blot分析制备的抗原与阳性血清的反应性
泳道M:蛋白Marker;泳道1:阴性对照GST;泳道2:p-FAdV-Hexon其它保守片段3表达产物;泳道3:p-FAdV-Hexon其它保守片段2表达产物;泳道4:p-FAdV-Hexon其它保守片段1表达产物为片段2的BL21表达产物;泳道5:本发明p-FAdV-Hexon-N端片段表达产物。
图5,SDS-PAGE分析纯化的p-FAdV-Hexon-N的表达产物
泳道M:蛋白Marker;泳道1:纯化的p-FAdV-Hexon-N的表达产物
图6,检测FAdV抗体的间接ELISA试剂盒检测效果。
具体实施方式
实施例:
1,禽腺病毒分离:取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏,研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液;5000r/min离心15min,取上清;加入青霉素和链霉素各1000IU/ml,37℃反应30min;经0.45um微孔滤器过滤后,以0.2ml/胚的剂量,经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚,接种后96-120小时后收取尿囊液;尿囊液经鉴定为禽腺病毒后,-20℃保存。
2,设计扩增出含pGEX-6p-1线性化载体与禽腺病毒Hexon蛋白N端保守区片段的引物:具体引物序列见表1,由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.PCR扩增线性化pGEX-6p-1及禽腺病毒Hexon蛋白N端保守区引物
3,禽腺病毒基因组的制备:取禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL指形管内,加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0,20mmol/L E DTA pH 8.0,2%SDS和蛋白酶K),充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时;加入400uLTris平衡酚,充分混匀后10000r/min离心10分钟,取上清于另一1.5mL指形管;加入400uL酚:氯仿:异戊醇,充分混匀后10000r/min离心5分钟,取上清于另一1.5mL指形管;加入800uL无水乙醇,颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟,12000r/min离心15分钟,弃尽上清;室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶,充分溶解后,即得血清4型禽腺病毒基因组,置-20℃备用。
4,PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及禽腺病毒Hexon基因N端保守区片段:分别以pGEX-6p-1载体质粒(Invitrogen公司)以及以上制备的禽腺病毒基因组为模板,表1所述相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒Hexon基因N端保守区。PCR扩增反应体系为:模板1uL,5×Buffer10uL,10mM dNTP Mix 1uL,上游引物为10μmol 2uL,下游引物为10μmol 2uL,高保真酶1uL,加入灭菌超纯水至50uL。PCR扩增反应循环参数为:95℃预变性4分钟,随后进行30个循环(95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸3分钟),72℃延伸10分钟。PCR结束后,PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1,图2所示)。
5,pFAdV-Hexon-N重组表达载体构建:将以上纯化的线性化载体pGEX-6p-1以及禽腺病毒Hexon基因N端保守区片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM Ⅱ的作用下进行重组克隆。具体重组反应体系如下:纯化的禽腺病毒Hexon基因片段PCR产物50-100ng,纯化的pGEX-6p-1线性化载体50ng,2μL商品化的ExnaseTM Ⅱ酶,4μL5倍的缓冲液,其它补加水至20μL。反应物于37℃作用30分钟后,置冰上5分钟。随后将20μL反应物转化到常规感受态细菌,涂LB平板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备,并进行PCR鉴定。鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。
6,表达产物的反应原性鉴定:扩增阳性克隆的BL21细胞,1:100接种于加AMP的LB培养基中,250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达,5h后收集细菌,用PBS重悬后40Hz,间隔8s进行破碎,破碎完成后离心分上清和沉淀,图3为SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀,可见表达产物主要表达在沉淀中以包涵体的形式存在,之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(图4)。用抗禽腺病毒阳性血清进行的Western-blot分析证明,只有本发明表达的Hexon蛋白N端保守片段能与禽腺病毒阳性血清进行良好的免疫反应,而其它表达的Hexon蛋白保守片段(包括p-FAdV-Hexon保守片段1,2,3)均不能与抗禽腺病毒阳性血清进行良好免疫反应。p-FAdV-Hexon保守片段1,2,3的扩增引物如表2,其他操作相同
表2.PCR扩增保守片段1,2,3引物
7,制备检测禽腺病毒抗体的抗原:利用BL21表达的产物沉淀进行SDS-PAGE之后用预冷的Kcl显色,切下目的条带,真空冷冻干燥以后进行研磨,加入适量的PBS溶解,离心以后去上清获得可溶性Hexon蛋白N端保守区表达产物,即为检测禽腺病毒抗体的抗原。图5为SDS-PAGE分析纯化的Hexon蛋白N端保守区表达产物。
8,检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒组装及特性:该试剂盒成分包括包被有Hexon蛋白N端保守区表达产物的ELISA酶标板,阳性阴性对照,商品化的HRP标记的兔抗鸡二抗,样品稀释液、显色液以及洗涤液。该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下:将阳性血清1:400稀释后,加入A1、A2孔,将阴性血清1:400稀释后加入A3、A4孔,剩下的的孔用于检测待检样品,37度反应1小时;PBS洗涤3遍后,加入1:50000稀释的HRP标记的兔抗鸡抗体,37度反应1小时;PBS洗涤5遍后,进行显色10分钟,之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值。以大于阴性OD值+3倍标准偏差的孔判为阳性。试剂盒特异性试验发现,该试剂盒仅与阳性血清反应(FadV1,FadV1),而SPF鸡血清、抗马立克氏病病毒血清(MDV)、抗鸡新城疫病毒血清(NDV)、抗禽白血病病毒血清(ALV)、抗禽流感病毒血清(AIV),抗传染性法氏囊病病毒血清(IBDV)以及抗传染性支气管炎病毒血清(IBV)均不反应(图6)。
Claims (3)
1.一种基于hexon蛋白N端保守区的检测禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒,其特征在于,包括包被有hexon蛋白N端保守区表达产物的ELISA酶标板,HRP标记的兔抗鸡抗体,样品稀释液,洗涤液;所述的hexon蛋白N端保守区序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述包被有hexon蛋白N端保守区表达产物的ELISA酶标板,是通过将纯化的hexon蛋白N端保守区表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于稀释液及洗涤液是10mM pH7.2的磷酸缓冲液。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170222 |